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CN118240914A - 一种脱氧核酶及检测mRNA加帽率的方法 - Google Patents

一种脱氧核酶及检测mRNA加帽率的方法 Download PDF

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CN118240914A
CN118240914A CN202410309857.5A CN202410309857A CN118240914A CN 118240914 A CN118240914 A CN 118240914A CN 202410309857 A CN202410309857 A CN 202410309857A CN 118240914 A CN118240914 A CN 118240914A
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CN
China
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mrna
dnazyme
rna
capping
cap
Prior art date
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CN202410309857.5A
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孙秀莲
赵晟
孙叶
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Yiming Suzhou Cell Biotechnology Co ltd
Nanjing Hongming Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Yiming Suzhou Cell Biotechnology Co ltd
Nanjing Hongming Biotechnology Co ltd
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Publication date
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    • C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Abstract

本文提供了一种检测RNA加帽效率的方法，包括如下步骤：1)采用脱氧核酶DNAzyme(10‑23)处理所述RNA，生成带有帽结构的RNA片段以及不带有所述帽结构的对应RNA片段；以及2)检测所述带有帽结构的RNA片段和所述对应RNA片段之间的比例关系，以确定所述加帽效率，其中所述脱氧核酶DNAzyme(10‑23)的两结合臂长度独立地选自11、12、13、14和15nt。本文还提供了上述脱氧核酶DNAzyme(10‑23)以及包括上述脱氧核酶DNAzyme(10‑23)的RNA加帽效率检测试剂盒。

Description

一种脱氧核酶及检测mRNA加帽率的方法
本申请为申请号为2023111590463、申请日为2023年9月9日，名称为一种脱氧核酶及检测mRNA加帽率的方法的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种脱氧核酶及检测mRNA加帽率的方法。
背景技术
核糖核酸(RNA)是所有生物遗传信息传递中重要的大分子，同时在生物体内也扮演着多种多样的调控角色，近年来RNA研究已成为生物学研究中最热门的领域之一。例如，基于mRNA的治疗方法，在实际应用中较为精准且可用于个体化治疗，与在患者体内产生治疗性蛋白相比，可避免复杂的生产问题；mRNA作为药物，相比基因治疗这种改变DNA产生永久不可逆效果的方法，副作用也小得多。因此，mRNA治疗已逐渐成为最热门的药物研究方向之一，有望成为应对多种疾病的有效方法，具有良好的发展前景。
有效的mRNA治疗需要将mRNA有效递送至患者体内，并在体内有效合成相应的蛋白质。为了优化mRNA递送和体内蛋白生成，通常在构建体的5′端需要进行适当的加帽，以防止mRNA降解同时促进蛋白翻译。因此，加帽效率的有效检测至关重要。最早的加帽检测方法是利用放射性同位素标记帽子结构，然后进行定性或定量的分析。放射性标记的方法灵敏度高，但需要使用同位素，具有一定的安全隐患和同位素污染风险，需要特殊防护手段，不容易推广，因而研究人员也开始研发不依赖同位素标记的检测方法。
