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CN118845640B - 双氯芬酸钠滴眼液的制备方法 - Google Patents

双氯芬酸钠滴眼液的制备方法 Download PDF

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CN118845640B CN202410910915.XA CN202410910915A CN118845640B CN 118845640 B CN118845640 B CN 118845640B CN 202410910915 A CN202410910915 A CN 202410910915A CN 118845640 B CN118845640 B CN 118845640B
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Abstract

本发明属于滴眼液药物领域。针对现有的双氯芬酸钠眼用制剂对角膜新生血管的疗效欠佳、刺激性较强的问题，本发明提供一种双氯酚酸钠滴眼液的制备方法，首先，在冰浴条件下，将双氯芬酸溶液加入硫酸亚铁溶液中。随后，原花青素与硫酸亚铁和双氯芬酸钠配位得到铁基原花青素‑双氯芬酸钠纳米酶。本发明通过原花青素、硫酸亚铁和双氯芬酸钠配位得到铁基原花青素‑双氯芬酸钠纳米酶，该纳米酶用于滴眼液，提高了双氯芬酸滴眼液对角膜新生血管的抑制效果，而且能提高角膜敏感度，维持正常的眼压。

Description

双氯芬酸钠滴眼液的制备方法
技术领域
本发明属于滴眼液药物领域，具体涉及双氯芬酸钠滴眼液的制备方法。
背景技术
角膜新生血管(CNV)是临床上一类损害视力甚至导致角膜失明的疾病。眼部化学烧伤、感染性角膜炎、角膜移植排斥反应等导致促血管与抗血管因素的不平衡是角膜新生血管形成的主要原因。角膜上皮损伤、角膜炎症和氧化应激可不断影响和改变角膜微环境，导致角膜新生血管形成、角膜混浊、水肿和溃疡，最终导致视力下降。因此，及时有效地治疗角膜新生血管是非常有迫切且必须的。皮质内固醇类滴眼液，如地塞米松(DEX)滴眼液等，可以有效地抑制角膜炎症和新生血管，但会引起青光眼、白内障和角膜反复感染等并发症。抗血管内皮生长因子(anti-VEGF)药物对角膜新生血管具有一定的疗效，但是对角膜成熟血管疗效不佳。部分植物提取成分，如姜黄素，抗氧化和抗炎能力强，但因水溶性差限制了在眼科的临床应用。有文献报道第三代强效邻氨基苯甲酸类非甾体消炎药－双氯酚酸钠可抑制角膜新生血管过程中VEGF、COX-2的表达，在治疗角膜新生血管方面具有一定的适用前景。但是临床和实验研究都证明，现有的双氯芬酸钠眼用制剂在控制角膜新生血管疗效上远不如地塞米松制剂。碱烧伤大鼠角膜新生血管动物模型，伤后第四天和第七天用新生血管长度来计算新生血管面积，发现实验组CNV的发生发展受到明显抑制，与对照组的CNV有显著差异(P＜0.05)。实验组新生血管面积为分别是对照组的52.11％(烧伤后第四天)和55.41％(烧伤后第七天)。新生血管面积(X±s，mm 2)分别为12.46±2.23，19.01±3.45和23.91±3.59，36.11±4.02。第四天P＜0.05，第七天P＜0.01(双氯酚酸钠抑制VEGF对角膜新生血管调控作用的研究，海峡药学，2006年第18卷第5期)。此外，双氯酚酸钠眼用制剂还存在较强的刺激性，使用过程中会引起局部的刺激感，如眼睛发红、疼痛等症状。目前对双氯芬酸钠眼用制剂的研究主要集中在如何减轻刺激性，例如专利文献CN101352409A以及CN104127377A均是采用通过使用渗透压调节剂减少双氯芬酸纳滴眼液的刺激性，提高药效。CN106806340A使用了一种抑菌剂双乙酸钠用来降低刺激性，并且维持制剂的稳定性，提高患者的用药有效性和安全性。对于如何提高双氯芬酸钠眼用制剂抑制角膜新生血管的治疗效果，鲜有报道。专利文献CN112043820A采用转甲状腺素蛋白与双氯芬酸能够协同配合，来提高对于与眼部血管新生和/或眼部视网膜渗漏等相关的眼部疾病的治疗效果，该制剂主要针对眼底的新生血管，对于角膜新生血管的治疗效果不得而知。
