CN118786215A - 使用催化性核酸分析rna分子 - Google Patents

Abstract

本发明涉及使用催化性核酸分析RNA分子群中RNA分子的5’末端结构的方法，例如，用于确定5’帽结构的存在或不存在。

Description

使用催化性核酸分析RNA分子

本发明涉及用于分析RNA分子群的方法，其中确定具有5’帽结构的RNA分子的量。本发明的其它方面涉及用于确定RNA分子群中的加帽效率的方法和用于加帽RNA合成质量控制的方法。

背景

基于体外转录(IVT)mRNA的治疗剂正在作为具有多种应用的新型生物制剂出现，包括最近针对由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起的冠状病毒疾病2019(COVID-19)的疫苗，以及其它传染病疫苗候选物、癌症免疫疗法、基因编辑疗法和蛋白质替代疗法[1-6]。使用IVT mRNA进行的临床前和临床研究需要用于IVT mRNA的质量控制的创新解决方案。

帽结构在其5’末端的存在是IVT mRNA的关键特征之一，可增加其稳定性和可译性。与未加帽mRNA相比，加帽mRNA通常被更有效地翻译[7-9]。在合成后，IVT mRNA的酶促和共转录加帽可能不完全，导致在最终的IVT mRNA中存在可变数量的未加帽分子。

目前用于确定IVT mRNA的加帽效率的方法适用性有限。在一种方法中，在[α-32P]GTP和帽类似物存在的情况下，从短DNA模板转录IVT mRNA。通过使用阴离子交换层析和随后的测量，已经显示用RNA酶T2消化这种产生的IVT mRNA释放了含有[³²P]标记的3’-磷酸的放射性帽结构[10，11]。然而，该方法仅适用于<50nt长的RNA。其他人已经通过测量mRNA放射性的降低来确定在[γ-32P]GTP存在的情况下转录的长mRNA的酶促加帽的效率，因为成功的加帽消除了标记的γ磷酸[12]。这些方法的主要缺点是使用放射性材料用于mRNA产生。

在另一种方法中，在不使用放射性的情况下测量不同长度(>1,000nt)的IVT mRNA的加帽效率。在该程序中，将互补的生物素标记的寡核苷酸退火至IVT mRNA的5’端，然后用RNA酶H切割[13]。使用链霉亲和素包被的磁珠纯化切割的5’端，然后通过液相层析和质谱(LC-MS)进行分析。尽管该方法避免了mRNA的放射性标记，但RNA酶H切割位点不是唯一的，因为也产生了不同长度的另外的切割产物，使得该方法不完全可靠。此外，切割片段的分析需要LC-MS，其影响测定的可负担性。

最近，开发了同时检测mRNA的加帽水平和完整性的生物传感器[14]。然而，生物传感器方法仅允许以至少20％的增量检测加帽水平的变化，使得该方法难以用作精确的分析工具。

概述

本发明的一方面涉及用于分析RNA分子群的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)在允许所述RNA分子切割以产生5’末端片段和至少一个3’片段的条件下，使催化性核酸分子与RNA分子群接触，所述RNA分子群包含含有用于所述催化性核酸分子的切割位点和5’帽结构的一种或多种RNA分子，

(b)将在步骤(a)中获得的5’末端片段至少部分地与所述至少一个3’片段分离，得到5’末端片段群，以及

(c)在从步骤(b)中获得的5’末端片段群中确定具有所述5’帽结构的RNA分子的量。

本发明的一方面涉及用于确定RNA分子群中的加帽效率的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)在允许所述RNA分子切割以产生5’末端片段和至少一个3’片段的条件下，使催化性核酸分子与RNA分子群接触，所述RNA分子群包含含有用于所述催化性核酸分子的切割位点和5’帽结构的一种或多种RNA分子，

(b)将在步骤(a)中获得的所述5’末端片段至少部分地与所述至少一个3’片段分离，得到5’末端片段群，以及

(c)在从步骤(b)中获得的所述5’末端片段群中确定具有所述5’帽结构的RNA分子的量。

本发明的一方面涉及用于分析RNA分子的方法，其包括以下步骤：

(i)合成RNA分子，

(ii)对(i)中合成的所述RNA加帽，以及

(iii)通过本发明的用于分析RNA分子群的方法来分析所述RNA分子。

本发明的一方面涉及用于加帽RNA合成质量控制的方法，其包括以下步骤：

(i)合成RNA分子，

(ii)对(i)中合成的所述RNA加帽，以及

(iii)通过本发明的用于分析RNA分子群的方法来分析所述RNA分子。

本发明的一方面涉及催化性核酸分子，

(i)选自SEQ ID NO:1-25的序列，

(ii)与SEQ ID NO:1-25中任一个具有至少80％同一性的序列，和/或

(iii)(i)和/或(ii)的片段，

其中所述催化性核酸分子包含催化核心。

本发明的一方面涉及本文所述的催化性核酸分子在用于分析RNA分子群的方法中、在用于确定RNA分子群中的加帽效率的方法中、在分析RNA分子的方法中，和/或用于加帽RNA合成质量控制的方法中的用途。

在确定具有所述5’帽结构的RNA分子的量的步骤之前将所述5’末端片段至少部分地与所述3’片段分离的步骤是提供富集的(至少部分纯化的)5’末端片段的群，即，存在于分离步骤之后获得的分离的(或纯化的)富集群中的以占所有切割和未切割的RNA分子的百分比表示的5’末端片段的量大于存在于所述分离步骤之前的群中的以占所有切割和未切割的RNA分子的百分比表示的5’末端片段的量。然后对该富集的或部分纯化的群进行确定具有5’帽结构的RNA分子的量的步骤。通过首先提供这种富集的或部分纯化的群，提高了测定的灵敏度和准确性。

详述

尽管下文详细描述了本发明，但应当理解，本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以变化。还应当理解，本文所使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求来限定。除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。

优选地，本文所用的术语如“多语种生物技术术语词典：(IUPAC推荐)(Amultilingual glossary of biotechnological terms:(IUPAC Recommendations))”,H.G.W.Leuenberger,B.Nagel和H.Eds.,Helvetica Chimica Acta,CH-4010Basel，瑞士，(1995)中所述定义。

除非另有说明，本发明的实践将采用化学、生物化学、细胞生物学、免疫学和重组DNA技术的常规方法，这些方法在本领域的文献中进行了解释(参见，例如，分子克隆：实验手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，第2版，J.Sambrook等人编辑，ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor 1989)。

在下文中，将描述本发明的要素。这些要素与具体实施方案一起列出；然而，应当理解，它们可以以任何方式和以任何数量组合以产生另外的实施方案。各种描述的实例和优选实施方案不应被解释为将本发明仅限于明确描述的实施方案。该描述应当被理解为公开并包括将明确描述的实施方案与任何数量的所公开的和/或优选的要素相结合的实施方案。此外，除非上下文另有说明，否则本申请中所有描述的要素的任何排列和组合应当被认为是由本说明书公开的。

术语“约”意指大致或接近，并且在本文所述的数值或范围的上下文中，优选意指所列举或要求保护的数值或范围的+/-10％。

在描述本发明的上下文中(特别是在权利要求的上下文中)使用的术语“一个/种(a/an)”和“所述(the)”以及类似的引用应被解释为涵盖单数和复数，除非本文另外指出或与上下文明显矛盾。本文中值的范围的列举仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独的值的速记方法。除非本文另有说明，每个单独的值被并入说明书中，就好像其在本文中被单独地列举一样。本文所述的所有方法可以以任何合适的顺序进行，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。本文所提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本发明并且不对另外要求保护的本发明的范围构成限制。说明书中的语言不应被解释为表示实践本发明所必需的任何未要求保护的要素。

除非另有明确说明，否则术语“包含”在本文件的上下文中用于表示除了由“包含”引入的列表的成员之外，还可以任选地存在其他成员。然而，作为本发明的具体实施方案，预期术语“包含”涵盖不存在其它成员的可能性，即，出于该实施方案的目的，“包含”应理解为具有“由…组成”的含义。

以通用术语为特征的组分的相对量的表示意指由所述通用术语涵盖的所有具体变体或成员的总量。如果由通用术语限定的某些组分具体以某些相对量存在，并且如果该组分还被表征为由通用术语涵盖的具体变体或成员，则意味着不另外存在由通用术语涵盖的其它变体或成员，使得由通用术语涵盖的组分的总相对量超过具体的相对量；更优选地，根本不存在由通用术语涵盖的其它变体或成员。

在本说明书全文中引用了几份文件。本文所引用的每份文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、说明书等)，无论是上文还是下文，都通过引用整体并入本文。本文中的任何内容都不应被解释为承认本发明不具有先于此类公开的权利。

在体外转录(IVT)mRNA的5’端上的帽结构的存在决定了其翻译和稳定性，从而支持了其在治疗中的应用。酶促和共转录加帽都可以导致帽在新合成的RNA分子上的不完全定位。IVT mRNA作为新型生物制剂迅速出现，包括最近针对COVID-19的疫苗和针对其它传染性疾病的疫苗候选物以及用于癌症免疫疗法和蛋白质替代疗法。目前正在开发这些疗法的临床前和临床开发阶段所必需的质量控制方法。

与未加帽mRNA相比，加帽mRNA通常被更有效地翻译[7-9]。在合成后，IVT mRNA的酶促和共转录加帽可能是不完全的，导致在最终的IVT mRNA中存在可变数量的未加帽分子。本申请的发明人开发了允许快速和简单定量测量加帽效率的方法。这些方法可用作基于mRNA的疗法的质量控制。

在本发明的实施例中，将催化性核酸分子(特别是核酶，Rz)设计成在紧邻5’端的独特位置特异性切割IVT mRNA，释放10nt-30nt范围内的加帽或未加帽短5’切割产物。由核酶切割的明确限定的加帽或未加帽5’切割产物在长度上彼此相差一个核苷，具体来说是帽结构本身。如果帽结构大于一个核苷酸，则长度差异将大于一个核苷酸。

与用于分析RNA分子的5’端的其它方法相比，本发明的方法的改进之处在于它们更灵敏、更准确并且允许结果的更高的再现性，这种改进使得该方法特别适用于基于mRNA的疗法的质量控制。

本发明的一方面涉及用于分析RNA分子群的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)在允许RNA分子切割以产生5’末端片段和至少一个3’片段的条件下，使催化性核酸分子与RNA分子群接触，所述RNA分子群包含含有用于所述催化性核酸分子的切割位点和5’帽结构的一种或多种RNA分子，

(b)将在步骤(a)中获得的所述5’末端片段至少部分地与所述至少一个3’片段分离，得到5’末端片段群，以及

(c)在从步骤(b)中获得的所述5’末端片段群中确定具有所述5’帽结构的RNA分子的量。

在一些实施方案中，以指定的步骤的顺序执行所述方法。

根据本发明，术语“核酸”还包括在核苷酸碱基、糖或磷酸上的核酸的化学衍生物，以及含有非天然核苷酸和核苷酸类似物的核酸。在一些实施方案中，核酸是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。通常，核酸分子或核酸序列是指优选为脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的核酸。根据本发明，核酸包括基因组DNA、cDNA、mRNA、病毒RNA、重组制备的和化学合成的分子。根据本发明，核酸可以是单链或双链以及线性或共价闭合的环状分子的形式。

根据本发明，“核酸序列”是指核酸(例如；核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA))中的核苷酸序列。该术语可以是指完整的核酸分子(诸如完整核酸分子的单链)或其部分(例如，片段)。

根据本发明，术语“RNA”或“RNA分子”涉及包含核糖核苷酸残基的分子，并且其优选完全或基本上由核糖核苷酸残基组成。术语“核糖核苷酸”涉及在β-D-呋喃核糖基的2’位具有羟基的核苷酸。术语“RNA”包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA(诸如部分或完全纯化的RNA)、基本纯的RNA、合成的RNA和重组产生的RNA(诸如修饰的RNA，其与天然存在的RNA的不同之处在于一个或多个核苷酸的添加、缺失、取代和/或改变)。此类改变可以包括添加非核苷酸材料，诸如添加到RNA的末端或内部，例如添加到RNA的一个或多个核苷酸上。RNA分子中的核苷酸也可以包括非标准核苷酸，诸如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可以被称为类似物，特别是天然存在的RNA的类似物。

根据本发明，RNA可以是单链或双链的。在本发明的一些实施方案中，单链RNA是优选的。术语“单链RNA”通常是指没有互补核酸分子(通常没有互补RNA分子)与之缔合的RNA分子。单链RNA可以含有自身互补序列，其允许RNA的部分折回并形成二级结构基序，其包括但不限于碱基对、茎、茎环和突起。单链RNA可以作为负链[(-)链]或正链[(+)链]存在。(+)链是包含或编码遗传信息的链。遗传信息可以是例如编码蛋白质的多核苷酸序列。当(+)链RNA编码蛋白质时，(+)链可直接用作翻译(蛋白质合成)的模板。(-)链是(+)链的互补链。在双链RNA的情况下，(+)链和(-)链是两个单独的RNA分子，并且这两个RNA分子彼此缔合以形成双链RNA(“双链体RNA”)。

如本文所用的，术语“天然存在的”是指可以在自然界中发现物体的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中并且可以从天然来源中分离并且在实验室中没有被人有意修饰的肽或核酸是天然存在的。术语“在自然界中发现”意味着“在自然界中存在”，并且包括已知对象以及尚未被发现和/或从自然界中分离，但是在将来可以被发现和/或从天然来源中分离的对象。

术语“RNA分子群”涉及多个RNA分子。群可以是多于一种RNA分子种类的混合物，或者可以是单一种类的RNA分子。一种RNA分子的RNA分子可以具有基本上相同的核苷酸序列。RNA分子群可以从任何天然来源获得，或者可以通过合成获得。可以使用本领域技术人员已知的任何合成方法。RNA合成可以包括体外转录(IVT)或固相合成。RNA合成还可以包括在细胞系统中的转录和复制。如果在本文中没有指出作为RNA分子制备中的单独步骤，合成包括RNA分子的加帽。“RNA分子种类”可以包括加帽RNA分子和非加帽RNA分子。

根据本发明，“RNA复制”通常是指基于给定RNA分子(模板RNA分子)的核苷酸序列合成的RNA分子。合成的RNA分子可以是，例如，与模板RNA分子相同或互补的。通常，RNA复制可以通过DNA中间体的合成发生，或者可以通过RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)介导的RNA依赖性RNA复制直接发生。

RNA分子可以包含可翻译的核酸序列，即可翻译成肽或蛋白质。为了使RNA序列是“可翻译的”，它需要5’帽结构的存在。

根据本发明的“核酸的3’端”是指具有游离羟基的端。在双链核酸，特别是DNA的图解的表示中，3’端总是在右手侧。根据本发明的“核酸的5’端”是指具有游离磷酸基团的端。在双链核酸，特别是DNA的图解的表示中，5’端总是在左手侧。

5’端5’--P-NNNNNNN-OH-3’3’端

3’-HO-NNNNNNN-P--5’

