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CN117886949A - 结合触发的转录开关及其使用方法 - Google Patents

结合触发的转录开关及其使用方法 Download PDF

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CN117886949A
CN117886949A CN202311802292.6A CN202311802292A CN117886949A CN 117886949 A CN117886949 A CN 117886949A CN 202311802292 A CN202311802292 A CN 202311802292A CN 117886949 A CN117886949 A CN 117886949A
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CN
China
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amino acid
acid sequence
cases
cell
domain
Prior art date
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Application number
CN202311802292.6A
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English (en)
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W·A·林
L·默尔苏特
K·T·伊宝
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of California San Diego UCSD
Original Assignee
University of California San Diego UCSD
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Abstract

本公开提供了结合触发的转录开关多肽、包括编码所述结合触发的转录开关多肽的核苷酸序列的核酸，以及用所述核酸遗传修饰的宿主细胞。本公开还提供了嵌合Notch受体多肽、包括编码所述嵌合Notch受体多肽的核苷酸序列的核酸，以及用所述核酸转导和/或遗传修饰的宿主细胞。本公开提供了包括编码本公开的结合触发的转录开关多肽和/或嵌合Notch受体多肽的核酸的转基因生物体。本公开的结合触发的转录开关多肽和嵌合Notch受体多肽可用于另外提供的多种应用。

Description

结合触发的转录开关及其使用方法
本申请为分案，其母案申请的申请号为201680023446.3，申请日为2016年2月23日，发明名称为“结合触发的转录开关及其使用方法”。
交叉引用
本申请要求于2015年2月24日提交的美国临时专利申请No.62/120,256、于2015年11月18日提交的美国临时专利申请No.62/257,153和于2015年12月18日提交的美国临时专利申请No.62/269,758的权益，所述申请均以引用方式全文并入本文。
关于联邦政府资助研究的声明
本发明是在美国国立卫生研究院授予的基金号EY016546、P50GM081879和R01GM055040的政府资助下完成的。美国政府拥有本发明的某些权利。
引言
Notch受体是介导细胞-细胞接触信号传导的跨膜蛋白并且在发育和细胞与细胞通信的其他方面起中心作用，例如两个接触细胞之间的通信，其中一个接触细胞是“接收器”细胞(“receiver”cell)，并且另一个接触细胞是“发送器”细胞(“sender”cell)。在接收器细胞中表达的Notch受体识别在发送器细胞上表达的它们的配体(δ家族蛋白质)。这些接触细胞上的notch和δ的接合引起notch受体的两步蛋白水解，最终导致受体的细胞内部分从膜释放到细胞质中。这一释放结构域通过起到转录调控子的作用而改变接收器细胞行为。Notch受体参与发育期间的多种细胞功能且是所述细胞功能所需要的，并且对于物种间数目众多的细胞类型的功能是至关重要的。
概述
本公开提供了结合触发的转录开关多肽、包括编码结合触发的转录开关多肽的核苷酸序列的核酸，以及用核酸遗传修饰的宿主细胞。本公开提供了包括编码本公开的结合触发的转录开关多肽的核酸的转基因生物体。还提供了使用一种或多种结合触发的转录开关多肽局部调节细胞的活性的方法和使用一种或多种结合触发的转录开关多肽的定位性细胞激活系统。本公开的结合触发的转录开关多肽可用于另外提供的多种应用。
本公开提供了嵌合Notch受体多肽、包含编码嵌合Notch受体多肽的核苷酸序列的核酸，以及用核酸遗传修饰的宿主细胞。本公开提供了包含编码本公开的嵌合Notch受体多肽的核酸的转基因生物体。本公开的嵌合Notch受体多肽可用于另外提供的多种应用。
本公开提供了一种嵌合多肽(本文也称为“嵌合Notch受体多肽”)，其从N末端至C末端包括以下，且以共价键联：a)包括特异性结合对的第一成员的细胞外结构域；b)Notch受体多肽，其中Notch受体多肽具有50个氨基酸至1000个氨基酸的长度，并且包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中特异性结合对的第一成员对于Notch受体多肽是异源性的，并且其中特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员的结合在一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点处诱导Notch受体多肽的裂解，从而释放细胞内结构域。在一些情况下，Notch受体多肽具有300个氨基酸至400个氨基酸的长度。在一些情况下，嵌合Notch受体多肽包括插置在细胞外结构域与Notch受体多肽之间的接头。在一些情况下，细胞内结构域是转录激活蛋白。在一些情况下，细胞内结构域是转录阻遏蛋白。在一些情况下，细胞内结构域是位点特异性核酸酶。在一些情况下，位点特异性核酸酶是Cas9多肽。在一些情况下，细胞内结构域是重组酶。在一些情况下，细胞内结构域是抑制性免疫受体。在一些情况下，细胞内结构域是活化性免疫受体。在一些情况下，特异性结合对的第一成员包括基于抗体的识别支架。在一些情况下，特异性结合对的第一成员包括抗体。在特异性结合对的第一成员是抗体的一些情况下，抗体特异性地结合肿瘤特异性抗原、疾病相关抗原或细胞外基质组分。在特异性结合对的第一成员是抗体的情况下，抗体特异性地结合细胞表面抗原、可溶性抗原或固定在不溶性基材上的抗原。在特异性结合对的第一成员是抗体的一些情况下，抗体是单链Fv。在一些情况下，特异性结合对的第一成员是纳米抗体、单域抗体、双链抗体、三链抗体或微型抗体(minibody)。在一些情况下，特异性结合对的第一成员是基于非抗体的识别支架。在特异性结合对的第一成员是基于非抗体的识别支架的一些情况下，基于非抗体的识别支架是avimer、DARPin、ad nectin、avimer、亲和体、anticalin或affilin。在一些情况下，特异性结合对的第一成员是抗原。在特异性结合对的第一成员是抗原的一些情况下，抗原是内源性抗原。在特异性结合对的第一成员是抗原的一些情况下，抗原是外源性抗原。在一些情况下，特异性结合对的第一成员是受体的配体。在一些情况下，特异性结合对的第一成员是受体。在一些情况下，特异性结合对的第一成员是细胞粘附分子(例如，细胞粘附分子的细胞外区域的全部或一部分)。在一些情况下，特异性结合对的第一成员包括第一二聚化结构域并且其中特异性结合对的第二成员包括第二二聚化结构域；例如，在一些情况下，通过小分子二聚化试剂诱导第一二聚化结构域与第二二聚化结构域的结合，并且在其他情况下，通过光诱导第一二聚化结构域与第二二聚化结构域的结合。在一些情况下，Notch受体多肽包含与图2A-2G中所示的氨基酸序列中的任一个具有至少75％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，Notch受体多肽包含与图2A-2G中所示的氨基酸序列中的任一个具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，Notch受体多肽包含与图2A-2G中所示的氨基酸序列中的任一个具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，Notch受体多肽包含与图2A-2G中所示的氨基酸序列中的任一个具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，Notch受体多肽包含与图2A-2G中所示的氨基酸序列中的任一个具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，Notch受体多肽包含与图3中所示的氨基酸序列中的任一个具有至少75％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，Not ch受体多肽包含与图3中所示的氨基酸序列中的任一个具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，Notch受体多肽包含与图3中所示的氨基酸序列中的任一个具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，Notch受体多肽包含与图3中所示的氨基酸序列中的任一个具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，Notch受体多肽包含与图3中所示的氨基酸序列中的任一个具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，Notch受体多肽包含与以下序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：PPQIEEACELPECQVDAGNKVCNLQ CNNHACGWDGGDCSLNFNDPWKNCTQSLQCWKYFSDGHCDSQCNSAGCLFDGFDCQLTEGQCNPLYDQYCKDHFSDGHCDQGCNSAECEWDGLDCAEHVPERLAAGTLVLVVLLPPDQLRNNSFHFLRELSHVLHTNVVFKRDAQGQQMIFPYYGHEEELRKHPIKRSTVGWATSSLLPGTSGGRQRRELDPMDIRGSIVYLEIDNRQCVQSSSQCFQSATDVAAFLGALASLGSLNIPYKIEAVKSEPVEPPLPSQLHLMYVAAAAFVLLFFVGCGVLLS(SEQ ID NO:1)。在一些情况下，Notch受体多肽包含与以下序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：PCVGSNPCYNQGTCEPTSENPFYRCLCPAKFNGLLCHILDYSF TGGAGRDIPPPQIEEACELPECQVDAGNKVCNLQCNNHACGWDGGDCSLNFNDPWKNCTQSLQCWKYFSDGHCDSQCNSAGCLFDGFDCQLTEGQCNPLYDQYCKDHFSDGHCDQGCNSAECEWDGLDCA EHVPERLAAGTLVLVVLLPPDQLRNNSFHFLRELSHVLHTNVVFKRDAQGQQMIFPYYGHEEELRKHPIKRSTVGWATSSLLPGTSGGRQRRELDPMDIRGSIVYLEIDNRQCVQSSSQCFQSATDVAAFLGALASLGSLNIPYKIEAVKSEPVEPPLPSQLHLMYVAAAAFVLLFFVGCGVLLS(SEQ ID NO:2)。在一些情况下，一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点选自S1、S2和S3蛋白水解裂解位点。在一些情况下，S1蛋白水解裂解位点为包含氨基酸序列Arg-X-(Arg/Lys)-Arg的弗林蛋白酶样蛋白酶裂解位点，其中X为任何氨基酸。在一些情况下，S2蛋白水解裂解位点为包含Ala-Val二肽序列的ADAM-17型蛋白酶裂解位点。在一些情况下，S3蛋白水解裂解位点为包含Gly-Val二肽序列的γ-分泌酶裂解位点。
本公开提供了一种包含编码如本文所述的嵌合Notch受体多肽的核苷酸序列的核酸。本公开提供了一种包含编码如本文所述的嵌合Notch受体多肽的核苷酸序列的重组表达载体。本公开提供了一种用核酸或表达载体遗传修饰的宿主细胞。在一些情况下，宿主细胞为真核细胞。在一些情况下，宿主细胞为哺乳动物细胞。在一些情况下，宿主细胞为免疫细胞、神经元、上皮细胞和内皮细胞或干细胞。在一些情况下，免疫细胞为T细胞、B细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、树突细胞或巨噬细胞。在一些情况下，宿主细胞用包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列的核酸遗传修饰，并且其中嵌合多肽的细胞内结构域为转录激活蛋白。在一些情况下，编码CAR的核苷酸序列可操作地连接至通过嵌合多肽的细胞内结构域激活的转录控制元件。
本公开提供了一种调节表达如本文所述的本公开的嵌合Notch受体多肽的细胞的活性的方法，所述方法包括：使细胞与特异性结合对的第二成员接触，其中特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员的结合在一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点处诱导Notch受体多肽的裂解，从而释放细胞内结构域，其中细胞内结构域的释放调节细胞的活性。在一些情况下，所述接触在体内、离体或在体外进行。在一些情况下，特异性结合对的第二成员在第二细胞的表面上、固定在不溶性基材上、存在于细胞外基质中、存在于人工基质中，或是可溶性的。在一些情况下，细胞内结构域的释放调节细胞的增殖。在一些情况下，细胞内结构域的释放调节细胞的细胞凋亡。在一些情况下，细胞内结构域的释放通过除了细胞凋亡之外的机制诱导细胞死亡。在一些情况下，细胞内结构域的释放通过转录调控、染色质调控、翻译、运输或翻译后加工来调节细胞中的基因表达。在一些情况下，细胞内结构域的释放调节细胞的分化。在一些情况下，细胞内结构域的释放调节细胞的迁移。在一些情况下，细胞内结构域的释放调节分子从细胞中的表达和分泌。在一些情况下，细胞内结构域的释放调节细胞对第二细胞或对细胞外基质的粘附。在一些情况下，细胞内结构域的释放诱导细胞中基因产物的重新表达。在细胞内结构域的释放诱导细胞中基因产物的重新表达的一些情况下，基因产物为转录激活蛋白、转录阻遏蛋白、嵌合抗原受体、第二嵌合Notch受体多肽、翻译调控子、细胞因子、激素、趋化因子或抗体。
本公开提供了一种调节表达如本文所述的本公开的嵌合Notch受体多肽的细胞的活性的方法，所述方法包括：使细胞与特异性结合对的第二成员接触，其中特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员的结合在一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点处诱导Notch受体多肽的裂解，从而释放细胞内结构域，其中细胞内结构域为诱导编码效应子多肽的核酸的转录的转录因子，所述效应子多肽调节细胞的活性。在一些情况下，所述接触在体内、离体或在体外进行。在一些情况下，特异性结合对的第二成员在第二细胞的表面上、固定在不溶性基材上、存在于细胞外基质中、存在于人工基质中，或是可溶性的。在一些情况下，效应子多肽为细胞凋亡诱导剂、细胞凋亡抑制剂、活化性免疫受体、抑制性免疫受体、转录激活蛋白、转录阻遏蛋白、细胞因子、生长因子、激素、受体、抗体或位点特异性核酸酶。
本公开提供了一种调节细胞的活性的方法，所述方法包括：使细胞与第一特异性结合对的第二成员接触，其中所述细胞表达：i)如本文所述的本公开的第一嵌合Notch受体多肽，其包括第一特异性结合对的第一成员；以及ii)至少如本文所述的本公开的第二嵌合Notch受体多肽，其包括第二特异性结合对的第一成员，其中第一和第二特异性结合对彼此不同，其中第一嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域提供第一效应子功能；并且第二嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域提供不同于第一效应子功能的第二效应子功能，并且其中所释放的第一和第二细胞内结构域调节细胞的活性。在一些情况下，所述接触在体内进行。在一些情况下，所述接触离体进行。在一些情况下，所述接触在体外进行。
本公开提供了一种激活T细胞的方法，所述方法包括：使如本文所述的T细胞(其中T细胞用包含编码以下各项的核苷酸序列的一种或多种核酸遗传修饰：i)本公开的嵌合Notch受体多肽；以及ii)CAR)与固定抗原接触，其中嵌合Notch受体多肽的细胞外结构域包括对第一抗原具有特异性的抗体，并且其中所述接触导致转录激活蛋白的释放以及细胞中CAR的产生，其中CAR在第二抗原的结合之后提供T细胞的激活。
本公开提供了一种调节细胞的活性的方法，所述方法包括：使细胞与第一特异性结合对的第二成员接触，其中所述细胞表达：i)本公开的第一嵌合Notch受体多肽，其包括第一特异性结合对的第一成员；以及ii)至少本公开的第二嵌合Notch受体多肽，其包括第二特异性结合对的第一成员，其中第一和第二特异性结合对彼此不同，其中编码第二嵌合Notch受体的核苷酸序列可操作地连接至通过第一嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域激活或阻遏的转录控制元件。在一些情况下，所述接触在体内进行。在一些情况下，所述接触离体进行。在一些情况下，所述接触在体外进行。
本公开提供了一种激活T细胞的方法，所述方法包括：使如本文所述的T细胞(其中T细胞用包含编码以下各项的核苷酸序列的一种或多种核酸遗传修饰：i)本公开的嵌合Notch受体多肽；以及ii)CAR，其中嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域为转录激活蛋白)与固定抗原接触，其中嵌合多肽的细胞外结构域包括对第一抗原具有特异性的抗体，并且其中所述接触导致转录激活蛋白的释放以及细胞中CAR的产生，其中CAR在第二抗原的结合之后提供T细胞的激活。
本公开提供了一种调节细胞的活性的方法，所述方法包括：使细胞与固定在表面上的抗原接触，其中细胞表达本公开的嵌合Notch受体多肽，其中特异性结合对的第一成员结合抗原，并且其中所述接触导致细胞内结构域的释放和细胞活性的调节。在一些情况下，细胞内结构域为调节细胞的分化的转录因子。
本公开提供了局部调节细胞的活性的方法，所述方法包括：在细胞中表达包括包含特异性结合对的第一成员的细胞外结构域、结合转导子和细胞内结构域的结合触发的转录开关；以及使细胞与特异性结合对的第二成员接触，其中特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员的结合诱导结合转导子转导结合信号，以激活细胞内结构域，从而产生激活的细胞内结构域，其中激活的细胞内结构域调节选自由以下各项组成的组的细胞的活性：细胞的基因产物的表达、细胞的增殖、细胞的细胞凋亡、细胞的非细胞凋亡性死亡、细胞的分化、细胞的去分化、细胞的迁移、分子从细胞中的分泌以及细胞的细胞粘附。
在一些情况下，激活的细胞内结构域调节细胞的内源性基因产物的表达。
在一些情况下，细胞的内源性基因产物选自由以下各项组成的组：趋化因子、趋化因子受体、细胞因子、细胞因子受体、分化因子、生长因子、生长因子受体、激素、代谢酶、增殖诱导剂、受体、小分子第二信使合成酶、T细胞受体、转录激活蛋白、转录阻遏蛋白、转录激活蛋白、转录阻遏蛋白、翻译调控子、翻译激活蛋白、翻译阻遏蛋白、活化性免疫受体、细胞凋亡抑制剂、细胞凋亡诱导剂、免疫激活剂、免疫抑制剂以及抑制性免疫受体。
在一些情况下，细胞的内源性基因产物为分泌性基因产物。在一些情况下，细胞的内源性基因产物为表面表达的基因产物。在一些情况下，激活的细胞内结构域同时调节细胞的两种或更多种内源性基因产物的表达。在一些情况下，激活的细胞内结构域调节细胞的异源性基因产物的表达。
在一些情况下，细胞的异源性基因产物选自由以下各项组成的组：趋化因子、趋化因子受体、嵌合抗原受体、细胞因子、细胞因子受体、分化因子、生长因子、生长因子受体、激素、代谢酶、病原体衍生蛋白、增殖诱导剂、受体、RNA引导性核酸酶、位点特异性核酸酶、小分子第二信使合成酶、T细胞受体、毒素衍生蛋白、转录激活蛋白、转录阻遏蛋白、转录激活蛋白、转录阻遏蛋白、翻译调控子、翻译激活蛋白、翻译阻遏蛋白、活化性免疫受体、抗体、细胞凋亡抑制剂、细胞凋亡诱导剂、工程化T细胞受体、免疫激活剂、免疫抑制剂、抑制性免疫受体、RNA引导的DNA结合蛋白以及第二结合触发的转录开关。
在一些情况下，细胞的异源性基因产物为选自由以下各项组成的组的抗体：806、9E10、3F8、81C6、8H9、阿巴伏单抗(Abagovomab)、阿巴西普(Abatacept)、阿昔单抗(Abciximab)、Abituzumab、阿瑞鲁单抗(Abrilumab)、Actoxumab、阿达木单抗(Adalimumab)、阿德木单抗(Adecatumumab)、Aducanumab、阿非莫单抗(Afelimomab)、阿托珠单抗(Afutuzumab)、培戈-阿珠单抗(Alacizumab pegol)、ALD518、阿法赛特(Alefacept)、阿仑单抗(Alemtuzumab)、阿利库单抗(Alirocumab)、喷替酸阿妥莫单抗(Altumomab pentetate)、Amatuximab、AMG 102、麻安莫单抗(Anatumomab mafenatox)、Anetumab ravtansine、Anifrolumab、安芦珠单抗(Anrukinzumab)、阿泊珠单抗(Apolizumab)、阿西莫单抗(Arcitumomab)、Ascrinvacumab、阿塞珠单抗(Aselizumab)、阿塞西普(Atacicept)、阿特珠单抗(Atezolizumab)、阿替奴单抗(Atinumab)、托珠单抗(Atlizumab/tocilizumab)、阿托木单抗(Atorolimumab)、AVE1642、巴匹珠单抗(Bapineuzumab)、巴利昔单抗(Basiliximab)、巴维昔单抗(Bavituximab)、贝妥莫单抗(Bectumomab)、Begelomab、贝利木单抗(Belimumab)、本雷利珠单抗(Benralizumab)、柏替利木单抗(Bertilimumab)、贝西索单抗(Besilesomab)、贝伐珠单抗(Bevacizumab)、贝洛托舒单抗(Bezlotoxumab)、比西单抗(Biciromab)、比玛卢单抗(Bimagrumab)、比美吉珠单抗(Bimekizumab)、莫-比伐珠单抗(Bivatuzumab mertansine)、布利妥莫单抗(Blinatumomab)、布洛索珠单抗(Blosozumab)、BMS-936559、伯考赛珠单抗(Bococizumab)、维汀-本妥昔单抗(Brentuximab vedotin)、布雷努单抗(Briakinumab)、布罗鲁单抗(Brodalumab)、Brolucizumab、布隆妥珠单抗(Brontictuzumab)、卡那单抗(Canakinumab)、莫-坎妥珠单抗(Cantuzumab mertansine)、拉-坎妥珠单抗(Cantuzumab ravtansine)、卡普赛珠单抗(Caplacizumab)、卡罗单抗喷地肽(Capromab pendetide)、卡鲁单抗(Carlumab)、卡妥索单抗(Catumaxomab)、cBR96-阿霉素免疫偶联物、CC49、CDP791、西利珠单抗(Cedelizumab)、培戈-赛妥珠单抗(Certolizumab pegol)、西妥昔单抗(Cetuximab)、cG250、Ch.14.18、泊-西他珠单抗(Citatuzumab bogatox)、西妥木单抗(Cixutumumab)、克拉吉珠单抗(Clazakizumab)、克立昔单抗(Clenoliximab)、泰坦-克利伐珠单抗(Clivatuzumab tetraxetan)、考曲妥珠单抗(Codrituzumab)、联合利妥昔单抗(Coltuximab ravtansine)、可那木单抗(Conatumumab)、康西组单抗(Concizumab)、CP751871、CR6261、克雷内治单抗(Crenezumab)、CS-1008、达西珠单抗(Dacetuzumab)、达利珠单抗(Daclizumab)、达妥珠单抗(Dalotuzumab)、培戈-达匹利珠单抗(Dapirolizumabpegol)、达雷木单抗(Daratumumab)、Dectrekumab、登西珠单抗(Demcizumab)、Denintuzumab mafodotin、地诺单抗(Denosumab)、Derlotuximab biotin、地莫单抗(Detumomab)、地努妥昔单抗(Dinutuximab)、地瑞伏单抗(Diridavumab)、阿托度单抗(Dorlimomab aritox)、达洛珠单抗(Drozitumab)、杜利图单抗(Duligotumab)、度匹鲁单抗(Dupilumab)、Durvalumab、杜斯图单抗(Dusigitumab)、依美昔单抗(Ecromeximab)、依库珠单抗(Eculizumab)、埃巴单抗(Edobacomab)、依决洛单抗(Edrecolomab)、依法利珠单抗(Efalizumab)、依芬古单抗(Efungumab)、埃德鲁单抗(Eldelumab)、Elgemtumab、埃罗妥珠单抗(Elotuzumab)、艾西莫单抗(Elsilimomab)、依玛妥珠单抗(Emactuzumab)、依米妥珠单抗(Emibetuzumab)、依那妥珠单抗(Enavatuzumab)、维汀-恩弗妥单抗(Enfortumabvedotin)、培戈-赖莫单抗(Enlimomab pegol)、Enoblituzumab、依诺吉珠单抗(Enokizumab)、依诺苏单抗(Enoticumab)、恩司昔单抗(Ensituximab)、西-依匹莫单抗(Epitumomab cituxetan)、依帕珠单抗(Epratuzumab)、厄利珠单抗(Erlizumab)、厄马索单抗(Ertumaxomab)、依那西普(Etanercept)、埃达珠单抗(Etaracizumab)、依卓利珠单抗(Etrolizumab)、Evinacumab、依伏库单抗(Evolocumab)、艾韦单抗(Exbivirumab)、F19、法索单抗(Fanolesomab)、法拉莫单抗(Faralimomab)、法拉图组单抗(Farletuzumab)、法希姆单抗(Fasinumab)、FBTA05、非维珠单抗(Felvizumab)、非扎奴单抗(Fezakinumab)、费希腊妥单抗(Ficlatuzumab)、芬妥木单抗(Figitumumab)、菲瑞伏单抗(Firivumab)、弗兰托单抗(Flanvotumab)、夫来库单抗(Fletikumab)、芳妥珠单抗(Fontolizumab)、弗罗鲁单抗(Foralumab)、福拉韦单抗(Foravirumab)、夫苏木单抗(Fresolimumab)、弗兰单抗(Fulranumab)、弗图希单抗(Futuximab)、加利昔单抗(Galiximab)、盖尼塔单抗(Ganitumab)、盖坦德单抗(Gantenerumab)、加维莫单抗(Gavilimomab)、吉妥珠单抗奥佐米星(Gemtuzumab ozogamicin)、加沃坦珠单抗(Gevokizumab)、吉仁土希单抗(Girentuximab)、维汀-格仑妥木单抗(Glembatumumab vedotin)、戈利木单抗(Golimumab)、戈利昔单抗(Gomiliximab)、古谢夫单抗(Guselkumab)、HGS-ETR2、hu3S193、huA33、替伊立珠单抗(Ibalizumab)、替伊莫单抗(Ibritumomab tiuxetan)、依库单抗(Icrucumab)、依达赛珠单抗(Idarucizumab)、IGN101、IgN311、伊戈伏单抗(Igovomab)、IIIA4、IM-2C6、IMAB362、依玛鲁单抗(Imalumab)、IMC-A12、英西单抗(Imciromab)、英戈土珠单抗(Imgatuzumab)、英克拉库单抗(Inclacumab)、依坦希单抗(Indatuximabravtansine)、Indusatumab vedotin、英利昔单抗(Infliximab)、伊诺莫单抗(Inolimomab)、伊珠单抗奥佐米星(Inotuzumab ozogamicin)、英妥木单抗(Intetumumab)、易普利单抗(Ipilimumab)、英妥木单抗(Iratumumab)、Isatuximab、依拓珠单抗(Itolizumab)、希凯珠单抗(Ixekizumab)、J591、KB004、凯利昔单抗(Keliximab)、KW-2871、拉贝珠单抗(Labetuzumab)、拉姆布罗力珠单抗(Lambrolizumab)、拉姆帕力珠单抗(Lampalizumab)、来金珠单抗(Lebrikizumab)、来马索单抗(Lemalesomab)、来齐鲁单抗(Lenzilumab)、乐地单抗(Lerdelimumab)、来沙木单抗(Lexatumumab)、利韦单抗(Libivirumab)、维汀-利法妥珠单抗(Lifastuzumab vedotin)、利格利珠单抗(Ligelizumab)、Lilotomab satetraxetan、林妥珠单抗(Lintuzumab)、立鲁单抗(Lirilumab)、罗德希珠单抗(Lodelcizumab)、Lokivetmab、劳乌土珠单抗(Lorvotuzumabmertansine)、鲁卡木单抗(Lucatumumab)、培戈-鲁利珠单抗(Lulizumab pegol)、鲁利昔单抗(Lumiliximab)、鲁瑞妥珠单抗(Lumretuzumab)、马帕木单抗(Mapatumumab)、马格土希单抗(Margetuximab)、马司莫单抗(Maslimomab)、马妥珠单抗(Matuzumab)、美力姆单抗(Mavrilimumab)、MEDI4736、美泊利单抗(Mepolizumab)、美替木单抗(Metelimumab)、METMAB、米拉珠单抗(Milatuzumab)、明瑞莫单抗(Minretumomab)、Mirvetuximabsoravtansine、米妥莫单抗(Mitumomab)、MK-0646、MK-3475、MM-121、莫格穆里单抗(Mogamulizumab)、MORAb-003、莫罗木单抗(Morolimumab)、莫他珠单抗(Motavizumab)、MOv18、莫希土姆单抗(Moxetumomab pasudotox)、MPDL33280A、莫罗单抗-CD3(Muromonab-CD3)、他那可单抗(Nacolomab tafenatox)、纳米路单抗(Namilumab)、他那莫单抗(Naptumomab estafenatox)、纳瑞特单抗(Narnatumab)、那他珠单抗(Natalizumab)、奈巴库单抗(Nebacumab)、奈昔木单抗(Necitumumab)、Nemolizumab、奈瑞莫单抗(Nerelimomab)、耐西维单抗(Nesvacumab)、尼妥珠单抗(Nimotuzumab)、尼威路单抗(Nivolumab)、疏诺莫单抗(Nofetumomab merpentan)、奥托昔单抗(Obiltoxaximab)、奥比妥珠单抗(Obinutuzumab)、奥卡土珠单抗(Ocaratuzumab)、奥瑞珠单抗(Ocrelizumab)、奥度莫单抗(Odulimomab)、奥法木单抗(Ofatumumab)、奥拉图单抗(Olaratumab)、奥鲁凯珠单抗(Olokizumab)、奥马珠单抗(Omalizumab)、欧那土珠单抗(Onartuzumab)、欧土希珠单抗(Ontuxizumab)、奥匹奴单抗(Opicinumab)、莫奥珠单抗(Oportuzumab monatox)、奥戈伏单抗(Oregovomab)、奥泰单抗(Orticumab)、奥昔珠单抗(Otelixizumab)、奥特乐土珠单抗(Otlertuzumab)、欧西鲁单抗(Oxelumab)、欧赞尼珠单抗(Ozanezumab)、欧左立珠单抗(Ozoralizumab)、帕昔单抗(Pagibaximab)、帕利珠单抗(Palivizumab)、帕利珠单抗(Panitumumab)、帕尼库单抗(Pankomab)、帕诺库单抗(Panobacumab)、帕萨土珠单抗(Parsatuzumab)、帕考珠单抗(Pascolizumab)、帕妥昔珠单抗(Pasotuxizumab)、帕特立珠单抗(Pateclizumab)、帕图单抗(Patritumab)、派姆单抗(Pembrolizumab)、帕尼单抗(Pemtumomab)、培拉凯珠单抗(Perakizumab)、培妥珠单抗(Pertuzumab)、培克珠单抗(Pexelizumab)、皮地利珠单抗(Pidilizumab)、维汀-平尼土珠单抗(Pinatuzumabvedotin)、平妥莫单抗(Pintumomab)、普拉库鲁单抗(Placulumab)、维汀-普拉土珠单抗(Polatuzumab vedotin)、拍珠单抗(Ponezumab)、普立昔单抗(Priliximab)、普陀希单抗(Pritoxaximab)、普立木单抗(Pritumumab)、PRO 140、坤立珠单抗(Quilizumab)、R1507、雷库图单抗(Racotumomab)、雷德图单抗(Radretumab)、雷韦单抗(Rafivirumab)、劳赛珠单抗(Ralpancizumab)、雷莫芦单抗(Ramucirumab)、雷珠单抗(Ranibizumab)、雷昔库单抗(Raxibacumab)、Refanezumab、瑞加韦单抗(Regavirumab)、瑞利珠单抗(Reslizumab)、利妥木单抗(Rilotumumab)、Rinucumab、利妥昔单抗(Rituximab)、罗妥木单抗(Robatumumab)、罗勒杜单抗(Roledumab)、罗姆苏珠单抗(Romosozumab)、罗利珠单抗(Rontalizumab)、罗维珠单抗(Rovelizumab)、鲁利珠单抗(Ruplizumab)、Sacituzumab govitecan、沙玛立珠单抗(Samalizumab)、沙鲁单抗(Sarilumab)、沙妥莫单抗(Satumomab pendetide)、SCH 900105、司库钦单抗(Secukinumab)、司瑞斑图单抗(Seribantumab)、斯图希单抗(Setoxaximab)、司韦单抗(Sevirumab)、SGN-CD19A、SGN-CD33A、西罗珠单抗(Sibrotuzumab)、西法木单抗(Sifalimumab)、西图希单抗(Siltuximab)、西姆土珠单抗(Simtuzumab)、西利珠单抗(Siplizumab)、希瑞库单抗(Sirukumab)、维汀-索菲妥珠单抗(Sofituzumab vedotin)、苏兰珠单抗(Solanezumab)、苏力图单抗(Solitomab)、松普希珠单抗(Sonepcizumab)、松妥珠单抗(Sontuzumab)、司他芦单抗(Stamulumab)、硫索单抗(Sulesomab)、索维单抗(Suvizumab)、他贝鲁单抗(Tabalumab)、他珠单抗(Tacatuzumab tetraxetan)、他度珠单抗(Tadocizumab)、他利珠单抗(Talizumab)、他尼珠单抗(Tanezumab)、帕他莫单抗(Taplitumomab paptox)、他瑞妥单抗(Tarextumab)、替非珠单抗(Tefibazumab)、阿替莫单抗(Telimomab aritox)、替妥莫单抗(Tenatumomab)、替奈昔单抗(Teneliximab)、替利珠单抗(Teplizumab)、替普单抗(Teprotumumab)、Tesidolumab、Tetulomab、TGN1412、替西木单抗(Ticilimumab)/曲美木单抗(tremelimumab)、替加珠单抗(Tigatuzumab)、替曲吉珠单抗(Tildrakizumab)、TNX-650、托珠单抗(Tocilizumab)、托利珠单抗(Toralizumab)、托萨托舒单抗(Tosatoxumab)、托西莫单抗(Tositumomab)、托维图单抗(Tovetumab)、曲洛青木单抗(Tralokinumab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、TRBS07、曲加立珠单抗(Tregalizumab)、曲美木单抗(Tremelimumab)、Trevogrumab、西莫白介素单抗(Tucotuzumab celmoleukin)、妥韦单抗(Tuvirumab)、乌波利土西单抗(Ublituximab)、乌洛鲁单抗(Ulocuplumab)、乌瑞鲁单抗(Urelumab)、乌珠单抗(Urtoxazumab)、优特克单抗(Ustekinumab)、Vandortuzumabvedotin、伐提克图单抗(Vantictumab)、伐努赛珠单抗(Vanucizumab)、伐利昔单抗(Vapaliximab)、伐利鲁单抗(Varlilumab)、维特立珠单抗(Vatelizumab)、维多珠单抗(Vedolizumab)、维妥珠单抗(Veltuzumab)、维帕莫单抗(Vepalimomab)、维西库单抗(Vesencumab)、维西珠单抗(Visilizumab)、伏洛昔单抗(Volociximab)、伏妥土珠单抗(Vorsetuzumab mafodotin)、伏妥昔单抗(Votumumab)、扎芦木单抗(Zalutumumab)、扎木单抗(Zanolimumab)、扎土希单抗(Zatuximab)、齐拉木单抗(Ziralimumab)以及阿佐莫单抗(Zolimomab aritox)。
在一些情况下，细胞的异源性基因产物为分泌性基因产物。在一些情况下，细胞的异源性基因产物为表面表达的基因产物。在一些情况下，激活的细胞内结构域同时调节细胞的两种或更多种异源性基因产物的表达。在一些情况下，接触在体内、离体或在体外进行。
在一些情况下，特异性结合对的第二成员在第二细胞的表面上、固定在不溶性基材上、存在于细胞外基质中、存在于人工基质中，或是可溶性的。在一些情况下，细胞内转录因子直接调节细胞的分化。在一些情况下，转录因子通过调节第二转录因子的表达间接地调节细胞的分化。
在一些情况下，细胞为免疫细胞并且细胞的活性是免疫细胞的分化。在一些情况下，细胞为免疫细胞，细胞内结构域为调节细胞的分化的转录因子，并且细胞的活性是免疫细胞的分化。在一些情况下，转录因子直接调节免疫细胞的分化。在一些情况下，转录因子通过调节第二转录因子的表达间接地调节免疫细胞的分化。
在一些情况下，细胞为干细胞并且细胞的活性是干细胞的分化。在一些情况下，细胞为祖细胞或前体细胞并且细胞的活性是祖细胞或前体细胞的分化。
在一些情况下，细胞内结构域的活化通过转录调控、染色质调控、翻译、运输或翻译后加工来调节细胞的内源性基因的表达。在一些情况下，细胞内结构域的活化调节细胞对第二细胞或对细胞外基质的细胞粘附。
在一些情况下，结合转导子包含配体诱导型蛋白水解裂解位点，其中特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员的结合在配体诱导型蛋白水解裂解位点处诱导结合转导子的裂解，从而转导结合信号并且通过以蛋白水解方式释放细胞内结构域来激活细胞内结构域。
本公开提供了一种调节细胞的活性的方法，所述方法包括：使细胞与第一特异性结合对的第二成员和第二特异性结合对的第二成员接触，其中所述细胞表达：i)包括包含第一特异性结合对的第一成员的细胞外结构域、结合转导子和细胞内结构域的第一结合触发的转录开关；以及ii)包括包含第二特异性结合对的第一成员的细胞外结构域、结合转导子和细胞内结构域的至少第二结合触发的转录开关；其中当第一和第二特异性结合对的第一和第二成员的结合诱导结合转导子转导结合信号以激活第一和第二细胞内结构域时，第一结合触发的转录开关的细胞内结构域提供第一效应子功能并且第二结合触发的转录开关的细胞内结构域提供不同于第一效应子功能的第二效应子功能。
在一些情况下，第一结合触发的转录开关的细胞内结构域的效应子功能调节细胞的基因产物的表达。
在一些情况下，细胞的基因产物为细胞的内源性基因产物。在一些情况下，细胞的基因产物为细胞的异源性基因产物。在一些情况下，细胞的基因产物为选自由以下各项组成的组的细胞的基因产物：趋化因子、趋化因子受体、细胞因子、细胞因子受体、分化因子、生长因子、生长因子受体、激素、代谢酶、增殖诱导剂、受体、小分子第二信使合成酶、T细胞受体、转录激活蛋白、转录阻遏蛋白、转录激活蛋白、转录阻遏蛋白、翻译调控子、翻译激活蛋白、翻译阻遏蛋白、活化性免疫受体、细胞凋亡抑制剂、细胞凋亡诱导剂、免疫激活剂、免疫抑制剂以及抑制性免疫受体。
在一些情况下，第二结合触发的转录开关的细胞内结构域的效应子功能调节细胞的基因产物的表达。在一些情况下，细胞的基因产物为细胞的内源性基因产物。在一些情况下，细胞的基因产物为细胞的异源性基因产物。
在一些情况下，细胞的基因产物选自由以下各项组成的组：趋化因子、趋化因子受体、细胞因子、细胞因子受体、分化因子、生长因子、生长因子受体、激素、代谢酶、增殖诱导剂、受体、小分子第二信使合成酶、T细胞受体、转录激活蛋白、转录阻遏蛋白、转录激活蛋白、转录阻遏蛋白、翻译调控子、翻译激活蛋白、翻译阻遏蛋白、活化性免疫受体、细胞凋亡抑制剂、细胞凋亡诱导剂、免疫激活剂、免疫抑制剂以及抑制性免疫受体。
在一些情况下，第一和第二结合触发的转录开关的结合转导子中的至少一个包含配体诱导型蛋白水解裂解位点，其中相应特异性结合对的第一和第二成员的结合在配体诱导型蛋白水解裂解位点处诱导结合转导子的裂解，从而转导结合信号并且通过以蛋白水解方式释放细胞内结构域来激活相应的细胞内结构域。
在一些情况下，第一和第二结合触发的转录开关的结合转导子均包含配体诱导型蛋白水解裂解位点。
在一些情况下，所述方法还包括使细胞与可溶性抑制剂分子接触，所述可溶性抑制剂分子竞争性地抑制特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员的结合，从而防止诱导结合转导子转导结合信号以激活细胞内结构域，其中使细胞与可溶性抑制剂分子接触包括向第一细胞施加或施用可溶性抑制剂分子和/或将细胞置于表达可溶性抑制剂分子的第二细胞的存在下。在一些情况下，第二细胞组成型地表达可溶性抑制剂分子。在一些情况下，第二细胞条件性地表达可溶性抑制剂分子。
本公开提供了一种调节细胞的活性的方法，所述方法包括：使细胞与第一特异性结合对的第二成员接触，其中所述细胞表达：i)第一结合触发的转录开关，其包括包含第一特异性结合对的第一成员的细胞外结构域、结合转导子和细胞内结构域；以及ii)至少第二结合触发的转录开关，其包括包含第二特异性结合对的第一成员的细胞外结构域、结合转导子和细胞内结构域，其中编码第二结合触发的转录开关的核苷酸序列可操作地连接至通过第一结合触发的转录开关的细胞内结构域激活或阻遏的转录控制元件。
在一些情况下，接触在体内、离体或在体外进行。在一些情况下，第一特异性结合对的第二成员在第二细胞的表面上、固定在不溶性基材上、存在于细胞外基质中、存在于人工基质中，或是可溶性的。
在一些情况下，第二结合触发的转录开关的细胞内结构域的激活调节选自由以下各项组成的组的细胞活性：细胞的基因产物的表达、细胞的增殖、细胞的细胞凋亡、细胞的非细胞凋亡性死亡、细胞的分化、细胞的去分化、细胞的迁移、分子从细胞中的分泌以及细胞的细胞粘附。
在一些情况下，细胞的活性为细胞的基因产物的表达。在一些情况下，细胞的基因产物为选自由以下各项组成的组的细胞的基因产物：趋化因子、趋化因子受体、细胞因子、细胞因子受体、分化因子、生长因子、生长因子受体、激素、代谢酶、增殖诱导剂、受体、小分子第二信使合成酶、T细胞受体、转录激活蛋白、转录阻遏蛋白、转录激活蛋白、转录阻遏蛋白、翻译调控子、翻译激活蛋白、翻译阻遏蛋白、活化性免疫受体、细胞凋亡抑制剂、细胞凋亡诱导剂、免疫激活剂、免疫抑制剂以及抑制性免疫受体。
在一些情况下，第一和第二结合触发的转录开关的结合转导子中的至少一个包含配体诱导型蛋白水解裂解位点，其中相应特异性结合对的第一和第二成员的结合在配体诱导型蛋白水解裂解位点处诱导结合转导子的裂解，从而转导结合信号并且通过以蛋白水解方式释放细胞内结构域来激活相应的细胞内结构域。
本公开提供了一种追踪细胞-细胞接触的方法，所述方法包括：在多个第一细胞的每个细胞中表达包括包含特异性结合对的第一成员的细胞外结构域、结合转导子和细胞内结构域的结合触发的转录开关；在多个第二细胞的每个细胞中表达特异性结合对的第二成员；以及使多个第一细胞与多个第二细胞接触，其中特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员的结合诱导结合转导子转导结合触发的转录开关的结合信号，从而激活细胞内结构域，其中细胞内结构域的激活诱导足以在空间、时间或其组合上追踪细胞-细胞接触的可检测报告基因的表达。
在一些情况下，多个第一细胞、多个第二细胞或两者均为神经元。在一些情况下，结合转导子包含配体诱导型蛋白水解裂解位点，其中特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员的结合在配体诱导型蛋白水解裂解位点处诱导结合转导子的裂解，从而转导结合信号并且通过以蛋白水解方式释放细胞内结构域来激活细胞内结构域。
在一些情况下，结合触发的转录开关，包括上文和本文所述的那些，是SynNotch多肽。
本公开还提供了一种定位性细胞激活系统，所述系统包括：细胞，其包括：表达的结合触发的转录开关，其包括包含第一特异性结合对的第一成员的细胞外结构域、结合转导子和细胞内结构域；以及核酸，其可操作地连接至通过第一结合触发的转录开关的细胞内结构域诱导的转录控制元件，编码包括第二特异性结合对的第一成员的结合触发的激活多肽；其中在与第一特异性结合对的第二成员接触时，结合触发的激活多肽被表达，并且在与第二特异性结合对的第二成员接触时，结合触发的激活多肽激活细胞。
在一些情况下，所述细胞选自由以下各项组成的组：免疫细胞、祖细胞或前体细胞、干细胞以及神经元。在一些情况下，细胞为免疫细胞，结合触发的转录开关为抗原触发的转录开关，并且结合触发的激活多肽为抗原触发的激活多肽，其中在与第一特异性结合对的第二成员接触时，抗原触发的激活多肽被表达，并且在与第二特异性结合对的第二成员接触时，抗原触发的激活多肽激活免疫细胞以识别表达第二特异性结合对的第一成员的靶细胞。
在一些情况下，抗原触发的激活多肽为嵌合抗原受体或其变体。在一些情况下，抗原触发的激活多肽为工程化T细胞受体或其变体。在一些情况下，表达的结合触发的转录开关为SynNotch多肽。
本公开提供了一种局部调节细胞的活性的方法，所述方法包括：在第一细胞中表达包括结合转导子、细胞内结构域以及包括特异性结合可溶性衔接子分子上的第一表位的第一衔接子结合结构域的第一细胞外结构域的结合触发的转录开关；使第一细胞与以下各项接触：i)表达包括特异性结合可溶性衔接子分子上的第二表位的第二衔接子结合结构域的第二细胞外结构域的第二细胞；以及ii)有效浓度的可溶性衔接子分子，其中第一衔接子结合结构域和第二衔接子结合结构域与衔接子分子的结合诱导结合转导子转导结合信号，以激活细胞内结构域，从而产生激活的细胞内结构域，其中激活的细胞内结构域调节选自由以下各项组成的组的第一细胞的活性：细胞的基因产物的表达、细胞的增殖、细胞的细胞凋亡、细胞的非细胞凋亡性死亡、细胞的分化、细胞的去分化、细胞的迁移、分子从细胞中的分泌以及细胞的细胞粘附。在一些情况下，接触包括在体外或离体向细胞施加可溶性衔接子分子或在体内向细胞施用可溶性衔接子分子。在一些情况下，使第一细胞与有效浓度的可溶性衔接子分子接触包括将第一细胞置于表达衔接子分子的第三细胞的存在下，其中第三细胞组成型地或条件性地表达衔接子分子。在一些情况下，第一细胞外结构域和可溶性衔接子分子是特异性结合对的第一和第二成员。在一些情况下，第二细胞外结构域和可溶性衔接子分子是特异性结合对的第一和第二成员。在一些情况下，第一细胞外结构域和第二细胞外结构域是抗体或纳米抗体。在一些情况下，细胞内结构域是转录因子。在一些情况下，激活的细胞内结构域调节第一细胞的内源性或异源性基因产物的表达。在一些情况下，结合转导子包含配体诱导型蛋白水解裂解位点，其中第一细胞外结构域和第二细胞外结构域与可溶性衔接子分子的结合在配体诱导型蛋白水解裂解位点处诱导结合转导子的裂解，从而转导结合信号并且通过以蛋白水解方式释放细胞内结构域来激活细胞内结构域。
本公开提供了一种宿主细胞，其包括：编码响应于第一抗原的第一结合触发的转录开关的核酸；第一启动子，其响应于第一结合触发的转录开关并且可操作地连接至编码包括特异性结合到特异性结合对的第一成员的细胞外结构域的CAR的核酸；编码响应于第二抗原的第二结合触发的转录开关的核酸；以及第二启动子，其响应于第二结合触发的转录开关并且可操作地连接至编码细胞内CAR抑制结构域的核酸；其中在第二抗原的存在下，细胞内CAR抑制结构域被表达，从而抑制通过CAR对细胞的激活，并且在第一抗原而不是第二抗原的存在下，CAR被表达且通过特异性结合对的第二成员可激活。
本公开提供了一种宿主细胞，其包括：编码响应于第一抗原的第一结合触发的转录开关的核酸；第一启动子，其响应于第一结合触发的转录开关并且可操作地连接至编码包括特异性结合到特异性结合对的第一成员的细胞外结构域的CAR的第一部分的核酸；编码响应于第二抗原的第二结合触发的转录开关的核酸；以及第二启动子，其响应于第二结合触发的转录开关并且可操作地连接至编码包括细胞内信号传导结构域的CAR的第二部分的核酸；其中在第一抗原和第二抗原的存在下，CAR的第一部分和第二部分被表达，并且CAR通过特异性结合对的第二成员可激活。在一些情况下，细胞还包括：编码响应于第三抗原的第三结合触发的转录开关的核酸；以及第三启动子，其响应于第三结合触发的转录开关并且可操作地连接至编码细胞内CAR抑制结构域的核酸；其中在第三抗原的存在下，细胞内CAR抑制结构域被表达，从而抑制通过CAR对细胞的激活。
附图说明
图1为Notch受体多肽的示意图。
图2A-2G提供各种物种的Notch受体多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:131-137)。
图3提供各种哺乳动物物种的Notch受体多肽的一部分的氨基酸序列比对(小鼠–SEQ ID NO:138；人–SEQ ID NO:139；奶牛–SEQ ID NO:140)。
图4A-4G提供本公开的示例性嵌合Notch受体多肽的示意图。
图5提供使用本公开的嵌合Notch受体多肽直接控制效应子功能的示意图。
图6提供使用本公开的嵌合Notch受体多肽直接控制效应子功能的实例的示意图。
图7提供使用本公开的嵌合Notch受体多肽间接控制效应子功能的示意图。
图8提供使用本公开的嵌合Notch受体多肽间接控制效应子功能的实例的示意图。
图9A和9B提供并行使用多个嵌合Notch受体多肽的示意图。
图10提供串联使用多个嵌合Notch受体多肽的示意图。
图11提供串联使用嵌合Notch受体多肽和嵌合抗原受体(CAR)的示意图。
图12提供在两个或更多个细胞中使用嵌合Notch受体多肽的示意图，示出多细胞协同性。
图13提供在多细胞环境中使用嵌合Notch受体多肽的示意图。
图14提供具有两个或更多个细胞的多受体电路的使用的示意图。
图15提供生物物质响应于特定细胞外结构而定位/靶向产生的示意图。
图16A-16C示出Notch受体多肽的实例(SEQ ID NO:141-143)。
图17-29提供示例性嵌合Notch受体多肽的氨基酸序列(图17A-C–SEQ ID NO:144-146；图18–SEQ ID NO:147；图19A-B–SEQ ID NO:148-149；图20–SEQ ID NO:150-153；图21–SEQ ID NO:154；图22–SEQ ID NO:155；图23–SEQ ID NO:156；图24–SEQ ID NO:157；图25–SEQ ID NO:158；图26–SEQ ID NO:159；图27–SEQ ID NO:160；图28–SEQ ID NO:161；图29–SEQ ID NO:162)。
图30A和30B示出TRE报告系中具有抗CD19的嵌合Notch的代表性结果。
图31A和31B示出TRE报告系中具有抗间皮素的嵌合Notch的代表性结果。
图32A和32B示出UAS报告系中嵌合Notch抗CD19的代表性结果。
图33A和33B示出利用使用抗CD19嵌合Notch转导的SV40/UAS报告细胞的结果，其中细胞内结构域为Gal4 DNA结合结构域与转录阻遏结构域KRAB的融合。
图34示出嵌合Notch受体多肽在信号传导中继的级联中的使用。
图35A-35C示出嵌合Notch受体多肽对嵌合抗原受体(CAR)表达和针对癌细胞的T细胞激活的作用。
图36提供了Cas9多肽(SEQ ID NO:163)的氨基酸序列。
图37-83提供了示例性转录激活蛋白和阻遏蛋白的氨基酸序列(图37–SEQ ID NO:164；图38–SEQ ID NO:165；图39–SEQ ID NO:165；图40–SEQ ID NO:166；图41–SEQ ID NO:167；图42–SEQ ID NO:169；图43–SEQ ID NO:170；图44–SEQ ID NO:171；图45–SEQ ID NO:172；图46–SEQ ID NO:173；图47–SEQ ID NO:174；图48–SEQ ID NO:175；图49–SEQ ID NO:176；图50–SEQ ID NO:177；图51–SEQ ID NO:178；图52–SEQ ID NO:179；图53–SEQ ID NO:180；图54–SEQ ID NO:181；图55–SEQ ID NO:182；图56–SEQ ID NO:183；图57–SEQ ID NO:184；图58–SEQ ID NO:185；图59–SEQ ID NO:186；图60–SEQ ID NO:187；图61–SEQ ID NO:188；图62–SEQ ID NO:189；图63–SEQ ID NO:190；图64–SEQ ID NO:191；图65–SEQ ID NO:192；图66–SEQ ID NO:193；图67–SEQ ID NO:194；图68–SEQ ID NO:195；图69–SEQ ID NO:196；图70–SEQ ID NO:197；图71–SEQ ID NO:198；图72–SEQ ID NO:199；图73–SEQ ID NO:200；图74–SEQ ID NO:201；图75–SEQ ID NO:202；图76–SEQ ID NO:203；图77–SEQ ID NO:204；图78–SEQ ID NO:205；图79–SEQ ID NO:206；图80–SEQ ID NO:207；图81–SEQ ID NO:208；图82–SEQ ID NO:209；图83–SEQ ID NO:210)。
图84A和84B示出γ-分泌酶抑制剂对嵌合Notch受体多肽的激活的作用。
图85A和85B示出synNotch受体的示例性模块化构造。
图86A-86C阐释了SynNotch受体可用于程序接触依赖性转录调控。
图87A-87D提供了与图85A和85B相关的另外的数据。
图88A-88C提供了与图86A-C相关的另外的数据。
图89A和89B阐述了SynNotch受体在各种不同细胞类型中的功能。
图90A-90C提供了与图89A和89B相关的另外的数据。
图91A-91D阐释了SynNotch受体产生各种不同的细胞行为的空间控制。
图92A-92C提供了与图91A-D相关的另外的数据。
图93A-93C阐释了SynNotch受体彼此正交并且可用于组合调控。
图94A-94C阐释了多个synNotch受体可用于生成多层自组织上皮细胞的图案。
图95A-95C示出synNotch受体的模块性扩大了哺乳动物细胞的感测/应答工程化。
图96A-96C阐释了使用synNotch受体工程化定制治疗性T细胞应答的潜能。
图97A-97F示出synNotch受体可在CD4+和CD8+人原代T淋巴细胞中驱动抗原诱导的转录。
图98A-98F阐释了synNotch受体可驱动抗原诱导的定制细胞因子程序。
图99A-99E阐释了synNotch受体可驱动T细胞分化对抗肿瘤Th1命运的抗原依赖性偏向。
图100A-100E阐释了非天然治疗剂的定制T细胞递送-synNotch驱动的TRAIL产生。
图101A-101C阐释了通过synNotch受体工程化T细胞实现的细胞因子在实体肿瘤中的体内局部表达。
图102A-102B阐释了SynNotch受体是允许T细胞监测和选择性地调节它们的微环境的万能调控子(versatile regulator)。
图103A-103F提供了与图97A-97F相关的补充数据。
图104A-104I提供了与图98A-98F相关的补充数据。
图105A-105G提供了与图99A-99E相关的补充数据。
图106A-106H提供了与图100A-100E相关的补充数据。
图107A-107E提供了与图101A-101C相关的补充数据。
图108A-108D提供了用于T细胞中的组合抗原感测的synNotch受体的实施方案。
图109A-109D阐释了synNotch门控的CAR表达-对Jurkat T细胞激活的组合抗原需要。
图110A-110F阐释了人原代T细胞中synNotch门控的CAR表达-对治疗性T细胞激活和肿瘤杀死的组合抗原控制。
图111A-111C示出synNotch受体在体内驱动肿瘤定位性CAR表达。
图112A-112D示出通过synNotch门控的CAR表达实现的体内选择性组合抗原肿瘤杀死。
图113A-113C示出synNotch受体控制和定位CAR T细胞应答，以用于精确的免疫疗法。
图114A-114D提供了与图109A-109D相关的补充数据。
图115A-115I提供了与图110A-110F相关的补充数据。
图116A-116C提供了与图111A-111C相关的补充数据。
图117A-117E提供了与图112A-112D相关的补充数据。
图118阐释了使用synNotch在人T细胞中诱导Foxp3的表达。
图119提供了用于人T细胞的SynNotch控制的抗体分泌的一般抗体构建体设计。
图120提供了用于测试synNotch诱导的抗体分泌的体外测定的示意图。
图121提供了细胞表面“夹心ELISA”流式细胞术测定的示意图。
图122阐释了SynNotch T细胞可响应于抗原刺激被诱导产生异源性抗体。
图123提供了拆分SynNotch信号传导系统的示意图。
图124阐释了根据本公开的拆分SynNotch信号传导系统的一个实施方案在可溶性衔接子分子的各种浓度下的接收器细胞激活。
图125提供了根据本公开的实施方案的三细胞拆分SynNotch信号传导系统的示意图。
图126阐释了根据本公开的实施方案的三细胞拆分SynNotch信号传导系统中的SynNotch接收器细胞激活。
图127提供了根据本公开的实施方案的三细胞拆分SynNotch抑制性信号传导系统的示意图。