纳米酶是一种制备简单、尺寸可控、功能可调、性能稳定、具有酶催化作用的纳米材料。纳米酶在眼部疾病中具有独特的潜力和优势。纳米酶具有类似过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)的作用，能有效消除活性氧(ROS)。纳米酶作为药物递送载体，可以通过强大的粘膜附着力，延长保留时间，并控制药物的释放。
发明内容
针对现有的双氯芬酸钠眼用制剂对角膜新生血管的疗效欠佳、刺激性较强的上述问题，本发明提供一种双氯酚酸钠滴眼液的制备方法，通过原花青素、双氯芬酸钠与硫酸亚铁的金属配位反应得到铁基原花青素-双氯芬酸钠纳米酶，该纳米酶用于滴眼液，提高了双氯芬酸滴眼液对角膜新生血管的抑制效果，而且能提高角膜敏感度，维持正常的眼压。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供的双氯芬酸钠滴眼液的制备方法包括以下步骤：
(1)将硫酸亚铁溶解于去离子水中并将硫酸亚铁溶液降温至-1℃～2℃；
(2)将双氯芬酸钠溶解于去离子水中，然后将双氯芬酸钠溶液逐滴加入至步骤(1)获得的硫酸亚铁溶液中，控制体系的温度为-1℃～2℃，边滴加边搅拌，双氯芬酸钠的羧基与铁离子发生金属配位，体系颜色由浅绿色逐渐变成白色；
(3)将原花青素溶解于去离子水中，然后将原花青素溶液逐滴加入步骤(3)得到的白色体系中，控制体系的温度为-1℃～2℃，边滴加边搅拌，原花青素的酚羟基与铁离子金属配位，体系颜色逐渐变成黑色，得到混悬液；
(4)将混悬液以8,000～15,000rpm离心3～8min，取上清液，利用8000-14000Da透析袋在蒸馏水中，以除去副产物；
(5)将所得透析液进行真空冷冻干燥，得到铁基原花青素-双氯芬酸钠纳米酶；
(6)将铁基原花青素-双氯芬酸钠纳米酶溶解于水，即得铁基原花青素-双氯芬酸钠纳米酶滴眼液。
进一步的，所述步骤(1)硫酸亚铁溶液的浓度为8.0～16.0mg/mL，优选浓度为12.0mg/mL。
进一步的，所述步骤(2)双氯芬酸钠溶液的浓度为44.0～52.0mg/mL，优选浓度为48.0mg/mL。
进一步的，所述步骤(3)原花青素溶液的浓度为8.0～16.0mg/mL，优选浓度为12.0mg/mL。
进一步的，所述步骤(5)铁基原花青素-双氯芬酸钠纳米酶中硫酸亚铁、双氯芬酸钠和原花青素的质量比为1：2：(1～2)。
进一步的，所述步骤(6)铁基原花青素-双氯芬酸钠纳米酶滴眼液的浓度为1.0-5.0mg/mL，优选2-4mg/mL。
进一步的，所述步骤(1)硫酸亚铁溶液降温至0℃。
进一步的，所述步骤(2)和(3)的反应温度均为0℃。
进一步的，所述步骤(5)真空冷冻干燥前先将透析液置于-80～-60℃进行预冷冻。
进一步的，所述步骤(1)～(3)分别采用超声溶解方法溶解硫酸亚铁、双氯芬酸钠及原花青素。
进一步的，所述步骤(2)和(3)搅拌速度均为300-600rpm，搅拌时间均为8-12min。
进一步的，所述步骤(4)离心混悬液的速度为10,000rpm，离心时间5min。
本发明具有以下有益效果：
使用金属配位键连接原花青素和双氯芬酸钠的纳米酶可以释放金属离子和生物活性药物分子，表现出良好的水溶性，并具有抑制角膜新生血管、抗炎、抗氧化和促进角膜上皮修复的优点；能提高角膜敏感度，维持正常的眼压；制备方法操作简便且制备时间短；所得滴眼液生物相容性好，性质稳定，可以常温保存。
附图说明