CN114894916A公开了一种定量检测RNA加帽率的方法，根据待检测RNA序列设计脱氧核酶，利用所述脱氧核酶切割待检测RNA分子，检测切割后的待检测RNA的分子量以及相对比例，测定加帽效率。脱氧核酶是具有催化活性的单链DNA分子。一个众所周知的脱氧核酶家族是“10-23”脱氧核酶(DNAzyme(10-23))，它通过催化活性特异性识别、互补结合和切割RNA分子的靶序列，从而失去或降低被切割的RNA分子的活性。DNAzyme(10-23)有一个15个核苷酸的核心催化结构域，两侧是两个底物结合结构域(I和II)。根据Watson-Crick规则，10-23DNAzyme通过底物结合域I和II通过碱基配对与RNA底物结合。利用脱氧核酶切割待测RNA，通过测定其分子量来判断是否加帽成功，并可通过计算不同分子量的丰度定量测定RNA加帽效率。该方法灵敏度高，同时无需使用放射性标记，无需担忧放射性污染。然而，该已有方法并没有对DNAzyme(10-23)进行进一步优化和筛选，实际使用中常会遇到切割效率低下的情况。还有些方法中使用了RNaseH进行切割，但RNaseH的定点切割对目标序列有更严格的要求，通用性较差。另外还有些方法使用基于RNA的核酶(Ribozyme)，但相对于DNAzyme，Ribozyme和蛋白类核酸酶(如RNaseH)均更不稳定，制备成本远高于DNAzyme，且易引入其他杂质，如Ribozyme易发生降解导致无效RNA小片段杂质的产生，RNaseH制备过程中则常含有其他非特异性核酸酶残留。另外，该类基于质谱的方法均需要采用eHPLC-MS或LC-MS等昂贵设备对切割后的RNA进行检测，其使用和维护的成本均非常高。因而，如何设计出操作更简单、成本更低的检测方法，仍然是本领域亟待解决的问题。
本文引用的所有文章和参考文献的内容通过引用整体并入本文。
发明内容
在一方面，本文提供了一种检测RNA加帽效率的方法，包括如下步骤：
1)采用脱氧核酶DNAzyme(10-23)处理所述RNA，生成带有帽结构的RNA片段以及不带有所述帽结构的对应RNA片段；以及
2)检测所述带有帽结构的RNA片段和所述对应RNA片段之间的比例关系，以确定所述加帽效率，
其中所述脱氧核酶DNAzyme(10-23)的两结合臂长度独立地选自11、12、13、14和15nt。
在一些实施方案中，所述RNA为mRNA。
在一些实施方案中，所述脱氧核酶DNAzyme(10-23)的两结合臂长度相等。
在一些实施方案中，所述RNA片段的长度为26nt。
在一些实施方案中，通过分子量差异来确定所述RNA片段是否带有所述帽结构。
在一些实施方案中，通过毛细管电泳来确定所述比例关系。
在一些实施方案中，所述帽结构位于所述RNA的5′端。
在一些实施方案中，所述帽结构选自Cap O、Cap I和Cap II型结构。
在一些实施方案中，所述mRNA包括SEQ ID NO：1所示序列，所述脱氧核酶DNAzyme(10-23)包括SEQ ID NO：7、8、9、10和11中任一项所示序列。
在一些实施方案中，步骤1)包括将所述RNA与所述脱氧核酶DNAzyme(10-23)混合后于85℃预变性1min，随后37℃反应3h。
在一方面，本文提供了一种脱氧核酶DNAzyme(10-23)，其包括SEQ ID NO：7、8、9、10和11中任一项所示序列。
在一方面，本文提供了一种mRNA加帽效率检测盒，其包括上述脱氧核酶DNAzyme(10-23)。
附图说明
为了更好地理解本发明并更清楚地展示出如何实现本发明，现通过示例的方式并参考附图，阐述了根据本发明的实施方式的特征，其中：
图1：10-23_DNAzyme切割mRNA的原理示意图；
图2：通过DNAzyme(10-23)x-35对mRNA的5′-UTR区的不同切割位点进行切割后的毛细管电泳图谱；
图3：不同臂长DNAzyme(10-23)26-y对mRNA的5′-UTR区进行切割后的毛细管电泳图谱；
图4：mRNA酶法加帽不同反应时间后利用DNAzyme(10-23)26-43对mRNA进行切割的毛细管电泳检测图；
图5：mRNA帽类似物不同浓度转录共加帽后利用DNAzyme(10-23)26-43对mRNA进行切割的毛细管电泳检测图。
具体实施方式
为了对本发明的说明书中所使用的术语提供清楚且一致的理解，在下文中提供一些定义。此外，除了特殊说明，本发明所用的全部技术和科学术语具有同本发明所属领域中普通技术人员通常所理解的相同的含义。
当在权利要求和/或说明书中与术语“包括”结合使用时，词语“一”的使用可以表示“一个”，但它也与“一个或多个”，“至少一个”和“一个或多于一个”的含义一致。类似地，词语“另一个”可以表示至少第二个或者很多个。
如在本说明书和权利要求中所使用的词语“包括”(以及包括的任何形式，诸如“包括”和“包含”)，“具有”(以及任何形式的具有，“具有”、“包含”和“含有”)是包括性的和开放式的，并且不排除另外的未列出的要素或处理步骤。
术语“约”或“大约”用于表示该值包括在确定该值中所用的仪器和方法带来的误差。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语″约″意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
本说明书涉及了本领域技术人员所使用的许多术语和缩写。然而，为了清楚和一致性，提供了所选术语的定义。