核酸分子的“5’末端片段”涉及核酸分子的片段，其包括核酸分子的5’末端序列。

核酸分子的“3’片段”涉及核酸分子的任何片段，其包括5’末端片段序列下游的核酸分子序列。

核酸分子的“3’末端片段”是包括核酸分子的3’末端序列的3’片段。

在一些实施方案中，核酸分子，特别是RNA分子的5’末端片段和3’片段可以通过用催化性核酸分子切割获得，产生5’末端片段和至少一个3’片段。在单个切割位点处的切割产生一个5’末端片段和一个3’片段(即3’末端片段)。在两个或更多个切割位点的切割产生一个5’末端片段和两个或更多个3’片段。

在一些实施方案中，5’末端片段和至少一个3’末端片段的序列彼此不重叠。

包含具有5’帽结构的一种或多种RNA分子的任何RNA群都可以采用本文所述的方法。在一些实施方案中，RNA分子群可以是mRNA分子、自复制RNA、ncRNA和/或sRNA的群。

根据本发明，术语“mRNA”意味着“信使RNA”，并且涉及典型地通过使用DNA模板产生并编码肽或蛋白质的转录物。通常，mRNA包含5’UTR、蛋白编码区、3’UTR和聚(A)序列。mRNA可以通过体外转录从DNA模板产生。体外转录方法学是本领域技术人员已知的。例如，有多种商购可获得的体外转录试剂盒。根据本发明，mRNA可以通过稳定修饰和加帽来修饰。

根据本发明，术语“聚(A)序列”或“聚(A)尾”是指通常位于RNA分子3’端的不间断或间断的腺苷酸残基序列。不间断序列的特征在于连续的腺苷酸残基。在自然界中，不间断的聚(A)序列是典型的。聚(A)序列通常不是由真核DNA编码的，而是在真核转录过程中在细胞核中通过转录后的模板非依赖性RNA聚合酶与RNA的游离3’端连接，但聚(A)序列也可以由DNA编码。因此，RNA分子可以包括DNA和/或酶聚腺苷酸化编码的聚(A)序列。

根据本发明，术语“自复制RNA”包括能够在宿主细胞中自主复制的任何RNA。“自复制RNA”包括RNA病毒，其可以具有单链RNA(ssRNA)基因组，并且包括甲病毒、黄病毒、麻疹病毒(MV)和弹状病毒。甲病毒和黄病毒具有正极性的基因组，而麻疹病毒(MV)和弹状病毒的基因组是负链ssRNA。通常，自复制病毒是具有(+)链RNA基因组的病毒，其可以在细胞感染后直接翻译，并且该翻译提供RNA依赖性的RNA聚合酶，其然后从感染的RNA产生反义和有义转录物。在一些实施方案中，自复制RNA可以是一种类型的mRNA。

非编码RNA(ncRNA)涉及不翻译成多肽或蛋白质的RNA分子。

小核RNA(snRNA)涉及在真核细胞的核内发现的一类小RNA分子。

在一些实施方案中，在步骤(a)中，催化性核酸分子可以与通过体外转录或固相合成获得的RNA分子群接触。

术语“转录(transcription)”和“转录(transcribing)”涉及一种过程，在所述过程中，具有特定核酸序列(“核酸模板”)的核酸分子被RNA聚合酶读取，从而RNA聚合酶产生单链RNA分子。在转录过程中，核酸模板中的遗传信息被转录。核酸模板可以是DNA；然而，例如；在从RNA病毒核酸模板转录的情况下，模板通常是RNA。随后，可将转录的RNA翻译成蛋白质。根据本发明，术语“转录”包括“体外转录(IVT)”，其中术语“体外转录”涉及在无细胞系统中体外合成RNA、特别是mRNA的过程。优选地，克隆载体用于产生转录物。这些克隆载体通常被命名为转录载体，并且根据本发明被术语“载体”所包括。克隆载体优选是质粒。根据本发明，RNA优选是体外转录的RNA(IVT-RNA)，并且可以通过适当DNA模板的体外转录获得。用于控制转录的启动子可以是任何RNA聚合酶的任何启动子。用于体外转录的DNA模板可以通过克隆核酸(特别是cDNA)，并将其引入到用于体外转录的适当载体中而获得。cDNA可以通过RNA的逆转录获得。

体外转录方法学是本领域技术人员已知的。例如，如WO 2011/015347A1中所述，多种体外转录试剂盒是商售可获得的。

转录过程中产生的单链核酸分子通常具有与模板互补的核酸序列。

根据本发明，术语“模板”或“核酸模板”或“模板核酸”通常是指可以复制或转录的核酸序列。

“从核酸序列转录的核酸序列”和类似术语是指核酸序列，其中适当时作为完整RNA分子的一部分，所述完整RNA分子是模板核酸序列的转录产物。通常，转录的核酸序列是单链RNA分子。

术语“载体”在本文中以其最一般的含义使用，并且包括核酸的任何中间载体，其例如使得所述核酸能够被导入原核和/或真核宿主细胞，并且在适当的情况下被整合到基因组中。此类载体优选在细胞中复制和/或表达。载体包括质粒、噬菌粒、病毒基因组及它们的部分。

核酸分子，特别是RNA分子的“固相合成”是指使用核苷酸或寡核苷酸构建块的核酸分子的化学合成。核酸分子的固相合成是本领域技术人员已知的。例如，可以使用亚磷酰胺化学。

在一些实施方案中，在RNA分子中，切割位点可以位于RNA分子的5’端的下游至少5nt、至少10nt或至少15nt。

在一些实施方案中，在RNA分子中，切割位点可以位于RNA分子的5’端的下游至多50nt或至多35nt。

在一些实施方案中，切割位点可以位于RNA分子5’端的下游的5-50个核苷酸的范围内。

在一些实施方案中，切割位点也可以位于RNA分子5’端的下游10-50个核苷酸的范围内。

在一些实施方案中，切割位点也可以位于RNA分子5’端的下游15-30个核苷酸的范围内。

在一些实施方案中，RNA分子可以包含5’UTR序列。合适的5’UTR序列是本领域技术人员已知的。例如，5’UTR可以选自人α珠蛋白(hAg)5’UTR和烟草蚀纹病毒(TEV)5’UTR。

术语“非翻译区”或“UTR”涉及DNA分子中转录但不翻译成氨基酸序列的区域，或涉及RNA分子(诸如mRNA分子)中的相应区域。非翻译区(UTR)可以存在于开放阅读框(5’UTR)的5’(上游)和/或开放阅读框(3’UTR)的3’(下游)。

3’UTR(如果存在的话)位于基因的3’端，在蛋白质编码区的终止密码子的下游，但术语“3’UTR”优选不包括聚(A)尾。因此，3’UTR在聚(A)尾(如果存在的话)的上游，例如直接邻近聚(A)尾。

5’UTR(如果存在的话)位于基因的5’端，在蛋白质编码区的起始密码子的上游。5’UTR在5’帽(如果存在的话)的下游，例如直接邻近5’帽。

根据本发明，5’和/或3’非翻译区可以功能性地连接到开放阅读框，从而使这些区域与开放阅读框相缔合，从而提高包含所述开放阅读框的RNA的稳定性和/或翻译效率。

UTR涉及RNA(例如，mRNA)的稳定性和翻译效率。除了如本文所述的涉及5’帽和/或3’聚(A)尾的结构修饰之外，通过选择特定的5’和/或3’非翻译区(UTR)可以改进两者。UTR内的序列元件通常被理解为影响翻译效率(主要是5’UTR)和RNA稳定性(主要是3’UTR)。优选存在具有活性的5’UTR以提高RNA复制子的翻译效率和/或稳定性。独立地或另外地，优选存在具有活性的3’UTR，以提高RNA复制子的翻译效率和/或稳定性。

根据本发明的5’UTR可以包含多于一个的核酸序列的任意组合，任选地被接头分开。根据本发明的3’UTR可以包含多于一个的核酸序列的任意组合，任选地被接头分开。

本发明的术语“接头”涉及添加在两个核酸序列之间以连接所述两个核酸序列的核酸序列。对接头序列没有特别的限制。

3’UTR的长度通常为200-2000个核苷酸，例如500-1500个核苷酸。免疫球蛋白mRNA的3’非翻译区相对较短(少于约300个核苷酸)，而其它基因的3’非翻译区相对较长。例如，tPA的3’非翻译区长约800个核苷酸，VIII因子的3’非翻译区长约1800个核苷酸，促红细胞生成素的3’非翻译区长约560个核苷酸。哺乳动物mRNA的3’非翻译区通常具有被称为AAUAAA六核苷酸序列的同源区。该序列可能是聚(A)连接信号，并且通常位于聚(A)连接位点上游10-30个碱基。3’非翻译区可以含有一个或多个反向重复序列，其可以折叠以得到茎环结构，所述茎环结构作为外切核糖核酸酶的屏障或与已知增加RNA稳定性的蛋白(例如RNA结合蛋白)相互作用。

在一些实施方案中，RNA分子可以包含催化性核酸分子的至少一个切割位点。在一些实施方案中，RNA分子仅具有一个可被步骤(a)中所使用的催化性核酸切割的位点。

在一些实施方案中，催化性核酸可以在至少一个切割位点特异性切割RNA分子。在单个切割位点的特异性切割产生一个5’末端片段和一个3’片段。在两个或更多个切割位点处的特异性切割产生一个5’末端片段和两个或更多个3’片段。

在一些实施方案中，RNA分子可以包含催化性核酸分子的一个切割位点。切割位点可以存在于RNA分子5’端下游的5-50个核苷酸、RNA分子5’端下游的10-50个核苷酸，或RNA分子5’端下游的15-30个核苷酸的范围内。其它切割位点可以位于该范围的下游。为了从5’末端片段分离3’片段，至少一个3’片段可以比5’末端片段长。例如，至少一个3’片段的长度可以为100个、200个、500个或甚至更多个的核苷酸。

“上游”描述核酸分子的第一元件相对于所述核酸分子的第二元件的相对定位，其中两个元件包含在同一核酸分子中，并且其中第一元件比所述核酸分子的第二元件更靠近所述核酸分子的5’端。然后说第二元件是所述核酸分子的第一元件的“下游”。位于第二元件“上游”的元件可以同义地称为位于所述第二元素的“5’”。对于双链核酸分子，对于(+)链给出了诸如“上游”和“下游”之类的表示。

在一些实施方案中，本发明的催化性核酸分子可以在5’UTR序列中的切割位点处进行切割。例如，包含选自SEQ ID NO:1-4和SEQ ID NO:6-25的序列的催化性核酸分子识别hAg的5’UTR中的序列，并且包含SEQ ID NO:5的催化性核酸分子识别TEV的5’UTR中的序列。

在一些实施方案中，催化性核酸分子可以在RNA分子中的5’-NUH-3’切割位点处进行切割以产生包含NUH>p 3’端的5’片段，其中

·N选自G、A、C和U；并且

·H选自A、C和U。

在一些实施方案中，催化性核酸分子可以在RNA分子中的5’-NCH-3’切割位点处进行切割以产生包含NCH>p 3’末端的5’片段，其中

·N选自G、A、C和U；并且

·H选自A、C和U。

催化性核酸的NUH和NCH切割位点是本领域技术人员已知的。

如本文所用的，NUH>p 3’和NCH>p 3’表示在RNA分子中在NUH或NCH序列与直接与该序列3’相邻的核苷酸之间的切割。例如，包含SEQ ID NO:1、3或4的催化性核酸分子切割序列GUC的3’(实施例1的表4)。在其它实例中，包含SEQ ID NO:2的催化性核酸分子切割序列GUA的3’。在另一个实例中，包含SEQ ID NO:5的催化性核酸分子切割序列ACA的3’。表1中公开了其它切割位点的实例。

“催化性核酸分子”或“催化性核酸”涉及具有核酸切割活性的核酸分子。催化性核酸可包含“催化核心序列”或“催化核心”以及3’和5’侧接序列。

在一些实施方案中，催化性核酸分子的长度可以为30-60nt或35-50nt。在一些实施方案中，催化核的长度可以为20 -25nt，优选22nt或23nt。

在一些实施方案中，侧接序列可以包含“识别序列”，即特异性识别RNA分子中靶序列的序列。在一些实施方案中，侧接序列的长度可以为5-20nt。

在一些实施方案中，催化性核酸分子可以是核酶或脱氧核酶。核酶和脱氧核酶是本领域技术人员已知的。与核酸分子中的靶序列特异性结合并特异性切割核酸分子的催化性核酸分子的设计和构建是本领域技术人员已知的。

“核酶”涉及反义RNA分子，其具有识别RNA底物上的特定靶标并通过酸碱催化切割所述靶标的能力。有不同类型的核酶，其被充分研究并且经常应用的是锤头锤头状核酶。锤头状RNA切割反应是从5’至3’二酯到2’,3’-环磷酸酯二酯的磷酸二酯异构化，导致磷酸酯骨架的切割。第一核酶在自然界中被发现为能够催化自切割的RNA，在1988年，Haseloff和Gerlach(https://www.nature.com/articles/334585a0.pdf)分离了它们的底物和核酸酶活性。他们提出了设计和合成核酶的模型，并提出了对核酶催化的RNA切割的最小结构要求：(A)在RNA底物中含有保守序列(切割位点，例如GUC和其它三联体)，紧邻切割位点，(B)包含维持在核酶中的天然高度保守序列(核心序列)，以及由侧接螺旋组成的区域(C)，并且底物和核酶RNA(其允许核酶在底物RNA上的精确定位和稳定结构形成)之间碱基配对。

反式切割核酶的实例描述于第6,656,731号美国专利中。

在一些实施方案中，催化性核酸分子可以是锤头状核酶、发夹状核酶或HDV核酶。

在一些实施方案中，催化性核酸分子可以是经修饰的催化性核酸分子。在一些实施方案中，通过如本文所述的方法分析的RNA分子可以是经修饰RNA分子。在一些实施方案中，催化性核酸分子和/或RNA分子可以包含至少一个经修饰核苷酸。

如本文所定义的经修饰RNA分子和/或催化性核酸分子可以含有核苷酸类似物/修饰，例如骨架修饰、糖修饰或碱基修饰。与本发明有关的骨架修饰是一种修饰，其中包含在本文所定义的RNA分子和/或催化性核酸分子中的核苷酸骨架的磷酸酯被化学修饰。与本发明有关的糖修饰是如本文所定义的RNA分子和/或催化性核酸分子的核苷酸的糖的化学修饰。此外，与本发明有关的碱基修饰是RNA分子和/或催化性核酸分子的核苷酸的碱基部分的化学修饰。在这个背景下，核苷酸类似物或修饰优选选自核苷酸类似物，所述核苷酸类似物适用于转录和/或翻译。

