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DE10337368A1 - Verfahren und Mittel zur Diagnose und Behandlung von Pankreastumoren - Google Patents

Verfahren und Mittel zur Diagnose und Behandlung von Pankreastumoren Download PDF

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DE10337368A1
DE10337368A1 DE2003137368 DE10337368A DE10337368A1 DE 10337368 A1 DE10337368 A1 DE 10337368A1 DE 2003137368 DE2003137368 DE 2003137368 DE 10337368 A DE10337368 A DE 10337368A DE 10337368 A1 DE10337368 A1 DE 10337368A1
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adam9
expression
antibody
diagnosis
specific
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English (en)
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Jutta Dr. Lüttges
Bence Dr. Sipos
Günther Prof. Dr. Klöppel
Robert Dr. Grützmann
Christian Dr. Pilarsky
Hans Detlev Prof. Dr. Saeger
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Technische Universitaet Dresden
Original Assignee
Technische Universitaet Dresden
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Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren und Mittel zur Diagnose und Behandlung von Pankreastumoren, insbesondere zur differentiellen Prognose des Duktalen Adenokarzinom des Pankreas (PDAC). Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Medizin, insbesondere die Radiologie und die Onkologie. DOLLAR A Überraschend wurde gefunden, dass in 98,3% der Duktalen Pankreaskarzinome (PDAC) das ADAM9-Protein überexprimiert wird. Dadurch eignet sich ADAM9 als Target für die Diagnose und Behandlung von PDAC. DOLLAR A Die Erfindung gibt ein Verfahren zur Diagnose von Tumoren des Pankreas, bei dem in Gewebe- oder Zellproben des Pankreas die ADAM9-Proteinexpression bestimmt wird, an. Dabei werden isolierte Pankreaszellen oder Gewebeschnitten mit ADAM9-spezifischen Antikörpern inkubiert und unter einem Mikroskop auf Binden des ADAM9-spezifischen Antikörpers analysiert. Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung von ADAM9-spezifischen Antikörpern und Nukleinsäuren zur Diagnose und/oder Behandlung von Pankreastumoren.

Description

  • Die Erfindung betrifft Verfahren und Mittel zur Diagnose und Behandlung von Pankreastumoren, insbesondere zur differentiellen Prognose des Duktalen Adenokarzinom des Pankreas (PDAC). Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Medizin, insbesondere die Radiologie und die Onkologie. PDAC ist der häufigste Tumor der Bauchspeicheldrüse (Pankreas) und die 5. häufigste Ursache für Krebstod in den USA. Patienten mit diesem Tumor haben sehr schlechte Überlebenschancen.
  • Die histologische Differentialdiagnose von Pankreastumoren ist oft schwierig. Es existieren verschiedene in der pathologischen Routine angewendete Antikörper (z. B. gegen Zytokeratin 18), mit welchen aber nicht immer eine Prognose zum Krankheitsverlauf möglich ist. Bei der Untersuchung von Absiedelungen (Metastasen) von verschiedenen Karzinomen des Pankreas, der Gallenwege und der Gallenblase, wie auch der Papilla vateri ist meist die histologische Zuordnung zum Primärtumor nicht möglich. Eine Zuordnung dieser Metastasen zum Primärtumor ist zur Wahl einer angepassten palliativen Chemotherapie wichtig.
  • Für die Früherkennung, die laborchemische Differentialdiagnose von Pankreastumoren zu anderen Bauchspeicheldrüsenerkrankungen und der Verlaufskontrolle nach Operation gibt es bisher nur einen Marker, das CA19-9. Dieser im Blut zu bestimmende Tumormarker ist allerdings nicht sehr spezifisch und sensitiv, d.h. es gibt Patienten mit chronischer Pankreatitis (Bauchspeicheldrüsenentzündung), welche einen stark erhöhten Ca19-9 Wert haben und Patienten mit normalem Ca19-9, welche einen Pankreastumor haben.
  • Die Behandlung des Duktalen Pankreaskarzinoms ist derzeit auf die Operation und Chemotherapie begrenzt. Die Operative Entfernung des Tumors bietet als einzige Option eine Heilungschance. Die Chemotherapie mit dem meist eingesetzten Chemotherapeutikum bietet nur in wenigen Fällen eine Lebensverbesserung, aber keine Heilung.
  • Aufgabe der Erfindung ist daher Mittel und Verfahren zur Diagnose und Behandlung von Pankreastumoren, insbesondere zur differentiellen Prognose des Duktalen Adenokarzinom des Pankreas (PDAC), bereitzustellen.
  • Erfindungemäß wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Diagnose von Tumoren des Pankreas, insbesondere zur Diagnose des Duktalen Adenokarzinom des Pankreas (PDAC), bei dem in Gewebe- oder Zellproben der Pankreas die ADAM9-Proteinexpression bestimmt wird. Dazu werden isolierte Pankreaszellen oder Gewebeschnitte mit ADAM9-spezifischen Antikörpern inkubiert und unter einem Mikroskop auf Binden des ADAM9-spezifischen Antikörpers analysiert.
  • Die Auswertung der ADAM9-Bindung unter dem Mikroskop erfolgt vorzugsweise mit automatisierten Bilderkennungsverfahren.
  • ADAM9 stellt ein Membranprotein dar, welches eine Rolle im proteolytischen Prozessieren von Membran-gebunden Prekursormolekülen und im Modulieren von Zell-Zell- und Zell-Matrix-Wechselwirkungen spielt (Nath D et al., J Cell Sci. 2000 Jun; 113: S. 2319-2328). Der Name ADAM9 leitet sich davon ab, dass ADAM9 eine Disintegrin- und eine Metalloprotease-Domain enthält („A DISINTEGRIN AND METALLOPROTEINASE DOMAIN 9"). Die Proteinsequenz des ADAM9, gemäß SEQ-ID-Nr. 27, ist bekannt (Sequenzeintrag NP_003807.1, Genbank, NCBI, Bethesda, USA).
  • Überraschend wurde gefunden, dass in 98,3 % der Duktalen Pankreaskarzinome (PDAC) das ADAM9 Protein überexprimiert wird. Dadurch eignet sich ADAM9 als Target für die Diagnose von PDAC.
  • Dabei wurde weiter überraschend gefunden, dass in unterschiedlichen Tumoren das ADAM9 Protein in unterschiedlichen zellulären Kompartimenten des Pankreasgewebe exprimiert wird.
  • Mikroskopisch kann zwischen einer ADAM9-Proteinexpression auf der Zellmembran und im Cytoplasma unterscheiden werden. Bei der Expression auf der Zellmembran kann weiter eine Expression auf der apikalen und der basolateralen Seite der Pankreaszellen differenziert werden.