图128阐释了根据本公开的实施方案的三细胞拆分SynNotch抑制性信号传导系统中的SynNotch接收器细胞激活的抑制。
图129A-129F提供了如本文所述的拆分CAR系统的具体实施方案的示意图(图129F标识了在图129A-129E中表示的示意图的元件)。
图130示出双抗原门控的拆分CAR电路的一个实施方案。
图131示出双抗原门控的拆分CAR电路的另一个实施方案。
图132提供了三输入门控电路的实施方案的示意图。
图133提供了三抗原门控的SynNotch拆分CAR电路的一种构造的图。
图134提供了四输入门控电路的实施方案的示意图。
图135提供了五输入门控电路的实施方案的示意图。
图136提供了本公开的三输入与(AND)+非(NOT)门的一个实施方案的示意图。
图137提供了具有拆分转录因子与功能性和显性负性非功能性的多输入门的一个实施方案的示意图。
图138提供了多输入门控的CAR T细胞激活电路的一个实施方案的示意图。
图139提供了经修饰以条件性地分泌派姆单抗的SynNotch CD4T细胞的与图122中进行的分析类似的分析的结果。
图140提供了经修饰分泌派姆单抗的SynNotch E6-1 Jurkat细胞的与图122中进行的分析类似的分析的结果。
图141提供了使用替代性构建体修饰以分泌派姆单抗的SynNotch E6-1 Jurkat细胞的与图122中进行的分析类似的分析的结果。
图142提供了经修饰分泌曲美木单抗的SynNotch CD4 T细胞的与图122中进行的分析类似的分析的结果。
图143提供了经修饰分泌曲美木单抗的SynNotch E6-1 Jurkat细胞的与图122中进行的分析类似的分析的结果。
定义
在本文互换使用的术语“多核苷酸”和“核酸”是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。因此，此术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合体或包括嘌呤和嘧啶碱基或其他天然的、化学或生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。
“可操作地连接”是指毗邻，其中如此描述的组件处于允许它们以其预期方式起作用的关系。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，那么所述启动子可操作地连接至所述编码序列。
“载体”或“表达载体”是复制子，诸如质粒、噬菌体、病毒或粘粒，另一个DNA区段，即“插入序列”可与其附接，以便在细胞中引起附接区段的复制。
如本文所用的“异源性”是指不是在天然(例如，天然存在的)核酸或蛋白质中发现的核苷酸或多肽序列。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”包括任何同种型的抗体或免疫球蛋白、保持与抗原特异性结合的抗体的片段(包括但不限于Fab、Fv、scFv和Fd片段)、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体(scAb)、单结构域抗体(dAb)、单结构域重链抗体、单结构域轻链抗体、纳米抗体、双特异性抗体、多特异性抗体，以及包括抗体和非抗体蛋白的抗原-结合(本文也称为抗原结合)部分的融合蛋白。可以用例如放射性同位素、生成可检测产物的酶、荧光蛋白等对抗体进行可检测标记。抗体还可被缀合至其他部分，诸如特异性结合对的成员，例如生物素(生物素-抗生物素蛋白特异性结合对的成员)等。抗体还可结合至固体支持体，包括但不限于聚苯乙烯板或珠等。该术语还涵盖了Fab’、Fv、F(ab’)2和或保持与抗原特异性结合的其他抗体片段以及单克隆抗体。如本文所用，单克隆抗体为通过一组相同的细胞产生的抗体，所述细胞全部通过重复的细胞复制由单一细胞产生。也就是说，细胞的克隆仅产生单一抗体种类。虽然可使用杂交瘤生产技术产生单克隆抗体，但是也可使用本领域技术人员已知的其他产生方法(例如，源自抗体噬菌体展示文库的抗体)。抗体可以是一价或二价的。抗体可以是Ig单体，其为由四个多肽链组成的“Y形”分子：通过二硫键连接的两个重链和两个轻链。
如本文所用的术语“人源化免疫球蛋白”是指包括不同来源的免疫球蛋白的部分的免疫球蛋白，其中至少一个部分包括人来源的氨基酸序列。例如，人源化抗体可包括通过常规技术化学地连结在一起(例如合成)或使用基因工程技术制备为连续多肽(例如，可使编码嵌合抗体的蛋白质部分的DNA表达以产生连续多肽链)的衍生自具有所需特异性的非人(诸如小鼠)来源的免疫球蛋白的部分和衍生自人来源的免疫球蛋白序列(例如，嵌合免疫球蛋白)的部分。人源化免疫球蛋白的另一个实例是包含包括衍生自非人来源的抗体的互补决定区(CDR)和衍生自人源的轻链和/或重链的框架区的一个或多个免疫球蛋白链的免疫球蛋白(例如，具有或不具有框架变化的CDR-移植抗体)。术语人源化免疫球蛋白还涵盖嵌合或CDR移植的单链抗体。参见，例如，Cabilly等人，美国专利No.4,816,567；Cabilly等人，欧洲专利No.0,125,023B1；Boss等人，美国专利No.4,816,397；Boss等人，欧洲专利No.0,120,694B1；Neuberger,M.S.等人，WO 86/01533；Neuberger,M.S.等人，欧洲专利No.0,194,276B1；Winter，美国专利No.5,225,539；Winter，欧洲专利No.0,239,400B1；Padlan,E.A.等人，欧洲专利申请No.0,519,596A1。关于单链抗体，另外参见，Ladner等人，美国专利No.4,946,778；Huston，美国专利No.5,476,786；以及Bird,R.E.等人，Science,242:423-426(1988))。
如本文所用，术语“纳米抗体”(Nb)是指衍生自天然存在的重链抗体的最小的抗原结合片段或单一可变结构域(VHH)并且是本领域技术人员已知的。它们衍生自骆驼科动物中可见的仅重链的抗体(Hamers-Casterman等人,1993；Desmyter等人,1996)。在“骆驼科动物”家族中，发现了缺乏轻多肽链的免疫球蛋白。“骆驼科动物”包括旧大陆骆驼科动物(双峰驼(Camelus bactrianus)和单峰驼(Camelus dromedarius))和新大陆骆驼科动物(例如，羊驼(Llama paccos)、驼羊(Llama glama)、原驼(Llama guanicoe)以及骆马(Llamavicugna))。单一可变结构域重链抗体在本文指纳米抗体或VHH抗体。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分，例如，完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双链抗体；线性抗体(Zapata等人,ProteinEng.8(10):1057-1062(1995))；结构域抗体(dAb；Holt等人(2003)Trends Biotechnol.21:484)；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有一个抗原结合位点，以及一个残余的“Fc”片段，名称反映了其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab')2片段，其具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。
“Fv”是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。此区由紧密、非共价结合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。正是在这种构造中，各可变结构域的三个CDR相互作用而在VH-VL二聚体的表面上确定了一个抗原结合位点。总起来说，六个CDR共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变结构域(或只包含对抗原有特异的三个CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，但是亲和力低于完整结合位点。
“Fab”片段还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab片段与Fab'片段的不同之处在于重链CH1结构域的羧基末端添加了少数残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文中对其中恒定结构域的半胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab'的称谓。F(ab')2抗体片段最初是作为在Fab'片段之间具有铰链半胱氨酸的成对Fab'片段产生的。还已知抗体片段的其他化学偶联。
来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可基于其恒定结构域的氨基酸序列分为两种截然不同的类型之一，称为κ和λ。根据其重链的恒定结构域的氨基酸序列，可将免疫球蛋白分为不同的种类。有五大类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些种类中的几种可进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。亚类可进一步分成类型，例如IgG2a和IgG2b。
“单链Fv”或“sFv”或“scFv”抗体片段包括抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。在一些实施方案中，Fv多肽还包括VH与VL结构域之间的多肽接头，其使得sFv能够形成用于抗原结合的期望结构。sFv的综述参见Pluckthun，于The Pharmacologyof Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag,NewYork,第269-315页(1994)中。
术语“双链抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包括在相同多肽链(VH-VL)中连接至轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)。通过使用过短以允许相同链上的两个结构域之间配对的接头，迫使结构域与另一链的互补结构域配对并产生抗原结合位点。双链抗体更全面地描述于例如EP 404,097；WO 93/11161；以及Hollinger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448中。
如本文所用，术语“亲和力”是指两种试剂(例如，抗体和抗原)的可逆结合的平衡常数并且表示为解离常数(KD)。亲和力可比抗体对不相关氨基酸序列的亲和力大至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍或至少1,000倍或更多。抗体与靶蛋白的亲和力可以为例如，约100纳摩尔(nM)至约0.1nM、约100nM至约1皮摩尔(pM)或约100nM至约1飞摩尔(fM)或更多。如本文所用，术语“亲合力(avidity)”是指两种或更多种试剂的复合物在稀释后解离的阻力。术语“免疫反应性”和“优先结合”相对于抗体和/或抗原结合片段在本文互换使用。
术语“结合”是指由于例如共价、静电、疏水和离子和/或氢键相互作用，包括诸如盐桥和水桥的相互作用造成的两个分子之间的直接缔合。在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽的细胞外结构域中存在的特异性结合对的第一成员特异性结合到特异性结合对的第二成员。“特异性结合”是指以至少约10-7M或更大，例如5x10-7M、10-8M、5x 10-8M和更大的亲和力结合。“非特异性结合”是指以小于约10-7M的亲和力结合，例如以10-6M、10-5M、10-4M等的亲和力结合。
如本文互换使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”是指任何长度的氨基酸的聚合形式，所述氨基酸可包括遗传编码的和非遗传编码的氨基酸、化学或生物化学修饰的或衍生的氨基酸，以及具有经修饰的肽骨架的多肽。该术语包括融合蛋白，包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白、具有异源和同源前导序列、具有或不具有N末端甲硫氨酸残基的融合蛋白；免疫标记蛋白；等等。
“分离”多肽是已经鉴定并且与其天然环境的组分分开和/或从其中回收的多肽。其天然环境的污染物组分是将妨碍多肽的诊断或治疗用途的材料，并且可包括酶、激素以及其他蛋白质性或非蛋白质性溶质。在一些实施方案中，将通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或银染将多肽纯化(1)至大于90％、大于95％或大于98％，按抗体的重量计，如通过洛雷(Lowry)法测定的，例如大于99重量％；(2)至足以获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，通过使用离心杯序列分析仪；或(3)至均匀。由于多肽的天然环境的至少一种组分将是不存在的，所以分离多肽包括重组细胞内的原位多肽。在一些情况下，分离多肽将通过至少一个纯化步骤进行制备。
本文互换使用的术语“嵌合抗原受体”和“CAR”是指能够触发或抑制免疫细胞的活化的人工多模块分子，其通常但非排他性地包括细胞外结构域(例如，配体/抗原结合结构域)、跨膜结构域以及一个或多个细胞内信号传导结构域。术语CAR不具体地限于CAR分子，而且还包括CAR变体。CAR变体包括拆分CAR，其中CRA的细胞外部分(例如，配体结合部分)和细胞内部分(例如，细胞内信号传导部分)存在于两个独立的分子上。CAR变体还包括启动开关CAR(ON-switch CAR)，其为可条件性激活的CAR，例如，包括拆分CAR，其中通过药物控制拆分CAR的两个部分的条件性异源二聚化。CAR变体还包括双特异性CAR，其包括可放大或抑制主要CAR的活性的次要CAR结合结构域。CAR变体还包括抑制性嵌合抗原受体(iCAR)，其可以例如用作双特异性CAR系统的组分，其中次要CAR结合结构域的结合导致主要CAR激活的抑制。CAR分子及其衍生物(即CAR变体)描述于例如PCT申请No.US2014/016527；Fedorov等人Sci Transl Med(2013)；5(215):215ra172；Glienke等人Front Pharmacol(2015)6:21；Kakarla&Gottschalk 52Cancer J(2014)20(2):151-5；Riddell等人Cancer J(2014)20(2):141-4；Pegram等人Cancer J(2014)20(2):127-33；Cheadle等人Immunol Rev(2014)257(1):91-106；Barrett等人Annu Rev Med(2014)65:333-47；Sadelain等人CancerDiscov(2013)3(4):388-98；Cartellieri等人,J Biomed Biotechnol(2010)956304；其公开内容全文以引用方式并入本文中。
如本文所用，根据Fridy等人(2014)Nat.Methods.11(12):1253-1260(其公开内容，包括相关补充材料，全文以引用方式并入本文)，GFP纳米抗体在本文可根据它们的“LaG”(针对GFP的美洲驼抗体)命名进行称呼。因此，例如，在其中GFP(或者GFP的变体或与GFP相关的其他刺胞动物荧光蛋白(例如，AmCFP、DsRed等))用作衔接子分子的情况下，假定LaG纳米抗体对的成员在它们与GFP的结合中不彼此干扰，例如，在LaG纳米抗体对的成员结合GFP的不同表位的情况中，可使用LaG纳米抗体的各种组合。LaG纳米抗体包括但不限于LaG-2、LaG-3、LaG-6、LaG-9、LaG-10、LaG-12、LaG-14、LaG-16、LaG-17、LaG-19、LaG-21、LaG-24、LaG-26、LaG-27、LaG-29、LaG-30、LaG-35、LaG-37、LaG-41、LaG-42、LaG-43、LaG-5、LaG-8、LaG-11、LaG-18、LaG16-G4S-2、LaG16-3xFLAG-2、LaG41-G4S-2等。在一些情况下，针对mCherry(LaM)的美洲驼抗体还可用于如本文所述的系统和装置，其中例如，LaM纳米抗体包括但不限于例如LaM-1、LaM-2、LaM-3、LaM-4、LaM-6、LaM-8。
如本文所用，术语“治疗(treatment、treating、treat)”等是指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果可以是就完全或部分预防疾病或其症状的预防性和/或可以是就疾病和/或可归因于疾病的不良作用的部分或完全治愈的治疗性。如本文所用，术语“治疗”涵盖哺乳动物，尤其是人的疾病的任何治疗，并且包括：(a)在可能易患疾病但尚未被诊断患有该疾病的受试者中预防疾病发生；(b)抑制该疾病，即阻止其发展；以及(c)减轻疾病，即引起疾病的消退。
本文互换使用的术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”是指哺乳动物，包括但不限于鼠科动物(大鼠、小鼠)、非人灵长类动物、人、犬科动物、猫科动物、有蹄类动物(例如，马、牛、羊、猪、山羊)、兔类动物等。在一些情况下，个体为人。在一些情况下，个体是非人灵长类动物。在一些情况下，个体是啮齿类动物，例如大鼠或小鼠。在一些情况下，个体是兔类动物，例如兔子。
在进一步描述本发明之前，应理解，本发明并不限于所描述的具体实施方案，因为这些实施方案当然是可变的。还应理解，本文所用的术语仅出于描述具体实施方案的目的，并不意在具有限制意义，因为本发明的范围将仅受所附权利要求的限定。
在提供值的范围的情况中，应理解，该范围的上限和下限之间的每个中间值(至下限的个位的十分之一，除非上下文另有清楚规定)和该所述范围中的任何其它所述值和中间值也被涵盖在本发明之内。这些较小范围的上限和下限可独立地被包括在较小范围中并且也被涵盖在本发明之内，受到所述范围中任何明确排除的限制。在所述范围包括限值中的一个或两个的情况中，排除那些被包括的限值中的任一个或两个的范围，也被包括在本发明中。
除非另外定义，本文所用的所有科技术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的一样。现在描述优选的方法和材料，不过任何与本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料也均可用于实施或测试本发明。本文所提及的全部出版物以引用方式并入本文，从而公开和描述了与出版物所引用的内容相关的方法和/或材料。
必须注意，如本文中和随附权利要求书中所用，单数形式“一个/种”和“所述”包括多个指代物，除非上下文清楚表明并非如此。因此，例如，所指的“嵌合Notch受体多肽”包括多个此类嵌合Notch受体多肽并且所指的“经遗传修饰的宿主细胞”包括一个或多个经遗传修饰的宿主细胞以及本领域技术人员已知的它们的等效物，等等。还应指出的是，权利要求书可能撰写成排除任何可选择的元素。同样，此陈述旨在作为与权利要求元素的复述一起使用此类排他性术语如“单独地”、“仅”等，或使用“否定性”限制的基础。
应认识到，为清楚起见在单独实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征也可组合提供于单个实施方案中。相反地，为简明起见在单个实施方案的上下文中描述的本发明的各种特征也可单独地或以任何合适的子组合提供。关于本发明的实施方案的所有组合被明确地包括在本发明中并公开于本文中，就如同每个和每一个组合被个别地且明确地公开。此外，各种实施方案的所有子组合及其元素也被明确地包括在本发明中并在本文公开，就如同每个和每一个此类子组合被个别地且清楚地在本文公开。
本文所论述的公布仅针对它们在本申请提交日之前的公开内容而提供。不得将本文任何条款视为允许本发明未经授权依靠现有发明先于此公布。此外，所提供的公布的日期可能不同于真实的公开日，真实的公开日可能需要独立地进行确认。
详述
本公开提供了嵌合Notch受体多肽、包含编码嵌合Notch受体多肽的核苷酸序列的核酸，以及用核酸遗传修饰的宿主细胞。嵌合Notch受体多肽可用于另外提供的多种应用。
本公开包括结合触发的转录开关以及使用结合触发的转录开关的方法。如本文所用，“结合触发的转录开关”通常是指具有包括特异性结合对的第一成员的细胞外结构域、结合转导子和细胞内结构域的相互作用的多肽的合成模块多肽或系统。在特异性结合对的第二成员与结合触发的转录开关结合时，结合信号被转导至细胞内结构域，使得细胞内结构域变得活化并且在细胞内执行其在结合信号的不存在下不执行的一些功能。
结合触发的转录开关的组件以及开关的组件相对于彼此的布置将根据许多因素变化，包括但不限于例如，期望的结合触发器、细胞内结构域的活性、结合触发的转录开关的总体功能、包括结合触发的转录开关的分子电路的较宽布置等。第一结合成员可包括但不限于例如，本文所述的特异性结合对的那些第一和/或第二结合成员。细胞内结构域可包括但不限于例如，那些细胞内结构域和或具有如本文所述的生物功能的结构域。
结合触发的转录开关的结合转导子将还根据结合信号的期望转导方法而变化。一般来讲，结合转导子可包括转导细胞外信号以进行细胞内信号传导，例如如各种信号转导途径的受体所执行的一样的那些多肽和/或那些多肽的结构域。结合信号的转导可通过各种机制实现，包括但不限于例如结合诱导的蛋白水解裂解、结合诱导的磷酸化、结合诱导的构象变化等。在一些情况下，结合转导子可包含配体诱导型蛋白水解裂解位点，使得在结合时，通过结合触发的转录开关的裂解转导结合信号，例如，以释放细胞内结构域。例如，在一些情况下，结合触发的转录开关可包括Notch衍生的可裂解结合转导子，诸如例如如本文所述的嵌合notch受体多肽。
在其他情况下，结合信号可在不存在可诱导的蛋白水解裂解时被转导。任何信号转导组分或信号转导途径的组分可用于结合触发的转录开关，无论蛋白水解裂解对于信号传播是否必要。例如，在一些情况下，包括但不限于例如Jak-Stat途径的一种或多种信号转导组分的基于磷酸化的结合转导子可用于非蛋白水解性结合触发的转录开关。
为简明起见，包括但不限于嵌合notch受体多肽的结合触发的转录开关主要描述为单一多肽链。然而，如将从本公开清楚的，结合触发的转录开关，包括嵌合notch受体多肽，可在两个或更多个单独的多肽链上分开或拆分，其中用以形成功能性结合触发的转录开关，例如嵌合notch受体多肽的两个或更多个多肽的连结可以组成型或条件性地控制。例如，拆分的结合触发的转录开关的两个部分的组成型连结可通过将组成型异源二聚化结构域插入拆分多肽的第一部分与第二部分之间来实现，使得在异源二聚化时，拆分部分功能性地连结。
在一些情况下，拆分的结合触发的转录开关的连结和/或来自拆分的结合触发的转录开关的信号传导可通过使用“衔接子”条件性地控制，所述“衔接子”介导例如拆分的结合触发的转录开关的第一部分和第二部分的功能性连结。为了介导通过拆分的结合触发的转录开关进行的信号传导，衔接子可直接添加或施用，或者可间接产生，例如通过从被构造用于此类表达的细胞中，例如条件性地或组成型地表达衔接子。可用的衔接子包括具有可由两个不同的结合分子同时利用的第一和第二结合表面的那些蛋白质。在一些情况下，衔接子可包括这样的蛋白质，其中两个抗体结合至所述蛋白质的两个不同的表位。
例如，在一些情况下，抗原可用作衔接子，其中所利用的结合分子可以是结合至抗原的两个不同表位的两个不同的抗体。在这一构型中，抗体或其部分与拆分的结合触发的转录开关的第一和第二部分的附接导致在抗原的存在下所述部分的功能性连结，如通过两个抗体与抗原的单分子的同时结合所介导的一样。可用作衔接子的抗原包括但不限于病原体的抗原、癌症相关抗原、疾病相关抗原、抗体等。在一些情况下，衔接子抗原是可溶的(例如，不与细胞的表面结合)。在一些情况下，衔接子抗原结合至细胞的表面。
例如，在一些情况下，GFP可用作衔接子，其中所利用的结合分子可以是结合至GFP的两个不同表面的两个不同的抗体。在这一构型中，抗体或其部分与拆分的结合触发的转录开关的第一和第二部分的附接导致在GFP的存在下所述部分的功能性连结，如通过两个抗体与GFP的单分子的同时结合所介导的一样。
在一些情况下，拆分的结合触发的转录开关，例如其中拆分的结合触发的转录开关的第一部分和第二部分的结合是由抗原衔接子介导的并且导致所述部分的功能性连结，拆分的结合触发的转录开关允许拆分的结合触发的转录开关的第一部分和第二部分附近抗原的存在的检测。例如，在某些实施方案中，结合触发的转录开关的第一部分在第一细胞的表面上表达并且结合触发的转录开关的第二部分在第二细胞上表达，并且此类第一和第二部分被构造成使得当第一和第二细胞附近存在可溶性抗原时，第一和第二部分通过抗原功能性地连结，从而导致通过激活的结合触发的转录开关激活报告基因。
拆分的结合触发的转录开关的两个部分不一定必须锚定至细胞以在抗原的检测中起作用。例如，在一些情况下，结合触发的转录开关的第一部分可溶性地表达并且结合触发的转录开关的第二部分在细胞上表达，并且此类第一和第二部分被构造成使得当第一和第二部分附近存在可溶性抗原时，所述部分通过抗原功能性地连结，从而导致结合触发的转录开关的引发，使得引发的结合触发的转录开关能够响应，例如报告第二事件，包括例如激活结合触发的转录开关的第二抗原的存在。这一第二抗原可存在于细胞的表面上或者可不附接至细胞(即可溶性的)。
拆分的结合触发的转录开关的部分的连结的条件性控制提供来自拆分的结合触发的转录开关的信号传导的进一步控制。例如，通过经由提供或表达衔接子介导连结，来自拆分的结合触发的转录开关的信号传导，产生了允许从该开关的信号传导的情况。相反地，通过经由提供阻止拆分的结合触发的转录开关的部分的连结的竞争性抑制剂抑制连结，可阻止来自该开关的信号传导。在一些情况下，此类效果是剂量依赖性的，即可基于所提供的衔接子和/或竞争性抑制剂的量进一步控制。
因此，鉴于本文提供的拆分的结合触发的转录开关的描述和单个多肽结合触发的转录开关的描述，普通技术人员将易于理解其中拆分多肽可用于提供对来自此类开关的信号传导和包含此类开关的分子电路的另外的组成型和/或条件性控制。
嵌合NOTCH受体多肽
本公开提供了嵌合Notch受体多肽。本公开的嵌合Notch受体多肽包括：a)包括特异性结合对的第一成员的细胞外结构域；b)Notch受体多肽，其中Notch受体多肽具有50个氨基酸至1000个氨基酸的长度，并且包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域。特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员的结合在一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点处诱导Notch受体多肽的裂解，从而释放细胞内结构域。细胞内结构域的释放调节产生嵌合Notch受体多肽的细胞的活性。细胞外结构域包括特异性结合对的第一成员；特异性结合对的第一成员包括对于Notch受体多肽来说异源性的氨基酸序列。细胞内结构域包括对于Notch受体多肽来说异源性的氨基酸序列。
Notch受体多肽的示意图提供于图1中。图1所示的Notch受体多肽包括：a)细胞外部分，其包括：i)表皮生长因子(EGF)重复序列；ii)配体结合位点；iii)三个Lin-12 Notch重复序列(LNR)，命名为LNR-A、LNR-B和LNR-C；iv)两个异源二聚化结构域(HD-N和HD-C)；b)跨膜(TM)部分；以及c)细胞内部分，其包括：i)RAM结构域；ii)锚蛋白重复序列；iii)转录激活结构域；以及iv)PEST区。Notch受体多肽包含三个蛋白水解位点，称为S1、S2和S3。S1，弗林蛋白酶裂解位点，位于HD-N与HC-C之间；S2，ADAM17裂解位点，位于HD-C内；以及S3，γ分泌酶裂解位点，处于TM部分内。Notch受体多肽介导细胞与细胞通信，例如接触细胞之间的通信，其中一个接触细胞是“接收器”细胞并且另一个接触细胞是“发送器”细胞。存在于发送器细胞上的δ多肽(“配体”)对存在于接收器细胞上的Notch受体多肽的接合导致Notch受体多肽的配体诱导的裂解，从而导致受体的细胞内部分从膜释放到细胞质中。所释放的部分通过起到转录调控子的作用而改变接收器细胞行为。
细胞外结构域
如上文指出，本公开的嵌合Notch受体多肽包括细胞外结构域。细胞外结构域包括特异性结合对的第一成员。特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员结合，其中特异性结合对的第二成员处于与本公开的嵌合Notch受体多肽不同的多肽上。特异性结合对的第二成员与包括包含特异性结合对的第一成员的细胞外结构域的嵌合Notch受体多肽分开(例如，不共价连接)。特异性结合对的第二成员可存在于细胞表面上。特异性结合对的第二成员可固定于不溶性基材上。特异性结合对的第二成员可以是可溶的。特异性结合对的第二成员可存在于细胞外环境(例如细胞外基质)中。特异性结合对的第二成员可存在于人工基质中。特异性结合对的第二成员可存在于非细胞性环境中。
细胞外结构域包括对于Notch受体多肽异源的特异性结合对的第一成员。换句话说，存在于细胞外结构域中的特异性结合对的第一成员且非天然地存在于Notch受体多肽中。
特异性结合对的合适的第一成员包括但不限于基于抗体的识别支架；抗体(即，基于抗体的识别支架，包括抗原结合的抗体片段)；基于非抗体的识别支架；抗原(例如，内源性抗原、外源性抗原等)；受体的配体；受体；基于非抗体的识别支架的靶标；Fc受体(例如，FcγRIIIa、FcγRIIIb等)；细胞外基质组分等。
特异性结合对包括例如，抗原-抗体特异性结合对，其中第一成员为特异性地结合第二成员的抗体(或基于抗体的识别支架)，所述第二成员为抗原，或者其中第一成员为抗原并且第二成员为特异性地结合抗原的抗体(或基于抗体的识别支架)；配体-受体特异性结合对，其中第一成员为配体并且第二成员为配体所结合的受体，或其中第一成员为受体，并且第二成员为受体所结合的配体；基于非抗体的识别支架-靶标特异性结合对，其中第一成员为基于非抗体的识别支架并且第二成员为结合至基于非抗体的识别支架的靶标，或其中第一成员为靶标并且第二成员为结合至靶标的基于非抗体的识别支架；粘附分子-细胞外基质结合对；Fc受体-Fc结合对，其中第一成员包括结合至第二成员的免疫球蛋白Fc，所述第二成员为Fc受体，或其中第一成员为结合至第二成员的Fc受体，所述第二成员包括免疫球蛋白Fc；以及受体-辅助受体结合对，其中第一成员为特异性地结合第二成员的受体，所述第二成员为辅助受体，或其中第一成员为特异性地结合第二成员的辅助受体，所述第二成员为受体。
合适的细胞外结构域的非限制性实例包括例如，钙粘蛋白(CDH1-20)、整联蛋白(α和β同种型)、肝配蛋白、NCAM、连接蛋白、CD44、粘结蛋白聚糖、CD47、DGα/β、SV2、原钙粘着蛋白、Fas、Dectin-1、CD7、CD40、神经调节蛋白、KIR、BTLA、Tim-2、Lag-3、CD19、CTLA4、CD28、TIGIT以及ICOS。
在一些情况下，细胞外结构域包括toll样受体(TLR)。在一些情况下，细胞外结构域包括识别存在于致病性真菌和癌症细胞的表面上的N-聚糖的dectin。参见，例如，Xie(2012)Glycoconj.29:273；以及Brown等人(2007)Protein Sci.16:1042。在一些情况下，细胞外结构域包括识别细菌表面分子的多肽。
在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽的细胞外结构域包含与以下氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：GVLSSPCPPNWIIYEKSCYLFSMSLNSWDGSKRQCWQ LGSNLLKIDSSNELGFIVKQVSSQPDNSFWIGLSRPQTEVPWLWED GSTFSSNLFQIRTTATQENPSPNCVWIHVSVIYDQLCSVPSYSICEK KFSM(SEQ ID NO:3)。
技术人员可基于经遗传修饰以表达本公开的嵌合Notch受体多肽的细胞的期望定位或功能选择细胞外结构域。例如，细胞外结构域可使细胞靶向在细胞表面上具有增加的雌激素受体数量的雌激素依赖性乳腺癌细胞，其中特异性结合对的第一成员结合至雌激素受体(特异性结合对的第二成员)。配体/受体相互作用的其他非限制性实例包括CCRI(例如，在类风湿性关节炎和/或多发性硬化症中用于靶向发炎的关节组织或脑)、CCR7、CCR8(例如，靶向淋巴结组织)、CCR6、CCR9、CCRIO(例如，用以靶向肠组织)、CCR4、CCRIO(例如，用于靶向皮肤)、CXCR4(例如，用于大体增强的移行)、HCELL(例如，用于炎症和炎症性病症、骨髓的靶向)、α4β7(例如，用于肠粘膜靶向)、VLA-4/VCAM-I(例如，靶向内皮)。一般来讲，靶向(例如，癌转移)中涉及的任何受体可用作本公开的嵌合Notch受体多肽的细胞外结构域。
基于抗体的识别支架
在一些情况下，特异性结合对的第一成员是抗体。抗体可以是任何基于抗原结合抗体的多肽，其中的广泛多种是本领域中已知的。在一些情况下，抗原结合结构域为单链Fv(scFv)。其他基于抗体的识别结构域(cAb VHH(骆驼科动物抗体可变结构域))和人源化型式、IgNAR VH(鲸鱼抗体可变结构域)和人源化型式、sdAb VH(单结构域抗体可变结构域)和“骆驼源化”抗体可变结构域是适用的。在一些情况下，基于T细胞受体(TCR)的识别结构域诸如单链TCR(scTv，包含VαVβ的单链双结构域TCR)也是适用的。
在本公开的嵌合Notch受体多肽中的特异性结合对的成员为基于抗体的识别支架的情况中，嵌合Notch受体多肽在特异性结合对的第二成员的存在下可被激活，其中特异性结合对的第二成员为结合至基于抗体的识别支架的抗原。
适于包括在本公开的嵌合Notch多肽中的抗体可具有多种抗原结合特异性。
在一些情况下，抗原结合结构域对于癌细胞所表达(所合成)的抗原(即癌细胞相关抗原)中存在的表位是特异性的。癌细胞相关抗原可以是与例如乳腺癌细胞、B细胞淋巴瘤、胰腺癌、霍奇金淋巴瘤细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、间皮瘤、肺癌细胞(例如，小细胞肺癌细胞)、非霍奇金B细胞淋巴瘤(B-NHL)细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、间皮瘤细胞、肺癌细胞(例如，小细胞肺癌细胞)、黑素瘤细胞、慢性淋巴细胞性白血病细胞、急性淋巴细胞性白血病细胞、成神经细胞瘤细胞、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤、结直肠癌细胞等相关联的抗原。癌细胞相关抗原也可通过非癌性细胞表达。
在一些情况下，抗原结合结构域对组织特异性抗原中存在的表位具有特异性。在一些情况下，抗原结合结构域对疾病相关抗原中存在的表位具有特异性。
主题嵌合Notch受体多肽的抗原结合结构域可结合的抗原的非限制性实例包括，例如，CD19、CD20、CD38、CD30、Her2/neu、ERBB2、CA125、MUC-1、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、CD44表面粘附分子、间皮素、癌胚抗原(CEA)、表皮生长因子受体(EGFR)、EGFRvIII、血管内皮生长因子受体-2(VEGFR2)、高分子量-黑素瘤相关抗原(HMW-MAA)、MAGE-A1、IL-13R-a2、GD2等。
主题嵌合Notch受体多肽的抗原结合结构域可结合的抗原的非限制性实例包括例如，钙粘蛋白(CDH1-20)、整联蛋白(α和β同种型)、肝配蛋白、NCAM、连接蛋白、CD44、粘结蛋白聚糖、CD47、DGα/β、SV2、原钙粘着蛋白、Fas、Dectin-1、CD7、CD40、神经调节蛋白、KIR、BTLA、Tim-2、Lag-3、CD19、CTLA4、CD28、TIGIT以及ICOS。
在一些情况下，抗体对细胞因子具有特异性。在一些情况下，抗体对细胞因子受体具有特异性。在一些情况下，抗体对生长因子具有特异性。在一些情况下，抗体对生长因子受体具有特异性。在一些情况下，抗体对细胞表面受体具有特异性。
在一些情况下，抗体对细胞表面靶标具有特异性，其中细胞表面靶标的非限制性实例包括CD19、CD30、Her2、CD22、ENPP3、EGFR、CD20、CD52、CD 11a以及α-整联蛋白。
在一些情况下，基于抗体的支架所结合的抗原(特异性结合对的第二成员)是可溶的。在一些情况下，抗原是膜结合的，例如，在一些情况下，抗原存在于细胞表面上。在一些情况下，抗原固定在不溶性支持体上，其中不溶性支持体可包括多种材料(例如，聚乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚碳酸酯、硝基纤维素等)中的任一种；并且其中不溶性支持体可采取多种形式，例如平板、组织培养皿、柱等。在一些情况下，抗原存在于细胞外基质(ECM)中(例如，抗原为ECM组分)。在一些情况下，抗原存在于人工基质中。在一些情况下，抗原存在于非细胞性环境中。
基于非抗体的识别支架
在一些情况下，特异性结合对的第一成员是基于非抗体的识别支架。在本公开的嵌合Notch受体多肽中的特异性结合对的成员为基于非抗体的识别支架的情况中，嵌合Notch受体多肽在特异性结合对的第二成员的存在下可被激活，其中特异性结合对的第二成员为结合至基于非抗体的识别支架的靶标。
基于非抗体的识别支架包括例如，亲和体；工程化Kunitz结构域；单抗体(adnectin)；anticalin；设计的锚蛋白重复结构域(DARPin)；富含半胱氨酸的多肽的结合位点(例如，富含半胱氨酸的结肽(knottin peptide))；avimer；afflin等。参见，例如，Gebauer和Skerra(2009)Curr.Opin.Chem.Biol.13:245。
基于非抗体的支架(本文也称为“抗体模拟分子”)可通过从具有人工多样化的结合位点的结合分子的文库中选择或分离靶结合变体进行鉴定。多样化文库可使用完全随机方法(例如，易错聚合酶链式反应(PCR)、外显子改组或定向进化)生成或通过本领域认识到的设计策略辅助。例如，可通过在编码结合位点的核酸内相应的位置处插入简并密码子、三核苷酸、随机肽或整个环来随机化当结合位点与其同源靶分子相互作用时通常涉及的氨基酸位置(参见例如，美国公布No.20040132028)。氨基酸位置的定位可通过具有靶分子的蛋白质实体中的结合位点的晶体结构的研究而鉴定。随机化的候选位置包括环、平坦表面、螺旋和结合位点的结合腔。在某些实施方案中，可通过它们与免疫球蛋白折叠的同源性鉴定结合位点内的氨基酸，其可能是多样化的候选者。例如，可将纤连蛋白的CDR样环内的残基随机化以生成纤连蛋白结合分子的文库(参考，例如，Koide等人,J.Mol.Biol.,284:1141-1151(1998))。可被随机化的结合位点的其他部分包括平坦表面。在随机化之后，可接着使多样化文库进行选择或筛选程序，以获得具有期望的结合特征的结合分子。例如，可通过本领域认识到的方法诸如噬菌体展示、酵母展示或核糖体展示实现选择。
例如，在一些情况下，基于非抗体的支架包括来自纤连蛋白结合分子的结合位点。纤连蛋白结合分子(例如，包括纤连蛋白I型、II型或III型结构域的分子)展示CDR样环，与免疫球蛋白相比，其不依赖于链内二硫键。FnIII环包括可经受随机突变以及靶标结合、选择和进一步突变的多轮重复的定向进化方案，以便开发出可用的治疗工具的区域。可开发出基于纤连蛋白的“可编址的”治疗结合分子(“FATBIM”)，以特异性地结合靶抗原或表位。用于制备纤连蛋白结合多肽的方法描述于例如WO 01/64942和美国专利No.6,673,901、6,703,199、7,078,490和7,119,171中。
作为另一实例，在一些情况下，基于非抗体的支架包括来自亲和体的结合位点。亲和体衍生自葡萄球菌蛋白A(SPA)的免疫球蛋白结合结构域(参见例如，Nord等人,Nat.Biotechnol.,15:772-777(1997))。亲和体为具有结合特定靶标的独特结合位点的抗体模拟物。亲和体可以是小的(例如，由具有58个氨基酸的三个α螺旋组成并且具有约6kDa的摩尔质量)、具有惰性形式(没有Fc功能)，并且已经作为靶向部分在人体中成功测试。可通过诱变衍生自SPA的结构域(例如结构域B)的SPA相关蛋白(例如蛋白质Z)并且选择对靶抗原或表位具有结合亲和力的突变型SPA相关多肽来合成亲和体结合位点。用于制备亲和体结合位点的其他方法描述于美国专利No.6,740,734和6,602,977以及WO 00/63243中。
作为另一实例，在一些情况下，基于非抗体的支架包括来自anticalin的结合位点。Anticalin是衍生自人脂质运载蛋白的抗体功能性模拟物。脂质运载蛋白是结合和运输小的疏水分子诸如类固醇、后胆色素类(bilins)、类视色素和脂质的天然存在的结合蛋白的家族。Anticalin的主要结构类似于野生型脂质运载蛋白。此蛋白构造的中心元件是八个反平行链的β-桶结构，在其开口端支撑着四个环。这些环形成脂质运载蛋白的天然结合位点并且可通过广泛的氨基酸替换在体外再成形，从而产生新型结合特异性。Anticalin对它们的配体具有高亲和力和特异性以及快速结合动力学，由此使得它们的功能特性类似于抗体的那些。Anticalin描述于例如美国专利No.7,723,476中。
作为另一实例，在一些情况下，基于非抗体的支架包括来自富含半胱氨酸的多肽的结合位点。富含半胱氨酸的结构域在一些情况下不形成α螺旋、β-片层或β-桶结构。在一些情况下，二硫键促进结构域折叠成三维结构。在一些情况下，富含半胱氨酸的结构域具有至少两个二硫键，例如至少三个二硫键。示例性的富含半胱氨酸的多肽为A结构域蛋白。A结构域(有时称为“补体型重复序列”)包含约30-50或30-65个氨基酸。在一些情况下，所述结构域包括约35-45个氨基酸并且在一些情况下约40个氨基酸。在30-50个氨基酸内，存在约6个半胱氨酸残基。在六个半胱氨酸中，二硫键通常存在于以下半胱氨酸之间：C1与C3、C2与C5、C4与C6。A结构域构成配体结合部分。所述结构域的半胱氨酸残基以二硫键连接以形成紧凑的、稳定的功能独立的部分。这些重复序列的簇构成配体结合结构域，并且有差别的集簇可赋予关于配体结合的特异性。包含A结构域的示例性蛋白包括例如补体组分(例如，C6、C7、C8、C9和因子I)、丝氨酸蛋白酶(例如，肠肽酶、蛋白裂解酶和丝氨酸肽酶(corin))、跨膜蛋白(例如，ST7、LRP3、LRP5和LRP6)以及内吞受体(例如，分拣蛋白相关受体、LDL-受体、VLDLR、LRP1、LRP2和ApoER2)。用于制备具有期望结合特异性的A结构域蛋白的方法公开于例如WO 02/088171和WO 04/044011中。
作为另一实例，在一些情况下，基于非抗体的支架包括来自重复蛋白的结合位点。重复蛋白是包含堆叠在一起以形成连续结构域的小的(例如，约20至约40个氨基酸残基)结构单元或重复序列的连续拷贝的蛋白质。可通过调节蛋白质中重复序列的数量来修饰重复蛋白以适应特定靶结合位点。示例性的重复蛋白包括经过设计的锚蛋白重复蛋白(即，DARPin)(参见例如，Binz等人，Nat.Biotechnol.,22:575-582(2004))或富含亮氨酸的重复蛋白(即，LRRP)(参见例如Pancer等人,Nature,430:174-180(2004))。作为另一实例，在一些情况下，基于非抗体的支架包括DARPin。
如本文所用，术语“DARPin”是指通常表现出高特异性和高亲和力靶蛋白结合的基因工程化的抗体模拟蛋白。DARPin首先衍生自天然锚蛋白。在一些情况下，DARPin包括锚蛋白的三个、四个或五个重复基序。在一些情况下，锚蛋白重复序列的单元由30-34个氨基酸残基组成并且用于介导蛋白质-蛋白质相互作用。在一些情况下，每个锚蛋白重复序列表现出螺旋-转角-螺旋构象，并且此类串联重复的串堆积在近似线性的阵列中，以形成由相对柔性环连接的螺旋-转角-螺旋束。在一些情况下，通过重复序列内和重复序列间的疏水和氢键合相互作用使锚蛋白重复蛋白的总体结构稳定。锚蛋白重复序列的重复和伸长性质为锚蛋白重复蛋白在蛋白质稳定性、折叠和展开、以及结合特异性方面的独特特征提供了分子基础。DARPin结构域的分子质量可为对于四个重复DARPin的约14kDa或对于五个重复DARPin的约18kDa。DARPin描述于例如美国专利No.7,417,130中。在一些情况下，锚蛋白重复单元的三级结构共享由以下构成的特征：β-发夹，接着两个反平行α-螺旋且以将重复单元与下一个重复单元连接的环结尾。锚蛋白重复单元的结构域构建可通过将重复单元堆叠成延长且弯曲的结构而形成。来自海七鳃鳗(sea lamprey)和其它无颔鱼的适应性免疫系统的部分的LRRP结合位点类似于抗体，因为它们是通过一套富含亮氨酸的重复基因在淋巴细胞成熟过程中的重组形成的。用于制备DARpin或LRRP结合位点的方法描述于WO 02/20565和WO 06/083275中。
作为另一实例，在一些情况下，基于非抗体的支架包括衍生自Src同源结构域(例如SH2或SH3结构域)、PDZ结构域、β-内酰胺酶、高亲和力蛋白酶抑制剂或小的二硫化物结合蛋白支架诸如蝎毒素的结合位点。用于制备衍生自这些分子的结合位点的方法在本领域中已有公开，参见例如Panni等人,J.Biol.Chem.,277:21666-21674(2002)；Schneider等人,Nat.Biotechnol.,17:170-175(1999)；Legendre等人,Protein Sci.,11:1506-1518(2002)；Stoop等人,Nat.Biotechnol.,21:1063-1068(2003)；以及Vita等人,PNAS,92:6404-6408(1995)。而其他结合位点可衍生自选自由以下各项组成的组的结合结构域：EGF样结构域、三环结构域、PAN结构域、Gla结构域、SRCR结构域、Kunitz/牛胰腺胰蛋白酶抑制剂结构域、Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域、Trefoil(P型)结构域、血管性血友病因子C型结构域、过敏毒素样结构域、CUB结构域、甲状腺球蛋白I型重复序列、LDL受体A类结构域、Sushi结构域、Link结构域、血小板反应蛋白I型结构域、免疫球蛋白样结构域、C型凝集素结构域、MAM结构域、血管性血友病因子A型结构域、生长调节素B结构域、WAP型四-二硫键核心结构域、F5/8C型结构域、血红素结合蛋白结构域、层粘连蛋白型EGF样结构域、C2结构域、衍生自其单体或三聚体形式的四连接素的结合结构域，和本领域的那些技术人员已知的其他此类结构域，以及其衍生物和/或变体。示例性的基于非抗体的支架及其制备方法还可见于Stemmer等人,"Protein scaffolds and uses thereof"；美国专利公布No.20060234299(2006年10月19日)和Hey等人,Artificial,Non-Antibody Binding Proteins forPharmaceutical and Industrial Applications,TRENDS in Biotechnology,第23卷,第10号,表2和第514-522页(2005年10月)中。
作为另一实例，在一些情况下，基于非抗体的支架包括Kunitz结构域。如本文所用的术语“Kunitz结构域”是指抑制某些蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶的保守蛋白结构域。Kunitz结构域相对小，通常长约50至60个氨基酸且具有约6kDa的分子量。Kunitz结构域通常携带碱性电荷并且其特征在于促成折叠肽的紧凑和稳定性质的两个、四个、六个或八个或更多个所述形式的二硫键的布置。例如，许多Kunitz结构域具有形成三个二硫键的六个保守的半胱氨酸残基。Kunitz结构域的富含二硫化物的α/β折叠可包括两个、三个(通常)或四个或更多个二硫键。
Kunitz结构域具有梨形结构，其使例如三个二硫键稳定化并且包含特征为处于严格确认的主要决定簇P1残基的反应性位点区域。这些抑制剂通过将P1残基插入活性位点裂缝中而竞争性地阻止靶蛋白(例如丝氨酸蛋白酶)接近其生理学相关大分子底物。蛋白酶抑制环中的P1残基提供主要特异性决定簇并且决定特定Kunitz蛋白对靶蛋白酶具有多少抑制活性。一般来讲，反应性位点(P)的N末端侧就能量而言比P'的C末端侧更重要。在大多数情况下，赖氨酸或精氨酸占据P1位，以抑制在蛋白质底物中的那些残基附近裂解的蛋白酶。其他残基，尤其是抑制剂环区域中的那些，促进结合的强度。一般来讲，靶蛋白中的约10-12个氨基酸残基和蛋白酶中的20-25个残基在稳定的蛋白酶-抑制剂蛋白实体的形成中直接接触并且提供约600至900A的内埋面积。通过修饰P位点中的残基和周围残基，可将Kunitz结构域设计成靶向所选蛋白质。Kunitz结构域描述于例如美国专利No.6,057,287中。
作为另一实例，在一些情况下，基于非抗体的支架为affilin。Affilin是设计用于对蛋白质和小化合物具有特定亲和力的小抗体模拟蛋白。可从两个文库中非常快速地选择新的affilin，所述文库中的每一个基于不同的人源支架蛋白。Affilin不显示出与免疫球蛋白的任何结构同源性。存在两种常用的affilin支架，其中的一种是γ晶体，一种人结构性眼晶状体蛋白，另一种是“泛素”超家族蛋白。两种人支架都非常小，显示出高温稳定性并几乎抗pH变化和变性剂。这种高稳定性主要是由于所述蛋白质的扩展的β折叠结构。γ晶体衍生的蛋白质的实例描述于WO200104144中，并且“泛素样”蛋白质的实例描述于WO2004106368中。
作为另一实例，在一些情况下，基于非抗体的支架为Avimer。Avimer通过体外外显子改组和噬菌体展示，从而生成具有结合和抑制特性的多结构域蛋白而由人细胞外受体结构域的大家族进化而来。连接多个独立的结合结构域已经显示出产生亲合力并且导致与常规单表位结合蛋白相比改善的亲和力和特异性。在某些实施方案中，Avimer由通过间隔区肽连接的各自具有30至35个氨基酸的两个或更多个肽序列组成。各个序列衍生自各种膜受体的A结构域并且具有通过二硫键和钙稳定的刚性结构。每个A结构域可结合至靶蛋白的某一表位。与相同蛋白的不同表位结合的结构域的组合增大了与该蛋白的亲和力，一种已知为亲合力的效应(故此命名)。已获得针对多种靶标的具有亚纳摩尔亲和力的Avimer。可选地，所述结构域可针对不同靶蛋白上的表位。关于Avimer的另外的信息可见于美国专利申请公布No.2006/0286603、2006/0234299、2006/0223114、2006/0177831、2006/0008844、2005/0221384、2005/0164301、2005/0089932、2005/0053973、2005/0048512、2004/0175756中。
基于非抗体的支架的合适的靶标包括基于抗体的支架可结合的上文提及的抗原中的任一种。
在一些情况下，基于非抗体的支架所结合的靶标(特异性结合对的第二成员)是可溶的。在一些情况下，靶标是膜结合的，例如，在一些情况下，靶标存在于细胞表面上。在一些情况下，靶标固定在不溶性支持体上，其中不溶性支持体可包括多种材料(例如，聚乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚碳酸酯、硝基纤维素等)中的任一种；并且其中不溶性支持体可采取多种形式，例如平板、组织培养皿、柱等。在一些情况下，靶标存在于细胞外基质(ECM)中(例如，抗原为ECM组分)。在一些情况下，靶标存在于人工基质中。在一些情况下，靶标存在于非细胞性环境中。
细胞粘附分子
在一些情况下，特异性结合对的第一成员是细胞粘附分子(CAM)，即，结合细胞外基质(ECM)的组分或结合细胞表面分子的多肽。例如，在一些情况下，特异性结合对的第一成员是CAM的细胞外区域。在一些情况下，CAM是不依赖钙的粘附分子，例如，在一些情况下，CAM是免疫球蛋白超级族CAM。在一些情况下，CAM是钙依赖性粘附分子，例如，CAM是整联蛋白、钙粘蛋白或选择素。在一些情况下，特异性结合对的第一成员为整联蛋白。在一些情况下，特异性结合对的第一成员为钙粘蛋白，例如E-钙粘蛋白、P-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白、R-钙粘蛋白、M-钙粘蛋白等。在一些情况下，特异性结合对的第一成员为选择素，例如E-选择素、L-选择素或P-选择素。CAM的结合片段可用作特异性结合对的第一成员。
在特异性结合对的第一成员为CAM的情况下，特异性结合对的第二成员为ECM的组分或结合CAM的细胞表面分子。例如，在特异性结合对的第一成员为整联蛋白的情况下，特异性结合对的第二成员为胶原蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白或玻连蛋白的组分。作为另一实例，在特异性结合对的第一成员为钙粘蛋白的情况下，特异性结合对的第二成员为钙粘蛋白所结合的细胞表面抗原。作为另一实例，在特异性结合对的第一成员为选择素的情况下，特异性结合对的第二成员为岩藻糖基化的碳水化合物。
配体
在一些情况下，特异性结合对的第一成员是受体的配体。配体包括多肽、核酸、糖蛋白、小分子、碳水化合物、脂质、糖脂、脂蛋白、脂多糖等。在一些情况下，配体是可溶的。
配体包括但不限于细胞因子(例如，IL-13等)；生长因子(例如，heregulin；血管内皮生长因子(VEGF)；等)；肽激素；整联蛋白结合肽(例如，包括序列Arg-Gly-Asp的肽)；N-聚糖；等等。
在本公开的嵌合Notch受体多肽中的特异性结合对的成员为配体的情况中，嵌合Notch受体多肽在特异性结合对的第二成员的存在下可被激活，其中特异性结合对的第二成员为配体的受体。例如，在配体为VEGF的情况中，特异性结合对的第二成员可以是VEGF受体，包括可溶性VEGF受体。可选地，特异性结合对的第一成员可以是VEGF受体，并且特异性结合对的第一成员可以是VEGF。作为另一实例，在配体为heregulin的情况中，特异性结合对的第二成员可以是Her2。
在特异性结合对的第一成员为配体的情况中，特异性结合对的第二成员为结合配体的分子，例如，特异性结合对的第二成员为特异性结合配体的抗体、配体的受体等。
在特异性结合对的第一成员为配体的情况中，在一些情况下，特异性结合对的第二成员(结合配体的分子)是可溶的。在一些情况下，特异性结合对的第二成员是膜结合的，例如在一些情况下，特异性结合对的第二成员存在于细胞表面上。在一些情况下，特异性结合对的第二成员固定在不溶性支持体上，其中不溶性支持体可包括多种材料(例如，聚乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚碳酸酯、硝基纤维素等)中的任一种；并且其中不溶性支持体可采取多种形式，例如平板、组织培养皿、柱等。在一些情况下，特异性结合对的第二成员存在于非细胞性环境中。
抗原
在一些情况下，特异性结合对的第一成员为抗体特异性结合的抗原。抗原可以是抗原，例如，天然存在的(内源性)抗原；合成(例如，以其与天然存在的抗原不再相同的方式修饰的；由其天然状态改变的；等等)抗原等。
在本公开的嵌合Notch受体多肽中的特异性结合对的成员为抗原的情况中，嵌合Notch受体多肽在特异性结合对的第二成员的存在下可被激活，其中特异性结合对的第二成员为与抗原结合的抗体(基于抗体的识别支架)。
在一些情况下，抗原为疾病相关抗原，例如，癌症相关抗原、自身免疫疾病相关抗原、病原体相关抗原、炎症相关抗原等。
例如，在特异性结合对的第二成员为对癌症相关抗原具有特异性的抗体的情况中，抗原可以是癌症相关抗原，其中癌症相关抗原包括，例如，CD19、CD20、CD38、CD30、Her2/neu、ERBB2、CA125、MUC-1、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、CD44表面粘附分子、间皮素、癌胚抗原(CEA)、表皮生长因子受体(EGFR)、EGFRvIII、血管内皮生长因子受体-2(VEGFR2)、高分子量-黑素瘤相关抗原(HMW-MAA)、MAGE-A1、IL-13R-a2、GD2等。癌症相关抗原还包括，例如，4-1BB、5T4、腺癌抗原、α-胎蛋白、BAFF、B-淋巴瘤细胞、C242抗原、CA-125、碳酸酐酶9(CA-IX)、C-MET、CCR4、CD152、CD19、CD20、CD200、CD22、CD221、CD23(IgE受体)、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD33、CD4、CD40、CD44 v6、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CEA、CNTO888、CTLA-4、DRS、EGFR、EpCAM、CD3、FAP、纤连蛋白外结构域-B、叶酸受体1、GD2、GD3神经节苷脂、糖蛋白75、GPNMB、HER2/neu、HGF、人扩散因子受体激酶、IGF-1受体、IGF-I、IgG1、L1-CAM、IL-13、IL-6、胰岛素样生长因子I受体、整联蛋白α5β1、整联蛋白αvβ3、MORAb-009、MS4A1、MUC1、粘蛋白CanAg、N-乙醇酰神经氨酸、NPC-1C、PDGF-Rα、PDL192、磷脂酰丝氨酸、前列腺癌细胞、RANKL、RON、ROR1、SCH 900105、SDC1、SLAMF7、TAG-72、腱生蛋白C、TGFβ2、TGF-β、TRAIL-R1、TRAIL-R2、肿瘤抗原CTAA16.88、VEGF-A、VEGFR-1、VEGFR2以及波形蛋白。
抗原可以与炎性疾病相关联。与炎性疾病相关联的抗原的非限制性实例包括，例如，AOC3(VAP-1)、CAM-3001、CCL11(嗜酸细胞活化趋化因子-1)、CD125、CD147(basigin)、CD154(CD40L)、CD2、CD20、CD23(IgE受体)、CD25(IL-2受体的α链)、CD3、CD4、CD5、IFN-α、IFN-γ、IgE、IgE Fc区、IL-1、IL-12、IL-23、IL-13、IL-17、IL-17A、IL-22、IL-4、IL-5、IL-5、IL-6、IL-6受体、整联蛋白α4、整联蛋白α4β7、LFA-1(CD11a)、肌生长抑制素、OX-40、硬化蛋白(scleroscin)、SOST、TGFβ1、TNF-α以及VEGF-A。
在特异性结合对的第一成员为抗原的情况中，特异性结合对的第二成员可以是基于抗体的支架(例如抗体)或基于非抗体的支架。在一些情况下，特异性结合对的第二成员存在于细胞的表面上。在一些情况下，特异性结合对的第二成员固定于不溶性支持体上。在一些情况下，特异性结合对的第二成员是可溶的。在一些情况下，特异性结合对的第二成员存在于细胞外环境(例如，细胞外基质)中。在一些情况下，特异性结合对的第二成员存在于人工基质中。在一些情况下，特异性结合对的第二成员存在于非细胞性环境中。
基于非抗体的识别支架的靶标
在一些情况下，特异性结合对的第一成员是基于非抗体的支架的靶标。靶标包括，例如，多肽、核酸、糖蛋白、小分子、碳水化合物、脂质、糖脂、脂蛋白、脂多糖等。
在特异性结合对的第一成员为基于非抗体的支架的靶标的情况中，特异性结合对的第二成员为基于非抗体的支架。
受体
