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CN118166105A - 一种能够快速检测结直肠癌的试剂盒 - Google Patents

一种能够快速检测结直肠癌的试剂盒 Download PDF

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CN118166105A CN202410449406.1A CN202410449406A CN118166105A CN 118166105 A CN118166105 A CN 118166105A CN 202410449406 A CN202410449406 A CN 202410449406A CN 118166105 A CN118166105 A CN 118166105A
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Abstract

本发明公开了一种能够快速检测结直肠癌的试剂盒，所述试剂盒包括miRNA‑21检测试纸条、能够分离全血的微流控装置，其中：所述miRNA‑21检测试纸条由样品垫、样品结合垫、检测垫、吸水垫和底板构成，样品垫、样品结合垫、检测垫、吸水垫依次粘贴在底板上；所述微流控装置包括位于上方的顶盖和位于下方的装置主体，装置主体的上表面设置有血细胞分离I区和血细胞分离II区，血细胞分离I区内设有过滤装置，过滤装置由多排不同间隙的微柱组成，血细胞分离II区由数个漏斗结构构成。该试剂盒将miRNA‑21作为被检测的标志物，用来反映结直肠癌的患病情况，具有体积小、检测快速、成本低和准确度高等优势。

Description

一种能够快速检测结直肠癌的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种检测结直肠癌的试剂盒。
背景技术
结直肠癌高死亡率的主要原因在于该病在早期阶段症状不明显，患者往往在晚期被诊断，从而使治疗难度增加。这同时也加剧了医保部门和患者家庭的经济负担。为了应对这一严峻的形势，亟需开展新型、快速、低成本的早期筛查方法的研发。
传统早期检测结直肠癌的方法一般以肠镜为主，这种方法是侵入性的，具有诸多缺点。目前还鲜有用于快速、便捷检测结直肠癌的试剂盒，已有的几款试剂盒仍存在一些有待改进的地方，如：以粪便为样本，检测粪便中的相关标志物的试剂盒极易被粪便中的其他物质干扰，导致检测效果不佳，并且粪便样本的特殊性导致用该试剂盒检测的很少；以血清为样本，检测血清中的相关标志物的试剂盒虽然灵敏度较高，但是存在操作复杂等缺点，并且普通居民家里缺少相关设备，无法将自己采集到的全血自行分离出血细胞形成血清以供检测。近年来，基于微流控装置的液体活检技术被认为是一种具有巨大潜力的创新方法，其依赖于体液中的各种生物标志物，通过检测这些生物标志物来反映机体是否存在疾病，因此它能够规避传统检查所存在的问题，具备体积小、成本低、准确度高等优势。目前微流控装置在生物医学领域得到了广泛的应用，获得了诸多成果。
微流控装置的开发离不开体液中的生物标志物，与结直肠癌有关的血清生物标志物有外泌体蛋白(CEA、AFP、CA19-9等)、微小RNA(miRNA，miRNA-21、miRNA-92a、miRNA-221等)和循环肿瘤细胞等。其中，miRNA-21被国内外学者认为是最有前途的结直肠癌生物标志物之一。
发明内容
针对现有试剂盒存在的上述问题，本发明提供了一种能够快速检测结直肠癌的试剂盒，该试剂盒将miRNA-21作为被检测的标志物，用来反映结直肠癌患者的患病情况，具有体积小、检测快速、成本低和准确度高等优势。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种能够快速检测结直肠癌的试剂盒，包括miRNA-21检测试纸条、能够分离全血的微流控装置，其中：
所述miRNA-21检测试纸条由样品垫、样品结合垫、检测垫、吸水垫和底板构成，样品垫、样品结合垫、检测垫、吸水垫依次粘贴在底板上；
所述样品结合垫含有DNA-1金纳米粒子，DNA-1序列如下：ATC GAA TAG TC；
