DE19533354C2

DE19533354C2 - Methods and their applications for sequence-specific detection and quantification of nucleic acids

Info

Publication number: DE19533354C2
Application number: DE19533354A
Authority: DE
Inventors: Derya Dr Ozkan
Original assignee: Individual
Current assignee: OZKAN, DERYA, DR., 10437 BERLIN, DE
Priority date: 1995-09-08
Filing date: 1995-09-08
Publication date: 1999-07-01
Anticipated expiration: 2015-09-09
Also published as: DE19533354A1

Description

Nucleinsäuren sind die Grundbausteine der Erbinformation aller Lebewesen und sind daher Gegenstand einer immer größer werdenden Anzahl von Untersuchungen. Diese Untersuchungen beziehen sich dabei auf verschiedene Fragestellungen. Der sequenzspezifische Nachweis und der Quantität von spezifischen Nucleinsäuren ist oft erforderlich in der Gentechnik, z. B. im Rahmen der Klonierung, in der medizinischen Diagnostik z. B. bei der Mutationsanalyse, der Bestimmung von Tumormarkern oder dem Nachweis von genetischem Material von Mikroorganismen in der klinischen Diagnostik. Der sequenzspezifische Nachweis einer Nucleinsäure ist unter anderem erforderlich bei der Bestimmung von polymorphen Markern, z. B. bei der Längenmessung von Microsatellite- Markern bei Segregationsanalysen oder in der Forensik.Nucleic acids are the basic building blocks of the genetic information of all living things and are hence the subject of an ever increasing number of studies. This Studies relate to various questions. The Sequence-specific detection and the quantity of specific nucleic acids is often required in genetic engineering, e.g. B. in the context of cloning, in medical Diagnostics e.g. B. in mutation analysis, the determination of tumor markers or the Detection of genetic material from microorganisms in clinical diagnostics. The sequence-specific detection of a nucleic acid is required, among other things, in the Determination of polymorphic markers, e.g. B. in the length measurement of microsatellite Markers in segregation analysis or in forensics.

Eine Anzahl von Nachweisverfahren für Nucleinsäuren existiert bereits. Spectrophotometrische Verfahren können die Konzentration von Nucleinsäuren in Lösung bestimmen. Andere Nachweisverfahren stützen sich auf Visualisierung der Nucleinsäure oder seiner Derivate in einer Matrix, z. B. nach Gelelectrophorese in Agarose oder Polyacrylamid. Die spezifische Sequenz einer Nucleinsäure kann unter anderem bestimmt werden durch Spaltung mit Restriktionsenzymen, durch chemische und enzymatische Sequenzierung und durch Hybridisierung mit Proben komplementärer Sequenz. All diese Verfahren erfordern eine große Anzahl von Arbeitsschritten, aufwendige Apparaturen, radioaktive oder toxische Markierungssubstanzen und fortgeschrittene technische Fertigkeiten. Das Fehlen von einfachen, standardisierbaren und automatisierbaren Nachweisverfahren macht die genetische Analyse derzeit zu teuer, um in großem Umfang eingesetzt werden zu können.A number of detection methods for nucleic acids already exist. Spectrophotometric methods can measure the concentration of nucleic acids in solution determine. Other detection methods rely on visualization of the nucleic acid or its derivatives in a matrix, e.g. B. after gel electrophoresis in agarose or Polyacrylamide. The specific sequence of a nucleic acid can be determined, among other things are by cleavage with restriction enzymes, by chemical and enzymatic Sequencing and by hybridization with samples of complementary sequence. All these Processes require a large number of work steps, complex equipment, radioactive or toxic labeling substances and advanced technical Skills. The lack of simple, standardizable and automatable Detection methods currently make genetic analysis too expensive to do on a large scale to be able to be used.

Zu der hier veröffentlichten Methode sind ähnliche, aber dennoch fundamental verschiedene Methoden bekannt. Eine Publikation (Landegren, U. et al.: Science 241: 1077-1080, 1988) beschreibt ein Verfahren, bei dem zwei Oligonucleotidproben unmittelbar nebeneinander auf einer zu messenden komplementären Nucleinsäure hybridisieren. Beide Oligonucleotidproben können daraufhin ligiert werden, vorausgesetzt daß die endständigen unmittelbar aneinander angrenzenden Basen der einzelnen Oligonucleotide eine korrekte Basenpaarung mit der zu messenden komplementären Nucleinsäure eingehen können. Eine andere Methode (Nielsson, M. et. al.: Science 265: 2085-2088, 1994) ist beschrieben, bei der bei einem einzelnen linearen radioaktiv markier ten Probenmolekül die 5'- und 3'-Enden unmittelbar nebeneinander auf einer nachzuweisenden linearen Nucleinsäure hybridisieren. Damit kann dieses einzelne Probenmolekül zu einem ringförmigen Molekül ligiert werden. Durch eine vorangegangene Immobilisierung ist die nachzuweisende lineare Nucleinsäure dabei an eine Nylonmembran gebunden. Die radioaktive ringförmige Probe kann somit nicht von der zu messenden Nucleinsäure dissoziieren und es tritt eine Verknüpfung mit ihr ein. Potentielle Anwendungen werden angegeben für in situ-Hybridisierungen von zirkularisierbaren Oligonucleotidproben mit menschlichen Metaphasenchromosomen, zur Detektion einer vorher bekannten Mutation mittels einer zirkularisierbaren Probe, mehrer bekannter Mutationen mittels gleichzeitiger Hybridisierung mehrerer farbkodierter zirkularisierbarer Proben, zur Detektion spezifischer RNA-Moleküle in Gewebsschnitten und zur preparativen Aufreinigung anderer zirkulärer Nucleinsäurenmoleküle (z. B. Plasmiden) beim Screening von Genbanken. Bei dieser Methode sind die Anwendungen beschränkt, weil auf der zu messenden Nucleinsäure im Extremfall nur die zwei exakt nebeneinanderliegenden 5'- und 3'-endständigen Basen der zirkularisierbaren Probe auf Komplementarität mit der nachzuweisenden Nucleinsäure untersucht werden können. Unter Standardbedingungen können hierbei nicht gepaarte Basen, wenn sie nicht endständig sind, eine Hybridisierung der zirkularisierbaren Probe mit der nachzuweisenden Nucleinsäure und eine Ligation der endständigen Basen nicht verhindern, wobei ein Ringschluß eintreten kann. Dieser Fall setzt die Sensitivität und Spezifität dieser Methode soweit herab, daß sie für routinemäßige Anwendung und für Anwendungen, wie sie hier in der vorliegenden Veröffentlichung beschrieben werden, nicht brauchbar ist. Für zu untersuchende Nucleinsäurenabschnitte mit mehreren Sequenzabweichungen müßte daher für jede Punktmutation eine eigene Probe bereitgestellt werden. Die Methode (Stand der Technik) ist somit z. B. für Längenmessungen repetitiver Elemente nicht geeignet. Der Nachweis mehrerer ähnlicher Nucleinsäuren, die sich nur in einem zentralen Bereich unterscheiden, wie z. B. erforderlich in der Forensik oder in phylogenetischen Untersuchungen, wo z. B. konservierte Nucleinsäurenabschnitte als Primer-Bindungsstellen für die PCR dienen und zentrale divergente Sequenzen bestimmt werden, ist mit der Methode von Nielsson (Stand der Technik) ebenfalls nicht möglich. Diese wird erst durch die Verwendung mehrerer erster Proben ermöglicht. The method published here is similar, but still fundamental known various methods. A publication (Landegren, U. et al .: Science 241: 1077-1080, 1988) describes a method in which two oligonucleotide samples immediately next to each other on a complementary nucleic acid to be measured hybridize. Both oligonucleotide samples can then be ligated, provided that that the terminal immediately adjacent bases of the individual Oligonucleotides a correct base pairing with the complementary to be measured Can enter nucleic acid. Another method (Nielsson, M. et. Al .: Science 265: 2085-2088, 1994) is described in which at a single linear radioactive label sample molecule, the 5 'and 3' ends immediately next to each other on one hybridize linear nucleic acid to be detected. With this, this individual Sample molecule to be ligated into a ring-shaped molecule. By a previous immobilization is the linear nucleic acid to be detected bound a nylon membrane. The radioactive ring-shaped sample can therefore not dissociate the nucleic acid to be measured and there is a link to it. Potential applications are indicated for in situ hybridizations of circularizable oligonucleotide samples with human metaphase chromosomes, for Detection of a previously known mutation using a circularizable sample, several known mutations by simultaneous hybridization of several color-coded circularizable samples for the detection of specific RNA molecules in tissue sections and for the preparative purification of other circular nucleic acid molecules (e.g. Plasmids) in the screening of gene banks. With this method are the applications limited because in extreme cases only the two are exactly on the nucleic acid to be measured adjacent 5'- and 3'-terminal bases of the circularizable sample Complementarity with the nucleic acid to be detected can be examined. Under standard conditions, unpaired bases can be used if they are not terminal are a hybridization of the circularizable sample with the one to be detected Do not prevent nucleic acid and ligation of the terminal bases, being a Ring closure can occur. This case sets the sensitivity and specificity of this method to the extent that they are for routine use and for applications as described here in described in this publication is not usable. For too nucleic acid sections with several sequence deviations should therefore be examined a separate sample is provided for each point mutation. The method (status of Technology) is thus z. B. not suitable for length measurements of repetitive elements. The Detection of several similar nucleic acids that are only in a central area distinguish, such as B. required in forensics or phylogenetic Investigations where e.g. B. conserved nucleic acid segments as primer binding sites serve for the PCR and central divergent sequences are determined with the Nielsson method (state of the art) also not possible. This is only through allows the use of several first samples.