糖修饰：经修饰的核苷和核苷酸可以在糖部分中被修饰，所述经修饰的核苷和核苷酸可以掺入到如本文所述的经修饰RNA分子和/或催化性核酸分子中。例如，2’羟基基团(OH)可以被修饰或用许多不同的“氧”或“脱氧”取代基替换。“氧”-2’羟基基团修饰的示例包括但不限于烷氧基或芳氧基(-OR，例如R＝H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)、-O(CH2CH2)nCH2CH2OR；“锁”核酸(LNA)，其中2’羟基例如通过亚甲基桥与相同核糖的4’碳连接；和氨基(-O-氨基，其中氨基(例如NRR)可以是烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺、聚氨基)或氨基烷氧基。“脱氧”修饰包括氢、氨基(例如NH2；烷基氨基，二烷基氨基，杂环基，芳基氨基，二芳基氨基，杂芳基氨基，二杂芳基氨基或氨基酸)；或者氨基可以通过连接子连接到糖上，其中连接子包含一个或多个原子C、N和O。糖基团还可以包含一个或多个碳，所述碳具有与核糖中相应碳相反的立体化学构型。因此，经修饰RNA分子可以包括含有例如阿拉伯糖作为糖的核苷酸。

骨架修饰：可以在经修饰的核苷和核苷酸中对磷酸酯骨架进行进一步修饰，所述经修饰核苷和核苷酸可以掺入如本文所述的经修饰的RNA分子和/或催化性核酸分子中。骨架的磷酸酯基团可以通过用不同的取代基替换一个或多个氧原子来修饰。此外，经修饰的核苷和核苷酸可包括用如本文所述的经修饰的磷酸酯对未经修饰的磷酸酯部分的完全替换。经修饰的磷酸酯基团的实例包括但不限于硫代磷酸酯、酯代磷酸、硼烷磷酸酯、硼烷磷酸酯类、氢膦酸酯、氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。二硫代磷酸具有被硫替换的两个非连接的氧。通过用氮(桥接的氨基磷酸酯)、硫(桥接的硫代磷酸酯)和碳(桥接的亚甲基-膦酸酯)替换连接的氧，也可以修饰磷酸酯连接子。

碱基修饰：经修饰的核苷和核苷酸可以在核碱基部分中被进一步修饰，所述经修饰的核苷和核苷酸可以被掺入到如本文所述的经修饰的RNA分子和/或催化性核酸分子中。在RNA中发现的核碱基的实例包括但不限于腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。例如，本文所述的核苷和核苷酸可以在主沟面上进行化学修饰。在一些实施方案中，主沟化学修饰可包括氨基基团、硫醇基基团、烷基基团或卤素基团。

在本发明的具体实施方案中，核苷酸类似物/修饰选自碱基修饰物，其优选选自：2-氨基-6-氯嘌呤核苷-5’-三磷酸、2-氨基嘌呤-核糖核苷-5’-三磷酸；2-氨基腺苷-5’-三磷酸、2’-氨基-2’-脱氧-胞苷-三磷酸、2-硫代胞苷-5’-三磷酸、2-硫代尿苷-5’-三磷酸、2’-氟胸苷-5’-三磷酸、2’-0-甲基次黄嘌呤-5’-三磷酸、4-硫代-尿苷-5’-三磷酸、5-氨基烯丙基胞苷-5’-三磷酸、5-氨基烯丙基尿苷-5’-三磷酸、5-溴胞苷-5’-三磷酸、5-溴尿苷-5’-三磷酸、5-溴-2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸、5-溴-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸、5-碘胞苷-5’-三磷酸、5-碘-2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸、5-碘尿苷-5’-三磷酸、5-碘-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸、5-甲基胞苷-5’-三磷酸、5-甲基尿苷-5’-三磷酸、5-丙炔基-2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸、5-丙炔基-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸、6-氮杂胞苷-5’-三磷酸、6-氮杂尿苷-5’-三磷酸、6-氯嘌呤核苷-5’-三磷酸、7-脱氮-腺苷-5’-三磷酸、7-脱氮鸟苷-5’-三磷酸、8-氮杂腺苷-5’-三磷酸、8-叠氮腺苷-5’-三磷酸、苯并咪唑-核糖核苷-5’-三磷酸、N1-甲基腺苷-5’-三磷酸、N1-甲基鸟苷-5’-三磷酸、N6-甲基腺苷-5’-三磷酸、06-甲基鸟苷-5’-三磷酸、假尿苷-5’-三磷酸或嘌呤霉素-5’-三磷酸、黄苷-5’-三磷酸。可以特别优先考虑的选自以下的碱基修饰核苷酸的用于碱基修饰物的核苷酸：5-甲基胞苷-5’-三磷酸、7-脱氮鸟苷-5’-三磷酸、5-溴胞苷-5’-三磷酸和假尿苷-5’-三磷酸。在一些实施方案中，经修饰的核苷包括吡啶-4-一核糖核苷、5-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷、二氢-假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷和4-甲氧基-2-硫代-假尿苷。

在一些实施方案中，经修饰核苷的包括5-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙酰胞苷、5-甲酰胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、1-甲基-假异胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假异胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、泽布拉林(zebularine)、5-氮杂-泽布拉林、5-甲基-泽布拉林、5-氮杂-2-硫代-泽布拉林、2-硫代-泽布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷和4-甲氧基-I-甲基-假异胞苷。

在其它实施方案中，经修饰的核苷包括2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲硫基-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰氨基甲酰基腺苷、N6-苏氨酰氨基甲酰基腺苷、2-甲硫基-N6-苏氨酰氨基甲酰基腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤和2-甲氧基-腺嘌呤。在其它实施方案中，经修饰的核苷包括肌苷、1-甲基-肌苷、丫苷、怀丁苷、7-脱氮-鸟苷、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2,N2-二甲基鸟苷、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷和N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟苷。

在一些实施方案中，核苷酸可以在主沟面上被修饰，并且可以包括用甲基基团或卤素基团替换尿嘧啶的C-5上的氢。在具体的实施方案中，经修饰的核苷是5’-0-(I-硫代磷酸酯)-腺苷、5’-0-(I-硫代磷酸酯)-胞苷、5’-0-(I-硫代磷酸酯)-鸟苷、5’-0-(I-硫代磷酸酯)-尿苷或5’-0-(I-硫代磷酸酯)-假尿苷。

在其它实施方案中，经修饰的RNA分子和/或催化性核酸分子可以包含选自以下的的核苷修饰物：6-氮杂-胞苷、2-硫代-胞苷、a-硫代-胞苷、假异胞苷、5-氨基烯丙基-尿苷、5-碘-尿苷、N1-甲基-假尿苷、5,6-二氢尿苷、a-硫代-尿苷、4-硫代-尿苷、6-氮杂-尿苷、5-羟基-尿苷、脱氧-胸苷、5-甲基-尿苷、吡咯并-胞苷、肌苷、a-硫代-鸟苷、6-甲基-鸟苷、5-甲基-胞苷、8-氧代-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、N1-甲基-腺苷、2-氨基-6-氯-嘌呤、N6-甲基-2-氨基-嘌呤、假异胞苷、6-氯-嘌呤、N6-甲基-腺苷、a-硫代-腺苷、8-叠氮基-腺苷、7-脱氮-腺苷。

在某些优选的实施方案中，RNA分子和/或催化性核酸分子包含替代至少一个(例如，每个)尿苷的经修饰的核苷，除非本文另有规定。

如本文所用的，术语“尿嘧啶”描述了RNA核酸中可能存在的核碱基之一。尿嘧啶的结构为：

如本文所用的，术语“尿苷”描述了RNA中可能存在的核苷之一。尿苷的结构为：

UTP(尿苷5’-三磷酸)具有以下结构：

经修饰的尿苷也是RNA中可能存在的核苷之一。一种此类经修饰尿苷是具有以下结构的假UTP(假尿苷5’-三磷酸)：

“假尿苷”是示例性的经修饰的核苷，它是尿苷的异构体，其中尿嘧啶通过碳-碳键而不是氮-碳糖苷键与戊糖环连接。

另一个示例性的经修饰的尿苷是N1-甲基-假尿苷(1mΨ)，其具有以下结构：

N1-甲基-假UTP具有以下结构：

另一个示例性的经修饰的尿苷是5-甲基尿苷(m5U)，其具有以下结构：

在某些优选的实施方案中，本文所述的RNA和/或催化性核酸分子中的一个或多个尿苷被经修饰的核苷替换。在一些实施方案中，经修饰的核苷是经修饰的尿苷。

在某些优选的实施方案中，RNA分子和/或催化性核酸分子包含替换至少一个尿苷的经修饰的尿苷。在一些实施方案中，RNA分子和/或催化性核酸分子包含替换每个尿苷的经修饰的尿苷。

在某些优选的实施方案中，经修饰的尿苷独立地选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(1mΨ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方案中，经修饰的尿苷包括假尿苷(Ψ)。在一些实施方案中，经修饰的尿苷包括N1-甲基-假尿苷(1mΨ)。在一些实施方案中，经修饰的尿苷包括5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方案中，RNA分子和/或催化性核酸分子可以包含多于一种类型的经修饰的尿苷，并且经修饰的尿苷独立地选自假尿苷(Ψ)、N1-甲基-假尿苷(1mΨ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方案中，经修饰的尿苷包括假尿苷(ψ)和N1-甲基-假尿苷(1mΨ)。在一些实施方案中，经修饰的尿苷包括假尿苷(Ψ)和5-甲基尿苷(m5U)。在一些实施方案中，经修饰的尿苷包括N1-甲基-假尿苷(1mΨ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方案中，经修饰的尿苷包括假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(1mΨ)和5-甲基-尿苷(m5U)。

在某些优选的实施方案中，替换RNA分子和/或催化性核酸分子中一个或多个(例如，全部)尿苷的经修饰的核苷可以是以下经修饰的尿苷中的任何一种或多种：3-甲基-尿苷(m³U)、5-甲氧基-尿苷(mo⁵U)、5-氮杂尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-尿苷(s²U)、4-硫代-尿苷(s⁴U)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿苷(ho⁵U)、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤素-尿苷(例如，5-碘-尿苷或5-溴-尿苷)、尿苷5-氧乙酸(cmo⁵U)、尿苷5-氧乙酸甲酯(mcmo⁵U)、5-羧甲基-尿苷(cm⁵U)、1-羧甲基-假尿苷、5-羧基羟甲基-尿苷(chm⁵U)、5-羧基羟甲基-尿苷甲酯(mchm⁵U)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm⁵U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿苷(mcm⁵s²U)、5-氨基甲基-2-硫代-尿苷(nm⁵s²U)、5-甲基氨基甲基-尿苷(mnm⁵U)、1-乙基-假尿苷、5-甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(mnm⁵s²U)、5-甲基氨基甲基-2-硒基-尿苷(mnm⁵se²U)、5-氨基甲酰基甲基-尿苷(ncm⁵U)、5-羧基甲基氨基甲基-尿苷(cmnm⁵U)、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(cmnm⁵s²U)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷(τm⁵U)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷(τm5s2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷)、5-甲基-2-硫代-尿苷(m⁵s²U)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m¹s⁴ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m³ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷(D)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷(m⁵D)、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷(acp³U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)-假尿苷(acp³ψ)、5-(异戊烯基氨甲基)尿苷(inm⁵U)、5-(异戊烯基氨甲基)-2-硫代-尿苷(inm⁵s²U)、α-硫代-尿苷、2’-O-甲基-尿苷(Um)、5,2’-O-二甲基-尿苷(m⁵Um)、2’-O-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫代-2’-O-甲基-尿苷(s²Um)、5-甲氧基羰基甲基-2’-O-甲基-尿苷(mcm⁵Um)、5-氨基甲酰基甲基-2’-O-甲基-尿苷(ncm⁵Um)、5-羧甲基氨基甲基-2’-O-甲基-尿苷(cmnm⁵Um)、3,2’-O-二甲基-尿苷(m³Um)、5-(异戊烯基氨甲基)-2’-O-甲基-尿苷(inm⁵Um)、1-硫代-尿苷、脱氧胸苷、2’-F-阿拉伯糖-尿苷、2’-F-尿苷、2’-OH-阿拉伯糖-尿苷、5-(2-羰基甲氧基乙烯基)尿苷、5-[3-(1-E-丙烯基氨基)尿苷，或本领域已知的任何其它经修饰的尿苷。

在实施方案中，RNA分子和/或催化性核酸分子包含其它经修饰的核苷或包含其它经修饰的核苷，例如，经修饰的胞苷，诸如上述的那些。例如，在一实施方案中，在RNA中，5-甲基胞苷部分或完全，优选完全被胞苷取代。在一实施方案中，RNA分子和/或催化性核酸分子包含5-甲基胞苷和一种或多种选自以下的核苷：假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(1mΨ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在实施方案中，RNA分子和/或催化性核酸分子包含5-甲基胞苷和N1-甲基-假尿苷(1mΨ)。在一些实施方案中，RNA分子和/或催化性核酸分子包含替换每个胞苷的5-甲基胞苷和替换每个尿苷的N1-甲基-假尿苷(1mΨ)。

在一些实施方案中，催化性核酸分子和/或RNA分子可以包含至少一个N1-甲基假尿苷(m1Ψ)核苷酸。

在一些实施方案中，催化性核酸分子和/或RNA分子可以包含选自以下的至少一种核苷：肌苷、2’-O-甲基腺苷、2’-O-甲基鸟苷、2’-O-甲基尿苷和2’-O-甲基胞苷。

在一些实施方案中，催化性核酸和/或RNA分子可以包含至少一个脱氧核糖核苷酸。

在一些实施方案中，催化性核酸分子可以包含：

(i)选自SEQ ID NO:1-25的序列，

(ii)与SEQ ID NO：1-25中任一个具有至少80％同一性，优选至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，和/或

(iii)(i)和/或(ii)的片段，

其中催化性核酸分子包含催化核心。

表1：SEQ ID NO：1-25

锤头状Rz催化核心序列为下划线；hAg，人α珠蛋白；I，肌苷；m，2’-O-

Met；TEV，烟草蚀纹病毒；Rz，核酶；5’UTR，5’非翻译区。

表2：SEQ ID NO:1-25的催化核心序列

参考核酸序列，“片段”涉及核酸序列的一部分，即；代表在5’和/或3’端缩短的核酸序列的序列。优选地，核酸序列的片段包含来自所述核酸序列的至少80％，优选至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸残基。在本发明中，优选那些保持RNA稳定性的RNA分子片段。

在一些实施方案中，如本文所述的，催化性核酸分子的片段可包含SEQ ID NO:1-25中任一个的催化性核酸分子的催化核心。

在一些实施方案中，催化核心可包含SEQ ID NO:26或27(表2)，或与SEQ ID NO:26和/或27具有至少80％同一性，优选至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。

在一些实施方案中，在SEQ ID NO:1-25中任一个中，Am可独立地选自A和2’-O-甲基腺苷，Gm可独立地选自G和2’-O-甲基鸟苷，Um可独立地选自U和2’-O-甲基尿苷，并且/或Cm可独立地选自C和2’-O-甲基胞苷。

在一些实施方案中，本发明的催化性核酸分子可以是RNA分子，特别是核酶。

与参考核酸相比，术语“核酸变体”包括单个或多个核苷酸缺失、添加、突变、取代和/或插入。缺失包括从参考核酸中除去一个或多个核苷酸。另外的变体包括一个或多个核苷酸(诸如1个、2个、3个、5个、10个、20个、30个、50个或更多个核苷酸)的5’和/或3’末端融合。在取代的情况下，序列中的至少一个核苷酸被去除，并且至少一个其它核苷酸被插入其位置(诸如颠换和转换)。突变包括无碱基位点、交联位点和化学改变或经修饰的碱基。插入包括向参考核酸中加入至少一个核苷酸。