图1为实施例制备的铁基原花青素-双氯芬酸钠纳米酶(PC-DS NE)的表征。(A)透射电镜照片。(B)PC-DS NE粒径分析。(C)PC-DS NE的Zeta电位。(D-F)PC-DS NE的透射电子显微镜元素分布图(TEM mapping)。(G)X射线光电子能谱技术(XPS)。(H)能量色散光谱仪(EDS)。(I)常温下的四种溶液的照片，从左至右依次为生理盐水、地塞米松(DEX)、原花青素(PC)、双氯芬酸钠(DS)和PC-DS NE溶液。(J)傅里叶变换红外光谱(FTIR)。(K)热重分析。(L)PC-DS NE新西兰大白兔体内药物释放实验。(M)PC-DS NE体外药物释放实验。(N)不同浓度PC-DS NE溶液的外观和颜色，从左至右分别为：5mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL和0.1mg/mL。(O)不同浓度PC-DS NE溶液的吸光度。
图2为实施例制备的PC-DS NE的多酶活性。(A)pH值对TMB反应的影响；(B)四甲基联苯胺(TMB)浓度对TMB反应的影响；(C)H2O2浓度对TMB反应的影响；(D)PC-DS NE溶度对TMB反应的影响；(E)温度对TMB反应的影响。(F)不同pH和反应时间的邻苯二胺(POD)对TMB反应的影响。(G)超氧化物歧化酶活性实验。(H)电子自旋共振(ESR)分析。
图3为实施例制备的PC-DS NE的生物相容性图。(A)活死细胞染色。(B-C)人角膜上皮细胞(HCEC)和人角膜基质细胞(HCSC)CCK-8实验。(D)眼刺激试验和角膜苏木素-伊红(HE)染色。(E)小鼠心肝脾肺肾HE染色。
图4为实施例制备的PC-DS NE的ROS清除能力。(A)HCEC和HCSC ROS清除实验。(B)羟自由基抑制实验(EP管从左至右依次为空白管、标准管、对照管、12mg/mL、9mg/mL和6mg/mLPC-DS NE溶液)。(C)碱烧伤第7天后正常组、对照组、DEX组和PC-DS NE组ROS染色流式细胞术分析。
图5为实施例制备的PC-DS NE的抗炎活性分析。(A-D)骨髓来源巨噬细胞加脂多糖(LPS)后32h正常组、对照组、DEX组和PC-DS NE组IL-1β、IL-6、IL-10和IL-17α实时荧光定量PCR(RT-qPCR)。(E)正常组、对照组和PC-DS NE组IL-1β免疫荧光(标尺＝100μm)。(F)碱烧伤第7天小鼠角膜蛋白免疫印迹实验(WB)。
图6为实施例制备的PC-DS NE的角膜上皮损伤修复实验。(A)划痕实验(标尺：60μm)和(B)损伤修复率(％)。(C)刮除角膜上皮第0h、12h、24h和48h荧光素钠染色拍照(标尺：1mm)和(D)染色面积分析。(E)小鼠角膜上皮损伤滴眼第7天，Tublin神经染色铺片(标尺：1mm)和(F)角膜神经面积分析。
图7为实施例制备的PC-DS NE的小鼠碱烧伤角膜新生血管实验。(A)动物处理模式图。(B)碱烧伤后第1天，裂隙灯照和荧光素钠染色。(C)碱烧伤后裂隙灯角膜缘血管照片(标尺：1mm)。(D-E)碱烧伤后血管长度、血管面积分析。(F)碱烧伤第7天OCTA照片。(G)碱烧伤CD31角膜染色铺片(标尺：1mm)。(H)碱烧伤角膜HE染色(红色箭头：血管，标尺：100μm)。(I)碱烧伤第7天小鼠角膜WB。
图8为实施例制备的PC-DS NE的脐静脉内皮细胞(HUVEC)成管实验和碱烧伤第7天后角膜成熟血管的治疗。(A)HUVEC成管实验。(B)碱烧伤第7天后，角膜成熟血管的治疗。
图9为实施例制备的PC-DS NE的碱烧伤实验疗效分析。(A)碱烧伤后角膜前段光学相干断层扫描(AS-OCT)拍照和(B)角膜厚度分析。(C)碱烧伤后角膜敏感度对比。(D)碱烧伤后角膜透明度对比。(E)碱烧伤各组眼压值。(F)碱烧伤后角膜机械强度对比。
具体实施方式
下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步详细说明。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