在一些情况下，特异性结合对的第一成员是受体。在一些情况下，受体为生长因子受体。在一些情况下，受体为细胞因子受体。在一些情况下，受体为结合至细胞上的辅助受体的细胞表面受体。在一些情况下，受体为神经递质受体。在一些情况下，受体结合至细胞外基质组分。在一些情况下，受体为免疫球蛋白Fc受体。
合适的受体包括但不限于生长因子受体(例如，VEGF受体)；杀伤细胞凝集素样受体亚家族K，成员1(NKG2D)多肽(MICA、MICB和ULB6的受体)；细胞因子受体(例如，IL-13受体；IL-2受体；等等)；表皮生长因子(EGF)受体；Her2；CD27；天然细胞毒性受体(NCR)(例如，NKP30(NCR3/CD337)多肽(HLA-B相关转录物3(BAT3)和B7-H6的受体)；等等)；T细胞抗原受体；二氢叶酸受体；嵌合细胞因子受体；Fc受体；细胞外基质受体(例如整联蛋白)；细胞粘附受体(例如钙粘蛋白)；免疫调节受体，包括正辅助受体(例如CD28)和负(免疫抑制)辅助受体(例如PD1)；细胞因子受体；以及免疫调节分子(例如TGFβ)的受体等等。在一些情况下，相对于野生型受体来说，受体是截短的。
在特异性结合对的第一成员为受体的情况中，特异性结合对的第二成员为受体的靶标，其中靶标可以是受体的配体或辅助受体。在一些情况下，特异性结合对的第二成员存在于细胞的表面上。在一些情况下，特异性结合对的第二成员固定于不溶性支持体上。在一些情况下，特异性结合对的第二成员是可溶的。在一些情况下，特异性结合对的第二成员存在于细胞外环境(例如，细胞外基质)中。在一些情况下，特异性结合对的第二成员存在于人工基质中。在一些情况下，特异性结合对的第二成员存在于非细胞性环境中。
Notch受体多肽
如上所述，本公开的嵌合Notch受体多肽包括具有50个氨基酸至1000个氨基酸的长度并且包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点的Notch受体多肽。
在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽中存在的Notch受体多肽具有50个氨基酸(aa)至1000aa，例如50aa至75aa、75aa至100aa、100aa至150aa、150aa至200aa、200aa至250aa、250a至300aa、300aa至350aa、350aa至400aa、400aa至450aa、450aa至500aa、500aa至550aa、550aa至600aa、600aa至650aa、650aa至700aa、700aa至750aa、750aa至800aa、800aa至850aa、850aa至900aa、900aa至950aa或950aa至1000aa的长度。在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽中存在的Notch受体多肽具有300aa至400aa的长度。在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽中存在的Notch受体多肽具有300aa至350aa的长度。在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽中存在的Notch受体多肽具有300aa至325aa的长度。在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽中存在的Notch受体多肽具有350aa至400aa的长度。在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽中存在的Notch受体多肽具有750aa至850aa的长度。在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽中存在的Notch受体多肽具有50aa至75aa的长度。在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽中存在的Notch受体多肽具有310aa至320aa，例如，310aa、311aa、312aa、313aa、314aa、315aa、316aa、317aa、318aa、319aa或320aa的长度。在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽中存在的Notch受体多肽具有315aa的长度。在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽中存在的Notch受体多肽具有360aa至370aa，例如，360aa、361aa、362aa、363aa、364aa、365aa、366aa、367aa、368aa、369aa或370aa的长度。在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽中存在的Notch受体多肽具有367aa的长度。
包括TM结构域的Notch受体多肽
在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽中存在的Notch受体多肽包含与以下氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：IPYKIEAVKSEPVEPPLPSQLHLMYVAAAAFVLLFFVGCG VLLSRKRRRQLCIQKL(SEQ ID NO:4)；其中TM结构域加下划线；其中Notch受体多肽包含S2蛋白水解裂解位点和S3蛋白水解裂解位点；其中Notch受体多肽具有50个氨基酸(aa)至65aa，例如50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64或65aa的长度。在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽中存在的Notch受体多肽包含与以下氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：IPYKIEAVKSEPVEPPLPSQLHLMYVAAAAFVLLFFVGCGVLLSRKRRRQLCIQKL(SEQ IDNO:4)；其中TM结构域加下划线；其中Notch受体多肽包含S2蛋白水解裂解位点和S3蛋白水解裂解位点；其中Notch受体多肽具有56个氨基酸的长度。
包括LNR区段、HD-N区段、HD-C区段以及TM结构域的Notch受体多肽
在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽中存在的Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：i)LNR-A区段；ii)LNR-B区段；iii)LNR-C区段；iv)HD-N区段；v)HD-C区段；以及vi)TM结构域。LNR-A区段、LNR-B区段和LNR-C区段可统称为“LNR区段”。这一Notch受体多肽示意性地示出于图4A中。
LNR区段可包含与图2A所示的氨基酸序列的氨基酸1442-1562或另一Notch受体多肽的对应区段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应区段的实例示出于图2B-2G中；并且可具有90个氨基酸至150个氨基酸，例如，90个氨基酸(aa)至100aa、100aa至110aa、110aa至120aa、120aa至130aa、130aa至140aa或140aa至150aa的长度。在一些情况下，LNR区段包含与图2A所示的氨基酸序列的氨基酸1442-1562或另一Notch受体多肽的对应区段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应区段的实例示出于图2B-2G中；并且具有115aa至125aa，例如，115、116、117、118、119、120、121、122、123、124或125aa的长度。
LNR区段可包含与以下氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：PPQIEEACELPECQVDAGNKVCNLQCNNHACGWDGGDCSLNFNDPWKNCTQSLQCWKYFSDGHCDSQCNSAGCLFDGFDCQLTEGQCNPLYDQYCKDHFSDGHCDQGCNSA ECEWDGLDC(SEQ ID NO:5)；并且可具有118至122个氨基酸(例如，118、119、120、121或122个氨基酸)的长度。
HD-N区段可包含与图2A所示的氨基酸序列的氨基酸1563-1664或另一Notch受体多肽的对应区段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应区段的实例示出于图2B-2G中；并且可具有90个氨基酸(aa)至110aa，例如90aa至95aa、95aa至100aa、100aa至105aa或105aa至110aa的长度。在一些情况下，HD-N区段包含与图2A所示的氨基酸序列的氨基酸1563-1664或另一Notch受体多肽的对应区段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应区段的实例示出于图2B-2G中；并且具有95aa至105aa，例如，95、96、98、98、99、100、101、102、103、104或105aa的长度。
HD-C区段可包含与图2A所示的氨基酸序列的氨基酸1665-1733或另一Notch受体多肽的对应区段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应区段的实例示出于图2B-2G中；并且可具有60个氨基酸(aa)至80aa，例如60aa至65aa、65aa至70aa、70aa至75aa或75aa至80aa的长度。在一些情况下，HD-C区段包含与图2A所示的氨基酸序列的氨基酸1665-1733或另一Notch受体多肽的对应区段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应区段的实例示出于图2B-2G中；并且具有65个氨基酸至75个氨基酸，例如，65、66、67、68、69、70、71、72、73、74或75个氨基酸的长度。
HD区段(HD-N加HD-C)可包含与以下氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：AAGTLVLVVLLPPDQLRNNSFHFLRELSHVLHTNVVFKRDAQGQQMIFPYYGHEEELRKHPIKRSTVGWATSSLLPGTSGGRQRRELDPMDIRGSIVYLEIDNRQCVQSSSQCFQSATDVAAFLGALASLGSLNIPYKIEAVKSEPVEPPLP(SEQ ID NO:6)；并且可具有150、151、152、153或154个氨基酸的长度。
跨膜区段包含与图2A所示的氨基酸序列的氨基酸1736至1756或另一Notch受体多肽的对应区段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应区段的实例示出于图2B-2G中；并且可具有15个氨基酸(aa)至25个氨基酸，例如，15、16、17、18、29、20、21、22、23、24或25个氨基酸的长度。
跨膜区段可包含与以下氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：HLMYVAAAAFVLLFFVGCGVLLS(SEQ ID NO:7)；并且可具有21、22、23、24或25个氨基酸的长度。
在一些情况下，Notch受体多肽具有约310个氨基酸(aa)至约320aa(例如，310aa、311aa、312aa、313aa、314aa、315aa、316aa、317aa、318aa、319aa或320aa)的长度，并且包含与图2A所示的氨基酸序列的氨基酸1442-1756或另一Notch受体多肽的对应区段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应区段的实例示出于图2B-2G中。
在一些情况下，Notch受体多肽包含与以下氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：PPQIEEACELPECQVDAGNKVCNLQCNNHACGWDGGDCSLNFNDPWKNCTQSLQCWKYFSDGHCDSQCNSAGCLFDGFDCQLTEGQCNPLYDQYCKDHFSDGHCDQGCNSAECEWDGLDCAEHVPERLAAGTLVLVVLLPPDQLRNNSFHFLRELSHVLHTNVVFKRDAQGQQMIFPYYGHEEELRKHPIKRSTVGWATSSLLPGTSGGRQRRELDPMDIRGSIVYLEIDNRQCVQSSSQCFQSATDVAAFLGALASLGSLNIPYKIEAVKSEPVEPPLPSQLHLMYVAAAAFVLLFFVGCGVLLS(SEQ ID NO:1)；并且具有300个氨基酸至310个氨基酸(例如，300、301、302、303、304、305、306、307、308、309或310个氨基酸)的长度。
在一些情况下，Notch受体多肽包含与以下氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：PCVGSNPCYNQGTCEPTSENPFYRCLCPAKFNGLLCHILDYSFTGGAGRDIPPPQIEEACELPECQVDAGNKVCNLQCNNHACGWDGGDCSLNFNDPWKNCTQSLQCWKYFSDGHCDSQCNSAGCLFDGFDCQLTEGQCNPLYDQYCKDHFSDGHCDQGCNSAECEWDGLDCAEHVPERLAAGTLVLVVLLPPDQLRNNSFHFLRELSHVLHTNVVFKRDAQGQQMIFPYYGHEEELRKHPIKRSTVGWATSSLLPGTSGGRQRRELDPMDIRGSIVYLEIDNRQCVQSSSQCFQSATDVAAFLGALASLGSLNIPYKIEAVKSEPVEPPLPSQLHLMYVAAAAFVLLFFVGCGVLLS(SEQ ID NO:2)；并且具有350个氨基酸至370个氨基酸(例如，350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369或370个氨基酸)的长度。
包括单个EGF重复序列、LNR区段、HD-N区段、HD-C区段以及TM结构域的Notch受体多肽
在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽中存在的Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：i)单个EGF重复序列；ii)LNR区段；iii)HD-N区段；iv)HD-C区段；以及v)TM结构域。这一Notch受体多肽示意性地示出于图4B中。
EGF重复序列可包含与图2A所示的氨基酸序列的氨基酸1390至1430或另一Notch受体多肽的对应区段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应区段的实例示出于图2B-2G中；并且可具有35个氨基酸(aa)至45aa(例如，35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45aa)的长度。
EGF重复序列可包含与以下序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：PCVGSNPCYNQGTCEPTSENPFYRCLC PAKFNGLLCH(SEQ ID NO:8)；并且可具有35个氨基酸至40个氨基酸(例如，35、36、37、38、39或40个氨基酸)的长度。
LNR区段可包含与图2A所示的氨基酸序列的氨基酸1442-1562或另一Notch受体多肽的对应区段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应区段的实例示出于图2B-2G中；并且可具有90个氨基酸至150个氨基酸，例如，90个氨基酸(aa)至100aa、100aa至110aa、110aa至120aa、120aa至130aa、130aa至140aa或140aa至150aa的长度。在一些情况下，LNR区段包含与图2A所示的氨基酸序列的氨基酸1442-1562或另一Notch受体多肽的对应区段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应区段的实例示出于图2B-2G中；并且具有115aa至125aa，例如，115、116、117、118、119、120、121、122、123、124或125aa的长度。
LNR区段可包含与以下氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：PPQIEEACELPECQVDAGNKVCNLQ CNNHACGWDGGDCSLNFNDPWKNCTQSLQCWKYFSDGHCDSQ CNSAGCLFDGFDCQLTEGQCNPLYDQYCKDHFSDGHCDQGCNSA ECEWDGLDC(SEQ ID NO:5)；并且可具有118至122个氨基酸(例如，118、119、120、121或122个氨基酸)的长度。
HD-N区段可包含与图2A所示的氨基酸序列的氨基酸1563-1664或另一Notch受体多肽的对应区段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应区段的实例示出于图2B-2G中；并且可具有90个氨基酸(aa)至110aa，例如90aa至95aa、95aa至100aa、100aa至105aa或105aa至110aa的长度。在一些情况下，HD-N区段包含与图2A所示的氨基酸序列的氨基酸1563-1664或另一Notch受体多肽的对应区段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应区段的实例示出于图2B-2G中；并且具有95aa至105aa，例如，95、96、98、98、99、100、101、102、103、104或105aa的长度。
HD-C区段可包含与图2A所示的氨基酸序列的氨基酸1665-1733或另一Notch受体多肽的对应区段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应区段的实例示出于图2B-2G中；并且可具有60个氨基酸(aa)至80aa，例如60aa至65aa、65aa至70aa、70aa至75aa或75aa至80aa的长度。在一些情况下，HD-C区段包含与图2A所示的氨基酸序列的氨基酸1665-1733或另一Notch受体多肽的对应区段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应区段的实例示出于图2B-2G中；并且具有65个氨基酸至75个氨基酸，例如，65、66、67、68、69、70、71、72、73、74或75个氨基酸的长度。
HD区段(HD-N加HD-C)可包含与以下氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
并且可具有150、151、152、153或154个氨基酸的长度。
跨膜区段包含与图2A所示的氨基酸序列的氨基酸1736至1756或另一Notch受体多肽的对应区段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应区段的实例示出于图2B-2G中；并且可具有15个氨基酸(aa)至25个氨基酸，例如，15、16、17、18、29、20、21、22、23、24或25个氨基酸的长度。
跨膜区段可包含与以下氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
并且可具有21、22、23、24或25个氨基酸的长度。
在一些情况下，Notch受体多肽具有约360个氨基酸(aa)至约375aa(例如，360aa、361aa、362aa、363aa、364aa、365aa、366aa、367aa、368aa、369aa、370aa、371aa、372aa、373aa、374aa或375aa)的长度，并且包含与图2A所示的氨基酸序列的氨基酸1390-1756或另一Notch受体多肽的对应区段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应区段的实例示出于图2B-2G中。
在一些情况下，Notch受体多肽包括合成接头。例如，在一些情况下，Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：i)合成接头；ii)EGF重复序列；iii)LNR区段；iv)HD-N区段；v)HD-C区段；以及vi)TM结构域。这一Notch受体多肽示意性地示出于图4C中。
合成接头可具有约10个氨基酸(aa)至约200aa，例如10aa至25aa、25aa至50aa、50aa至75aa、75aa至100aa、100aa至125aa、125aa至150aa、150aa至175aa或175aa至200aa的长度。合成接头可具有10aa至30aa，例如，10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30aa的长度。合成接头可具有30aa至50aa，例如30aa至35aa、35aa至40aa、40aa至45aa或45aa至50aa的长度。
在一些情况下，如本文所述的合成接头可包括细胞外蛋白结构域或其部分。适用作合成接头的细胞外蛋白结构域包括但不限于例如，Ig样细胞外结构域、Fc细胞外结构域、纤连蛋白细胞外结构域等。在一些情况下，合成接头可包括多个细胞外蛋白结构域，其中所述多个可包括多个相同的结构域或多个不同结构域。
包括2-11个EGF重复序列、LNR区段、HD-N区段、HD-C区段以及TM结构域的Notch受体多肽
在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽中存在的Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：i)2至11个EGF重复序列；ii)LNR区段；iii)HD-N区段；iv)HD-C区段；以及v)TM结构域。这一Notch受体多肽示意性地示出于图4D中。
在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽中存在的Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：i)2个EGF重复序列；ii)LNR区段；iii)HD-N区段；iv)HD-C区段；以及v)TM结构域。在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽中存在的Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：i)3个EGF重复序列；ii)LNR区段；iii)HD-N区段；iv)HD-C区段；以及v)TM结构域。在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽中存在的Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：i)4个EGF重复序列；ii)LNR区段；iii)HD-N区段；iv)HD-C区段；以及v)TM结构域。在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽中存在的Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：i)5个EGF重复序列；ii)LNR区段；iii)HD-N区段；iv)HD-C区段；以及v)TM结构域。在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽中存在的Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：i)6个EGF重复序列；ii)LNR区段；iii)HD-N区段；iv)HD-C区段；以及v)TM结构域。在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽中存在的Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：i)7个EGF重复序列；ii)LNR区段；iii)HD-N区段；iv)HD-C区段；以及v)TM结构域。在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽中存在的Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：i)8个EGF重复序列；ii)LNR区段；iii)HD-N区段；iv)HD-C区段；以及v)TM结构域。在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽中存在的Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：i)9个EGF重复序列；ii)LNR区段；iii)HD-N区段；iv)HD-C区段；以及v)TM结构域。在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽中存在的Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：i)10个EGF重复序列；ii)LNR区段；iii)HD-N区段；iv)HD-C区段；以及v)TM结构域。在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽中存在的Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：i)11个EGF重复序列；ii)LNR区段；iii)HD-N区段；iv)HD-C区段；以及v)TM结构域。
EGF重复序列可包含与图2A所示的氨基酸序列的氨基酸1390至1430或另一Notch受体多肽的对应区段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应区段的实例示出于图2B-2G中；并且可具有35个氨基酸(aa)至45aa(例如，35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45aa)的长度。
EGF重复序列可包含与图2A所示的氨基酸序列的氨基酸869-905(DINECVLSPCRHGASCQNTHGGYRCHCQAGYSGRNCE；SEQ ID NO:9)或另一Notch受体多肽的对应区段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应区段的实例示出于图2B-2G中；并且可具有35个氨基酸至约40个氨基酸(aa)(例如，35、36、37、38、39或40aa)的长度。
EGF重复序列可包含与图2A所示的氨基酸序列的氨基酸907-943(DIDDCRPNPCHNGGSCTDGINTAFCDCLPGFRGTFCE；SEQ ID NO:10)或另一Notch受体多肽的对应区段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应区段的实例示出于图2B-2G中；并且可具有35个氨基酸至约40个氨基酸(aa)(例如，35、36、37、38、39或40aa)的长度。
EGF重复序列可包含与图2A所示的氨基酸序列的氨基酸945-981(DINECASDPCRNGANCTDCVDSYTCTCPAGFSGIHCE；SEQ ID NO:11)或另一Notch受体多肽的对应区段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应区段的实例示出于图2B-2G中；并且可具有35个氨基酸至约40个氨基酸(aa)(例如，35、36、37、38、39或40aa)的长度。
EGF重复序列可包含与图2A所示的氨基酸序列的氨基酸988-1019(TESSCFNGGTCVDGINSFTCLCPPGFTGSYCQ；SEQ ID NO:12)或另一Notch受体多肽的对应区段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应区段的实例示出于图2B-2G中；并且可具有30个氨基酸(aa)至35aa(例如，30、31、32、33、34或35aa)的长度。
EGF重复序列可包含与图2A所示的氨基酸序列的氨基酸1021-1057(DVNECDSQPCLHGGTCQDGCGSYRCTCPQGYTGPNCQ；SEQ ID NO:13)或另一Notch受体多肽的对应区段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应区段的实例示出于图2B-2G中；并且可具有35个氨基酸至约40个氨基酸(aa)(例如，35、36、37、38、39或40aa)的长度。
EGF重复序列可包含与图2A所示的氨基酸序列的氨基酸1064-1090(DSSPCKNGGKCWQTHTQYRCECPSGWT；SEQ ID NO:14)或另一Notch受体多肽的对应区段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应区段的实例示出于图2B-2G中；并且可具有25个氨基酸(aa)至30aa，例如，25、26、27、28、29或30aa的长度。
EGF重复序列可包含与图2A所示的氨基酸序列的氨基酸1146-1180(LVDECSPSPCQNGATCTDYLGGYSCKCVAGYHGVNC；SEQ ID NO:15)或另一Notch受体多肽的对应区段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应区段的实例示出于图2B-2G中；并且可具有35个氨基酸至约40个氨基酸(aa)(例如，35、36、37、38、39或40aa)的长度。
EGF重复序列可包含与图2A所示的氨基酸序列的氨基酸1184-1219(IDECLSHPCQNGGTCLDLPNTYKCSCPRGTQGVHCE；SEQ ID NO:16)或另一Notch受体多肽的对应区段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应区段的实例示出于图2B-2G中；并且可具有35个氨基酸至约40个氨基酸(aa)(例如，35、36、37、38、39或40aa)的长度。
EGF重复序列可包含与图2A所示的氨基酸序列的氨基酸1238-1265(CFNNGTCVDQVGGYSCTCPPGFVGERCE；SEQ ID NO:17)或另一Notch受体多肽的对应区段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应区段的实例示出于图2B-2G中；并且可具有25个氨基酸(aa)至30aa，例如，25、26、27、28、29或30aa的长度。
EGF重复序列可包含与图2A所示的氨基酸序列的氨基酸1267-1305(DVNECLSNPCDARGTQNCVQRVNDFHCECRAGHTGR RCE；SEQ ID NO:18)或另一Notch受体多肽的对应区段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应区段的实例示出于图2B-2G中；并且可具有35个氨基酸至约40个氨基酸(aa)(例如，35、36、37、38、39或40aa)的长度。
EGF重复序列可包含与以下序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：PCVGSNPCYNQGTCEPTSENPFYRCLC PAKFNGLLCH(SEQ ID NO:8)；并且可具有35个氨基酸至40个氨基酸(例如，35、36、37、38、39或40个氨基酸)的长度。
LNR区段可包含与图2A所示的氨基酸序列的氨基酸1442-1562或另一Notch受体多肽的对应区段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应区段的实例示出于图2B-2G中；并且可具有90个氨基酸至150个氨基酸，例如，90个氨基酸(aa)至100aa、100aa至110aa、110aa至120aa、120aa至130aa、130aa至140aa或140aa至150aa的长度。在一些情况下，LNR区段包含与图2A所示的氨基酸序列的氨基酸1442-1562或另一Notch受体多肽的对应区段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应区段的实例示出于图2B-2G中；并且具有115aa至125aa，例如，115、116、117、118、119、120、121、122、123、124或125aa的长度。
LNR区段可包含与以下氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：PPQIEEACELPECQVDAGNKVCNLQ CNNHACGWDGGDCSLNFNDPWKNCTQSLQCWKYFSDGHCDSQ CNSAGCLFDGFDCQLTEGQCNPLYDQYCKDHFSDGHCDQGCNSA ECEWDGLDC(SEQ ID NO:5)；并且可具有118至122个氨基酸(例如，118、119、120、121或122个氨基酸)的长度。
HD-N区段可包含与图2A所示的氨基酸序列的氨基酸1563-1664或另一Notch受体多肽的对应区段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应区段的实例示出于图2B-2G中；并且可具有90个氨基酸(aa)至110aa，例如90aa至95aa、95aa至100aa、100aa至105aa或105aa至110aa的长度。在一些情况下，HD-N区段包含与图2A所示的氨基酸序列的氨基酸1563-1664或另一Notch受体多肽的对应区段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应区段的实例示出于图2B-2G中；并且具有95aa至105aa，例如，95、96、98、98、99、100、101、102、103、104或105aa的长度。
HD-C区段可包含与图2A所示的氨基酸序列的氨基酸1665-1733或另一Notch受体多肽的对应区段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应区段的实例示出于图2B-2G中；并且可具有60个氨基酸(aa)至80aa，例如60aa至65aa、65aa至70aa、70aa至75aa或75aa至80aa的长度。在一些情况下，HD-C区段包含与图2A所示的氨基酸序列的氨基酸1665-1733或另一Notch受体多肽的对应区段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应区段的实例示出于图2B-2G中；并且具有65个氨基酸至75个氨基酸，例如，65、66、67、68、69、70、71、72、73、74或75个氨基酸的长度。
HD区段(HD-N加HD-C)可包含与以下氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
并且可具有150、151、152、153或154个氨基酸的长度。
跨膜区段包含与图2A所示的氨基酸序列的氨基酸1736至1756或另一Notch受体多肽的对应区段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应区段的实例示出于图2B-2G中；并且可具有15个氨基酸(aa)至25个氨基酸，例如，15、16、17、18、29、20、21、22、23、24或25个氨基酸的长度。
跨膜区段可包含与以下氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：HLMYVAAAAFVLLFFVGCGVLLS(SEQ ID NO:7)；并且可具有21、22、23、24或25个氨基酸的长度。
在一些情况下，Notch受体多肽具有约490个氨基酸(aa)至约900aa的长度，并且包含与图2A所示的氨基酸序列的i)氨基酸1267-1756；ii)1238-1756；iii)1184-1756；iv)1146-1756；v)1064-1756；vi)1021-1756；vii)988-1756；viii)945-1756；ix)907-1756；或x)869-1756，或另一Notch受体多肽的对应区段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应区段的实例示出于图2B-2G中。
在一些情况下，Notch受体多肽包括合成接头。例如，在一些情况下，Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：i)2至11个EGF重复序列；ii)合成接头；iii)LNR区段；iv)HD-N区段；v)HD-C区段；以及vi)TM结构域。这一Notch受体多肽示意性地示出于图4E中。
合成接头可具有约10个氨基酸(aa)至约200aa，例如10aa至25aa、25aa至50aa、50aa至75aa、75aa至100aa、100aa至125aa、125aa至150aa、150aa至175aa或175aa至200aa的长度。合成接头可具有10aa至30aa，例如，10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30aa的长度。合成接头可具有30aa至50aa，例如30aa至35aa、35aa至40aa、40aa至45aa或45aa至50aa的长度。
包括HD-C区段和TM结构域的Notch受体多肽
在一些情况下，Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：i)HD-C区段；以及ii)TM结构域，其中Notch受体多肽不包括LNR区段。在一些情况下，LNR区段替换为异源多肽。这一Notch受体多肽示意性地示出于图4F中。
HD-C区段可包含与图2A所示的氨基酸序列的氨基酸1665-1733或另一Notch受体多肽的对应区段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应区段的实例示出于图2B-2G中；并且可具有60个氨基酸(aa)至80aa，例如60aa至65aa、65aa至70aa、70aa至75aa或75aa至80aa的长度。在一些情况下，HD-C区段包含与图2A所示的氨基酸序列的氨基酸1665-1733或另一Notch受体多肽的对应区段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应区段的实例示出于图2B-2G中；并且具有65个氨基酸至75个氨基酸，例如，65、66、67、68、69、70、71、72、73、74或75个氨基酸的长度。
跨膜区段包含与图2A所示的氨基酸序列的氨基酸1736至1756或另一Notch受体多肽的对应区段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应区段的实例示出于图2B-2G中；并且可具有15个氨基酸(aa)至25个氨基酸，例如，15、16、17、18、29、20、21、22、23、24或25个氨基酸的长度。
跨膜区段可包含与以下氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：HLMYVAAAAFVLLFFVGCGVLLS(SEQ ID NO:7)；并且可具有21、22、23、24或25个氨基酸的长度。
在一些情况下，Notch受体多肽包含与图2A所示的氨基酸序列的氨基酸1665至1756或另一Notch受体多肽的对应区段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应区段的实例示出于图2B-2G中；并且具有85个氨基酸(aa)至95aa(例如，85、86、87、88、89、90、91、92、93、94或95aa)的长度。
在一些情况下，Notch受体多肽包含与图2A所示的氨基酸序列的氨基酸1665至1756或另一Notch受体多肽的对应区段具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中对应区段的实例示出于图2B-2G中；并且包括在Notch受体多肽的N末端处框内融合的异源多肽。
配体诱导型蛋白水解裂解位点
如上所述，本公开的嵌合Notch受体多肽包括具有50个氨基酸至1000个氨基酸的长度并且包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点的Notch受体多肽。如上文所论述，本公开的嵌合Notch受体多肽包括：a)包括特异性结合对的第一成员的细胞外结构域；b)Notch受体多肽，其具有50个氨基酸至1000个氨基酸的长度，并且包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员的结合在一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点处诱导Notch受体多肽的裂解，从而释放细胞内结构域。特异性结合对的第二成员(“配体”)可存在于接触(例如“发送器”)细胞上。
在一些情况下，Notch受体多肽仅包含一个配体诱导型蛋白水解裂解位点。在一些情况下，Notch受体多肽包含两个配体诱导型蛋白水解裂解位点。在一些情况下，Notch受体多肽包含三个配体诱导型蛋白水解裂解位点。为简明起见，配体诱导型裂解位点在本文将称为“S1”、“S2”和“S3”配体诱导型蛋白水解裂解位点。
在一些情况下，Notch受体多肽包含S1配体诱导型蛋白水解裂解位点。S1配体诱导型蛋白水解裂解位点可位于HD-N区段与HD-C区段之间。在一些情况下，S1配体诱导型蛋白水解裂解位点为弗林蛋白酶样蛋白酶裂解位点。弗林蛋白酶样蛋白酶裂解位点可具有典型序列Arg-X-(Arg/Lys)-Arg，其中X为任何氨基酸；蛋白酶紧接着典型序列的C末端进行裂解。例如，在一些情况下，包含S1配体诱导型蛋白水解裂解位点的氨基酸序列可具有氨基酸序列GRRRRELDPM(SEQ ID NO:19)，其中裂解发生在“RE”序列之间。作为另一实例，包含S1配体诱导型蛋白水解裂解位点的氨基酸序列可具有氨基酸序列RQRRELDPM(SEQ ID NO:20)，其中裂解发生在“RE”序列之间。
在一些情况下，Notch受体多肽包含S2配体诱导型蛋白水解裂解位点。S2配体诱导型蛋白水解裂解位点可位于HD-C区段内。在一些情况下，S2配体诱导型蛋白水解裂解位点为ADAM-17型蛋白酶裂解位点。ADAM-17型蛋白酶裂解位点可包含Ala-Val二肽序列，其中酶在Ala与Val之间进行裂解。例如，在一些情况下，包含S2配体诱导型蛋白水解裂解位点的氨基酸序列可具有氨基酸序列KIEAVKSE(SEQ ID NO:21)，其中裂解发生在“AV”序列之间。作为另一实例，包含S2配体诱导型蛋白水解裂解位点的氨基酸序列可具有氨基酸序列KIEAVQSE(SEQ ID NO:22)，其中裂解发生在“AV”序列之间。
在一些情况下，Notch受体多肽包含S3配体诱导型蛋白水解裂解位点。S3配体诱导型蛋白水解裂解位点可位于TM结构域内。在一些情况下，S3配体诱导型蛋白水解裂解位点为γ-分泌酶(γ-分泌酶)裂解位点。γ-分泌酶裂解位点可包含Gly-Val二肽序列，其中酶在Gly与Val之间进行裂解。例如，在一些情况下，S3配体诱导型蛋白水解裂解位点具有氨基酸序列VGCGVLLS(SEQ ID NO:23)，其中裂解发生在“GV”序列之间。在一些情况下，S3配体诱导型蛋白水解裂解位点包含氨基酸序列GCGVLLS(SEQ ID NO:24)。
在一些情况下，Notch受体多肽缺乏S1配体诱导型蛋白水解裂解位点。在一些情况下，Notch受体多肽缺乏S2配体诱导型蛋白水解裂解位点。在一些情况下，Notch受体多肽缺乏S3配体诱导型蛋白水解裂解位点。在一些情况下，Notch受体多肽缺乏S1配体诱导型蛋白水解裂解位点和S2配体诱导型蛋白水解裂解位点两者。在一些情况下，Notch受体多肽包含S3配体诱导型蛋白水解裂解位点；并且缺乏S1配体诱导型蛋白水解裂解位点和S2配体诱导型蛋白水解裂解位点两者。实例示意性地示出于图4G中。
细胞内结构域
如上所述，本公开的嵌合Notch受体多肽包括在嵌合Notch受体多肽与特异性结合对的第二成员结合之后被释放的细胞内结构域，其中嵌合Notch受体多肽与特异性结合对的第二成员的结合诱导上文提及的蛋白水解裂解位点的裂解。
细胞内结构域包含对于Notch受体多肽来说异源性的氨基酸序列。换句话说，细胞内结构域包含并非天然存在于Notch受体多肽中的氨基酸序列。
当从嵌合Notch受体多肽中释放时，细胞内结构域提供效应子功能，其中效应子功能包括，例如，细胞的一种或多种细胞因子的产生增加；细胞的一种或多种细胞因子的产生减少；细胞的激素的产生增加或减少；细胞的抗体产生；细胞器活性的改变；细胞内多肽的运输变化；靶基因转录的改变；蛋白质活性的改变；细胞行为的改变，例如，细胞死亡；细胞增殖；对细胞分化的影响；对细胞存活的影响；细胞信号应答的调节；等等。在一些情况下，当从嵌合Notch受体多肽中释放时，细胞内结构域提供靶基因转录的改变。在一些情况下，当从嵌合Notch受体多肽中释放时，细胞内结构域提供靶基因转录的增加。在一些情况下，当从嵌合Notch受体多肽中释放时，细胞内结构域提供靶基因的减少。
细胞内结构域可以是广泛多种多肽中的任一种，其中实例包括但不限于转录激活蛋白；转录阻遏蛋白；转录辅助激活蛋白；转录辅助阻遏蛋白；DNA结合多肽；RNA结合多肽；翻译调控多肽；激素；细胞因子；毒素；抗体；染色质调节剂；自杀蛋白(suicide protein)；细胞器特异性多肽(例如，核孔调控子、线粒体调控子、内质网调控子等)；促细胞凋亡多肽；抗细胞凋亡多肽；通过其他机制促进细胞死亡的其他多肽；促增殖多肽；抗增殖多肽；免疫共刺激多肽；位点特异性核酸酶；重组酶；抑制性免疫受体；活化性免疫受体；Cas9和RNA靶向核酸酶的变体；以及DNA识别多肽；多肽的显性负性(dominant negative)变体；信号传导多肽；受体酪氨酸激酶；非受体酪氨酸激酶；促进分化的多肽；等等。
在一些情况下，细胞内结构域包括信号传导多肽。合适的信号传导多肽包括，例如，STAT3/5、Akt、Myc等。在一些情况下，信号传导多肽为PI3K/mTOR-、NFκB-、MAPK-、STAT-、FAK-、MYC或TGF-β介导的信号传导通路的一部分。在一些情况下，信号传导多肽为Ras/Raf/Mek/Erk1/2、JAK/STAT3或PI3K/Akt信号传导通路的一部分。
在一些情况下，细胞内结构域包括多肽的显性负性变体，例如信号传导多肽的显性负性变体。显性负性变体的实例包括，例如，显性负性TGF-β受体；STAT3的显性负性变体，其包括影响用作显性负性变体的STAT3的DNA结合结构域的一个或多个突变；等等。
在一些情况下，细胞内结构域为当从嵌合Notch受体多肽中释放时阻断或改变细胞活性的基于抗体的支架或基于非抗体的支架。
在一些情况下，细胞内结构域包括免疫受体，例如，活化性免疫受体或抑制性免疫受体。合适的活化性免疫受体可包括基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。ITAM基序为YX1X2L/I，其中X1和X2独立地为任何氨基酸。合适的细胞内信号传导结构域可以是衍生自包含ITAM基序的多肽的包含ITAM基序的部分。例如，合适的细胞内信号传导结构域可以是来自任何包含ITAM基序的蛋白质的包含ITAM基序的结构域。因此，合适的细胞内信号传导结构域不必须包含其所衍生于的整个蛋白质的整个序列。合适的包含ITAM基序的多肽的实例包括但不限于：DAP12；FCER1G(Fcε受体Iγ链)；CD3D(CD3δ)；CD3E(CD3ε)；CD3G(CD3δ)；CD3Z(C D3ζ)；以及CD79A(抗原受体复合物相关蛋白α链)。作为一个非限制性实例，合适的包含ITAM基序的多肽可包含与以下氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列： 其中ITAM基序以粗体示出并且加有下划线。作为另一实例，合适的包含ITAM基序的多肽可包含与以下氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：/> 其中ITAM基序以粗体示出并且加有下划线。多肽可包括全长CD3ζ氨基酸序列的包含ITAM基序的部分。作为另一实例，合适的包含ITAM基序的多肽可包含与以下氨基酸序列中的任一个具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：/>
或/>/>其中ITAM基序以粗体示出并且加有下划线。
适用于本公开的嵌合Notch多肽的细胞内信号传导结构域包括包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)的细胞内信号传导多肽。ITAM基序为YX1X2L/I，其中X1和X2独立地为任何氨基酸。在一些情况下，嵌合Notch多肽的细胞内信号传导结构域包括1、2、3、4或5个ITAM基序。在一些情况下，ITAM基序在细胞内信号传导结构域中重复两次，其中ITAM基序的第一和第二实例由6至8个氨基酸，例如(YX1X2L/I)(X3)n(YX1X2L/I)彼此隔开，其中n为从6至8的整数，并且是6-8中的每一个，X3可以是任何氨基酸。在一些情况下，嵌合Notch多肽的细胞内信号传导结构域包括3个ITAM基序。
合适的细胞内信号传导结构域可以是衍生自包含ITAM基序的多肽的包含ITAM基序的部分。例如，合适的细胞内信号传导结构域可以是来自任何包含ITAM基序的蛋白质的包含ITAM基序的结构域。因此，合适的细胞内信号传导结构域不必须包含其所衍生于的整个蛋白质的整个序列。合适的包含ITAM基序的多肽的实例包括但不限于：DAP12；FCER1G(Fcε受体1γ链)；CD3D(CD3δ)；CD3E(CD3ε)；CD3G(CD3γ)；CD3Z(CD3ζ)；以及CD79A(抗原受体复合物相关蛋白α链)。
在一些情况下，细胞内信号传导结构域衍生自DAP12(也称为T YROBP；TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白；KARAP；PLOSL；DN AX激活蛋白12；KAR相关蛋白；TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白；杀伤活化性受体相关蛋白；杀伤活化性受体相关蛋白；等等)。例如，合适的细胞内信号传导结构域多肽可包含与以下氨基酸序列(4个同种型)中的任一个具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
或
其中ITAM基序以粗体示出并且加有下划线。
同样，合适的细胞内信号传导结构域多肽可包括全长DAP12氨基酸序列的包含ITAM基序的部分。因此，合适的细胞内信号传导结构域多肽可包含与以下氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列： 其中ITAM基序以粗体示出并且加有下划线。
在一些情况下，细胞内信号传导结构域衍生自FCER1G(也称为FCRG；Fcε受体Iγ链；Fc受体γ链；fc-εRI-γ；fcRγ；fceRIγ；高亲和力免疫球蛋白ε受体亚基γ；免疫球蛋白E受体高亲和力γ链；等等)。例如，合适的细胞内信号传导结构域多肽可包含与以下氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
其中ITAM基序以粗体示出并且加有下划线。
同样，合适的细胞内信号传导结构域多肽可包括全长FCER1G氨基酸序列的包含ITAM基序的部分。因此，合适的细胞内信号传导结构域多肽可包含与以下氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列： 其中ITAM基序以粗体示出并且加有下划线。
在一些情况下，细胞内信号传导结构域衍生自T细胞表面糖蛋白CD3δ链(也称为CD3D；CD3-δ；T3D；CD3抗原，δ亚基；CD3δ；CD3d抗原，δ多肽(TiT3复合物)；OKT3，δ链；T细胞受体T3δ链；T细胞表面糖蛋白CD3δ链；等等)。例如，合适的细胞内信号传导结构域多肽可包含与以下氨基酸序列(2个同种型)中的任一个的约100个氨基酸至约110个氨基酸(aa)、约110aa至约115aa、约115aa至约120aa、约120aa至约130aa、约130aa至约140aa、约140aa至约150aa或约150aa至约170aa的连续段具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
或
其中ITAM基序以粗体示出并且加有下划线。
同样，合适的细胞内信号传导结构域多肽可包括全长CD3δ氨基酸序列的包含ITAM基序的部分。因此，合适的细胞内信号传导结构域多肽可包含与以下氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：其中ITAM基序以粗体示出并且加有下划线。
在一些情况下，细胞内信号传导结构域衍生自T细胞表面糖蛋白CD3ε链(也称为CD3e、T细胞表面抗原T3/Leu-4ε链、T细胞表面糖蛋白CD3ε链、AI504783、CD3、CD3ε、T3e，等等)。例如，合适的细胞内信号传导结构域多肽可包含与以下氨基酸序列的约100个氨基酸至约110个氨基酸(aa)、约110aa至约115aa、约115aa至约120aa、约120aa至约130aa、约130aa至约140aa、约140aa至约150aa或约150aa至约205aa的连续段具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
其中ITAM基序以粗体示出并且加有下划线。
同样，合适的细胞内信号传导结构域多肽可包括全长CD3ε氨基酸序列的包含ITAM基序的部分。因此，合适的细胞内信号传导结构域多肽可包含与以下氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列： 其中ITAM基序以粗体示出并且加有下划线。
在一些情况下，细胞内信号传导结构域衍生自T细胞表面糖蛋白CD3γ链(也称为CD3G、T细胞受体T3γ链、CD3-γ、T3G、γ多肽(TiT3复合物)，等等)。例如，合适的细胞内信号传导结构域多肽可包含与以下氨基酸序列的约100个氨基酸至约110个氨基酸(aa)、约110aa至约115aa、约115aa至约120aa、约120aa至约130aa、约130aa至约140aa、约140aa至约150aa或约150aa至约180aa的连续段具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
其中ITAM基序以粗体示出并且加有下划线。
同样，合适的细胞内信号传导结构域多肽可包括全长CD3γ氨基酸序列的包含ITAM基序的部分。因此，合适的细胞内信号传导结构域多肽可包含与以下氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列： 其中ITAM基序以粗体示出并且加有下划线。
在一些情况下，细胞内信号传导结构域衍生自T细胞表面糖蛋白CD3ζ链(也称为CD3Z、T细胞受体T3ζ链、CD247、CD3-ζ、C D3H、CD3Q、T3Z、TCRZ，等等)。例如，合适的细胞内信号传导结构域多肽可包含与以下氨基酸序列(2个同种型)中的任一个的约100个氨基酸至约110个氨基酸(aa)、约110aa至约115aa、约115a a至约120aa、约120aa至约130aa、约130aa至约140aa、约140aa至约150aa或约150aa至约160aa的连续段具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
或
其中ITAM基序以粗体示出并且加有下划线。
同样，合适的细胞内信号传导结构域多肽可包括全长CD3ζ氨基酸序列的包含ITAM基序的部分。因此，合适的细胞内信号传导结构域多肽可包含与以下氨基酸序列中的任一个具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
或/>
其中ITAM基序以粗体示出并且加有下划线。
在一些情况下，细胞内信号传导结构域衍生自CD79A(也称为B细胞抗原受体复合物相关蛋白α链；CD79a抗原(免疫球蛋白相关α)；MB-1膜糖蛋白；ig-α；膜结合的免疫球蛋白相关蛋白；表面IgM相关蛋白；等等)。例如，合适的细胞内信号传导结构域多肽可包含与以下氨基酸序列(2个同种型)中的任一个的约100个氨基酸至约110个氨基酸(aa)、约110aa至约115aa、约115aa至约120aa、约120aa至约130aa、约130aa至约150aa、约150aa至约200aa或约200aa至约220aa的连续段具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
或
MPGGPGVLQALPATIFLLFLLSAVYLGPGCQALWMHKVPASLMVSLGEDAHFQCPHNSSNNANVTWWRVLHGNYTWPPEFLGPGEDPNEPPPRPFLDMGEGTKNRIITAEGIILLFCAVVPGTLLLFRKRWQNEKLGLDAGDEYEDENLYEGLNLDDCSMYEDISRGLQGTYQDVGSLNIGDVQLEKP(SEQ ID NO:46)，其中ITAM基序以粗体示出并且加有下划线。
同样，合适的细胞内信号传导结构域多肽可包括全长CD79A氨基酸序列的包含ITAM基序的部分。因此，合适的细胞内信号传导结构域多肽可包含与以下氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列： 其中ITAM基序以粗体示出并且加有下划线。
DAP10/CD28
适用于本公开的嵌合Notch多肽的细胞内信号传导结构域包括DAP10/CD28型信号传导链。
DAP10信号传导链的实例为以下氨基酸序列：
在一些实施方案中，合适的细胞内信号传导结构域包含与氨基酸序列
的全长具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
CD28信号传导链的实例为氨基酸序列
在一些实施方案中，合适的细胞内信号传导结构域包含与氨基酸序列
的全长具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
ZAP70