根据本发明，与参考核酸相比，“核苷酸变化”可以指单个或多个核苷酸缺失、添加、突变、取代和/或插入。在一些实施方案中，与参考核酸相比，“核苷酸变化”选自：单个核苷酸的缺失、单个核苷酸的添加、单个核苷酸的突变、单个核苷酸的取代和/或单个核苷酸的插入。根据本发明，与参考核酸相比，核酸变体可以包含一个或多个核苷酸变化。

特定核酸序列的变体优选可以具有所述特定序列的至少一种功能特性，并且优选与所述特定序列在功能上等同，例如，表现出与特定核酸序列相同或相似特性的核酸序列。

优选地，给定核酸序列与作为所述给定核酸序列的变体的核酸序列之间的“同一性程度”或“同一性”或“％同一性”将是至少70％、优选至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％或最优选至少95％、96％、97％、98％或99％。优选给出至少约30个、至少约50个、至少约70个、至少约90个、至少约100个、至少约150个、至少约200个、至少约250个、至少约300个，或至少约400个核苷酸的区域的同一性程度。在优选的实施方案中，给出参考核酸序列全长的同一性程度。

两个核酸序列之间的“序列同一性”表示序列之间相同的核苷酸的百分比。

术语“％相同的”特别是指在待比较的两个序列之间的最佳比对中相同的核苷酸的百分比，所述百分比是纯粹统计的，并且两个序列之间的差异可以随机分布在序列的整个长度上，并且待比较的序列可以包括与参考序列相比的添加或缺失，以便获得两个序列之间的最佳比对。两个序列的比较通常通过在最佳比对之后将所述序列与区段或“比较窗口”进行比较来进行，以便识别相应序列的局部区域。用于比较的最佳比对可以手动进行或借助于Smith和Waterman,1981,Ads App.Math.2:482的局部同源性算法，借助于Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443的局部同源性算法，并且借助于Pearson和Lipman,1988,Proc.Natl Acad.Sci.USA 85:2444的相似性搜索算法，或借助于使用所述算法的计算机程序(威斯康星州麦迪逊，575科学驱动，遗传学计算机组的威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575ScienceDrive,Madison,Wis.)中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST N和TFASTA)进行。

通过确定待比较的序列对应的相同位置的数目，将该数目除以比较的位置的数目，并将该结果乘以100来获得同一性百分比。

例如，可以使用在网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi上可获得的BLAST程序“BLAST 2序列”。

“nt”是核苷酸的缩写；或者是多个核苷酸，优选核酸分子中的连续核苷酸。

在一些实施方案中，在步骤(a)中，催化性核酸分子可以在加帽类似物的存在的情况下与被酶促或/和共转录加帽加帽的RNA分子群接触。

术语“5’帽”、“帽”、“5’帽结构”、“帽结构”同义使用，并且可以指在一些真核生物初级转录物(诸如前体信使RNA)的5’端上发现的二核苷酸。5’帽是其中(任选地经修饰的)鸟苷通过5’至5’三磷酸键(或在某些帽类似物的情况下经修饰的三磷酸键)结合到mRNA分子的第一核苷酸的结构。该术语可指常规的帽或帽类似物。

“包含5’帽的RNA”或“提供有5’帽的RNA”或“用5’帽修饰的RNA”或“加帽RNA”是指包含5’帽的RNA。例如，提供具有5’帽的RNA可以通过在所述5’帽存在下DNA模板的体外转录来实现，其中所述5’帽被共转录地掺入到产生的RNA链中，或者RNA可以例如通过体外转录来产生，并且5’帽可以使用加帽酶(例如，牛痘病毒的加帽酶)在转录后与RNA连接。在加帽RNA中，(加帽)RNA分子的第一个碱基的3’位置通过磷酸二酯键与RNA分子的后续碱基(“第二碱基”)的5’位置连接。

术语“常规5’帽”是指天然存在的5’帽，优选7-甲基鸟苷帽。在7-甲基鸟苷帽中，帽的鸟苷是经修饰的鸟苷，其中修饰由第7位的甲基化组成。

在本发明的上下文中，术语“5’帽类似物”是指类似于常规5’帽的分子结构，但被修饰以具有稳定RNA(如果连接其上)的能力，优选在体内和/或在细胞中稳定RNA的能力。帽类似物不是常规5’帽。

在真核生物mRNA的情况下，5’帽通常被描述为涉及mRNA的有效翻译：通常，在真核生物中，翻译仅在信使RNA(mRNA)分子的5’端开始，除非存在内部核糖体进入位点(IRES)。真核细胞能够在核中转录期间提供具有5’帽的RNA：新合成的mRNA通常用5’帽结构修饰，例如；当转录物达到20-30个核苷酸的长度时。首先，5’末端核苷酸pppN(ppp代表三磷酸酯；N代表任何核苷)在细胞中通过具有RNA 5’-三磷酸酶和鸟苷酰转移酶活性的加帽酶转化为5’GpppN。GpppN随后可以在细胞中通过具有(鸟嘌呤-7)-甲基转移酶活性的第二酶甲基化以形成单甲基化的m⁷GpppN帽。在一实施方案中，用于本发明的5’帽是天然5’帽。

在本发明中，天然5’帽二核苷酸通常选自非甲基化帽二核苷酸(G(5’)ppp(5’)N；也被称为GpppN)和甲基化帽二核苷酸((m⁷G(5’)ppp(5’)N；也被称为m⁷GpppN)。m⁷GpppN(其中N是G)由下式表示：

本发明的加帽RNA可以在体外制备，因此不依赖于宿主细胞中的加帽机制。在体外制备加帽RNA最常用的方法是在所有四种核糖核苷三磷酸和加帽二核苷酸(诸如m⁷G(5’)ppp(5’)G(也被称为m⁷GpppG))存在下用细菌或噬菌体RNA聚合酶转录DNA模板。RNA聚合酶通过m⁷GpppG的鸟苷部分的3’-OH对下一个模板化的核苷三磷酸(pppN)的α-磷酸的亲核攻击来启动转录，产生中间体m⁷GpppGpN(其中N是RNA分子的第二碱基)。通过在体外转录期间将帽与GTP的摩尔比设定5至10，抑制竞争性GTP引发的产物pppGpN的形成。

在本发明的优选实施方案中，5’帽(如果存在的话)是5’帽类似物。如果RNA是通过体外转录获得的，例如是体外转录的RNA(IVT-RNA)，则这些实施方案是特别合适的。帽类似物最初已经被描述为通过体外转录促进RNA转录物的大规模合成。

对于信使RNA，至今已经一般地描述了一些帽类似物(合成帽)，并且它们都可以用于本发明的上下文中。理想地，选择与更高的翻译效率和/或增加的体内降解抗性和/或增加的体外降解抗性相关的帽类似物。

优选地，使用只能沿一个方向掺入RNA链的帽类似物。Pasquinelli等人，1995,RNAJ.1:957-967)证明了在体外转录过程中，噬菌体RNA聚合酶使用7-甲基鸟苷单元来启动转录，由此约40％-50％的具有帽的转录物具有反向的帽二核苷酸(即，初始反应产物是Gpppm⁷GpN)。与具有正确帽的RNA相比，具有反向帽的RNA在核酸序列翻译成蛋白质方面不起作用。因此，期望以正确的方向掺入帽，即产生具有基本上对应于m⁷GpppGpN等的结构的RNA。已经显示帽二核苷酸的反向整合被甲基化鸟苷单元的2’-或3’-OH基团的取代所抑制(Stepinski等人，2001,RNA J.7:1486-1495；Peng等人，2002,Org.Lett.24:161-164).在此类“抗反向帽类似物”存在下合成的RNA比在常规5’帽m⁷GpppG存在下体外转录的RNA翻译更有效。为此，描述了一种帽类似物，其中甲基化鸟苷单元的3’OH基团被OCH₃替换，例如由Holtkamp等人，2006,Blood 108:4009-4017描述的(7-甲基(3’-O-甲基)GpppG；抗反向帽类似物(ARCA))。根据本发明，ARCA是合适的帽二核苷酸。

在实施方案中，本发明的RNA基本上不是易去帽的。这是重要的，因为通常，从引入到培养的哺乳动物细胞中的合成mRNA产生的蛋白质的量受到mRNA天然降解的限制。mRNA降解的一种体内途径开始于除去mRNA帽。该除去由含有调节亚基(Dcp1)和催化亚基(Dcp2)的异二聚体焦磷酸酶催化。催化亚基在三磷酸酯桥的α和β磷酸酯基团之间切割。在本发明中，可以选择或存在帽类似物，使其不易或较不易于这种类型的切割。用于该目的的合适的帽类似物可以选自根据式(I)的帽二核苷酸：

其中R¹选自：任选地取代的烷基、任选地取代的烯基、任选地取代的炔基、任选地取代的环烷基、任选地取代的杂环基、任选地取代的芳基和任选地取代的杂芳基，

R²和R³独立地选自：H、卤素、OH和任选地取代的烷氧基，或者R²和R³一起形成O-X-O，其中X选自：任选地取代的CH₂、CH₂CH₂、CH₂CH₂CH₂、CH₂CH(CH₃)，和C(CH₃)₂，或R²与R²所连接的环的4’位处的氢原子结合形成-O-CH₂-或-CH_2-O-，

R⁵选自：S、Se和BH₃，

R⁴和R⁶独立地选自：O、S、Se和BH₃。

n是1、2或3。

R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶的优选实施方案公开于WO 2011/015347A1中，并且可以在本发明中相应地选择。

例如，在实施方案中，本发明的RNA包含硫代磷酸酯-帽类似物。硫代磷酸酯-帽类似物是特定的帽类似物，其中三磷酸酯链中的三个非桥接O原子中的一个被S原子替换，即式(I)中的R⁴、R⁵或R⁶中的一个是S。硫代磷酸酯-帽类似物已被Kowalska等人，2008,RNA,14:1119-1131描述为不期望的脱帽过程的方案，并因此增加RNA在体内的稳定性。特别地，在5’帽的β-磷酸基团处用氧原子取代硫原子产生对Dcp2的稳定。在该实施方案中，其在本发明中是优选的，式(I)中的R⁵是S；并且R⁴和R⁶是O。

在其它实施方案中，本发明的RNA包含硫代磷酸酯-帽类似物，其中RNA5’帽的硫代磷酸酯修饰与“抗反向帽类似物”(ARCA)修饰组合。在WO 2008/157688 A2中描述了相应的ARCA-硫代磷酸酯-帽类似物，并且它们都可以用于本发明的RNA中。在该实施方案中，式(I)中的R²或R³中的至少一个不是OH，优选R²和R³中的一个是甲氧基(OCH₃)，并且R²和R³中的另一个优选是OH。在优选的实施方案中，氧原子在β-磷酸基团处被硫原子取代(使得式(I)中的R⁵为S；并且R⁴和R⁶为O)。据认为，ARCA的硫代磷酸酯修饰确保α、β和γ硫代磷酸酯基团在翻译和去帽机制中都精确地位于帽结合蛋白的活性位点内。这些类似物中的至少一些基本上对焦磷酸酶Dcp1/Dcp2有抗性。硫代磷酸酯修饰的ARCA被描述为对eIF4E具有比相应的缺少硫代磷酸酯基团的ARCA高得多的亲和力。

在本发明中特别优选的相应的帽类似物，即，m_2’ ^7,2’-OGpp_spG，被称为β-S-ARCA(WO2008/157688 A2；Kuhn等人，2010,Gene Ther.17:961-971)。因此，在本发明的一个实施方案中，用β-S-ARCA修饰本发明的RNA。β-S-ARCA由以下结构表示：

通常，在桥接磷酸酯处用氧原子替换硫原子，基于它们在HPLC中的洗脱模式，得到被称为D1和D2的硫代磷酸酯非对映异构体。简言之，“β-S-ARCA”的D1非对映异构体或“β-S-ARCA(D1)”是β-S-ARCA的非对映异构体，其与β-S-ARCA的D2非对映异构体(β-S-ARCA(D2))相比首先在HPLC柱上洗脱，并因此表现出更短的保留时间。在WO 2011/015347 A1中描述了通过HPLC测定立体化学构型。

在本发明的第一特别优选的实施方案中，用β-S-ARCA(D2)非对映异构体修饰本发明的RNA。β-S-ARCA的两种非对映异构体对核酸酶的敏感性不同。已经表明，携带β-S-ARCA的D2非对映异构体的RNA对Dcp2切割几乎完全抵抗(与在未修饰ARCA 5’帽存在的情况下已经合成的RNA相比，仅6％切割)，而具有β-S-ARCA(D1)5’帽的RNA表现出对Dcp2切割的中等敏感性(71％切割)。还表明，对Dcp2切割的稳定性增加与哺乳动物细胞中蛋白质表达增加相关。特别地，已经表明携带β-S-ARCA(D2)帽的RNA在哺乳动物细胞中比携带β-S-ARCA(D1)帽的RNA更有效地翻译。因此，在本发明的一个实施方案中，用根据式(I)的帽类似物修饰本发明的RNA，其特征在于在包含式(I)中的取代基R⁵的P原子处的立体化学构型对应于在β-S-ARCA的D2非对映异构体的P_β原子处的立体化学构型。在该实施方案中，式(I)中的R⁵是S；并且R⁴和R⁶是O。此外，式(I)中的R²或R³中的至少一个优选不是OH，优选R²和R³中的一个是甲氧基(OCH₃)，并且R²和R³中的另一个优选是OH。

在第二特别优选的实施方案中，用β-S-ARCA(D1)非对映异构体修饰本发明的RNA。该实施方案特别适于将加帽RNA转移到未成熟抗原呈递细胞中，例诸如用于接种疫苗目的。已经证明，一经将各自加帽RNA转移到未成熟抗原呈递细胞中，β-S-ARCA(D1)非对映异构体特别适用于增加RNA的稳定性、增加RNA的翻译效率、延长RNA的翻译、增加RNA的总蛋白表达，和/或增加针对由所述RNA编码的抗原或抗原肽的免疫应答(Kuhn等人，2010,GeneTher.17:961-971)。因此，在本发明的可替代实施方案中，本发明的RNA用根据式(I)的帽类似物修饰，其特征在于在包含式(I)中的取代基R⁵的P原子处的立体化学构型对应于在β-S-ARCA的D1非对映异构体的P_β原子处的立体化学构型。WO 2011/015347 A1和Kuhn等人，2010,Gene Ther.17:961-971中描述了其各自的帽类似物和实施方案。在WO 2011/015347A1中描述的任何帽类似物可以在本发明中使用，其中在包含取代基R⁵的P原子处的立体化学构型对应于在β-S-ARCA的D1非对映异构体的P_β原子处的立体化学构型。优选地，式(I)中的R⁵是S；并且R⁴和R⁶是O。此外，式(I)中的R²或R³中的至少一个优选不是OH，优选R²和R³中的一个是甲氧基(OCH₃)，并且R²和R³中的另一个优选是OH。