  • Nahezu alle untersuchten PDAC zeigen eine apikale ADAM9-Proteinexpression. Überraschend wurde gefunden, dass circa 50 % der PDAC das ADAM9-Protein zusätzlich an der basolateralen Membran und circa 30 % zusätzlich im Cytoplasma exprimieren.
  • Weiter überraschend wurde gefunden, dass Patienten mit entweder einer cytoplasmatischer oder basolateraler ADAM9-Proteinexpression im Pankreasgewebe eine deutlich kürzere mittlere Überlebenszeit haben, als Patienten die keine oder eine ausschließlich apikale ADAM9-Proteinexpression im Pankreas zeigen.
  • Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird es basierend auf der Lokalisation der ADAM9-Proteinexpression im Tumor die Patienten mit PDAC in wenigstens zwei Gruppen (Gruppe 1: keine oder ausschließlich apikale ADAM9-Proteinexpression; Gruppe 2: cytoplasmatische oder basolaterale ADAM9-Proteinexpression) einzuteilen. Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird es möglich für diese Gruppen eine unterschiedliche Prognose über den klinischen Verlauf des PDAC, eine Abschätzung der Überlebenszeit zu erstellen. Darüber hinaus können für diese Gruppen angepasste Behandlungsschemen angefertigt werden.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Erfindungsgemäßen Verfahrens wird daher bei der Analyse der ADAM9-Proteinexpression die Lokalisation des ADAM9-Proteins in der Zelle bestimmt wird und unterschieden wird zwischen apikaler, basolateraler und cytoplasmatischer Expression des ADAM9-Proteins.
  • Vorzugsweise wird als ADAM9-spezifischer Antikörper ein monoklonaler oder ein polyklonaler Antikörper gewählt.
  • Der Begriff Antikörper schließt dabei im Sinne dieser Beschreibung neben monoklonalen und polyklonalen Seren, Diabodies, Antikörperfragmente, wie Fab- und (Fab')2-, Single-Chain- (SCFv – Einzelketten-)-Fragmente mit ein.
  • Der ADAM9-spezifische Antikörper erkennt ein Epitop aus der ADAM9 Proteinsequenz gemäß SEQ-ID-Nr. 27, vorzugsweise eine extrazelluläre Domain des ADAM9-Proteins.
  • Vorzugsweise wird als ADAM9-spezifische Antikörper ein Antikörper aus folgender Gruppe gewählt: monoklonaler Maus anti-HumanADAM9 (AF949, R&D Systems, Wiesbaden oder 610750 Becton & Dickinson, Heidelberg), polyklonaler Kaninchen anti-HumanADAM9 (CL2ADAM9, Cedarlane, Ontario, Kanada oder SA-376, Biomol, Hamburg), polyklonaler Ziege antiHumanADAM9 (PC669, Novabiochem, Laufelfingen, Schweiz) oder polyklonaler Ziege anti-MausADAM9 (AF939, R&D Systems, Wiesbaden). Der polyklonale Ziege Anti-Maus ADAM9 AF939 erkennt auch das humane ADAM9.
  • In einer besonders bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt der Nachweis des ADAM9- spezifischen Antikörpers indirekt. Dazu wird die zu untersuchende Gewebeprobe zu erst mit einem unmarkierten ADAM9-spezifischen Antikörper, wie z. B. ein mit humanem ADAM9 crossreaktiver Ziege-anti-MausADAM9-Antikörper (R&D Systems, Wiesbaden, Katalog Nr. AF949) inkubiert.
  • Das binden dieses primären Antikörpers wird durch eine Inkubation mit einem speziesspezifischen sekundären Antikörper (z. B. einem biotinylierten anti-Ziegen-IgG Antikörper – erhältlich als fertiges Reagenziensystem bei Vector Laboratories) nachgewiesen. Da in diesem zweiten Schritt an einen primären Antikörper mehrere sekundäre Antikörper binden, wird das Signal vorteilhaft durch die Inkubation mit dem sekundären Antikörper verstärkt. Eine weitere Signalsverstärkung erfolgt vorzugsweise in einem dritten Schritt durch das Inkubieren mit tertiären Antikörpern oder Streptavidin/Avidin.
  • An den im letzten Inkubationsschritt verwendeten Antikörper oder Streptavidin/Avidin ein Marker gebunden, der es ermöglicht die Lokalisation der Antikörper zu detektieren.
  • In einer bevorzugten Variante ist dieser Marker ein Enzym, besonders vorzugsweise eine Luziferase, eine Peroxidase, wie z. B. die Peroxidase aus Meerrettich (horse radish), oder eine alkalische Phosphatase. Peroxidasen und Phosphatasen ermöglichen in bekannter Weise chromogene oder fluorogene Substrate zu Farbstoffen bzw. Fluoreszenzfarbstoffen umzusetzen. Diese Farbstoffe werden damit lokal, an den Stellen an den ursprünglich die ADAM9-spezifischen Antikörper gebunden haben, gebildet und ermöglichen eine Detektion mit bekannten mikroskopischen Methoden.
  • In einer alternativen Variante ist der Marker ein im Mikroskop detektierbarer Fluoreszenzfarbstoff, wie z. B. Fluorescein, oder auch ein fluoreszierendes Protein, wie z. B. das „Green Fluorescent Protein" (GFP).
  • In einer weiteren Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Marker direkt an den Primären ADAM9-spezifischen Antikörper gebunden. In dieser Variante erfolgt der Nachweis des ADAM9-spezifischen Antikörpers direkt durch die Detektion des markierten Antikörpers.
  • Um möglichst wenig Proben mikroskopisch untersuchen zu müssen wird in einer bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens vor der Analyse auf ADAM9-Proteinexpression eine Voranalyse durchgeführt wird, in der in Gewebe- oder Zellproben der Pankreas die ADAM9-Genexpression über die ADAM9-mRNA-Expression (Messenger-RNA) analysiert wird.
  • Nach dieser Voranalyse werden nur die Gewebe- oder Zellproben in denen eine ADAM9-mRNA-Expression nachgewiesen werden konnte, wie zuvor beschrieben auf eine ADAM9-Proteinexpression analysiert werden.
  • Die Analyse der ADAM9-mRNA-Expression in den Gewebe- oder Zellproben erfolgt vorzugsweise mittels den gängigen Methoden der RT-PCR und/oder Mikroarray-Analyse.
  • Für die Analyse mittels RT-PCR (Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion) wird dazu in die in den Gewebe- oder Zellproben vorhandene RNA mit unspezifischen Primern in cDNA (komplementäre DNA) umgeschrieben. Dabei wird, falls in den Proben eine ADAM9-mRNA vorhanden ist auch die entsprechende ADAM9-cDNA gebildet.