(1)将硫酸亚铁加入去离子水中，超声溶解至均匀溶液，溶液浓度为12.0mg/mL；将配制的硫酸亚铁溶液加入烧瓶中，使用冰盒冰浴，使用磁力搅拌机400rpm，搅拌5min，硫酸亚铁溶液温度降至0℃；
(2)将双氯芬酸钠加入去离子水中，超声溶解混匀，制得浓度为48.0mg/mL的双氯芬酸钠溶液，将5mL双氯芬酸钠溶液逐滴加入10mL 0℃的硫酸亚铁溶液中，控制体系温度为0℃，边滴加边以400rpm的转速搅拌10min，体系颜色由浅绿色逐渐变成白色；
(3)将原花青素加入去离子水中，超声溶解混匀，制得浓度为12.0mg/mL的原花青素溶液，将10mL原花青素溶液逐滴加入至步骤(3)的体系中，控制体系温度为0℃，以400rpm的转速搅拌10min，体系颜色由白色逐渐变成黑色，得到悬浮液；
(4)将得到的混悬液以10,000rpm的转速离心5min，取上清液，采用10000Da透析袋，在蒸馏水中透析，透析48h后，将透析液装入离心管，置于-80℃冰箱过夜；
(5)真空冷冻干燥机预冷20min后，将冰冻状态的离心管快速开盖，封口膜封口扎孔，冷冻干燥48h，得到铁基原花青素-双氯芬酸钠纳米酶；
(6)将铁基原花青素-双氯芬酸钠纳米酶溶解于水，即得铁基原花青素-双氯芬酸钠纳米酶滴眼液。
实施例2
(1)将硫酸亚铁加入去离子水中，超声溶解至均匀溶液，溶液浓度为8.0mg/mL；将配制的硫酸亚铁溶液加入烧瓶中，使用冰盒冰浴，使用磁力搅拌机400rpm，搅拌5min，硫酸亚铁溶液温度降至0℃；
(2)将双氯芬酸钠加入去离子水中，超声溶解混匀，制得浓度为44.0mg/mL的双氯芬酸钠溶液，将5mL双氯芬酸钠溶液逐滴加入10mL 0℃的硫酸亚铁溶液中，控制体系温度为0℃，边滴加边以400rpm的转速搅拌10min，体系颜色由浅绿色逐渐变成白色；
(3)将原花青素加入去离子水中，超声溶解混匀，制得浓度为8.0mg/mL的原花青素溶液，将10mL原花青素溶液逐滴加入至步骤(3)的体系中，控制体系温度为0℃，以400rpm的转速搅拌10min，体系颜色由白色逐渐变成黑色，得到悬浮液；
(4)将得到的混悬液以10,000rpm的转速离心5min，取上清液，采用8000Da透析袋，在蒸馏水中透析，透析48h后，将透析液装入离心管，置于-80℃冰箱过夜；
(5)真空冷冻干燥机预冷20min后，将冰冻状态的离心管快速开盖，封口膜封口扎孔，冷冻干燥48h，得到铁基原花青素-双氯芬酸钠纳米酶；
(6)将铁基原花青素-双氯芬酸钠纳米酶溶解于水，即得铁基原花青素-双氯芬酸钠纳米酶滴眼液。
实施例3
(1)将硫酸亚铁加入去离子水中，超声溶解至均匀溶液，溶液浓度为16.0mg/mL；将配制的硫酸亚铁溶液加入烧瓶中，使用冰盒冰浴，使用磁力搅拌机400rpm，搅拌5min，硫酸亚铁溶液温度降至0℃；
(2)将双氯芬酸钠加入去离子水中，超声溶解混匀，制得浓度为52.0mg/mL的双氯芬酸钠溶液，将5mL双氯芬酸钠溶液逐滴加入10mL 0℃的硫酸亚铁溶液中，控制体系温度为0℃，边滴加边以400rpm的转速搅拌10min，体系颜色由浅绿色逐渐变成白色；
(3)将原花青素加入去离子水中，超声溶解混匀，制得浓度为16.0mg/mL的原花青素溶液，将10mL原花青素溶液逐滴加入至步骤(3)的体系中，控制体系温度为0℃，以400rpm的转速搅拌10min，体系颜色由白色逐渐变成黑色，得到悬浮液；
(4)将得到的混悬液以10,000rpm的转速离心5min，取上清液，采用14000Da透析袋，在蒸馏水中透析，透析48h后，将透析液装入离心管，置于-80℃冰箱过夜；
(5)真空冷冻干燥机预冷20min后，将冰冻状态的离心管快速开盖，封口膜封口扎孔，冷冻干燥48h，得到铁基原花青素-双氯芬酸钠纳米酶；
(6)将铁基原花青素-双氯芬酸钠纳米酶溶解于水，即得铁基原花青素-双氯芬酸钠纳米酶滴眼液。
(一)铁基原花青素-双氯芬酸钠纳米酶的表征。