在一个实施方案中，用根据式(I)的5’帽结构修饰本发明的RNA，其中任一个磷酸酯基团被硼磷酸酯基团或磷硒基酯基团替换。此类帽在体外和体内都具有增强的稳定性。任选地，相应的化合物具有2’-O-或3’-O-烷基(其中烷基优选为甲基)；相应的帽类似物被称为BH₃-ARCA或Se-ARCA。如WO 2009/149253 A2中所述的，特别适用于mRNA加帽的化合物包括β-BH₃-ARCA和β-Se-ARCA。对于这些化合物，优选在包含式(I)中的取代基R⁵的P原子处的立体化学构型，其对应于在β-S-ARCA的D1非对映异构体的P_β原子处的立体化学构型。

在一个实施方案中，5’帽可以是具有以下结构的三核苷酸AU(帽1)：

在一些实施方案中，加帽类似物可以选自：G[5’]ppp[5’]G、m⁷G[5’]ppp[5’]G、m₃ ^{2 ,2,7}G[5’]ppp[5’]G、m₂ ^7,3’-OG[5’]ppp[5’]G(3’-ARCA)、m₂ ^7,2’-OGpppG(2’-ARCA)、m₂ ^7,2’-OGpp_spGD1(β-S-ARCAD1)、m₂ ^7,2’-OGpp_spG D2(β-S-ARCA D2)、m7(3’OMeG)(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG(Reagent AG(3’OMe)，目录号:N-7413)、m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG(Reagent AG，目录号:N-7113)、Reagent AU-(N-7114)、m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pU。

在一些实施方案中，在步骤(a)中，RNA分子群可以与过量的催化性核酸分子接触。例如，在步骤(a)中，RNA分子群可以与催化性核酸分子以约1:1至约1:20，或约1:1至约1:10的RNA分子与催化性核酸分子的摩尔比接触。例如，RNA分子与催化性核酸分子的摩尔比可以是约1:2.5、约1:5或约1:10。优选的是约1:2.5的比例。

在一些实施方案中，5’末端片段的长度允许区分加帽5’末端片段和非加帽5’末端片段。在一些实施方案中，加帽5’末端片段和非加帽5’末端片段可以在长度上相差1个至3个核苷酸。

在一些实施方案中，在步骤(a)中获得的5’末端片段的长度可以为至少5nt、至少10nt或至少15nt。在一些实施方案中，在步骤(a)中获得的5’末端片段的长度可以为至多35nt或至多50nt。在一些实施方案中，5’末端片段的长度可以在5-50nt、10-50nt或15-30nt的范围内。

在一些实施方案中，5’末端片段优选在包含步骤(a)的切割反应的反应物的反应混合物中进行步骤(b)。

在一些实施方案中，在步骤(a)中，5’末端片段可以在具有至少一个3’片段、催化性核酸分子和/或未切割的RNA分子的混合物中获得。

如本文所述的方法的步骤(a)中的切割可以是基本完全的。在一些实施方案中，在步骤(a)中，5’末端片段可以在具有至少一个3’片段和催化性核酸分子的混合物中获得。

如本文所述的方法的步骤(a)中的切割可以是不完全的。在一些实施方案中，在步骤(a)中，5’末端片段可以在具有至少一个3’片段、催化性核酸分子和未切割的RNA分子的混合物中获得。

在实施方案中，在步骤(b)中，将在步骤(a)中获得的切割RNA分子群中存在的5’末端片段和至少一个3’片段至少部分地彼此分离或纯化。该分离(纯化)步骤产生富集5’末端片段的群，即，存在于在步骤(b)中获得的分离的(或纯化的)富集群中的以占所有切割的和未切割的RNA分子的百分比表示的5’末端片段的量大于存在于在步骤(a)中获得的群中的以占所有切割的和未切割的RNA分子的百分比表示的5’末端片段的量。在一些实施方案中，富集的5’末端片段群在溶液中。在实施方案中，在步骤(b)中获得的富集的5’末端片段群(例如在溶液中)可以用于本发明的方法中，用于分析RNA分子的5’帽结构。

在一些实施方案中，5’末端片段的量的百分比的增加可以是至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，百分比的增加在50％至95％、60％至95％、70％至95％、80％至95％、90％至95％或95％至99％的范围内。在一些实施方案中，百分比的增加是1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、50倍、100倍或更高。

在一些实施方案中，步骤(b)可以包括在允许5’末端片段与至少一个3’片段、未切割的RNA分子和/或催化性核酸分子至少部分分离的条件下，使用基于二氧化硅的固定相对在步骤(a)中获得的混合物进行层析。

适用于层析的任何基于二氧化硅的材料可以用于例如柱和/或膜上。合适的基于二氧化硅的材料是本领域技术人员已知的。

在一些实施方案中，步骤(b)可以包括两个单独的层析步骤，其中在每个步骤中使用基于二氧化硅的固定相。实施例1和实施例2描述了具有两个单独柱的基于二氧化硅的层析的典型方案。

在一些实施方案中，在第一层析步骤中，包括未切割的全长RNA和长3’片段的长RNA可以保留在固相上，而短5’末端片段收集在流通部分中。流动相可以是在步骤(a)中获得的样品、醇和水性缓冲液的混合物，其比例允许5’末端片段与未切割的RNA分子和/或至少一个3’片段至少部分分离。

在一些实施方案中，在第一层析步骤中，醇和水性缓冲液的比例小于1，即，使用的水性缓冲液相对于醇过量。醇与水性缓冲液的体积比可以在约2:3至约3:4的范围内，考虑到醇，具有过量的水性缓冲液。在一些实施方案中，流动相可以含有在步骤(a)中获得的样品和体积比在约1:5至约1:7范围内的醇/缓冲液混合物。

在一些实施方案中，在第二层析步骤中，5’末端片段可以与固相结合。流动相可以是在第一层析步骤中获得的样品、醇和水性缓冲液的混合物，其比例允许5’末端片段与固相结合。

在一些实施方案中，在第二层析步骤中，醇和水性缓冲液的比例大于1，即，使用的醇相对于水性缓冲液过量。醇与水性缓冲液的体积比可以在约5:1至约20:1的范围内，例如约10:1。在一些实施方案中，流动相可以含有在第一层析步骤中获得的样品和体积比在约2:1至约1:1范围内的醇/缓冲液混合物。

可以用水洗脱与第二柱结合的5’片段。合适的方案是本领域技术人员已知的。

在一些实施方案中，在两个层析步骤中，醇可以独立地是C_1-6醇，优选C_1-3醇，诸如甲醇、乙醇、1-丙醇或2-丙醇、或它们的混合物。优选为乙醇。

水性缓冲液可以是本领域技术人员已知的任何合适的缓冲液。

本发明方法的步骤(b)中的“至少部分地分离(separating at leastpartially)”或“至少部分的分离(at least partial separation)”涉及5’末端片段与在步骤(a)中获得的反应混合物的至少一个3’片段和/或任何其它组分的完全或不完全分离。

在一些实施方案中，步骤(b)还可以包括在允许5’末端片段与至少一个3’片段和/或未切割的RNA分子至少部分分离的条件下，对在步骤(a)中获得的混合物进行PAGE。PAGE还可以包括以下步骤：(i)从PAGE凝胶中分离至少一个目的条带，所述至少一个条带包含5’末端片段，和(ii)从在步骤(i)中获得的分离的至少一个条带中洗脱5’末端片段。

在一些实施方案中，步骤(b)还可以包括在允许5’末端片段与至少一个3’片段和/或未切割的RNA分子至少部分分离的条件下，使在步骤(a)中获得的混合物与寡dT核苷酸接触。通过寡dT核苷酸，包含聚(A)序列的RNA分子可以与固相结合。mRNA分子通常含有聚(A)序列。在一些实施方案中，寡dT核苷酸可与塑料或磁性珠连接，或与生物素连接。在一些实施方案中，珠形成柱。

根据本发明，在一个实施方案中，聚(A)序列包含以下或基本上由以下组成或由以下组成：至少20个、优选至少26个、优选至少40个、优选至少80个、优选至少100个、优选至多500个、优选至多400个、优选至多300个、优选至多200个、特别是至多150个A核苷酸，特别是约120个A核苷酸。在本文中，“基本上由…组成”是指聚(A)序列中的大多数核苷酸，通常按“聚(A)序列”中的核苷酸的数目计至少50％、优选至少75％是A核苷酸(腺苷酸)，但允许剩余的核苷酸是除A核苷酸以外的核苷酸，诸如U核苷酸(尿苷酸)、G核苷酸(鸟苷酸)、C核苷酸(胞苷酸)。在本文中，“由…组成”是指聚(A)序列中的所有核苷酸，即聚(A)序列中100％数量的核苷酸是A核苷酸。术语“A核苷酸”或“A”是指腺苷酸。

在一些实施方案中，催化性核酸分子可以被标记，例如用生物素标记。

在一些实施方案中，催化性核酸分子可以与表面连接。表面可以是磁珠或塑料珠或颗粒。

在一些实施方案中，分离步骤(b)还可以包括在允许5’末端片段与催化性核酸分子至少部分分离的条件下将5’末端片段与催化性核酸分子分离。在一些实施方案中，分离可以包括在允许5’末端片段与标记的催化性核酸分子至少部分分离的条件下，使步骤(a)的混合物与结合标记的催化性核酸分子的材料接触。标记可以是生物素。

在一些实施方案中，步骤(b)和(c)可以是单独的步骤。如本文所述的，在步骤(b)中，将步骤(a)中获得的5’末端片段至少部分地与至少一个3’片段分离，得到5’末端片段群。在一些实施方案中，在步骤(b)中，优选不将加帽5’末端片段与非加帽5’末端片段分离。

在一些实施方案中，在步骤(c)中，可以在步骤(b)中获得的5’末端片段群中确定具有5’帽结构的RNA分子的量。在一些实施方案中，在步骤(c)中，加帽5’末端片段可以与未加帽5’片段区分开，例如通过层析方法。在一些实施方案中，加帽5’末端片段可以比非加帽5’末端片段长一个、两个或三个核苷酸。

在一些实施方案中，步骤(c)可以包括凝胶电泳、光谱分析、质谱分析、液相层析和/或测序。在一些实施方案中，凝胶电泳可以是PAGE。在一些实施方案中，质谱分析可以是LC-MS。在一些实施方案中，液相层析可以是HPLC或UPLC。

在一些实施例中，在步骤(b)和(c)中，可以使用不同的方法。例如，在步骤(b)中，可以使用使用基于二氧化硅的固定相的层析法、基于寡dT的分离、从PAGE洗脱和/或使用固定化催化性核酸的分离方法，而在步骤(c)中，可以使用PAGE、质谱分析、HPLC和/或UPLC。

在一些实施方案中，步骤(c)可以包括确定加帽5’末端片段和非加帽5’末端片段的量。通过加帽5’末端片段和非加帽5’末端片段的量，可以确定加帽效率。

在一些实施方案中，可以计算加帽5’末端片段相对于5’末端片段的总量的百分比。百分比可以以摩尔％或重量％计算。

在一些实施方案中，本发明的方法还可以包括步骤(d)：分析加帽5’末端片段中的帽结构。帽结构的分析可以包括帽类似物和RNA分子之间结合的分析。加帽类似物可以包含两个3’位置(在本文中被称为“第一”和“第二”3’位置)，这两个位置都能够结合RNA分子的5’端。在第一位置，核糖可以与鸟苷(G)连接，而在第二位置，核糖可以与m7G连接。术语“定向”或“正确定向”描述RNA分子与第一3’位置的结合，使得mRNA有效翻译，而“反向定向”描述RNA分子与第二3’位置的结合，使得翻译效率降低。帽结构的分析可以包括确定正确定向的帽结构的量和/或正确定向的帽结构相对于加帽分子总量的百分比。例如，用焦磷酸酶处理以正确定向加帽5’末端片段使得从5’末端片段切割m7G，而用焦磷酸酶处理以反向定向加帽5’末端片段使得从5’末端片段切割G，允许区分正确定向和反向定向。

本发明的另一方面是用于确定RNA分子群中的加帽效率的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)在允许所述RNA分子切割以产生5’末端片段和至少一个3‘片段的条件下，使催化性核酸分子与RNA分子群接触，所述RNA分子群包含含有用于催化性核酸分子的切割位点和5’帽结构的一种或多种RNA分子，

(b)将在步骤(a)中获得的所述5’末端片段至少部分地与所述至少一个3’片段分离，得到5’末端片段群，以及

(c)在从步骤(b)中获得的所述5’末端片段群中确定具有所述5’帽结构的RNA分子的量。

在本文中，在分析本发明的RNA分子群的方法的上下文中描述了步骤(a)、(b)和(c)的实施方案。

本发明的另一方面是用于分析RNA分子的方法，其包括以下步骤：

(i)合成RNA分子，

(ii)对(i)中合成的所述RNA加帽，以及

(iii)如本文所述的，通过本发明的用于分析RNA分子群的方法来分析所述RNA分子。

在步骤(i)中，可以使用任何已知的RNA合成方法。在一些实施方案中，如本文在用于分析本发明的RNA分子群的方法的上下文中所述的，可以通过体外转录和/或固相合成来合成RNA分子。

在一些实施方案中，如本文在用于分析本发明的RNA分子群的方法的上下文中所述的，在步骤(ii)中，可通过酶促或/和共转录加帽来对在步骤(i)中合成的RNA加帽。

本发明的另一方面是用于加帽RNA合成质量控制的方法，其包括以下步骤：

(i)合成RNA分子，

(ii)对(i)和(ii)中合成的所述RNA加帽，以及

(iii)如本文所述的，通过本发明的用于分析RNA分子群的方法来分析所述RNA分子。

在步骤(i)中，可以使用任何已知的RNA合成方法。在一些实施方案中，如本文在用于分析本发明的RNA分子群的方法的上下文中所述的，可以通过体外转录和/或固相合成来合成RNA分子。

在一些实施方案中，如本文在用于分析本发明的RNA分子群的方法的上下文中所述的，在步骤(ii)中，可通过酶促或/和共转录加帽来对在步骤(i)中合成的RNA加帽。

在实施方案中，使用PAGE凝胶或HPLC不同时进行分离和确定步骤。

本发明的另一方面是催化性核酸分子，其包含：

(i)选自SEQ ID NO:1-25的序列，

(ii)与SEQ ID NO:1-25中任一个具有至少80％同一性的序列，和/或

(iii)(i)和/或(ii)的片段，

其中所述催化性核酸分子包含催化核心。

在用于分析本发明的RNA分子群的方法的上下文中描述了SEQ ID NO:1-25。

在一些实施方案中，在本发明的该方面中描述的催化性核酸分子可以是分离的催化性核酸分子。如本文所用的“分离的分子”是指基本上不含其它分子(诸如其它细胞材料)的分子。术语“分离的核酸”意指根据本发明的核酸已经(i)在体外扩增，例如通过聚合酶链反应(PCR)扩增，(ii)通过克隆重组产生，(iii)纯化，例如通过切割和凝胶电泳分离纯化，或(iv)合成，例如通过化学合成。分离的核酸是可通过重组技术操作的核酸。