  • Diese ADAM9-cDNA wird in einer anschließenden PCR (Polymerasekettenreaktion) mit ADAM9-spezifischen Primern (d. h. Oligonukleotide die spezifisch mit der ADAM9-cDNA hybridisieren) vervielfältigt. Der Nachweis dieser spezifisch vervielfältigten ADAM9-cDNA erfolgt durch Verwendung von spezifischen Sonden bei der PCR (TagMan), oder durch Southernblot.
  • Für die Mikroarray-Analyse wird die in den Gewebe- oder Zellproben vorhandene RNA, oder eine durch eine RT-PCR erhaltene cDNA, mit Microarrays inkubiert, an die Oligonukleotide gebunden sind, die spezifisch mit der ADAM9-cDNA hybridisieren. Der Nachweis dieser spezifisch gebunden ADAM9-RNA oder cDNA erfolgt durch Einbau von Fluoreszenzfarbstoffen oder radioaktiven Markern in die RNA oder cDNA.
  • Vorzugsweise werden zur Analyse der ADAM9-mRNA-Expression (mittels RT-PCR oder Mikroarray-Analyse Oligonukleotide der SEQ-ID-Nr. 1 bis SEQ-ID-Nr. 11 verwendet. Diese Oligonukleotide, bevorzugt DNA-Oligonukleotide, hybridisieren spezifisch mit ADAM9-RNA und ADAM9-cDNA und können daher als Primer für die PCR und/oder Sonden (z. B. als TagMan-Sonden oder Southernblot) oder zur Herstellung eines Mikroarrays verwendet werden.
  • Ein Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung von ADAM9 spezifischen Antikörpern zur Diagnose und Behandlung von Pankreastumoren.
  • Bevorzugt werden dazu humanisierte oder humane monoklonale Antikörper (mAb) verwendet. Insbesondere bei einer wiederholten Behandlung, werden um eine unerwünschte Immunantwort zu vermeiden, Antikörper verwendet, deren invariablen Bereiche deletiert sind, z. B. F(ab')2-Fragmente oder scFv-Fragmente oder humanisiert, humanisierte mAb, sind.
  • Die Herstellung dieser F(ab')2-Fragmente oder scFv-Fragmente bzw. humanisierte mAb erfolgt nach gängigen Methoden (Roland Kontermann, Stefan Dübel, Antibody Engineering (Springer Lab Manuals) Springer Verlag Berlin).
  • Neben dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Diagnose von Pankreastumoren an isolierten Zellen oder Gewebe des Pankreas, werden die ADAM9-spezifischen Antikörpern erfindungsgemäß auch zur Diagnose von Pankreastumoren, Insbesondere PDAC, in vivo, d. h. im menschlichen Körper verwendet.
  • Dazu ist an den ADAM9-spezifischen Antikörper vorzugsweise ein Marker, bevorzugt ein radioaktives Isotop, wie Technetium-99 oder Iod-131, gebunden, der über die emittierte Strahlung die Darstellung in Tomographieverfahren oder Szintigraphieverfahren erlaubt.
  • Durch die Diagnose von Pankreastumoren, insbesondere PDAC, mit ADAM9-spezifischen Antikörpern im Körper von Patienten kann die Größe eines Pankreastumors bestimmt werden. Vorteilhaft können darüber hinaus eventuell vorhandene Tochtergeschwülste (Metastasen) lokalisiert werden. Die Bestimmung der Größe und das Vorhandensein von Tochtergeschwülsten eines Pankreastumors ist eine wichtige Voraussetzung, um die Patienten in Gruppen mit unterschiedlichen Behandlungsschemas einzuteilen.
  • Darüber hinaus ist die Lokalisation von Tochtergeschwülsten die Vorraussetzung dafür, dass diese operativ entfernt werden können.
  • Bei der Diagnose und Behandlung mit ADAM9-spezifischen Antikörpern wird ausgenützt, dass die Antikörper durch die ADAM9-Expression in PDAC, Pankreastumorzellen auch in vivo erkennen.
  • Die Verwendung von ADAM9 spezifischen Antikörper zur Behandlung von Pankreastumoren erfolgt vorzugsweise alleine oder in Kombination mit einer Chemotherapie geschehen (z. B. während einer gleichzeitigen Behandlung mit Gemcitabine).
  • Bei der Verwendung von ADAM9 spezifische Antikörper zur Behandlung von Pankreastumoren, ist vorzugsweise direkt an den Antikörper ein zelltötendes Agens gebunden.
  • Bevorzugt wird das zelltötende Agens aus der Gruppe der zelltötenden Radioisotope, wie Iod 131, Rhenium 186 oder besonders bevorzugt Yttrium 90. Alternativ wird das zelltötende Agens aus der Gruppe der chemischen, bevorzugt Anthracyline wie Daunorubicin (DNR) oder Doxorubicin (DOX) und deren Derivate (Rosik LO Bioconjug Chem. 1990 Jul-Aug; 1(4):251-6) oder aus der Gruppe der biologischen Toxine, wie vorzugsweise Pseudomonas Exotoxin A oder Diphtheria Toxin gewählt.
  • Durch das Binden des Antikörpers an die Tumorzellen wird das zelltötende Agens mit den abzutötenden Tumorzellen in Kontakt gebracht und tötet diese ab.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung von Nukleinsäuren oder Nukleinsäurederivate, die spezifisch an das ADAM9-Gen und/oder die ADAM9-mRNA binden, zur Behandlung von Pankreastumoren, insbesondere des PDAC. Durch das Binden an das ADAM9-Gen und/oder die ADAM9-mRNA können die Substanzen die ADAM9-Expression und damit das Wachstum von Pankreastumoren, insbesondere PDAC, unterdrücken.
  • Im Sinne dieser Beschreibung unter Nukleinsäuren und Nukleinsäurederivaten insbesondere folgende Moleküle zu verstehen: Desoxyribonukleinsäuren (DNA), Ribonukleinsäuren (RNA) und Peptid-Nukleinsäuren (PNA), sowie auch alle aus diesen Grundstrukturen ableitbaren Modifikationen wie z. B. Phosphothioate, Phosphoramidate, O-Methyl-Derivate und locked nucleic acids (LNA).