适用于本公开的嵌合Notch多肽的细胞内信号传导结构域包括ZAP70多肽，例如，包括与以下氨基酸序列的约300个氨基酸至约400个氨基酸、约400个氨基酸至约500个氨基酸或约500个氨基酸至619个氨基酸的连续段具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的多肽：
MPDPAAHLPFFYGSISRAEAEEHLKLAGMADGLFLLRQCLRSLGG
YVLSLVHDVRFHHFPIERQLNGTYAIAGGKAHCGPAELCEFYSRD
PDGLPCNLRKPCNRPSGLEPQPGVFDCLRDAMVRDYVRQTWKLE
GEALEQAIISQAPQVEKLIATTAHERMPWYHSSLTREEAERKLYS
GAQTDGKFLLRPRKEQGTYALSLIYGKTVYHYLISQDKAGKYCIP
EGTKFDTLWQLVEYLKLKADGLIYCLKEACPNSSASNASGAAAP
TLPAHPSTLTHPQRRIDTLNSDGYTPEPARITSPDKPRPMPMDTSV
YESPYSDPEELKDKKLFLKRDNLLIADIELGCGNFGSVRQGVYRM
RKKQIDVAIKVLKQGTEKADTEEMMREAQIMHQLDNPYIVRLIG
VCQAEALMLVMEMAGGGPLHKFLVGKREEIPVSNVAELLHQVS
MGMKYLEEKNFVHRDLAARNVLLVNRHYAKISDFGLSKALGAD
DSYYTARSAGKWPLKWYAPECINFRKFSSRSDVWSYGVTMWEA
LSYGQKPYKKMKGPEVMAFIEQGKRMECPPECPPELYALMSDCW
IYKWEDRPDFLTVEQRMRACYYSLASKVEGPPGSTQKAEAACA(SEQ ID NO:50)。
衍生自受体的共刺激结构域适用作本公开的嵌合Notch多肽的细胞内结构域。共刺激结构域可以是跨膜蛋白的细胞内部分(即，共刺激结构域可衍生自跨膜蛋白)。合适的共刺激多肽的非限制性实例包括但不限于4-1BB(CD137)、CD28、ICOS、OX-40、BTLA、CD27、CD30、GITR以及HVEM。
在一些情况下，共刺激结构域衍生自跨膜蛋白CD28(也称为Tp44)的细胞内部分。例如，合适的共刺激结构域可包含与以下氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：FWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:51)。
在一些情况下，共刺激结构域衍生自跨膜蛋白4-1BB(也称为TNFRSF9；CD137；4-1BB；CDw137；ILA；等等)的细胞内部分。例如，合适的共刺激结构域可包含与以下氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:52)。
在一些情况下，共刺激结构域衍生自跨膜蛋白OX-40(也称为TNFRSF4、RP5-902P8.3、ACT35、CD134、OX40、TXGP1L)的细胞内部分。例如，合适的共刺激结构域可包含与以下氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：RRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI(SEQ ID NO:53)。
在一些情况下，共刺激结构域衍生自跨膜蛋白BTLA(也称为BT LA1和CD272)的细胞内部分。例如，合适的共刺激结构域可包含与以下氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：CCLRRHQGKQNELSDTAGREINLVDAHLKSEQTEASTR QNSQVLLSETGIYDNDPDLCFRMQEGSEVYSNPCLEENKPGIVYA SLNHSVIGPNSRLARNVKEAPTEYASICVRS(SEQ ID NO:54)。
在一些情况下，共刺激结构域衍生自跨膜蛋白CD27(也称为S152、T14、TNFRSF7和Tp55)的细胞内部分。例如，合适的共刺激结构域可包含与以下氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：HQRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEE GSTIPIQEDYRKPEPACSP(SEQ IDNO:55)。
在一些情况下，共刺激结构域衍生自跨膜蛋白CD30(也称为TN FRSF8、D1S166E和Ki-1)的细胞内部分。例如，合适的共刺激结构域可包含与以下氨基酸序列的约100个氨基酸至约110个氨基酸(a a)、约110aa至约115aa、约115aa至约120aa、约120aa至约130aa、约130aa至约140aa、约140aa至约150aa、约150aa至约160aa或约160aa至约185aa的连续段具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：RRACRKRIRQKLHLCYPVQT SQPKLELVDSRPRRSSTQLRSGASVTEPVAEERGLMSQPLMETCHSVGAAYLESLPLQDASPAGGPSSPRDLPEPRVSTEHTNNKIEKIYIMKADTVIVGTVKAELPEGRGLAGPAEPELEEELEADHTPHYPEQETEPPLGSCSDVMLSVEEEGKEDPLPTAASGK(SEQ ID NO:56)。
在一些情况下，共刺激结构域衍生自跨膜蛋白GITR(也称为TNFRSF18、RP5-902P8.2、AITR、CD357和GITR-D)的细胞内部分。例如，合适的共刺激结构域可包含与以下氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：HIWQLRSQCMWPRETQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEE KGRLGDLWV(SEQ ID NO:57)。
在一些情况下，共刺激结构域衍生自跨膜蛋白HVEM(也称为TNFRSF14、RP3-395M20.6、ATAR、CD270、HVEA、HVEM、LIGHTR和TR2)的细胞内部分。例如，合适的共刺激结构域可包含与以下氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：CVKRRKPRGDVVKVIVSVQRKRQEAEGEATVIEALQAPPDVTTV AVEETIPSFTGRSPNH(SEQ ID NO:58)。
合适的抑制性免疫受体可包括基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)、基于免疫受体酪氨酸的转换基序(ITSM)、NpxY基序或YXXΦ基序。合适的抑制性免疫受体包括PD1；CTLA4；BTLA；CD160；KRLG-1；2B4；Lag-3；以及Tim-3。参见，例如，Odorizzi和Wherry(2012)J.Immunol.188:2957；以及Baitsch等人(2012)PLoSOne 7:e30852。
在一些情况下，合适的抑制性免疫受体包含与以下PD1氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLV(SEQ ID NO:59)。
在一些情况下，合适的抑制性免疫受体包含与以下CTLA4氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
MACLGFQRHKAQLNLATRTWPCTLLFFLLFIPVFCKAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKMLKKRSPLTTGVYVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN(SEQ ID NO:60)。
在一些情况下，合适的抑制性免疫受体包含与以下CD160氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：MLLEPGRGCCALAILLAIVDIQSGGCINITSSASQEGTRLNLICTVWHKKEEAEGFVVFLCKDRSGDCSPETSLKQLRLKRDPGIDGVGEISSQLMFTISQVTPLHSGTYQCCARSQKSGIRLQGHFFSILFTETGNYTVTGLKQRQHLEFSHNEGTLSSGFLQEKVWVMLVTSLVALQAL(SEQ ID NO:61)。
在一些情况下，合适的抑制性免疫受体包含与以下T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域-3(Tim-3)氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
MFSHLPFDCVLLLLLLLLTRSSEVEYRAEVGQNAYLPCFYTPAAPGNLVPVCWGKGACPVFECGNVVLRTDERDVNYWTSRYWLNGDFRKGDVSLTIENVTLADSGIYCCRIQIPGIMNDEKFNLKLVIKP AKVTPAPTLQRDFTAAFPRMLTTRGHGPAETQTLGSLPDINLTQISTLANELRDSRLANDLRDSGATIRIGIYIGAGICAGLALALIFGALIFKWYSHSKEKIQNLSLISLANLPPSGLANAVAEGIRSEENIYTIEENVYEVEEPNEYYCYVSSRQQPSQPLGCRFAMP(SEQ ID NO:62)。
在一些情况下，合适的抑制性免疫受体包含与以下淋巴细胞活化基因3(Lag-3)氨基酸序列的氨基酸23-525具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：MWEAQFLGLLFLQPLWVAPVK PLQPGAEVPVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRASDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLEPPTPLTVYAGAGSRVGLPCRLPAGVGTRSFLTAKWTPPGGGPDLLVTGDNGDFTLRLEDVSQAQAGTYTCHIHLQEQQLNATVTLAIITVTPKSFGSPGSLGKLLCEVTPVSGQERFVWSSLDTPSQRSFSGPWLEAQEAQLLSQPWQCQLYQGERLLGAAVYFTELSSPGAQRSGRAPGALPAGHLLLFLILGVLSLLLLVTGAFGFHLWRRQWRPRRFSALEQGIHPPQAQSKIEELEQEPEPEPEPEPEPEPEPEPEQL(SEQ ID NO:63)。
在一些情况下，细胞内结构域是Siglec。参见，例如，Varki和Angata(2006)Glycobiol.16:1R。在一些情况下，Siglec为Siglec-15。在一些情况下，细胞内结构域是KIR2DL4。Miah等人(2008)J.Immunol.180:2922。
在一些情况下，细胞内结构域是重组酶。合适的重组酶包括Cre重组酶、Flp重组酶、Dre重组酶等。合适的重组酶为FLPe重组酶(参见，例如，Akbudak和Srivastava(2011)Mol.Biotechnol.49:82)。合适的重组酶为Flpo重组酶。
如本文所述，重组酶可以是完整重组酶或拆分重组酶。拆分重组酶的部分可由相同或不同的表达构建体表达。在一些情况下，拆分重组酶的两个部分可以可操作地连接至不同的结合触发的转录开关。在其他情况下，拆分重组酶的第一部分可以可操作地连接至结合触发的转录开关，并且拆分重组酶的第二部分可以由表达构建体独立表达。
在利用拆分重组酶的情况中，例如，如在逻辑门控SynNotch电路中，拆分重组酶的部分可以基本上如下文关于拆分转录因子所描述的各种方式布置在具有其他组分的一个或多个表达盒中并且由其表达。
因此，一个或多个结合触发的转录开关的激活可诱导拆分重组酶的部分的表达，导致拆分重组酶部分的异源二聚化和/或复合物形成，从而导致功能性重组酶的形成。可选地，一个或多个结合触发的转录开关的激活可导致从一个或多个结合触发的转录开关中释放出重组酶部分，导致拆分重组酶部分的异源二聚化和/或复合物形成，从而导致功能性重组酶的形成。此外，拆分重组酶部分的诱导和释放可组合，例如，其中一个或多个结合触发的转录开关的激活可诱导拆分重组酶的部分的表达以及拆分重组酶部分从一个或多个结合触发的转录开关中的释放，导致拆分重组酶部分的异源二聚化和/或复合物形成，从而导致功能性重组酶的形成。
合适的拆分重组酶包括但不限于，例如拆分的Cre重组酶，如例如Beckervordersandforth R等人,Stem Cell Reports.2014；2(2):153-62Wen M等人,PLoSOne.2014；9(10):e110290O'Brien SP等人,Biotechnol J.2014；9(3):355-61Wang P等人,Sci Rep.2012；2:497Hirrlinger J等人,PLoS One.2009；4(12):e8354Hirrlinger J等人,PLoS One.2009；4(1):e4286中所述；其公开内容全文以引用方式并入本文中。
合适的Cre重组酶可包含与以下氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：VSNLLTVHQNLPALPVDATSDEVRKNLMDMFRDRQAFSEHTWKMLLSVCRSWAAWCKLNNRKWFPAEPEDVRDYLLYLQARGLAVKTIQQHLGQLNMLHRRSGLPRPSDSNAVSLVMRRIRKENVDAGERAKQALAFERTDFDQVRSLMENSDRCQDIRNLAFLGIAYNTLLRIAEIARIRVKDISRTDGGRMLIHIGRTKTLVSTAGVEKALSLGVTKLVERWISVSGVADDPNNYLFCRVRKNGVAAPSATSQLSTRALEGIFEATHRLIYGAKDDSGQRYLAWSGHSARVGAARDMARAGVSIPEIMQAGGWTNVNIVMNYIRNLDSETGAMVRLLEDGD(SEQ ID NO:64)；并且可具有335个氨基酸(aa)至350aa的长度。
合适的FLPe重组酶可包含与以下氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：MSQFDILCKTPPKVLVRQFVERFERPSGEKIASCAAELTYLCWMITHNGTAIKRATFMSYNTIISNSLSFDIVNKSLQFKYKTQKATILEASLKKLIPAWEFTIIPYNGQKHQSDITDIVSSLQLQFESSEEADKGNSHSKKMLKALLSEGESIWEITEKILNSFEYTSRFTKTKTLYQFLFLATFINCGRFSDIKNVDPKSFKLVQNKYLGVIIQCLVTETKTSVSRHIYFFSARGRIDPLVYLDEFLRNSEPVLKRVNRTGNSSSNKQEYQLLKDNLVRSYNKALKKNAPYPIFAIKNGPKSHIGRHLMTSFLSMKGLTELTNVVGNWSDKRASAVARTTYTHQITAIPDHYFALVSRYYAYDPISKEMIALKDETNPIEEWQHIEQLKGSAEGSIRYPAWNGIISQEVLDYLSSYINRRIGPVEQKLISEEDL(SEQ ID NO:65)；并且可具有430个氨基酸至445个氨基酸的长度。
合适的位点特异性核酸酶包括但不限于具有核酸酶活性的RNA引导的DNA结合蛋白，例如Cas9多肽；类转录激活蛋白效应子核酸酶(transcription activator-likeeffector nuclease，TALEN)；锌指核酸酶等。
Cas9多肽在本领域中是已知的；参见，例如Fonfara等人(2014)Nucl.AcidsRes.42:2577；以及Sander和Joung(2014)Nat.Biotechnol.32:347。Cas9多肽可包含与图36中所示的氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些情况下，细胞内结构域为缺乏核酸酶活性，但仍保留DNA靶标结合活性的Cas9变体。这一Cas9变体在本文称为“死Cas9”或“dCas9”。参见，例如，Qi等人(2013)Cell152:1173。dCas9多肽可包含图36中所示的氨基酸序列或另一Cas9多肽的对应氨基酸的D10A和/或H840A氨基酸取代。
在一些情况下，细胞内结构域为嵌合dCas9，例如，包括dCas9和融合配偶体的融合蛋白，其中合适的融合配偶体包括，例如，提供酶活性的非Cas9酶，其中酶活性为甲基转移酶活性、脱甲基酶活性、乙酰转移酶活性、脱乙酰基酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、泛素连接酶活性、去泛素化活性、腺苷酸化活性、脱腺苷酸化活性、SUMO化活性、脱SUMO化活性、核糖基化活性、脱核糖基化活性、十四烷基化活性或脱十四烷基化活性。在一些情况下，细胞内结构域为嵌合dCas9，例如，包括dCas9和融合配偶体的融合蛋白，其中合适的融合配偶体包括，例如，提供酶活性的非Cas9酶，其中酶活性为核酸酶活性、甲基转移酶活性、脱甲基酶活性、DNA修复活性、DNA损伤活性、脱氨基化活性、歧化酶活性、烷基化活性、脱嘌呤活性、氧化活性、嘧啶二聚体形成活性、整合酶活性、转座酶活性、重组酶活性、聚合酶活性、连接酶活性、解旋酶活性、光裂解酶活性或糖基化酶活性。
在一些情况下，细胞内结构域为嵌合dCas9，例如，包括dCas9和融合配偶体的融合蛋白，其中合适的融合配偶体包括，例如，转录激活蛋白或转录阻遏蛋白结构域(例如，Kruppel相关盒(KRAB或SKD)；Mad mSIN3相互作用域(SID)；ERF阻遏蛋白结构域(ERD)等)；基于锌指的人工转录因子(参见，例如，Sera(2009)Adv.Drug Deliv.61:513)；基于TALE的人工转录因子(参见，例如，Liu等人(2013)Nat.Rev.Genetics 14:781)等等。
在一些情况下，细胞内结构域是细胞凋亡诱导剂。合适的细胞凋亡诱导剂包括tBID。术语“tBID”是指由胞质BID的酶促裂解(例如通过活性半胱天冬酶)得到的BH3相互作用死亡激动剂(BID)蛋白的C末端截短的片段。在细胞凋亡的早期，tBID移位至线粒体并介导Cyt c从其中的释放。tBID蛋白的非限制性实例包括人tBID(GenBank登录号CAG30275中提供的氨基酸序列的氨基酸61-195)。
人tBID具有以下氨基酸序列：gnrsshsrlgrieadsesqediirniarhlaqvg dsmdrsippglvnglaedrnrdlataleqllqayprdmekektmlvlalllakkvashtpsllrdvfhttvnfinqnlrtyvrslarngmd(SEQ ID NO:66)。
在一些实施方案中，细胞内结构域包含与上文提供的人tBID氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且具有约120个氨基酸(aa)至150aa，例如，120aa至125aa、125aa至130aa、130aa至135aa、135aa至140aa、140aa至145aa或145aa至150aa的长度。在一些情况下，细胞内结构域包含与上文提供的人tBID氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且具有135aa的长度。
在一些情况下，细胞内结构域是转录因子。合适的转录因子的实例为美国专利申请No.2014/0308746的表1中给出的那些。合适的转录因子的非限制性实例示出于图37-66中。合适的转录激活蛋白和转录阻遏蛋白的非限制性实例示出于图37-83中。在一些情况下，细胞内结构域是转录调控子。合适的转录调控蛋白的非限制性实例包括，例如，转录调控蛋白的实例包括，例如，ABT1、ACYP2、AEBP1、AEBP2、AES、AFF1、AFF3、AHR、ANK1、ANK2、ANKFY1、ANKIB1、ANKRD1、ANKRD10、ANKRD2、ANKRD32、ANKRD46、ANKRD49、ANKRD56、ANKRD57、ANKS4B、AR、ARHGAP17、ARID1A、ARID1B、ARID3A、ARID4A、ARID5B、ARNT、ARNT2、ARNTL、ARNTL2、ARX、ASB10、ASB11、ASB12、ASB15、ASB2、ASB5、ASB8、ASB9、ASH1L、ASH2L、ASXL1、ASZ1、ATF1、ATF3、ATF4、ATF4、ATF5、ATF6、ATF7、ATF7IP、ATM、ATOH1、ATXN3、1300003B13RIK、B3GAT3、B930041F14RIK、BACH1、BACH2、BARX1、BARX2、BATF、BATF2、BATF3、BAZ2A、BBX、BC003267、BCL11A、BCL11B、BCL3、BCL6、BCL6B、BCLAF1、BCOR、BHLHA15、BHLHE40、BHLHE41、BLZF1、BMYC、BNC1、BNC2、BPNT1、BRCA1、BRWD1、BTBD11、BTF3、6030408C04RIK、CAMK4、CARHSP1、CARM1、CBX4、CBX7、CCNC、CCNH、CCNT1、CCNT2、CDC5L、CDK2、CDK4、CDK9、CDKN2C、CDX1、CDX1、CDX2、CEBPA、CEBPB、CEBPD、CEBPG、CEBPG、CEBPZ、CHD4、CHD7、CHGB、CIC、CIITA、CITED1、CITED2、CITED4、CLOCK、CLPB、CML3、CNOT7、COPS2、CREB1、CREB3、CREB3L1、CREB3L1、CREB3L2、CREB3L3、CREB5、CREBBP、CREBL2、CREM、CSDA、CSDA、CSDC2、CSDE1、CTBP2、CTCF、CTCFL、CTNNB1、CTNNBL1、CXXC1、D11BWG0517E、2300002D11RIK、DACH1、DAXX、DBP、DDIT3、DDX20、DDX54、DDX58、DEAF1、DEK、DIDO1、DLX2、DMRT1、DMRT2、DMRTB1、DNMT1、DNMT3A、DR1、DRG1、DUSP26、DYSFIP1、E2F1、E2F2、E2F3、E2F5、E2F6、EBF1、EBF2、EBF3、EBF3、EED、EGR1、EGR2、EGR3、EHF、EHMT2、EID2、ELAVL2、ELF1、ELF1、ELF2、ELF3、ELF4、ELF5、ELK3、ELK4、ELL2、EMX2、EMX2、EN2、ENPP2、EOMES、EP300、EPAS1、ERF、ERG、ESR1、ESRRA、ESRRB、ESRRG、ETS1、ETS2、ETV1、ETV3、ETV4、ETV5、ETV6、EVI1、EWSR1、EZH1、EZH2、FAH、FBXL10、FBXL11、FBXW7、FEM1A、FEM1B、FEM1C、FHL2、FLI1、FMNL2、FOS、FOSB、FOSL1、FOSL2、FOXA1、FOXA2、FOXA3、FOXC1、FOXD1、FOXD2、FOXD3、FOXF1、FOXF1A、FOXF2、FOXG1、FOXI1、FOXJ2、FOXJ3、FOXK1、FOXK2、FOXL1、FOXL2、FOXM1、FOXN1、FOXN2、FOXN3、FOXO1、FOXO3、FOXP1、FOXP2、FOXP3、FOXP4、FOXQ1、FUS、FUSIP1、2810021G02RIK、GABPA、GABPB1、GARNL1、GAS7、GATA1、GATA2、GATA3、GATA4、GATA5、GATA5、GATA6、GBX2、GCDH、GCM1、GFI1、GFI1B、GLI2、GLI3、GLIS1、GLIS2、GLIS3、GLS2、GMEB1、GMEB2、GRHL1、GRHL2、GRHL3、GRLF1、GTF2A1、GTF2B、GTF2E2、GTF2F1、GTF2F2、GTF2H2、GTF2H4、GTF2I、GTF2IRD1、GTF2IRD1、GZF1、HAND2、HBP1、HCLS1、HDAC10、HDAC11、HDAC2、HDAC5、HDAC9、HELZ、HES1、HES4、HES5、HES6、HEXIM1、HEY2、HEYL、HHEX、HHEX、HIC1、HIC2、HIF1A、HIF1AN、HIPK2、HIVEP1、HIVEP2、HIVEP2、HIVEP3、HLF、HLTF、HLX、HMBOX1、HMG20A、HMGA2、HMGB2、HMGB3、HNF1B、HNF4A、HNF4G、HOMEZ、HOXA10、HOXA11、HOXA13、HOXA2、HOXA3、HOXA4、HOXA5、HOXA6、HOXA7、HOXA9、HOXB1、HOXB2、HOXB3、HOXB4、HOXB6、HOXB7、HOXB8、HOXB9、HOXC10、HOXC10、HOXC11、HOXC5、HOXC6、HOXC8、HOXC9、HOXD8、HOXD9、HR、HSBP1、HSF2BP、HTATIP2、HTATSF1、HUWE1、5830417I10RIK、ID1、ID2、ID3、ID3、IFNAR2、IKBKB、IKBKG、IKZF1、IKZF2、IKZF3、IKZF4、IL31RA、ILF3、ING1、ING2、ING3、ING4、INSM1、INTS12、IQWD1、IRF1、IRF1、IRF2、IRF3、IRF4、IRF5、IRF6、IRF7、IRF8、IRF8、IRX1、IRX2、IRX3、IRX4、IRX5、ISL1、ISL2、ISX、ISX、IVNS1ABP、2810021J22RIK、JARID1A、JARID1B、JARID1C、JARID1D、JDP2、JUN、JUNB、JUND、KLF1、KLF10、KLF11、KLF12、KLF13、KLF15、KLF16、KLF2、KLF3、KLF3、KLF4、KLF5、KLF6、KLF7、KLF8、KLF9、KRR1、6330416L07RIK、L3MBTL2、LASS2、LASS4、LASS6、LBA1、LBH、LBX1、LCOR、LDB1、LDB2、LEF1、LHX1、LHX2、LHX5、LIMD1、LIN28、LMO1、LMO4、LMX1A、LSM11、LSM4、LYL1、9030612M13RIK、1810007M14RIK、3632451O06RIK、MAF、MAFA、MAFB、MAFF、MAFG、MAFK、MAGED1、MAP3K12、MAPK1、MAPK3、MAPK8、MAPK8IP1、MAX、MAZ、MBD2、MCM2、MCM4、MCM5、MCM6、MCM7、MECOM、MECP2、MED12、MED8、MEF2A、MEF2B、MEF2C、MEF2D、MEIS1、MEIS1、MEIS2、MEOX2、MESP2、MID1、MITF、MKI67IP、MKL1、MLL1、MLL3、MLLT10、MLLT3、MLX、MLXIP、MLXIPL、MNT、MNX1、MPL、MSC、MSRB2、MSX2、MTA3、MTF1、MTF2、MTPN、MXD1、MXD4、MXI1、MYB、MYBBP1A、MYBL2、MYC、MYCBP、MYCL1、MYCN、MYEF2、MYF6、MYNN、MYOCD、MYOD1、MYOG、MYST3、MYST4、MYT1L、MZF1、NAB1、NAB2、NANOG、NARG1、NCOA1、NCOA2、NCOA3、NCOR1、NCOR2、NDN、NEUROD1、NEUROD4、NEUROD6、NEUROG1、NEUROG2、NFAT5、NFATC1、NFATC2、NFATC2IP、NFATC3、NFATC3、NFATC4、NFE2、NFE2L1、NFE2L2、NFIA、NFIA、NFIB、NFIC、NFIL3、NFIX、NFKB1、NFKB2、NFKBIB、NFKBIE、NFKBIZ、NFX1、NFXL1、NFYA、NFYB、NHLH1、NKX2-2、NKX2-3、NKX2-5、NKX2-6、NKX6-2、NMI、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、NPAS1、NPAS2、NPAS3、NR0B1、NR0B2、NR1D1、NR1D2、NR1H3、NR1H4、NR1I2、NR1I3、NR2C1、NR2C2、NR2E3、NR2F1、NR2F2、NR2F6、NR3C1、NR3C2、NR4A1、NR4A2、NR4A2、NR4A3、NR5A1、NR5A2、NRARP、NRIP1、NRIP2、NSBP1、NSD1、NUDT12、NULL、NUPR1、1700065O13RIK、OLIG1、OLIG2、OLIG2、ONECUT1、ONECUT2、ONECUT3、ORC2L、OSGIN1、OSR1、OSR2、OSTF1、OVOL1、OVOL2、PAPOLA、PAPOLG、PAPPA2、PATZ1、PAWR、PAX2、PAX5、PAX6、PAX7、PAX8、PAX9、PBX1、PBX2、PBX3、PBX4、PCBD1、PCGF6、PDCD11、PDLIM4、PDX1、PEG3、PER1、PFDN1、PGR、PHF1、PHF10、PHF12、PHF13、PHF14、PHF20、PHF21A、PHF5A、PHF7、PHOX2A、PHOX2B、PIAS2、PIR、PITX1、PITX2、PKNOX1、PKNOX2、PLA2G6、PLAGL1、PLAGL2、PLRG1、PML、POGK、POLR2B、POLR2E、POLR2H、POLR3E、POLR3H、POLRMT、POU1F1、POU2AF1、POU2F1、POU2F2、POU3F2、POU3F3、POU3F3、POU5F1、POU6F1、PPARA、PPARD、PPARG、PPARGC1A、PPARGC1B、PPP1R12C、PPP1R13B、PPP1R16B、PPP1R1B、PPP2R1A、PPP3CB、PQBP1、PRDM1、PRDM14、PRDM15、PRDM16、PRDM2、PRDM4、PRDM5、PRDM6、PRDM8、PREB、PRKAR1A、PRKCBP1、PROX1、PRRX1、PRRX2、PSMC5、PSMD10、PSMD9、PTF1A、PTGES2、PURB、PWP1、RAB11A、RAB11B、RAB15、RAB18、RAB1B、RAB25、RAB8A、RAB8B、RAI14、RARA、RARB、RARG、RASSF7、RB1、RBBP7、RBL1、RBM14、RBM39、RBM9、RBPJ、RBPJL、RCOR2、REL、RELA、RELB、RERE、REST、REXO4、RFC1、RFX1、RFX2、RFX3、RFX5、RFX7、RFX8、RHOX5、RHOX6、RHOX9、RIPK4、RNF12、RNF14、RNF141、RNF38、RNF4、RORA、RORA、RORB、RORC、RPS6KA4、RREB1、RSRC1、RUNX1、RUNX1T1、RUNX2、RUNX2、RUNX3、RUVBL1、RUVBL2、RXRA、RXRG、RYBP、SAFB2、SALL1、SALL1、SALL2、SALL4、SAP30、SAP30BP、SATB1、SATB2、SATB2、SCAND1、SCAP、SCRT2、SEC14L2、SERTAD1、SF1、SFPI1、SFRS5、SH3D19、SH3PXD2B、SHANK3、SHOX2、SHPRH、SIN3A、SIN3B、SIRT2、SIRT3、SIRT5、SIX1、SIX1、SIX2、SIX3、SIX4、SIX5、SKI、SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD7、SMARCA1、SMARCA2、SMARCA5、SMARCB1、SMYD1、SNAI1、SNAI2、SNAPC2、SNAPC4、SNIP1、SOLH、SOX1、SOX10、SOX11、SOX12、SOX13、SOX15、SOX17、SOX18、SOX2、SOX21、SOX4、SOX5、SOX6、SOX7、SOX8、SOX9、SP1、SP110、SP140L、SP2、SP3、SP4、SP6、SP8、SPDEF、SPEN、SPI1、SPIB、SQSTM1、SREBF1、SREBF2、SREBF2、SRF、SSBP2、SSBP3、SSBP4、SSRP1、ST18、STAG1、STAT1、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT5B、STAT6、SUB1、SUZ12、TADA2L、TAF13、TAF5、TAF5L、TAF7、TAF9、TAL1、TAL1、TARDBP、TBPL1、TBR1、TBX1、TBX10、TBX15、TBX18、TBX2、TBX2、TBX20、TBX21、TBX3、TBX4、TBX5、TBX6、TCEA1、TCEA3、TCEAL1、TCEB3、TCERG1、TCF12、TCF15、TCF19、TCF20、TCF21、TCF21、TCF3、TCF4、TCF7、TCF7L2、TCFAP2A、TCFAP2B、TCFAP2C、TCFCP2L1、TCFE2A、TCFE3、TCFEB、TCFEC、TCFL5、TEAD1、TEAD2、TEAD3、TEAD4、TEF、TFAP2A、TFAP2C、TFCP2L1、TFDP2、TFEB、TFEC、TGFB1I1、TGIF1、TGIF2、TGIF2LX、THRA、THRAP3、THRB、THRSP、TIAL1、TLE1、TLE6、TMEM131、TMPO、TNFAIP3、TOB1、TOX4、TP63、TRERF1、TRIB3、TRIM24、TRIM28、TRIM30、TRIP13、TRIP4、TRIP6、TRP53、TRP53BP1、TRP63、TRPS1、TRPS1、TSC22D1、TSC22D2、TSC22D3、TSC22D4、TSHZ1、TSHZ1、TSHZ3、TTRAP、TUB、TULP4、TWIST1、TWIST2、TYSND1、UBE2W、UBN1、UBP1、UBTF、UGP2、UHRF1、UHRF2、UNCX、USF1、USF2、UTF1、VDR、VEZF1、VGLL2、VSX1、WASL、WHSC1、WHSC2、WT1、WWP1、WWTR1、XBP1、YAF2、YY1、ZBED1、ZBED4、ZBTB1、ZBTB10、ZBTB16、ZBTB16、ZBTB17、ZBTB2、ZBTB20、ZBTB22、ZBTB25、ZBTB32、ZBTB38、ZBTB4、ZBTB43、ZBTB45、ZBTB47、ZBTB7A、ZBTB7B、ZBTB7C、ZCCHC8、ZDHHC13、ZDHHC16、ZDHHC21、ZDHHC5、ZDHHC6、ZEB2、ANK2ZEB2、ZFHX2、ZFHX3、ZFHX4、ZFP105、ZFP110、ZFP143、ZFP148、ZFP161、ZFP192、ZFP207、ZFP219、ZFP238、ZFP263、ZFP275、ZFP277、ZFP281、ZFP287、ZFP292、ZFP35、ZFP354C、ZFP36、ZFP36L1、ZFP386、ZFP407、ZFP42、ZFP423、ZFP426、ZFP445、ZFP451、ATF5ZFP451、ZFP467、ZFP52、ZFP57、ZFP592、ZFP593、ZFP597、ZFP612、ZFP637、ZFP64、ZFP647、ZFP748、ZFP810、ZFP9、ZFP91、ZFPM1、ZFPM2、ZFX、ZHX2、ZHX3、ZIC1、ZIC2、ZIC3、ZIC4、ZIC5、ZKSCAN1、ZKSCAN3、ZMYND11、ZNF143、ZNF160、ZNF175、ZNF184、ZNF192、ZNF213、ZNF217、ZNF219、ZNF22、ZNF238、ZNF24、ZNF267、ZNF273、ZNF276、ZNF280D、ZNF281、ZNF292、ZNF311、ZNF331、ZNF335、ZNF337、ZNF33B、ZNF366、ZNF394、ZNF398、ZNF41、ZNF410、ZNF415、ZNF423、ZNF436、ZNF444、ZNF445、ZNF451、ZNF460、ZNF496、ZNF498、ZNF516、ZNF521、ZNF532、ZNF536、ZNF546、ZNF552、ZNF563、ZNF576、ZNF580、ZNF596、ZNF621、ZNF628、ZNF648、ZNF649、ZNF652、ZNF655、ZNF664、ZNF668、ZNF687、ZNF692、ZNF696、ZNF697、ZNF710、ZNF80、ZNF91、ZNF92、ZNRD1、ZSCAN10、ZSCAN16、ZSCAN20、ZSCAN21、ZXDC和ZZZ3。
在一些情况下，细胞内结构域是转录因子。合适的转录因子包括，例如，ASCL1、BRN2、CDX2、CDX4、CTNNB1、EOMES、JUN、FOS、HNF4a、HOXA(例如，HOXA1、HOXA2、HOXA3、HOXA4、HOXA5、HOXA10、HOXA11、HOXA13)、HOXB(例如，HOXB9)、HOXC(例如，HOXC4、HOXC5、HOXC6、HOXC8、HOXC9、HOXC10、HOXC11、HOXC12、HOXC13)、HOXD(例如，HOXD1、HOXD3、HOXD4、HOXD8、HOXD9、HOXD10、HOXD11、HOXD12、HOXD13)、SNAI1-3、MYOD1、MYOG、NEUROD1-6(例如，NEUROD1、NEUROD2、NEUROD4、NEUROD6)、PDX1、PU.1、SOX2、Nanog、Klf4、BCL-6、SOX9、STAT1-6、TBET、TCF、TEAD1-4(例如，TEAD1、TEAD2、TEAD3、TEAD4)、TAF6L、CLOCK、CREB、GATA3、IRF7、MycC、NFkB、RORyt、RUNX1、SRF、TBX21、NFAT、MEF2D和FoxP3。
在一些情况下，细胞内结构域为在一种或多种免疫细胞中具有调控作用的转录因子(即，免疫细胞调控性转录因子)。合适的免疫细胞调控性转录因子包括，例如，2210012G02Rik、Akap8l、Appl2、Arid4b、Arid5b、Ash1l、Atf7、Atm、C430014K11Rik、Chd9、Dmtf1、Fos、Foxo1、Foxp1、Hmbox1、Kdm5b、Klf2、Mga、Mll1、Mll3、Myst4、Pcgf6、Rev3l、Scml4、Scp2、Smarca2、Ssbp2、Suhw4、Tcf7、Tfdp2、Tox、Zbtb20、Zbtb44、Zeb1、Zfml、Zfp1、Zfp319、Zfp329、Zfp35、Zfp386、Zfp445、Zfp518、Zfp652、Zfp827、Zhx2、Eomes、Arntl、Bbx、Hbp1、Jun、Mef2d、Mterfd1、Nfat5、Nfe2l2、Nr1d2、Phf21a、Taf4b、Trf、Zbtb25、Zfp326、Zfp451、Zfp58、Zfp672、Egr2、Ikzf2、Taf1d、Chrac1、Dnajb6、Aplp2、Batf、Bhlhe40、Fosb、Hist1h1c、Hopx、Ifih1、Ikzf3、Lass4、Lin54、Mxd1、Mxi1、Prdm1、Prf1、Rora、Rpa2、Sap30、Stat2、Stat3、Taf9b、Tbx21、Trps1、Xbp1、Zeb2、Atf3、Cenpc1、Lass6、Rb1、Zbtb41、Crem、Fosl2、Gtf2b、Irf7、Maff、Nr4a1、Nr4a2、Nr4a3、Obfc2a、Rbl2、Rel、Rybp、Sra1、Tgif1、Tnfaip3、Uhrf2、Zbtb1、Ccdc124、Csda、E2f3、Epas1、H1f0、H2afz、Hif1a、Ikzf5、Irf4、Nsbp1、Pim1、Rfc2、Swap70、Tfb1m、2610036L11Rik、5133400G04Rik、Apitd1、Blm、Brca1、Brip1、C1d、C79407、Cenpa、Cfl1、Clspn、Ddx1、Dscc1、E2f7、E2f8、Ercc6l、Ezh2、Fen1、Foxm1、Gen1、Gsg2、H2afx、Hdac1、Hdgf、Hells、Hist1h1e、Hist3h2a、Hjurp、Hmgb2、Hmgb3、Irf1、Irf8、Kif22、Kif4、Lig1、Lmo2、Lnp、Mbd4、Mcm2、Mcm3、Mcm4、Mcm5、Mcm6、Mcm7、Mybl2、Neil3、Nusap1、Orc6l、Pola1、Pola2、Pole、Pole2、Polh、Polr2f、Polr2j、Ppp1r8、Prim2、Psmc3ip、Rad51、Rad51c、Rad54l、Rfc3、Rfc4、Rnps1、Rpa1、Smarcc1、Spic、Ssrp1、Taf9、Tfdp1、Tmpo、Topbp1、Trdmt1、Uhrf1、Wdhd1、Whsc1、Zbp1、Zbtb32、Zfp367、Car1、Polg2、Atr、Lef1、Myc、Nucb2、Satb1、Taf1a、Ift57、Apex1、Chd7、Chtf8、Ctnnb1、Etv3、Irf9、Myb、Mybbp1a、Pms2、Preb、Sp110、Stat1、Trp53、Zfp414、App、Cdk9、Ddb1、Hsf2、Lbr、Pa2g4、Rbms1、Rfc1、Rfc5、Tada2l、Tex261、Xrcc6等。
在一些情况下，转录因子可以是人工转录因子(ATF)，包括但不限于例如，基于锌指的人工转录因子(包括，例如，Sera T.Adv Drug Deliv Rev.2009 61(7-8):513-26；Collins等人Curr Opin Biotechnol.2003 14(4):371-8；Onori等人BMC Mol Biol.201314:3中所述的那些，其公开内容全文以引用方式并入本文中)。
例如，在一些情况下，细胞内结构域包含与图37中所示的细胞凋亡拮抗转录因子(AATF)氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图38中所示的基本转录激活蛋白(ABT1)氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图39中所示的脂肪细胞增强子结合蛋白2氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图40中所示的转录激活因子1(ATF1)氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图41中所示的转录调控蛋白BACH1氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图42中所示的E类碱性螺旋-环-螺旋蛋白41氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图43中所示的含溴结构域蛋白氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图44中所示的CCAAT/增强子结合蛋白ζ氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图45中所示的染色质域-解旋酶-DNA-结合蛋白1氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图46中所示的死亡诱导终结因子1同种型c氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图47中所示的蛋白Dr1氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图48中所示的早期生长反应蛋白1氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图49中所示的ETS相关转录因子Elf-2氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图50中所示的雌激素受体氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图51中所示的包含锌指和BTB结构域的蛋白质7A的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图52中所示的四个半LIM结构域蛋白1的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图53中所示的叉头框蛋白P3的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图54中所示的GA结合蛋白α链的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图55中所示的肝性白血病因子氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图56中所示的HOP氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图57中所示的DNA结合蛋白抑制剂ID-1氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图58中所示的DNA结合蛋白抑制剂ID-2(显性负性螺旋-环-螺旋)氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图59中所示的干扰素调控因子1氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图60中所示的Krueppel样因子12氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图61中所示的LIM结构域结合蛋白1氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图62中所示的LIM/同源框蛋白Lhx1氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图63中所示的锌指转录因子E2S-VP64氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与以下氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：VDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGS DALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSGGSGGSGGSLEIEAAFLE RENTALETRVAELRQRVQRLRNRVSQYRTRYGPLGGGK(SEQ ID NO:67)；并且具有105-115个氨基酸(例如，105、106、107、108、109、110、111、112、113、114或115个氨基酸)的长度。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图64中所示的GAL4 DNA结合结构域氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与以下氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：LEIRAAFLRQRNTALRTEVAELEQEVQRLENEVSQYETRYGPLGGGKGGSGGSGGSMKLLSSIEQACDICRLKKLKCSKEKPKCAKCLKNNWECRYSPKTKRSPLTRAHLTEVESRLERLEQLFLLIFPREDLDMILKMDSLQDIKALLTGLFVQDNVNKDAVTDRLASVETDMPLTLRQHRISATSSSEESSNKGQRQLTVSAA(SE Q ID NO:68)；并且具有200个氨基酸至210个氨基酸(例如，200、201、202、203、204、205、206、207、208、209或210个氨基酸)的长度。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图65中所示的信号转导和转录激活蛋白3(STAT3)氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图66中所示的Myc氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图67中所示的ASCL1氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图68中所示的CDX2氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图69中所示的CREB1氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图70中所示的CTNNB1氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图71中所示的EOMES氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图72中所示的Fos氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图73中所示的GATA3氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图74中所示的HOXA1氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图75中所示的干扰素调控因子7(IRF7)氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图76中所示的Jun氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图77中所示的肌细胞增强因子2D(MEF2D)氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图78中所示的神经元分化因子1(NEUROD1)氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图79中所示的NFAT氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图80中所示的NFκB氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图81中所示的SNAI1氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图82中所示的STAT1氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
作为另一实例，在一些情况下，细胞内结构域包含与图83中所示的TEAD1氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，细胞内结构域是转录激活蛋白。在一些情况下，细胞内结构域包含与以下四环素调控的转录激活蛋白(tTA)氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：MSRLDKSKVINSALELLNEVGIEGLTTRKLAQKLGVEQPTLYWHVKNKRALLDALAIEMLDRHHTHFCPLEGESWQDFLRNNAKSFRCALLSHRDGAKVHLGTRPTEKQYETLENQLAFLCQQGFSLENALYALSAVGHFTLGCVLEDQEHQVAKEERETPTTDSMPPLLRQAIELFDHQGAEPAFLFGLELIICGLEKQLKCESGGPADALDDFDLDMLPADALDDFDLDMLPADALDDFDLDMLPG(SEQ ID NO:69)；并且具有约245个氨基酸至252个氨基酸(例如，248、249、250、251或252个氨基酸)的长度。
在一些实施方案中，细胞内结构域是转录激活蛋白。在一些情况下，转录激活蛋白为GAL4-VP16。在一些情况下，转录激活蛋白为GAL4-VP64。在一些情况下，转录激活蛋白为Tbx21。在一些情况下，转录激活蛋白是工程化蛋白，诸如与效应子结构域诸如VP64(转录激活)或KRAB(转录阻遏)融合的基于锌指或TALE的DNA结合结构域。本领域中已知的多种其他转录反式激活蛋白是适用的。
在一些情况下，细胞内结构域包含与以下GAL4-VP64序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：MKLLSSIEQACDICRLKKLKCSKEKPKCAKCLKNNWECRYSPKTKRSPLTRAHLTEVESRLERLEQLFLLIFPREDLDMILKMDSLQDIKALLTGLFVQDNVNKDAVTDRLASVETDMPLTLRQHRISATSSSEESSNKGQRQLTVSAAAGGSGGSGGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGS(SEQ IDNO:70)；并且具有208至214个氨基酸(例如，208、209、210、211、212、213或214个氨基酸)的长度。
在一些情况下，细胞内结构域包含与以下Tbx21序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：MGIVEPGCGDMLTGTEPMPGSDEGRAPGADPQHRYFYPEPGAQDADERRGGGSLGSPYPGGALVPAPPSRFLGAYAYPPRPQAAGFPGAGESFPPPADAEGYQPGEGYAAPDPRAGLYPGPREDYALPAGLEVSGKLRVALNNHLLWSKFNQHQTEMIITKQGRRMFPFLSFTVAGLEPTSHYRMFVDVVLVDQHHWRYQSGKWVQCGKAEGSMPGNRLYVHPDSPNTGAHWMRQEVSFGKLKLTNNKGASNNVTQMIVLQSLHKYQPRLHIVEVNDGEPEAACNASNTHIFTFQETQFIAVTAYQNAEITQLKIDNNPFAKGFRENFESMYTSVDTSIPSPPGPNCQFLGGDHYSPLLPNQYPVPSRFYPDLPGQAKDVVPQAYWLGAPRDHSYEAEFR AVSMKPAFLPSAPGPTMSYYRGQEVLAPGAGWPVAPQYPPKMGPASWFRPMRTLPMEPGPGGSEGRGPEDQGPPLVWTEIAPIRPESSDSGLGEGDSKRRRVSPYPSSGDSSSPAGAPSPFDKEAEGQFYNYFPN(SEQ ID NO:71)；并且具有530个氨基酸至540个氨基酸(例如，530、531、532、533、534、535、536、537、538、539或540个氨基酸)的长度。
在一些情况下，细胞内结构域包含与以下MyoD氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：MELLSPPLRDIDLTGPDGSLCSFETADDFYDDPCFDSPDLRFFEDLDPRLVHMGALLKPEEHAHFPTAVHPGPGAREDEHVRAPSGHHQAGRCLLWACKACKRKTTNADRRKAATMRERRRLSKVNEAFETLKRCTSSNPNQRLPKVEILRNAIRYIEGLQALLRDQDAAPPGAAAFYAPGPLPPGRGSEHYSGDSDASSPRSNCSDGMMDYSGPPSGPRRQNGYDTAYYSEAARESRPGKSAAVSSLDCLSSIVERISTDSPAAPALLLADAPPESPPGPPEGASLSDTEQGTQTPSPDAAPQCPAGSNPNAIYQVL(SEQ ID NO:72)；并且具有305至325个氨基酸(例如，305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324或325个氨基酸)的长度。
在一些情况下，细胞内结构域包括毒素。毒素的实例包括，例如，白喉毒素A片段、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒素A链、莫迪素A链、α-sacrin、某些油桐(Aleurites fordii)蛋白、某些石竹素(Dianthin)蛋白、美洲商陆(Phytolacca americana)蛋白(PAP、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Morodica charantia)抑制剂、麻疯树毒素(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(Saponaria officinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、丝林霉素(mitogillin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)和新霉素(neomycin)。在一些情况下，细胞内结构域包括通常通过II型分泌系统由细菌病原体分泌的蛋白质。在一些情况下，细胞内结构域包括来自III型(例如，沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、耶尔森菌属(Yersinia)、弧菌属(Vibrio))和IV型(例如，百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、嗜肺性军团杆菌(Legionella pneumophila)、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens))分泌系统的毒性细菌效应子。来自III型细菌分泌系统的毒性细菌效应子的实例包括，例如，VopQ、YopH等。参见，例如，Dean(2011)FEMS Microbiol.Rev.35:1100。来自IV型细菌分泌系统的毒性细菌效应子的实例包括，例如，百日咳毒素、CagA等。