Durch das hier beschriebene neue Verfahren mit der selektiven Verknüpfung der ersten Proben mit einer immobilisierten zweiten, generischen Probe, der zusätzlichen Region der Komplementarität und der Verwendung von zweiten Probenmolekülen, bedarf es keiner Immobilisierung von ersten Probenmolekülen oder nachzuweisenden Nucleinsäuren und somit erfordern alle Arbeitsschritte nur die Manipulation von Flüssigkeiten. Dadurch wird eine weitgehende Automatisierung möglich. Außerdem werden Kosten pro Ansatz gesenkt, indem die zweiten Proben und die Meßproben aus der Gruppe der ersten Proben weitgehend generischer Natur sind, sodaß diese günstig hergestellt werden können, anstatt für jeden Ansatz neu bereitgestellt werden zu müssen.Through the new process described here with the selective linking of the first Samples with an immobilized second, generic sample, the additional region of the Complementarity and the use of second sample molecules is not required Immobilization of first sample molecules or nucleic acids to be detected and thus all work steps only require the manipulation of liquids. This will extensive automation possible. It also reduces costs per approach by taking the second samples and the measurement samples from the group of the first samples are largely generic in nature so that they can be manufactured cheaply instead of need to be redeployed for each approach.

Aufgrund der genannten Schwierigkeiten, Nucleinsäuren in Lösung spezifisch nachzu weisen und dem gleichzeitig vorhandenen großen Bedarf an diesen Nachweisverfahren für Diagnostik und Forschung, erscheint es notwendig neue Verfahren zu entwickeln, die routinemäßig und ohne vielfältige Manipulationen eingesetzt werden können. Das hier vorgestellte neue Verfahren ist hierzu geeignet. Because of the difficulties mentioned to specifically read nucleic acids in solution point and the simultaneous great need for these detection methods for Diagnostics and research, it appears necessary to develop new procedures can be used routinely and without multiple manipulations. This one The new method presented is suitable for this.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren mit bestimmter Anordnung von komplementären Nucleinsäuren die in der Lage sind, nachzuweisende Nucleinsäuren sequenzspezifisch zu bestimmen und quantifizieren, wobei zwei Gruppen von Probenmolekülen eingesetzt werden. Die erste Gruppe besteht aus einer oder mehreren "Meßproben" und einer oder mehrerer "Detektionsproben". Die Detektionsprobe bildet das Rückgrat der ersten Proben und ist so gestaltet, daß ihr 5'- und 3'-Ende mit der nachzuweisenden Nucleinsäure komplementär ist und einen zentralen Bereich auf der nachzuweisenden Nucleinsäure einrahmt, der von den Meßproben nach Hybridisierung mit der nachzuweisenden Nucleinsäure ausgefüllt wird. Meßproben und Detektionsproben können nach Hybridisierung mit der nachzuweisenden Nucleinsäure unter Standardbedingungen unter Zusatz einer Ligase effizient verbunden werden und bilden dann ein ringförmiges Molekül. Meßproben, die häufig aus kurzen Oligonucleotiden bestehen, können dabei unter Standardbedingungen nur bei vollständiger Komplementarität so binden, daß beide Enden ligierbar sind. Die Detektionsprobe besitzt einen oder mehrere weitere Abschnitte der Komplementarität mit Proben aus der zweiten Gruppe. Diese zweite Gruppe besteht aus ringförmigen Proben, die immobilisiert sind. Nach Ringschluß der ersten Proben sind, weil zwei hybridisierte Nucleinsäurenstränge aufgrund Ihrer schraubenförmigen gewundenen Topologie miteinander verdrillt sind, dadurch erste und zweite Proben miteinander verkettet und können damit spezifisch von ersten Probenmoleküllen, die nicht durch Meßproben an beiden Enden geschlossen wurden, abgetrennt werden. Der Nachweis kann dadurch geführt werden, daß die Proben der ersten Gruppe dabei radioaktiv oder anderweitig markiert sind.The invention therefore relates to a method with a specific arrangement of complementary nucleic acids that are able to detect nucleic acids to determine and quantify sequence-specifically, two groups of Sample molecules are used. The first group consists of one or more "Measurement samples" and one or more "detection samples". That forms the detection sample Backbone of the first samples and is designed so that its 5 'and 3' end with the nucleic acid to be detected is complementary and has a central region on the the nucleic acid to be detected is framed by the test samples after hybridization with the nucleic acid to be detected is filled in. Measurement samples and detection samples can after hybridization with the nucleic acid to be detected under Standard conditions with the addition of a ligase can be efficiently connected and form then a ring-shaped molecule. Measurement samples, often made up of short oligonucleotides can exist under standard conditions only with complete Tie complementarity so that both ends can be ligated. The detection sample has one or more other sections of complementarity with samples from the second Group. This second group consists of ring-shaped samples that are immobilized. After ring closure of the first samples are because two hybridized strands of nucleic acid due to your helical spiral topology twisted together are first and second samples together are chained and can therefore be specific from the first sample molecules that do not pass through Measurement samples were closed at both ends, are separated. The proof can in that the samples of the first group are radioactive or are marked otherwise.