“脱氧核酶”或“脱氧核糖核酸酶”或“DNAzyme”或类似表述是具有催化作用的DNA序列。它们包括一个由大约15个核苷酸组成的催化核心，两侧是位于催化核心的左右两边的短结合臂。虽然催化核心的序列是固定的，但结合臂可以被修改，以便特异性匹配几乎任何RNA靶序列。脱氧核酶的非限制性实例可参考Usman等人的美国专利No.6,159,714，其全部内容通过引用并入本文；Chartrand et al.，1995，NAR 23，4092；Breaker et al.，1995，Chem.Bio.2，655；Santoro et al.，1997，PNAS 94，4262；Breaker，1999，NatureBiotechnology，17，422-423；and Santoro et.a1.，2000，J.Am.Chem.Soc.，122，2433-39.以上全部内容通过引入并入本文。“10-23”DNAzyme基序是一种特殊类型的DNAzyme，它是使用体外选择进化而来的，如Joyce等人，美国专利No.5,777,37中一般描述的那样。美国专利号5,807,718和Santoro等人，同上。可以使用与这些参考文献中描述的技术类似的技术来选择额外的DNAzyme基序，因此，这些基序在本发明的范围内。
碱基是合成核苷、核苷酸和核酸的基本组成单位。生物体中常见的碱基有5种，分别是腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)，2019年又人工合成了4种碱基，美国科学家StevenA.Benner将这4个新成员分别命名为“Z”“P”“S”“B”(顾名思义，前5种碱基中，腺嘌呤和鸟嘌呤属于嘌呤族(缩写作R)，它们具有双环结构。胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶属于嘧啶族(Y)，它们的环系是一个六元杂环，也被称为主要或标准碱基，是组成遗传密码的基本单元，其中碱基A、G、C和T存在于DNA中，而A、G、C和U存在于RNA中。每个碱基对都含有一个嘌呤和一个嘧啶：A与T配对通过2个氢键相连，C与G配对或Z配P或S配B是通过3个氢键相连。“nt”指核苷酸的数量，也可指代核苷酸对应碱基的数量。
嘌呤-嘧啶间“互补性”是指核酸通过传统的Watson-Crick或其他非传统类型与另一个RNA序列形成氢键的能力。关于本发明的核酸分子，核酸分子与其靶序列或互补序列的结合自由能足以使核酸的相关功能得以进行，例如酶促核酸裂解、连接、异构化、磷酸化或去磷酸化。“完全互补”是指核酸序列的所有连续残基将与第二核酸序列中相同数量的连续残基形成氢键。
“RNA片段”在本文中指RNA(尤其是mRNA)经脱氧核酶DNAzyme(10-23)切割后产生的片段，尤其是与所关注的加帽效率相关的片段。例如，当关注5’端加帽效率时，该RNA片段指包括5’端碱基的5’端片段。在加帽不完全时(加帽效率小于100％)，同一样品中经脱氧核酶DNAzyme(10-23)处理后所产生的RNA片段可带有帽结构或不带有帽结构，即产生带有帽结构的RNA片段以及不带有帽结构的对应RNA片段(二者在核苷酸序列上相同，区别在于是否带有帽结构)。
“结合臂”、“底物结合臂”、“底物结合结构域”、“底物结合区”、“同源臂”或类似描述是指DNAzyme的部分区域，其能够通过互补性与其底物或报告基因的一部分互相结合。优选地，这种互补性是100％，但如果需要可以更低。例如，14个碱基中少至10个可以碱基配对(参见例如Werner和Uhlenbeck，1995，Nucleic Acids Research，23，2092-2096；Hammann等，1999，Antisense and Nucleic Acid Drug Dev.，9，25-31)。也就是说，这些包含在DNAzyme内的臂的序列，其旨在通过互补碱基配对相互作用将DNAzyme和底物例如RNA结合在一起。本发明的DNAzyme可以具有连续的或不连续的并且可以具有不同长度的结合臂。结合臂的长度优选大于或等于六个核苷酸并且具有足够的长度以稳定地与目标底物相互作用。DNAzyme左右两个结合臂的长度是对称的(即，每个结合臂具有相同的长度；例如，五个和五个核苷酸，或六个和六个核苷酸，或七个和七个核苷酸长)或不对称(即，结合臂长度不同；例如，六个和三个核苷酸；三个和六个核苷酸长；四个和五个核苷酸长；四个和六个核苷酸长；四个和七个核苷酸长)。