在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域为激素。合适的激素的实例包括，例如，促红细胞生成素(EPO)、胰岛素、分泌素、胰高血糖素样肽1(GLP-1)等。此类激素的另外的实例包括但不限于活化素、抑制素、脂联素、脂肪组织衍生性激素、促肾上腺皮质激素、阿法诺肽(Afamelanotide)、刺豚鼠(agouti)信号传导肽、咽侧体抑制素(Allatostatin)、胰淀素(Amylin)、胰淀素家族、紧张素、心房钠尿肽、胃泌素、生长激素、缓激肽、脑源性神经营养因子、降钙素、缩胆囊素、睫状神经营养因子、促肾上腺皮质素释放激素、促皮质素、内皮肽(endothelian)、肠高血糖素、成纤维细胞生长因子15(FGF15)、GFG15/19、促卵泡激素、胃泌素、胃抑制肽、胃饥饿素、胰高血糖素、胰高血糖素样肽-1、促性腺激素、促性腺激素释放激素、粒细胞集落刺激因子、生长激素、生长激素释放激素、铁调素、人绒毛膜促性腺激素、人胎盘催乳激素、肠促胰岛素、胰岛素、胰岛素类似物、门冬胰岛素、德谷胰岛素、甘精胰岛素(insulin glargine)、赖脯胰岛素(insulin lispro)、胰岛素样生长因子、胰岛素样生长因子-1、胰岛素样生长因子-2、瘦素、利拉鲁肽(liraglutide)、促黄体生成素、黑皮质素、黑色素细胞刺激素、α-黑色素细胞刺激素、melanotin II、小促胃液素(minigastrin)、脑钠肽的N末端激素原、神经生长因子、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、NPH胰岛素、肥胖抑制素、食欲素、骨钙素、胰激素、甲状旁腺素、肽激素、肽YY、血浆肾素活性、普兰林肽(pramlintide)、前激素原、催乳素、松弛素、松弛素家族肽激素、肾素、鲑降钙素(salcatonin)、分泌素、分泌素家族肽激素、辛卡利特(sincalide)、硬骨鱼瘦素、temporin、替莫瑞林(tesamorelin)、甲状腺刺激素、促甲状腺素释放激素、尿皮素、尿皮素II、尿皮素III、血管活性肠肽以及卵黄蛋白原。
在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域为生长因子。合适的生长因子的实例包括但不限于肝细胞刺激因子、浆细胞瘤生长因子、脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、神经营养因子3(NT3)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子(TGF)、血小板转化生长因子、乳生长因子、内皮生长因子(EGF)、内皮细胞衍生的生长因子(ECDGF)、α-内皮生长因子、β-内皮生长因子、神经营养生长因子、神经生长因子(NGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、4-1BB受体(4-1BBR)、TRAIL(TNF相关细胞凋亡诱导配体)、artemin(GFRα3-RET配体)、BCA-1(B细胞虏获趋化因子1)、B淋巴细胞趋化因子(BLC)、B细胞成熟蛋白(BCMA)、脑源性神经营养因子(BDNF)、骨生长因子诸如骨保护素(OPG)、骨源性生长因子、巨核细胞衍生的生长因子(MGDF)、角化细胞生长因子(KGF)、促血小板生成素、血小板衍生的生长因子(PGDF)、巨核细胞衍生的生长因子(MGDF)、角化细胞生长因子(KGF)、血小板衍生的生长因子(PGDF)、神经营养蛋白-2(NT-2)、神经营养蛋白-3(NT-3)、神经营养蛋白-4(NT-4)、神经营养蛋白-5(NT-5)、神经胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)、骨形态发生蛋白2(BMP2)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、集落刺激因子(CSF)等。
在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域为细胞因子。合适的细胞因子的实例包括例如，干扰素(例如，α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素)；白介素(例如，IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-17A、IL-18、IL-19、IL-20、IL-24)；肿瘤坏死因子(例如，TNF-α)；转化生长因子-β；TRAIL等。合适的细胞因子的实例还包括flexi-12(Anderson等人(1997)Hum.Gene Ther.8:1125)、组合了IL-12异源二聚体的两个多肽链的单链多肽)；IL-12superkine H9(Levin等人(2012)Nature 484:529)等等。
在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域为趋化因子。合适的趋化因子的实例包括，例如，MIP-1、MIP-1β、MCP-1、RANTES、IP10等。合适的趋化因子的另外实例包括但不限于趋化因子(C-C基序)配体-2(CCL2；也称为单核细胞趋化蛋白-1或MCP1)；趋化因子(C-C基序)配体-3(CCL3；也称为巨噬细胞炎性蛋白-1A或MIP1A)；趋化因子(C-C基序)配体-5(CCL5；也称为RANTES)；趋化因子(C-C基序)配体-17(CCL17；也称为胸腺和活化调节趋化因子或TARC)；趋化因子(C-C基序)配体-19(CCL19；也称为EBI1配体趋化因子或ELC)；趋化因子(C-C基序)配体-21(CCL21；也称为6Ckine)；C-C趋化因子受体7(CCR7)；趋化因子(C-X-C基序)配体9(CXCL9；也称为γ干扰素诱导的单核因子或MIG)；趋化因子(C-X-C基序)配体10(CXCL10；也称为干扰素γ-诱导蛋白10或IP-10)；趋化因子(C-X-C基序)配体11(CXCL11；也称为干扰素诱导型T细胞α趋化剂或I-TAC)；趋化因子(C-X-C基序)配体16(CXCL16；趋化因子(C基序)配体(XCL1；也称为淋巴细胞趋化蛋白)；以及巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)。
在一些情况下，结合触发的转录开关(例如，本公开的嵌合Notch受体多肽)的细胞内结构域为抗体(或抗体的抗原结合片段)。合适的抗体包括，例如，靶向α4β1和α4β7整联蛋白的α4亚基的那他珠单抗(Natalizumab)(Tysabri；Biogen Idec/Elan)(如MS和克隆氏病的治疗中所使用的)；靶向α4β7整联蛋白的维多珠单抗(Vedolizumab)(MLN2；MillenniumPharmaceuticals/Takeda)(如UC和克隆氏病的治疗中所使用的)；靶向BAFF的贝利木单抗(Belimumab)(Benlysta；Human Genome Sciences/GlaxoSmithKline)(如SLE的治疗中所使用的)；靶向BAFF和APRIL的阿塞西普(Atacicept)(TACI–Ig；Merck/Serono)(如SLE的治疗中所使用的)；靶向CD2的阿法赛特(Alefacept)(Amevive；Astellas)(如斑块型银屑病、GVHD的治疗中所使用的)；靶向CD3的奥昔珠单抗(Otelixizumab)(TRX4；Tolerx/GlaxoSmithKline)(如T1D的治疗中所使用的)；靶向CD3的替利珠单抗(Teplizumab)(MGA031；MacroGenics/Eli Lilly)(如T1D的治疗中所使用的)；靶向CD20的利妥昔单抗(Rituximab)(Rituxan/Mabthera；Genentech/Roche/Biogen Idec)(如非霍奇金淋巴瘤、RA(对TNF阻断应答不足的患者)和CLL的治疗中所使用的)；靶向CD20的奥法木单抗(Ofatumumab)(Arzerra；Genmab/GlaxoSmithKline)(如CLL、RA的治疗中所使用的)；靶向CD20的奥瑞珠单抗(Ocrelizumab)(2H7；Genentech/Roche/Biogen Idec)(如RA和SLE的治疗中所使用的)；靶向CD22的依帕珠单抗(Epratuzumab)(hLL2；Immunomedics/UCB)(如SLE和非霍奇金淋巴瘤的治疗中所使用的)；靶向CD52的阿仑单抗(Alemtuzumab)(Campath/MabCampath；Genzyme/Bayer)(如CLL、MS的治疗中所使用的)；靶向CD80和CD86的阿巴他塞(Abatacept)(Orencia；Bristol-Myers Squibb)(如RA和JIA、UC和克隆氏病、SLE的治疗中所使用的)；靶向C5补体蛋白的依库珠单抗(Eculizumab)(Soliris；Alexionpharmaceuticals)(如阵发性睡眠性血红蛋白尿症的治疗中所使用的)；靶向IgE的奥马珠单抗(Omalizumab)(Xolair；Genentech/Roche/Novartis)(如中度至重度持续性过敏性哮喘的治疗中所使用的)；靶向IL-1β的卡那津单抗(Canakinumab)(Ilaris；Novartis)(如冷吡啉相关的周期性综合征、全身型JIA、新生儿发病的多系统炎症性疾病和急性痛风的治疗中所使用的)；靶向IL-5的美泊利单抗(Mepolizumab)(Bosatria；GlaxoSmithKline)(如嗜酸细胞过多综合征的治疗中所使用的)；靶向IL-5的瑞利珠单抗(Reslizumab)(SCH55700；Ception Therapeutics)(如嗜酸细胞性食管炎的治疗中所使用的)；靶向IL-6R的托珠单抗(Tocilizumab)(Actemra/RoActemra；Chugai/Roche)(如RA、JIA的治疗中所使用的)；靶向IL-12和IL-23的优特克单抗(Ustekinumab)(Stelara；Centocor)(如斑块型银屑病、牛皮癣性关节炎、克隆氏病的治疗中所使用的)；靶向IL-12和IL-23的贝伐珠单抗(Briakinumab)(ABT-874；Abbott)(如银屑病和斑块型银屑病的治疗中所使用的)；靶向TNF的依那西普(Etanercept)(Enbrel；Amgen/Pfizer)(如RA、JIA、牛皮癣性关节炎、AS和斑块型银屑病的治疗中所使用的)；靶向TNF的英夫利昔单抗(Infliximab)(Remicade；Centocor/Merck)(如克隆氏病、RA、牛皮癣性关节炎、UC、AS和斑块型银屑病的治疗中所使用的)；靶向TNF的阿达木单抗(Adalimumab)(Humira/Trudexa；Abbott)(如RA、JIA、牛皮癣性关节炎、克隆氏病、AS和斑块型银屑病的治疗中所使用的)；靶向TNF的赛妥珠单抗(Certolizumab pegol)(Cimzia；UCB)(如克隆氏病和RA的治疗中所使用的)；靶向TNF的戈利木单抗(Golimumab)(Simponi；Centocor)(如RA、牛皮癣性关节炎和AS的治疗中所使用的)等等。在一些情况下，其产生由本公开的synNotch多肽的细胞内结构域诱导的抗体是用于癌症的治疗的治疗性抗体。此类抗体包括，例如，靶向CTLA-4的依匹单抗(Ipilimumab)(如黑素瘤、前列腺癌、RCC的治疗中所使用的)；靶向CTLA-4的曲美目单抗(Tremelimumab)(如CRC、胃癌、黑素瘤、NSCLC的治疗中所使用的)；靶向PD-1的纳武单抗(Nivolumab)(如黑素瘤、NSCLC、RCC的治疗中所使用的)；靶向PD-1的MK-3475(如黑素瘤的治疗中所使用的)；靶向PD-1的皮地利珠单抗(Pidilizumab)(如血液恶性肿瘤的治疗中所使用的)；靶向PD-L1的BMS-936559(如黑素瘤、NSCLC、卵巢癌、RCC的治疗中所使用的)；靶向PD-L1的MEDI4736；靶向PD-L1的MPDL33280A(如黑素瘤的治疗中所使用的)；靶向CD20的利妥昔单抗(Rituximab)(如非霍奇金淋巴瘤的治疗中所使用的)；替伊莫单抗(Ibritumomab tiuxetan)和托西莫单抗(tositumomab)(如淋巴瘤的治疗中所使用的)；靶向CD30的本妥昔单抗(Brentuximabvedotin)(如霍奇金淋巴瘤的治疗中所使用的)；靶向CD33的吉妥单抗(Gemtuzumabozogamicin)(如急性骨髓性白血病的治疗中所使用的)；靶向CD52的阿仑单抗(如慢性淋巴细胞性白血病的治疗中所使用的)；靶向EpCAM的IGN101和阿德木单抗(adecatumumab)(如上皮性肿瘤(乳房、结肠和肺部)的治疗中所使用的)；靶向CEA的拉贝珠单抗(Labetuzumab)(如乳房、结肠和肺部肿瘤的治疗中所使用的)；靶向gpA33的huA33(如结肠直肠癌的治疗中所使用的)；靶向粘蛋白的帕尼单抗(Pemtumomab)和奥戈伏单抗(oregovomab)(如乳房、结肠、肺部和卵巢肿瘤的治疗中所使用的)；靶向TAG-72的CC49(明瑞莫单抗(minretumomab))(如乳房、结肠和肺部肿瘤的治疗中所使用的)；靶向CAIX的cG250(如肾细胞癌的治疗中所使用的)；靶向PSMA的J591(如前列腺癌的治疗中所使用的)；靶向叶酸结合蛋白的MOv18和MORAb-003(法来妥珠单抗(farletuzumab))(如卵巢肿瘤的治疗中所使用的)；靶向神经节苷脂(诸如GD2、GD3和GM2)的3F8、ch14.18和KW-2871(如神经外胚层肿瘤和一些上皮性肿瘤的治疗中所使用的)；靶向Le y的hu3S193和IgN311(如乳房、结肠、肺部和前列腺肿瘤的治疗中所使用的)；靶向VEGF的贝伐珠单抗(Bevacizumab)(如肿瘤脉管系统的治疗中所使用的)；靶向VEGFR的IM-2C6和CDP791(如上皮来源的实体肿瘤的治疗中所使用的)；靶向整联蛋白_V_3的埃达珠单抗(Etaracizumab)(如肿瘤脉管系统的治疗中所使用的)；靶向整联蛋白_5_1的伏洛昔单抗(Volociximab)(如肿瘤脉管系统的治疗中所使用的)；靶向EGFR的西妥昔单抗(Cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)和806(如神经胶质瘤、肺部、乳房、结肠和头颈部肿瘤的治疗中所使用的)；靶向ERBB2的曲妥珠单抗(Trastuzumab)和帕妥珠单抗(pertuzumab)(如乳房、结肠、肺部、卵巢和前列腺肿瘤的治疗中所使用的)；靶向ERBB3的MM-121(如乳房、结肠、肺部、卵巢和前列腺肿瘤的治疗中所使用的)；靶向MET的AMG 102、METMAB和SCH 900105(如乳房、卵巢和肺部肿瘤的治疗中所使用的)；靶向IGF1R的AVE1642、IMC-A12、MK-0646、R1507和CP 751871(如神经胶质瘤、肺部、乳房、头颈部、前列腺和甲状腺癌的治疗中所使用的)；靶向EPHA3的KB004和IIIA4(如肺部、肾和结肠肿瘤、黑素瘤、神经胶质瘤和血液学恶性肿瘤的治疗中所使用的)；靶向TRAILR1的马帕木单抗(Mapatumumab)(HGS-ETR1)(如结肠、肺部和胰腺肿瘤以及血液学恶性肿瘤的治疗中所使用的)；靶向TRAILR2的HGS-ETR2和CS-1008；靶向RANKL的地诺单抗(Denosumab)(如前列腺癌和骨转移的治疗中所使用的)；靶向FAP的西罗珠单抗(Sibrotuzumab)和F19(如结肠、乳房、肺部、胰腺和头颈部肿瘤的治疗中所使用的)；靶向腱生蛋白的81C6(如神经胶质瘤、乳房和前列腺肿瘤的治疗中所使用的)；靶向的CD3的布利妥莫单抗(Blinatumomab)(Blincyto；Amgen)(如ALL的治疗中所使用的)；靶向PD-1的派姆单抗(pembrolizumab)，如癌症免疫疗法中所使用的；靶向c-Myc的9E10抗体等。
可整体或部分地用于结合触发的转录开关的抗体还包括但不限于8H9、阿巴伏单抗、阿昔单抗、Abituzumab、阿瑞鲁单抗、Actoxumab、Aducanumab、阿非莫单抗、阿托珠单抗、培戈-阿珠单抗、ALD518、阿利库单抗、喷替酸阿妥莫单抗、Amatuximab、麻安莫单抗、Anetumab ravtansine、Anifrolumab、安芦珠单抗、阿泊珠单抗、阿西莫单抗、Ascrinvacumab、阿塞珠单抗、阿特珠单抗、阿替奴单抗、托珠单抗、阿托木单抗、巴匹珠单抗、巴利昔单抗、巴维昔单抗、贝妥莫单抗、Begelomab、本雷利珠单抗、柏替利木单抗、贝西索单抗、贝伐珠单抗、贝洛托舒单抗、比西单抗、比玛卢单抗、比美吉珠单抗、莫-比伐珠单抗、布洛索珠单抗、伯考赛珠单抗、维汀-本妥昔单抗、布罗鲁单抗、Brolucizumab、布隆妥珠单抗、莫-坎妥珠单抗、拉-坎妥珠单抗、卡普赛珠单抗、卡罗单抗喷地肽、卡鲁单抗、卡妥索单抗、cBR96-阿霉素免疫偶联物、西利珠单抗、Ch.14.18、泊-西他珠单抗、西妥木单抗、克拉吉珠单抗、克立昔单抗、泰坦-克利伐珠单抗、考曲妥珠单抗、联合利妥昔单抗、可那木单抗、康西组单抗、CR6261、克雷内治单抗、达西珠单抗、达利珠单抗、达妥珠单抗、培戈-达匹利珠单抗、达雷木单抗、Dectrekumab、登西珠单抗、Denintuzumab mafodotin、Derlotuximabbiotin、地莫单抗、地努妥昔单抗、地瑞伏单抗、阿托度单抗、达洛珠单抗、杜利图单抗、度匹鲁单抗、Durvalumab、杜斯图单抗、依美昔单抗、埃巴单抗、依决洛单抗、依法利珠单抗、依芬古单抗、埃德鲁单抗、Elgemtumab、埃罗妥珠单抗、艾西莫单抗、依玛妥珠单抗、依米妥珠单抗、依那妥珠单抗、维汀-恩弗妥单抗、培戈-赖莫单抗、Enoblituzumab、依诺吉珠单抗、依诺苏单抗、恩司昔单抗、西-依匹莫单抗、厄利珠单抗、厄马索单抗、依卓利珠单抗、Evinacumab、依伏库单抗、艾韦单抗、法索单抗、法拉莫单抗、法拉图组单抗、法希姆单抗、FBTA05、非维珠单抗、非扎奴单抗、费希腊妥单抗、芬妥木单抗、菲瑞伏单抗、弗兰托单抗、夫来库单抗、芳妥珠单抗、弗罗鲁单抗、福拉韦单抗、夫苏木单抗、弗兰单抗、弗图希单抗、加利昔单抗、盖尼塔单抗、盖坦德单抗、加维莫单抗、加沃坦珠单抗、吉仁土希单抗、维汀-格仑妥木单抗、戈利昔单抗、古谢夫单抗、替伊立珠单抗、替伊立珠单抗、依库单抗、依达赛珠单抗、伊戈伏单抗、IMAB362、依玛鲁单抗、英西单抗、英戈土珠单抗、英克拉库单抗、依坦希单抗、Indusatumab vedotin、伊诺莫单抗、伊珠单抗奥佐米星、英妥木单抗、英妥木单抗、Isatuximab、依拓珠单抗、希凯珠单抗、凯利昔单抗、拉姆布罗力珠单抗、拉姆帕力珠单抗、来金珠单抗、来马索单抗、来齐鲁单抗、乐地单抗、来沙木单抗、利韦单抗、维汀-利法妥珠单抗、利格利珠单抗、Lilotomab satetraxetan、林妥珠单抗、立鲁单抗、罗德希珠单抗、Lokivetmab、劳乌土珠单抗、鲁卡木单抗、培戈-鲁利珠单抗、鲁利昔单抗、鲁瑞妥珠单抗、马格土希单抗、马司莫单抗、马妥珠单抗、美力姆单抗、美替木单抗、米拉珠单抗、明瑞莫单抗、Mirvetuximab soravtansine、米妥莫单抗、莫格穆里单抗、莫罗木单抗、免疫莫罗木单抗、莫他珠单抗、莫希土姆单抗、莫罗单抗-CD3、他那可单抗、纳米路单抗、他那莫单抗、纳瑞特单抗、奈巴库单抗、奈昔木单抗、Nemolizumab、奈瑞莫单抗、耐西维单抗、疏诺莫单抗、奥托昔单抗、奥比妥珠单抗、奥卡土珠单抗、奥度莫单抗、奥拉图单抗、奥鲁凯珠单抗、欧那土珠单抗、欧土希珠单抗、奥匹奴单抗、莫奥珠单抗、奥泰单抗、奥特乐土珠单抗、欧西鲁单抗、欧赞尼珠单抗、欧左立珠单抗、帕昔单抗、帕利珠单抗、帕尼库单抗、帕诺库单抗、帕萨土珠单抗、帕考珠单抗、帕妥昔珠单抗、帕特立珠单抗、帕图单抗、培拉凯珠单抗、培克珠单抗、维汀-平尼土珠单抗、平妥莫单抗、普拉库鲁单抗、维汀-普拉土珠单抗、拍珠单抗、普立昔单抗、普陀希单抗、普立木单抗、PRO 140、坤立珠单抗、雷库图单抗、雷德图单抗、雷韦单抗、劳赛珠单抗、雷莫芦单抗、雷珠单抗、雷昔库单抗、Refanezumab、瑞加韦单抗、利妥木单抗、Rinucumab、罗妥木单抗、罗勒杜单抗、罗姆苏珠单抗、罗利珠单抗、罗维珠单抗、鲁利珠单抗、Sacituzumab govitecan、沙玛立珠单抗、沙鲁单抗、沙妥莫单抗、司库钦单抗、司瑞斑图单抗、斯图希单抗、司韦单抗、SGN-CD19A、SGN-CD33A、西法木单抗、西图希单抗、西姆土珠单抗、西利珠单抗、希瑞库单抗、维汀-索菲妥珠单抗、苏兰珠单抗、苏力图单抗、松普希珠单抗、松妥珠单抗、司他芦单抗、硫索单抗、索维单抗、他贝鲁单抗、他珠单抗、他度珠单抗、他利珠单抗、他尼珠单抗、帕他莫单抗、他瑞妥单抗、替非珠单抗、阿替莫单抗、替妥莫单抗、替奈昔单抗、替普单抗、Tesidolumab、Tetulomab、TGN1412、替西木单抗/曲美木单抗、替加珠单抗、替曲吉珠单抗、TNX-650、托利珠单抗、托萨托舒单抗、托维图单抗、曲洛青木单抗、TRBS07、曲加立珠单抗、Trevogrumab、西莫白介素单抗、妥韦单抗、乌波利土西单抗、乌洛鲁单抗、乌瑞鲁单抗、乌珠单抗、Vandortuzumab vedotin、伐提克图单抗、伐努赛珠单抗、伐利昔单抗、伐利鲁单抗、维特立珠单抗、维妥珠单抗、维帕莫单抗、维西库单抗、维西珠单抗、伏妥土珠单抗、伏妥昔单抗、扎芦木单抗、扎木单抗、扎土希单抗、齐拉木单抗、阿佐莫单抗等。
在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域为神经肽。合适的神经肽的实例包括但不限于N-乙酰基天冬氨酰谷氨酸、刺豚鼠相关肽、α-内啡肽、大强啡肽、铃蟾肽、铃蟾肽样肽、卡贝缩宫素、可卡因和安非他明调节的转录物(CART)、缩胆囊素、昆虫神经肽(corazonin)、促肾上腺皮质激素样中间肽、皮质抑素、去氨缩宫素(demoxytocin)、强啡肽A、强啡肽B、章鱼素、脑啡肽、甘丙肽、甘丙肽样肽、galmic、galnon、γ-内啡肽、饥饿素、hemopressin、亲吻促动素(kisspeptin)、神经激肽B、神经介肽B、神经介肽N、神经介肽S、神经介肽U、神经介肽S、神经介肽Y、神经肽Y、神经降压肽、痛敏素、opiorphin、食欲肽、食欲肽-A、催产素、泡蛙肽(physalaemin)、前速激肽原、直肠肽、脑啡肽原、促黑皮质素原(proopiomelanocortin)、蛋白质episteme、松弛肽-3、促生长素抑制素、物质P、TAC1、速激肽、加压素以及催产加压素。
由synNotch多肽的释放的细胞内结构域诱导的基因产物
在一些情况下，细胞内结构域为当在特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员结合时被释放时，在表达嵌合Notch多肽的细胞中诱导基因产物的产生的多肽。例如，在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域，当在特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员结合时被释放时，在表达嵌合Notch多肽的细胞中诱导基因产物(多肽；核酸)的产生。在一些情况下，基因产物为核酸。在一些情况下，基因产物为多肽。由释放的细胞内结构域诱导的多肽基因产物包括内源性多肽(例如，由细胞天然编码的多肽)和异源性多肽(例如，并非由细胞天然编码的多肽；由用于对细胞进行遗传修饰的异源性核酸编码的多肽)。由释放的细胞内结构域诱导的多肽基因产物包括分泌性多肽。由释放的细胞内结构域诱导的多肽基因产物包括细胞表面多肽。由释放的细胞内结构域诱导的多肽基因产物包括细胞内多肽(通常存在于细胞内的多肽，诸如转录因子)。由释放的细胞内结构域诱导的多肽基因产物包括受体、细胞因子、激素、生长因子、趋化因子、细胞表面多肽、转录因子(例如，转录激活蛋白；转录阻遏蛋白)、细胞凋亡诱导剂、细胞凋亡抑制剂、显性负性变体等等。其产生可由释放的细胞内结构域诱导的多肽基因产物包括转录激活蛋白、转录阻遏蛋白、嵌合抗原受体、T细胞受体(TCR)、第二嵌合Notch多肽、CAR、翻译调控子、免疫抑制受体、免疫抑制蛋白、免疫激活蛋白、细胞因子受体、趋化因子受体、DNA结合蛋白、表观遗传调控子(epigenetic regulator)、RNA引导的内切核酸酶(例如Cas9多肽)、无酶活性的Cas9多肽、位点特异性核酸酶、重组酶、诱导分化的转录因子、诱导去分化的转录因子等。
在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域，当在特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员结合时被释放时，在表达嵌合Notch多肽的细胞中诱导内源性基因产物的产生。内源性基因产物包括，例如，趋化因子、趋化因子受体、细胞因子、细胞因子受体、分化因子、生长因子、生长因子受体、激素、代谢酶、增殖诱导剂、受体、小分子第二信使合成酶、T细胞受体、转录激活蛋白、转录阻遏蛋白、转录激活蛋白、转录阻遏蛋白、翻译调控子、翻译激活蛋白、翻译阻遏蛋白、活化性免疫受体、细胞凋亡抑制剂、细胞凋亡诱导剂、免疫激活剂、免疫抑制剂以及抑制性免疫受体。
在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域，当在特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员结合时被释放时，在表达嵌合Notch多肽的细胞中诱导异源性基因产物的产生。异源性基因产物包括通常不由该细胞产生的基因产物。例如，可以用包括编码异源性基因产物的核苷酸序列的核酸对细胞进行遗传修饰。异源性基因产物包括，例如，趋化因子、趋化因子受体、嵌合抗原受体、细胞因子、细胞因子受体、分化因子、生长因子、生长因子受体、激素、代谢酶、病原体衍生蛋白、增殖诱导剂、受体、RNA引导性核酸酶、位点特异性核酸酶、小分子第二信使合成酶、T细胞受体、毒素衍生蛋白、转录激活蛋白、转录阻遏蛋白、转录激活蛋白、转录阻遏蛋白、翻译调控子、翻译激活蛋白、翻译阻遏蛋白、活化性免疫受体、抗体、细胞凋亡抑制剂、细胞凋亡诱导剂、工程化T细胞受体、免疫激活剂、免疫抑制剂、抑制性免疫受体、RNA引导的DNA结合蛋白、T细胞受体(TCR)、MESA多肽、TANGO多肽以及第二synNotch多肽(其中第二synNotch多肽不同于其细胞内结构域诱导第二synNotch多肽的产生的所述synNotch多肽)。
可由释放的细胞内结构域诱导的多肽基因产物包括分泌性多肽。分泌性多肽的非限制性实例包括，例如，IL-2、IL-7、TNFα、IL-12、GMCSF、EGF、TGFβ、IL-10、IL-17、IL-4、IL-5、IL-13、IFNα、IFNγ、HMG-B1、分泌性PTEN、Wnt以及单链抗体。可由释放的细胞内结构域诱导的多肽基因产物包括显性负性多肽。显性负性多肽的实例包括，例如，显性负性TGF-β受体；STAT3的显性负性变体，其包括影响用作显性负性变体的STAT3的DNA结合结构域的一个或多个突变；等等。
在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域，当在特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员结合时被释放时，在表达嵌合Notch多肽的细胞中诱导激素的产生。此类激素的实例包括，例如，促红细胞生成素(EPO)、胰岛素、分泌素、胰高血糖素样肽1(GLP-1)等。此类激素的另外的实例包括但不限于活化素、抑制素、脂联素、脂肪组织衍生性激素、促肾上腺皮质激素、阿法诺肽、刺豚鼠信号传导肽、咽侧体抑制素、胰淀素、紧张素、心房钠尿肽、胃泌素、生长激素、缓激肽、脑源性神经营养因子、降钙素、缩胆囊素、睫状神经营养因子、促肾上腺皮质素释放激素、促皮质素、内皮肽、肠高血糖素、成纤维细胞生长因子15(FGF15)、GFG15/19、促卵泡激素、胃泌素、胃抑制肽、胃饥饿素、胰高血糖素、胰高血糖素样肽-1、促性腺激素、促性腺激素释放激素、粒细胞集落刺激因子、生长激素、生长激素释放激素、铁调素、人绒毛膜促性腺激素、人胎盘催乳激素、肠促胰岛素、胰岛素、胰岛素类似物、门冬胰岛素、德谷胰岛素、甘精胰岛素、赖脯胰岛素、胰岛素样生长因子、胰岛素样生长因子-1、胰岛素样生长因子-2、瘦素、利拉鲁肽、促黄体生成素、黑皮质素、黑色素细胞刺激素、α-黑色素细胞刺激素、melanotin II、小促胃液素、脑钠肽的N末端激素原、神经生长因子、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、NPH胰岛素、肥胖抑制素、食欲素、骨钙素、胰激素、甲状旁腺素、肽激素、肽YY、血浆肾素活性、普兰林肽、前激素原、催乳素、松弛素、松弛素家族肽激素、肾素、鲑降钙素、分泌素、分泌素家族肽激素、辛卡利特、硬骨鱼瘦素、temporin、替莫瑞林、甲状腺刺激素、促甲状腺素释放激素、尿皮素、尿皮素II、尿皮素III、血管活性肠肽以及卵黄蛋白原。
在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域，当在特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员结合时被释放时，在表达嵌合Notch多肽的细胞中诱导生长因子的产生。此类生长因子的实例包括但不限于肝细胞刺激因子、浆细胞瘤生长因子、脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、神经营养因子3(NT3)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子(TGF)、血小板转化生长因子、乳生长因子、内皮生长因子(EGF)、内皮细胞衍生的生长因子(ECDGF)、α-内皮生长因子、β-内皮生长因子、神经营养生长因子、神经生长因子(NGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、4-1BB受体(4-1BBR)、TRAIL(TNF相关细胞凋亡诱导配体)、artemin(GFRα3-RET配体)、BCA-1(B细胞虏获趋化因子1)、B淋巴细胞趋化因子(BLC)、B细胞成熟蛋白(BCMA)、脑源性神经营养因子(BDNF)、骨生长因子诸如骨保护素(OPG)、骨源性生长因子、巨核细胞衍生的生长因子(MGDF)、角化细胞生长因子(KGF)、促血小板生成素、血小板衍生的生长因子(PGDF)、巨核细胞衍生的生长因子(MGDF)、角化细胞生长因子(KGF)、血小板衍生的生长因子(PGDF)、神经营养蛋白-2(NT-2)、神经营养蛋白-3(NT-3)、神经营养蛋白-4(NT-4)、神经营养蛋白-5(NT-5)、神经胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)、骨形态发生蛋白2(BMP2)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、集落刺激因子(CSF)等。
在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域，当在特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员结合时被释放时，在表达嵌合Notch多肽的细胞中诱导细胞因子的产生。此类细胞因子的实例包括例如，干扰素(例如，α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素)；白介素(例如，IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-17A、IL-18、IL-19、IL-20、IL-24)；肿瘤坏死因子(例如，TNF-α)；转化生长因子-β；TRAIL等。此类细胞因子的实例还包括flexi-12(Anderson等人(1997)Hum.Gene Ther.8:1125)、组合了IL-12异源二聚体的两个多肽链的单链多肽)；IL-12superkine H9(Levin等人(2012)Nature 484:529)等等。
在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域，当在特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员结合时被释放时，在表达嵌合Notch多肽的细胞中诱导趋化因子的产生。此类趋化因子的实例包括，例如，MIP-1、MIP-1β、MCP-1、RANTES、IP10等。合适的趋化因子的另外实例包括但不限于趋化因子(C-C基序)配体-2(CCL2；也称为单核细胞趋化蛋白-1或MCP1)；趋化因子(C-C基序)配体-3(CCL3；也称为巨噬细胞炎性蛋白-1A或MIP1A)；趋化因子(C-C基序)配体-5(CCL5；也称为RANTES)；趋化因子(C-C基序)配体-17(CCL17；也称为胸腺和活化调节趋化因子或TARC)；趋化因子(C-C基序)配体-19(CCL19；也称为EBI1配体趋化因子或ELC)；趋化因子(C-C基序)配体-21(CCL21；也称为6Ckine)；C-C趋化因子受体7(CCR7)；趋化因子(C-X-C基序)配体9(CXCL9；也称为γ干扰素诱导的单核因子或MIG)；趋化因子(C-X-C基序)配体10(CXCL10；也称为干扰素γ-诱导蛋白10或IP-10)；趋化因子(C-X-C基序)配体11(CXCL11；也称为干扰素诱导型T细胞α趋化剂或I-TAC)；趋化因子(C-X-C基序)配体16(CXCL16；趋化因子(C基序)配体(XCL1；也称为淋巴细胞趋化蛋白)；以及巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)。
在一些情况下，本公开的结合触发的转录开关(例如嵌合Notch受体多肽)的细胞内结构域，当在特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员结合时被释放时，在表达嵌合Notch多肽的细胞中诱导抗体的产生。此类抗体包括，例如，靶向α4β1和α4β7整联蛋白的α4亚基的那他珠单抗(Tysabri；Biogen Idec/Elan)(如MS和克隆氏病的治疗中所使用的)；靶向α4β7整联蛋白的维多珠单抗(MLN2；Millennium Pharmaceuticals/Takeda)(如UC和克隆氏病的治疗中所使用的)；靶向BAFF的贝利木单抗(Benlysta；Human GenomeSciences/GlaxoSmithKline)(如SLE的治疗中所使用的)；靶向BAFF和APRIL的阿塞西普(TACI–Ig；Merck/Serono)(如SLE的治疗中所使用的)；靶向CD2的阿法赛特(Amevive；Astellas)(如斑块型银屑病、GVHD的治疗中所使用的)；靶向CD3的奥昔珠单抗(TRX4；Tolerx/GlaxoSmithKline)(如T1D的治疗中所使用的)；靶向CD3的替利珠单抗(MGA031；MacroGenics/Eli Lilly)(如T1D的治疗中所使用的)；靶向CD20的利妥昔单抗(Rituxan/Mabthera；Genentech/Roche/Biogen Idec)(如非霍奇金淋巴瘤、RA(对TNF阻断应答不足的患者)和CLL的治疗中所使用的)；靶向CD20的奥法木单抗(Arzerra；Genmab/GlaxoSmithKline)(如CLL、RA的治疗中所使用的)；靶向CD20的奥瑞珠单抗(2H7；Genentech/Roche/Biogen Idec)(如RA和SLE的治疗中所使用的)；靶向CD22的依帕珠单抗(hLL2；Immunomedics/UCB)(如SLE和非霍奇金淋巴瘤的治疗中所使用的)；靶向CD52的阿仑单抗(Campath/MabCampath；Genzyme/Bayer)(如CLL、MS的治疗中所使用的)；靶向CD80和CD86的阿巴他塞(Orencia；Bristol-Myers Squibb)(如RA和JIA、UC和克隆氏病、SLE的治疗中所使用的)；靶向C5补体蛋白的依库珠单抗(Soliris；Alexion pharmaceuticals)(如阵发性睡眠性血红蛋白尿症的治疗中所使用的)；靶向IgE的奥马珠单抗(Xolair；Genentech/Roche/Novartis)(如中度至重度持续性过敏性哮喘的治疗中所使用的)；靶向IL-1β的卡那津单抗(Ilaris；Novartis)(如冷吡啉相关的周期性综合征、全身型JIA、新生儿发病的多系统炎症性疾病和急性痛风的治疗中所使用的)；靶向IL-5的美泊利单抗(Bosatria；GlaxoSmithKline)(如嗜酸细胞过多综合征的治疗中所使用的)；靶向IL-5的瑞利珠单抗(SCH55700；Ception Therapeutics)(如嗜酸细胞性食管炎的治疗中所使用的)；靶向IL-6R的托珠单抗(Actemra/RoActemra；Chugai/Roche)(如RA、JIA的治疗中所使用的)；靶向IL-12和IL-23的优特克单抗(Stelara；Centocor)(如斑块型银屑病、牛皮癣性关节炎、克隆氏病的治疗中所使用的)；靶向IL-12和IL-23的贝伐珠单抗(ABT-874；Abbott)(如银屑病和斑块型银屑病的治疗中所使用的)；靶向TNF的依那西普(Enbrel；Amgen/Pfizer)(如RA、JIA、牛皮癣性关节炎、AS和斑块型银屑病的治疗中所使用的)；靶向TNF的英夫利昔单抗(Remicade；Centocor/Merck)(如克隆氏病、RA、牛皮癣性关节炎、UC、AS和斑块型银屑病的治疗中所使用的)；靶向TNF的阿达木单抗(Humira/Trudexa；Abbott)(如RA、JIA、牛皮癣性关节炎、克隆氏病、AS和斑块型银屑病的治疗中所使用的)；靶向TNF的赛妥珠单抗(Cimzia；UCB)(如克隆氏病和RA的治疗中所使用的)；靶向TNF的戈利木单抗(Simponi；Centocor)(如RA、牛皮癣性关节炎和AS的治疗中所使用的)等等。在一些情况下，其产生由本公开的synNotch多肽的细胞内结构域诱导的抗体是用于癌症的治疗的治疗性抗体。此类抗体包括，例如，靶向CTLA-4的依匹单抗(如黑素瘤、前列腺癌、RCC的治疗中所使用的)；靶向CTLA-4的曲美目单抗(如CRC、胃癌、黑素瘤、NSCLC的治疗中所使用的)；靶向PD-1的纳武单抗(如黑素瘤、NSCLC、RCC的治疗中所使用的)；靶向PD-1的MK-3475(如黑素瘤的治疗中所使用的)；靶向PD-1的皮地利珠单抗(如血液恶性肿瘤的治疗中所使用的)；靶向PD-L1的BMS-936559(如黑素瘤、NSCLC、卵巢癌、RCC的治疗中所使用的)；靶向PD-L1的MEDI4736；靶向PD-L1的MPDL33280A(如黑素瘤的治疗中所使用的)；靶向CD20的利妥昔单抗(如非霍奇金淋巴瘤的治疗中所使用的)；替伊莫单抗和托西莫单抗(如淋巴瘤的治疗中所使用的)；靶向CD30的本妥昔单抗(如霍奇金淋巴瘤的治疗中所使用的)；靶向CD33的吉妥单抗(如急性骨髓性白血病的治疗中所使用的)；靶向CD52的阿仑单抗(如慢性淋巴细胞性白血病的治疗中所使用的)；靶向EpCAM的IGN101和阿德木单抗(如上皮性肿瘤(乳房、结肠和肺部)的治疗中所使用的)；靶向CEA的拉贝珠单抗(如乳房、结肠和肺部肿瘤的治疗中所使用的)；靶向gpA33的huA33(如结肠直肠癌的治疗中所使用的)；靶向粘蛋白的帕尼单抗和奥戈伏单抗(如乳房、结肠、肺部和卵巢肿瘤的治疗中所使用的)；靶向TAG-72的CC49(明瑞莫单抗)(如乳房、结肠和肺部肿瘤的治疗中所使用的)；靶向CAIX的cG250(如肾细胞癌的治疗中所使用的)；靶向PSMA的J591(如前列腺癌的治疗中所使用的)；靶向叶酸结合蛋白的MOv18和MORAb-003(法来妥珠单抗)(如卵巢肿瘤的治疗中所使用的)；靶向神经节苷脂(诸如GD2、GD3和GM2)的3F8、ch14.18和KW-2871(如神经外胚层肿瘤和一些上皮性肿瘤的治疗中所使用的)；靶向Ley的hu3S193和IgN311(如乳房、结肠、肺部和前列腺肿瘤的治疗中所使用的)；靶向VEGF的贝伐珠单抗(如肿瘤脉管系统的治疗中所使用的)；靶向VEGFR的IM-2C6和CDP791(如上皮来源的实体肿瘤的治疗中所使用的)；靶向整联蛋白_V_3的埃达珠单抗(如肿瘤脉管系统的治疗中所使用的)；靶向整联蛋白_5_1的伏洛昔单抗(如肿瘤脉管系统的治疗中所使用的)；靶向EGFR的西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗和806(如神经胶质瘤、肺部、乳房、结肠和头颈部肿瘤的治疗中所使用的)；靶向ERBB2的曲妥珠单抗和帕妥珠单抗(如乳房、结肠、肺部、卵巢和前列腺肿瘤的治疗中所使用的)；靶向ERBB3的MM-121(如乳房、结肠、肺部、卵巢和前列腺肿瘤的治疗中所使用的)；靶向MET的AMG 102、METMAB和SCH 900105(如乳房、卵巢和肺部肿瘤的治疗中所使用的)；靶向IGF1R的AVE1642、IMC-A12、MK-0646、R1507和CP 751871(如神经胶质瘤、肺部、乳房、头颈部、前列腺和甲状腺癌的治疗中所使用的)；靶向EPHA3的KB004和IIIA4(如肺部、肾和结肠肿瘤、黑素瘤、神经胶质瘤和血液学恶性肿瘤的治疗中所使用的)；靶向TRAILR1的马帕木单抗(HGS-ETR1)(如结肠、肺部和胰腺肿瘤以及血液学恶性肿瘤的治疗中所使用的)；靶向TRAILR2的HGS-ETR2和CS-1008；靶向RANKL的地诺单抗(如前列腺癌和骨转移的治疗中所使用的)；靶向FAP的西罗珠单抗和F19(如结肠、乳房、肺部、胰腺和头颈部肿瘤的治疗中所使用的)；靶向腱生蛋白的81C6(如神经胶质瘤、乳房和前列腺肿瘤的治疗中所使用的)；靶向的CD3的布利妥莫单抗(Blincyto；Amgen)(如ALL的治疗中所使用的)；靶向PD-1的派姆单抗，如癌症免疫疗法中所使用的；靶向c-Myc的9E10抗体等。
可整体或部分地作为如本文所述的结合触发的转录开关的激活的结果而表达的抗体还包括但不限于8H9、阿巴伏单抗、阿昔单抗、Abituzumab、阿瑞鲁单抗、Actoxumab、Aducanumab、阿非莫单抗、阿托珠单抗、培戈-阿珠单抗、ALD518、阿利库单抗、喷替酸阿妥莫单抗、Amatuximab、麻安莫单抗、Anetumab ravtansine、Anifrolumab、安芦珠单抗、阿泊珠单抗、阿西莫单抗、Ascrinvacumab、阿塞珠单抗、阿特珠单抗、阿替奴单抗、托珠单抗、阿托木单抗、巴匹珠单抗、巴利昔单抗、巴维昔单抗、贝妥莫单抗、Begelomab、本雷利珠单抗、柏替利木单抗、贝西索单抗、贝伐珠单抗、贝洛托舒单抗、比西单抗、比玛卢单抗、比美吉珠单抗、莫-比伐珠单抗、布洛索珠单抗、伯考赛珠单抗、维汀-本妥昔单抗、布罗鲁单抗、Brolucizumab、布隆妥珠单抗、莫-坎妥珠单抗、拉-坎妥珠单抗、卡普赛珠单抗、卡罗单抗喷地肽、卡鲁单抗、卡妥索单抗、cBR96-阿霉素免疫偶联物、西利珠单抗、Ch.14.18、泊-西他珠单抗、西妥木单抗、克拉吉珠单抗、克立昔单抗、泰坦-克利伐珠单抗、考曲妥珠单抗、联合利妥昔单抗、可那木单抗、康西组单抗、CR6261、克雷内治单抗、达西珠单抗、达利珠单抗、达妥珠单抗、培戈-达匹利珠单抗、达雷木单抗、Dectrekumab、登西珠单抗、Denintuzumabmafodotin、Derlotuximab biotin、地莫单抗、地努妥昔单抗、地瑞伏单抗、阿托度单抗、达洛珠单抗、杜利图单抗、度匹鲁单抗、Durvalumab、杜斯图单抗、依美昔单抗、埃巴单抗、依决洛单抗、依法利珠单抗、依芬古单抗、埃德鲁单抗、Elgemtumab、埃罗妥珠单抗、艾西莫单抗、依玛妥珠单抗、依米妥珠单抗、依那妥珠单抗、维汀-恩弗妥单抗、培戈-赖莫单抗、Enoblituzumab、依诺吉珠单抗、依诺苏单抗、恩司昔单抗、西-依匹莫单抗、厄利珠单抗、厄马索单抗、依卓利珠单抗、Evinacumab、依伏库单抗、艾韦单抗、法索单抗、法拉莫单抗、法拉图组单抗、法希姆单抗、FBTA05、非维珠单抗、非扎奴单抗、费希腊妥单抗、芬妥木单抗、菲瑞伏单抗、弗兰托单抗、夫来库单抗、芳妥珠单抗、弗罗鲁单抗、福拉韦单抗、夫苏木单抗、弗兰单抗、弗图希单抗、加利昔单抗、盖尼塔单抗、盖坦德单抗、加维莫单抗、加沃坦珠单抗、吉仁土希单抗、维汀-格仑妥木单抗、戈利昔单抗、古谢夫单抗、替伊立珠单抗、替伊立珠单抗、依库单抗、依达赛珠单抗、伊戈伏单抗、IMAB362、依玛鲁单抗、英西单抗、英戈土珠单抗、英克拉库单抗、依坦希单抗、Indusatumab vedotin、伊诺莫单抗、伊珠单抗奥佐米星、英妥木单抗、英妥木单抗、Isatuximab、依拓珠单抗、希凯珠单抗、凯利昔单抗、拉姆布罗力珠单抗、拉姆帕力珠单抗、来金珠单抗、来马索单抗、来齐鲁单抗、乐地单抗、来沙木单抗、利韦单抗、维汀-利法妥珠单抗、利格利珠单抗、Lilotomab satetraxetan、林妥珠单抗、立鲁单抗、罗德希珠单抗、Lokivetmab、劳乌土珠单抗、鲁卡木单抗、培戈-鲁利珠单抗、鲁利昔单抗、鲁瑞妥珠单抗、马格土希单抗、马司莫单抗、马妥珠单抗、美力姆单抗、美替木单抗、米拉珠单抗、明瑞莫单抗、Mirvetuximab soravtansine、米妥莫单抗、莫格穆里单抗、莫罗木单抗、免疫莫罗木单抗、莫他珠单抗、莫希土姆单抗、莫罗单抗-CD3、他那可单抗、纳米路单抗、他那莫单抗、纳瑞特单抗、奈巴库单抗、奈昔木单抗、Nemolizumab、奈瑞莫单抗、耐西维单抗、疏诺莫单抗、奥托昔单抗、奥比妥珠单抗、奥卡土珠单抗、奥度莫单抗、奥拉图单抗、奥鲁凯珠单抗、欧那土珠单抗、欧土希珠单抗、奥匹奴单抗、莫奥珠单抗、奥泰单抗、奥特乐土珠单抗、欧西鲁单抗、欧赞尼珠单抗、欧左立珠单抗、帕昔单抗、帕利珠单抗、帕尼库单抗、帕诺库单抗、帕萨土珠单抗、帕考珠单抗、帕妥昔珠单抗、帕特立珠单抗、帕图单抗、培拉凯珠单抗、培克珠单抗、维汀-平尼土珠单抗、平妥莫单抗、普拉库鲁单抗、维汀-普拉土珠单抗、拍珠单抗、普立昔单抗、普陀希单抗、普立木单抗、PRO 140、坤立珠单抗、雷库图单抗、雷德图单抗、雷韦单抗、劳赛珠单抗、雷莫芦单抗、雷珠单抗、雷昔库单抗、Refanezumab、瑞加韦单抗、利妥木单抗、Rinucumab、罗妥木单抗、罗勒杜单抗、罗姆苏珠单抗、罗利珠单抗、罗维珠单抗、鲁利珠单抗、Sacituzumab govitecan、沙玛立珠单抗、沙鲁单抗、沙妥莫单抗、司库钦单抗、司瑞斑图单抗、斯图希单抗、司韦单抗、SGN-CD19A、SGN-CD33A、西法木单抗、西图希单抗、西姆土珠单抗、西利珠单抗、希瑞库单抗、维汀-索菲妥珠单抗、苏兰珠单抗、苏力图单抗、松普希珠单抗、松妥珠单抗、司他芦单抗、硫索单抗、索维单抗、他贝鲁单抗、他珠单抗、他度珠单抗、他利珠单抗、他尼珠单抗、帕他莫单抗、他瑞妥单抗、替非珠单抗、阿替莫单抗、替妥莫单抗、替奈昔单抗、替普单抗、Tesidolumab、Tetulomab、TGN1412、替西木单抗/曲美木单抗、替加珠单抗、替曲吉珠单抗、TNX-650、托利珠单抗、托萨托舒单抗、托维图单抗、曲洛青木单抗、TRBS07、曲加立珠单抗、Trevogrumab、西莫白介素单抗、妥韦单抗、乌波利土西单抗、乌洛鲁单抗、乌瑞鲁单抗、乌珠单抗、Vandortuzumab vedotin、伐提克图单抗、伐努赛珠单抗、伐利昔单抗、伐利鲁单抗、维特立珠单抗、维妥珠单抗、维帕莫单抗、维西库单抗、维西珠单抗、伏妥土珠单抗、伏妥昔单抗、扎芦木单抗、扎木单抗、扎土希单抗、齐拉木单抗、阿佐莫单抗等。
在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域，当在特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员结合时被释放时，在表达嵌合Notch多肽的细胞中诱导神经肽的产生。此类神经肽的实例包括但不限于N-乙酰基天冬氨酰谷氨酸、刺豚鼠相关肽、α-内啡肽、大强啡肽、铃蟾肽、铃蟾肽样肽、卡贝缩宫素、可卡因和安非他明调节的转录物(CART)、缩胆囊素、昆虫神经肽、促肾上腺皮质激素样中间肽、皮质抑素、去氨缩宫素、强啡肽A、强啡肽B、章鱼素、脑啡肽、甘丙肽、甘丙肽样肽、galmic、galnon、γ-内啡肽、饥饿素、hemopressin、亲吻促动素、神经激肽B、神经介肽B、神经介肽N、神经介肽S、神经介肽U、神经介肽S、神经介肽Y、神经肽Y、神经降压肽、痛敏素、opiorphin、食欲肽、食欲肽-A、催产素、泡蛙肽、前速激肽原、直肠肽、脑啡肽原、促黑皮质素原、蛋白质episteme、松弛肽-3、促生长素抑制素、物质P、TAC1、速激肽、加压素以及催产加压素。
在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域，当在特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员结合时被释放时，在表达嵌合Notch多肽的细胞中诱导转录调控子(例如，转录因子；转录诱导剂；转录阻遏蛋白)的产生。转录调控子的实例包括，例如，ABT1、ACYP2、AEBP1、AEBP2、AES、AFF1、AFF3、AHR、ANK1、ANK2、ANKFY1、ANKIB1、ANKRD1、ANKRD10、ANKRD2、ANKRD32、ANKRD46、ANKRD49、ANKRD56、ANKRD57、ANKS4B、AR、ARHGAP17、ARID1A、ARID1B、ARID3A、ARID4A、ARID5B、ARNT、ARNT2、ARNTL、ARNTL2、ARX、ASB10、ASB11、ASB12、ASB15、ASB2、ASB5、ASB8、ASB9、ASH1L、ASH2L、ASXL1、ASZ1、ATF1、ATF3、ATF4、ATF4、ATF5、ATF6、ATF7、ATF7IP、ATM、ATOH1、ATXN3、1300003B13RIK、B3GAT3、B930041F14RIK、BACH1、BACH2、BARX1、BARX2、BATF、BATF2、BATF3、BAZ2A、BBX、BC003267、BCL11A、BCL11B、BCL3、BCL6、BCL6B、BCLAF1、BCOR、BHLHA15、BHLHE40、BHLHE41、BLZF1、BMYC、BNC1、BNC2、BPNT1、BRCA1、BRWD1、BTBD11、BTF3、6030408C04RIK、CAMK4、CARHSP1、CARM1、CBX4、CBX7、CCNC、CCNH、CCNT1、CCNT2、CDC5L、CDK2、CDK4、CDK9、CDKN2C、CDX1、CDX1、CDX2、CEBPA、CEBPB、CEBPD、CEBPG、CEBPG、CEBPZ、CHD4、CHD7、CHGB、CIC、CIITA、CITED1、CITED2、CITED4、CLOCK、CLPB、CML3、CNOT7、COPS2、CREB1、CREB3、CREB3L1、CREB3L1、CREB3L2、CREB3L3、CREB5、CREBBP、CREBL2、CREM、CSDA、CSDA、CSDC2、CSDE1、CTBP2、CTCF、CTCFL、CTNNB1、CTNNBL1、CXXC1、D11BWG0517E、2300002D11RIK、DACH1、DAXX、DBP、DDIT3、DDX20、DDX54、DDX58、DEAF1、DEK、DIDO1、DLX2、DMRT1、DMRT2、DMRTB1、DNMT1、DNMT3A、DR1、DRG1、DUSP26、DYSFIP1、E2F1、E2F2、E2F3、E2F5、E2F6、EBF1、EBF2、EBF3、EBF3、EED、EGR1、EGR2、EGR3、EHF、EHMT2、EID2、ELAVL2、ELF1、ELF1、ELF2、ELF3、ELF4、ELF5、ELK3、ELK4、ELL2、EMX2、EMX2、EN2、ENPP2、EOMES、EP300、EPAS1、ERF、ERG、ESR1、ESRRA、ESRRB、ESRRG、ETS1、ETS2、ETV1、ETV3、ETV4、ETV5、ETV6、EVI1、EWSR1、EZH1、EZH2、FAH、FBXL10、FBXL11、FBXW7、FEM1A、FEM1B、FEM1C、FHL2、FLI1、FMNL2、FOS、FOSB、FOSL1、FOSL2、FOXA1、FOXA2、FOXA3、FOXC1、FOXD1、FOXD2、FOXD3、FOXF1、FOXF1A、FOXF2、FOXG1、FOXI1、FOXJ2、FOXJ3、FOXK1、FOXK2、FOXL1、FOXL2、FOXM1、FOXN1、FOXN2、FOXN3、FOXO1、FOXO3、FOXP1、FOXP2、FOXP3、FOXP4、FOXQ1、FUS、FUSIP1、2810021G02RIK、GABPA、GABPB1、GARNL1、GAS7、GATA1、GATA2、GATA3、GATA4、GATA5、GATA5、GATA6、GBX2、GCDH、GCM1、GFI1、GFI1B、GLI2、GLI3、GLIS1、GLIS2、GLIS3、GLS2、GMEB1、GMEB2、GRHL1、GRHL2、GRHL3、GRLF1、GTF2A1、GTF2B、GTF2E2、GTF2F1、GTF2F2、GTF2H2、GTF2H4、GTF2I、GTF2IRD1、GTF2IRD1、GZF1、HAND2、HBP1、HCLS1、HDAC10、HDAC11、HDAC2、HDAC5、HDAC9、HELZ、HES1、HES4、HES5、HES6、HEXIM1、HEY2、HEYL、HHEX、HHEX、HIC1、HIC2、HIF1A、HIF1AN、HIPK2、HIVEP1、HIVEP2、HIVEP2、HIVEP3、HLF、HLTF、HLX、HMBOX1、HMG20A、HMGA2、HMGB2、HMGB3、HNF1B、HNF4A、HNF4G、HOMEZ、HOXA10、HOXA11、HOXA13、HOXA2、HOXA3、HOXA4、HOXA5、HOXA6、HOXA7、HOXA9、HOXB1、HOXB2、HOXB3、HOXB4、HOXB6、HOXB7、HOXB8、HOXB9、HOXC10、HOXC10、HOXC11、HOXC5、HOXC6、HOXC8、HOXC9、HOXD8、HOXD9、HR、HSBP1、HSF2BP、HTATIP2、HTATSF1、HUWE1、5830417I10RIK、ID1、ID2、ID3、ID3、IFNAR2、IKBKB、IKBKG、IKZF1、IKZF2、IKZF3、IKZF4、IL31RA、ILF3、ING1、ING2、ING3、ING4、INSM1、INTS12、IQWD1、IRF1、IRF1、IRF2、IRF3、IRF4、IRF5、IRF6、IRF7、IRF8、IRF8、IRX1、IRX2、IRX3、IRX4、IRX5、ISL1、ISL2、ISX、ISX、IVNS1ABP、2810021J22RIK、JARID1A、JARID1B、JARID1C、JARID1D、JDP2、JUN、JUNB、JUND、KLF1、KLF10、KLF11、KLF12、KLF13、KLF15、KLF16、KLF2、KLF3、KLF3、KLF4、KLF5、KLF6、KLF7、KLF8、KLF9、KRR1、6330416L07RIK、L3MBTL2、LASS2、LASS4、LASS6、LBA1、LBH、LBX1、LCOR、LDB1、LDB2、LEF1、LHX1、LHX2、LHX5、LIMD1、LIN28、LMO1、LMO4、LMX1A、LSM11、LSM4、LYL1、9030612M13RIK、1810007M14RIK、3632451O06RIK、MAF、MAFA、MAFB、MAFF、MAFG、MAFK、MAGED1、MAP3K12、MAPK1、MAPK3、MAPK8、MAPK8IP1、MAX、MAZ、MBD2、MCM2、MCM4、MCM5、MCM6、MCM7、MECOM、MECP2、MED12、MED8、MEF2A、MEF2B、MEF2C、MEF2D、MEIS1、MEIS1、MEIS2、MEOX2、MESP2、MID1、MITF、MKI67IP、MKL1、MLL1、MLL3、MLLT10、MLLT3、MLX、MLXIP、MLXIPL、MNT、MNX1、MPL、MSC、MSRB2、MSX2、MTA3、MTF1、MTF2、MTPN、MXD1、MXD4、MXI1、MYB、MYBBP1A、MYBL2、MYC、MYCBP、MYCL1、MYCN、MYEF2、MYF6、MYNN、MYOCD、MYOD1、MYOG、MYST3、MYST4、MYT1L、MZF1、NAB1、NAB2、NANOG、NARG1、NCOA1、NCOA2、NCOA3、NCOR1、NCOR2、NDN、NEUROD1、NEUROD4、NEUROD6、NEUROG1、NEUROG2、NFAT5、NFATC1、NFATC2、NFATC2IP、NFATC3、NFATC3、NFATC4、NFE2、NFE2L1、NFE2L2、NFIA、NFIA、NFIB、NFIC、NFIL3、NFIX、NFKB1、NFKB2、NFKBIB、NFKBIE、NFKBIZ、NFX1、NFXL1、NFYA、NFYB、NHLH1、NKX2-2、NKX2-3、NKX2-5、NKX2-6、NKX6-2、NMI、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、NPAS1、NPAS2、NPAS3、NR0B1、NR0B2、NR1D1、NR1D2、NR1H3、NR1H4、NR1I2、NR1I3、NR2C1、NR2C2、NR2E3、NR2F1、NR2F2、NR2F6、NR3C1、NR3C2、NR4A1、NR4A2、NR4A2、NR4A3、NR5A1、NR5A2、NRARP、NRIP1、NRIP2、NSBP1、NSD1、NUDT12、NULL、NUPR1、1700065O13RIK、OLIG1、OLIG2、OLIG2、ONECUT1、ONECUT2、ONECUT3、ORC2L、OSGIN1、OSR1、OSR2、OSTF1、OVOL1、OVOL2、PAPOLA、PAPOLG、PAPPA2、PATZ1、PAWR、PAX2、PAX5、PAX6、PAX7、PAX8、PAX9、PBX1、PBX2、PBX3、PBX4、PCBD1、PCGF6、PDCD11、PDLIM4、PDX1、PEG3、PER1、PFDN1、PGR、PHF1、PHF10、PHF12、PHF13、PHF14、PHF20、PHF21A、PHF5A、PHF7、PHOX2A、PHOX2B、PIAS2、PIR、PITX1、PITX2、PKNOX1、PKNOX2、PLA2G6、PLAGL1、PLAGL2、PLRG1、PML、POGK、POLR2B、POLR2E、POLR2H、POLR3E、POLR3H、POLRMT、POU1F1、POU2AF1、POU2F1、POU2F2、POU3F2、POU3F3、POU3F3、POU5F1、POU6F1、PPARA、PPARD、PPARG、PPARGC1A、PPARGC1B、PPP1R12C、PPP1R13B、PPP1R16B、PPP1R1B、PPP2R1A、PPP3CB、PQBP1、PRDM1、PRDM14、PRDM15、PRDM16、PRDM2、PRDM4、PRDM5、PRDM6、PRDM8、PREB、PRKAR1A、PRKCBP1、PROX1、PRRX1、PRRX2、PSMC5、PSMD10、PSMD9、PTF1A、PTGES2、PURB、PWP1、RAB11A、RAB11B、RAB15、RAB18、RAB1B、RAB25、RAB8A、RAB8B、RAI14、RARA、RARB、RARG、RASSF7、RB1、RBBP7、RBL1、RBM14、RBM39、RBM9、RBPJ、RBPJL、RCOR2、REL、RELA、RELB、RERE、REST、REXO4、RFC1、RFX1、RFX2、RFX3、RFX5、RFX7、RFX8、RHOX5、RHOX6、RHOX9、RIPK4、RNF12、RNF14、RNF141、RNF38、RNF4、RORA、RORA、RORB、RORC、RPS6KA4、RREB1、RSRC1、RUNX1、RUNX1T1、RUNX2、RUNX2、RUNX3、RUVBL1、RUVBL2、RXRA、RXRG、RYBP、SAFB2、SALL1、SALL1、SALL2、SALL4、SAP30、SAP30BP、SATB1、SATB2、SATB2、SCAND1、SCAP、SCRT2、SEC14L2、SERTAD1、SF1、SFPI1、SFRS5、SH3D19、SH3PXD2B、SHANK3、SHOX2、SHPRH、SIN3A、SIN3B、SIRT2、SIRT3、SIRT5、SIX1、SIX1、SIX2、SIX3、SIX4、SIX5、SKI、SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD7、SMARCA1、SMARCA2、SMARCA5、SMARCB1、SMYD1、SNAI1、SNAI2、SNAPC2、SNAPC4、SNIP1、SOLH、SOX1、SOX10、SOX11、SOX12、SOX13、SOX15、SOX17、SOX18、SOX2、SOX21、SOX4、SOX5、SOX6、SOX7、SOX8、SOX9、SP1、SP110、SP140L、SP2、SP3、SP4、SP6、SP8、SPDEF、SPEN、SPI1、SPIB、SQSTM1、SREBF1、SREBF2、SREBF2、SRF、SSBP2、SSBP3、SSBP4、SSRP1、ST18、STAG1、STAT1、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT5B、STAT6、SUB1、SUZ12、TADA2L、TAF13、TAF5、TAF5L、TAF7、TAF9、TAL1、TAL1、TARDBP、TBPL1、TBR1、TBX1、TBX10、TBX15、TBX18、TBX2、TBX2、TBX20、TBX21、TBX3、TBX4、TBX5、TBX6、TCEA1、TCEA3、TCEAL1、TCEB3、TCERG1、TCF12、TCF15、TCF19、TCF20、TCF21、TCF21、TCF3、TCF4、TCF7、TCF7L2、TCFAP2A、TCFAP2B、TCFAP2C、TCFCP2L1、TCFE2A、TCFE3、TCFEB、TCFEC、TCFL5、TEAD1、TEAD2、TEAD3、TEAD4、TEF、TFAP2A、TFAP2C、TFCP2L1、TFDP2、TFEB、TFEC、TGFB1I1、TGIF1、TGIF2、TGIF2LX、THRA、THRAP3、THRB、THRSP、TIAL1、TLE1、TLE6、TMEM131、TMPO、TNFAIP3、TOB1、TOX4、TP63、TRERF1、TRIB3、TRIM24、TRIM28、TRIM30、TRIP13、TRIP4、TRIP6、TRP53、TRP53BP1、TRP63、TRPS1、TRPS1、TSC22D1、TSC22D2、TSC22D3、TSC22D4、TSHZ1、TSHZ1、TSHZ3、TTRAP、TUB、TULP4、TWIST1、TWIST2、TYSND1、UBE2W、UBN1、UBP1、UBTF、UGP2、UHRF1、UHRF2、UNCX、USF1、USF2、UTF1、VDR、VEZF1、VGLL2、VSX1、WASL、WHSC1、WHSC2、WT1、WWP1、WWTR1、XBP1、YAF2、YY1、ZBED1、ZBED4、ZBTB1、ZBTB10、ZBTB16、ZBTB16、ZBTB17、ZBTB2、ZBTB20、ZBTB22、ZBTB25、ZBTB32、ZBTB38、ZBTB4、ZBTB43、ZBTB45、ZBTB47、ZBTB7A、ZBTB7B、ZBTB7C、ZCCHC8、ZDHHC13、ZDHHC16、ZDHHC21、ZDHHC5、ZDHHC6、ZEB2、ANK2ZEB2、ZFHX2、ZFHX3、ZFHX4、ZFP105、ZFP110、ZFP143、ZFP148、ZFP161、ZFP192、ZFP207、ZFP219、ZFP238、ZFP263、ZFP275、ZFP277、ZFP281、ZFP287、ZFP292、ZFP35、ZFP354C、ZFP36、ZFP36L1、ZFP386、ZFP407、ZFP42、ZFP423、ZFP426、ZFP445、ZFP451、ATF5ZFP451、ZFP467、ZFP52、ZFP57、ZFP592、ZFP593、ZFP597、ZFP612、ZFP637、ZFP64、ZFP647、ZFP748、ZFP810、ZFP9、ZFP91、ZFPM1、ZFPM2、ZFX、ZHX2、ZHX3、ZIC1、ZIC2、ZIC3、ZIC4、ZIC5、ZKSCAN1、ZKSCAN3、ZMYND11、ZNF143、ZNF160、ZNF175、ZNF184、ZNF192、ZNF213、ZNF217、ZNF219、ZNF22、ZNF238、ZNF24、ZNF267、ZNF273、ZNF276、ZNF280D、ZNF281、ZNF292、ZNF311、ZNF331、ZNF335、ZNF337、ZNF33B、ZNF366、ZNF394、ZNF398、ZNF41、ZNF410、ZNF415、ZNF423、ZNF436、ZNF444、ZNF445、ZNF451、ZNF460、ZNF496、ZNF498、ZNF516、ZNF521、ZNF532、ZNF536、ZNF546、ZNF552、ZNF563、ZNF576、ZNF580、ZNF596、ZNF621、ZNF628、ZNF648、ZNF649、ZNF652、ZNF655、ZNF664、ZNF668、ZNF687、ZNF692、ZNF696、ZNF697、ZNF710、ZNF80、ZNF91、ZNF92、ZNRD1、ZSCAN10、ZSCAN16、ZSCAN20、ZSCAN21、ZXDC和ZZZ3。转录调控子的另外的实例如上所述。转录因子(转录激活蛋白；转录阻遏蛋白)的非限制性实例示出于图37-83中。例如，转录因子可包含与图37-83中的任一个中所示的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