对实施例1制备的铁基原花青素-双氯芬酸钠纳米酶(PC-DS NE)的进行表征。图1(A)透射电镜照片显示PC-DS NE为类球形结构。(B)PC-DS NE粒径分析得到纳米酶直径约40nm。(C)PC-DS NE的Zeta电位表明纳米酶的分散性好。(D～F)PC-DS NE的透射电子显微镜元素分布图(TEM mapping)表明PC-DS NE含有O和Fe元素。(G)X射线光电子能谱技术(XPS)，表明PC-DS NE含有C、N、O、Fe元素。(H)能量色散光谱仪(EDS)表明PC-DS NE含有C、N、O、Fe元素及其含量。图1(I)常温下的四种溶液的pH值，从左至右依次为生理盐水、地塞米松(DEX)、原花青素(PC)、双氯芬酸钠(DS)和PC-DS NE溶液，PC-DS NE溶液的pH值为5.85±0.02。(J)傅里叶变换红外光谱(FTIR)，表明原花青素在3385cm-1、1610cm-1和1110cm-1有吸收峰。双氯芬酸钠在3385cm-1、1574cm-1和746cm-1有吸收峰，而这些特征峰的强度在PC-DS NE的FTIR中均明显下降。说明通过反应成功制备了PC-DS NE。(K)热重分析，说明PC-DS NE热稳定性良好。(L)PC-DS NE新西兰大白兔体内药物释放实验，从15min到120min，在新西兰大白兔房水中，原花青素浓度呈逐渐上升的趋势，而双氯芬酸钠浓度呈先上升后下降的趋势，说明双氯芬酸钠在体内也能快速释放。(M)PC-DS NE体外药物释放实验表明随着时间增加，PC-DS NE中的原花青素48h内先快速释放，48h后平稳释放，而PC-DS NE中的双氯酸芬钠在48h内迅速释放，48h后缓慢释放。(N)不同浓度PC-DS NE溶液的外观和颜色，从左至右分别为：5mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL和0.1mg/mL，表明低浓度时，纳米酶溶液没有明显的颜色，当浓度超过2mg/mL，浓度越高，颜色越深。(O)不同浓度PC-DS NE溶液的吸光度，表明当PC-DS NE溶液波长＞300nm且浓度≤2mg/mL时，没有明显的吸光度。
(二)PC-DS NE的多酶活性
对实施例1制备的PC-DS NE进行多酶活性实验。图1(A)pH值实验，表明随着时间增加，pH＝2的OD 652呈现下降趋势，而pH＝3的OD 652呈现上升趋势，并最终成为最高点。因此，本申请以pH＝3的PBS作为后续反应条件。(B)四甲基联苯胺(TMB)浓度，表明随着TMB浓度的上升，OD 652呈现上升趋势，并在TMB＝4之后这种趋势开始变得平缓。(C)50～500mmol/L的H2O2浓度范围内，改变H2O2浓度(50-500mM)，OD 652值变化不明显。；(D)表明OD652随着PC-DS NE浓度增高而上升。(E)温度对TMB反应影响，37℃时OD 652最高，4℃最低，60℃高于常温。(F)不同pH和时间的邻苯二胺(POD)实验，PC-DS NE的OPD实验中，在pH＝1时OD 450值最高，随着pH增加，OD 450逐渐下降。(G)超氧化物歧化酶活性实验，PC-DS NE溶液与对照组相比，能明显降低产物320nm的吸收峰，说明PC-DS NE具有超氧化物歧化酶活性。(H)电子自旋共振(ESR)分析，PC-DS NE与H2O2相互作用时有明显信号，而单独检测PC-DS NE或H2O2时，这些信号显著减弱。说明在H2O2存在的条件下，PC-DS NE具有催化H2O2产生羟自由基的作用。
(三)PC-DS NE的生物相容性
对实施例1制备的PC-DS NE的生物相容性研究。图1(A)活死细胞染色，表明PC-DSNE对HCEC及HCSC没有毒性，并具有促进HCEC细胞增殖的活性。(B-C)人角膜上皮细胞(HCEC)和人角膜基质细胞(HCSC)CCK-8实验，PC-DS NE组与对照组HCEC及HCSC细胞活性均无明显差异，说明PC-DS NE无细胞毒性。(D)眼刺激试验和角膜苏木素-伊红(HE)染色，PC-DS NE组裂隙灯及荧光素钠染色均未见明显角膜上皮缺损、角膜水肿和色素沉着，HE染色PBS组和PC-DS NE组角膜未见水肿和炎症。(E)小鼠心肝脾肺肾HE染色，PBS组和PC-DS NE组心肝脾肺肾均未见明显变性、坏死、炎症细胞浸润、细胞再生和组织纤维化。