Das neue Verfahren hier zeichnet sich gegenüber den bisher bekannten Verfahren dadurch aus, daß nicht eine Probe, sondern mindestens drei zum Nachweis eingesetzt werden. Die Probe mit den endständigen Regionen der Komplementarität hybridisiert hier nicht mit ihren Enden unmittelbar aneinander angrenzend und wird daher nicht mit sich selbst ligiert. Die Enden der Detektionsprobe hier hybridisieren stattdessen in einem Abstand voneinander, der durch Meßproben ausgefüllt wird, die in diesem Abschnitt komplementär zu der nachzuweisenden Nucleinsäure sind. Es werden hier mehrere erste Proben verwendet, so daß die zu messende Nucleinsäure durch ein oder mehrere auf ihrer gesamten Länge hybridisierenden Meßproben abgetastet wird. Dies hat den Vorteil, daß die gesamte Sequenz der zu messenden Nucleinsäure, die zwischen den beiden Enden der ersten Detektionsprobe liegt, analysiert werden kann. Das ermöglicht die Analyse größerer Abschnitte einer zu messenden Nucleinsäure, da einzelne kurze Proben unter Standardbedingungen nicht auf der zu messenden Nucleinsäure hybridisieren, wenn die Sequenzen nicht exakt komplementär sind. Die Detektionsprobe, die hier mit ihrem 5'- und 3'-Ende auf der zu messenden Nucleinsäure hybridisiert, ist zu einem Ringschluß alleine nicht fähig, da die beiden Enden weit voneinander entfernt auf der zu messenden Nucleinsäure zu liegen kommen. Der Ringschluß und die Messung werden hier durch die Meßproben bewirkt.The new process here is distinguished from the previously known processes from the fact that not one sample, but at least three are used for detection. The Sample with the terminal regions of complementarity does not hybridize here their ends immediately adjacent to each other and therefore does not become with itself ligated. Instead, the ends of the detection sample hybridize at a distance from each other, which is completed by measurement samples that are complementary in this section to the nucleic acid to be detected. There will be several first samples here used so that the nucleic acid to be measured by one or more on it entire length of hybridizing measurement samples is scanned. This has the advantage that the entire sequence of the nucleic acid to be measured, which lies between the two ends of the first detection sample lies, can be analyzed. This enables the analysis of larger ones Sections of a nucleic acid to be measured, since individual short samples are below Standard conditions do not hybridize to the nucleic acid to be measured if the Sequences are not exactly complementary. The detection sample, which here with its 5 'and The 3 'end hybridized on the nucleic acid to be measured is alone for ring closure unable because the two ends are far apart on the one to be measured Nucleic acid come to rest. The ring closure and the measurement are here by the Measurement samples causes.

Die Proben werden hier nicht, wie in den bisher beschriebenen Methoden, nach Ringschluß mit der zu messenden Nucleinsäure verknüpft, sondern mit mindestens einer zweiten Probe. Dies wird dadurch erzielt, daß die Detektionsprobe eine Region der Komplementarität zu einer zweiten Probe besitzt. Durch Ringschluß der ersten Proben werden diese deshalb nicht mit der zu messenden Nucleinsäure verkettet, sondern mit der oder den zweiten Proben, welche immobilisiert sind. In der hier vorliegenden Erfindung ist es daher nicht notwendig, die zu messende Nucleinsäure zu immobilisieren, sondern sie liegt in Lösung vor, was das Verfahren hier weitaus einfacher und einfach zu automatisieren macht. Mittels immobilisierter zweiter Proben können somit spezifische Nucleinsäuren in komplexen Stoffmengen bestehend aus unterschiedlichen Nucleinsäuren in Lösung nachgewiesen werden.The samples are not, as in the methods described so far, after ring closure linked to the nucleic acid to be measured, but to at least a second one Sample. This is achieved in that the detection sample is a region of the Has complementarity to a second sample. By ring-closing the first samples are therefore not linked to the nucleic acid to be measured, but to the or the second samples, which are immobilized. In the present invention it is therefore not necessary to immobilize the nucleic acid to be measured, but rather it is in solution, which makes the process much simpler and easier automate power. Specific immobilized samples can thus be used Nucleic acids in complex amounts consisting of different nucleic acids can be detected in solution.

Besonders vorteilhaft ist ein solches Verfahren, bei dem die zu messende Nucleinsäure aus synthetischer, genomischer, mitochondrialer oder in vitro enzymatisch amplifizierter DNA oder RNA besteht.Such a method in which the nucleic acid to be measured is particularly advantageous synthetic, genomic, mitochondrial or in vitro enzymatically amplified DNA or RNA.

Ganz besonders vorteilhaft ist ein solches Verfahren, bei dem die zweite Probe auf einer festen Phase, z. B. einer Mikrotiterplatte, immobilisiert ist.Such a method is very particularly advantageous, in which the second sample on a solid phase, e.g. B. a microtiter plate is immobilized.

Vorteilhaft ist ferner ein solches Verfahren, wenn die zweite Probe an magnetisierbare, oder anderweitig aus der Lösung abtrennbare Partikel oder Materialien gebunden ist. Weiterhin vorteilhaft ist ein solches Verfahren, bei dem die feste Phase Partikel aus natürlichen oder synthetischen Polymeren, z. B. sog. Latex-Partikel oder Ionenaustauscher- Harze oder synthetische Polymere in Form von kovalenten oder konvexen Artikeln ist. Gegenstand der Erfindung ist ein solches Verfahren, bei dem die ersten Proben durch Ringschluß so ligiert werden, daß sie mit der zweiten Probe verkettet sind. Besonders vorteilhaft ist ein solches Verfahren, bei dem die nachzuweisende Nucleinsäure in Lösung vorliegt und bei der Ligation der Meß- und Detektionsproben assistiert. Such a method is also advantageous if the second sample of magnetizable, or is otherwise bound to particles or materials that can be separated from the solution. Such a method is also advantageous, in which the solid phase consists of particles natural or synthetic polymers, e.g. B. so-called latex particles or ion exchanger Resins or synthetic polymers in the form of covalent or convex articles. The invention relates to such a method, in which the first samples Ring closure are ligated so that they are chained to the second sample. Especially Such a method is advantageous in which the nucleic acid to be detected is in solution is available and assists in the ligation of the measurement and detection samples.

Vorteilhaft ist darüberhinaus ein solches Verfahren, bei dem die Hybridisierungs- und Ligationsreaktionen zusammen mit einer zunächst noch linearen zweiten Probe durchgeführt werden und die zweite Probe erst bei Überführung in ein geeignetes Probengefäß zirkularisiert wird. Dies ist z. B. der Fall bei 5'- und 3'-Biotinylierung der zweiten Probe und Überführung in ein Streptavidin-beschichtetes Probengefäß.Such a method is also advantageous, in which the hybridization and Ligation reactions together with an initially linear second sample be carried out and the second sample only when transferred to a suitable one Sample vessel is circularized. This is e.g. B. the case with 5'- and 3'-biotinylation of second sample and transfer to a streptavidin-coated sample vessel.