如上所述的转录调控子的另外的实例包括但不限于在一种或多种免疫细胞中具有调控作用的转录因子(即，免疫细胞调控性转录因子)。合适的免疫细胞调控性转录因子包括，例如，2210012G02Rik、Akap8l、Appl2、Arid4b、Arid5b、Ash1l、Atf7、Atm、C430014K11Rik、Chd9、Dmtf1、Fos、Foxo1、Foxp1、Hmbox1、Kdm5b、Klf2、Mga、Mll1、Mll3、Myst4、Pcgf6、Rev3l、Scml4、Scp2、Smarca2、Ssbp2、Suhw4、Tcf7、Tfdp2、Tox、Zbtb20、Zbtb44、Zeb1、Zfml、Zfp1、Zfp319、Zfp329、Zfp35、Zfp386、Zfp445、Zfp518、Zfp652、Zfp827、Zhx2、Eomes、Arntl、Bbx、Hbp1、Jun、Mef2d、Mterfd1、Nfat5、Nfe2l2、Nr1d2、Phf21a、Taf4b、Trf、Zbtb25、Zfp326、Zfp451、Zfp58、Zfp672、Egr2、Ikzf2、Taf1d、Chrac1、Dnajb6、Aplp2、Batf、Bhlhe40、Fosb、Hist1h1c、Hopx、Ifih1、Ikzf3、Lass4、Lin54、Mxd1、Mxi1、Prdm1、Prf1、Rora、Rpa2、Sap30、Stat2、Stat3、Taf9b、Tbx21、Trps1、Xbp1、Zeb2、Atf3、Cenpc1、Lass6、Rb1、Zbtb41、Crem、Fosl2、Gtf2b、Irf7、Maff、Nr4a1、Nr4a2、Nr4a3、Obfc2a、Rbl2、Rel、Rybp、Sra1、Tgif1、Tnfaip3、Uhrf2、Zbtb1、Ccdc124、Csda、E2f3、Epas1、H1f0、H2afz、Hif1a、Ikzf5、Irf4、Nsbp1、Pim1、Rfc2、Swap70、Tfb1m、2610036L11Rik、5133400G04Rik、Apitd1、Blm、Brca1、Brip1、C1d、C79407、Cenpa、Cfl1、Clspn、Ddx1、Dscc1、E2f7、E2f8、Ercc6l、Ezh2、Fen1、Foxm1、Gen1、Gsg2、H2afx、Hdac1、Hdgf、Hells、Hist1h1e、Hist3h2a、Hjurp、Hmgb2、Hmgb3、Irf1、Irf8、Kif22、Kif4、Lig1、Lmo2、Lnp、Mbd4、Mcm2、Mcm3、Mcm4、Mcm5、Mcm6、Mcm7、Mybl2、Neil3、Nusap1、Orc6l、Pola1、Pola2、Pole、Pole2、Polh、Polr2f、Polr2j、Ppp1r8、Prim2、Psmc3ip、Rad51、Rad51c、Rad54l、Rfc3、Rfc4、Rnps1、Rpa1、Smarcc1、Spic、Ssrp1、Taf9、Tfdp1、Tmpo、Topbp1、Trdmt1、Uhrf1、Wdhd1、Whsc1、Zbp1、Zbtb32、Zfp367、Car1、Polg2、Atr、Lef1、Myc、Nucb2、Satb1、Taf1a、Ift57、Apex1、Chd7、Chtf8、Ctnnb1、Etv3、Irf9、Myb、Mybbp1a、Pms2、Preb、Sp110、Stat1、Trp53、Zfp414、App、Cdk9、Ddb1、Hsf2、Lbr、Pa2g4、Rbms1、Rfc1、Rfc5、Tada2l、Tex261、Xrcc6等。
在一些情况下，转录因子可以是人工转录因子(ATF)，包括但不限于例如，基于锌指的人工转录因子(包括，例如，Sera T.Adv Drug Deliv Rev.2009 61(7-8):513-26；Collins等人Curr Opin Biotechnol.2003 14(4):371-8；Onori等人BMC Mol Biol.201314:3中所述的那些，其公开内容全文以引用方式并入本文中)。
在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域，当在特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员结合时被释放时，在表达嵌合Notch多肽的细胞中诱导免疫受体(例如，活化性免疫受体或抑制性免疫受体)的产生。此类免疫受体的实例包括活化性免疫受体。合适的活化性免疫受体可包括基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。ITAM基序为YX1X2L/I，其中X1和X2独立地为任何氨基酸。合适的免疫受体可包括衍生自包含ITAM基序的多肽的包含ITAM基序的部分。例如，合适的免疫受体可包括来自任何包含ITAM基序的蛋白质的包含ITAM基序的结构域。因此，合适的免疫受体不必须包含其所衍生于的整个蛋白质的整个序列。合适的包含ITAM基序的多肽的实例包括但不限于：DAP12；FCER1G(Fcε受体Iγ链)；CD3D(CD3δ)；CD3E(CD3ε)；CD3G(CD3γ)；CD3Z(CD3ζ)；以及CD79A(抗原受体复合物相关蛋白α链)。合适的包含ITAM基序的多肽的另外的实例如上所述。
在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域，当在特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员结合时被释放时，在表达嵌合Notch多肽的细胞中诱导T细胞表面糖蛋白CD3δ链(也称为CD3D；CD3-δ；T3D；CD3抗原，δ亚基；CD3δ；CD3d抗原，δ多肽(TiT3复合物)；OKT3，δ链；T细胞受体T3δ链；T细胞表面糖蛋白CD3δ链等)的产生。在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域，当在特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员结合时被释放时，在表达嵌合Notch多肽的细胞中诱导T细胞表面糖蛋白CD3ε链(也称为CD3e、T细胞表面抗原T3/Leu-4ε链、T细胞表面糖蛋白CD3ε链、AI504783、CD3、CD3ε、T3e等)的产生。
在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域，当在特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员结合时被释放时，在表达嵌合Notch多肽的细胞中诱导共刺激多肽的产生。合适的共刺激多肽的非限制性实例包括但不限于4-1BB(CD137)、CD28、ICOS、OX-40、BTLA、CD27、CD30、GITR以及HVEM。合适的共刺激多肽的另外的实例如上所述。
在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域，当在特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员结合时被释放时，在表达嵌合Notch多肽的细胞中诱导抑制性免疫受体的产生。抑制性免疫受体可包括基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)、基于免疫受体酪氨酸的转换基序(ITSM)、NpxY基序或YXXΦ基序。合适的抑制性免疫受体包括PD1；CTLA4；BTLA；CD160；KRLG-1；2B4；Lag-3；以及Tim-3。参见，例如，Odorizzi和Wherry(2012)J.Immunol.188:2957；以及Baitsch等人(2012)PLoSOne 7:e30852。抑制性免疫受体的另外的实例如上所述。
在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域，当在特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员结合时被释放时，在表达嵌合Notch多肽的细胞中诱导重组酶的产生。重组酶的非限制性实例包括Cre重组酶、Flp重组酶、Dre重组酶等。重组酶的另外的实例为FLPe重组酶(参见，例如，Akbudak和Srivastava(2011)Mol.Biotechnol.49:82)。合适的重组酶为Flpo重组酶。重组酶的另外的实例如上所述。
在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域，当在特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员结合时被释放时，在表达嵌合Notch多肽的细胞中诱导位点特异性核酸酶的产生。位点特异性核酸酶的非限制性实例包括但不限于具有核酸酶活性的RNA引导的DNA结合蛋白，例如Cas9多肽；类转录激活蛋白效应子核酸酶(TALEN)；锌指核酸酶等。位点特异性核酸酶的另外的实例如上所述。
在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域，当在特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员结合时被释放时，在表达嵌合Notch多肽的细胞中诱导细胞凋亡诱导剂的产生。细胞凋亡诱导剂的非限制性实例为tBID多肽。术语“tBID”是指由胞质BID的酶促裂解(例如通过活性半胱天冬酶)得到的BH3相互作用死亡激动剂(BID)蛋白的C末端截短的片段。在细胞凋亡的早期，tBID移位至线粒体并介导Cyt c从其中的释放。tBID蛋白的非限制性实例包括人tBID(GenBank登录号CAG30275中提供的氨基酸序列的氨基酸61-195)。
在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域，当在特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员结合时被释放时，在表达嵌合Notch多肽的细胞中诱导结合触发的转录开关的产生。
在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域，当在特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员结合时被释放时，在表达嵌合Notch多肽的细胞中诱导TCR的产生。在一些情况下，TCR对抗原的表位具有特异性。此类抗原的实例包括，例如，肿瘤抗原；癌细胞相关抗原；血液学恶性肿瘤抗原；实体肿瘤抗原；细胞表面抗原(例如，由T细胞受体(TCR)靶向的细胞表面抗原；细胞内抗原等。血液学恶性肿瘤抗原的实例包括，例如，CD19(表达于例如B细胞中)、CD20(表达于例如B细胞中)、CD22(表达于例如B细胞中)、CD30(表达于例如B细胞中)、CD33(表达于例如骨髓细胞中)、CD70(表达于例如B细胞/T细胞中)、CD123(表达于例如骨髓细胞中)、κ(表达于例如B细胞中)、Lewis Y(表达于例如骨髓细胞中)、NKG2D配体(表达于例如骨髓细胞中)、ROR1(表达于例如B细胞中)、SLAMF7/CS1(表达于例如骨髓瘤细胞、自然杀伤细胞、T细胞以及大多数B细胞类型中)、CD138(表达于例如多发性骨髓瘤中的恶性浆细胞中)、CD56(表达于例如骨髓瘤细胞、神经细胞、自然杀伤细胞、T细胞和小梁成骨细胞中)、CD38(表达于例如B细胞/T细胞中)以及CD160(表达于例如NK细胞/T细胞中)等。实体肿瘤抗原的实例包括，例如，B7H3(表达于例如恶性毒瘤、神经胶质瘤中)、CAIX(表达于例如肾中)、CD44v6/v7(表达于例如子宫颈中)、CD171(表达于例如成神经细胞瘤中)、CEA(表达于例如结肠中)、EGFRvIII(表达于例如神经胶质瘤中)、EGP2(表达于例如癌中)、EGP40(表达于例如结肠中)、EphA2(表达于例如神经胶质瘤、肺中)、ErbB2(HER2)(表达于例如乳房、肺、前列腺、神经胶质瘤中)、ErbB受体家族(表达于例如乳房、肺、前列腺、神经胶质瘤中)、ErbB3/4(表达于例如乳房、卵巢中)、HLA-A1/MAGE1(表达于例如黑素瘤中)、HLA-A2/NY-ESO-1(表达于例如恶性毒瘤、黑素瘤中)、FR-a(表达于例如卵巢中)、(表达于例如癌症相关成纤维细胞中)、FAR(表达于例如横纹肌肉瘤中)、GD2(表达于例如成神经细胞瘤、恶性毒瘤、黑素瘤中)、GD3(表达于例如黑素瘤、肺癌中)、HMW-MAA(表达于例如黑素瘤中)、IL11Ra(表达于例如骨肉瘤中)、IL13Ra2(表达于例如神经胶质瘤中)、Lewis Y(表达于例如乳房/卵巢/胰腺中)、间皮素(表达于例如间皮瘤、乳房、胰腺中)、Muc1(表达于例如卵巢、乳房、前列腺中)、NCAM(表达于例如成神经细胞瘤、结肠直肠中)、NKG2D配体(表达于例如卵巢、恶性毒瘤中)、PSCA(表达于例如前列腺、胰腺中)、PSMA(表达于例如前列腺中)、TAG72(表达于例如结肠中)、VEGFR-2(表达于例如肿瘤脉管系统中)、Axl(表达于例如肺癌中)、Met(表达于例如肺癌中)、α5β3(表达于例如肿瘤脉管系统中)、α5β1(表达于例如肿瘤脉管系统中)、TRAIL-R1/TRAIL-R2(表达于例如实体肿瘤(结肠、肺、胰腺)和血液学恶性肿瘤中)、RANKL(表达于例如前列腺癌和骨转移中)、腱生蛋白(表达于例如神经胶质瘤、上皮性肿瘤(乳房、前列腺)中)、EpCAM(表达于例如上皮性肿瘤(乳房、结肠、肺)中)、CEA(表达于例如上皮性肿瘤(乳房、结肠、肺)中)、gpA33(表达于例如结肠直肠癌中)、粘蛋白(表达于例如上皮性肿瘤(乳房、结肠、肺、卵巢)中)、TAG-72(表达于例如上皮性肿瘤(乳房、结肠、肺)中)、EphA3(表达于例如肺、肾、黑素瘤、神经胶质瘤、血液学恶性肿瘤中)以及IGF1R(表达于例如肺、乳房、头颈部、前列腺、甲状腺、神经胶质瘤中)。表面和细胞内抗原的实例包括，例如，Her2(基因符号ERBB2)、MAGE-A1(基因符号MAGEA1)、MART-1(基因符号MLANA)、NY-ESO(基因符号CTAG1)、WT1(基因符号WT1)、MUC17和MUC13。其他抗原的实例包括，例如，BCMA(基因符号TNFRSF17)、B7H6(基因符号NCR3LG1)、CAIX(基因符号CA9)、CD123(基因符号IL3RA)、CD138(基因符号SDC1)、CD171(基因符号L1CAM)、CD19(基因符号CD19)、CD20(基因符号CD20)、CD22(基因符号CD22)、CD30(基因符号TNFRSF8)、CD33(基因符号CD33)、CD38(基因符号CD38)、CD44、间接变体incl 7和8(在文献中表示为vX)(基因符号CD44)、CEA、CS1(基因符号SLAMF7)、EGFRvIII(基因符号EGFR、vIII缺失变体)、EGP2、EGP40(基因符号EPCAM)、Erb家族成员(基因符号ERBB1、ERBB2、ERBB3、ERBB4)、FAP(基因符号FAP)、胎儿乙酰胆碱受体(基因符号AChR)、叶酸受体α(基因符号FOLR1)、叶酸受体β(基因符号FOLR2)、GD2、GD3、GPC3(基因符号GPC3)、Her2/neu(基因符号ERBB2)、IL-13Ra2(基因符号IL13RA2)、κ轻链(基因符号IGK)、Lewis-Y、间皮素(基因符号MSLN)、粘蛋白-1(基因符号MUC1)、粘蛋白-16(基因符号MUC16)、NKG2D配体、前列腺特异性膜抗原(PSMA)(基因符号FOLH1)、前列腺干细胞抗原(PSCA)(基因符号PSCA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(基因符号ROR1)以及间变性淋巴瘤受体酪氨酸激酶(基因符号ALK)。
在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域，当在特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员结合时被释放时，在表达嵌合Notch多肽的细胞中诱导MESA多肽的产生。在一些情况下，MESA多肽包括特异性结合抗原的结构域。此类抗原的实例包括，例如，肿瘤抗原；癌细胞相关抗原；血液学恶性肿瘤抗原；实体肿瘤抗原；细胞表面抗原(例如，由T细胞受体(TCR)靶向的细胞表面抗原；细胞内抗原等。血液学恶性肿瘤抗原的实例包括，例如，CD19(表达于例如B细胞中)、CD20(表达于例如B细胞中)、CD22(表达于例如B细胞中)、CD30(表达于例如B细胞中)、CD33(表达于例如骨髓细胞中)、CD70(表达于例如B细胞/T细胞中)、CD123(表达于例如骨髓细胞中)、κ(表达于例如B细胞中)、Lewis Y(表达于例如骨髓细胞中)、NKG2D配体(表达于例如骨髓细胞中)、ROR1(表达于例如B细胞中)、SLAMF7/CS1(表达于例如骨髓瘤细胞、自然杀伤细胞、T细胞以及大多数B细胞类型中)、CD138(表达于例如多发性骨髓瘤中的恶性浆细胞中)、CD56(表达于例如骨髓瘤细胞、神经细胞、自然杀伤细胞、T细胞和小梁成骨细胞中)、CD38(表达于例如B细胞/T细胞中)以及CD160(表达于例如NK细胞/T细胞中)等。实体肿瘤抗原的实例包括，例如，B7H3(表达于例如恶性毒瘤、神经胶质瘤中)、CAIX(表达于例如肾中)、CD44v6/v7(表达于例如子宫颈中)、CD171(表达于例如成神经细胞瘤中)、CEA(表达于例如结肠中)、EGFRvIII(表达于例如神经胶质瘤中)、EGP2(表达于例如癌中)、EGP40(表达于例如结肠中)、EphA2(表达于例如神经胶质瘤、肺中)、ErbB2(HER2)(表达于例如乳房、肺、前列腺、神经胶质瘤中)、ErbB受体家族(表达于例如乳房、肺、前列腺、神经胶质瘤中)、ErbB3/4(表达于例如乳房、卵巢中)、HLA-A1/MAGE1(表达于例如黑素瘤中)、HLA-A2/NY-ESO-1(表达于例如恶性毒瘤、黑素瘤中)、FR-a(表达于例如卵巢中)、(表达于例如癌症相关成纤维细胞中)、FAR(表达于例如横纹肌肉瘤中)、GD2(表达于例如成神经细胞瘤、恶性毒瘤、黑素瘤中)、GD3(表达于例如黑素瘤、肺癌中)、HMW-MAA(表达于例如黑素瘤中)、IL11Ra(表达于例如骨肉瘤中)、IL13Ra2(表达于例如神经胶质瘤中)、Lewis Y(表达于例如乳房/卵巢/胰腺中)、间皮素(表达于例如间皮瘤、乳房、胰腺中)、Muc1(表达于例如卵巢、乳房、前列腺中)、NCAM(表达于例如成神经细胞瘤、结肠直肠中)、NKG2D配体(表达于例如卵巢、恶性毒瘤中)、PSCA(表达于例如前列腺、胰腺中)、PSMA(表达于例如前列腺中)、TAG72(表达于例如结肠中)、VEGFR-2(表达于例如肿瘤脉管系统中)、Axl(表达于例如肺癌中)、Met(表达于例如肺癌中)、α5β3(表达于例如肿瘤脉管系统中)、α5β1(表达于例如肿瘤脉管系统中)、TRAIL-R1/TRAIL-R2(表达于例如实体肿瘤(结肠、肺、胰腺)和血液学恶性肿瘤中)、RANKL(表达于例如前列腺癌和骨转移中)、腱生蛋白(表达于例如神经胶质瘤、上皮性肿瘤(乳房、前列腺)中)、EpCAM(表达于例如上皮性肿瘤(乳房、结肠、肺)中)、CEA(表达于例如上皮性肿瘤(乳房、结肠、肺)中)、gpA33(表达于例如结肠直肠癌中)、粘蛋白(表达于例如上皮性肿瘤(乳房、结肠、肺、卵巢)中)、TAG-72(表达于例如上皮性肿瘤(乳房、结肠、肺)中)、EphA3(表达于例如肺、肾、黑素瘤、神经胶质瘤、血液学恶性肿瘤中)以及IGF1R(表达于例如肺、乳房、头颈部、前列腺、甲状腺、神经胶质瘤中)。表面和细胞内抗原的实例包括，例如，Her2(基因符号ERBB2)、MAGE-A1(基因符号MAGEA1)、MART-1(基因符号MLANA)、NY-ESO(基因符号CTAG1)、WT1(基因符号WT1)、MUC17和MUC13。其他抗原的实例包括，例如，BCMA(基因符号TNFRSF17)、B7H6(基因符号NCR3LG1)、CAIX(基因符号CA9)、CD123(基因符号IL3RA)、CD138(基因符号SDC1)、CD171(基因符号L1CAM)、CD19(基因符号CD19)、CD20(基因符号CD20)、CD22(基因符号CD22)、CD30(基因符号TNFRSF8)、CD33(基因符号CD33)、CD38(基因符号CD38)、CD44、间接变体incl 7和8(在文献中表示为vX)(基因符号CD44)、CEA、CS1(基因符号SLAMF7)、EGFRvIII(基因符号EGFR、vIII缺失变体)、EGP2、EGP40(基因符号EPCAM)、Erb家族成员(基因符号ERBB1、ERBB2、ERBB3、ERBB4)、FAP(基因符号FAP)、胎儿乙酰胆碱受体(基因符号AChR)、叶酸受体α(基因符号FOLR1)、叶酸受体β(基因符号FOLR2)、GD2、GD3、GPC3(基因符号GPC3)、Her2/neu(基因符号ERBB2)、IL-13Ra2(基因符号IL13RA2)、κ轻链(基因符号IGK)、Lewis-Y、间皮素(基因符号MSLN)、粘蛋白-1(基因符号MUC1)、粘蛋白-16(基因符号MUC16)、NKG2D配体、前列腺特异性膜抗原(PSMA)(基因符号FOLH1)、前列腺干细胞抗原(PSCA)(基因符号PSCA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(基因符号ROR1)以及间变性淋巴瘤受体酪氨酸激酶(基因符号ALK)。
在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域，当在特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员结合时被释放时，在表达嵌合Notch多肽的细胞中诱导CAR的产生。在一些情况下，CAR包括特异性结合抗原的结构域。此类抗原的实例包括，例如，肿瘤抗原；癌细胞相关抗原；血液学恶性肿瘤抗原；实体肿瘤抗原；细胞表面抗原(例如，由T细胞受体(TCR)靶向的细胞表面抗原；细胞内抗原等。血液学恶性肿瘤抗原的实例包括，例如，CD19(表达于例如B细胞中)、CD20(表达于例如B细胞中)、CD22(表达于例如B细胞中)、CD30(表达于例如B细胞中)、CD33(表达于例如骨髓细胞中)、CD70(表达于例如B细胞/T细胞中)、CD123(表达于例如骨髓细胞中)、κ(表达于例如B细胞中)、Lewis Y(表达于例如骨髓细胞中)、NKG2D配体(表达于例如骨髓细胞中)、ROR1(表达于例如B细胞中)、SLAMF7/CS1(表达于例如骨髓瘤细胞、自然杀伤细胞、T细胞以及大多数B细胞类型中)、CD138(表达于例如多发性骨髓瘤中的恶性浆细胞中)、CD56(表达于例如骨髓瘤细胞、神经细胞、自然杀伤细胞、T细胞和小梁成骨细胞中)、CD38(表达于例如B细胞/T细胞中)以及CD160(表达于例如NK细胞/T细胞中)等。实体肿瘤抗原的实例包括，例如，B7H3(表达于例如恶性毒瘤、神经胶质瘤中)、CAIX(表达于例如肾中)、CD44v6/v7(表达于例如子宫颈中)、CD171(表达于例如成神经细胞瘤中)、CEA(表达于例如结肠中)、EGFRvIII(表达于例如神经胶质瘤中)、EGP2(表达于例如癌中)、EGP40(表达于例如结肠中)、EphA2(表达于例如神经胶质瘤、肺中)、ErbB2(HER2)(表达于例如乳房、肺、前列腺、神经胶质瘤中)、ErbB受体家族(表达于例如乳房、肺、前列腺、神经胶质瘤中)、ErbB3/4(表达于例如乳房、卵巢中)、HLA-A1/MAGE1(表达于例如黑素瘤中)、HLA-A2/NY-ESO-1(表达于例如恶性毒瘤、黑素瘤中)、FR-a(表达于例如卵巢中)、(表达于例如癌症相关成纤维细胞中)、FAR(表达于例如横纹肌肉瘤中)、GD2(表达于例如成神经细胞瘤、恶性毒瘤、黑素瘤中)、GD3(表达于例如黑素瘤、肺癌中)、HMW-MAA(表达于例如黑素瘤中)、IL11Ra(表达于例如骨肉瘤中)、IL13Ra2(表达于例如神经胶质瘤中)、Lewis Y(表达于例如乳房/卵巢/胰腺中)、间皮素(表达于例如间皮瘤、乳房、胰腺中)、Muc1(表达于例如卵巢、乳房、前列腺中)、NCAM(表达于例如成神经细胞瘤、结肠直肠中)、NKG2D配体(表达于例如卵巢、恶性毒瘤中)、PSCA(表达于例如前列腺、胰腺中)、PSMA(表达于例如前列腺中)、TAG72(表达于例如结肠中)、VEGFR-2(表达于例如肿瘤脉管系统中)、Axl(表达于例如肺癌中)、Met(表达于例如肺癌中)、α5β3(表达于例如肿瘤脉管系统中)、α5β1(表达于例如肿瘤脉管系统中)、TRAIL-R1/TRAIL-R2(表达于例如实体肿瘤(结肠、肺、胰腺)和血液学恶性肿瘤中)、RANKL(表达于例如前列腺癌和骨转移中)、腱生蛋白(表达于例如神经胶质瘤、上皮性肿瘤(乳房、前列腺)中)、EpCAM(表达于例如上皮性肿瘤(乳房、结肠、肺)中)、CEA(表达于例如上皮性肿瘤(乳房、结肠、肺)中)、gpA33(表达于例如结肠直肠癌中)、粘蛋白(表达于例如上皮性肿瘤(乳房、结肠、肺、卵巢)中)、TAG-72(表达于例如上皮性肿瘤(乳房、结肠、肺)中)、EphA3(表达于例如肺、肾、黑素瘤、神经胶质瘤、血液学恶性肿瘤中)以及IGF1R(表达于例如肺、乳房、头颈部、前列腺、甲状腺、神经胶质瘤中)。表面和细胞内抗原的实例包括，例如，Her2(基因符号ERBB2)、MAGE-A1(基因符号MAGEA1)、MART-1(基因符号MLANA)、NY-ESO(基因符号CTAG1)、WT1(基因符号WT1)、MUC17和MUC13。其他抗原的实例包括，例如，BCMA(基因符号TNFRSF17)、B7H6(基因符号NCR3LG1)、CAIX(基因符号CA9)、CD123(基因符号IL3RA)、CD138(基因符号SDC1)、CD171(基因符号L1CAM)、CD19(基因符号CD19)、CD20(基因符号CD20)、CD22(基因符号CD22)、CD30(基因符号TNFRSF8)、CD33(基因符号CD33)、CD38(基因符号CD38)、CD44、间接变体incl 7和8(在文献中表示为vX)(基因符号CD44)、CEA、CS1(基因符号SLAMF7)、EGFRvIII(基因符号EGFR、vIII缺失变体)、EGP2、EGP40(基因符号EPCAM)、Erb家族成员(基因符号ERBB1、ERBB2、ERBB3、ERBB4)、FAP(基因符号FAP)、胎儿乙酰胆碱受体(基因符号AChR)、叶酸受体α(基因符号FOLR1)、叶酸受体β(基因符号FOLR2)、GD2、GD3、GPC3(基因符号GPC3)、Her2/neu(基因符号ERBB2)、IL-13Ra2(基因符号IL13RA2)、κ轻链(基因符号IGK)、Lewis-Y、间皮素(基因符号MSLN)、粘蛋白-1(基因符号MUC1)、粘蛋白-16(基因符号MUC16)、NKG2D配体、前列腺特异性膜抗原(PSMA)(基因符号FOLH1)、前列腺干细胞抗原(PSCA)(基因符号PSCA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(基因符号ROR1)以及间变性淋巴瘤受体酪氨酸激酶(基因符号ALK)。
在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽(例如，第一synNotch多肽)的细胞内结构域，当在特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员结合时被释放时，在表达嵌合Notch多肽的细胞中诱导第二synNotch多肽的产生。在一些情况下，第二synNotch多肽包括特异性结合抗原的结构域。此类抗原的实例包括，例如，肿瘤抗原；癌细胞相关抗原；血液学恶性肿瘤抗原；实体肿瘤抗原；细胞表面抗原(例如，由T细胞受体(TCR)靶向的细胞表面抗原；细胞内抗原等。血液学恶性肿瘤抗原的实例包括，例如，CD19(表达于例如B细胞中)、CD20(表达于例如B细胞中)、CD22(表达于例如B细胞中)、CD30(表达于例如B细胞中)、CD33(表达于例如骨髓细胞中)、CD70(表达于例如B细胞/T细胞中)、CD123(表达于例如骨髓细胞中)、κ(表达于例如B细胞中)、Lewis Y(表达于例如骨髓细胞中)、NKG2D配体(表达于例如骨髓细胞中)、ROR1(表达于例如B细胞中)、SLAMF7/CS1(表达于例如骨髓瘤细胞、自然杀伤细胞、T细胞以及大多数B细胞类型中)、CD138(表达于例如多发性骨髓瘤中的恶性浆细胞中)、CD56(表达于例如骨髓瘤细胞、神经细胞、自然杀伤细胞、T细胞和小梁成骨细胞中)、CD38(表达于例如B细胞/T细胞中)以及CD160(表达于例如NK细胞/T细胞中)等。实体肿瘤抗原的实例包括，例如，B7H3(表达于例如恶性毒瘤、神经胶质瘤中)、CAIX(表达于例如肾中)、CD44v6/v7(表达于例如子宫颈中)、CD171(表达于例如成神经细胞瘤中)、CEA(表达于例如结肠中)、EGFRvIII(表达于例如神经胶质瘤中)、EGP2(表达于例如癌中)、EGP40(表达于例如结肠中)、EphA2(表达于例如神经胶质瘤、肺中)、ErbB2(HER2)(表达于例如乳房、肺、前列腺、神经胶质瘤中)、ErbB受体家族(表达于例如乳房、肺、前列腺、神经胶质瘤中)、ErbB3/4(表达于例如乳房、卵巢中)、HLA-A1/MAGE1(表达于例如黑素瘤中)、HLA-A2/NY-ESO-1(表达于例如恶性毒瘤、黑素瘤中)、FR-a(表达于例如卵巢中)、(表达于例如癌症相关成纤维细胞中)、FAR(表达于例如横纹肌肉瘤中)、GD2(表达于例如成神经细胞瘤、恶性毒瘤、黑素瘤中)、GD3(表达于例如黑素瘤、肺癌中)、HMW-MAA(表达于例如黑素瘤中)、IL11Ra(表达于例如骨肉瘤中)、IL13Ra2(表达于例如神经胶质瘤中)、Lewis Y(表达于例如乳房/卵巢/胰腺中)、间皮素(表达于例如间皮瘤、乳房、胰腺中)、Muc1(表达于例如卵巢、乳房、前列腺中)、NCAM(表达于例如成神经细胞瘤、结肠直肠中)、NKG2D配体(表达于例如卵巢、恶性毒瘤中)、PSCA(表达于例如前列腺、胰腺中)、PSMA(表达于例如前列腺中)、TAG72(表达于例如结肠中)、VEGFR-2(表达于例如肿瘤脉管系统中)、Axl(表达于例如肺癌中)、Met(表达于例如肺癌中)、α5β3(表达于例如肿瘤脉管系统中)、α5β1(表达于例如肿瘤脉管系统中)、TRAIL-R1/TRAIL-R2(表达于例如实体肿瘤(结肠、肺、胰腺)和血液学恶性肿瘤中)、RANKL(表达于例如前列腺癌和骨转移中)、腱生蛋白(表达于例如神经胶质瘤、上皮性肿瘤(乳房、前列腺)中)、EpCAM(表达于例如上皮性肿瘤(乳房、结肠、肺)中)、CEA(表达于例如上皮性肿瘤(乳房、结肠、肺)中)、gpA33(表达于例如结肠直肠癌中)、粘蛋白(表达于例如上皮性肿瘤(乳房、结肠、肺、卵巢)中)、TAG-72(表达于例如上皮性肿瘤(乳房、结肠、肺)中)、EphA3(表达于例如肺、肾、黑素瘤、神经胶质瘤、血液学恶性肿瘤中)以及IGF1R(表达于例如肺、乳房、头颈部、前列腺、甲状腺、神经胶质瘤中)。表面和细胞内抗原的实例包括，例如，Her2(基因符号ERBB2)、MAGE-A1(基因符号MAGEA1)、MART-1(基因符号MLANA)、NY-ESO(基因符号CTAG1)、WT1(基因符号WT1)、MUC17和MUC13。其他抗原的实例包括，例如，BCMA(基因符号TNFRSF17)、B7H6(基因符号NCR3LG1)、CAIX(基因符号CA9)、CD123(基因符号IL3RA)、CD138(基因符号SDC1)、CD171(基因符号L1CAM)、CD19(基因符号CD19)、CD20(基因符号CD20)、CD22(基因符号CD22)、CD30(基因符号TNFRSF8)、CD33(基因符号CD33)、CD38(基因符号CD38)、CD44、间接变体incl 7和8(在文献中表示为vX)(基因符号CD44)、CEA、CS1(基因符号SLAMF7)、EGFRvIII(基因符号EGFR、vIII缺失变体)、EGP2、EGP40(基因符号EPCAM)、Erb家族成员(基因符号ERBB1、ERBB2、ERBB3、ERBB4)、FAP(基因符号FAP)、胎儿乙酰胆碱受体(基因符号AChR)、叶酸受体α(基因符号FOLR1)、叶酸受体β(基因符号FOLR2)、GD2、GD3、GPC3(基因符号GPC3)、Her2/neu(基因符号ERBB2)、IL-13Ra2(基因符号IL13RA2)、κ轻链(基因符号IGK)、Lewis-Y、间皮素(基因符号MSLN)、粘蛋白-1(基因符号MUC1)、粘蛋白-16(基因符号MUC16)、NKG2D配体、前列腺特异性膜抗原(PSMA)(基因符号FOLH1)、前列腺干细胞抗原(PSCA)(基因符号PSCA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(基因符号ROR1)以及间变性淋巴瘤受体酪氨酸激酶(基因符号ALK)。在一些情况下，第一synNotch多肽和第二synNotch多肽特异性地结合两个不同的抗原。
在一些情况下，本公开的嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域，当在特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员结合时被释放时，在表达嵌合Notch多肽的细胞中诱导TANGO多肽的产生。
由于本公开的嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域，当在特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员结合时被释放时，可诱导如本文所述的各种多肽的表达，在一些情况下，两种或更多种多肽的诱导表达可生成逻辑门控电路。此类逻辑门控电路可包括但不限于例如，“与门(AND gate)”、“或门(OR gate)”、“非门(NOT gate)”以及它们的组合，包括例如高阶门，包括例如高阶与门、高阶或门、高阶非门、高阶组合门(即，使用与门、或门和/或非门的一些组合的门)。
本公开的“与”门包括其中信号的传播需要两个或更多个输入的情况。例如，在一些情况下，与门允许通过两个或更多个结合触发的转录开关或其部分的信号传导，其中通过两个或更多个结合触发的转录开关或其部分的信号传导需要两个输入，例如两个抗原。
本公开的“或”门包括其中两个或更多个输入中的任一个可允许信号的传播的情况。例如，在一些情况下，或门允许通过两个或更多个结合触发的转录开关或其部分的信号传导，其中任一个输入，例如两个抗原中的任一个可诱导两个或更多个结合触发的转录开关或其部分的信号输出。
本公开的“非”门包括其中输入能够阻止信号传播的情况。例如，在一些情况下，非门抑制通过结合触发的转录开关的信号传导。在一个实施方案中，非门可包括结合相互作用的抑制。例如，阻止拆分的结合触发的转录开关的部分的结合的竞争性抑制剂可充当阻止通过结合触发的转录开关的信号传导的非门。在另一个实施方案中，非门可包括电路的元件的功能性抑制。例如，功能性地阻止通过结合触发的转录开关的信号传导或通过结合触发的转录开关的信号传导的结果的抑制剂可充当如本文所述的分子电路的非门。作为另一实例，抑制剂结构域，例如抑制性PD-1结构域，可充当非门，以阻止通过结合触发的转录开关的信号传导(例如，其导致细胞活化)。
多输入门可以多种不同的方式利用非门，以阻止通过电路的一些其他组分的信号传导或关闭当和/或在存在激活非门的信号(例如，特定的阴性抗原)时的细胞应答。例如，与+非门可包括在第一抗原的存在下积极影响特定细胞活性的结合触发的开关和在第二抗原的存在下消极影响细胞活性的结合触发的开关。
在一个实施方案中，响应于抗原A的第一结合触发的转录开关驱动响应于抗原X的CAR的表达，由此使得在抗原A和X的存在下，CAR具有活性，从而导致T细胞激活(参见图136)。所述电路还包括在抗原B的存在下阻遏CAR(例如，通过抑制性细胞内结构域(例如，PD-1、CLTA4、CD45等))，从而防止T细胞激活的第二结合触发的转录开关(图136)。因此，在3输入与+非门的所述实施方案中，仅当存在抗原A和X，但是不存在B时，T细胞激活的细胞活性被诱导。
在一些情况下，高阶多输入门包括非门功能。例如，在其中激活依赖于与门中的拆分转录因子的两个部分的表达以诱导期望细胞活性的电路中，可利用非门功能性，例如以阻遏拆分转录因子的活性。
在一个实施方案中，响应于抗原A的第一SynNotch在抗原A的存在下诱导拆分转录因子的第一部分的表达或释放所述部分；并且响应于抗原B的第二SynNotch在抗原B的存在下诱导拆分转录因子的第二部分的表达或释放所述部分，由此使得当存在和/或不含拆分转录因子的第一和第二部分时，转录因子激活一些下游活性，包括例如响应于抗原D的CAR的表达(参见图137)。在这一实施方案中，电路可包括非功能性，例如，呈响应于抗原C的第三SynNotch受体的形式，其在抗原C的存在下诱导或释放拆分转录因子的显性负性抑制剂。转录因子的任何便利的显性负性抑制剂可用于这一非功能性，包括但不限于，例如，拆分转录因子的缺乏两个部分形成功能性转录因子所需的结构域(例如，相互作用域)的一部分。因此，在具有非功能性的多输入门的所述实施方案(图137)中，仅当存在抗原A、B和D，但是不存在C时，CAR的细胞活性(例如T细胞激活)被诱导。
在另一个实施方案中，响应于抗原A的第一SynNotch诱导响应于抗原X的拆分CAR的第一部分的表达，并且响应于抗原B的第二SynNotch诱导响应于抗原X的拆分CAR的第二部分的表达，由此使得当存在抗原A和B时，拆分CAR的两个部分形成响应于抗原X的功能性CAR，其在抗原X的存在下导致T细胞激活(参见图138)。这一电路还可包括呈响应于抗原C的第三SynNotch形式的非功能性，由此使得在抗原C的存在下，从拆分CAR中表达或释放抑制T细胞激活的细胞内抑制性结构域(参见图138)。因此，在具有非功能性的四输入门的所述实施方案(图138)中，仅当存在抗原A、B和X，但是不存在C时，通过拆分CAR的门的细胞活性(例如T细胞激活)被诱导。
在一些情况下，双输入门控电路可包括当被其相应的抗原特异性地结合时诱导拆分CAR的一部分的表达的第一SynNotch多肽。在一些情况下，本公开的细胞可组成型地表达拆分CAR的第一部分，因此，在拆分CAR的第二部分诱导表达时，拆分CAR变得响应于其抗原(当存在时)。拆分CAR的第二部分的表达的必要性在一些情况下可称为“激励(priming)”，由此使得拆分CAR的第二部分的表达激励系统响应于拆分CAR所应答的抗原。
此类双抗原门控电路的构造可以变化。在一些情况下，响应于第一抗原(即抗原A)的SynNotch诱导响应于第二抗原(即抗原X)的包含抗原识别结构域的拆分CAR的一部分的表达(参见，例如，图130)。在这一构造中，在通过由SynNotch多肽诱导的拆分CAR的所述部分的表达激励细胞之前，拆分CAR不识别抗原X。因此，T细胞激活需要抗原A和抗原X两者的存在。
在一些情况下，响应于第一抗原(即抗原A)的SynNotch诱导响应于第二抗原(即抗原X)的包含T细胞激活所必需的一种或多种细胞内组分的拆分CAR的一部分的表达(参见，例如，图131)。在这一构造中，拆分CAR在激励之前识别抗原X，但是，在不存在抗原A时，抗原X的结合不被传播以诱导T细胞激活。然而，当由SynNotch多肽诱导的拆分CAR的部分表达时，抗原X的结合被传播，从而引起T细胞激活。因此，T细胞激活需要抗原A和抗原X两者的存在。
在一些情况下，三输入与门可包括两个SynNotch多肽，所述多肽当被它们相应的第一和第二抗原特异性地结合时，诱导在第三抗原的结合时变得活化的第三抗原应答性多肽(antigen-responsive polypeptide)的表达。例如，在一个实施方案中，三输入与门可包括响应于第一抗原的第一SynNotch多肽和响应于第二抗原的第二SynNotch多肽，其中第一和第二SynNotch多肽诱导响应于第三抗原的拆分CAR的第一和第二部分的表达。因此，在第一和第二抗原(即抗原A和B)的存在下，拆分CAR的第一和第二部分被表达，并且在第三抗原(即抗原C)的存在下，拆分CAR激活所述拆分CAR在其中表达的T细胞(参见图132)。其中识别抗原A和抗原B的两个SynNotch多肽诱导识别抗原X的拆分CAR的部分的表达的三抗原门控系统的另一个示意图示出于图133中。在这一系统中，抗原A、B和X是T细胞激活所需的。
在一些情况下，四输入与门可包括三个SynNotch多肽，所述多肽当被它们相应的第一、第二和第三抗原特异性地结合时，直接或间接地诱导在第四抗原的结合时变得活化的第四抗原应答性多肽的表达。例如，在一个实施方案中，四输入与门可包括响应于第一抗原的第一SynNotch多肽、响应于第二抗原的第二SynNotch多肽以及响应于第三抗原的第三SynNotch多肽，其中第一SynNotch多肽诱导响应于第四抗原的拆分CAR的第一部分的表达并且第二和第三SynNotch多肽诱导转录因子的第一和第二部分的表达，所述转录因子在两个部分均存在时诱导响应于第四抗原的拆分CAR的第二部分的表达。因此，在第一、第二和第三抗原(即抗原A、B和C)的存在下，拆分CAR的第一和第二部分被表达，并且在第四抗原(即抗原D)的存在下，拆分CAR激活所述拆分CAR在其中表达的T细胞(参见图134)。
在一些情况下，五输入与门可包括四个SynNotch多肽，所述多肽当被它们相应的第一、第二、第三和第四抗原特异性地结合时，诱导在第五抗原的结合时变得活化的第五抗原应答性多肽的表达。例如，在一个实施方案中，五输入与门可包括响应于第一和第二抗原的诱导第一转录因子的第一和第二部分的表达的第一和第二SynNotch多肽，所述第一转录因子在两个部分均存在时诱导拆分CAR的第一部分的表达；以及响应于第三和第四抗原的诱导第二转录因子的第一和第二部分的表达的第三和第四SynNotch多肽，所述第二转录因子在两个部分均存在时诱导响应于第五抗原的拆分CAR的第二部分的表达。因此，在第一、第二、第三和第四抗原(即抗原A、B、C和D)的存在下，拆分CAR的第一和第二部分被表达，并且在第五抗原(即抗原E)的存在下，拆分CAR激活所述拆分CAR在其中表达的T细胞(参见图135)。
在利用拆分转录因子的情况中，例如，如在逻辑门控的SynNotch电路中，转录因子或其部分可由独立于系统的其他表达盒(例如，包含编码SynNotch或其部分的序列、编码CAR或其部分的序列等的表达盒)的表达盒在细胞内表达。在转录因子或其部分，例如拆分转录因子的一部分，包含在独立于电路的其他组分的表达盒中的情况中，转录因子表达盒可仅包含编码转录因子或其部分的序列以及其表达所必需的序列元件，包括例如，启动子、增强子等。独立的转录因子或其部分可或可不包含不实质影响转录的表达或功能的另外的元件，包括，例如编码报告基因的序列、编码标记的序列等。
在其他情况下，在利用拆分转录因子的情况中，例如，如在逻辑门控的SynNotch电路中，转录因子或其部分可由与系统的其他组分共享的表达盒在细胞内表达，例如，编码SynNotch或其部分的表达盒、编码CAR或其部分的表达盒等。存在于与系统的其他组分共享的表达盒上的编码转录因子或其部分的序列可独立控制，即包含独立于盒的其他系统元件的表达控制元件(即，启动子、增强子等)，或可与表达盒的其他系统元件同时控制，即由相同的表达控制元件控制转录因子和其他系统元件中的一个或多个。在编码转录因子或其部分的序列与表达盒的其他系统元件同时调控的情况中，转录因子或其部分可被编码成被附接至一个或多个其他系统元件。
在某些实施方案中，编码结合触发的转录开关的核酸被构造成编码可操作地连接至结合触发的转录开关的一个或多个结构域的拆分转录因子的一部分，由此使得，在结合触发的转录开关激活时，拆分转录因子的部分被释放并且可以与拆分转录因子的一个或多个其他部分复合以形成功能性转录因子。
因此，一个或多个结合触发的转录开关的激活可诱导拆分转录因子的部分的表达，导致拆分转录因子部分的异源二聚化和/或复合物形成，从而导致功能性转录因子的形成。可选地，一个或多个结合触发的转录开关的激活可导致拆分转录因子部分从一个或多个结合触发的转录开关中的释放，导致拆分转录因子部分的异源二聚化和/或复合物形成，从而导致功能性转录因子的形成。此外，拆分转录因子部分的诱导和释放可组合，例如，其中一个或多个结合触发的转录开关的激活可诱导拆分转录因子的部分的表达以及拆分转录因子部分从一个或多个结合触发的转录开关中的释放，导致拆分转录因子部分的异源二聚化和/或复合物形成，从而导致功能性转录因子的形成。
本公开的逻辑门控系统不限于具体描述的那些并且可包括另选的构造和/或与所述的那些相比更高阶的门。例如，在一些情况下，本公开的逻辑门控系统可以是双输入门、三输入门、四输入门、五输入门、六输入门、七输入门、八输入门、九输入门、十输入门或更大。此外，本公开的逻辑门控系统的组分不限于用于诱导另外的电路组分的表达的SynNotch，并且可包括例如其他结合触发的转录开关，包括但不限于例如本文所述的那些。此外，虽然为简明起见，已经关于拆分CAR的部分的诱导表达描述了上述实例，但是其他拆分分子(包括但不限于例如拆分SynNotch多肽)也可用于本公开的逻辑门控电路。
本公开提供了一种调节靶细胞的活性的方法，所述方法包括：a)在靶细胞中表达本公开的第一synNotch多肽，其中第一synNotch多肽包括结合可溶性衔接子分子(例如抗原)上的第一表位的抗原结合结构域(例如，scFv、纳米抗体等)；b)使靶细胞与以下各项接触：i)表达本公开的第二synNotch多肽的第二细胞，其中第二synNotch多肽包括结合可溶性衔接子分子(例如抗原)上的第二表位的抗原结合结构域(例如，scFv、纳米抗体等)；以及ii)可溶性衔接子分子(例如抗原)，其中第一synNotch多肽的抗原结合结构域和第二synNotch多肽的抗原结合结构域与可溶性衔接子分子(例如抗原)的结合诱导第一synNotch多肽的细胞内结构域的裂解，从而释放细胞内结构域，其中所释放的细胞内结构域调节靶细胞的活性。靶细胞的活性可选自由以下各项组成的组：细胞的基因产物的表达、细胞的增殖、细胞的细胞凋亡、细胞的非细胞凋亡性死亡、细胞的分化、细胞的去分化、细胞的迁移、分子从细胞中的分泌以及细胞的细胞粘附。衔接子分子可以是癌症相关抗原、病原体相关抗原、抗体等。
另外的序列
本公开的嵌合Notch受体多肽还可包括一个或多个另外的多肽，其中合适的另外多肽包括但不限于信号序列；表位标记；亲和结构域；核定位信号(NLS)；以及产生可检测信号的多肽。
信号序列
适用于本公开的嵌合Notch受体多肽的信号序列包括任何真核信号序列，包括天然存在的信号序列、合成(例如人造)信号序列等。
表位标记
合适的表位标记包括但不限于血凝素(HA；例如，YPYDVPDYA(SEQ ID NO:73)；FLAG(例如，DYKDDDDK(SEQ ID NO:74))；c-myc(例如，EQKLISEEDL；SEQ ID NO:75)等。
亲和结构域
亲和结构域包括可与结合配偶体相互作用的肽序列，例如诸如固定在固体支持体上用于鉴定或纯化的结合配偶体。多个连续的单个氨基酸，诸如组氨酸，在与本公开的嵌合Notch受体多肽融合时，可用于通过与树脂柱诸如镍琼脂糖的高亲和力结合进行的重组嵌合多肽的一步纯化。示例性亲和结构域包括His5(HHHHH)(SEQ ID NO:76)，HisX6(HHHHHH)(SEQ ID NO:77)，C-myc(EQKLISEEDL)(SEQ ID NO:75)，Flag(DYKDDDDK)(SEQ ID NO:74)，StrepTag(WSHPQFEK)(SEQ ID NO:78)，血凝素例如HA Tag(YPYDVPDYA)(SEQ ID NO:73)，GST，硫氧还蛋白，纤维素结合结构域，RYIRS(SEQ ID NO:79)，Phe-His-His-Thr(SEQ IDNO:80)，壳多糖结合结构域，S-肽，T7肽，SH2结构域，C端RNA标记，WEAAAREACCRECCARA(SEQID NO:81)，金属结合结构域，例如，锌结合结构域或钙结合结构域诸如来自钙结合蛋白的那些例如钙调蛋白、肌钙蛋白C、钙调磷酸酶B，肌球蛋白轻链，恢复蛋白，S-调制蛋白(S-modulin)，视锥蛋白，VILIP，神经钙蛋白，hippocalcin，frequenin，钙牵蛋白，钙蛋白酶大亚基，S100蛋白，小白蛋白，钙结合蛋白D9K，钙结合蛋白D28K，和钙视网膜蛋白，内含肽(intein)，生物素，链霉抗生物素蛋白，MyoD，Id，亮氨酸拉链序列，以及麦芽糖结合蛋白。
核定位序列
合适的核定位信号(“NLS”，在本文也称为“核定位序列”)包括，例如，PKKKRKV(SEQID NO:82)；KRPAATKKAGQAKKKK(SEQ ID NO:83)；MVPKKKRK(SEQ ID NO:84)；MAPKKKRKVGIHGVPAA(SEQ ID NO:85)等。NLS可存在于本公开的嵌合Notch受体多肽的N末端；靠近本公开的嵌合Notch受体多肽的N末端(例如，在N末端的5个氨基酸之内、10个氨基酸之内或20个氨基酸之内)；处于本公开的嵌合Notch受体多肽的C末端；靠近本公开的嵌合Notch受体多肽的C末端(例如，在C末端的5个氨基酸之内、10个氨基酸之内或20个氨基酸之内)；或在本公开的嵌合Notch受体多肽内部。
可检测信号产生多肽
合适的可检测信号产生蛋白包括，例如，荧光蛋白；催化生成可检测信号作为产物的反应的酶等。
合适的荧光蛋白包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)或其变体、GFP的蓝色荧光变体(BFP)、GFP的青色荧光变体(CFP)、GFP的黄色荧光变体(YFP)、增强型GFP(EGFP)、增强型CFP(ECFP)、增强型YFP(EYFP)、GFPS65T、Emerald、Topaz(TYFP)、Venus、Citrine、mCitrine、GFPuv、不稳定EGFP(dEGFP)、不稳定ECFP(dECFP)、不稳定EYFP(dEYFP)、mCFPm、Cerulean、T-Sapphire、CyPet、YPet、mKO、HcRed、t-HcRed、DsRed、DsRed2、DsRed-单体、J-Red、dimer2、t-dimer2(12)、mRFP1、pocilloporin、Renilla GFP、Monster GFP、paGFP、Kaede蛋白和激发蛋白(kindling protein)、藻胆蛋白和藻胆蛋白缀合物，包括B-藻红蛋白、R-藻红蛋白和别藻蓝蛋白。荧光蛋白的其他实例包括mHoneydew、mBanana、mOrange、dTomato、tdTomato、mTangerine、mStrawberry、mCherry、mGrape1、mRaspberry、mGrape2、mPlum(Shaner等人(2005)Nat.Methods 2:905-909)等。来自珊瑚虫(Anthozoan)物种的多种荧光和有色蛋白中的任一种，如例如Matz等人(1999)Nature Biotechnol.17:969-973中所描述的，是适用的。
合适的酶包括但不限于辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶(GAL)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、转化酶、黄嘌呤氧化酶、荧火虫荧光素酶、葡萄糖氧化酶(GO)等。
特异性结合对的第二成员的实例