所述检测垫含有T线和C线，T线处含有DNA-2金纳米粒子，检测垫C线处含有DNA-3金纳米粒子，DNA-2序列如下：TGA CTA CAA CT；DNA-3序列如下：TAG CTT ATC AG；
所述微流控装置包括位于上方的顶盖和位于下方的装置主体；
所述装置主体的前端设置有进样口，装置主体的后端设置有出样口；
所述装置主体的上表面设置有血细胞分离I区和血细胞分离II区；
所述血细胞分离I区的前端与进样口连通，后端与血细胞分离II区的前端连通，血细胞分离II区的后端与出样口连通；
所述血细胞分离I区内设有过滤装置，过滤装置由多排不同间隙的微柱组成，相邻微柱之间的间隙延血细胞分离I区前端到血细胞分离I区后端的方向依次递减；
所述血细胞分离II区由数个漏斗结构构成，漏斗结构的后端设置有微孔。
相比于现有技术，本发明具有如下优点：
1、本发明的试剂盒在检测过程中无需过多复杂的操作，无需将全血分离成血清，无需配置各种试剂，只需要将采集的全血稍加稀释后注入试剂盒即可，操作过程简单化。
2、本发明的试剂盒能够在15分钟内完成检测，检测时间短，方便快捷。
3、本发明的试剂盒准确率可达80％以上，准确率较高，可用来提示被测人员的患病风险。
4、将本发明的试剂盒应用于结直肠癌的早期筛查不仅可以有效提高早期筛查的效率，还能够在很大程度上降低结直肠癌的死亡率，提升居民的健康水平，减轻医疗系统的负担。
5、本发明的试剂盒能够在早期快速检测机体患有结直肠癌的可能性，为广大人民群众提供了一种新型的早期结直肠癌检测方式，可为解决全国范围内癌症高死亡率和筛查困难等一系列重大问题提供有力支持。
附图说明
图1是本发明中试纸条的结构示意图。
图2是本发明中微流控装置的结构示意图。
图3是本发明中试剂盒的结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
本发明提供了一种能够快速检测结直肠癌的试剂盒，包括miRNA-21检测试纸条、能够分离全血的微流控装置，其中：
所述miRNA-21检测试纸条由样品垫、样品结合垫、检测垫、吸水垫和PVC底板构成，检测垫、吸收垫、样品结合垫和样品垫沿层析方向依次粘贴在PVC底板上；
所述样品结合垫含有DNA-1金纳米粒子，DNA-1序列如下：ATC GAA TAG TC；
所述检测垫T线处含有DNA-2金纳米粒子，检测垫C线处含有DNA-3金纳米粒子，DNA-2序列如下：TGA CTA CAA CT；DNA-3序列如下：TAG CTT ATC AG；
所述微流控装置包括位于上方的顶盖和位于下方的装置主体；
所述装置主体的前端设置有进样口，装置主体的后端设置有出样口；
所述装置主体的上表面设置有血细胞分离I区和血细胞分离II区；
所述血细胞分离I区的前端与进样口连通，后端与血细胞分离II区的前端连通，血细胞分离II区的后端与出样口连通；
所述血细胞分离I区内设有过滤装置，过滤装置由多排不同间隙的微柱组成；
所述微柱之间的间隙延血细胞分离I区前端到血细胞分离I区后端的方向依次递减；
所述微柱之间的间隙为8～18μm，微柱直径为60μm，高为180μm；
所述血细胞分离II区由数个漏斗结构构成，漏斗结构的后端设置有微孔，微孔直径小于5μm；
所述微流控装置的出样口对准试纸条的样品垫，使用胶粘剂将二者粘贴在预先定制好的塑料壳上，然后扣上塑料外壳盖子，形成完整的试剂盒，如图3所示。
全血样本从进样口进入微流控装置后，直径大于微柱间隙的血细胞无法通过，从而起到分离出部分血细胞的作用；样本通过微柱后，大部分的血细胞会被分离，但还存在少部分没有分离干净。当样本继续通过微流控装置内通道流入漏斗结构后，漏斗结构底端的微孔会进一步过滤掉剩下的血细胞，确保流出微流控装置的样本中不含血细胞。
一种上述能够快速检测结直肠癌的试剂盒的制备方法，所述方法包括以下步骤：
步骤1、miRNA-21检测试纸条的制备：
步骤11、制备金纳米粒子：
采用柠檬酸三纳还原法制备金纳米粒子。
步骤12、DNA探针与金纳米粒子的结合：
步骤121、设计单链DNA序列(DNA-1：ATC GAA TAG TC；DNA-2：TGA CTA CAA CT；DNA-3：TAG CTT ATC AG)，并用巯基修饰该DNA分子。