Besonders vorteilhaft ist ein solches Verfahren auch, bei dem mehr als eine Region der Komplementarität der Detektionsprobe besteht und mehrere zweite Proben mit ihr verkettet werden.Such a method is also particularly advantageous in which more than one region of the There is complementarity of the detection sample and several second samples with it be chained.

Weiterhin ist ein solches Verfahren vorteilhaft, bei dem die ersten Proben radioaktiv oder anderweitig, z. B. mit Biotin, Digoxigenin, colorimetrisch nachzuweisenden Produkten eines angekoppelten Enzyms, oder mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind.Furthermore, such a method is advantageous in which the first samples are radioactive or otherwise, e.g. B. with biotin, digoxigenin, colorimetrically detectable products of a coupled enzyme, or labeled with fluorescent dyes.

Besonders vorteilhaft ist auch ein solches Verfahren, bei dem mehrere Meßproben verwendet werden, die nebeneinander auf der nachzuweisenden Nucleinsäure hybridisieren.Such a method is also particularly advantageous, in which several measurement samples used next to each other on the nucleic acid to be detected hybridize.

Ganz besonders vorteilhaft ist ein solches Verfahren, bei dem die Meßproben aus Oligonucleotiden bestehen.Such a method is particularly advantageous, in which the measurement samples are Oligonucleotides exist.

Darüberhinaus vorteilhaft ist ein solches Verfahren, bei dem die Meßproben aus freien Nucleotiden bestehen.Such a method is also advantageous, in which the test samples are free Nucleotides exist.

Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung eines solchen Verfahrens zur Bestimmung von Microsatelliten oder SSLPs auf ihre Länge hin, d. h. auf die Anzahl ihrer konstituierenden Repeat-Einheiten.The invention further relates to the use of such a method for Determination of microsatellites or SSLPs along their length, d. H. on the number of their constituent repeat units.

Besonders vorteilhaft ist hierbei die Verwendung eines solchen Verfahrens zur gleichzeitigen Amplifikation einer Reihe von Microsatellites in einem Reaktionsansatz (Multiplexing), welcher dann auf spezifische Markerallele untersucht werden kann.The use of such a method for simultaneous is particularly advantageous Amplification of a number of microsatellites in a reaction approach (multiplexing), which can then be examined for specific marker alleles.

Besonders vorteilhaft ist dabei die Verwendung eines solchen Verfahrens, bei dem alle Ansätze und Manipulationen automatisiert sind.The use of such a method, in which all Approaches and manipulations are automated.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein solches Verfahren, bei dem Kits verwendet werden, die eine oder mehrere Komponenten des hier vorgestellten Verfahrens beinhalten.The invention further relates to such a method in which kits are used which contain one or more components of the method presented here.

Ganz besonders vorteilhaft ist ein solches Verfahren, bei dem Kits verwendet werden und ein oder mehrere der Komponenten getrocknet vorliegen.Such a method, in which kits are used, is very particularly advantageous one or more of the components are dry.

Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung eines solchen Verfahrens zum Nachweis genetischen Materials von Microorganismen, z. B. von Krankheitserregern. The invention also relates to the use of such a method for Detection of genetic material from microorganisms, e.g. B. pathogens.

Besonders vorteilhaft ist ein solches Verfahren, bei dem Kits verwendet werden, die komplexe biologische Materialien auf das Vorhandensein einer Reihe von Microorganismen testen.Such a method, in which kits are used, is particularly advantageous complex biological materials on the presence of a number of Test microorganisms.

Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung eines solchen Verfahrens für forensische Zwecke, z. B. bei der Bestimmung einer Reihe von polymorphischen Markern. Gegenstand der Erfindung ist darüberhinaus die Verwendung eines solchen Verfahrens für phylogenetische Untersuchungen, um die Herkunft oder Verwandtschaftsbeziehungen der Quellen des genetischen Materials zu bestimmen, z. B. in der Lebensmittelchemie zur Bestimmung der Herkunft von Fleischprodukten oder in der anthropologischen Forschung. Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung eines solchen Verfahrens zur spezifischen Quantifizierung von Nucleinsäuren, z. B. in der gentechnischen Forschung oder in der klinischen Diagnostik zur Bestimmung von Tumormarkern, antigenen Determinanten und anderen.The invention also relates to the use of such a method for forensic purposes, e.g. B. in the determination of a number of polymorphic markers. The invention also relates to the use of such a method for phylogenetic studies to determine the origin or relationship of the Determine sources of genetic material, e.g. B. in food chemistry Determination of the origin of meat products or in anthropological research. The invention further relates to the use of such a method for specific quantification of nucleic acids, e.g. B. in genetic engineering research or in clinical diagnostics for the determination of tumor markers, antigens Determinants and others.

Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung, schränken diese aber nicht ein.The following examples serve to illustrate the invention but do not limit it on.

Es zeigt Zeichnung 1 den sequenzspezifischen Nachweis einer Nucleinsäure.Drawing 1 shows the sequence-specific detection of a nucleic acid.

Es zeigt Zeichnung 2 die Messung der Anzahl der Repeat-Einheiten eines Microsatellite- Markers. Dabei sind
Drawing 2 shows the measurement of the number of repeat units of a microsatellite marker. Are there

1. first samples. They are ligated together. Measurement samples have complementarity too the nucleic acid to be detected. Different measurement samples are in parallel Approaches used Detection samples are complementary to the one to be detected Nucleic acid and second samples.
2. second sample. In one section it is complementary to the detection sample. she is here immobilized on a microtiter plate.
3. Nucleic acid to be detected.

Nachfolgend seien einige Begriffe näher definiert.Some terms are defined in more detail below.

used abbreviations

PCR polymerase chain reaction
DNA Desoxyribonucleinsäure
RNA Ribonucleinsäure
cpm counts per minutePCR polymerase chain reaction
DNA deoxyribonucleic acid
RNA ribonucleic acid
cpm counts per minute