如上文所指出，本公开的嵌合Notch多肽的特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员的结合在一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点处诱导Notch受体多肽的裂解，从而释放细胞内结构域。如上文所指出，特异性结合对的第二成员可以是多种分子中的任一个。在一些情况下，嵌合Notch多肽特异性地结合抗原，例如，特异性结合对的第二成员为抗原。此类抗原的实例包括，例如，肿瘤抗原；癌细胞相关抗原；血液学恶性肿瘤抗原；实体肿瘤抗原；细胞表面抗原(例如，由T细胞受体(TCR)靶向的细胞表面抗原；细胞内抗原等。血液学恶性肿瘤抗原的实例包括，例如，CD19(表达于例如B细胞中)、CD20(表达于例如B细胞中)、CD22(表达于例如B细胞中)、CD30(表达于例如B细胞中)、CD33(表达于例如骨髓细胞中)、CD70(表达于例如B细胞/T细胞中)、CD123(表达于例如骨髓细胞中)、κ(表达于例如B细胞中)、Lewis Y(表达于例如骨髓细胞中)、NKG2D配体(表达于例如骨髓细胞中)、ROR1(表达于例如B细胞中)、SLAMF7/CS1(表达于例如骨髓瘤细胞、自然杀伤细胞、T细胞以及大多数B细胞类型中)、CD138(表达于例如多发性骨髓瘤中的恶性浆细胞中)、CD56(表达于例如骨髓瘤细胞、神经细胞、自然杀伤细胞、T细胞和小梁成骨细胞中)、CD38(表达于例如B细胞/T细胞中)以及CD160(表达于例如NK细胞/T细胞中)等。实体肿瘤抗原的实例包括，例如，B7H3(表达于例如恶性毒瘤、神经胶质瘤中)、CAIX(表达于例如肾中)、CD44 v6/v7(表达于例如子宫颈中)、CD171(表达于例如成神经细胞瘤中)、CEA(表达于例如结肠中)、EGFRvIII(表达于例如神经胶质瘤中)、EGP2(表达于例如癌中)、EGP40(表达于例如结肠中)、EphA2(表达于例如神经胶质瘤、肺中)、ErbB2(HER2)(表达于例如乳房、肺、前列腺、神经胶质瘤中)、ErbB受体家族(表达于例如乳房、肺、前列腺、神经胶质瘤中)、ErbB3/4(表达于例如乳房、卵巢中)、HLA-A1/MAGE1(表达于例如黑素瘤中)、HLA-A2/NY-ESO-1(表达于例如恶性毒瘤、黑素瘤中)、FR-a(表达于例如卵巢中)、(表达于例如癌症相关成纤维细胞中)、FAR(表达于例如横纹肌肉瘤中)、GD2(表达于例如成神经细胞瘤、恶性毒瘤、黑素瘤中)、GD3(表达于例如黑素瘤、肺癌中)、HMW-MAA(表达于例如黑素瘤中)、IL11Ra(表达于例如骨肉瘤中)、IL13Ra2(表达于例如神经胶质瘤中)、Lewis Y(表达于例如乳房/卵巢/胰腺中)、间皮素(表达于例如间皮瘤、乳房、胰腺中)、Muc1(表达于例如卵巢、乳房、前列腺中)、NCAM(表达于例如成神经细胞瘤、结肠直肠中)、NKG2D配体(表达于例如卵巢、恶性毒瘤中)、PSCA(表达于例如前列腺、胰腺中)、PSMA(表达于例如前列腺中)、TAG72(表达于例如结肠中)、VEGFR-2(表达于例如肿瘤脉管系统中)、Axl(表达于例如肺癌中)、Met(表达于例如肺癌中)、α5β3(表达于例如肿瘤脉管系统中)、α5β1(表达于例如肿瘤脉管系统中)、TRAIL-R1/TRAIL-R2(表达于例如实体肿瘤(结肠、肺、胰腺)和血液学恶性肿瘤中)、RANKL(表达于例如前列腺癌和骨转移中)、腱生蛋白(表达于例如神经胶质瘤、上皮性肿瘤(乳房、前列腺)中)、EpCAM(表达于例如上皮性肿瘤(乳房、结肠、肺)中)、CEA(表达于例如上皮性肿瘤(乳房、结肠、肺)中)、gpA33(表达于例如结肠直肠癌中)、粘蛋白(表达于例如上皮性肿瘤(乳房、结肠、肺、卵巢)中)、TAG-72(表达于例如上皮性肿瘤(乳房、结肠、肺)中)、EphA3(表达于例如肺、肾、黑素瘤、神经胶质瘤、血液学恶性肿瘤中)以及IGF1R(表达于例如肺、乳房、头颈部、前列腺、甲状腺、神经胶质瘤中)。表面和细胞内抗原的实例包括，例如，Her2(基因符号ERBB2)、MAGE-A1(基因符号MAGEA1)、MART-1(基因符号MLANA)、NY-ESO(基因符号CTAG1)、WT1(基因符号WT1)、MUC17和MUC13。其他抗原的实例包括，例如，BCMA(基因符号TNFRSF17)、B7H6(基因符号NCR3LG1)、CAIX(基因符号CA9)、CD123(基因符号IL3RA)、CD138(基因符号SDC1)、CD171(基因符号L1CAM)、CD19(基因符号CD19)、CD20(基因符号CD20)、CD22(基因符号CD22)、CD30(基因符号TNFRSF8)、CD33(基因符号CD33)、CD38(基因符号CD38)、CD44、间接变体incl 7和8(在文献中表示为vX)(基因符号CD44)、CEA、CS1(基因符号SLAMF7)、EGFRvIII(基因符号EGFR、vIII缺失变体)、EGP2、EGP40(基因符号EPCAM)、Erb家族成员(基因符号ERBB1、ERBB2、ERBB3、ERBB4)、FAP(基因符号FAP)、胎儿乙酰胆碱受体(基因符号AChR)、叶酸受体α(基因符号FOLR1)、叶酸受体β(基因符号FOLR2)、GD2、GD3、GPC3(基因符号GPC3)、Her2/neu(基因符号ERBB2)、IL-13Ra2(基因符号IL13RA2)、κ轻链(基因符号IGK)、Lewis-Y、间皮素(基因符号MSLN)、粘蛋白-1(基因符号MUC1)、粘蛋白-16(基因符号MUC16)、NKG2D配体、前列腺特异性膜抗原(PSMA)(基因符号FOLH1)、前列腺干细胞抗原(PSCA)(基因符号PSCA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(基因符号ROR1)以及间变性淋巴瘤受体酪氨酸激酶(基因符号ALK)。
示例性实施方案
以下是本公开的嵌合Notch受体多肽的非限制性实例。
在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽包括以从N末端至C末端的顺序包括以下各项的Notch受体多肽：i)Lin Notch重复序列A-C(LNR区段)；ii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；iii)TM结构域；并且包含S1蛋白水解裂解位点、S2蛋白水解裂解位点以及S3蛋白水解裂解位点。这一Notch受体多肽的实例示出于图16A中。在图16A中，Lin Notch重复序列A-C(LNR区段)具有以下氨基酸序列：PPQIEEACELPECQVDAGNKVCNLQCNNHACGWDGGDCSLNFNDPWKNCTQSLQCWKYFSDGHCDSQCNSAGCLFDGFDCQLTEGQCNPLYDQYCKDHFSDGHCDQGCNSAECEWDGLDC(SEQ ID NO:5)；并且异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)具有以下氨基酸序列：
其中S1蛋白水解裂解位点包含序列RQRR(SEQ ID NO:86)，S2蛋白水解裂解位点包含序列AV；并且TM结构域具有以下氨基酸序列：HLMYVAAAAFVLLFFVGCGVLLS(SEQ ID NO:7)，其中S3蛋白水解裂解位点包含序列VLLS(SEQ ID NO:87)。
在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽包括以从N末端至C末端的顺序包括以下各项的Notch受体多肽：i)EGF重复序列；ii)Lin Notch重复序列A-C(LNR区段)；iii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；iv)TM结构域；并且包含S1蛋白水解裂解位点、S2蛋白水解裂解位点以及S3蛋白水解裂解位点。这一Notch受体多肽的实例示出于图16B中。在图16B中，EGF重复序列具有以下氨基酸序列：PCVGSNPCYNQGTCEPTSENPFYRCLCPAKFNGLLCH(SEQ ID NO:8)；并且LNR区段、异源二聚化结构域、TM结构域、S1蛋白水解裂解位点、S2蛋白水解裂解位点和S3蛋白水解裂解位点示出于图16A中。
在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽包括包含以下氨基酸序列的Notch受体多肽：IPYKIEAVKSEPVEPPLPSQLHLMYVAAAAFVLLFFVGCGVLLSRKRRRQLCIQKL(SEQ ID NO:4)；其中TM结构域加下划线；其中Notch受体多肽包含S2蛋白水解裂解位点和S3蛋白水解裂解位点；其中Notch受体多肽具有56个氨基酸的长度。
在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)Fc受体FcγIIIa(CD16A)；b)Notch受体多肽，其包括以下各项：i)LNR区段；ii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iii)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为转录激活蛋白。在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)Fc受体FcγIIIa(CD16A)；Notch受体多肽，其包括以下各项：i)LNR区段；ii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iii)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为t TA转录因子。这一嵌合Notch受体多肽的实例示出于图16C中。S1、S2和S3裂解位点的位置示出于图16A中。在图16C中，CD16A具有以下氨基酸序列：MWQLLLPTALLLLVSAGMRTEDLPKAVVF LEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLFGSKNVSSETVNITITQGLAVSTISSFFPPG(SEQ ID NO:88)；Notch受体多肽具有图16A中所示的氨基酸序列；并且tTA转录因子具有以下氨基酸序列：MSRLDKSKVINSALELLNEVG IEGLTTRKLAQKLGVEQPTLYWHVKNKRALLDALAIEMLDRHHTHFCPLEGESWQDFLRNNAKSFRCALLSHRDGAKVHLGTRPTEKQYETLENQLAFLCQQGFSLENALYALSAVGHFTLGCVLEDQEHQVAKEERETPTTDSMPPLLRQAIELFDHQGAEPAFLFGLELIICGLEKQLKCESGGPADALDDFDLDMLPADALDDFDLDMLPADALDDFDLDMLPG(SEQ ID NO:69)。
在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)细胞表面抗原；b)Notch受体多肽，其包括以下各项：i)LNR区段；ii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iii)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为转录激活蛋白。在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)CD19多肽；b)Notch受体多肽，其包括以下各项：i)LNR区段；ii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iii)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为tTA转录因子。这一嵌合Notch受体多肽的实例示出于图17A中。在图17A中，CD19多肽具有以下氨基酸序列：RPEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQL TWSRESPLKPFLKLSLGLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWK(SEQ ID NO:89)；Notch受体多肽包含图16A中所示的氨基酸序列；并且tTA转录因子具有图16C中所示的氨基酸序列。
在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)抗体；b)Notch受体多肽，其包括以下各项：i)LNR区段；ii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iii)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为转录激活蛋白。在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)对细胞表面抗原具有特异性的抗体；b)Notch受体多肽，其包括以下各项：i)LNR区段；ii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iii)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为转录激活蛋白。在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)抗CD19 scFv；b)Notch受体多肽，其包括以下各项：i)LNR区段；ii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iii)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为tTA转录因子。这一嵌合Notch受体多肽的实例示出于图17B中。在图17B中，抗CD19 scFv具有以下氨基酸序列：DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:90)；Notch受体多肽包含图16A所示的氨基酸序列；并且tTA转录因子具有图16C所示的氨基酸序列。
在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)抗体；b)Notch受体多肽，其包括以下各项：i)EGF重复序列；ii)LNR区段；iii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iv)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为转录激活蛋白。在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)对细胞表面抗原具有特异性的抗体；b)Notch受体多肽，其包括以下各项：i)EGF重复序列；ii)LNR区段；iii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iv)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为转录激活蛋白。在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)抗CD19 scFv；b)Notch受体多肽，其包括以下各项：i)EG F重复序列；ii)LNR区段；iii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iv)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为tTA转录因子。这一嵌合Notch受体多肽的实例示出于图17C中。在图17C中，抗CD19 scFv具有以下氨基酸序列：DIQMTQ TTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:90)；Notch受体多肽包含图16B所示的氨基酸序列；并且tTA转录因子具有图16C所示的氨基酸序列。
在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)抗体；b)Notch受体多肽，其包括以下各项：i)EGF重复序列；ii)LNR区段；iii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iv)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为转录激活蛋白。在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)对细胞表面抗原，例如存在于癌细胞表面上的细胞表面抗原(例如癌症特异性抗原)具有特异性的抗体；b)Notch受体多肽，其包括以下各项：i)EGF重复序列；ii)LNR区段；iii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iv)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为转录激活蛋白。在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)抗间皮素scFv；b)Notch受体多肽，其包括以下各项：i)EGF重复序列；ii)LNR区段；iii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iv)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为tTA转录因子。这一嵌合Notch受体多肽的实例示出于图18中。在图18中，抗间皮素scFv具有以下氨基酸序列：GSQVQLQQS GPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKSLEWIGLIT PYNGASSYNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMDLLSLTSEDSAVYFCARGGYDGRGFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSSGGGSDIELTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPGRFSGSGSGNSYSLTISSVEAEDDATYYCQQWSKHPLTYGAGTKLEIKAS(SEQ ID NO:91)；Notch受体多肽包含图16B所示的氨基酸序列；并且tTA转录因子具有图16C所示的氨基酸序列。
在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)抗体；b)Notch受体多肽，其包括以下各项：i)LNR区段；ii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iii)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为转录激活蛋白。在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)对转录因子具有特异性的抗体；b)Notch受体多肽，其包括以下各项：i)LNR区段；ii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iii)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为转录激活蛋白。在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)抗myc scFv；b)Notch受体多肽，其包括以下各项：i)LNR区段；ii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iii)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为tTA转录因子。这一嵌合Notch受体多肽的实例示出于图19A和19B中。在图19A和19B中，抗Myc scFv具有以下氨基酸序列：GSQVQLQQQVQLQESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSHYG MSWVRQTPDKRLEWVATIGSRGTYTHYPDSVKGRFTISRDNDKNALYLQMNSLKSEDTAMYYCARRSEFYYYGNTYYYSAMDYWGQGASVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAFLAVSLGQRATIS CRASESVDNYGFSFMNWFQQKPGQPPKLLIYAISNRGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDPAMYFCQQTKEVPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:92)；Notch受体多肽包含图16A所示的氨基酸序列；并且tTA转录因子具有图16C所示的氨基酸序列。
在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)纳米抗体；b)Notch受体多肽，其包括以下各项：i)LNR区段；ii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iii)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为转录激活蛋白。在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)LaG 9纳米抗体；b)Notch受体多肽，其包括以下各项：i)LNR区段；ii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iii)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为tTA转录因子。这一嵌合Notch受体多肽的实例示出于图20A中。在图20A中，LaG 9纳米抗体具有以下氨基酸序列：MADVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSTSAMGWFRQAP GKEREFVARITWSAGYTAYSDSVKGRFTISRDKAKNTVYLQMNS LKPEDTAVYYCASRSAGYSSSLTRREDYAYWGQGTQVTVS(SEQ ID NO:93)；Notch受体多肽包含图16A所示的氨基酸序列；并且tTA转录因子具有图16C所示的氨基酸序列。
在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)纳米抗体；b)Notch受体多肽，其包括以下各项：i)LNR区段；ii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iii)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为转录激活蛋白。在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)LaG 50纳米抗体；b)Notch受体多肽，其包括以下各项：i)LNR区段；ii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iii)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为tTA转录因子。这一嵌合Not ch受体多肽的实例示出于图20B中。在图20B中，LaG 50纳米抗体具有以下氨基酸序列：MADVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASG RTISMAAMSWFRQAPGKEREFVAGISRSAGSAVHADSVKGRFTIS RDNTKNTLYLQMNSLKAEDTAVYYCAVRTSGFFGSIPRTGTAFD YWGQGTQVTVS(SEQ ID NO:94)；Notch受体多肽包含图16A所示的氨基酸序列；并且tTA转录因子具有图16C所示的氨基酸序列。
在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)纳米抗体；b)Notch受体多肽，其包括以下各项：i)LNR区段；ii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iii)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为转录激活蛋白。在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)LaG 18纳米抗体；b)Notch受体多肽，其包括以下各项：i)LNR区段；ii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iii)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为tTA转录因子。这一嵌合Not ch受体多肽的实例示出于图20C中。在图20C中，LaG 18纳米抗体具有以下氨基酸序列：MAQVQLVESGGGLVQTGGSLKLSCTASVR TLSYYHVGWFRQAPGKEREFVAGIHRSGESTFYADSVKGRFTISRDNAKNTVHLQMNSLKPEDTAVYYCAQRVRGFFGPLRSTPSWYD YWGQGTQVTVS(SEQ ID NO:95)；Notch受体多肽包含图16A所示的氨基酸序列；并且tTA转录因子具有图16C所示的氨基酸序列。
在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)纳米抗体；b)Notch受体多肽，其包括以下各项：i)LNR区段；ii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iii)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为转录激活蛋白。在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)LaG 16/La G 2纳米抗体；b)Notch受体多肽，其包括以下各项：i)LNR区段；ii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iii)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为tTA转录因子。这一嵌合Notch受体多肽的实例示出于图20D中。在图20D中，La G 16/LaG 2纳米抗体具有以下氨基酸序列：MAQVQLVESGGRLV QAGDSLRLSCAASGRTFSTSAMAWFRQAPGREREFVAAITWTVGNTILGDSVKGRFTISRDRAKNTVDLQMDNLEPEDTAVYYCSARSRGYVLSVLRSVDSYDYWGQGTQVTVSGGGGSGGGGSGGGGSMAQVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSNYAMGWFRQAPGKEREFVAAISWTGVSTYYADSVKGRFTISRDNDKNTVYVQMNSLIPEDTAIYYCAAVRARSFSDTYSRVNEYDYWGQGTQVTV(SEQ ID NO:96)；Notch受体多肽包含图16A所示的氨基酸序列；并且tTA转录因子具有图16C所示的氨基酸序列。
在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)细胞凋亡调控蛋白；b)Notch受体多肽，其包括以下各项：i)EGF重复序列；ii)LNR区段；iii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iv)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为转录激活蛋白。在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)细胞外结构域；b)N otch受体多肽，其包括以下各项：i)EGF重复序列；ii)LNR区段；iii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iv)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为tTA转录因子。这一嵌合Notch受体多肽的实例示出于图21中。在图21中，PD1细胞外结构域具有以下氨基酸序列：MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRP GWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQEQKLISEEDL(SEQ ID NO:97)；Notch受体多肽包含图16B所示的氨基酸序列；并且tTA转录因子具有图16C所示的氨基酸序列。
在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)抗体；b)Notch受体多肽，其包括以下各项：i)LNR区段；ii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iii)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为转录激活蛋白。在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)对细胞表面抗原具有特异性的抗体；b)Notch受体多肽，其包括以下各项：i)LNR区段；ii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iii)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为转录激活蛋白。在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)抗CD19 scFv；b)Notch受体多肽，其包括以下各项：i)LNR区段；ii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iii)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为Gal4-VP64转录激活蛋白。这一嵌合Notch受体多肽的实例示出于图22中。在图22中，抗CD19 scFv具有以下氨基酸序列：DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQK PDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:90)；Notch受体多肽包含图16A中所示的氨基酸序列；并且Gal4-VP64转录激活蛋白具有以下氨基酸序列：MKLLSSIEQACDICRLKKLKCSKEKPKCAK CLKNNWECRYSPKTKRSPLTRAHLTEVESRLERLEQLFLLIFPREDLDMILKMDSLQDIKALLTGLFVQDNVNKDAVTDRLASVETDMPLTLRQHRISATSSSEESSNKGQRQLTVSAAAGGSGGSGGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGS(SEQ ID NO:70)。
在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)抗体；b)Notch受体多肽，其包括以下各项：i)LNR区段；ii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iii)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为DNA结合多肽。在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)抗CD19scFv；b)Notch受体多肽，其包括以下各项：i)LNR区段；ii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iii)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为Zip(-)Gal4 DNA结合多肽。这一嵌合Notch受体多肽的实例示出于图23中。在图23中，抗CD19 scFv具有图22中所示的氨基酸序列；Notch受体多肽包含图16A中所示的氨基酸序列；并且Zip(-)Gal4 DNA结合多肽具有以下氨基酸序列：LEIRAAFLRQRNTALRTEVAELEQEVQRLENEVSQYETRYGPLGGGKGGSGGSGGSMKLLSSIEQACDICRLKKLKCSKEKPKCAKCLKNNWECRYSPKTKRSPLTRAHLTEVESRLERLEQLFLLIFPREDLDMILKMDSLQDIKALLTGLFVQDNVNKDAVTDRLASVETDMPLTLRQHRISATSSSEESSNKGQRQLTVSAA(SEQ ID NO:68)。
在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)抗体；b)Notch受体多肽，其包括以下各项：i)EGF重复序列；ii)LNR区段；iii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iv)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为转录激活蛋白。在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)抗间皮素scFv；b)Notch受体多肽，其包括以下各项：i)EGF重复序列；ii)LNR区段；iii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iv)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为包括NLS的VP64 Zip(+)。这一嵌合Notch受体多肽的实例示出于图24中。在图24中，抗间皮素scFv具有以下氨基酸序列：GSQVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKSLEWIGLITPYNGASSYNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMDLLSLTSEDSAVYFCARGGYDGRGFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSSGGGSDIELTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYD(SEQ ID NO:98)；Notch受体多肽包含图16B中所示的氨基酸序列；并且VP64 Zip(+)转录激活蛋白具有以下氨基酸序列：PKKKRKVDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDM LGSDALDDFDLDMLGSGGSGGSGGSLEIEAAFLERENTALETRVA ELRQRVQRLRNRVSQYRTRYGPLGGGK(SEQ ID NO:99)。
在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)抗体；b)Notch受体多肽，其包括以下各项：i)LNR区段；ii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iii)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为重组酶。在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)对细胞表面抗原具有特异性的抗体；b)Notch受体多肽，其包括以下各项：i)LNR区段；ii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iii)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为重组酶。在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)抗CD19scFv；b)Notch受体多肽，其包括以下各项：i)LNR区段；ii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iii)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为FLPe重组酶(参见，例如，Akbudak和Srivastava(2011)Mol.Biotechnol.49:82)。这一嵌合Notch受体多肽的实例示出于图25中。在图25中，抗CD19 scFv具有图22中所示的氨基酸序列；Notch多肽包含图16A中所示的氨基酸序列；并且FLPe重组酶具有以下氨基酸序列：MSQFDILCKTPPKVLVRQFVERFERPSGEKIASCAAELTYLCWMITHNGTAIKRATFMSYNTIISNSLSFDIVNKSLQFKYKTQKATILEASLKKLIPAWEFTIIPYNGQKHQSDITDIVSSLQLQFESSEEADKGNSHSKKMLKALLSEGESIWEITEKILNSFEYTSRFTKTKTLYQFLFLATFINCGRFSDIKNVDPKSFKLVQNKYLGVIIQCLVTETKTSVSRHIYFFSARGRIDPLVYLDEFLRNSEPVLKRVNRTGNSSSNKQEYQLLKDNLVRSYNKALKKNAPYPIFAIKNGPKSHIGRHLMTSFLSMKGLTELTNVVGNWSDKRASAVARTTYTHQITAIPDHYFALVSRYYAYDPISKEMIALKDETNPIEEWQHIEQLKGSAEGSIRYPAWNGIISQEVLDYLSSYINRRIGPVEQKLISEEDL(SEQ ID NO:65)。
在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)抗体；b)Notch受体多肽，其包括以下各项：i)LNR区段；ii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iii)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为重组酶。在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)对细胞表面抗原具有特异性的抗体；b)Notch受体多肽，其包括以下各项：i)LNR区段；ii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iii)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为重组酶。在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)抗CD19scFv；b)Notch受体多肽，其包括以下各项：i)LNR区段；ii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iii)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为包括NLS的Cre重组酶。这一嵌合Notch受体多肽的实例示出于图26中。在图26中，抗CD19 scFv具有图22中所示的氨基酸序列；Notch多肽包含图16A中所示的氨基酸序列；并且Cre重组酶具有以下氨基酸序列：MVPKKKRKVSNLLTVHQNLPALPVDATSDEVRKNLMDMFRDRQAFSEHTWKMLLSVCRSWAAWCKLNNRKWFPAEPEDVRDYLLYLQARGLAVKTIQQHLGQLNMLHRRSGLPRPSDSNAVSLVMRRIRKENVDAGERAKQALAFERTDFDQVRSLMENSDRCQDIRNLAFLGIAYNTLLRIAEIARIRVKDISRTDGGRMLIHIGRTKTLVSTAGVEKALSLGVTKLVERWISVSGVADDPNNYLFCRVRKNGVAAPSATSQLSTRALEGIFEATHRLIYGAKDDSGQRYLAWSGHSARVGAARDMARAGVSIPEIMQAGGWTNVNIVMNYIRNLDSETGAMVRLLEDGD(SEQ ID NO:100)，其中Cre重组酶包含NLS(MVPKKKRK；SEQ ID NO:84)。
在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)抗体；b)Notch受体多肽，其包括以下各项：i)LNR区段；ii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iii)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为调控因子。在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)对细胞表面抗原具有特异性的抗体；b)Notch受体多肽，其包括以下各项：i)LNR区段；ii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iii)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为生肌调节因子。在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)抗CD19 scFv；b)Notch受体多肽，其包括以下各项：i)LNR区段；ii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iii)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为MyoD多肽。这一嵌合Notch受体多肽的实例示出于图27中。在该实例中，MyoD与红色荧光蛋白(RFP)融合。在图27中，抗CD19scFv具有图22中所示的氨基酸序列；Notch多肽包含图16A中所示的氨基酸序列；并且MyoD多肽具有以下氨基酸序列：MELL SPPLRDIDLTGPDGSLCSFETADDFYDDPCFDSPDLRFFEDLDPRLVHMGALLKPEEHAHFPTAVHPGPGAREDEHVRAPSGHHQAGRCLLWACKACKRKTTNADRRKAATMRERRRLSKVNEAFETLKRCTSSNPNQRLPKVEILRNAIRYIEGLQALLRDQDAAPPGAAAFYAPGPLPPGRGSEHYSGDSDASSPRSNCSDGMMDYSGPPSGPRRQNGYDTAYYSEAARESRPGKSAAVSSLDCLSSIVERISTDSPAAPALLLADAPPESPPGPPEGASLSDTEQGTQTPSPDAAPQCPAGSNPNAIYQVL(SE Q ID NO:72)。
在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)抗体；b)Notch受体多肽，其包括以下各项：i)LNR区段；ii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iii)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为转录因子。在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)对细胞表面抗原具有特异性的抗体；b)Notch受体多肽，其包括以下各项：i)LNR区段；ii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iii)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为含T盒的转录因子。在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽以从N末端至C末端的顺序包括：a)抗CD19 scFv；b)Notch受体多肽，其包括以下各项：i)LNR区段；ii)异源二聚化结构域(HD-N区段和HD-C区段)；以及iii)TM结构域，其中Notch受体多肽包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为Tbx21多肽(也称为Tbet(GenBank BC039739))。这一嵌合Notch受体多肽的实例示出于图28中。Tbx21蛋白为控制干扰素-γ、Th1细胞因子的表达的Th1细胞特异性转录因子。在图28中，抗CD19 scFv具有图22中所示的氨基酸序列；Notch多肽包含图16A中所示的氨基酸序列；并且Tbx21蛋白具有以下氨基酸序列：MGIVEPGCGDMLTGTEPMPGSDEGRAPGADPQHRYFYPEPG AQDADERRGGGSLGSPYPGGALVPAPPSRFLGAYAYPPRPQAAGFPGAGESFPPPADAEGYQPGEGYAAPDPRAGLYPGPREDYALPAGLEVSGKLRVALNNHLLWSKFNQHQTEMIITKQGRRMFPFLSFTVAGLEPTSHYRMFVDVVLVDQHHWRYQSGKWVQCGKAEGSMPGNRLYVHPDSPNTGAHWMRQEVSFGKLKLTNNKGASNNVTQMIVLQSLHKYQPRLHIVEVNDGEPEAACNASNTHIFTFQETQFIAVTAYQNAEITQLKIDNNPFAKGFRENFESMYTSVDTSIPSPPGPNCQFLGGDHYSPLLPNQYPVPSRFYPDLPGQAKDVVPQAYWLGAPRDHSYEAEFRAVSMKPAFLPSAPGPTMSYYRGQEVLAPGAGWPVAPQYPPK MGPASWFRPMRTLPMEPGPGGSEGRGPEDQGPPLVWTEIAPIRPESSDSGLGEGDSKRRRVSPYPSSGDSSSPAGAPSPFDKEAEGQFYNYFPN(SEQ ID NO:71)。
在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽包括：a)细胞外结构域；b)包含以下氨基酸序列的Notch受体多肽：IPYKIEAVKSEPVEPPLPSQLHLMYVAAAAFVLLFFV GCGVLLSRKRRRQLCIQKL(SEQ ID NO:4)；其中TM结构域加下划线，其中Notch受体多肽包含S2蛋白水解裂解位点和S3蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域。在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽包括：a)细胞外结构域；b)包含以下氨基酸序列的Notch受体多肽：IPYKIEAVKSEPVEPPLPSQLHLMYVAAAAFVLLFFVGCGVLLSRKRRRQLCIQKL(SEQ ID NO:4)；其中TM结构域加下划线，其中Notch受体多肽包含S2蛋白水解裂解位点和S3蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为转录激活蛋白。在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽包括：a)细胞外结构域，其中细胞外结构域为存在于免疫细胞(T细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞)的表面上的多肽；b)包括以下氨基酸序列的Notch受体多肽：IPYKIEAVKSEPVEPPLPSQLHLMYVAAAAFVLLFFVGCGVLLSRKRRRQLCIQKL(SEQID NO:4)；其中TM结构域加下划线，其中Notch受体多肽包含S2蛋白水解裂解位点和S3蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为转录激活蛋白。在一个非限制性实施方案中，本公开的嵌合Notch受体多肽包括：a)细胞外结构域，其中细胞外结构域为CD4细胞外结构域；b)包含以下氨基酸序列的Notch受体多肽：IPYKIEAVKSEPVEPPLPSQLHLMYVA AAAFVLLFFVGCGVLLSRKRRRQLCIQKL(SEQ ID NO:4)；其中TM结构域加下划线，其中Notch受体多肽包含S2蛋白水解裂解位点和S3蛋白水解裂解位点；以及c)细胞内结构域，其中细胞内结构域为tTA转录激活蛋白。这一嵌合Notch受体多肽的实例示出于图29中。
核酸
本公开提供了一种包含编码本公开的嵌合Notch受体多肽的核苷酸序列的核酸。在一些情况下，包含编码本公开的嵌合Notch受体多肽的核苷酸序列的核酸包含在表达载体内。因此，本公开提供了一种包含包含编码本公开的嵌合Notch受体多肽的核苷酸序列的核酸的重组表达载体。在一些情况下，编码本公开的嵌合Notch受体多肽的核苷酸序列可操作地连接至转录控制元件(例如，启动子、增强子等)。在一些情况下，转录控制元件为诱导型。在一些情况下，转录控制元件为组成型。在一些情况下，启动子在真核细胞中具有功能。在一些情况下，启动子为细胞类型特异性启动子。在一些情况下，启动子为组织特异性启动子。
根据所利用的宿主/载体系统，多种合适的转录和翻译控制元件(包括组成型和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等)中的任一个可用于表达载体中(参见，例如Bitter等人(1987)Methods in Enzymology,153:516-544)。
启动子可以是组成型活性启动子(即，组成型地处于活性/“开”状态的启动子)，可以是诱导型启动子(即，其状态，活性/“开”或失活/“关”，是通过外部刺激，例如特定温度、化合物或蛋白质的存在控制的启动子)，可以是空间上受到限制的启动子(即，转录控制元件、增强子等)(例如，组织特异性启动子、细胞类型特异性启动子等)，并且可以是时间上受到限制的启动子(即，启动子在胚胎发育的特定阶段期间或在生物学过程的特定阶段期间(例如，小鼠中的毛囊周期)处于“开”状态或“关”状态)。
合适的启动子和增强子元件在本领域中是已知的。对于细菌细胞中的表达，合适的启动子包括但不限于lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP和trc。对于真核细胞中的表达，合适的启动子包括但不限于轻链和/或重链免疫球蛋白基因启动子和增强子元件；细胞巨化病毒立即早期启动子；单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子；早期和晚期SV40启动子；来自逆转录病毒的长末端重复序列上存在的启动子；小鼠金属硫蛋白-I启动子；以及各种本领域已知的组织特异性启动子。
合适的可逆启动子(包括可逆的诱导型启动子)在本领域中是已知的。此类可逆启动子可分离和衍生自许多生物体，例如真核生物和原核生物。对衍生自第一生物体的可逆启动子进行修饰以用于第二生物体(例如，第一原核生物和第二真核生物、第一真核生物和第二原核生物等)在本领域中是众所周知的。此类可逆启动子以及基于此类可逆启动子但还包括另外的控制蛋白的系统包括但不限于醇调控启动子(例如，醇脱氢酶I(alcA)基因启动子、响应于醇反式激活蛋白(AlcR)的启动子等)、四环素调控启动子(例如，包括TetActivator、TetON、TetOFF的启动子等)、类固醇调控启动子(例如，大鼠糖皮质激素受体启动子系统、人雌激素受体启动子系统、类视黄醇启动子系统、甲状腺启动子系统、蜕皮激素启动子系统、米非司酮启动子系统等)、金属调控启动子(例如，金属硫蛋白启动子系统等)、致病相关调控启动子(例如，水杨酸调控启动子、乙烯调控启动子、苯并噻二唑调控启动子等)、温度调控启动子(例如，热激诱导型启动子(例如，HSP-70、HSP-90、大豆热激启动子等)、光调控启动子、合成诱导型启动子等。
适用的诱导型启动子包括本文所述的或本领域的普通技术人员已知的任何诱导型启动子。诱导型启动子的实例包括但不限于化学/生物调控和物理调控的启动子，诸如醇调控启动子、四环素调控启动子(例如，无水四环素(aTc)-应答型启动子和其他四环素-应答型启动子系统，其包括四环素阻遏蛋白(tetR)、四环素操纵子序列(tetO)和四环素反式激活蛋白融合蛋白(tTA))、类固醇调控启动子(例如，基于大鼠糖皮质激素受体、人雌激素受体、蛾蜕皮激素受体的启动子，以及来自类固醇/类视黄醇/甲状腺受体超家族的启动子)、金属调控启动子(例如，衍生自来自酵母、小鼠和人的金属硫蛋白(结合和螯合金属离子的蛋白质)基因的启动子)、致病调控启动子(例如，由水杨酸、乙烯或苯并噻二唑(BTH)诱导)、温度/热诱导型启动子(例如，热激启动子)、以及光调控启动子(例如，来自植物细胞的光应答型启动子)。
在一些情况下，启动子为CD8细胞特异性启动子、CD4细胞特异性启动子、中性粒细胞特异性启动子或NK特异性启动子。例如，可使用CD4基因启动子，参见，例如，Salmon等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:7739；以及Marodon等人(2003)Blood101:3416。作为另一实例，可使用CD8基因启动子。NK细胞特异性表达可通过Ncr1(p46)启动子的使用实现，参见，例如，Eckelhart等人(2011)Blood 117:1565。
在一些情况下，启动子为心肌细胞特异性启动子。在一些情况下，启动子为平滑肌细胞特异性启动子。在一些情况下，启动子为神经元特异性启动子。在一些情况下，启动子为脂肪细胞特异性启动子。其他细胞类型特异性启动子在本领域中是已知的并且适用于本文。
在一些情况下，包含编码本公开的嵌合Notch受体多肽的核苷酸序列的核酸为重组表达载体。在一些实施方案中，重组表达载体为病毒载体，例如，重组腺相关病毒(AAV)构建体、重组腺病毒构建体、重组慢病毒构建体、重组逆转录病毒构建体等。在一些情况下，包含编码本公开的嵌合Notch受体多肽的核苷酸序列的核酸为重组慢病毒载体。在一些情况下，包含编码本公开的嵌合Notch受体多肽的核苷酸序列的核酸为重组AAV载体。
合适的表达载体包括但不限于病毒载体(例如，基于以下各项的病毒载体：牛痘病毒；脊髓灰质炎病毒；腺病毒(参见，例如Li等人,Invest Opthalmol Vis Sci 35:25432549,1994；Borras等人,Gene Ther6:515 524,1999；Li和Davidson,PNAS 92:7700 7704,1995；Sakamoto等人,Hum Gene Ther 5:1088 1097,1999；WO 94/12649；WO 93/03769；WO93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655)；腺相关病毒(参见，例如，Ali等人,Hum Gene Ther 9:81 86,1998；Flannery等人,PNAS 94:6916 6921,1997；Bennett等人,Invest Opthalmol Vis Sci38:2857 2863,1997；Jomary等人,Gene Ther 4:683 690,1997；Rolling等人,Hum Gene Ther 10:641 648,1999；Ali等人,Hum Mol Genet5:591594,1996；WO 93/09239中的Srivastava；Samulski等人,J.Vir.(1989)63:3822-3828；Mendelson等人,Virol.(1988)166:154-165；以及Flotte等人,PNAS(1993)90:10613-10617)；SV40；纯疱疹病毒；人免疫缺陷病毒(参见，例如，Miyoshi等人,PNAS 94:10319 23,1997；Takahashi等人,J Virol 73:7812 7816,1999)；逆转录病毒载体(例如，鼠白血病病毒、脾坏死病毒、以及衍生自逆转录病毒的载体，所述逆转录病毒诸如劳斯肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、慢病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增生肉瘤病毒以及乳腺肿瘤病毒)；等等。在一些情况下，载体为慢病毒载体。另外合适的是转座子介导的载体，诸如piggyback和sleeping beauty载体。
宿主细胞
本公开提供了用本公开的核酸遗传修饰的宿主细胞，即，用包含编码本公开的嵌合Notch受体多肽的核苷酸序列的核酸遗传修饰的宿主细胞。本公开提供了一种调节表达本公开的嵌合Notch多肽的细胞的活性的方法。所述方法通常包括使细胞与特异性结合对的第二成员接触。特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员的结合在一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点处诱导Notch受体多肽的裂解，从而释放细胞内结构域。细胞内结构域的释放调节细胞的活性。
在一些情况下，细胞为真核细胞。在一些情况下，细胞为哺乳动物细胞、两栖动物细胞、爬行动物细胞、禽类细胞或植物细胞。在一些情况下，细胞为植物细胞。
在一些情况下，细胞为哺乳动物细胞。在一些情况下，细胞为人细胞。在一些情况下，细胞为小鼠细胞。在一些情况下，细胞为大鼠细胞。在一些情况下，细胞为非人灵长类动物细胞。在一些情况下，细胞为兔类动物细胞。在一些情况下，细胞为有蹄类动物细胞。
在一些情况下，细胞为免疫细胞，例如，T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、单核细胞等。在一些情况下，细胞为T细胞。在一些情况下，细胞为细胞毒性T细胞(例如，CD8+T细胞)。在一些情况下，细胞为辅助T细胞(例如，CD4+T细胞)。在一些情况下，细胞为调节T细胞(“Treg”)。在一些情况下，细胞为B细胞。在一些情况下，细胞为巨噬细胞。在一些情况下，细胞为树突细胞。在一些情况下，细胞为外周血单核细胞。在一些情况下，细胞为单核细胞。在一些情况下，细胞为自然杀伤(NK)细胞。在一些情况下，细胞为CD4+、FOXP3+Treg细胞。在一些情况下，细胞为CD4+、FOXP3-Treg细胞。
在一些情况下，由个体获得细胞。例如，在一些情况下，细胞为原代细胞。作为另一实例，细胞为获自个体的干细胞或祖细胞。
作为一个非限制性实例，作为一个实例，细胞为获自个体的免疫细胞。作为另一实例，细胞可以是获自个体的T淋巴细胞。作为另一实例，细胞为获自个体的细胞毒性细胞(例如，细胞毒性T细胞)。作为另一实例，细胞可以是获自个体的辅助T细胞。作为另一实例，细胞可以是获自个体的调节T细胞。作为另一实例，细胞可以是获自个体的NK细胞。作为另一实例，细胞可以是获自个体的巨噬细胞。作为另一实例，细胞可以是获自个体的树突细胞。作为另一实例，细胞可以是获自个体的B细胞。作为另一实例，细胞可以是获自个体的外周血单核细胞。
在一些情况下，宿主细胞为体细胞，例如，成纤维细胞、造血细胞、神经元、胰腺细胞、肌细胞、骨细胞、肝细胞、胰腺细胞、上皮细胞、内皮细胞、心肌细胞、T细胞、B细胞、骨细胞等。
在一些情况下，细胞经遗传修饰，以表达本公开的两种不同的嵌合Notch受体多肽。例如，在一些情况下，宿主细胞经遗传修饰以表达：i)包括第一特异性结合对的第一成员的第一嵌合Notch受体多肽；以及ii)包括第二特异性结合对的第一成员的至少第二嵌合Notch受体多肽，其中第一和第二特异性结合对彼此不同，由此使得第一特异性结合对的第二成员与第一特异性结合对的第一成员的结合不导致第二嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域的释放，且使得第二特异性结合对的第二成员与第二特异性结合对的第一成员的结合不导致第一第二嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域的释放。
在一些情况下，细胞经遗传修饰以表达本公开的嵌合Notch受体多肽。在一些情况下，细胞经遗传修饰以表达本公开的嵌合Notch受体多肽，并且经进一步遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)。例如，在一些情况下，宿主细胞用包含编码CAR的核苷酸序列的核酸进行遗传修饰，并且嵌合多肽的细胞内结构域为转录激活蛋白。在一些情况下，编码CAR的核苷酸序列可操作地连接至通过嵌合多肽的细胞内结构域激活的转录控制元件。许多CAR多肽已经在本领域中有所描述，并且其中的任一个适用于本文。