“帽结构”是指寡核苷酸任一末端的化学修饰(参见例如Wincott等人，WO 97/26270，通过引用并入本文)。这些末端修饰可以保护核酸分子免于核酸外切酶降解，并有助于细胞内的递送和/或定位。帽可存在于5′-末端(5′-cap)或3′-末端(3′-cap)或可存在于两个末端。在非限制性实例中：5′-帽选自包含倒转无碱基残基(部分)、4′，5′-亚甲基核苷酸的组；1-(β-D-erythrofuranosyl)核苷酸、4′-硫代核苷酸、碳环核苷酸；1，5-脱水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；修饰碱基核苷酸；二硫代磷酸键；苏戊呋喃糖基核苷酸；无环3′，4′-seco核苷酸；无环3，4-二羟丁基核苷酸；无环3，5-二羟基戊基核苷酸,3′-3′-反向核苷酸部分；3′-3′-倒置的脱碱基部分；3′-2′-反向核苷酸部分；3′-2′-倒置的脱碱基部分；1，4-丁二醇磷酸酯；3′-氨基磷酸酯；磷酸己酯；磷酸氨基己酯；3′-磷酸盐；3′-硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；或桥接或非桥接甲基膦酸酯部分(更多详情参见Wincott等人，国际PCT公开号WO 97/26270，通过引用并入本文)。在另一个优选的实施方案中，3′-帽选自：4′，5′-亚甲基核苷酸；1-(β-D-erythrofuranosyl)核苷酸；4′-硫代核苷酸，碳环核苷酸；5′-氨基烷基磷酸酯；1，3-二氨基-2-丙基磷酸酯、3-氨基丙基磷酸酯；6-磷酸氨基己酯；1,2-氨基十二烷基磷酸酯；磷酸羟丙酯；1，5-脱水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；修饰碱基核苷酸；二硫代磷酸酯；苏戊呋喃糖基核苷酸；无3′,4′-seco核苷酸；3，4-二羟丁基核苷酸；3，5-二羟基戊基核苷酸,5′-5′-反向核苷酸部分；′-5′-倒置的脱碱基部分；5′-氨基磷酸酯；5′-硫代磷酸酯；1，4-丁二醇磷酸酯；5′-氨基；桥接和/或非桥接5′-氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯、桥接或非桥接甲基膦酸酯和5′-巯基部分(更多详情参见Beaucage和Iyer，1993，Tetrahedron 49，1925；通过引用并入本文)。在一些实例中，帽结构为7-甲基鸟苷三磷酸m7Gppp(Cap O型)；在另一些实例中，帽结构包括7-甲基鸟苷三磷酸m7Gppp以及第一核苷碱基的2’-OH甲基化甚至第二核苷碱基的2’-OH甲基化(分别称为Cap I型和Cap II型)。示例性的mRNA加帽方法包括酶法加帽或帽类似物转录共加帽等。
本发明利用筛选和改进脱氧核酶DNAzyme(10-23)，提高其切割待检测mRNA分子的效率，产生足够多的切割后的RNA加帽片段产物或未加帽片段能被毛细管电泳上清晰的分离和检测，并分别予以定量，从而通过毛细管电泳仪即可对mRNA加帽率进行定量检测，该方法更简单、成本更低、检测设备也更易于获取。
相应地，在一方面，本发明提供一种mRNA加帽效率的检测方法，该方法包括：根据待检测RNA序列设计脱氧核酶DNAzyme(10-23)x-y，利用所述脱氧核酶切割待检测RNA分子，切割后的检测RNA分子分为加帽的短片段和不加帽的短片段。毛细管电泳检测从待检测RNA上切割下来的短片段的分子量以及两种短片段的相对比例，进而测定加帽效率，其中，所述x表示切割后产生的mRNA短片段核苷酸个数，y表示脱氧核酶自身核苷酸个数，且y为大于或等于37的整数。
由于一般情况下待检测RNA全长比较长，核苷酸数目比较多，分子量比较大，而对RNA的一端进行加帽，其增加的分子量相对于初始分子量微不足道，很难用仪器分辨出来，因此将加帽端或计划加帽端切割出来，成为分子量较小的短片段，其加帽短片段与未加帽短片段之间的差异化增加，有利于对加帽的或未加帽成功的短片段进行区分和读取，本申请采用DNAzyme(10-23)x-y对待检测RNA进行切割后，得到足够量加帽的或未加帽的短片段，然后利用毛细管电泳高灵敏和可进行单碱基高精度分辨的特点，检测从待检测RNA上切割下来的短片段，并对加帽的或未加帽的短片段的显示峰进行单碱基差异分离检测后，计算两种短片段的峰积分面积，进而测定加帽效率，其中，所述x表示切割后产生的mRNA短片段核苷酸个数，y表示脱氧核酶自身核苷酸个数，且y为大于或等于37的整数，通过调节x和y的数值，可以设计出能够通过毛细管电泳仪区分加帽的或未加帽短片段的DNAzyme(10-23)。
脱氧核酶(DNAzyme)是一种具有催化功能的单链DNA片段，具有高效的催化活性和结构识别能力，DNAzyme具有以下优点：(1)作为DNA分子相较于核酶(Ribozyme)更稳定，不易被破坏；(2)分子量相对较小，易于人工合成和修饰，成本远低于蛋白类核酸酶类(如RNaseH)和Ribozyme；(3)其结合臂与底物配对的精确度高，除了核心催化序列外，其他识别碱基序列部分可根据底物碱基序列进行改变，可筛选的目标切割位点较之RNaseH的切割方案更多且灵活，在应于mRNA加帽测试的RNA定点切割的综合性能方面优于RNaseH和Ribozyme。
进一步地，待检测mRNA的切割位置选择在位于mRNA的5′-加帽端。在一些实施方式中，待检测mRNA的切割位置选择在位于5′-加帽端100个碱基范围之内，如本申请实例中的切割范围的5′端序列如SEQ ID NO：1所示。
SEQ ID NO：1：
该范围一般属于待检测mRNA的5′-端100个碱基UTR区，通常对体外合成制备的mRNA常采用已验证的有助于稳定表达蛋白质的固定序列的5′-UTR和3′-UTR，因而这些mRNA的UTR区常常是一致的，因此本申请提供的脱氧核酶具有对使用相同UTR区的mRNA具有较好的切割普适性。对于其他不同UTR的mRNA，也可按照本申请所提供的设计原理和筛选策略快速获得高效可用的DNAzyme。