Der Begriff "Nucleinsäuren" bezieht sich hier auf alle Arten von Nucleinsäuren, sei es DNA (Desoxyribonucleinsäure) oder RNA (Ribonucleinsäure). Der Begriff "Probe" bezeichnet Nucleinsäuren, die zum Nachweis anderer, zu messender Nucleinsäuren, der zu analysierenden Stoffmenge zugesetzt werden. Die "erste" Gruppe von Proben besteht aus "Meß-" und "Detektionsproben" und bezeichnet die Proben, die potentiell durch Ringschluß Teil des Probenmoleküls werden, das mit der zu messenden und außerdem mit der oder den "zweiten" Proben hybridisiert. Detektionsprobe bezeichnet die erste Probe, die eine Region der Komplementarität zu der zweiten Probe besitzt und den zu untersuchenden Abschnitt mit ihrem 5'- und 3'-Ende auf der zu messenden Nucleinsäure durch Hybridisierung einrahmt. Meßprobe bezeichnet der oder die Proben, die diesen eingerahmten Abschnitt durch Hybridisierung mit der nachzuweisenden Nucleinsäure ausfüllen. Erste Proben können Markermoleküle besitzen, die der Detektion dienen. Zweite Proben besitzen Regionen von Komplementarität mit der Detektionsprobe und sind entweder von vornherein zirkulär oder so mit einer Matrix vernetzt, daß die Abschnitte die die Region der Komplementarität mit der Detektionsprobe einschließen, nach den Seiten hin nicht mehr passierbar sind oder sie werden während des Versuches zirkularisiert. Nicht zirkularisierte erste Proben können durch Waschen unter stringenten Bedingungen von der zweiten, zirkulären Probe abgetrennt werden und ermöglichen so eine hohe Spezifität der Detektion. The term "nucleic acids" here refers to all types of nucleic acids, be it DNA (deoxyribonucleic acid) or RNA (ribonucleic acid). The term "sample" denotes nucleic acids that are used to detect other nucleic acids to be measured Analyzing amount of substance can be added. The "first" group of samples consists of "Measurement" and "detection samples" and refers to the samples that are potentially Ring closure become part of the sample molecule, which with the to be measured and also with the "second" sample hybridizes. Detection sample denotes the first sample, the has a region of complementarity to the second sample and that to examining section with its 5 'and 3' end on the nucleic acid to be measured framed by hybridization. Measurement sample means the sample or samples that this framed section by hybridization with the nucleic acid to be detected to complete. The first samples can have marker molecules that are used for detection. Second Samples have and are regions of complementarity with the detection sample either circular from the outset or networked with a matrix so that the sections are include the region of complementarity with the detection sample, according to the pages are no longer passable or they are circularized during the attempt. Not circularized first samples can be obtained by washing under stringent conditions from the second, circular sample are separated and thus allow a high specificity of the Detection.

example 1 Length measurement of microsatellite-repeat units

Genetische Analyseverfahren erfordern oft die Bestimmung polymorpher Marker. Diese sind meist Abschnitte der genomischen Erbsubstanz, die aus sich wiederholenden Einheiten von untereinander ähnlich beschaffenen DNA-Sequenzen bestehen. Eine der am häufigsten analysierten Repeats sind Microsatellites, die oft aus der sich mehrmals wiederholenden Dinucleotidsequenz (CA) bestehen. Weiterhin kommen tri- und tetranucleotid-repeats vor. Durch ihr Vorkommen im Genom vieler Organismen und ihren hohen Grad an Polymorphismus sind sie heute die am häufigsten verwendeten Marker zu Untersuchungen zur Vererbung bestimmter Allele und ihrer Assoziationen mit einem Phänotyp, da einzelne Allele voneinander unterschieden werden können. Diese. Untersuchungen werden auch in der Forensik angewandt, wo mehrere Marker zusam mengenommen eine Identifizierung der Herkunft des genetischen Materials mit hoher Wahrscheinlichkeit zulassen. Die repeats werden hierzu meist mit flankierenden Oligonucleotidprimern in der polymerase chain reaction amplifiziert und ihre Anzahl, d. h. die Länge der Amplifikationsprodukte, in Polyacrylamidgelen electrophoretisch gemessen. Diese Längenbestimmung erfordert eine große Anzahl von Arbeitsschritten und die Verwendung von teilweise toxischen Markierungsstoffen, wie z. B. radioactiver Nuclide oder fluorescenter Farben wie Ethidiumbromid.Genetic analysis methods often require the determination of polymorphic markers. This are mostly sections of the genomic genetic material that consist of repeating Units of mutually similar DNA sequences exist. One of the most The most common repeats analyzed are microsatellites, which are often made up of several times repeating dinucleotide sequence (CA) exist. Furthermore come tri- and tetranucleotide repeats. Because of their presence in the genome of many organisms and their High levels of polymorphism make them the most commonly used markers today Studies on the inheritance of certain alleles and their associations with one Phenotype because individual alleles can be distinguished from one another. This. Investigations are also used in forensics, where several markers come together taken an identification of the origin of the genetic material with high Allow probability. The repeats are usually accompanied by flanking Oligonucleotide primers amplified in the polymerase chain reaction and their number, d. H. the length of the amplification products, measured electrophoretically in polyacrylamide gels. This length determination requires a large number of work steps and the Use of partially toxic markers, such as. B. radioactive nuclides or fluorescent colors such as ethidium bromide.

Durch die hier vorgestellte Erfindung wird es möglich, diese Längenmessung ohne Gelelectrophorese, in Lösung, mit weniger Arbeitsschritten und automatisierbar durchzuführen. Die Verwendung mehrerer erster Proben, so wie hier beschrieben, ermöglicht eine Längenbestimmung zu messender Nucleinsäuren, wenn der Versuchsansatz so gewählt wird, daß z. B. eine Detektionsprobe mit ihrem 5'- und 3'-Ende jeweils in den Regionen hybridisiert, die die Microsatellite-Repeat-Elemente flankieren. In der zu messenden Nucleinsäurenlösung wird ein bestimmter Microsatellite-Marker durch die spezifische Hybridisierung der Enden der Detektionsprobe und die Anzahl der Repeat- Einheiten, gemessen durch Meßproben, definiert. In mehreren parallelen Ansätzen werden die zweite, zirkuläre Probe die eine Region der Komplementarität zu der Detektionsprobe besitzt, die Detektionsprobe selbst, die zu messende Nucleinsäure und jeweils verschiedene Meßproben hybridisiert. Diese Meßproben entsprechen verschiedenen Längeneinheiten der zu messenden Repeats. In einem nicht-exklusiven Beispiel können somit in elf parallelen Ansätzen elf verschieden lange Microsatellite-repeats identifiziert werden.The invention presented here makes it possible to perform this length measurement without Gel electrophoresis, in solution, with fewer work steps and can be automated perform. Using multiple first samples as described here enables the length of the nucleic acids to be measured if the Experimental approach is chosen so that, for. B. a detection sample with its 5 'and 3' end hybridized in the regions flanking the microsatellite repeat elements. In A specific microsatellite marker is passed through the nucleic acid solution to be measured the specific hybridization of the ends of the detection sample and the number of repeat Units, measured by measurement samples, defined. Be in several parallel approaches the second, circular sample, the one region of complementarity to the detection sample owns the detection sample itself, the nucleic acid to be measured and each different measurement samples hybridized. These measurement samples correspond to different ones Length units of the repeats to be measured. In a non-exclusive example, you can thus eleven microsatellite repeats of different lengths identified in eleven parallel approaches become.