在本发明的上下文中，术语“重组的”是指“通过基因工程化制成的”。优选地，在本发明的上下文中，“重组对象”诸如重组细胞不是天然存在的。

在一些实施方案中，本发明的催化性核酸分子可以是RNA分子，特别是核酶。

本发明的另一方面是核酸分子，其包含：

(i)SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27的序列，

(ii)与SEQ ID NO:26和/或SEQ ID NO:27具有至少90％同一性，优选至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。

在一些实施方案中，在本发明的该方面中所描述的核酸分子可以是分离的核酸分子。

在一些实施方案中，该方面的核酸分子可以是RNA分子。

在一些实施方案中，该方面的核酸分子可以包含核酶的催化核心。

在一些实施方案中，该方面的核酸分子可以是核酶。

在一些实施方案中，如本文所述的，该方面的核酸分子可以包含至少一个经修饰的核苷酸。

本发明的另一方面是如本文所述的催化性核酸分子在分析RNA分子群的本发明的方法中、在确定RNA分子群中的加帽效率的本发明的方法中、在分析RNA分子的本发明的方法中，和/或在如本文所述的用于加帽RNA合成质量控制的本发明的方法中的用途。

详细描述了本发明，并通过附图和实例对本发明进行了说明，所述附图和实例仅用于说明的目的，并不意味着对本发明的限制。由于描述和实例，同样包括在本发明中的其它实施方案对于本领域技术人员是容易获取的。

附图说明

图1：核酶介导的切割以定量体外转录的mRNA的加帽效率。核酶(Rz)退火至IVTmRNA并且在Mg⁺⁺存在下在37℃下切割IVT mRNA的5’端。底物切割产生RNA的混合物：短的加帽和未加帽5’切割产物(5’CP)、长的3’切割产物(3’CP)、长的未切割的RNA和Rz。使用具有两个基于二氧化硅的柱的方法纯化混合物，由此通过使用特定的盐和乙醇条件在第一柱膜上耗尽长RNA和3’CP。将含有短的加帽和未加帽5’CP的收集的流通物施加到第二柱上，结合在其膜上，并在水中洗脱。纯化的5’CP和Rz用21％ PAGE、8M尿素可视化或用液相层析和质谱(LC-MS)分析，以定量IVT mRNA的加帽效率。

图2:核酶与IVT mRNA底物摩尔比的优化。使用增加量的Rz1切割固定量的含U或含m1Ψ的未加帽mRNA，并且使用21％ PAGE、8M尿素使所得混合物可视化。基于未切割的RNA(112nt长)和3’切割产物(3’CP＝90nt长)之间的比率，评估Rz1的切割效率以增加Rz与IVTmRNA底物摩尔比。测试1至10的Rz与RNA底物的摩尔比，使得大约50％至70％的切割。Rz用作对照(ctrl)。5’CP，5’切割产物；nt，核苷酸。

图3:通过使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的可视化和定量，核酶介导的切割有效地评估IVT mRNA的加帽效率。含U或含m1Ψ的RNA的核酶(Rz)介导的切割(使用Rz1、Rz2和Rz5)：在基于二氧化硅的柱上纯化未加帽(-)、酶促帽0(E0)、酶促帽1(E1)和ARCA(A0)，然后使用21％ PAGE、8M尿素可视化(纯化的，上图)，或使用21％PAGE、8M尿素而不进行基于二氧化硅的柱纯化可视化(未纯化的，下图)。Rz用作上图和下图上的对照，同时未切割的mRNA另外用作下图上的对照(ctrl)。5’CP，5’切割产物(上：加帽的，下：未加帽的)；nt，核苷酸。在此可视化的IVT mRNA的加帽效率(％)显示在表5中。

图4:核酶介导的切割有效地评估不同长度的IVT mRNA的加帽效率。图像显示Rz5切割和二氧化硅柱纯化的TEV、含m1Ψ的β-S-ARCA(D1)或Reagent AG(3’OMe)、帽1(CC1)加帽的IVT mRNA的21％ PAGE、8M尿素可视化。IVT mRNA的长度范围为1.1kb至9.4kb。Rz，核酶；5’CP，5’切割产物。

图5:核酶介导的切割测定检测在共转录加帽的IVT mRNA的酶促加帽后加帽效率的增加。共转录D1加帽或D1+酶促加帽(D1+E1)的GCG转录起始位点(TSS)、hAg、含U的IVTmRNA被Rz1切割、二氧化硅柱纯化，并使用21％ PAGE、8M尿素可视化。Rz，核酶；5’CP，5’切割产物。

图6:核酶介导的切割测定优于RNA酶H切割测定。将RNA酶H探针(P1)杂交，并且RNA酶H切割一组含U或m1Ψ的RNA：未加帽(-)、酶促帽0(E0)、酶促帽1(E1)和ARCA(A0)。将切割的RNA片段混合物施加到用于纯化的基于二氧化硅的柱上，并使用21％ PAGE、8M尿素可视化(纯化的)，或使用21％ PAGE、8M尿素可视化，而不使用基于二氧化硅的柱纯化(未纯化的)。白色箭头：另外的+1nt条带，虚线方框：RNA酶H引起的RNA降解。RNA酶H探针P1或未切割的RNA(ctrl)用作对照。5’CP，5’切割产物；nt，核苷酸。

图7:用于定量和表征来自经Rz1切割和二氧化硅柱纯化的酶促加帽和2’-O-甲基化(E1)、人α珠蛋白(hAg)、含m1Ψ的促红细胞生成素(EPO)mRNA的加帽产物的核酶介导的切割产物的LC-MS分析。酶促加帽程序以7:2的比例得到7MeGpppA(OMe)GGCGAACU*AGU*AU*U*-CU*U*CU*GGU*Cp(MW＝8,334)和7MeGpppAGGCGAACU*AGU*AU*U*CU*U*CU*GGU*Cp(MW＝8,319)；由不完全的2’邻甲基转移产生。(A)UPLC和(B)MS图谱。Rz，核酶；Cap，加帽产物；Cap_m，加帽甲基化产物；Cap_u，加帽未甲基化产物；Cap+G，次要产物；AU，任意单位。

图8:用于定量和表征来自Rz1切割和二氧化硅柱纯化的Reagent AG(3’OMe)＝帽1(CC1)、人α珠蛋白(hAg)、含m1Ψ的促红细胞生成素(EPO)mRNA的加帽产物的核酶介导的裂解产物的LC-MS分析。检测到预期的加帽产物(MW＝8,347)>99％。(A)UPLC和(B)MS图谱。Rz，核酶；Cap，加帽产物；AU，任意单位。

图9:使用靶向NCH型位点的核酶(Rz6、Rz7、Rz8、Rz9和Rz10；SEQ ID NO:6-10)的核酶介导的切割测定显示有效切割和释放加帽和未加帽短5’切割产物。

实施例1

在该实施例中，核酶(Rz)被设计成在紧邻5’端的独特位置特异性切割IVT mRNA，释放10-30nt范围内的加帽或未加帽短5’切割产物。与从未加帽RNA切下的切割产物相比，由加帽mRNA的核酶切下的明确的5’切割产物在长度上不同，特别是帽结构本身。

使用基于二氧化硅的柱纯化这些产物，并使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)或液相层析和质谱分析(LC-MS)将其可视化/定量。使用该技术，确定了具有不同特征的IVTmRNA的加帽效率，所述特征包括：不同的帽结构、不同的5’非翻译区、不同的核苷修饰和不同的长度。总之，我们开发的核酶切割测定对于分析用于R&D目的的加帽效率和作为基于mRNA的疗法的一般质量控制是快速和可靠的。

可以在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)中直接分析来自切割反应的RNA。本实施例证实了使用基于二氧化硅的柱从切割反应中纯化RNA，并将得到的清洁的、短5’切割产物RNA加载到凝胶上获得更好的重复性，并改善可视化和定量。

在可检测5’切割产物差异的条件下对RNA进行电泳。通过它们的凝胶条带强度定量从加帽或未加帽mRNA释放的染色的和可视化的5’切割产物，并评估加帽效率。还使用LC-MS分析短的纯化的5’切割产物，允许另外的表征，诸如确定甲基化状态或次要加帽产物。

1.材料和方法

1.1.体外转录模板

通过线性化含有不同编码序列的质粒来产生体外转录模板，所述编码序列侧接对应于人α珠蛋白(hAg)的5’非翻译区(UTR)或烟草蚀纹病毒(TEV)的5’前导区、恒定的3’UTR和100nt长的聚(A)尾的序列[15,16]。用限制性酶EarI或BbsI(均来自New EnglandBiolabs)进行线性化。

1.2.RNA的体外转录和加帽

使用MEGAscript T7转录试剂盒(Thermo Fisher Scientific)合成大小范围为100nt至9.4kb的RNA。反应包括用于产生标准IVT mRNA的UTP或用于核苷修饰的mRNA的N1-甲基假尿苷5’-三磷酸(m1ΨTP)(TriLink)，其中100％的尿苷被m1Ψ取代。在RNA的亚集中，前3个转录的核苷酸的序列是GCG、GGA、AGC、AGG或AGA。将帽类似物ARCA-G(TriLink，N-7003)、β-S-ARCA(D1，BioNTech SE)[17]或Reagent AG(3’OMe)(TriLink，N-7413)加入到转录反应中以产生分别具有帽0(A0)、帽0(D1)或帽1(CC1)的mRNA。根据制造商的说明书使用牛痘病毒加帽酶(New England Biolabs)来酶促加帽合成的mRNA并产生具有帽0(E0)或帽1(E1)的RNA。使用1.4％琼脂糖凝胶电泳测试RNA质量[18]，并且使用NanoDrop分光光度计(Thermo Scientific)测量RNA浓度。

1.3.核酶和RNA酶H探针的设计

为该研究设计了五种锤头状核酶(表3)。

表3.设计的核酶的特征。

锤头状Rz催化核心序列为下划线；hAg，人α珠蛋白；I，肌苷；m，2’-O-Met；TEV，烟草蚀纹病毒；Rz，核酶；5’UTR，5’非翻译区。

Rz1、Rz2、Rz3和Rz4分别在GUC、GUA、GUC和GUC三联体之后切割hAg 5’UTR[19,20]。Rz3与Rz1的不同之处在于表现出短4nt的3’臂，而Rz4被设计为具有长4nt的5’臂和短1nt的3’臂。Rz5经改造以含有肌苷(I)且在ACA三联体后切割TEV 5’UTR[21]。为了提高退火的Rz：靶复合物的稳定性，将2’-O-甲基化的核苷酸(Nm)分别掺入Rz2和Rz5的最后第7个或第19个核苷酸位置。RNA酶H探针(5’-dGdAdC dCdAdG AmAmGm AmAmUm AmCmUm Am-3’)，其中掺入了脱氧核苷酸(dN)，是根据Beverly等人设计的[13]。通过Metabion合成核酶和RNA酶H探针，并通过电喷雾离子化飞行时间质谱(ESI-TOF)确认它们的质量。

1.4.通过核酶切割mRNA

核酶切割反应含有0.2μM至0.6μM mRNA和相对于mRNA底物2.5倍摩尔过量的核酶，反应在10mM Tris和10mM MgCl₂中进行。首先，通过首先在95℃孵育2min，然后在室温孵育5min，使核酶退火至不含MgCl₂的反应混合物中的mRNA。通过添加MgCl₂开始切割反应，并且在37℃下进行1h，然后进一步加工或在-20℃下冷冻。在测试相对于mRNA底物的1.0倍至10.0倍摩尔过量的核酶范围之后，发现相对于mRNA 2.5倍摩尔过量的核酶是最佳的。

1.5.通过RNA酶H切割mRNA

通过将5倍摩尔过量的RNA酶H探针与mRNA底物通过在92℃孵育2min，然后在含有50mM Tris和100mM NaCl的缓冲液中逐步冷却(65℃进行2min，55℃进行2min和40℃进行2min)来进行RNA酶H切割测定。退火后，将125μM的RNA酶H(New England Biolabs)和10mMMgCl₂加入到反应混合物中，然后在37℃孵育1h。将反应进一步处理或在-20℃冷冻。

1.6.使用基于二氧化硅的柱纯化切割的短RNA片段

通过使用RNeasy微型试剂盒(Qiagen)改良RNA分离程序来纯化来自存在于核酶或RNA酶H介导的切割反应中的切割的或未切割的长RNA片段的混合物的切割的短RNA片段。首先，将100μl切割反应混合物与350μl的RLT缓冲液(来自RNeasy微型试剂盒的裂解缓冲液)和250μl的100％乙醇混合，并施加到柱上。包括未切割、全长mRNA和长3’切割片段的长RNA保留在柱上，而短5’切割产物收集在流通部分中。接着，将50μl的RLT缓冲液和500μl的100％乙醇加入到收集的流通部分(700μl)中，并将混合物依次以625μl的两个等分试样施加到第二二氧化硅柱上，每次在Heraeus Fresco 17离心机(Thermo Scientific)上以9,600×g离心15sec，在所有离心步骤中将温度保持在22℃至23℃。在这些条件下，与柱结合的短5’切割产物和核酶用500μl RPE缓冲液(来自RNeasy微型试剂盒的洗涤缓冲液)洗涤，并在9,600×g下离心15sec，随后的步骤用500μl的100％乙醇洗涤，并在9,600×g下离心2min。为了除去剩余的乙醇，将柱转移到干净的收集管中，在17,000×g离心1min。然后将柱转移到干净的1.5ml管中，通过向柱中加入30μl无RNA酶的水，然后在13,800×g下离心1min来洗脱短RNA片段。通常，对于<5kb长的RNA，每柱纯化20μg的RNA，或者对于>5kb长的RNA，每柱纯化60μg的RNA。

1.7.通过从聚丙烯酰胺凝胶洗脱纯化切割的短片段

作为第二选择，根据从Nilsen 2013[22]改良的方法进行切割的短片段的纯化，由此分离之后从用8M尿素制备的21％聚丙烯酰胺凝胶中洗脱。在Tris-Borate-EDTA(TBE)缓冲液中的Bio-Rad Mini-Protean Tetra Cell上平行处理的2微凝胶中分离样品。将第一凝胶用在TBE缓冲液中以1:10,000稀释的金核酸凝胶染料(Thermo FisherScientific S11494)染色并用作参考，同时将相应的目的条带从平行运行的未染色的第二凝胶切下。将切下的凝胶片段转移到400μl洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl，3M乙酸钠，1mMEDTA，0.25％ SDS)中，在干冰上冷冻15min并在室温下储存过夜以允许RNA释放到溶液中。在17000×g离心10min后，上清液含有RNA，其用等体积的酸-苯酚/氯仿提取，然后用氯仿提取。进行异丙醇沉淀，并将回收的RNA溶解在10μl无RNA酶的水中。