进一步地，x选自15-51中的任意整数，具体地，x可以是15、26、47、51。
在一些实施方式中，采用一种改进型脱氧核酶DNAzyme(10-23)在待检测mRNA分子的某一位点上进行切割，切割后产生的mRNA短片段核苷酸长度为26nt(x＝26)。
进一步地，y选自35-45中的任意整数，具体地，y可以是35、36，37、38、39、40、41、42、43、44、45。
在一些实施方式中，脱氧核酶两臂长度相等，y可以是35、37、39、41、43、45；在一些实施方式中，脱氧核酶两臂长度不相等。
在一些实施方式中，采用一种改进型脱氧核酶DNAzyme(10-23)在待检测mRNA分子的某一位点上进行切割，脱氧核酶自身核苷酸长度为43nt(y＝43)。
在一些实施方式中，脱氧核酶两臂长度均为11nt。在一些实施方式中，脱氧核酶两臂长度均为12nt。在一些实施方式中，脱氧核酶两臂长度均为13nt。在一些实施方式中，脱氧核酶两臂长度均为14nt。在一些实施方式中，脱氧核酶两臂长度均为15nt。
在一些实施方式中，采用一种改进型脱氧核酶DNAzyme(10-23)在待检测mRNA分子的某一位点上进行切割，切割后产生的mRNA短片段核苷酸长度为26nt(x＝26)，脱氧核酶自身核苷酸长度为41nt(y＝41)，且脱氧核酶两臂长度均为13nt。。
在一些实施方式中，采用一种改进型脱氧核酶DNAzyme(10-23)在待检测mRNA分子的某一位点上进行切割，切割后产生的mRNA短片段核苷酸长度为26nt(x＝26)，脱氧核酶自身核苷酸长度为43nt(y＝43)，且脱氧核酶两臂长度均为14nt。
在一些实施方式中，采用一种改进型脱氧核酶DNAzyme(10-23)在待检测mRNA分子的某一位点上进行切割，切割后产生的mRNA短片段核苷酸长度为26nt(x＝26)，脱氧核酶自身核苷酸长度为45nt(y＝45)，且脱氧核酶两臂长度均为15nt。
进一步地，待检测mRNA的加帽方法包括酶法加帽或帽类似物转录共加帽。
在一些实施方式中，待检测mRNA的加帽方法为酶法加帽；在在一些实施方式中，待检测mRNA的加帽方法为帽类似物转录共加帽。
进一步地，本发明设计出一系列脱氧核酶，脱氧核酶的序列如SEQ ID NO：7、SEQID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11所示。在一些实施方式中，脱氧核酶的序列如SEQ ID NO：10所示。
进一步地，mRNA加帽效率的检测方法中的切割的方法为：将待检测RNA与脱氧核酶混合并进行退火，退火的程序为85℃预变性1min，37℃反应3h。
在另一方面，本发明还提供一种脱氧核酶，脱氧核酶的序列如SEQ ID NO：9、SEQID NO：10或SEQ ID NO：11所示。
在另一方面，本发明还提供一种mRNA加帽效率检测盒，检测盒包括如检测盒包括如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11所示的任意一种或多种脱氧核酶。
本发明根据待检测mRNA的5′-端UTR区域序列设计DNAzyme(10-23)；然后，利用DNAzyme(10-23)定点切割mRNA分子；最后，反应混合物直接上机，利用毛细管电泳的方法检测剪切后的mRNA产物的分子量大小以及相对比例，从而测定加帽效率。对mRNA进行加帽时，由于mRNA加帽效率的差异，体系中会存在加帽的和未成功加帽的mRNA，当用特异性DNAzyme(10-23)对mRNA定点剪切后，体系中加帽的mRNA和未加帽的mRNA经毛细管电泳分析会产生分子量差异，即加帽的mRNA增加了分子量的大小，根据加帽mRNA与总mRNA(加帽和未加帽mRNA)相对比值得出加帽效率。
本发明提供的mRNA加帽效率的检测方法，根据待检测RNA序列设计脱氧核酶DNAzyme(10-23)x-y，利用所述脱氧核酶切割待检测RNA分子，得切割后的5′端RNA加帽片段产物能和其他片段产物以及脱氧核酶本身在毛细管电泳上被清晰的分离和定量，从而通过毛细管电泳仪对mRNA加帽率进行检测，测定加帽效率，其中，所述x表示切割后产生的mRNA短片段核苷酸个数，y表示脱氧核酶自身核苷酸个数，且y为大于或等于37的整数。该方法更简单、成本更低、检测设备易于获取。
实施例
通过参考以下实施例将更容易理解本发明，所述实施例用于说明本发明，而不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。
除非另有定义或上下文另有明确规定，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。应当理解，与本文所述类似或等同的任何方法和材料可用于本发明的实践或测试。
除非另有定义或上下文另有明确规定，本文使用的所有材料或仪器均来自商业购买。