In diesem nicht-exclusiven Beispiel wurden zwei Nucleinsäuren und ihre antiparallelen Gegenstränge chemisch synthetisiert. Sie bestanden im sense-Strang aus einem zentralen Abschnitt von jeweils 14 und 16 (CA) Repeat-Einheiten und endständigen spezifischen Sequenzen einer Länge von jeweils 20 Nucleotiden. Die 5'-endständige spezifische Sequenz des sense-Stranges war hierbei 5' GTA CCG CTA ACG TTA CAT GT 3', und die 3'-endständige spezifische Sequenz des sense-Stranges war 5' CAG TAG GAC CGA TAT CCT AT 3'. Die antiparallelen Oligonucleotide waren jeweils vollkommen komplementär. Durch gegenseitiges Hybridisieren wurden die Oligonucleotide gleicher Länge in doppelsträngige DNA überführt. Diese beiden doppelsträngigen Nucleinsäuren repräsentierten die nachzuweisenden Microsatelliten mit zwei allelischen Ausprägungen und einem Längenunterschied von zwei Nucleotiden und deren flankierenden spezifischen Sequenzen. Meßproben wurden ebenfalls chemisch synthetisiert und bestanden aus phosphorylierten Oligonucleotiden verschiedener Länge. Sie unterschieden sich in der Anzahl der (CA) Repeat-Einheiten, die von 11 bis 21 reichte. Detektionsprobe war eine synthetisch hergestellte Nucleinsäure der Sequenz 5' CAG TAG GAC CGA TAT CCT AT (T)₄₀ CGG CCA GTG CCA AGC TTG CAT GCC TGC AGG TCG ACT CTA G (T)₄₀ GTA CCG CTA ACG TTA CAT GT 3', die mit γ-³²P-ATP (3000 Ci/mmol, DuPont) 5'- phosphoryliert wurde. Die zweite Probe bestand aus dem einsträngigen Plasmid M13mp18 (Boehringer Mannheim) und wurde biotinyliert. Das Plasmid wurde daraufhin an mit Streptavidin beschichtete Mikrotiterplatten (Pierce) gebunden. Um eine Hybridisierung des (GT)-stranges der nachzuweisenden Nucleinsäure, der Meß-, Detektions- und zweiten Proben zu erzielen, wurde in einzelnen Vertiefungen einer solchen plasmid-beschichteten Mikrotiterplatte ein equimolares Gemisch der beiden nachzuweisenden doppelsträngigen (CA)₁₄- und (CA)₁₆- Microsatelliten zu je 2 pmol angesetzt. Dazu wurde zugesetzt jeweils 4 pmol der markierten Detektionsprobe und in verschiedene Vertiefungen jeweils 8 pmol der Meßproben unterschiedlicher Länge (11 bis 21 Repeat-Einheiten). In Kontrollansätzen wurden nur (CA)₁₄ oder nur (CA)₁₆ oder ein Kontroll-Oligonucleotid mit nicht bestimmter Sequenz (N)₃₀ zugesetzt. Die Pufferlösung bestand aus 20 mM Tris-HCl (pH 8.3), 25 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 0.01% Triton X-100, und besaß ein Gesamtvolumen von 100 µl. In this non-exclusive example, two nucleic acids and their anti-parallel counter-strands were chemically synthesized. They consisted of a central section of 14 and 16 (CA) repeat units in the sense strand and terminal specific sequences each 20 nucleotides in length. The 5 'specific sequence of the sense strand was 5' GTA CCG CTA ACG TTA CAT GT 3 ', and the 3' specific sequence of the sense strand was 5 'CAG TAG GAC CGA TAT CCT AT 3'. The antiparallel oligonucleotides were completely complementary. The oligonucleotides of the same length were converted into double-stranded DNA by mutual hybridization. These two double-stranded nucleic acids represented the microsatellites to be detected with two allelic forms and a length difference of two nucleotides and their flanking specific sequences. Measurement samples were also chemically synthesized and consisted of phosphorylated oligonucleotides of various lengths. They differed in the number of (CA) repeat units, which ranged from 11 to 21. Detection sample was a synthetically produced nucleic acid of the sequence 5 'CAG TAG GAC CGA TAT CCT AT (T) ₄₀ CGG CCA GTG CCA AGC TTG CAT GCC TGC AGG TCG ACT CTA G (T) ₄₀ GTA CCG CTA ACG TTA CAT GT 3', the was 5'-phosphorylated with γ- ³² P-ATP (3000 Ci / mmol, DuPont). The second sample consisted of the single-stranded plasmid M13mp18 (Boehringer Mannheim) and was biotinylated. The plasmid was then bound to streptavidin-coated microtiter plates (Pierce). In order to hybridize the (GT) strand of the nucleic acid to be detected, the measurement, detection and second samples, an equimolar mixture of the two double-stranded (CA) ₁₄ - and (CA) to be detected was found in individual wells of such a plasmid-coated microtiter plate ) ₁₆ - Microsatellites set at 2 pmol each. For this purpose, 4 pmol of the marked detection sample was added and 8 pmol of the measurement samples of different lengths (11 to 21 repeat units) in different wells. In control batches, only (CA) ₁₄ or only (CA) ₁₆ or a control oligonucleotide with an unspecified sequence (N) _{30 were} added. The buffer solution consisted of 20 mM Tris-HCl (pH 8.3), 25 mM KCl, 10 mM MgCl ₂ , 0.01% Triton X-100, and had a total volume of 100 ul.

Nach Erhitzen des Ansatzes auf 90 Grad Celsius und abkühlen auf Raumtemperatur wurden 100 Einheiten T4 DNA Ligase (Boehringer Mannheim) zugegeben. Nach 20 Minuten wurde die Reaktion durch Erhitzen auf 90 Grad Celsius gestoppt und die Vertiefungen viermal mit 200 µl 0.2 N NaOH gewaschen. Zurückgehaltene Radioaktivität wurde bestimmt nach Fragmentierung der DNA mit HCl und in einem Scintillationszähler bestimmt Angegeben in Tabelle 1 sind die Mittelwerte zehn verschiedener Messungen. Sie zeigen, daß die nachzuweisenden Microsatellites mit entsprechenden Meßproben ermittelt werden können. Zeichnung 2 zeigt schematisch die Messung der Anzahl von Microsatellite Repeat-Einheiten mit dem hier vorgestellten Verfahren. Nur Meßproben korrekter Länge können so hybridisieren, daß eine effiziente Ligation mit der Detektionsprobe eintreten kann. After heating the batch to 90 degrees Celsius and cooling to room temperature 100 units of T4 DNA ligase (Boehringer Mannheim) were added. After 20 The reaction was stopped by heating to 90 degrees Celsius and the minutes Wells washed four times with 200 µl 0.2 N NaOH. Withheld radioactivity was determined after fragmentation of the DNA with HCl and in a scintillation counter determined Table 1 shows the mean values of ten different measurements. she show that the microsatellites to be detected are determined with appropriate measurement samples can be. Drawing 2 shows schematically the measurement of the number of microsatellite Repeat units using the procedure presented here. Only measuring samples of the correct length can hybridize in such a way that efficient ligation with the detection sample occurs can.

Tabelle 1: Längenbestimmung von Microsatellites Table 1: Length determination of microsatellites