1.8.通过PAGE可视化和分析切割的短片段

用凝胶加载缓冲液II(Ambion)以1:1稀释被核酶或RNA酶H切割的RNA片段：1)在切割后直接，2)在切割和二氧化硅柱纯化后，或3)在如上所述从凝胶纯化后。对于最佳的加载，样品之间的反应体积是恒定的，并且纯化的短RNA片段的浓度为10-70ng/μl。将RNA样品在65℃下变性10min，然后使用21％ PAGE、8M尿素在TBE缓冲液中分离2-2.5h，用金染色，并使用Gel Doc EZ系统(Bio-Rad)通过紫外光可视化。在Image Lab 5.0软件(Bio-Rad)中使用卷积工具分析图像。选择RNA条带的图像，其对应于1)较慢移动的加帽5’切割产物RNA，2)短1个核苷酸、较快移动的未加帽5’切割产物RNA，和3)相同面积的背景。为了定量加帽效率，对每个RNA样品测量对应于加帽和未加帽RNA的条带的相对强度，并减去背景值。合并的2个条带的总强度被认为是100％。对应于加帽RNA的条带的计算值代表加帽效率。

1.9.核酶切割产物的LC-MS分析

LC-MS使用Acquity超高效液相层析(UPLC)系统(Waters)进行，所述系统与配备有以负离子化模式操作的电喷雾源的Xevo TQ-S质谱仪(Waters)连接。在m/z 400-2,000的范围内获得MS光谱。所有样品在60℃的柱温下，在Acquity Beh C18柱(Waters，2.150mm；1.7μm的颗粒尺寸)上进行层析。将分析物在16.6mM三乙胺(TEA；VWR)、100mM六氟异丙醇(HFIP；Sigma)和10％甲醇，Ultra LC-MS级别(Carl Roth)作为缓冲液A，16.6mM TEA、100mM HFIP和95％甲醇作为缓冲液B的梯度中分离，流速为0.3ml/min。对于>20nt长度的寡核苷酸施加的梯度是：0％1.5min、0％至7％经3.5min、7％至15％经6.25min、15％至40％缓冲液B经4.5min。

2.结果

2.1.核酶测定定量IVT mRNA的加帽效率

人α珠蛋白(hAg)和TEV 5’非翻译区(5’UTR)是用于治疗性IVT mRNA的最广泛使用的5’UTR[16，23，24]。设计靶向hAg或TEV的5’UTR序列的核酶(表4，参见方法部分)。预期此处设计的所有五种核酶形成充分描述的锤头状结构，并在确定的核苷酸三联体之后切割靶向的RNA[19,25]。核酶在AUC或GUC三联体之后最有效地切割，而其它三联体也可以被靶向，但具有以下降低的切割效率：GuA，AUA，CUC>AUU，UUC，UUA>GuU，CUA>UUU，CUU[21]。Rz1、Rz3和Rz4被设计成在GUC后切割，而Rz2在GUA后切割。Rz5含有肌苷(I)，其允许在TEV 5’UTR中的ACA三联体之后识别和切割[21]。

表4.设计的核酶的长度和示例切割产物。

识别序列为下划线；切割位置表示为N>；CP，切割产物；hAg，人α珠蛋白；TEV，烟草蚀纹病毒；Rz，核酶；5’UTR，5’非翻译区。

每个核酶介导的切割反应产生仅在其长度上彼此不同的短的加帽和未加帽RNA5’切割产物-由于加帽结构，加帽RNA恰好长一个核苷酸。设计核酶以从靶RNA切割10-30nt长的产物，而核酶为35-47nt，允许5’切割产物和核酶的分离和分化(表4)。与靶RNA互补的Rz2和Rz5序列也含有2’-O-甲基化的核苷酸，以通过增加形成的双链结构的稳定性来增强切割。

为了定量加帽效率，将Rz退火至mRNA底物(图1)。在Mg⁺⁺离子存在的情况下，IVTmRNA的5’端被切割，产生短的加帽和/或未加帽5’切割产物、长的3’切割产物、长的未切割的RNA和Rz的混合物。在使用21％ PAGE、8M尿素或LC-MS分析可视化之前，使用优化的条件使用基于二氧化硅的MinElute Qiagen柱纯化短的Rz切割的片段(图1)。在这种情况下，5’切割产物与核酶一起被纯化并进一步可视化/定量。5’切割产物的纯化对于LC-MS分析是必需的，并且还改善了使用21％ PAGE、8M尿素的RNA可视化。

通过从凝胶中提取和洗脱5’切割产物(参见方法部分，数据未显示)，在PAGE分离的样品上实施可选择的纯化方法。该方法使得从混合物中消除未切割和3’末端切割的RNA产物以及核酶，这在使用Rz和重叠的5’切割产物设计LC-MS分析的情况下可能是有利的。然而，该纯化步骤在实验上是耗时的并且不容易扩大。使用这种方法，可以在2天内平行纯化2-4个样品，而使用基于二氧化硅的柱可以在少于1天内平行纯化12个样品，并可以选择扩大。

在此，我们描述了评估加帽效率的测定方法。该方法由核酶切割反应、切割片段的纯化，以及使用21％ PAGE、8M尿素或LC-MS分析可视化加帽和未加帽产物组成。

2.2.核酶切割测定优化

为了确定用于切割反应的Rz与RNA底物的最佳摩尔比，选择112nt长的含U或m1Ψ的mRNA底物。使用上述短底物允许检测和区分未切割的RNA、5’和3’切割产物，并且在相同的凝胶上分离Rz。图2显示了用21％ PAGE、8M尿素检测的112nt长的未切割RNA、22nt和90nt长的5’和3’切割产物和39nt长的Rz1。对含有U和m1Ψ的RNA测试了Rz在RNA底物上的摩尔浓度增加。选择相对于RNA底物2.5倍过量摩尔浓度的Rz并将其用于所有随后的实验。

为了进一步优化，测试切割反应期间的各种温度设置。如在1.4节中详述的，反应在25℃、37℃和50℃下用Rz1、Rz3和Rz4进行。

在该实验中，温度对Rz切割没有任何显著影响，并且使用不同的温度设置获得相同的加帽效率结果。然而，在50℃下进行的反应导致更显著的降解(数据未示出)。Takagi等人和Sawata等人发现，在25℃以下，产物离解步骤成为速率确定步骤，并且在37℃的温度下，没有检测到爆发动力学，并且核酶化学切割是速率确定步骤[26,27]。考虑到他们和我们的发现，在随后的实验中使用在37℃下的切割反应。

2.3.使用21％ PAGE、8M尿素可视化5’切割产物后的加帽效率定量

为了测量加帽效率，使用21％ PAGE、8M尿素可视化短的加帽和未加帽5’切割产物。作为原理证明实验，使用编码促红细胞生成素(EPO)的mRNA进行切割反应。使用Rz1和Rz2切割含有GCG转录起始位点(TSS)和hAg 5’UTR的IVT mRNA。用Rz5切割编码EPO的含有GGA TSS和TEV 5’UTR的IVT mRNA。测试以下含U和m1Ψ的RNA：未加帽(-)、没有2’-O-甲基化的酶促加帽(E0)、酶促加帽和2’-O-甲基化的(E1)或ARCA共转录加帽(A0)。使用21％ PAGE、8M尿素，代表核酶(Rz)和短的加帽以及未加帽5’切割产物的条带在预期的大小下被检测(图3)。

在没有基于二氧化硅的柱纯化步骤的核酶介导的切割反应后，在21％ PAGE、8M尿素凝胶中观察到3’端切割产物或未切割的长RNA。在使用基于二氧化硅的柱纯化后，观察到长RNA片段的消耗和代表短的加帽和未加帽5’切割产物的信号的增加。如预期的，使用21％PAGE、8M尿素可视化显示在所有未加帽的对照(-)RNA样品中在凝胶底部存在条带。此外，在所有酶促加帽的(E0和E1)样品中，在大多数情况下观察到加帽的高强度条带，而未加帽的条带未观察到或具有较低的强度，表明酶促加帽RNA的高加帽效率。相反，无论使用RNA或Rz，在ARCA(A0)样品中都以类似的强度检测到加帽和未加帽的条带。

对于所有12个酶促加帽(E0和E1)样品，检测到大约84％-100％的加帽效率，而不依赖于5’端和所使用的核酶，而ARCA(A0)样品对于hAg 5’UTR显示出34％-53％的加帽效率，对于含TEV 5’UTR的RNA显示出67％-77％的加帽效率(表5)。当比较纯化的E0 RNA和相应的2’-O-甲基化的E1 RNA的％加帽效率时，在6个实例中有5个看到+/-1％的差异，显示测定的高重复性。

表5.在核酶介导的切割测定和使用21％ PAGE、8M尿素的可视化之后定量IVTmRNA的加帽效率。

没有2’-O-甲基化(E0)的酶促加帽，酶促加帽且2’-O-甲基化的(E1)，ARCA共转录加帽(A0)，未修饰的/含尿苷的(U)、含m1Ψ的(m1Ψ)，hAg，人α珠蛋白；TEV，烟草蚀纹病毒。

与未经二氧化硅柱纯化的核酶切割的RNA相比，经二氧化硅柱纯化的RNA的加帽效率始终变化较小。在使用不同批次的纯化RNA的12个实例中的10个中，E0和E1均显示90％至96％的加帽效率，而对于相同的未经二氧化硅柱纯化的RNA，观察到的加帽效率范围为88％至100％(表5)。因此，推荐使用二氧化硅柱的纯化作为程序的标准部分，不仅用于LC-MS分析，而且用于使用21％ PAGE、8M尿素的可视化和加帽效率定量。

2.4.通过核酶介导的切割的加帽测定有效地评估不同长度的不同加帽的IVTmRNA的加帽效率

为了测试核酶介导的切割是否可以检测不同长度的IVT mRNA的加帽，对长度范围为1.1kb至9.4kb的5个IVT mRNA进行Rz5切割反应(不修改上述方法)。1.1kb长的β-S-ARCA(D1)加帽TEV 5’UTR，含m1Ψ的RNA显示61％的加帽效率，而2.3-9.4kb长的Reagent AG(3’OMe)，帽1(CC1)RNA显示81％-92％的加帽效率(图4)。％加帽与RNA长度之间没有观察到相关性。本文所述的方法成功地评估了不同长度的IVT mRNA的加帽效率，所述不同长度的IVT mRNA使用不同的帽结构加帽。

2.5.核酶介导的切割测定检测在共转录加帽RNA的另外酶促加帽之后加帽效率的增加

为了进一步测试核酶介导的切割测定性能，随后将共转录加帽D1含有U的GCG TSShAg 5’UTR IVT mRNA进行酶促加帽(E1)。尽管共同转录D1加帽IVT mRNA最初显示67％的加帽效率，但在随后的E1加帽之后，加帽效率增加到94％(图5)。该发现证实D1中5’切割产物有相当一部分确实是未加帽的，并且不代表在转录起始中潜在地跳过第一个G的T7 RNA聚合酶，这可能导致相同的RNA片段比加帽片段短1nt并且等于未加帽片段的大小。

2.6.核酶介导的切割测定性能优于RNA酶H切割测定

为了比较核酶介导的和RNA酶H介导的切割测定，我们开发了能退火至hAg 5’UTR序列的六个RNA酶H探针。如方法部分所述进行RNA酶H切割反应，并筛选探针(数据未显示)。选择含有六个DNA核苷酸(dN)和十个2’-O-甲基化RNA核苷酸的片段的探针(P1)，这是由于其优异的性能(表6)。

表6.RNA酶H切割测定探针和产物。

粗体的DNA核苷酸，dN；m，2’-O-Met；hAg，人α珠蛋白。

hAg GCG起始酶促加帽的(E0或E1)或共转录ARCA加帽的(A0)含U和m1Ψ的RNA的5’端被RNA酶H切割(图6)。RNA酶H切割证实了先前通过核酶介导的切割检测的酶促RNA的高加帽效率(纯化的hAg GCG：75％-85％)。对于ARCA样品，获得了相当低的37％-47％的加帽效率(图6，表7)，这与2.3节中所示的数据一致。

与核酶介导的切割相反，RNA酶H切割产生另外的条带。条带长1nt(长为21nt或22nt)，并出现在所有含U的样品中，包括未加帽RNA，分别与预期的20nt和21nt的短RNA片段相邻或重叠，对应于未加帽的和加帽的酶促5’切割产物(图6)。该发现表明RNA酶H在两个位置切割：在第四个DNA核苷酸之后的预期位置，并且在第五个DNA核苷酸之后的具有较低的效率的位置，从而使含U样品中的加帽效率分析复杂化(图6)。此外，在所有RNA酶H切割的样品中，观察到无酶对照中不存在大量非特异性长RNA片段(图6)。这些不同大小的非特异性长RNA片段不能通过基于二氧化硅的柱纯化而耗尽。它们的存在使得从21％ PAGE、8M尿素凝胶的加帽效率定量不太可重复，并且这可能导致复杂的LC-MS分析。

因此，使用特异性探针的RNA酶H切割可用于定量使用21％PAGE、8M尿素的加帽效率。然而，与RNA酶H切割相反，核酶介导的切割导致单一位点切割并且不产生非特异性长片段的斑迹，允许使用21％ PAGE、8M尿素或LC-MS分析进行可靠的定量。

表7.RNA酶H切割测定和使用21％ PAGE、8M尿素可视化后定量IVT mRNA的加帽效率。

没有2’-O-甲基化(E0)的酶促加帽，酶促加帽并2’-O-甲基化(E1)，ARCA共转录加帽(A0)，未修饰的/含尿苷的(U)，含m1Ψ的(m1Ψ)；hAg，人α珠蛋白。

2.7.使用核酶介导的切割测定的加帽效率的LC-MS分析

作为原理的证明，对核酶切割的和基于二氧化硅的柱纯化的短5’切割产物进行LC-MS分析，所述短5’切割产物来自酶促加帽的和2’-O-甲基化的(E1)或Reagent AG(3’OMe)(CC1)AGG TSS，hAg 5’UTR，含m1Ψ的IVT mRNA。E1加帽IVT mRNA的UPLC和MS图谱(图7)显示：

·占预期主要产物的68％

(7MeGpppA(Ome)GGCGAACU*AGU*AU*U*CU*U*CU*GGU*C>p),

·20％未甲基化产物

(7MeGpppAGGCGAACU*AGU*AU*U*CU*U*CU*GGU*C>p),

·和1％的另外产物(+G)。

检测到89％的E1加帽产物(AGG TSS IVT mRNA)与使用21％PAGE、8M尿素检测到的95％-96％一致；此外，使用不同批次和GCG TSS RNA进行PAGE。

Reagent AG(3’OMe)，N-7413TriLink(CC1)EPOmRNA的UPLC和MS图谱显示>99％加帽(图8)，这也与使用21％ PAGE、8M尿素筛选>100个CC1加帽的IVT mRNA的获得的>90％加帽效率一致(图4和数据未显示)。因此，结合基于二氧化硅的柱纯化的核酶介导的切割测定与LC-MS分析高度相容。如此处所示，应用于LC-MS产生了表征5’切割产物的另外的可能性，诸如确定甲基化状态或区分次要加帽产物。