  • Die im beigefügten Sequenzprotokollen offenbarten Nukleinsäuresequenzen SEQ-ID-Nr. 1 bis SEQ-ID- Nr. 26 umfassen auch den Austausch der Basen gegen andere Basen die analoge Wasserstoffbrücken eingehen können, wie z. B. den Austausch von t (Thymidin) gegen U (Uracil). Die offenbarten Sequenzen SEQ-ID-Nr. 1 bis SEQ-ID-Nr. 26 umfassen auch Modifikationen des Nukleinsäurerückgrads, und schließen insbesondere DNA, RNA, PNA, sowie auch alle aus diesen Grundstrukturen ableitbaren Modifikationen wie z. B. Phosphothioate, Phosphoramidate, O-Methyl-Derivate und locked nucleic acids (LNA) mit ein.
  • Vorzugsweise werden zur Unterdrückung der ADAM9-Expression in Pankreastumoren Nukleinsäuren oder Nukleinsäurederivate mit den Basen-Sequenzen der SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ-ID-Nr. 26 einzeln oder gemischt verwendet. Diese Sequenzen und deren Gemische sind ebenfalls Gegenstand der Anmeldung.
  • Die Verwendung von Nukleinsäuren oder Nukleinsäurederivate, die spezifisch an das ADAM9-Gen und/oder die ADAM9-mRNA binden, zur Behandlung von Pankreastumoren erfolgt vorzugsweise alleine oder in Kombination mit einer Chemotherapie geschehen (z. B. während einer gleichzeitigen Behandlung mit Gemcitabine).
  • Anhand der nachfolgenden Ausführungsbeispiele wird die Erfindung näher erläutert:
  • Ausführungsbeispiel 1: Immunhistochemie zum Nachweis der ADAM9-Proteinexpression in Pankreastumoren:
  • 1 zeigt die Ergebnisse einer immunohistochemischen Analyse der ADAM9-Proteinexpression in Pankreasgewebeschnitten. Zur Herstellung dieser Schnitte wird Pankreasgewebe in einem operativen Eingriff entnommen und zur Fixierung in gepuffertem 4% Formalin eingelegt. Nach der Fixierung wird das Gewebe nach einer gängigen Methode in Paraffin eingebettet (Carlos Thomas, Pathologie. Histopathologie. Lehrbuch und Atlas zur allgemeinen und speziellen Pathologie, Schattauer Verlag). Von diesem in Paraffin eingebetteten Gewebe werden Schnitte mit einer Dicke von 4 μm mit einem Mikrotom (Leica, Nussloch) angefertigt und auf speziell vorbereitete Objektträger (Superfrost; Menzel Gläser, Braunschweig) aufgezogen. Danach werden die Schnitte durch eine Inkubation in Xylol von dem Paraffin befreit. Danach werden die Schnitte durch die Inkubation in einer absteigenden Alkoholreihe (100% Ethanol bis 0% Ethanol) rehydriert.
  • Danach werden die Schnitte für 2 min in einem Schnellkochtopf gekocht während sie in einem Tris-EDTA-Citrat Puffer verbleiben und anschließend mit destilliertem Wasser gewaschen. Danach werden die Schnitte mit einer Lösung eines ADAM9 spezifischen primären Antikörper versetzt. Dieser Antikörper, wie z. B. ein mit humanem ADAM9 crossreaktiver Ziege-anti-MausADAM9-Antikörper (R&D Systems, Wiesbaden, Katalog Nr. AF949), wird dazu in einer Konzentration von 15 μg/ml in einer Lösung aus PBS welcher 2% Pferdeserum (erhältlich von Vector Laboratories, Alexis, Grünberg) enthält gelöst. Nach einer Inkubation der Schnitte mit der Antikörperlösung für 45 min bei Raumtemperatur, werden die Schnitte 2 mal mit PBS für jeweils 5 min gewaschen.
  • Die Bindung des Antikörpers an ADAM9 wird mit der folgenden Reaktion nachgewiesen:
    Die Schnitte werden mit einem biotinylierten anti-Ziegen-IgG Antikörper (erhältlich als fertiges Reagenziensystem bei Vector Laboratories) in einer Konzentration von 5μg/ml inkubiert. Danach werden die Schnitte mit dem Reagenziensystem Avidin-Biotin Peroxidase (ABC ELITE, Vector Laboratories) inkubiert. Dabei wird nach der Beschreibung in den Reagenziensystemen verfahren. Zum Schluss werden die Schnitte mit einer Lösung von Diaminobenzidin (Sigma, Taufkirchen) in 0.05 mol/l Tris-HCl pH7.0 bei Raumtemperatur inkubiert. Danach werden die Schnitte mit einem Standardverfahren mit Hematoxylin gefärbt und eingedeckt.
  • Die Färbung wird dann mikroskopisch beurteilt. Dabei steht eine positive Färbung für eine ADAM9-Proteinexpression (ADAM9-Färbung).
  • Zur Tumordiagnose sind die folgenden Parameter wichtig: Anfärbung der basolateralem Seite der Zellen (s. 1) und die Färbung des Cytoplasmas (s. 1). Dabei wird jegliche Anfärbung dieser beiden Teile der Zellen als positiv gewertet („ADAM9 positiv"). Eine Anfärbung der apikalen Seite ist zu erwarten, ADAM9 in den bisher untersuchten Epithelgeweben auf der apikalen Seite nachzuweisen ist und wird nicht als positives Ergebnis gewertet („ADAM9 negativ").
  • Photographische Aufnahmen derart präparierter Gewebeschnitte werden in 1 dargestellt:
  • 1A zeigt eine Aufnahme einer Analyse der ADAM9-Proteinexpression in einem gut differenzierten Duktalen Adenokarzinom des Pankreas (PDAC) mit einer typischen apikalen ADAM9-Färbung 1.
  • 1B zeigt eine Aufnahme einer Analyse der ADAM9-Proteinexpression in einem Gewebeschnitt eines Duktalen Adenokarzinom des Pankreas mit einer cytoplasmatischen 3 ADAM9-Färbung.
  • 1C und 1D zeigen Aufnahmen eine Analyse der ADAM9-Proteinexpression in einem Gewebeschnitt eines schlecht differenzierten Duktalen Adenokarzinom des Pankreas (PDAC) mit einer basolateralen Membrananfärbung 2 und punktueller Anfärbung des Cytoplasmas 3.
  • 1E zeigt eine Aufnahme einer Analyse der ADAM9-Proteinexpression in einem Pankreasgewebeschnitt eines Patienten mit Chronischer Pankreatitis. Hier zeigt sich eine leichte apikale Anfärbung des Gangepitheliums 4.
  • 1F zeigt eine Aufnahme einer Analyse der ADAM9-Proteinexpression in Inselzellen des Pankreas 5.
  • Ausführungsbeispiel 2: Voranalyse der ADAM9-mRNA-Expression (Variante 1)
  • Die Voranalyse der ADAM9-mRNA-Expression erfolgt in isolierter RNA aus Gewebestücken des Pankreas.