Example 2 Specific detection and quantification of nucleic acids to be measured

Viele Versuche in der Forschung und Diagnostik erfordern den Nachweis des Vorhandenseins einer bestimmten Nucleinsäure. Nicht-exclusive Beispiele dafür sind der Nachweis einer mutierten Sequenz, z. B. bei chromosomalen Rearrangements, bei Genmutationen, beim Tumormarkernachweis, in der klinischen Genetik zur Erkennung von Aneuploidien, zum Nachweis des genetischen Materials von Microorganismen, in der Forensik, in der Gentechnik und andere. Dabei kommt es oft darauf an nicht nur eine allgemeine Quantifizierung durchführen zu können, sondern eine spezifische Nucleinsäure in einem Stoffgemisch mengenmäßig nachzuweisen, d. h. nur die Nucleinsäure zu messen, die von Interesse ist, ohne die Nucleinsäuren zu messen die eine unterschiedliche Sequenz aufweisen und somit als Background in der zu untersuchenden Nucleinsäurenlösung vorhanden sind. Für komplexe Stoffmengen ist der spectrophotometrische Nachweis oder durch gelelectrophoretische Verfahren nicht geeignet. Eine direkte Sequenzierung dieser Gemische ist ebenfalls nicht möglich. Eine Längenmessungsapproximation durch Gelelectrophorese vermittelt nur Informationen hinsichtlich der Masse der Nucleinsäuren, aber ermöglicht keine Aussage über die spezifische Sequenz. In einem nicht-exklusiven Beispiel ist es mit dem hier vorgestellten Verfahren möglich, das Vorhandensein z. B. einer viralen Nucleinsäure in einem komplexen Gemisch das auch andere Nucleinsäuren enthält, wie z. B. die des Wirtsorganismus, spezifisch nachzuweisen und zu quantifizieren. Durch Verwendung von parallelen Ansätzen mit definierten Mengen und Mengenverhältnissen untereinander von nachzuweisenden Nucleinsäuren im Sinne der Erzeugung von Standardkurven ist es dabei möglich, eine spezifische Quantifizierung der nachzuweisenden Nucleinsäuren auch in komplexen Stoffgemischen vorzunehmen. In einem weiteren nicht-exklusiven Beispiel können Abschnitte auf Nucleinsäuren mit dieser Methode auf ihre Sequenz hin untersucht werden, so z. B. in der Mutationsanalyse. Many attempts in research and diagnostics require proof of Presence of a particular nucleic acid. Non-exclusive examples of this are the Detection of a mutated sequence, e.g. B. in chromosomal rearrangements Gene mutations, in tumor marker detection, in clinical genetics for recognition of aneuploidies, for the detection of the genetic material of microorganisms, in the Forensics, genetic engineering and others. Often it is not just a question of one general quantification, but a specific nucleic acid to be quantified in a mixture of substances, d. H. just measure the nucleic acid that is of interest without measuring the nucleic acids that have a different sequence have and thus as a background in the nucleic acid solution to be examined available. For complex quantities of substances, spectrophotometric detection is or not suitable due to gel electrophoretic methods. Direct sequencing of these Mixtures are also not possible. A length measurement approximation Gel electrophoresis only provides information regarding the mass of nucleic acids, but does not allow a statement about the specific sequence. In a non-exclusive Example, it is possible with the method presented here to check the presence of e.g. B. one viral nucleic acid in a complex mixture that also contains other nucleic acids, such as B. that of the host organism, specifically to detect and quantify. By Use of parallel approaches with defined quantities and quantitative ratios with each other of the nucleic acids to be detected in the sense of the generation of Standard curves allow a specific quantification of the nucleic acids to be detected also in complex mixtures. In Another non-exclusive example may include sections on nucleic acids with this Method to be examined for their sequence, such. B. in mutation analysis.

Example 3 Experimental setups in which the nucleic acid to be measured is an amplified molecule is

In weiteren bevorzugten Anwendungen der hier veröffentlichten Methode sind die zu messenden Nucleinsäuren Amplifikationsprodukte, die in einem vorangegangenen Arbeitsschritt bereitgestellt werden und die Konzentration der spezifischen zu messenden Nucleinsäuren erhöhen. Die Amplifikation kann hierbei z. B. durch die polymerase chain reaction (siehe hierzu US Patentschrift Nr. 4683202) oder durch strand displacement amplification erfolgen (siehe hierzu die relevanten Patentschriften). Mehrere verschiedene Amplifikationsprodukte können dabei in einer einzigen Stoffmenge vorhanden sein und spezifisch nachgewiesen werden. Zeichnung 1 zeigt schematisch, stellvertretend aber nicht einschränkend für andere Anwendungen, den Nachweis einer spezifischen Nucleinsäure. Spezifische Meßproben für diese nachzuweisenden Nucleinsäuren werden in parallelen Ansätzen hybridisiert. Die nachzuweisende Nucleinsäure kann hier z. B. ein PCR-Produkt sein, das mit Erreger- oder Erregerfamilien-spezifischen Primern amplifiziert wurde.In other preferred applications of the method published here, these are too measuring nucleic acid amplification products described in a previous Work step are provided and the concentration of the specific to be measured Increase nucleic acids. The amplification can z. B. by the polymerase chain reaction (see US Pat. No. 4683202) or by strand displacement amplification take place (see the relevant patents). Several different ones Amplification products can be present in a single amount and be specifically proven. Drawing 1 shows schematically, but not representative limiting for other applications, the detection of a specific nucleic acid. Specific test samples for these nucleic acids to be detected are in parallel Approaches hybridized. The nucleic acid to be detected can, for. B. a PCR product be that was amplified with pathogen or pathogen family-specific primers.

In einem nicht-exklusiven Beispiel ist es denkbar, einen Kit bereitzustellen, der es ermöglicht, nach Amplifikation innerhalb eines einzigen Probengefäßes mit Primern, die spezifisch für eine ganze Reihe von Krankheitserregern sind (Multiplexing), dieses Stoffgemisch bestehend aus Amplifikationsprodukten in mehreren parallelen Versuchsansätzen gleichzeitig auf das Vorhandensein spezifischer Amplifikationsprodukte zu untersuchen. In anderen Beispielen könnten größere Abschnitte von Nucleinsäuren durch teilweise überlappende Amplifikationsprodukte so analysiert werden, daß ganze Gene in einem Arbeitsgang auf Sequenzpolymorphismen oder Mutationen hin untersucht werden könnten.In a non-exclusive example, it is conceivable to provide a kit that enables after Amplification within a single sample tube with primers specific for one A whole range of pathogens are (multiplexing), this mixture of substances from amplification products in several parallel test batches simultaneously on the Examine the presence of specific amplification products. In other examples could larger sections of nucleic acids by partially overlapping Amplification products are analyzed in such a way that whole genes are found in one step Sequence polymorphisms or mutations could be examined.