(四)PC-DS NE的ROS清除能力
对实施例1制备的PC-DS NE的ROS清除能力进行研究。图4(A)HCEC和HCSC ROS清除实验，表明PC-DS NE能清除HCEC和HCSC细胞在H2O2刺激下产生的ROS。(B)羟自由基抑制实验(EP管从左至右依次为空白管、标准管、对照管、12mg/mL、9mg/mL和6mg/mL PC-DS NE溶液)，表明PC-DS NE随着浓度增加，其清除羟自由基的能力逐渐增强。(C)碱烧伤第7天后正常组、对照组、DEX组和PC-DS NE组ROS染色流式细胞术分析，表明PC-DS NE能降低碱烧伤小鼠角膜组织内的ROS。
(五)PC-DS NE的抗炎活性分析
对实施例1制备的PC-DS NE的进行抗炎活性分析。图5(A-D)骨髓来源巨噬细胞加脂多糖(LPS)后32h正常组、对照组、DEX组和PC-DS NE组IL-1β、IL-6、IL-10和IL-17α实时荧光定量PCR(RT-qPCR)，表明PC-DS NE组与对照组相比促炎因子IL-1β，IL-6和IL-17αmRNA表达水平明显降低(P＜0.05＝，而抑炎因子IL-10表达明显增高(P＜0.05＝。表明，PC-DS NE可能通过使M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化，达到抗炎的作用。(E)正常组、对照组和PC-DS NE组IL-1β免疫荧光(标尺＝100μm)，表明PC-DS NE能通过降低炎症因子IL-1β的表达水平来控制角膜碱烧伤后的炎症反应。(F)碱烧伤第7天小鼠角膜蛋白免疫印迹实验(WB)，表明PC-DS NE能通过降低各种炎症因子的表达水平来控制角膜碱烧伤后的炎症反应。
(六)角膜上皮损伤修复实验
将实施例1制备的PC-DS NE的应用于角膜上皮损伤修复实验。
实验过程：8周龄雄性C57小鼠腹腔注射0.6％戊巴比妥钠(300mg戊巴比妥钠粉末+50mL生理盐水)，注射量为14.5μL/g，约为0.32mL/只。0.5％丙美卡因滴眼进行表面麻醉。用2.5mm环钻在角膜上皮中央刻印，使用Alger Brush II corneal rust ring remover刮除角膜上皮，分三组：对照组、DEX组和PC-DS NE组。对照组滴加PBS、DEX组和PC-DS NE组分别滴加1mg/mL DEX溶液和1mg/mL PC-DS NE溶液。每天2次，每次5μL。共7d。于0h、12h、24h和48h进行裂隙灯荧光素钠染色拍照。通过ImageJ软件分析染色面积。
图6为PC-DS NE的应用于角膜上皮损伤修复的结果。HCEC划痕实验结果显示，对照组、0.1mg/mL PC-DS NE组和0.01mg/mLPC-DS NE组12h的HCEC划痕损伤修复率分别为(33.87±3.89)％、(63.73±9.03)％和(75.37±10.64)％。0.1mg/mLPC-DS NE组和0.01mg/mL PC-DS NE组HCEC划痕损伤修复率明显高于对照组(P＜0.05)。说明PC-DS NE能明显促进HCEC细胞迁移增殖和损伤修复。同样，小鼠上皮刮除后第0h、12h、24h和48h荧光素钠染色显示，相较于对照组，PC-DS NE组第48h没有明显荧光素钠染色，而DEX组第48h仍有面积较大的荧光素钠染色。说明PC-DS NE溶液能明显促进角膜上皮损伤修复，而DEX溶液会延缓角膜上皮修复。且第7天，角膜神经Tublin染色铺片显示，PC-DS NE组的角膜神经能长入角膜中央，细小神经密集，而对照组和DEX组角膜神经均不能长入角膜中央，细小神经稀疏。统计分析结果显示，PC-DS NE荧光素钠染色面积第48h明显低于对照组和DEX组(P＜0.05)。而PC-DS NE组第7天角膜神经面积明显高于DEX组(P＜0.05)。以上结果说明，DEX会导致角膜上皮和神经延迟愈合，而PC-DS NE具有促进角膜上皮和神经增殖修复的效果。