  • Dazu wird die RNA mit Standardverfahren und Reagenziensystemen aus Gewebestücken des Pankreas isoliert (RNeasy der Fa. Qiagen, Hilden, Deutschland). Dabei wird nach dem Protokoll des Reagenziensystems verfahren. Danach wird die RNA mit dem Enzym Reverse Transkriptase in cDNA umgeschrieben. Die dazu notwendige Transkriptionsinitiierung wird hierbei von „Random Hexameren" (Oligonukleotide bestehend aus je 6 Nukleotiden mit variabler Sequenz) übernommen (Invitrogen, Karlsruhe). Es werden zu dem Ansatz 100 pg der „Random Hexamere" gegeben. Die Synthese wird ansonsten gemäss der Beschreibung des Herstellers durchgeführt. Nach dieser Reaktion wird die cDNA in eine quantitative PCR eingesetzt. Dazu wird 1 μl der cDNA-Lösung verwendet. Die cDNA wird zu einem Ansatz von 24 μl aus einem Mastermix bestehend aus Puffer, Taq-DNA-Polymerase (z. B. Sybr Green PCR Mastermix der Fa. Applied Biosystems, Weiterstadt) und genspezifischen Primern der SEQ-ID-Nr. 1 und SEQ-ID-Nr. 2 gegeben. Dabei liegen in dem Mix die Primer in einer Konzentration von 300 nmol/l vor. Zur Herstellung dieses Mixes werden für jede Bestimmung 12,5 μl des Sybr Green PCR Mastermix jeweils 1 μl der Primer aus einer Lösung mit einer Konzentration von 3 μmol/l und 9.5 μl destilliertes Wasser gemischt. Danach wird eine PCR unter Standardbedingungen in z. B. dem ABI Prism Sequence Detection System durchgeführt und die Werte für die enthaltene RNA Menge wird nach der Durchführung der PCR errechnet. Dabei interkaliert der Farbstoff Sybr Greens in die währen der PCR gebildete DNA. Über die Fluoreszenz des interkalierten Farbstoffes wird gebildete Menge DNA quantifiziert.
  • Ausführungsbeispiel 3: Voranalyse der ADAM9-mRNA-Expression (Variante 2)
  • Die Voranalyse der ADAM9-mRNA-Expression erfolgt in isolierter RNA aus Gewebestücken des Pankreas.
  • Dazu wird die RNA mit Standardverfahren und Reagenziensystemen aus Gewebestücken des Pankreas isoliert (RNeasy der Fa. Qiagen, Hilden, Deutschland). Dabei wird nach dem Protokoll des Reagenziensystems verfahren. Danach wird die RNA mit dem Enzym Reverse Transkriptase in cDNA umgeschrieben. Die dazu notwendige Transkriptionsinitiierung wird hierbei von „Random Hexameren" (Oligonucleotide bestehend aus je 6 Nukleotiden mit variabler Sequenz) übernommen (Invitrogen, Karlsruhe). Es werden zu dem Ansatz 100 pg der „Random Hexamere" gegeben. Die Synthese wird ansonsten gemäss der Beschreibung des Herstellers durchgeführt. Nach dieser Reaktion wird die cDNA in eine quantitative PCR eingesetzt. Dazu wird 1 μl der cDNA-Lösung verwendet. Die cDNA wird zu einem Ansatz von 24 μl aus einem Mastermix bestehend aus Puffer, Taq-DNA-Polymerase (z. B. TagMan PCR Mastermix der Fa. Applied Biosystems, Weiterstadt) und genspezifischen Primern der SEQ-ID-Nr. 1, SEQ-ID-Nr. 2 und der genspezifischen Sonde SEQ-ID-Nr. 11 gegeben. Dabei liegen in dem Mix die Primer in einer Konzentration von 300 nmol/l vor. Zur Herstellung dieses Mixes werden für jede Bestimmung 12,5 μl des TagMan PCR Mastermix jeweils 1 μl der Primer aus einer Lösung mit einer Konzentration von 3 μmol/l und 9.5 μl destilliertes Wasser gemischt. Danach wird eine PCR unter Standardbedingungen in z.B. dem ABI Prism Sequence Detection System durchgeführt und die Werte für die enthaltene RNA Menge wird während der Durchführung der PCR analog dem Tagman-Verfahren bestimmt.
  • Ausführungsbeispiel 4: Lokalisation der ADAM9-Proteinexpression und Tumordiagnose:
  • In Gewebeproben der Pankreas wurde wie in Ausführüngsbeispiel 1 und zu 1 beschreiben die ADAM9 Proteinexpression analysiert. Dabei wurden Anfärbungen der basolateralem Seite der Zellen und die Färbung des Cytoplasmas als „ADAM9 positiv" gewertet und eine ausschließlich basolaterale Proteinexpression als „ADAM9 negativ".
  • Tabelle 1: ADAM9 Expression in verschiedenen Tumoren des Pankreas
    Figure 00130001
  • Es wurden Pankreasgewebeproben von 59 Patienten mit PDAC, 24 Patienten mit Azinärem Zellkarzinom (ACC) und 11 Patienten mit einem endokrinen Pankreastumor (ET) untersucht. Im Falle des PDAC sind 58/59 Fälle ADAM9 positiv, die anderen Pankreastumoren (ACC und ET) sind nahezu alle ADAM9 negativ. Nur im Falle der ACC sind 2 von 24 untersuchten Gewebeproben ADAM9 positiv.
  • Zusammenfassend verdeutlicht die Tabelle, dass durch die erfindungsgemäße Analyse der ADAM9-Proteinexpression eine differentielle Unterscheidung des PDAC von anderen Pankreastumoren (wie ACC und ET) möglich wird.
  • Ausführungsbeispiel 5: Lokalisation der ADAM9-Proteinexpression und Tumorprognose:
  • In Gewebeproben der Pankreas wurde wie in Ausführungsbeispiel 1 und zu 1 beschreiben die ADAM9 Proteinexpression analysiert. In einer statistischen Analyse wurde mit dem Kaplan-Meier Test die Korrelation zwischen ADAM9-Proteinexpression und klinisch-pathologischem Verlauf der PDAC untersucht (mit dem Computerprogramm SPSS Version 11 (SPSS Inc., Chicago, USA); Kaplan, E. L., & Meier, P. (1958). Nonparametric estimation from incomplete observations. Journal of the American Statistical Association, 53, 457-481).
  • Dabei sind in der folgenden Tabelle die Untersuchungsergebnisse von 103 Patienten mit PDAC aufgeführt. Dabei werden zwei Patientengruppen unterschieden:
    • (a): 59 Patienten ohne operationellen Eingriff (univariate Analyse) und
    • (b): 42 Patienten denen der Pankreastumor in einem operationellen Eingriff entnommen wurde (multivariate Analyse; Cox Regression (SPSS11, Cox, D. R., & Oakes, D. (1984). Analysis of survival data. New York: Chapman & Hall.).