尽管参照本发明的实施例详细描述了本发明，但提供这些实施例是为了说明而不是限制本发明。根据本发明原理能够得到的其它实施例均属于本发明权利要求所界定的范畴。
DNAzyme(10-23)酶活性中心由15个脱氧核糖核苷酸序列组成，为“10-23基序(motif)”-5′-GGCTAGCTACAACGA-3′，活性中心两端为底物结合区，其长度一般为7～12nt，与靶mRNA通过Watson-Crick碱基配对进行特异性结合，其序列可以根据底物mRNA的不同而改变，切割位点位于mRNA分子上未配对的嘌呤和配对的嘧啶之间的磷酸二酯键，由于加帽的mRNA会和未加帽的mRNA切割产物中包含5′-端切割后小片段产物之间单核苷酸的分子量差异，在毛细管电泳上以不同时间出峰，根据其峰面积可以算出其产量。切割原理图如图1所示。
本发明实施例中实验材料及仪器包括：
1、T7 HighYield RNATranscription Kit，Vazyme(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)；
2、GTP，Vazyme；
3、10×Capping Buffer；
4、Vaccinia Capping Enzyme，Vazyme；
5、mRNA Cap 2’-O-Methyltransferase，Vazyme；
6、SAM(S-腺苷甲硫氨酸)，Vazyme；
7、DNase I(脱氧核糖核酸酶1)，Vazyme；
8、共转录加帽T7体外转录试剂(Cap GAG)武汉瀚海新酶生物科技有限公司；
9、CleanCap@AG，TriLink；
10、UltraPureTM无DNase/RNase蒸馏水，InvitrogenTM；
11、Tris-HCl(三(羟甲基)氨基甲烷)，InvitrogenTM；
12、LiCl沉淀溶液(7.5M)，InvitrogenTM；
13、MgCl2，AmbionTM；
14、高分辨率卡夹(S1)，货号C105202，光鼎生物科技(江苏)有限公司；
15、Qsep1 Plus便携式毛细管电泳仪，光鼎生物科技(江苏)有限公司；
本发明中所涉及的材料及仪器，如无特殊标识，均由商业购买所得，所有DNAzyme和寡核苷酸均由通用生物(安徽)股份有限公司合成。
实施例1：合成未加帽的mRNA
本实施例利用体外转录合成未加帽的mRNA。使用限制性内切酶线性化转录模板质粒后，通过T7 RNA聚合酶启动RNA的体外转录，得到未加帽的mRNA。反应体系如表1所示。使用T7 High Yield RNA Transcription Kit，Vazyme(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)，货号：DD4201进行转录，具体操作参考说明书。
表1 mRNA体外转录体系
上表1中的试剂混合均匀后，37℃孵育2h，反应结束后，加入试剂盒自带DNase I 1μl 37℃消化30min去除模板。
按如下步骤进行转录后的纯化；
(1)按照1∶3体积比加入7.5M LiCl，混匀后-20℃静置30min，12000rpm离心10min，观察到底部沉淀，去上清；
(2)加入1ml预冷的70％乙醇将沉淀吹打悬浮。12000rpm离心5min，去上清；
(3)重复上一步；
(4)将上清完全去除，开盖37℃晾干5min,待沉淀干燥后加入RNase-free ddH2O充分溶解沉淀，得到未加帽的mRNA。
实施例2：酶法两步加帽法制备加帽的mRNA
本实施例利用酶法两步加帽法制备加帽的mRNA。采用Vaccinia Capping Enzyme(Vazyme，货号：10615)和mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase(Vazyme，货号：DD4110-PC-01)共加帽获得加帽的mRNA。
取10μg上述实施案例1中纯化后的mRNA，65℃变性5min后，立即置于冰上5min，然后按表2配制加帽反应体系。
表2酶法两步加帽法反应体系
组分 体积
10×Capping Buffer 2μl
Vaccinia Capping Enzyme(10U/μl) 1μl
mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase(50U/μl) 1μl
GTP(10mM) 1μl
SAM(4mM) 1μl
Denatured mRNA 10μg
RNase-free ddH2O 补齐至20μl
上表2中的试剂混合均匀后，37℃分别孵育30min，60min，120min后加入DNase I 1μl(Vazyme，货号：DD4104-PC-03)
37℃消化30min去除模板。
再按如下步骤进行转录后的纯化：
(1)按照1：3体积比加入7.5M LiCl，混匀后-20℃静置30min，12000rpm离心10min，观察到底部沉淀，去上清；
(2)加入1ml预冷的70％乙醇将沉淀吹打悬浮。12000rpm离心5min,去上清；
(3)重复上一步；
(4)将上清完全去除，开盖37℃晾干5min,待沉淀干燥后加入RNase-free ddH2O充分溶解沉淀，得到不同加帽率的加帽的mRNA。