步骤122、用超纯水配置2μM的DNA分子溶液(98μL)，然后加入10mM的TCEP溶液2μL。室温振荡反应2h，使用超滤膜YM-3(截留分子量3000)进行超滤，除去多余的TCEP，加入超纯水复溶至原体积混匀。
步骤123、在离心管中加入500μL胶体金溶液和100μL步骤122制备的DNA分子溶液，混匀振荡反应5min。加入500mM的柠檬酸三钠溶液使柠檬酸三钠最终浓度为10nM，并使用2mol/L的盐酸溶液调节溶液的pH为3。室温静置2小时后加入2mol/L的氢氧化钠溶液调节最终溶液的pH为7。室温静置1h之后使用离心机5000r/min离心20min，留下最终的沉淀，加PBS(0.5％PEG，2％蔗糖，0.1％吐温20，0.02％MgSO4，0.05％(NH4)2SO4和1％卵清蛋白)恢复至原体积。利用该方法分别得到了结合了DNA-1金纳米粒子(DNA-1-AuNP)，结合了DNA-2金纳米粒子(DNA-2-AuNP)和结合了DNA-3金纳米粒子(DNA-3-AuNP)。
步骤124、采用纤维素纤维膜作为样品垫；采用玻璃纤维膜作为样品结合垫；选择硝酸纤维素膜作为检测垫基底；选择棉纤维作为吸水垫；PVC底板作为试剂盒主体。上述材料的拼接顺序如图1所示。具体方法为：将样品结合垫充分浸泡在含有5％的DNA-1-AuNP的溶液中10min，室温干燥使其表面不含有水分。然后使用生物芯片点样仪将DNA-2-AuNP划定在检测垫T线处，将DNA-3-AuNP划定在检测垫C线处，T线与C线相距5mm。将胶粘剂涂抹在PVC底板上，按照图1所示依次将样品垫、样品结合垫、检测垫、吸水垫粘贴在PVC底板上，样品垫部分压在样品结合垫上，样品结合垫部分压在检测垫上，吸水垫部分压在检测垫上；每个垫子接口处重叠2mm。检测试纸条制备完成。
步骤2、能够分离全血的微流控装置的制备
由于检测试剂条的显色反应为红色，所以血液中的血细胞会干扰检测结果，因此本发明在试纸条前端添加能够将血液中的血细胞分离的微流控装置。本发明利用血细胞的直径远大于血液中其他细小分子的特点特异性分离血细胞。微流控装置的设计如图2所示，过滤装置由4排不同间隙的微柱组成，其中：第一排微柱间隙为18μm，第二排微柱间隙为15μm，第三排微柱间隙为12μm，第四排微柱间隙为8μm；血细胞分离II区由5个圆形的漏斗结构构成。采用紫外光刻技术获得微流控装置模板。微柱、漏斗结构和微流控装置内部的各个微小通道提前设计规划到微流控装置模板上，然后使用聚二甲基硅氧烷浇筑固化形成一个整体的微流控装置。具体步骤如下：将聚二甲基硅氧烷和固化剂(Sylgard184)以10:1的比例(w/w)混合均匀并使用真空泵脱气。将混合物倒入微流控装置模板中，然后将其放入80℃真空烘箱中固化2h。然后将装置主体从模板上揭取下来，用切割刀沿着装置外框小心切割并使用手持式打孔器在装置主体上将流体的入口和出口打孔，使用胶粘剂将进样管和出液管固定在装置两端。然后在氧等离子体中处理装置主体，将固化好的聚二甲基硅氧烷盖子结合到微流控装置的装置主体上以得到完整的、封闭的微流控装置。
步骤3、微流控装置与试纸条拼接组装成试剂盒
将微流控装置的出样口对准试纸条的样品垫，使用胶粘剂将二者粘贴在预先定制好的塑料壳上，然后扣上塑料外壳盖子，形成完整的试剂盒，并标注样品的进样口和显色指示区域。
本发明试剂盒的使用方法如下：
(1)取待测人员新鲜血液0.5mL，使用含有5％RNAlater的PBS缓冲液将其稀释至2mL。
(2)使用注射器吸取稀释后的血液将其从试剂盒的进样口推进试剂盒。
(3)等待15分钟左右观察显色指示区域的结果，若T线和C线处都出现红色条带，则说明该血液中的miRNA-21呈阳性；若T线出现没有出现红色条带，C线出现红色条带，则说明该血液中的miRNA-21呈阴性；若C线不出现红色条带，则无论T线出不出现红色条带都说明此次检测结果无效。
应用本试剂盒测试了20例结直肠癌患者的血液样本和20例正常的血液样本，其中：20例结直肠癌血液样本中18例样本血液的检测结果为阳性，准确率为80％；20例正常的血液样本均没有检测出阳性。