Stellvertretend, aber nicht ausschließlich, wurde eine Bestimmung der Herkunft von Fischfleisch anhand der Sequenzunterschiede im Cytochrom b-Gen vorgenommen. DNA wurde isoliert aus verschiedenen konservierten, frischen oder gefrorenen Fleischproben. Mit den Oligonucleotidprimern der Sequenz 5' GCT GGT ACC TCT ACA AAG AAA CAT GAA ACA 3', und 5' AAA CTG CAG CCC CTC AGA ATG ATA TTT GTC CTC A 3' wurde mit der PCR ein 123 Basenpaare langes Fragment der mitochondrialen DNA von Fleisch verschiedener Herkunft amplifiziert (Unseld, M. et al.: PCR Methods and Applications 4: 241-243, 1995) und nach Phenol- und Phenol/Chloroformextraktion und Präzipitation in Ethanol in Hybridisationspuffer (siehe Beispiel 1) aufgenommen. Die phosphorylierte Detektionsprobe besaß die Sequenz 5' T GAG GAC AAA TAT CAT TCT GAG GGG CTG CAG TTT (T)₅₀ CGG CCA GTG CCA AGC TTG CAT GCC TGC AGG TCG ACT CTA G (T)₅₀ GCT GGT ACC TCT ACA AAG AAA CAT GAA ACA 3'. Stellvertretend für andere wurde ein Versuchsansatz entwickelt, um die Spezies Euthynnus affinis, Euthynnus alleteratus und Auxis thazard spezifisch nachzuweisen. Für Euthynnus affinis wurde einem Set bestehend aus den phosphorylierten Meßproben 5' TCG GTG TAG TAC 3', 5' TAC TAC TTC TAG TGA 3', 5' TGA TAA CTG CCT TCG TAG 3' und 5' GCT ACG TAC TCC CC 3' verwendet. Für Euthynnus alleteratus wurde ein Set bestehend aus den phosphorylierten Meßproben 5' TTG GCG TAG TCC 3', 5' TAC TCC TCC TAG TAA 3', 5' TGA TAA CCG CCT TCG TCG 3' und 5' GGT ACG TAC TCC CC 3' verwendet. Für Auxis thazard wurde ein Set bestehend aus den phosphorylierten Meßproben 5' TTG GCG TAG TTC 3', 5' TTC TAC TGC TAG TCA 3', 5' TGA TGA CTG CAT TCG TCG 3' und 5' GCT ACG TAC TTC CA 3' verwendet. In verschiedenen Vertiefungen einer mit dem Plasmid M13mp18 beschichteten Mikrotitrationsplatte (siehe Beispiel 1) von 2 pmol PCR-Fragment, 4 mol radioaktiv markierter Detektionsprobe und ein Set bestehend aus jeweils 8 pmol der phosphorylierten Meßproben wurden Hybridisierungen vorgenommen. Das Gesamtvolumen betrug 100 µl und bestand aus dem in Beispiel 1 erwähnten Hybridisierungspuffer. Der Ansatz wurde auf 90 Grad Celsius erhitzt, und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Nach Zusatz von 100 Einheiten T4 DNA Ligase wurde der Ansatz für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und dann durch erneutes Erhitzen das Enzym inaktiviert. Die Vertiefungen der Mikrotiterplatte wurden anschließend fünf Mal mit 0.2 N NaOH gewaschen und dann mit 0.1 N HCl für 2 Stunden inkubiert. Die Lösung wurde in Scintillationsprobengefäße überführt und die Radioaktivität bestimmt. Die Messungen ergaben, daß dieser Versuchsansatz im Rahmen der hier veröffentlichten neuen Verfahren und Anwendungen dazu geeignet ist, die drei Spezies spezifisch nachzuweisen (siehe Tabelle 2). Dieser Ansatz läßt sich abgewandelt beliebig auf andere Organismen und taxonomische Gruppen erweitern. In diesem nicht- exklusiven Beispiel wurden die Spezies Euthynnus affinis dreimal. Euthynnus alleteratus einmal und Auxis thazard dreimal nachgewiesen. In zwei Fällen lag ein Gemisch von Euthynnus affinis und Auxis thazard vor. Representatively, but not exclusively, the origin of fish meat was determined on the basis of the sequence differences in the cytochrome b gene. DNA was isolated from various preserved, fresh or frozen meat samples. With the oligonucleotide primers of the sequence 5 'GCT GGT ACC TCT ACA AAG AAA CAT GAA ACA 3', and 5 'AAA CTG CAG CCC CTC AGA ATG ATA TTT GTC CTC A 3', a 123 base pair long fragment of the mitochondrial DNA from Meat of various origins amplified (Unseld, M. et al .: PCR Methods and Applications 4: 241-243, 1995) and after phenol and phenol / chloroform extraction and precipitation in ethanol taken up in hybridization buffer (see Example 1). The phosphorylated detection sample had the sequence 5 'T GAG GAC AAA TAT CAT TCT GAG GGG CTG CAG TTT (T) ₅₀ CGG CCA GTG CCA AGC TTG CAT GCC TGC AGG TCG ACT CTA G (T) ₅₀ GCT GGT ACC TCT ACA AAG AAA CAT GAA ACA 3 '. Representative of others, an experimental approach was developed to specifically detect the species Euthynnus affinis, Euthynnus alleteratus and Auxis thazard. For Euthynnus affinis a set consisting of the phosphorylated test samples 5 'TCG GTG TAG TAC 3', 5 'TAC TAC TTC TAG TGA 3', 5 'TGA TAA CTG CCT TCG TAG 3' and 5 'GCT ACG TAC TCC CC 3'' used. For Euthynnus alleteratus, a set consisting of the phosphorylated measurement samples 5 'TTG GCG TAG TCC 3', 5 'TAC TCC TCC TAG TAA 3', 5 'TGA TAA CCG CCT TCG TCG 3' and 5 'GGT ACG TAC TCC CC 3'' used. For Auxis thazard a set consisting of the phosphorylated samples 5 'TTG GCG TAG TTC 3', 5 'TTC TAC TGC TAG TCA 3', 5 'TGA TGA CTG CAT TCG TCG 3' and 5 'GCT ACG TAC TTC CA 3' used. Hybridizations were carried out in different wells of a microtitration plate (see Example 1) coated with the plasmid M13mp18 (see Example 1) of 2 pmol PCR fragment, 4 mol radioactive labeled detection sample and a set consisting of 8 pmol each of the phosphorylated measurement samples. The total volume was 100 ul and consisted of the hybridization buffer mentioned in Example 1. The batch was heated to 90 degrees Celsius and then cooled to room temperature. After adding 100 units of T4 DNA ligase, the mixture was incubated for 30 minutes at room temperature and then the enzyme was inactivated by heating again. The wells of the microtiter plate were then washed five times with 0.2 N NaOH and then incubated with 0.1 N HCl for 2 hours. The solution was transferred to scintillation vials and radioactivity determined. The measurements showed that this experimental approach is suitable, within the framework of the new methods and applications published here, for specifically detecting the three species (see Table 2). This approach can be modified to extend it to other organisms and taxonomic groups. In this non-exclusive example, the species Euthynnus affinis were found three times. Euthynnus alleteratus detected once and auxis thazard three times. In two cases there was a mixture of Euthynnus affinis and Auxis thazard.

Tabelle 2: Spezies-spezifischer Nachweis von Euthynnus affinis, Euthynnus alleteratus und Auxis thazard aus Fischfleisch. Table 2: Species-specific detection of Euthynnus affinis, Euthynnus alleteratus and Auxis thazard from fish meat.

Claims

1. A method for the detection of nucleic acids in aqueous solution, characterized in that with the aid of a sample liquid containing a nucleic acid to be detected, a first group of sample molecules is hybridized and ligated such that they close a ring and are linked to a second group of sample molecules, not circularized Separates sample molecules and detects the reaction product.

2. The method according to claim 1, characterized in that the first group of sample molecules from one or more measurement samples and one or several detection samples.

3. The method according to claim 2, characterized in that the 5 'and the 3' end of the detection sample with the nucleic acid to be detected is complementary and has a central area on the nucleic acid to be detected framed that of the measurement samples after hybridization with the one to be detected Nucleic acid is filled in such a way that the ends can be ligated together, and that the detection sample is a region of complementarity to at least one second group of sample molecules.

4. The method according to any one of claims 2 to 3, characterized in that examine the measurement samples from free oligonucleotides.

5. The method according to any one of claims 2 to 3, characterized in that the measurement samples consist of free nucleotides.

6. The method according to any one of claims 6 to 5, characterized in that multiple measurement samples are used, side by side on the one to be detected Hybridize nucleic acid.