实施例3：共转录法制备加帽的mRNA
本实施例利用共转录法制备加帽的mRNA。使用限制性内切酶线性化转录模板质粒后，通过T7 RNA聚合酶启动RNA的体外转录，按表3共转录反应体系，额外补充帽类似物以便获得共转录加帽的mRNA。使用共转录加帽T7体外转录试剂(Cap GAG)武汉瀚海新酶生物科技有限公司货号：HBP001510进行加帽，具体操作详见说明书。
表3共转录法反应体系
分别按照体系中Cap analog终浓度1，2，4，8mM进行配置。
上表3中的试剂混合均匀后，37℃孵育2h，反应结束后，试剂盒自带DNase I 2μl37℃消化30min去除DNA质粒模板。再按如下步骤进行转录后的纯化：
(1)按照1∶3体积比加入7.5M LiCl，混匀后-20℃静置30min，12000rpm离心10min，观察到底部沉淀，去上清；
(2)加入1ml预冷的70％乙醇将沉淀吹打悬浮。12000rpm离心5min,去上清；
(3)重复上一步；
(4)将上清完全去除，开盖37℃晾干5min,待沉淀干燥后加入RNase-free ddH2O充分溶解沉淀，得到不同加帽率的mRNA样品。
实施例4：DNAzyme(10-23)切割位点设计
本实施例选用的切割位置位于5′-端100个碱基范围之内(SEQ ID NO：1)。
SEQ ID NO：1：
根据不同的切割位点设计DNAzyme(10-23)x-y两端的结合臂，为了能定性比较不同切割位点的区别，将y固定为35(y＝35)，即脱氧核酶自身碱基或核苷酸个数为固定的35个。由于DNAzyme(10-23)催化核心为固定的15nt，因此本实施例所设计的DNAzyme(10-23)x-35两端臂长的总和为20nt，具体设计出的DNAzyme(10-23)x-35序列如表4所示。
表4 DNAzyme(10-23)x-35序列
名称 序列(5′-3′) SEQ ID NO：
DNAzyme(10-23)15-35 cagaagaataGGCTAGCTACAACGAtagtttattc 2
DNAzyme(10-23)26-35 tctgtggggaGGCTAGCTACAACGAcagaagaata 3
DNAzyme(10-23)47-35 tggtggcggiGGCTAGCTACAACGAtctctctgag 4
DNAzyme(10-23)51-35 ctcatggtgiGGCTAGCTACAACGAgggttctctc 5
分别采用表4中所示的DNAzyme(10-23)x-35对实施例1生成的未加帽的mRNA进行切割，具体退火反应体系见表5，退火程序为85℃预变性1min，37℃反应3h。反应结束后设置仪器维持4℃。
表5退火反应体系
组分 加入量 终浓度
mRNA(20μM) 1μl 1μM
DNAzyme(10-23)(20μM) 2.5μl 2.5μM
10×Reaction Buffer 2.0μl 1X
DEPC-H2O 补至20μ1 /
结果如图2所示(毛细管电泳图)，相同质量mRNA底物和DNAzyme(10-23)x-35投放量的情况下，仅有DNAzyme(10-23)26-35能够检测到少量5′-端切割产物峰，但由于其距DNAzyme(10-23)26-35核酶自身的峰过近，5′-端切割产物峰与DNAzyme(10-23)26-35核酶自身的峰难以区分开来，5′-端切割产物峰读取困难，不利于定量分析，于是着重对其进行进一步的优化。
实施例5：DNAzyme(10-23)26-y的设计
本实施例在确定x＝26的基础之上对脱氧核酶的两臂进行进一步的设计。包括：DNAzyme(10-23)26-35，即切割后产生的mRNA短片段核苷酸个数为26，脱氧核酶自身核苷酸个数为35，两端臂长为10nt；DNAzyme(10-23)26-37，即切割后产生的mRNA短片段核苷酸个数为26，脱氧核酶自身核苷酸个数为37，两端臂长为11nt：DNAzyme(10-23)26-39，即切割后产生的mRNA短片段核苷酸个数为26，脱氧核酶自身核苷酸个数为39，两端臂长为12nt；DNAzyme(10-23)26-41，即切割后产生的mRNA短片段核苷酸个数为26，脱氧核酶自身核苷酸个数为41，两端臂长为13nt；DNAzyme(10-23)26-43，即切割后产生的mRNA短片段核苷酸个数为26，脱氧核酶自身核苷酸个数为43，两端臂长为14nt；和DNAzyme(10-23)26-45，即切割后产生的mRNA短片段核苷酸个数为26，脱氧核酶自身核苷酸个数为45，两端臂长为15nt。分别采用表6中所示的DNAzyme(10-23)x-35对实施例1生成的未加帽的mRNA进行切割，实验流程参考实施例4。各核酶序列见表6。各DNAzyme(10-23)26-y对mRNA切割效率的影响如图3所示，图3中各DNAzyme(10-23)26-y的检测峰面积归一化结果如表7所示。
表6 DNAzyme(10-23)26-y序列
表7各DNAzyme(10-23)26-y的检测峰面积