(七)角膜碱烧伤新生血管治疗实验
将实施例1制备的PC-DS NE的应用于角膜碱烧伤新生血管的治疗。
实验过程：8周龄雄性C57小鼠腹腔注射0.6％戊巴比妥钠。0.5％丙美卡因滴眼进行表面麻醉。用2.0mm环钻在圆盘滤纸上钻取滤纸片，并浸入1M NaOH溶液中。将滤纸片取出放置在角膜中央40s后，立即用生理盐水冲洗40s。棉签擦净残留液体后，涂抹氧氟沙星眼膏1次。将小鼠分为6组：正常组(Normal)、对照组(Control)、原花青素组(PC)、双氯芬酸钠组(DS)、地塞米松组(DEX)，原花青素-双氯芬酸钠纳米酶组(PC-DS NE)。正常组正常饲养小鼠，对照组滴加PBS，PC组、DS组、DEX组和PC-DS NE组分别滴加5mg/mL的相应溶液，3次/d，共7d。
图7为PC-DS NE的应用于角膜碱烧伤新生血管实验结果。小鼠碱烧伤模型建立第1天，角膜裂隙灯和荧光素钠拍照显示六组小鼠角膜碱烧伤模型上皮缺损程度均衡。小鼠碱烧伤后第3天，对照组血管从角膜缘开始向角膜中央长入，第7天进入角膜视觉中心。原花青素组可见色素沉着。双氯芬酸钠组出现角膜变薄溶解的现象。DEX组及PC-DS NE组未见明显新生血管。与对照组相比，PC-DS NE组血管长度和血管面积减轻程度有统计学差异(P＜0.05)。六组数据中，PC-DS NE组第7天血管长度(0.20±0.09mm)和面积(0.23±0.13mm2)为最低。OCTA结果显示，对照组和原花青素组均可见粗大密集的血管，且对照组血管面积大，接近角膜中央。而DEX和PC-DS NE组角膜新生血管密度和面积均较小。同时，CD31角膜血管染色铺片显示，对照组有细密的新生血管长入角膜中央，而DEX组和PC-DS NE组新生血管面积小，和正常组类似，存在于角膜缘部位。HE染色结果显示，对照组炎症细胞浸润，虹膜前粘连，并可见到部分血管结构，而PC-DS NE组角膜未见明显炎症细胞浸润和血管结构。除了VEGF，病理性新生血管的形成也与角膜间质纤维化密切相关，因此，肌成纤维细胞标志物(α-SMA)也通常被认为是CNV的组织检测指标。小鼠角膜组织WB结果显示，碱烧伤后第7天，PC-DS NE组VEGFA和α-SMA蛋白的表达水平均低于对照组。以上结果说明，PC-DS NE能通过抑制CD31、VEGF和α-SMA等促血管生成因子的表达，起到抑制CNV形成的作用。
(八)角膜成熟血管的治疗实验
将实施例1制备的PC-DS NE的应用于角膜碱烧伤成熟血管的治疗。
试验过程：参照(七)建立小鼠碱烧伤模型后，正常饲养7d。第8天开始，分三组：对照组，DEX组和PC-DS NE组。双眼分别滴加PBS、5mg/mL DEX溶液和5mg/mL PC-DS NE溶液，每次5μL，每天3次，持续7d。于第7天和第14天进行裂隙灯角膜缘血管拍照。
图8为实施例1制备的PC-DS NE的脐静脉内皮细胞(HUVEC)成管实验和碱烧伤第7天后角膜成熟血管的治疗。(A)HUVEC成管实验，正常组和DEX组血管管腔结构明显，而PC-DSNE组细胞没有形成血管管腔结构，说明PC-DS NE能有效抑制HUVEC细胞血管管腔形成。(B)碱烧伤第7天后，角膜成熟血管的治疗。相比对照组和DEX组，PC-DS NE组能有效控制角膜成熟血管的生长。
(九)碱烧伤实验疗效分析