3.讨论

mRNA疫苗和治疗剂的质量控制在每个发阶段都是必需的，从临床前研究到临床应用，以及支持销售授权。mRNA分子上的帽结构决定mRNA翻译，因此与mRNA的治疗功效相关[7-9]。在mRNA产生的过程中，可以酶促或共转录进行mRNA的加帽。这两种策略都产生加帽和未加帽mRNA分子的混合物。在本研究中，我们开发了基于核酶介导的切割反应来检测加帽效率的分析方法。在该反应之后，下一步骤是使用21％ PAGE、8M尿素或LC-MS的二氧化硅柱纯化和可视化以及定量。使用21％ PAGE、8M尿素的可视化允许平行分析大量mRNA样品，而不需要特定的设备。此外，本文所述的方法与LC-MS相容，允许深入表征，其中不仅可以从同一样品中检测到加帽的百分比，而且可以检测到甲基化状态和潜在的次要加帽副产物。

如前所述，当前评估加帽效率的方法具有局限性，诸如需要放射性标记[10-12]或相当不敏感的检测加帽水平[14]。Beverly等人开发了基于特异性生物素标记的探针的RNA酶H切割，然后使用链霉亲和素包被的磁珠纯化和LC-MS分析来评估加帽效率的测定[13]。此处，我们直接比较了我们开发的针对hAg 5'UTR的核酶介导的切割测定和为相同5’UTR设计的RNA酶H切割测定。如预期的，核酶仅在IVT mRNA中的一个位置切割，并且在基于二氧化硅的纯化之后，在凝胶上仅观察到三个短RNA片段(核酶以及加帽和未加帽5’切割产物)，从而允许精确定量。相反，RNA酶H在两个位置切割，导致加帽的和未加帽5’切割产物和另外的意想不到的长了1nt的条带，也出现在未加帽RNA对照样品中。这使得使用RNA酶H测定进行定量很麻烦。这些结果与Beverly等人的观察一致，Beverly等人还报道了RNA酶H切割和生物素标记分析后的两个切割位点[13]。此外，我们观察到RNA酶H切割也产生大量非特异性长切割的RNA片段，这些片段预期对定量产生负面影响。我们得出结论，在本研究中开发的基于核酶切割的测定与用于加帽检测的其它测定相比显示出重大益处。

为了定量加帽效率，用于这些测定的核酶的设计取决于靶mRNA的5’末端序列。因此，在从mRNA的5’端起10nt和30nt位置之间的结构上可接近的区域中需要核酶切割位点。在该研究中，设计锤头状核酶以在GUC(Rz1、Rz3、Rz4)、GUA(Rz2)或ACA(Rz5)三联体之后切割。除了此类三联体之外，还可以使用可以由锤头状核酶靶向的其它NUH三联体(H表示A、C或U)(NUH切割效率按递减顺序为：AUC>AUA，CUC>AUU，UUC，UUA>GUU，CUA>UUU，CUU[21])。在核酶识别序列(如在Rz5中)中掺入肌苷允许额外靶向NCH三联体(例如ACA)。靶向典型NUH三联体和非典型NCH位点的可能性通过允许选择5’UTR内最易接近的切割位点而显著改善了该测定的通用性[21]。本文中开发和优化的测定可用于可重复地定量具有不同帽、含有不同5’UTR和不同长度的含U或m1Ψ的IVT mRNA的加帽效率。使用牛痘病毒加帽酶系统后观察到的89％至100％的加帽效率证实了Beverly等人报道的88％至98％的加帽[13]。此外，我们显示了不同的帽结构可以导致不同的加帽效率，它们在使用相同帽结构生产的不同IVTmRNA批次之间相对一致。例如，尽管酶促加帽和共转录加帽Reagent AG(3’OMe)(Trilink)通常产生>90％的加帽效率，但使用ARCA-G(Trilink)或β-S-ARCA(D1)的共转录加帽导致范围为34％至77％的较低的加帽效率。

综上所述，本研究中开发的核酶介导的切割测定是用于研究和开发目的的加帽效率的简便、快速和可靠分析的有用测定，或作为含有hAg和TEV 5’UTR的基于mRNA的治疗剂的质量控制。用于核酶分析设计、短片段纯化和通过凝胶电泳或LC-MS的可视化或定量的相同方法可以用于开发靶向针对其它5’UTR的核酶测定，允许在mRNA治疗领域中的更广泛的应用。

实施例2

催化性核酸(例如核酶)切割的IVT mRNA的两步基于二氧化硅的柱层析

·将催化性核酸(例如核酶)切割的IVT mRNA混合物与水性缓冲液混合，然后加入乙醇(缓冲液体积>或＝乙醇体积)，并施加到第一基于二氧化硅的柱上。

·离心步骤后，将长RNA(包括未切割的全长mRNA和长3’切割片段)保留在柱上，而短5’切割产物收集在流通部分中。

·接着，将缓冲液和乙醇加入到收集的流通部分(含水缓冲液<乙醇体积)中，并将混合物施加到第二二氧化硅柱上。

·在这些条件下，与柱结合的短5’切割产物被洗涤并以多个步骤离心直到从柱中洗脱。

·5’端短产物的纯化改善了UPLC和/或LC-MS分析的重复性，并改善了聚丙烯酰胺凝胶的可视化和定量。

实施例3

在与上述实施例1类似的实验方案中，该实施例将实施例1中使用的核酶(Rz1)与五种其它核酶进行比较，所述其它核酶各自靶向NCH切割位点，例如ACA、CCA、CCC。特别地，核酶Rz6至Rz10(SEQ ID No:6-10)和Rz1用于切割加帽(CC1)和未加帽(ppp)RNA分子。图9所示的结果显示，使用靶向RNA分子中NCH型位点的核酶，在10-31个核苷酸的范围内，加帽或未加帽短5’切割产物的有效切割和释放。

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Claims (61)

1.用于分析RNA分子群的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)在允许所述RNA分子切割以产生5’末端片段和至少一个3’片段的条件下，使催化性核酸分子与RNA分子群接触，所述RNA分子群包含含有用于所述催化性核酸分子的切割位点和5’帽结构的一种或多种RNA分子，

(b)将步骤(a)中获得的所述5’末端片段至少部分地与所述至少一个3’片段分离，得到5’末端片段群，以及

(c)在从步骤(b)中获得的所述5’末端片段群中确定具有所述5’帽结构的RNA分子的量。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述RNA分子群是mRNA分子、自复制RNA、ncRNA和/或sRNA的群。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤(a)中，所述催化性核酸分子与通过体外转录或固相合成获得的RNA分子群接触。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述RNA分子中，所述切割位点位于所述RNA分子的5’端的下游至少5nt。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述RNA分子中，所述切割位点位于所述RNA分子的5’端的下游至多50nt。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述RNA分子包含5’UTR。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述5’UTR选自人α珠蛋白(hAg)5’UTR和TEV 5’UTR。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述RNA分子包含所述催化性核酸分子的至少一个切割位点。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述催化性核酸分子在5’UTR序列中的切割位点切割。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中存在于步骤(b)后获得的群中的以占所有切割和未切割的RNA分子的百分比表示的5’末端片段的量大于存在于步骤(b)之前的群中的以占所有切割和未切割的RNA分子的百分比表示的5’末端片段的量，从而提供富集的或至少部分纯化的5’末端片段群。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述催化性核酸分子在所述RNA分子中的5’-NUH-3’切割位点处进行切割以产生包含NUH>p 3’端的5’片段，其中

N选自G、A、C和U；并且

H选自A、C和U。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述催化性核酸分子在所述RNA分子中的5’-NCH-3’切割位点处进行切割以产生包含NCH>p 3’末端的5’片段，其中

N选自G、A、C和U；并且

H选自A、C和U。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述催化性核酸分子是核酶或脱氧核酶。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述催化性核酸分子是锤头状核酶、发夹状核酶或HDV核酶。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述催化性核酸分子和/或所述RNA分子包含至少一个经修饰的核苷酸。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述催化性核酸分子包含：

(i)选自SEQ ID NO:1-25的序列，

(ii)与SEQ ID NO:1-25中任一个具有至少80％同一性的序列，和/或

(iii)(i)和/或(ii)的片段，

其中所述催化性核酸分子包含催化核心。

17.根据权利要求16所述的方法，其中

Am独立地选自A和2’-O-甲基腺苷，

Gm独立地选自G和2’-O-甲基鸟苷，

Um独立地选自U和2’-O-甲基尿苷，和/或

Cm独立地选自C和2’-O-甲基胞苷。

18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(a)中，在加帽类似物存在的情况下，使所述催化性核酸分子与通过酶促或/和共转录加帽加帽的RNA分子群接触。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述加帽类似物选自：G[5’]ppp[5’]G、m⁷G[5’]ppp[5’]G、m₃ ^2,2,7G[5’]ppp[5’]G、m₂ ^7,3'^-OG[5’]ppp[5’]G(3’-ARCA)、m₂ ^7,2'^-OGpppG(2’-ARCA)、m₂ ^7,2’-OGpp_spG D1(β-S-ARCA D1)、m₂ ^7,2'^-OGpp_spG D2(β-S-ARCA D2)、m7(3’OMeG)(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG(Reagent AG(3’OMe))和m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG(Reagent AG)。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(a)中，使所述RNA分子群与过量的催化性核酸分子接触。

21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(a)中，所述RNA分子群与所述催化性核酸分子以约1:1至约1:20的RNA分子与催化性核酸分子的摩尔比接触。

22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述5’末端片段的长度允许区分加帽5’末端片段和非加帽5’末端片段。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述加帽5’末端片段和非加帽5’末端片段在长度上相差1至3个核苷酸。

24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(a)中获得的所述5’末端片段的长度至少为5nt。

25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(a)中获得的所述5’末端片段的长度至多为50nt。

26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(a)中，所述5’末端片段在具有所述至少一个3’片段、所述催化性核酸分子和/或未切割的RNA分子的混合物中获得。

27.根据权利要求26所述的方法，其中步骤(b)包括在允许所述5’末端片段与所述至少一个3’片段、所述未切割的RNA分子和/或所述催化性核酸分子至少部分分离的条件下，使用基于二氧化硅的固定相对在步骤(a)中获得的所述混合物进行层析。

28.根据权利要求27所述的方法，其包括两个单独的层析步骤，其中使用基于二氧化硅的固定相。

29.根据权利要求26所述的方法，其中步骤(b)包括在允许所述5’末端片段与所述至少一个3’片段和/或所述未切割的RNA分子至少部分分离的条件下，对在步骤(a)中获得的所述混合物进行PAGE。

30.根据权利要求29所述的方法，其还包括(i)从所述PAGE凝胶中分离至少一个目的条带，所述至少一个条带包含所述5’末端片段，和(ii)从在步骤(i)中获得的分离的至少一个条带中洗脱所述5’末端片段。

31.根据权利要求26所述的方法，其中步骤(b)包括在允许所述5’末端片段与所述至少一个3’片段和/或未切割的RNA分子至少部分分离的条件下，使在步骤(a)中获得的所述混合物与寡dT核苷酸接触。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述寡dT核苷酸与塑料珠或磁性珠连接，或与生物素连接。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述珠形成柱。

34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述催化性核酸分子被标记。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述标记是生物素。

36.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述催化性核酸分子与表面连接。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述表面是磁珠或塑料珠或颗粒。

38.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中分离步骤(b)还包括在允许所述5’末端片段与所述催化性核酸分子至少部分分离的条件下将所述5’末端片段与所述催化性核酸分子分离。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述分离包括在允许所述5’末端片段与所述标记的催化性核酸分子至少部分分离的条件下，使步骤(a)的所述混合物与结合所述标记的催化性核酸分子的材料接触。

40.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(b)中，所述加帽5’末端片段不与非加帽5’末端片段分离。

41.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(b)和(c)是单独的步骤。

42.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述加帽5’末端片段比所述非加帽5’末端片段长一个、两个或三个核苷酸。

43.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括凝胶电泳、光谱分析、质谱分析、液相层析和/或测序。

44.根据权利要求43所述的方法，其中凝胶电泳是PAGE。

45.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在从步骤(b)中获得的所述至少部分纯化的5’末端片段中确定具有所述5’帽结构的RNA分子的量。

46.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(c)中，确定所述加帽5’末端片段和所述非加帽5’末端片段的量。

47.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(c)中，计算所述加帽5’末端片段相对于所述5’末端片段的总量的百分比。

48.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括：

(d)分析所述加帽5’末端片段中的帽结构。

49.用于确定RNA分子群中的加帽效率的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)在允许所述RNA分子切割以产生5’末端片段和至少一个3’片段的条件下，使催化性核酸分子与RNA分子群接触，所述RNA分子群包含含有用于所述催化性核酸分子的切割位点和5’帽结构的一种或多种RNA分子，

(b)将在步骤(a)中获得的所述5’末端片段至少部分地与所述至少一个3’片段分离，得到5’末端片段群，以及

(c)在从步骤(b)中获得的所述5’末端片段群中确定具有所述5’帽结构的RNA分子的量。

50.用于分析RNA分子的方法，其包括以下步骤：

(i)合成RNA分子，

(ii)对(i)中合成的所述RNA加帽，以及

(iii)通过权利要求1至55中任一项所述的方法分析所述RNA分子。

51.用于加帽RNA合成质量控制的方法，其包括以下步骤：

(i)合成RNA分子，

(ii)对(i)中合成的所述RNA加帽，以及

(iii)通过权利要求1至55任一项所述的方法分析所述RNA分子。

52.根据权利要求50和51所述的方法，其中所述RNA分子是通过体外转录和/或固相合成的。

53.根据权利要求50-52中任一项所述的方法，其中所述RNA分子通过酶促或/和共转录加帽来加帽。

54.催化性核酸分子，其包含：

(i)选自SEQ ID NO:1-25的序列，

(ii)与SEQ ID NO:1-25中任一个具有至少80％同一性的序列，和/或

(iii)(i)和/或(ii)的片段，

其中所述催化性核酸分子包含催化核心。

55.根据权利要求54所述的催化性核酸分子，其中

Am独立地选自A和2’-O-甲基腺苷，

Gm独立地选自G和2’-O-甲基鸟苷，

Um独立地选自U和2’-O-甲基尿苷，和/或

Cm独立地选自C和2’-O-甲基胞苷。

56.根据权利要求54和55所述的催化性核酸分子，其是RNA分子。

57.根据权利要求54-56中任一项所述的催化性核酸分子，其是核酶。

58.权利要求54-57中任一项所述的催化性核酸分子在用于分析RNA分子群的权利要求1-52中任一项所述的方法中、在用于确定RNA分子群中的加帽效率的方法中、在分析RNA分子的方法中，和/或在加帽RNA合成质量控制的方法中的用途。

59.核酸分子，其包含：

(i)SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27的序列，

(ii)与SEQ ID NO:26和/或SEQ ID NO:27具有至少90％同一性的序列。

60.根据权利要求59所述的核酸分子，其是RNA分子。

61.根据权利要求59或60所述的核酸分子，其包含核酶的催化核心。