  • In der univariaten Analyse wird nur der Einfluss eines Parameters, hier die cytoplasmatische oder basolaterale Expression, auf die zu testende Variable, hier das Überleben, untersucht. In der multivariaten Analyse hingegen wird der Einfluss von mehreren Parametern, hier die cytoplasmatische und basolaterale Expression sowie Tumorgrad, auf die zu testende Variable, hier das Überleben, untersucht. Die Ergebnisse der univariaten Analyse dienen zur Einschätzung inwieweit die untersuchten Parameter in eine multivariate Analyse eingehen sollten.
  • Zur Vorhersage des klinisch-pathologischem Verlauf der PDAC werden folgende Parameter untersucht:
    Unter N ist die Anzahl (In der untersuchten Patienten (total) und die Anzahl der Todesfälle (Tod) in der Patientengruppe angegeben.
  • Unter HR ist das relative Risiko (HR) für einen schlechteren Krankheitsverlauf, also einen früheren Sterbezeitpunkt als Ergebnis der multivariaten Analyse zu verstehen.
  • Der Konfidenzintervall (CI) gibt welche Spanne das HR umfasst.
  • Der P Wert gibt die Signifikanz an mit dem ein Parameter zu dem HR beiträgt.
  • Tabelle 2 Ergebnisse der univariaten und der multivariaten Analyse der ADAM9 Expression in Patienten mit PDAC.
    Figure 00150001
  • Diese Daten zeigen, dass die cytoplasmatische ADAM9 Expression zu der Einschätzung des Risikos für einen schlechteren Krankheitsverlauf verwendet werden kann. Dies ist nur begrenzt mit der Bestimmung des Tumorgrad möglich, da die Bestimmung des Tumorgrad beim Pankreastumor nicht einfach durchzuführen ist: Die cytoplasmatische ADAM9 Anfärbung bietet sich folglich als neue Methode zur Einschätzung des HR an und als Ersatz der Bestimmung des Tumorgrads an, da die Werte sich im HR und im p-Wert gleichen. Anhand der cytoplasmatischen ADAM9 Expression ist eine Stratifizierung von Patienten mit mindestens der gleichen Qualität wie mit dem Tumorgrad möglich.
  • 2 zeigt die Ergebnisse einer statistischen Kaplan-Meier-Analyse (mit dem Computerprogramm SPSS Version 11 (SPSS Inc., Chicago, USA); Kaplan, E. L., & Meier, P. (1958). Nonparametric estimation from incomplete observations. Journal of the American Statistical Association, 53, 457-481). Die Kaplan-Meier Analyse errechnet nach
    Figure 00160001
    die kumulierte Gesamtüberlebenswahrscheinlichkeit. In dieser Gleichung ist, S(t) die geschätzte Überlebensfunktion, n die Gesamtanzahl der Fälle und Π beschreibt die geometrische Summe über alle Fälle welche kleiner gleich t sind; δ(j) ist eine Konstante die entweder gleich 1 ist, im Falle das von allen Fällen die Überlebenszeit bekannt ist oder 0 wenn das nicht der Fall ist. Dazu wird anhand der vorhandenen Fällen bei Patienten mit PDAC das Überleben geschätzt ("cumulated survival", 1 = Überleben, 0 = Tod). Die Überlebenswahrscheinlichkeit wird dabei in der linken Graphik bei positiver („pos.") oder („neg.") cytoplasmatischer („ADAM9 cyto.") und in der rechten Graphik bei basolateraler („lat.") ADAM9-Expression angegeben.
  • Dabei zeigen die X-Achsen: Zeit nach der Operation in Monaten und die Y-Achsen: Kumulierte Gesamtüberlebenswahrscheinlichkeit ("cumulated survival").
  • Die in 1 und 2 zusammengefassten Ergebnisse zeigen, dass Patienten mit entweder einer cytoplasmatischer oder basolateraler ADAM9-Proteinexpression eine deutlich kürzere mittlere Überlebenszeit, als Patienten die keine oder eine ausschließlich apikale ADAM9-Proteinexpression zeigen.
  • Diese Patienten sollten deshalb einer anderen Behandlung zugeführt werden, als Patienten bei denen eine solche Expression nicht nachgewiesen werden kann. Vorteilhaft kann durch das erfindungsgemäße Verfahren das Behandlungsschema in Abhängigkeit von der ADAm9-Expression angepasst werden. Die unterschiedliche ADAM9 Expression selbst kann dabei als Ansatzpunkt für die Therapie selbst, z. B. eine Immounotherapie mit anti-ADAM9-Antkörpern, gewählt werden.
  • Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird es möglich eine Prognose über den klinischen Verlauf des PDAC zu erstellen und die Patienten mit PDAC in wenigstens zwei Gruppen einzuteilen und für diese Gruppen eine Abschätzung der Überlebenszeit zu geben.
  • Ausführungsbeispiel 6: Herstellung von ADAM9 spezifischen Antikörpern:
  • Monoklonale Antikörper gegen humanes ADAM9 aus der Maus werden mittels Standardtechniken erhalten und humanisiert (Roland Kontermann, Stefan Dübel, Antibody Engineering (Springer Lab Manuals) Springer Verlag Berlin). Alternativ werden humane Antikörper gegen humanes ADAM9 aus der Maus gewonnen (Nina D. Russel, Jose R. F. Corvalan, Michael L. Gallo, C. Geoffrey Davis, Liise-Anne Pirofski. Production of Protective Human Antipneumococcal Antibodies by Transgenic Mice with Human Immunoblobulin Loci. Infection and Immunity April 2000, p. 1820-1826).
  • Ausführungsbeispiel 7: Diagnose des PDAC mit ADAM9-spezifischen Antikörpern in vivo:
  • Die humanisierten oder humanen Antikörper werden mit Iod-131 markiert (Simmel et al., J. Biol. Chem., Vol. 275, 30445-30450, September 29, 2000) und in Patienten in einer Konzentration von 2 MBq/kg bis 50 MBq/kg Körpergewicht in einer isotonen Lösung infundiert. Die Bindung der Antikörper an das humane ADAM9 wird mit einem Szintigraphen gemessen. Aus der Verteilung der aufgenommen Strahlung lässt sich die Anwesenheit, die Lokalisation und die Größe von Tumorgewebe im Körper bestimmen.