图9为实施例1制备的PC-DS NE的碱烧伤实验疗效分析。(A)碱烧伤后角膜前段光学相干断层扫描(AS-OCT)拍照和(B)角膜厚度分析，PC-DS NE组第7天中央角膜厚度(108.33±13.43μm)与正常组(105±6.51μm)无明显差异(P＞0.05)，PC-DS NE组角膜形态和厚度维持相对正常。(C)碱烧伤后角膜敏感度对比，表明PC-DS NE能提高碱烧伤后角膜的敏感度。(D)碱烧伤后角膜透明度对比，相比对照组，PC-DS NE组角膜透明度更好，且角膜炎症更轻。(E)碱烧伤各组眼压值，对照组、PC组、DS组和DEX都有不同程度的眼压升高，而PC-DS NE组眼压能维持在正常水平。(F)碱烧伤后角膜机械强度对比，表明PC-DS NE组能提高碱烧伤后小鼠角膜的机械强度。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.双氯芬酸钠滴眼液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将硫酸亚铁溶解于去离子水中并将硫酸亚铁溶液降温至-1℃～2℃；
（2）将双氯芬酸钠溶解于去离子水中，然后将双氯芬酸钠溶液逐滴加入至步骤（1）获得的硫酸亚铁溶液中，控制体系的温度为-1℃～2℃，边滴加边搅拌，双氯芬酸钠的羧基与铁离子发生配位反应，体系颜色由浅绿色逐渐变成白色；
（3）将原花青素溶解于去离子水中，然后将原花青素溶液逐滴加入步骤（3）得到的白色体系中，控制体系的温度为-1℃～2℃，边滴加边搅拌，原花青素的酚羟基与铁离子发生配位反应，体系颜色逐渐变成黑色，得到混悬液；
（4）将混悬液以8,000～15,000 rpm离心3～8 min，取上清液，利用8000-14000Da透析袋在蒸馏水中透析，以除去副产物；
（5）将所得透析液真空冷冻干燥，得到铁基原花青素-双氯芬酸钠纳米酶；
（6）将铁基原花青素-双氯芬酸钠纳米酶溶解于水，即得铁基原花青素-双氯芬酸钠纳米酶滴眼液。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）硫酸亚铁溶液的浓度为8.0～16.0 mg/mL；所述步骤（2）双氯芬酸钠溶液的浓度为44.0～52.0 mg/mL；所述步骤（3）原花青素溶液的浓度为8.0～16.0 mg/mL。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）硫酸亚铁溶液的浓度为12.0 mg/mL;所述步骤（2）双氯芬酸钠溶液的浓度为48.0 mg/mL；所述步骤（3）原花青素溶液的浓度为12.0 mg/mL。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）铁基原花青素-双氯芬酸钠纳米酶中硫酸亚铁、双氯芬酸钠和原花青素的质量比为1：2：1。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（6）铁基原花青素-双氯芬酸钠纳米酶滴眼液的浓度为1.0～5.0 mg/mL。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）硫酸亚铁溶液降温至0℃；所述步骤（2）和（3）的反应温度均为0℃。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）真空冷冻干燥前先将透析液置于-80～-60℃预冷冻。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）～（3）分别采用超声溶解方法溶解硫酸亚铁、双氯芬酸钠及原花青素。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）和（3）搅拌速度均为300-600rpm，搅拌时间均为8-12min。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）离心混悬液的速度为10,000 rpm，离心时间5min。
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