如图3所示相同质量mRNA底物投放量和DNAzyme(10-23)投放量的情况下，当y＝37时，即当DNAzyme(10-23)两端同源臂长为11nt时，相较于y＝35，5′-端切割产物峰与DNAzyme(10-23)峰显著分开，在一定范围内，随着DNAzyme(10-23)两端同源臂长的进一步增加，5′-端切割产物峰与DNAzyme(10-23)峰之间的距离越来越远，有助于5′-端切割产物峰的区分与读取，且随着DNAzyme(10-23)两端同源臂长的进一步增加，其引物二聚体dimers(副产物)也逐渐减少，当DNAzyme(10-23)两端同源臂长为12nt时，其引物二聚体已基本可以忽略。通过表7可知，当y＝37时，即当DNAzyme(10-23)两端同源臂长为11nt时，相较于y＝35，5′-端切割产物峰的积分面积显著增加，即切割出的5′-端切割产物显著增加，而DNAzyme(10-23)26-43不仅能在毛细管电泳仪上清晰的被分离开，可以进行后续定量分析，而且其5′-端切割产物峰面积最大，有较高的切割活性，故选取其进行进一步的加帽率测试。
实施例6：两步酶法加帽不同时间的加帽效率测试
采用DNAzyme(10-23)26-43对实施例2所得到的经两步酶法加帽不同时间后的mRNA进行切割，切割步骤参照实施例4，并用毛细管电泳图谱进行检测，其图谱如图4所示，指示了DNAzyme(10-23)26-43峰，未加帽的mRNA经DNAzyme处理后其5′-UTR端切割后短片段产物(-Capped)；加帽的mRNA经DNAzyme处理后其5′-UTR端切割后短片段产物(+Capped)；加帽的mRNA和未加帽的mRNA相比较，增加了一个Cap1结构的分子量大小，如下表8中所示相同mRNA底物投放量的情况下，加帽效率随加帽时间(0min、30min、60min、120min)呈增加趋势。
表8两步酶法加帽效率测试
实施例7：共转录加帽不同帽子类似物浓度的加帽效率测试
采用DNAzyme(10-23)26-43对实施例3所得到的通过不同帽类似物浓度进行共转录加帽后的mRNA进行切割，切割步骤参照实施例4，并用毛细管电泳图谱进行检测，当使用的mRNA起始碱基是GG开头，用AG帽子类似物进行共转录加帽时，其加帽效率一般在50％左右，其图谱如图5所示，指示了DNAzyme(10-23)26-43峰，未加帽的mRNA经DNAzyme处理后其5′-UTR端切割后短片段产物(-Capped)；加帽的mRNA经DNAzyme处理后其5′-UTR端切割短片段产物(+Capped)；如下表9中所示，加帽的mRNA和未加帽的mRNA相比较，增加了一个Cap1结构的分子量大小，在相同质量未加帽mRNA底物投放量的情况下，加帽效率随帽子类似物浓度增加(0mM、1mM、2mM、4mM、8mM)呈增加趋势。在相同质量底物和投放量的情况下，根据加帽的mRNA 5′-端切割后短片段产物峰面积所占总mRNA(加帽的mRNA和未加帽的mRNA)5′-端切割后短片段产物峰面积峰面积的比例计算加帽效率。当使用的mRNA起始碱基是AG开头，用AG帽子类似物进行共转录加帽时，如下表10中所示，其加帽效率达到100％。
表9共转录法加帽效率测试(GG开头)
表10共转录法加帽效率测试(AG开头)
综上所述，本发明根据待检测mRNA序列设计和筛选最优的DNAzyme(10-23)x-y，利用DNAzyme(10-23)x-y在5′-UTR区域定点高效的切割mRNA分子，并利用毛细管电泳的方法检测剪切后的5’端的mRNA短片段的分子量大小以及加帽片段和未加帽片段的相对比例，从而计算加帽效率，实现了定量检测mRNA加帽效率，本技术无需使用放射性标记，无放射性污染，无需使用昂贵的质谱设备，且操作简单、成本低，易于实现。
尽管参照本发明的实施例详细描述了本发明，但提供这些实施例是为了说明而不是限制本发明。根据本发明原理能够得到的其它实施例均属于本发明权利要求所界定的范畴。

Claims (5)

1.一种毛细管电泳检测RNA加帽效率的方法，包括如下步骤：
1)采用脱氧核酶10-23DNAzyme处理所述RNA，其中，所述脱氧核酶10-23DNAzyme的两结合臂长度相等，均选自11、12、13、14和15nt，生成带有帽结构的RNA片段以及不带有所述帽结构的对应RNA片段；以及
2)通过所述毛细管电泳检测所述带有帽结构的RNA片段和所述对应RNA片段之间的比例关系，以确定所述加帽效率。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述RNA为mRNA。
3.如权利要求1所述的方法，其中通过分子量差异来确定所述RNA片段是否带有所述帽结构。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述帽结构位于所述RNA的5′端。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述帽结构选自Cap O、Cap I和Cap II型结构。
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