  • Ausführungsbeispiel 8: Behandlung des PDAC mit ADAM9 spezifischen Antikörpern:
  • Die humanisierten (unmarkierten) Antiköper werden in einer Konzentration von 1 mg/kg bis 20 mg/kg Körpergewicht in einer isotonen Lösung an jeweils mehreren Tagen infundiert.
  • Ausführungsbeispiel 9: Herstellung von und Behandlung mit humanisierten Yttrium-90 markierten Antikörpern:
  • Die humanisierten oder humanen Antikörper werden mit Yttrium-90 markiert (Simmel et al., J. Biol. Chem., Vol. 275, 30445-30450, September 29, 2000) und in Patienten in einer Konzentration von 5-20MBq/kg Körpergewicht in einer isotonen Lösung an jeweils mehreren Tagen infundiert. Durch das spezifische Binden des Radionuklidmarkierten Antikörper werden gezielt Tumorzellen zerstört.
  • Ausführungsbeispiel 10: Behandlung des PDAC mit siRNA:
  • Eine siRNA nach Seq ID Nr: 12 wird in einer chemischen Nukleotidsynthese nach Standardmethoden synthetisiert. Dabei werden Phosphothioatnukleotide zur Synthese verwendet, um die RNA vor zu schnellem Verdau durch Ribonukleasen zu schützen. Diese siRNA wird in einer Konzentration von 2-20 mg/kg in einer isotonen Lösung an jeweils mehreren Tagen infundiert.
  • In der Beschreibung werden folgende Abkürzungen verwendet:
    • ACC:
    Azinäres Zellkarzinom
    ADAM9:
    A DISINTEGRIN AND METALLOPROTEINASE DOMAIN 9
    cDNA:
    komplementäre DNA
    CI:
    Konfidenzintervall
    Cyto:
    cytoplasmatisch
    DNA:
    Desoxyribonukleinsäure
    ET:
    endokriner Pankreastumor
    HR:
    relatives Risiko
    IgG:
    Immunglobulin gamma
    Lat:
    basolateral
    MAb:
    monoklonaler Antikörper
    MBq:
    Mega-Becquerel
    N:
    Anzahl
    Neg:
    negativ für ADAM9 – keine ADAM9-Anfärbung
    PBS
    Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung
    PCR:
    Polymerasekettenreaktion
    PNA:
    „peptid nucleid acids" – Peptid-Nukleinsäuren
    PDAC:
    Duktales Adenokarzinom des Pankreas
    Pos:
    positiv für ADAM9 – ADAM9-Anfärbung sichtbar
    RNA:
    Ribonukleinsäure
    siRNA:
    "Small Interfering RNA" – kurze interferierende RNA
    RT-PCR:
    Reverse-Transkriptase PCR
    Taq:
    Thermophilus Aquaticus
    Tris-HCl:
    Tris-(hydroxymethyl)aminomethan hydrochlorid
  • In den Figuren werden folgende Bezugszeichen verwendet:
    •
    • 1
    apikale ADAM9-Membrananfärbung
    2
    cytoplasmatischen ADAM9-Färbung.
    3
    basolaterale ADAM9-Membrananfärbung
    4
    apikale ADAM9-Anfärbung des Gangepitheliums.
    5
    ADAM9- Anfärbung in Inselzellen des Pankreas
  • Figure 00200001
  • Figure 00210001
  • Figure 00220001
  • Figure 00230001
  • Figure 00240001
  • Figure 00250001
  • Figure 00260001
  • Figure 00270001

Claims (16)

  1. Verfahren zur Diagnose von Tumoren des Pankreas bei dem in Gewebe- oder Zellproben des Pankreas die ADAM9-Proteinexpression bestimmt wird, wobei isolierte Pankreaszellen oder Gewebeschnitten mit ADAM9-spezifischen Antikörpern inkubiert werden und unter einem Mikroskop auf Binden des ADAM9- spezifischen Antikörpers analysiert werden.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Analyse der ADAM9-Proteinexpression die Lokalisation des ADAM9-Proteins in der Zelle bestimmt wird und unterschieden wird zwischen apikaler, basolateraler und cytoplasmatischer Expression des ADAM9-Proteins.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der ADAM9-spezifische Antikörper ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 3 dadurch gekennzeichnet, dass der ADAM9-spezifische Antikörper aus der folgenden Gruppe gewählt wird: AF949, AF939, 610750, CL2ADAM9, PC669, SA-376.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis des Binden des ADAM9-spezifischen Antikörpers durch Fluoreszenz oder mittels einer Farbreaktion erfolgt.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass vor der Analyse auf ADAM9-Proteinexpression eine Voranalyse durchgeführt wird, wobei in Gewebe- oder Zellproben der Pankreas die ADAM9-Genexpression oder ADAM9-mRNA-Expression bestimmt wird.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass nach der Voranalyse auf ADAM9-Genexpression oder ADAM9-mRNA-Expression die Gewebe- oder Zellproben in denen eine ADAM9- Genexpression oder ADAM9-mRNA-Expression nachgewiesen werden konnte, mit ADAM9-spezifischen Antikörpern inkubiert werden und unter einem Mikroskop auf ADAM9-Proteinexpression analysiert werden.
  8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyse der ADAM9-mRNA-Expression in den Gewebe- oder Zellproben mittels RT-PCR und/oder Mikroarray-Analyse erfolgt.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass zur Analyse der ADAM9-mRNA-Expression mindestens ein Oligonukleotid der SEQ-ID-Nr. 1 bis SEQ-ID-Nr. 11 verwendet wird.
  10. Verwendung von ADAM9 spezifischen Antikörpern zur Diagnose und/oder Behandlung von Pankreastumoren.
  11. ADAM9 spezifischer Antikörper zur Diagnose von Pankreastumoren, wobei an den Antikörper ein Marker, vorzugsweise ein radioaktives Isotop wie Technetium-99, gebunden ist, der die Darstellung in Tomographieverfahren oder Szintigraphieverfahren erlaubt.
  12. ADAM9 spezifische Antikörper zur Behandlung von Pankreastumoren, wobei an den Antikörper ein zelltötendes Agens gebunden ist.
  13. ADAM9 spezifischer Antikörper nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das zelltötende Agens ein Radionukleotid, vorzugsweise Yttrium 90, oder ein Toxin ist.
  14. Verwendung von Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäurederivaten, die spezifisch an das ADAM9-Gen und/oder die ADAM9-mRNA binden, zur Behandlung von Pankreastumoren.
  15. Nukleinsäuren oder Nukleinsäurederivate mit einer Basensequenz aus der Gruppe der SEQ-ID-Nr. 1 bis SEQ-ID-Nr. 26.
  16. Verwendung von Nukleinsäuren oder Nukleinsäurederivaten nach Anspruch 15 zur Diagnose oder Behandlung von Pankreastumoren.