Claims (8)

1.一种能够快速检测结直肠癌的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括miRNA-21检测试纸条、能够分离全血的微流控装置，其中：
所述miRNA-21检测试纸条由样品垫、样品结合垫、检测垫、吸水垫和底板构成，样品垫、样品结合垫、检测垫、吸水垫依次粘贴在底板上；
所述样品结合垫含有DNA-1金纳米粒子，DNA-1序列如下：ATC GAA TAG TC；
所述检测垫含有T线和C线，T线处含有DNA-2金纳米粒子，检测垫C线处含有DNA-3金纳米粒子，DNA-2序列如下：TGA CTA CAA CT；DNA-3序列如下：TAG CTT ATC AG；
所述微流控装置包括位于上方的顶盖和位于下方的装置主体；
所述装置主体的前端设置有进样口，装置主体的后端设置有出样口；
所述装置主体的上表面设置有血细胞分离I区和血细胞分离II区；
所述血细胞分离I区的前端与进样口连通，后端与血细胞分离II区的前端连通，血细胞分离II区的后端与出样口连通；
所述血细胞分离I区内设有过滤装置，过滤装置由多排不同间隙的微柱组成；
所述血细胞分离II区由数个漏斗结构构成。
2.根据权利要求1所述的能够快速检测结直肠癌的试剂盒，其特征在于所述过滤装置中，微柱之间的间隙延血细胞分离I区前端到血细胞分离I区后端的方向依次递减。
3.根据权利要求1或2所述的能够快速检测结直肠癌的试剂盒，其特征在于所述过滤装置中，微柱之间的间隙为8～18μm。
4.根据权利要求3所述的能够快速检测结直肠癌的试剂盒，其特征在于所述微柱直径为60μm，高为180μm。
5.根据权利要求1所述的能够快速检测结直肠癌的试剂盒，其特征在于所述漏斗结构的后端设置有微孔。
6.根据权利要求5所述的能够快速检测结直肠癌的试剂盒，其特征在于所述微孔直径小于5μm。
7.根据权利要求1所述的能够快速检测结直肠癌的试剂盒，其特征在于所述样品垫部分压在样品结合垫上，样品结合垫部分压在检测垫上，吸水垫部分压在检测垫上。
8.根据权利要求7所述的能够快速检测结直肠癌的试剂盒，其特征在于所述样品垫、样品结合垫、检测垫、吸水垫接口处重叠2mm。
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