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1897507A1 (de) * 2006-09-06 2008-03-12 Suros Surgical Systems, Inc. Lokalisationsobturator
WO2010094733A3 (en) * 2009-02-19 2010-11-11 Biofocus Dpi B.V. Methods for identifying and compounds useful for the diagnosis and treatment of diseases involving inflammation
US8043316B2 (en) 2008-05-02 2011-10-25 Suros Surgical Systems, Inc. Adjustable spacer
WO2018119166A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 Macrogenics, Inc. Adam9-binding molecules, and methods of use thereof
WO2018119196A1 (en) * 2016-12-23 2018-06-28 Immunogen, Inc. Immunoconjugates targeting adam9 and methods of use thereof
CN112543770A (zh) * 2018-06-26 2021-03-23 伊缪诺金公司 靶向adam9的免疫缀合物及其使用方法
RU2783619C2 (ru) * 2016-12-23 2022-11-15 Макродженикс, Инк. Молекулы, связывающие adam9, и способы их применения

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997040072A2 (en) * 1996-04-19 1997-10-30 The University Of Sheffield Adam proteins and uses thereof
DE19711932A1 (de) * 1997-03-21 1998-09-24 Anne Katrin Dr Werenskiold In vitro-Verfahren zum Prognostizieren des Krankheitsverlaufs von Patienten mit Mammakarzinom und/oder zum Diagnostizieren eines Mammakarzinoms
US20030091568A1 (en) * 2000-04-07 2003-05-15 Jurgen Frey Inhibitors for the formation of soluble human CD23
DE69233125T2 (de) * 1991-12-02 2004-04-22 Millennium Pharmaceuticals, Inc., South San Francisco Inhibitorische immunglobulin-polypeptide gegen den pdgf beta-rezeptor

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69233125T2 (de) * 1991-12-02 2004-04-22 Millennium Pharmaceuticals, Inc., South San Francisco Inhibitorische immunglobulin-polypeptide gegen den pdgf beta-rezeptor
WO1997040072A2 (en) * 1996-04-19 1997-10-30 The University Of Sheffield Adam proteins and uses thereof
DE19711932A1 (de) * 1997-03-21 1998-09-24 Anne Katrin Dr Werenskiold In vitro-Verfahren zum Prognostizieren des Krankheitsverlaufs von Patienten mit Mammakarzinom und/oder zum Diagnostizieren eines Mammakarzinoms
US20030091568A1 (en) * 2000-04-07 2003-05-15 Jurgen Frey Inhibitors for the formation of soluble human CD23

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biochm. Biophys. Res. Commun. 2002, May 3, 293(2), 800-5 (Abstr.)
Biochm. Biophys. Res. Commun. 2002, May 3, 293(2),800-5 (Abstr.) *
Biochm. Biophys. Res. Commun. 2003, Jan 31, 301(1), 231-5 (Abstr.) *
D.J. Duggen et al., Nature Genetics Supplement, Vol. 21, Jan. 1999, 10-14 *
E. Harlow, D. Lane: Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1988, S. 319-357 u. 359-420 *
Int. J. Cancer 2003 Jul. 20, 105(6), 754-61 (Abstr.) *
Nath D. et al., J. Cell Sci. 2000, 113, S. 2319-2328 *

Cited By (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1897507A1 (de) * 2006-09-06 2008-03-12 Suros Surgical Systems, Inc. Lokalisationsobturator
US8043316B2 (en) 2008-05-02 2011-10-25 Suros Surgical Systems, Inc. Adjustable spacer
WO2010094733A3 (en) * 2009-02-19 2010-11-11 Biofocus Dpi B.V. Methods for identifying and compounds useful for the diagnosis and treatment of diseases involving inflammation
EP3558368A4 (de) * 2016-12-23 2020-12-30 MacroGenics, Inc. Adam9-bindende moleküle und verfahren zur verwendung davon
TWI783957B (zh) * 2016-12-23 2022-11-21 美商伊繆諾金公司 靶向adam9之免疫共軛物及其使用方法
CN110167591A (zh) * 2016-12-23 2019-08-23 宏观基因有限公司 Adam9结合分子及使用其的方法
KR20190099247A (ko) * 2016-12-23 2019-08-26 마크로제닉스, 인크. Adam9-결합 분자, 및 이것의 사용 방법
CN110267685A (zh) * 2016-12-23 2019-09-20 伊缪诺金公司 靶向adam9的免疫缀合物及其使用方法
JP2020502233A (ja) * 2016-12-23 2020-01-23 マクロジェニクス，インコーポレーテッド Ａｄａｍ９結合分子、およびその使用方法
JP2020504607A (ja) * 2016-12-23 2020-02-13 イミュノジェン・インコーポレーテッド Ａｄａｍ９を標的とする免疫コンジュゲート及びその使用
WO2018119166A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 Macrogenics, Inc. Adam9-binding molecules, and methods of use thereof
IL267589B2 (en) * 2016-12-23 2024-11-01 Macrogenics Inc Adam9-binding molecules, and methods of use thereof
IL267589B1 (en) * 2016-12-23 2024-07-01 Macrogenics Inc Adam9-binding molecules, and methods of use thereof
JP7128819B2 (ja) 2016-12-23 2022-08-31 マクロジェニクス，インコーポレーテッド Ａｄａｍ９結合分子、およびその使用方法
JP7170642B2 (ja) 2016-12-23 2022-11-14 イミュノジェン・インコーポレーテッド Ａｄａｍ９を標的とする免疫コンジュゲート及びその使用
RU2783619C2 (ru) * 2016-12-23 2022-11-15 Макродженикс, Инк. Молекулы, связывающие adam9, и способы их применения
WO2018119196A1 (en) * 2016-12-23 2018-06-28 Immunogen, Inc. Immunoconjugates targeting adam9 and methods of use thereof
CN110267685B (zh) * 2016-12-23 2023-06-20 伊缪诺金公司 靶向adam9的免疫缀合物及其使用方法
CN110167591B (zh) * 2016-12-23 2023-09-26 宏观基因有限公司 Adam9结合分子及使用其的方法
KR102630036B1 (ko) * 2016-12-23 2024-01-29 마크로제닉스, 인크. Adam9-결합 분자, 및 이것의 사용 방법
JP2021528471A (ja) * 2018-06-26 2021-10-21 イミュノジェン・インコーポレーテッド Ａｄａｍ９を標的とする免疫コンジュゲート、及び、その使用の方法
CN112543770A (zh) * 2018-06-26 2021-03-23 伊缪诺金公司 靶向adam9的免疫缀合物及其使用方法

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