在一些情况下，CAR包括细胞外结构域、跨膜区域和细胞内信号传导结构域；其中细胞外结构域包括连接至能够将细胞外结构域拴系至细胞表面的任选的支持区域的配体或受体，并且细胞内信号传导结构域包括来自人CD3复合物的ζ链(CD3ζ)的信号传导结构域和一个或多个共刺激信号传导结构域，诸如来自CD28、4-1BB和OX-40的那些。细胞外结构域包含使CAR能够结合靶标的识别元件(例如，抗体或其他靶标结合支架)。在一些情况下，CAR包括连接至T细胞信号传导结构域的抗体(例如scFv)的抗原结合结构域。在一些情况下，当在T细胞表面上表达时，CAR可将T细胞活性引导至表达该识别元件对其具有特异性的受体或配体的那些细胞。作为一个实例，包含含有对肿瘤抗原具有特异性的识别元件的细胞外结构域的CAR可将T细胞活性引导至携带肿瘤抗原的肿瘤细胞。细胞内结构域使细胞(例如T细胞)能够接受共刺激信号。共刺激信号传导结构域可选自CD28、4-1BB、OX-40或这些的任何组合。示例性CAR包括人CD4跨膜区域、人IgG4 Fc以及肿瘤特异性的受体或配体，诸如IL13或IL3分子。
细胞外结构域由连接至能够将细胞外结构域拴系至细胞表面的任选的支持区域的可溶性受体配体(其对靶肿瘤抗原或其他肿瘤细胞表面分子具有特异性)构成。在一些情况下，CAR为异源二聚化的条件性活性CAR，如WO 2014/127261中所述。在一些实施方案中，异源二聚化的条件性活性CAR通过以下各项激活：i)结合CAR对其具有特异性的抗原；以及ii)诱导异源二聚化的条件性活性CAR的两条多肽链的二聚反应的二聚化试剂。二聚化试剂可以是小分子，或可以是光。
转基因生物体
本公开提供了包含编码本公开的嵌合Notch多肽的核酸的非人转基因生物体。本公开的转基因非人生物体包括已经经过遗传修饰以包括包含编码本公开的嵌合Notch多肽的核苷酸序列的核酸的基因组。
产生经遗传修饰的生物体的方法在本领域中是已知的。例如，参见Cho等人,CurrProtoc Cell Biol.2009年3月；第19章:第19.11单元:Generation of transgenic mice；Gama等人,Brain Struct Funct.2010年3月；214(2-3):91-109.Epub 2009年11月25日:Animal transgenesis:an overview；以及Husaini等人,GM Crops.2011年6-12月；2(3):150-62.Epub 2011年6月1日:Approaches for gene targeting and targeted geneexpression in plants。
在本公开的非人转基因生物体中，包含编码本公开的嵌合Notch多肽的核苷酸序列的核酸可处于未知启动子的控制下(例如，可操作地连接)(例如，当核酸随机整合到宿主基因组中时)或者可处于已知启动子的控制下(例如，可操作地连接)。合适的已知启动子可以是任何已知启动子并且包括组成型活性启动子(例如，CMV启动子)、诱导型启动子(例如，热激启动子、四环素调控启动子、类固醇调控启动子、金属调控启动子、雌激素受体调控启动子等)、空间上受到限制和/或时间上受到限制的启动子(例如，组织特异性启动子、细胞类型特异性启动子等)等。
主题经遗传修饰的生物体(例如，其基因组包含编码本公开的嵌合Notch多肽的核苷酸序列的生物体)可以是任何生物体，包括例如，植物；无脊椎动物(例如，刺胞动物、棘皮动物、蠕虫、蝇等)；非哺乳类脊椎动物(例如，鱼(例如，斑马鱼、河豚鱼、金鱼等))；两栖动物(例如，蝾螈、青蛙等)；爬行动物；鸟；哺乳动物等)；有蹄类动物(例如，山羊、猪、绵羊、奶牛等)；啮齿类动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠)；兔类动物(例如，兔子)；等等。在一些情况下，转基因非人生物体为小鼠。在一些情况下，转基因非人生物体为大鼠。在一些情况下，转基因非人生物体为植物。
在一些实施方案中，转基因非人动物对于编码本公开的嵌合Notch多肽的转基因而言是纯合的。在一些实施方案中，转基因非人动物对于编码本公开的嵌合Notch多肽的转基因而言是杂合的。
方法
本公开的嵌合Notch受体多肽和本公开的核酸(包含编码嵌合Notch受体多肽的核苷酸序列的核酸)以及本公开的包括核酸的重组表达载体适用于多种应用。本公开提供了此类应用。
本公开提供了一种调节表达本公开的嵌合Notch多肽的细胞的活性的方法。本公开的用于调节细胞活性的方法可在体外、离体或在体内进行。本公开的用于调节细胞活性的方法可在单个细胞中或在多细胞环境(例如，天然存在的组织；人工组织等)中进行。本公开的用于调节细胞活性的方法可并行或连续进行。
调节细胞活性的方法
本公开提供了一种调节表达本公开的嵌合Notch多肽的细胞的活性的方法。在一些情况下，所述方法包括：使细胞与特异性结合对的第二成员接触，其中特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员的结合在一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点处诱导Notch受体多肽的裂解，从而释放细胞内结构域，其中细胞内结构域的释放调节细胞的活性。细胞内结构域提供“效应子功能”，其中效应子功能可以是转录激活；转录阻遏；翻译激活；翻译阻遏；细胞器功能的调节；免疫细胞激活；免疫细胞阻遏；细胞凋亡的诱导；细胞凋亡的阻遏；核酸酶活性；分化的调控；靶核酸的替换；靶核酸的修饰等。可使用本公开的方法调节的细胞的活性包括但不限于免疫细胞激活(例如，T细胞激活等)；细胞凋亡；效应分子(例如，细胞因子、抗体、生长因子等)的产生；靶核酸的转录；靶mRNA的翻译；细胞器活性；细胞内运输；分化；等等。本公开的方法还可用于导致作用于质膜的效应子的释放，从而引起细胞活性的改变(例如，提供免疫活化的免疫共抑制受体基序的释放)。
本公开提供了一种在表达本公开的嵌合Notch多肽的细胞中诱导效应子功能的方法。在一些情况下，所述方法包括：使细胞与特异性结合对的第二成员接触，其中特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员的结合在一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点处诱导Notch受体多肽的裂解，从而释放细胞内结构域，其中细胞内结构域提供效应子功能，其中细胞内结构域的释放在细胞中提供效应子功能的作用。
在一些情况下，特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员的结合在一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点处诱导Notch受体多肽的裂解，从而释放细胞内结构域，其中细胞内结构域为细胞凋亡诱导剂。在一些情况下，特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员的结合在一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点处诱导Notch受体多肽的裂解，从而释放细胞内结构域，其中细胞内结构域为重组酶。在一些情况下，特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员的结合在一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点处诱导Notch受体多肽的裂解，从而释放细胞内结构域，其中细胞内结构域为Cas9多肽。在一些情况下，特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员的结合在一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点处诱导Notch受体多肽的裂解，从而释放细胞内结构域，其中细胞内结构域为dCas9多肽。在一些情况下，特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员的结合在一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点处诱导Notch受体多肽的裂解，从而释放细胞内结构域，其中细胞内结构域为转录激活蛋白。在一些情况下，特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员的结合在一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点处诱导Notch受体多肽的裂解，从而释放细胞内结构域，其中细胞内结构域为转录阻遏蛋白。
本公开的方法可在体内、体外或离体进行。
在一些情况下，本公开的方法离体进行，其中细胞从个体中获得，并且经遗传修饰以表达：i)单个本公开的嵌合Notch受体多肽；ii)两个或更多个本公开的嵌合Notch受体多肽；iii)本公开的嵌合Notch受体多肽和CAR；或iv)本公开的嵌合Notch受体多肽以及在细胞中提供非内源性应答能力的天然存在或合成的受体。
作为一个非限制性实例，本公开提供了一种在患有癌症的个体中治疗癌症的方法，所述方法包括：i)用包含编码本公开的嵌合Notch受体多肽的核苷酸序列的表达载体对获自个体的T淋巴细胞或自然杀伤(NK)细胞进行遗传修饰，其中嵌合Notch受体多肽对个体中的癌细胞上的表位具有特异性，并且其中遗传修饰离体进行；ii)将经遗传修饰的T淋巴细胞或NK细胞引入个体中，其中经遗传修饰的T淋巴细胞或NK识别并杀死癌细胞，从而治疗癌症。
在一些情况下，本公开的方法在体内进行，例如，其中向有需要的个体施用包含编码本公开的嵌合Notch受体多肽的核苷酸序列的表达载体。向个体施用表达载体的方法在本领域中是已知的；用于向个体施用表达载体的任何已知方法均适用于本公开的方法。
在一些情况下，本公开的方法在体外进行，例如，在体外细胞培养物中，其中作为单个细胞生长在悬液中的细胞、生长在固体支持体上的细胞、生长在3维支架中的细胞等。
效应子功能的直接控制
本公开提供了一种调节表达本公开的嵌合Notch多肽的细胞的活性的方法。如上文所详述，嵌合Notch多肽包括包含特异性结合对的第一成员的细胞外结构域。嵌合Notch多肽还包括包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点的Notch受体多肽；以及细胞内结构域。在一些情况下，所述方法包括：使细胞与特异性结合对的第二成员接触，其中特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员的结合在一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点处诱导Notch受体多肽的裂解，从而释放细胞内结构域，其中细胞内结构域的释放调节细胞的活性。在一些情况下，特异性结合对的第二成员存在于接触表达本公开的嵌合Notch多肽的细胞的第二细胞的细胞表面上。在一些情况下，特异性结合对的第二成员是可溶的。
在一些情况下，所释放的细胞内结构域直接调节表达本公开的嵌合Notch多肽的细胞。这一实施方案示意性地示出于图5中。
作为效应子功能的直接控制的一个非限制性实例，本公开的嵌合Notch受体多肽包括包含对配体具有特异性的scFv的细胞外结构域以及作为细胞内结构域的细胞凋亡调控子(例如，tBID)。嵌合Notch受体多肽在第一细胞的表面上表达。在与第二细胞的表面上的特异性结合对的第二成员(在此情况下为scFv特异性结合的配体(抗原))结合时，tBID在第一细胞中被释放并且在第一细胞中诱导细胞凋亡。该实例示意性地示出于图6中。
效应子功能的间接控制
本公开提供了一种调节表达本公开的嵌合Notch多肽的细胞的活性的方法。如上文所详述，嵌合Notch多肽包括包含特异性结合对的第一成员的细胞外结构域。嵌合Notch多肽还包括包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点的Notch受体多肽；以及细胞内结构域。在一些情况下，所述方法包括：使细胞与特异性结合对的第二成员接触，其中特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员的结合在一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点处诱导Notch受体多肽的裂解，从而释放细胞内结构域。在一些情况下，特异性结合对的第二成员存在于接触表达本公开的嵌合Notch多肽的细胞的第二细胞的细胞表面上。在一些情况下，特异性结合对的第二成员是可溶的。
在一些情况下，所释放的细胞内结构域为在释放时调控靶核酸的表达(例如，增加转录、减少转录、增加翻译、减少翻译等)的转录因子或翻译因子。在一些情况下，所释放的细胞内结构域为在释放时诱导效应基因的转录，从而导致由效应基因编码的基因产物(例如，效应子多肽；效应子核酸)的产生的转录因子。效应子功能的这一“间接”控制的实例示出于图7中。在一些情况下，效应子多肽是细胞凋亡诱导剂、活化性免疫受体、抑制性免疫受体、转录因子、细胞凋亡抑制剂、分泌因子(例如，细胞因子；激素；趋化因子；抗体；改变细胞响应于一种或多种内源性因子的能力的受体；显性负性调控蛋白；细胞内阻断蛋白等)或位点特异性核酸酶。在一些情况下，所释放的细胞内结构域为在释放时调节(增加或减少)靶基因产物的翻译、mRNA稳定性或蛋白加工的多肽，其中靶基因产物提供效应子功能。
作为效应子功能的间接控制的一个非限制性实例，本公开的嵌合Notch受体多肽包括包含对配体具有特异性的scFv的细胞外结构域以及包括转录因子(例如，tTa)的细胞内结构域。嵌合Notch受体多肽在第一细胞的表面上表达。在与第二细胞的表面上的特异性结合对的第二成员(在此情况下为scFv特异性结合的配体(抗原))结合时，转录因子(在此情况下，tTa)在第一细胞中被释放并且诱导编码细胞凋亡诱导剂(在此情况下，tBID)的核酸的转录。tBID在第一细胞中产生并且在第一细胞中诱导细胞凋亡。该实例示意性地示出于图8中。
嵌合notch受体多肽在生物试剂的定向递送和分泌中的使用
本公开的嵌合Notch受体多肽可用于控制生物分子的表达和分泌，所述生物分子诸如细胞因子、生长因子、抗体、以及遗传编码的其他结合剂、激动剂、捕集剂或阻断剂。
嵌合Notch受体(或协同作用的嵌合Notch受体的组合)的结合可用于在体内感测特定区域、组织或细胞类型，然后触发分泌的生物物质向所述位点的定位表达/递送。生物物质的递送的控制可通过间接控制(试剂的转录的控制)或通过生物物质的表达、加工和分泌中涉及的其他过程的控制实现。
嵌合Notch受体多肽的组合使用–并行的多个受体；嵌合Notch多肽和CAR
本公开提供了一种调节细胞的活性的方法，所述细胞表达：i)本公开的嵌合Notch多肽；以及b)嵌合抗原受体。所述方法包括使表达本公开的嵌合Notch受体多肽和CAR两者的细胞与以下各项接触：i)特异性结合对的第二成员(其中特异性结合对的第二成员与特异性结合对的存在于嵌合Notch受体多肽中的第一成员结合)；以及ii)CAR所结合的抗原。在这些实施方案中，细胞活性的调节需要特异性结合对的第二成员和CAR所特异性结合的抗原两者。
在一些情况下，CAR包括细胞外结构域、跨膜区域和细胞内信号传导结构域；其中细胞外结构域包括连接至能够将细胞外结构域拴系至细胞表面的任选的支持区域的配体或受体，并且细胞内信号传导结构域包括来自人CD3复合物的ζ链(CD3ζ)的信号传导结构域和一个或多个共刺激信号传导结构域，诸如来自CD28、4-1BB和OX-40的那些。细胞外结构域包含使CAR能够结合靶标的识别元件(例如，抗体或其他靶标结合支架)。在一些情况下，CAR包括连接至T细胞信号传导结构域的抗体(例如scFv)的抗原结合结构域。在一些情况下，当在T细胞表面上表达时，CAR可将T细胞活性引导至表达该识别元件对其具有特异性的受体或配体的那些细胞。作为一个实例，包含含有对肿瘤抗原具有特异性的识别元件的细胞外结构域的CAR可将T细胞活性引导至携带肿瘤抗原的肿瘤细胞。细胞内结构域使细胞(例如T细胞)能够接受共刺激信号。共刺激信号传导结构域可选自CD28、4-1BB、OX-40或这些的任何组合。示例性CAR包括人CD4跨膜区域、人IgG4 Fc以及肿瘤特异性的受体或配体，诸如IL13或IL3分子。
细胞外结构域由连接至能够将细胞外结构域拴系至细胞表面的任选的支持区域的可溶性受体配体(其对靶肿瘤抗原或其他肿瘤细胞表面分子具有特异性)构成。在一些情况下，CAR为异源二聚化的条件性活性CAR，如WO 2014/127261中所述。
嵌合notch受体也可用于类似地调节其活性并非组成型地存在于细胞中或其活性并非通常存在于细胞中的任何其他天然、嵌合或正交受体的活性，从而改变细胞所应答的信号。
嵌合Notch受体多肽的组合使用–并行的多个受体；两个不同的嵌合Notch多肽
本公开提供了一种调节细胞的活性的方法，所述细胞表达：i)本公开的第一嵌合Notch多肽；以及b)本公开的第二嵌合Notch多肽。例如，在一些情况下，所述细胞表达：i)包括第一特异性结合对的第一成员的第一嵌合Notch受体多肽；以及ii)包括第二特异性结合对的第一成员的至少第二嵌合Notch受体多肽，其中第一和第二特异性结合对彼此不同，由此使得第一特异性结合对的第二成员与第一特异性结合对的第一成员的结合不导致第二嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域的释放，且使得第二特异性结合对的第二成员与第二特异性结合对的第一成员的结合不导致第一第二嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域的释放。在这些实施方案中，第一嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域提供第一效应子功能，并且第二嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域提供不同于第一效应子功能的第二效应子功能。这些实施方案的示意图在图9A中给出。
本公开提供了一种调节细胞的活性的方法，所述细胞表达：i)本公开的第一嵌合Notch多肽；以及b)本公开的第二嵌合Notch多肽。例如，在一些情况下，所述细胞表达：i)包括第一特异性结合对的第一成员的第一嵌合Notch受体多肽；以及ii)包括第二特异性结合对的第一成员的至少第二嵌合Notch受体多肽，其中第一和第二特异性结合对彼此不同，由此使得第一特异性结合对的第二成员与第一特异性结合对的第一成员的结合不导致第二嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域的释放，且使得第二特异性结合对的第二成员与第二特异性结合对的第一成员的结合不导致第一第二嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域的释放。在这些实施方案中，第一嵌合Notch受体多肽的所释放的细胞内结构域与第二嵌合Notch受体多肽的所释放的细胞内结构域结合(或以其他方式与其可操作地相互作用)，以提供效应子功能。第一嵌合Notch受体多肽的释放的细胞内结构域自身不提供效应子功能；并且第二嵌合Notch受体多肽的释放的细胞内结构域自身不提供效应子功能。然而，两个释放的细胞内结构域一起提供效应子功能。这些实施方案的示意图在图9A中给出。
一个类似的实施方案可利用通过两个不同的嵌合Notch受体进行的间接调控，由此两个不同的嵌合Notch受体中的每一个将诱导效应子的表达，所述效应子仅在一起表达时将诱导效应子功能。
本公开的嵌合Notch受体也可用于类似地调节其活性并非组成型地存在于细胞中或并非通常存在于细胞中的任何其他天然、嵌合或正交受体的活性。
嵌合Notch受体多肽的组合使用–串联的多个受体；嵌合Notch多肽和CAR
本公开提供了一种调节细胞的活性的方法，所述细胞用以下各项遗传修饰：a)包含编码本公开的嵌合Notch多肽的核苷酸序列的核酸；以及b)包含编码嵌合抗原受体的核苷酸序列的核酸，其中编码嵌合抗原受体的核苷酸序列处于诱导型启动子的控制下。所述方法包括：i)使表达本公开的嵌合Notch受体多肽(但不表达CAR)的细胞与特异性结合对的第二成员接触(其中特异性结合对的第二成员与特异性结合对的存在于嵌合Notch受体多肽中的第一成员结合)，其中使细胞与特异性结合对的第二成员接触诱导嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域的释放，其中细胞内结构域为激活包括编码嵌合抗原受体的核苷酸序列的核酸的转录，从而导致CAR的表达的转录因子；以及ii)在(i)的接触步骤之后，使细胞与CAR所结合的抗原接触。第二接触步骤导致通过CAR实现活性的调节。在这些实施方案中，细胞活性的调节需要特异性结合对的第二成员和CAR所特异性结合的抗原两者。这些实施方案的实例示意性地示出于图10中。
本公开的嵌合Notch受体也可用于类似地调节其活性并非组成型地存在于细胞中或并非通常存在于细胞中的任何其他天然、嵌合或正交受体的活性。
在一些情况下，细胞经遗传修饰，以产生两种或更多种本公开的嵌合Notch受体多肽。因此，在一些情况下，本公开提供了一种调节细胞的活性的方法，所述细胞用以下各项遗传修饰：a)包含编码两种或更多种(例如，2、3、4或更多种)本公开的嵌合Notch多肽的核苷酸序列的核酸；以及b)包含编码嵌合抗原受体的核苷酸序列的核酸，其中编码嵌合抗原受体的核苷酸序列处于诱导型启动子的控制下。所述方法包括：i)使表达两种或更多种本公开的嵌合Notch受体多肽(但不表达CAR)的细胞与特异性结合对的第二成员接触(其中特异性结合对的第二成员与特异性结合对的存在于嵌合Notch受体多肽中的第一成员结合)，其中使细胞与特异性结合对的第二成员接触诱导两种或更多种嵌合Notch受体多肽中的至少一个的细胞内结构域的释放，其中细胞内结构域为激活包含编码嵌合抗原受体的核苷酸序列的核酸的转录，从而导致CAR的表达的转录因子；以及ii)在(i)的接触步骤之后，使细胞与CAR所结合的抗原接触。第二接触步骤导致通过CAR实现活性的调节。在这些实施方案中，细胞活性的调节需要特异性结合对的第二成员和CAR所特异性结合的抗原两者。
本公开的嵌合Notch受体也可用于类似地调节任何其他天然、嵌合或正交受体的活性，其活性并非组成型地存在于细胞中或并非通常存在于细胞中。一起起作用的多个嵌合Notch受体多肽可类似地用于调节任何其他天然、嵌合或正交受体的活性，其活性并非组成型地存在于细胞中或并非通常存在于细胞中。
嵌合Notch受体多肽的组合使用–串联的多个受体；两个不同的嵌合Notch多肽
本公开提供了一种调节细胞的活性的方法，所述细胞用以下各项遗传修饰：i)包含编码本公开的第一嵌合Notch多肽的核苷酸序列的核酸；以及b)包含编码本公开的第二嵌合Notch多肽的核苷酸序列的核酸。例如，在一些情况下，细胞用以下各项遗传修饰：i)包含编码包括第一特异性结合对的第一成员的第一嵌合Notch受体多肽的核苷酸序列的核酸；以及ii)包含编码包括第二特异性结合对的第一成员的至少第二嵌合Notch受体多肽的核苷酸序列的核酸，其中第一和第二特异性结合对彼此不同，由此使得第一特异性结合对的第二成员与第一特异性结合对的第一成员的结合不导致第二嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域的释放，且使得第二特异性结合对的第二成员与第二特异性结合对的第一成员的结合不导致第一第二嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域的释放。在这些实施方案中，第一嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域提供第一效应子功能，其中所述效应子功能提供第二嵌合Notch多肽的转录的诱导；并且第二嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域提供不同于第一效应子功能的第二效应子功能。
所述方法包括：i)使表达第一嵌合Notch受体多肽(但不表达第二嵌合Notch受体多肽)的细胞与第一特异性结合对的第二成员接触(其中第一特异性结合对的第二成员与第一特异性结合对的存在于第一嵌合Notch受体多肽中的第一成员结合)，其中使细胞与第一特异性结合对的第二成员接触诱导第一嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域的释放，其中第一嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域为激活包含编码第二嵌合Notch受体多肽的核苷酸序列的核酸的转录，从而导致第二嵌合Notch受体多肽的表达的转录因子；以及ii)在(i)的接触步骤之后，使细胞与第二特异性结合对的第二成员接触(其中第二特异性结合对的第二成员与第二特异性结合对的存在于第二嵌合Notch受体多肽中的第一成员结合)。第二接触步骤导致第二嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域的释放，其中第二嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域提供调节细胞的活性的效应子功能。在这些实施方案中，细胞活性的调节需要使细胞首先与第一特异性结合对的第二成员接触，接着与第二特异性结合对的第二成员接触。这些实施方案的实例示意性地示出于图11中。
两种或更多种本公开的嵌合Notch受体也可串联用于以此方式类似地调节任何其他天然、嵌合或正交受体的活性，其活性并非组成型地存在于细胞中或并非通常存在于细胞中。
涉及具有两个或更多个细胞的多受体电路的方法
本公开提供了一种用于调节第一细胞的活性的方法，所述方法包括使第一细胞与第二细胞接触，其中第二细胞表达包括包含特异性结合对的第一成员的细胞外结构域的嵌合Notch受体多肽；并且其中第二细胞在其表面上表达包括特异性结合对的第二成员的分子。在一些情况下，使第一细胞与第二细胞接触调节第一细胞中的活性。在一些情况下，使第一细胞与第二细胞接触调节第二细胞中的活性。
本公开提供了一种调节第一细胞的活性的方法，所述方法包括使第一细胞与第二细胞接触，其中第二细胞表达包括包含第一特异性结合对的第一成员的细胞外结构域的第一嵌合Notch受体多肽；并且第一细胞表达包括包含第二特异性结合对的第一成员的细胞外结构域的第二嵌合Notch受体多肽，并且其中第一细胞包括包含编码CAR的核苷酸序列的核酸。使第二细胞与第一特异性结合对的第二成员接触，从而导致第一嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域的释放，其中第一嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域为诱导编码第二特异性结合对的第二成员的核酸的转录的转录因子。第二特异性结合对的第二成员在第二细胞的表面上表达。当在第二细胞的表面上表达的第二特异性结合对的第二成员与第一细胞接触时，第二特异性结合对的第二成员与存在于第一细胞的细胞表面上的第二嵌合Notch受体多肽中存在的第一成员结合，从而导致第二嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域的释放。第二嵌合Notch受体多肽的细胞内结构域可以是，例如，诱导CAR的全部或部分的转录，由此使得CAR在第一细胞的表面上表达的转录因子。在一些情况下，存在于第二细胞的表面上的第一嵌合Notch受体多肽和存在于第一细胞的表面上的CAR识别存在于第三细胞的表面上的两个单独的抗原。在一些情况下，第三细胞为靶细胞。在一些情况下，第二细胞为“辅助细胞”，当与第一抗原接触时，其导致CAR在第一细胞的表面上的表达，其中CAR识别靶细胞上的第二抗原。这些实施方案示意性地示出于图12中。
在多细胞环境中调节细胞活性的方法
本公开的用于调节细胞活性的方法可在多细胞环境中进行。例如，存在于第一细胞(“第一接收器细胞”)中的第一嵌合Notch受体多肽可包括细胞内结构域，所述细胞内结构域当在与相邻细胞(例如，“发送器”细胞)上的第一配体结合之后被释放时提供第二细胞上的第二嵌合Notch受体多肽所结合的第二配体的转录，其中第二配体在第一细胞的表面上表达。第二细胞(“第二接收器细胞”)在其表面上表达第二嵌合Notch受体多肽；在与第一接收器细胞相互作用时，第二接收器细胞中的细胞内效应子功能被释放并且提供第二接收器细胞的活性的调节。这些实施方案示意性地示出于图13中。这一方法适用于，例如，构建器官化组织；追踪细胞连通性等。
涉及靶细胞的双重识别的调节细胞活性的方法
在一些情况下，本公开的用于调节细胞活性的方法涉及靶细胞上的两个单独的靶分子的识别。例如，表达本公开的嵌合Notch受体多肽的第一细胞识别靶细胞上的第一靶分子；并且在其细胞表面上表达受体或其他识别分子的第二细胞结合靶细胞上的第二靶分子。第一和第二细胞与靶细胞上的第一和第二靶分子的结合导致通过第二细胞表达新的效应子功能(例如新的基因产物，诸如新的多肽)。在一些情况下，第一细胞与靶细胞上的第一靶分子的结合在第一细胞中诱导基因产物(例如，多肽)的表达；其中在一些情况下，由第一细胞产生的新的基因产物在第一细胞的表面上表达并且与第二细胞的表面上的受体或其他识别分子结合，所述结合可导致第二细胞的活性的调节(例如，核酸转录的诱导，由此使得第二细胞表达新的效应子功能(例如，新的基因产物，诸如新的多肽))。在一些情况下，第一和第二细胞与靶细胞上的第一和第二靶分子的结合导致通过第二细胞杀死靶细胞，或通过第二细胞表达的新的效应子功能杀死靶细胞。在一些情况下，第一和第二细胞与靶细胞上的第一和第二靶分子的结合导致靶细胞的活性的调节；例如，其中靶细胞的活性的调节由第二细胞产生的新的效应子功能诱导。这些实施方案示意性地示出于图14中。
方法
本公开提供了一种调节表达结合触发的转录开关(例如，本公开的嵌合Notch多肽；MESA多肽；TANGO多肽等)的细胞的活性的方法。本公开的用于调节细胞活性的方法可在体外、离体或在体内进行。本公开的用于调节细胞活性的方法可在单个细胞中或在多细胞环境(例如，天然存在的组织；人工组织等)中进行。本公开的用于调节细胞活性的方法可并行或连续进行。
本公开提供了一种局部调节细胞活性的方法。所述方法通常包括：a)在细胞中表达包括包含特异性结合对的第一成员的细胞外结构域、结合转导子和细胞内结构域的结合触发的转录开关；以及b)使细胞与特异性结合对的第二成员接触。特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员的结合诱导结合转导子转导结合信号，以激活细胞内结构域，从而产生活化的细胞内结构域。活化的细胞内结构域调节细胞的活性。可使用所述方法调节的细胞的活性包括但不限于：i)细胞的基因产物的表达；ii)细胞的增殖；iii)细胞的细胞凋亡；iv)细胞的非细胞凋亡性死亡；v)细胞的分化；vi)细胞的去分化；vii)细胞的迁移；viii)分子从细胞中的分泌；以及ix)细胞的细胞粘附。在一些情况下，接触步骤在体内进行。在一些情况下，接触步骤离体进行。在一些情况下，接触步骤在体外进行。
本公开提供了一种局部调节细胞活性的方法。所述方法通常包括：a)在细胞中表达本公开的嵌合Notch多肽，其中嵌合Notch多肽包括：i)包括特异性结合对的第一成员的细胞外结构域；ii)Notch受体多肽，其中Notch受体多肽如上文所述，并且包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及iii)细胞内结构域；以及b)使细胞与特异性结合对的第二成员接触。特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员的结合在一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点处诱导Notch受体多肽的裂解，从而释放细胞内结构域。释放的细胞内结构域调节细胞的活性。可使用所述方法调节的细胞的活性包括但不限于：i)细胞的基因产物的表达；ii)细胞的增殖；iii)细胞的细胞凋亡；iv)细胞的非细胞凋亡性死亡；v)细胞的分化；vi)细胞的去分化；vii)细胞的迁移；viii)分子从细胞中的分泌；以及ix)细胞的细胞粘附。在一些情况下，接触步骤在体内进行。在一些情况下，接触步骤离体进行。在一些情况下，接触步骤在体外进行。
本公开提供了一种局部调节细胞活性的方法。所述方法通常包括：a)在细胞中表达包括包含特异性结合对的第一成员的细胞外结构域、结合转导子和细胞内结构域的MESA多肽；以及b)使细胞与特异性结合对的第二成员接触。特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员的结合诱导结合转导子转导结合信号，以释放细胞内结构域，从而产生释放的细胞内结构域。释放的细胞内结构域调节细胞的活性。可使用所述方法调节的细胞的活性包括但不限于：i)细胞的基因产物的表达；ii)细胞的增殖；iii)细胞的细胞凋亡；iv)细胞的非细胞凋亡性死亡；v)细胞的分化；vi)细胞的去分化；vii)细胞的迁移；viii)分子从细胞中的分泌；以及ix)细胞的细胞粘附。在一些情况下，接触步骤在体内进行。在一些情况下，接触步骤离体进行。在一些情况下，接触步骤在体外进行。
本公开提供了一种局部调节细胞活性的方法。所述方法通常包括：a)在细胞中表达包括包含特异性结合对的第一成员的细胞外结构域、结合转导子和细胞内结构域的TANGO多肽；以及b)使细胞与特异性结合对的第二成员接触。特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员的结合诱导结合转导子转导结合信号，以释放细胞内结构域，从而产生释放的细胞内结构域。释放的细胞内结构域调节细胞的活性。可使用所述方法调节的细胞的活性包括但不限于：i)细胞的基因产物的表达；ii)细胞的增殖；iii)细胞的细胞凋亡；iv)细胞的非细胞凋亡性死亡；v)细胞的分化；vi)细胞的去分化；vii)细胞的迁移；viii)分子从细胞中的分泌；以及ix)细胞的细胞粘附。在一些情况下，接触步骤在体内进行。在一些情况下，接触步骤离体进行。在一些情况下，接触步骤在体外进行。
在一些情况下，激活的(或释放的)细胞内结构域调节细胞的内源性基因产物的表达。在一些情况下，细胞的内源性基因产物为趋化因子、趋化因子受体、细胞因子、细胞因子受体、分化因子、生长因子、生长因子受体、激素、代谢酶、增殖诱导剂、受体、小分子第二信使合成酶、T细胞受体、转录激活蛋白、转录阻遏蛋白、转录激活蛋白、转录阻遏蛋白、翻译调控子、翻译激活蛋白、翻译阻遏蛋白、活化性免疫受体、细胞凋亡抑制剂、细胞凋亡诱导剂、免疫激活剂、免疫抑制剂或抑制性免疫受体。在一些情况下，内源性基因产物为分泌性基因产物。在一些情况下，内源性基因产物为细胞表面基因产物。在一些情况下，内源性基因产物为细胞内基因产物。在一些情况下，激活的细胞内结构域同时调节细胞中的两种或更多种内源性基因产物的表达。“激活的细胞内结构域”可以是释放的细胞内结构域(例如，通过结合触发的转录开关的蛋白水解裂解释放)。“激活的细胞内结构域”可以是磷酸化的细胞内结构域，例如，其中细胞内结构域在其非磷酸化状态中失活，并且在其磷酸化状态中具有活性。
在一些情况下，激活的(或释放的)细胞内结构域调节细胞中的异源性基因产物的表达。异源性基因产物为通常不由该细胞产生的基因产物。例如，可以用包含编码异源性基因产物的核苷酸序列的核酸对细胞进行遗传修饰。在一些情况下，异源性基因产物为趋化因子、趋化因子受体、嵌合抗原受体、细胞因子、细胞因子受体、分化因子、生长因子、生长因子受体、激素、代谢酶、病原体衍生蛋白、增殖诱导剂、受体、RNA引导性核酸酶、位点特异性核酸酶、小分子第二信使合成酶、T细胞受体、毒素衍生蛋白、转录激活蛋白、转录阻遏蛋白、转录激活蛋白、转录阻遏蛋白、翻译调控子、翻译激活蛋白、翻译阻遏蛋白、活化性免疫受体、抗体、细胞凋亡抑制剂、细胞凋亡诱导剂、工程化T细胞受体、免疫激活剂、免疫抑制剂、抑制性免疫受体、RNA引导的DNA结合蛋白、本公开的synNotch多肽、MESA多肽、TANGO多肽、CAR、TCR或第二结合触发的转录开关。在一些情况下，异源性基因产物为分泌性基因产物。在一些情况下，异源性基因产物为细胞表面基因产物。在一些情况下，异源性基因产物为细胞内基因产物。在一些情况下，激活的细胞内结构域同时调节细胞中的两种或更多种异源性基因产物的表达。“激活的细胞内结构域”可以是释放的细胞内结构域(例如，通过结合触发的转录开关的蛋白水解裂解释放)。“激活的细胞内结构域”可以是磷酸化的细胞内结构域，例如，其中细胞内结构域在其非磷酸化状态中失活，并且在其磷酸化状态中具有活性。
在一些情况下，激活的(或释放的)细胞内结构域在细胞中诱导异源性基因产物的表达，其中异源性基因产物为本公开的synNotch多肽。在一些情况下，释放的细胞内结构域为本公开的第一synNotch多肽的细胞内结构域，其中第一synNotch多肽的释放的细胞内结构域诱导本公开的第二synNotch多肽的表达。
在一些情况下，激活的(或释放的)细胞内结构域在细胞中诱导异源性基因产物的表达，其中异源性基因产物为CAR。在一些情况下，释放的细胞内结构域为本公开的synNotch多肽的细胞内结构域，其中synNotch多肽的释放的细胞内结构域诱导CAR的表达。
在一些情况下，激活的(或释放的)细胞内结构域在细胞中诱导异源性基因产物的表达，其中异源性基因产物为MESA多肽。在一些情况下，释放的细胞内结构域为本公开的synNotch多肽的细胞内结构域，其中synNotch多肽的释放的细胞内结构域诱导MESA多肽的表达。
在一些情况下，激活的(或释放的)细胞内结构域在细胞中诱导异源性基因产物的表达，其中异源性基因产物为TANGO多肽。在一些情况下，释放的细胞内结构域为本公开的synNotch多肽的细胞内结构域，其中synNotch多肽的释放的细胞内结构域诱导TANGO多肽的表达。
在一些情况下，激活的(或释放的)细胞内结构域在细胞中诱导异源性基因产物的表达，其中异源性基因产物为TCR。在一些情况下，释放的细胞内结构域为本公开的synNotch多肽的细胞内结构域，其中synNotch多肽的释放的细胞内结构域诱导TCR的表达。
在一些情况下，激活的(或释放的)细胞内结构域在细胞中诱导异源性基因产物的表达，其中异源性基因产物为MESA多肽。在一些情况下，释放的细胞内结构域为第一MESA多肽的细胞内结构域，其中第一MESA多肽的释放的细胞内结构域诱导第二MESA多肽的表达。
在一些情况下，激活的(或释放的)细胞内结构域在细胞中诱导异源性基因产物的表达，其中异源性基因产物为CAR。在一些情况下，释放的细胞内结构域为MESA多肽的细胞内结构域，其中MESA多肽的释放的细胞内结构域诱导CAR的表达。
在一些情况下，激活的(或释放的)细胞内结构域在细胞中诱导异源性基因产物的表达，其中异源性基因产物为本公开的synNotch多肽。在一些情况下，释放的细胞内结构域为MESA多肽的细胞内结构域，其中MESA多肽的释放的细胞内结构域诱导本公开的synNotch多肽的表达。
在一些情况下，激活的(或释放的)细胞内结构域在细胞中诱导异源性基因产物的表达，其中异源性基因产物为TANGO多肽。在一些情况下，释放的细胞内结构域为MESA多肽的细胞内结构域，其中MESA多肽的释放的细胞内结构域诱导TANGO多肽的表达。
在一些情况下，激活的(或释放的)细胞内结构域在细胞中诱导异源性基因产物的表达，其中异源性基因产物为TCR。在一些情况下，释放的细胞内结构域为MESA多肽的细胞内结构域，其中MESA多肽的释放的细胞内结构域诱导TCR的表达。
在一些情况下，激活的(或释放的)细胞内结构域在细胞中诱导异源性基因产物的表达，其中异源性基因产物为TANGO多肽。在一些情况下，释放的细胞内结构域为第一TANGO多肽的细胞内结构域，其中第一TANGO多肽的释放的细胞内结构域诱导第二TANGO多肽的表达。
在一些情况下，激活的(或释放的)细胞内结构域在细胞中诱导异源性基因产物的表达，其中异源性基因产物为CAR。在一些情况下，释放的细胞内结构域为TANGO多肽的细胞内结构域，其中TANGO多肽的释放的细胞内结构域诱导CAR的表达。
在一些情况下，激活的(或释放的)细胞内结构域在细胞中诱导异源性基因产物的表达，其中异源性基因产物为本公开的synNotch多肽。在一些情况下，释放的细胞内结构域为TANGO多肽的细胞内结构域，其中TANGO多肽的释放的细胞内结构域诱导本公开的synNotch多肽的表达。
在一些情况下，激活的(或释放的)细胞内结构域在细胞中诱导异源性基因产物的表达，其中异源性基因产物为MESA多肽。在一些情况下，释放的细胞内结构域为TANGO多肽的细胞内结构域，其中TANGO多肽的释放的细胞内结构域诱导MESA多肽的表达。
在一些情况下，激活的(或释放的)细胞内结构域在细胞中诱导异源性基因产物的表达，其中异源性基因产物为TCR。在一些情况下，释放的细胞内结构域为TANGO多肽的细胞内结构域，其中TANGO多肽的释放的细胞内结构域诱导TCR的表达。
在上述实施方案中的任一个中，特异性结合对的第二成员可处于第二细胞的表面上、可固定在不溶性基材上、可存在于细胞外基质中、可存在于人工基质中，或可以是可溶的。
MESA
适用于本公开的方法的模块化细胞外传感器架构(modular extracellularsensor architecture，MESA)多肽可以是如美国专利公布No.2014/0234851中所述的MESA多肽。MESA多肽包括：a)配体结合结构域；b)跨膜结构域；c)蛋白酶裂解位点；以及d)功能结构域。功能结构域可以是转录调控子(例如，转录激活蛋白、转录阻遏蛋白)。在一些情况下，MESA受体包括两个多肽链。在一些情况下，MESA受体包括单一多肽链。
TANGO
合适的TANGO多肽为异源二聚体，其中第一包括烟草蚀纹病毒(Tev)蛋白酶并且第二多肽包括与转录因子融合的Tev蛋白水解裂解位点(PCS)。当两个多肽彼此接近时，所述接近由天然蛋白质-蛋白质相互作用介导，Tev裂解PCS以释放转录因子。Barnea等人(ProcNatl Acad Sci USA.2008年1月8日；105(1):64-9)。
TCR
在一些情况下，结合触发的开关在细胞中诱导T细胞受体(TCR)的表达。可使用本公开的方法诱导的TCR包括对多种表位中的任一个具有特异性的TCR，所述表位包括，例如，癌细胞表面上的表位、病毒感染细胞的表面上的表位、自身抗原中存在的表位等。TCR通常包括α链和β链；并且当呈现为主要组织相容性复合物时识别抗原。在一些情况下，TCR为工程化TCR。
具有免疫细胞激活功能的任何工程化TCR可使用本公开的方法诱导。此类TCR包括，例如，抗原特异性TCR、单克隆TCR(MTCR)、单链MTCR、高亲和力CDR2突变TCR、CD1-结合MTCR、高亲和力NY-ESO TCR、VYG HLA-A24端粒酶TCR，包括例如以下各项中所述的那些：PCT公布No.WO 2003/020763、WO 2004/033685、WO 2004/044004、WO 2005/114215、WO 2006/000830、WO 2008/038002、WO 2008/039818、WO 2004/074322、WO 2005/113595、WO 2006/125962；Strommes等人Immunol Rev.2014；257(1):145-64；Schmitt等人Blood.2013；122(3):348-56；Chapuls等人Sci Transl Med.2013；5(174):174ra27；Thaxton等人HumVaccin Immunother.2014；10(11):3313-21(PMID:25483644)；Gschweng等人ImmunolRev.2014；257(1):237-49(PMID:24329801)；Hinrichs等人Immunol Rev.2014；257(1):56-71(PMID:24329789)；Zoete等人Front Immunol.2013；4:268(PMID:24062738)；Marr等人Clin Exp Immunol.2012；167(2):216-25(PMID:22235997)；Zhang等人Adv Drug DelivRev.2012；64(8):756-62(PMID:22178904)；Chhabra等人Scientific WorldJournal.2011；11:121-9(PMID:21218269)；Boulter等人Clin Exp Immunol.2005；142(3):454-60(PMID:16297157)；Sami等人Protein Eng Des Sel.2007；20(8):397-403；Boulter等人Protein Eng.2003；16(9):707-11；Ashfield等人IDrugs.2006；9(8):554-9；Li等人Nat Biotechnol.2005；23(3):349-54；Dunn等人Protein Sci.2006；15(4):710-21；Liddy等人Mol Biotechnol.2010；45(2)；Liddy等人Nat Med.2012；18(6):980-7；Oates等人Oncoimmunology.2013；2(2):e22891；McCormack等人Cancer ImmunolImmunother.2013Apr；62(4):773-85；Bossi等人Cancer Immunol Immunother.2014；63(5):437-48以及Oates等人Mol Immunol.2015年10月；67(2Pt A):67-74；其公开内容全文以引用方式并入本文中。
CAR
在一些情况下，结合触发的开关在细胞中诱导CAR的表达。本文互换使用的术语“嵌合抗原受体”和“CAR”是指能够触发或抑制免疫细胞的活化的人工多模块分子，其通常但非排他性地包括细胞外结构域(例如，配体/抗原结合结构域)、跨膜结构域以及一个或多个细胞内信号传导结构域。术语CAR不具体地限于CAR分子，而且还包括CAR变体。CAR变体包括拆分CAR，其中CRA的细胞外部分(例如，配体结合部分)和细胞内部分(例如，细胞内信号传导部分)存在于两个独立的分子上。CAR变体还包括启动开关CAR(ON-switch CAR)，其为可条件性激活的CAR，例如，包括拆分CAR，其中通过药物控制拆分CAR的两个部分的条件性异源二聚化。CAR变体还包括双特异性CAR，其包括可放大或抑制主要CAR的活性的次要CAR结合结构域。CAR变体还包括抑制性嵌合抗原受体(iCAR)，其可以例如用作双特异性CAR系统的组分，其中次要CAR结合结构域的结合导致主要CAR激活的抑制。CAR分子及其衍生物(即CAR变体)描述于例如PCT申请No.US2014/016527；Fedorov等人Sci Transl Med(2013)；5(215):215ra172；Glienke等人Front Pharmacol(2015)6:21；Kakarla&Gottschalk52Cancer J(2014)20(2):151-5；Riddell等人Cancer J(2014)20(2):141-4；Pegram等人Cancer J(2014)20(2):127-33；Cheadle等人Immunol Rev(2014)257(1):91-106；Barrett等人Annu Rev Med(2014)65:333-47；Sadelain等人Cancer Discov(2013)3(4):388-98；Cartellieri等人,J Biomed Biotechnol(2010)956304；其公开内容全文以引用方式并入本文中。
拆分CAR可以是细胞外拆分或细胞内拆分的并且可或可以不是可条件性地异源二聚化的。例如，不是可条件性地异源二聚化的拆分CAR系统可包含组成型异源二聚化结构域或不取决于用于导致由拆分部分的装配形成活性CAR的异源二聚化的一种或多种另外的分子的存在的其他结合对(例如，Fc结合对或其他正交结合对)。
在一些情况下，细胞外拆分CAR可在抗原结合结构域处细胞外拆分为两个部分，包括例如，其中拆分CAR的第一部分包含细胞外Fc结合结构域，其与包含抗原识别结构域的拆分CAR的第二部分特异性地结合，如图129A中大体描绘的。
在一些情况下，细胞外拆分CAR可在抗原结合结构域处细胞外拆分为两个部分，包括例如，其中拆分CAR的第一部分包含正交蛋白结合对的第一部分，其与包含抗原识别结构域的拆分CAR的第二部分中包含的正交蛋白结合对的第二部分特异性地结合，如图129B中大体描绘的。
在一些情况下，细胞内拆分CAR可以在跨膜结构域附近细胞内拆分为两个部分，包括例如，其中拆分CAR的第一部分包括抗原识别结构域、跨膜结构域和组成型异源二聚化结构域的细胞内第一部分，并且拆分CAR的第二部分包括跨膜结构域、跨膜结构域附近的组成型异源二聚化结构域的第二部分、一个或多个共刺激结构域以及一个或多个信号传导结构域(例如，ITAM结构域)，例如，如图129C中大体描绘的。
在一些情况下，细胞内拆分CAR可以在细胞内结构域附近或在两个细胞内结构域之间细胞内拆分为两个部分，包括例如，其中拆分CAR的第一部分包括抗原识别结构域、跨膜结构域、一个或多个共刺激结构域以及组成型异源二聚化结构域的细胞内第一部分，并且拆分CAR的第二部分包括跨膜结构域、一个或多个共刺激结构域、一个或多个信号传导结构域(例如，ITAM结构域)以及一个或多个共刺激结构域与一个或多个信号传导结构域之间的组成型异源二聚化结构域的第二部分，例如，如图129D中大体描绘的。
在一些情况下，细胞内拆分CAR可以在细胞内结构域之间细胞内拆分为两个部分，包括例如，其中拆分CAR的第一部分包括抗原识别结构域、跨膜结构域、一个或多个共刺激结构域以及拆分CAR的第一部分的细胞内末端附近的组成型异源二聚化结构域的细胞内第一部分，并且拆分CAR的第二部分包括跨膜结构域、一个或多个信号传导结构域(例如，ITAM结构域)以及跨膜结构域与一个或多个信号传导结构域之间的组成型异源二聚化结构域的第二部分，例如，如图129E中大体描绘的。
普通技术人员将易于知道拆分CAR的第一和第二部分内结构域的布置不限于本文具体描述的那些布置。单个CAR可被拆分以生成拆分CAR的具体位置可变化，前提条件是由这一拆分或多个拆分产生的两个或更多个多肽在它们同时存在于单个细胞内时能够功能性地形成功能性CAR。这一功能活性可易于确定，包括例如通过使用本文所述的测定中的一个或多个。
特异性结合对的第一成员
特异性结合对的第一成员可以是多种特异性结合对中的任一个的第一成员。合适的特异性结合对在上文详细描述。
在一些情况下，特异性结合对的第一成员包括基于抗体的识别支架。在一些情况下，特异性结合对的第一成员包括抗体。在特异性结合对的第一成员是抗体的一些情况下，抗体特异性地结合肿瘤特异性抗原、疾病相关抗原或细胞外基质组分。在特异性结合对的第一成员是抗体的一些情况下，抗体特异性地结合细胞表面抗原、可溶性抗原或固定在不溶性基材上的抗原。在特异性结合对的第一成员是抗体的一些情况下，抗体是单链Fv。在一些情况下，特异性结合对的第一成员是纳米抗体、单域抗体、双链抗体、三链抗体或微型抗体(minibody)。在一些情况下，特异性结合对的第一成员是基于非抗体的识别支架。在特异性结合对的第一成员是基于非抗体的识别支架的一些情况下，基于非抗体的识别支架是avimer、DARPin、adnectin、avimer、亲和体、anticalin或affilin。在一些情况下，特异性结合对的第一成员是抗原。在特异性结合对的第一成员是抗原的一些情况下，抗原是内源性抗原。在特异性结合对的第一成员是抗原的一些情况下，抗原是外源性抗原。在一些情况下，特异性结合对的第一成员是受体的配体。在一些情况下，特异性结合对的第一成员是受体。在一些情况下，特异性结合对的第一成员是细胞粘附分子(例如，细胞粘附分子的细胞外区域的全部或一部分)。在一些情况下，特异性结合对的第一成员包括第一二聚化结构域并且其中特异性结合对的第二成员包括第二二聚化结构域；例如，在一些情况下，通过小分子二聚化试剂诱导第一二聚化结构域与第二二聚化结构域的结合，并且在其他情况下，通过光诱导第一二聚化结构域与第二二聚化结构域的结合。
特异性结合对的第二成员
特异性结合对包括例如，抗原-抗体特异性结合对，其中第一成员为特异性地结合第二成员的抗体(或基于抗体的识别支架)，所述第二成员为抗原，或者其中第一成员为抗原并且第二成员为特异性地结合抗原的抗体(或基于抗体的识别支架)；配体-受体特异性结合对，其中第一成员为配体并且第二成员为配体所结合的受体，或其中第一成员为受体，并且第二成员为受体所结合的配体；基于非抗体的识别支架-靶标特异性结合对，其中第一成员为基于非抗体的识别支架并且第二成员为结合至基于非抗体的识别支架的靶标，或其中第一成员为靶标并且第二成员为结合至靶标的基于非抗体的识别支架；粘附分子-细胞外基质结合对；Fc受体-Fc结合对，其中第一成员包括结合至第二成员的免疫球蛋白Fc，所述第二成员为Fc受体，或其中第一成员为结合至第二成员的Fc受体，所述第二成员包括免疫球蛋白Fc；以及受体-辅助受体结合对，其中第一成员为特异性地结合第二成员的受体，所述第二成员为辅助受体，或其中第一成员为特异性地结合第二成员的辅助受体，所述第二成员为受体。
特异性结合对的第二成员可存在于细胞表面上。特异性结合对的第二成员可固定于不溶性基材上。特异性结合对的第二成员可以是可溶的。特异性结合对的第二成员可存在于细胞外环境(例如细胞外基质)中。特异性结合对的第二成员可存在于人工基质中。特异性结合对的第二成员可存在于非细胞性环境中。
细胞内结构域
在一些情况下，细胞内结构域为转录调控子，例如，转录因子诸如转录激活蛋白或转录阻遏蛋白。在一些情况下，转录因子直接调控细胞的分化。在一些情况下，转录因子通过调节第二转录因子的表达间接地调节细胞的分化。
转录调控子的实例包括，例如，ABT1、ACYP2、AEBP1、AEBP2、AES、AFF1、AFF3、AHR、ANK1、ANK2、ANKFY1、ANKIB1、ANKRD1、ANKRD10、ANKRD2、ANKRD32、ANKRD46、ANKRD49、ANKRD56、ANKRD57、ANKS4B、AR、ARHGAP17、ARID1A、ARID1B、ARID3A、ARID4A、ARID5B、ARNT、ARNT2、ARNTL、ARNTL2、ARX、ASB10、ASB11、ASB12、ASB15、ASB2、ASB5、ASB8、ASB9、ASH1L、ASH2L、ASXL1、ASZ1、ATF1、ATF3、ATF4、ATF4、ATF5、ATF6、ATF7、ATF7IP、ATM、ATOH1、ATXN3、1300003B13RIK、B3GAT3、B930041F14RIK、BACH1、BACH2、BARX1、BARX2、BATF、BATF2、BATF3、BAZ2A、BBX、BC003267、BCL11A、BCL11B、BCL3、BCL6、BCL6B、BCLAF1、BCOR、BHLHA15、BHLHE40、BHLHE41、BLZF1、BMYC、BNC1、BNC2、BPNT1、BRCA1、BRWD1、BTBD11、BTF3、6030408C04RIK、CAMK4、CARHSP1、CARM1、CBX4、CBX7、CCNC、CCNH、CCNT1、CCNT2、CDC5L、CDK2、CDK4、CDK9、CDKN2C、CDX1、CDX1、CDX2、CEBPA、CEBPB、CEBPD、CEBPG、CEBPG、CEBPZ、CHD4、CHD7、CHGB、CIC、CIITA、CITED1、CITED2、CITED4、CLOCK、CLPB、CML3、CNOT7、COPS2、CREB1、CREB3、CREB3L1、CREB3L1、CREB3L2、CREB3L3、CREB5、CREBBP、CREBL2、CREM、CSDA、CSDA、CSDC2、CSDE1、CTBP2、CTCF、CTCFL、CTNNB1、CTNNBL1、CXXC1、D11BWG0517E、2300002D11RIK、DACH1、DAXX、DBP、DDIT3、DDX20、DDX54、DDX58、DEAF1、DEK、DIDO1、DLX2、DMRT1、DMRT2、DMRTB1、DNMT1、DNMT3A、DR1、DRG1、DUSP26、DYSFIP1、E2F1、E2F2、E2F3、E2F5、E2F6、EBF1、EBF2、EBF3、EBF3、EED、EGR1、EGR2、EGR3、EHF、EHMT2、EID2、ELAVL2、ELF1、ELF1、ELF2、ELF3、ELF4、ELF5、ELK3、ELK4、ELL2、EMX2、EMX2、EN2、ENPP2、EOMES、EP300、EPAS1、ERF、ERG、ESR1、ESRRA、ESRRB、ESRRG、ETS1、ETS2、ETV1、ETV3、ETV4、ETV5、ETV6、EVI1、EWSR1、EZH1、EZH2、FAH、FBXL10、FBXL11、FBXW7、FEM1A、FEM1B、FEM1C、FHL2、FLI1、FMNL2、FOS、FOSB、FOSL1、FOSL2、FOXA1、FOXA2、FOXA3、FOXC1、FOXD1、FOXD2、FOXD3、FOXF1、FOXF1A、FOXF2、FOXG1、FOXI1、FOXJ2、FOXJ3、FOXK1、FOXK2、FOXL1、FOXL2、FOXM1、FOXN1、FOXN2、FOXN3、FOXO1、FOXO3、FOXP1、FOXP2、FOXP3、FOXP4、FOXQ1、FUS、FUSIP1、2810021G02RIK、GABPA、GABPB1、GARNL1、GAS7、GATA1、GATA2、GATA3、GATA4、GATA5、GATA5、GATA6、GBX2、GCDH、GCM1、GFI1、GFI1B、GLI2、GLI3、GLIS1、GLIS2、GLIS3、GLS2、GMEB1、GMEB2、GRHL1、GRHL2、GRHL3、GRLF1、GTF2A1、GTF2B、GTF2E2、GTF2F1、GTF2F2、GTF2H2、GTF2H4、GTF2I、GTF2IRD1、GTF2IRD1、GZF1、HAND2、HBP1、HCLS1、HDAC10、HDAC11、HDAC2、HDAC5、HDAC9、HELZ、HES1、HES4、HES5、HES6、HEXIM1、HEY2、HEYL、HHEX、HHEX、HIC1、HIC2、HIF1A、HIF1AN、HIPK2、HIVEP1、HIVEP2、HIVEP2、HIVEP3、HLF、HLTF、HLX、HMBOX1、HMG20A、HMGA2、HMGB2、HMGB3、HNF1B、HNF4A、HNF4G、HOMEZ、HOXA10、HOXA11、HOXA13、HOXA2、HOXA3、HOXA4、HOXA5、HOXA6、HOXA7、HOXA9、HOXB1、HOXB2、HOXB3、HOXB4、HOXB6、HOXB7、HOXB8、HOXB9、HOXC10、HOXC10、HOXC11、HOXC5、HOXC6、HOXC8、HOXC9、HOXD8、HOXD9、HR、HSBP1、HSF2BP、HTATIP2、HTATSF1、HUWE1、5830417I10RIK、ID1、ID2、ID3、ID3、IFNAR2、IKBKB、IKBKG、IKZF1、IKZF2、IKZF3、IKZF4、IL31RA、ILF3、ING1、ING2、ING3、ING4、INSM1、INTS12、IQWD1、IRF1、IRF1、IRF2、IRF3、IRF4、IRF5、IRF6、IRF7、IRF8、IRF8、IRX1、IRX2、IRX3、IRX4、IRX5、ISL1、ISL2、ISX、ISX、IVNS1ABP、2810021J22RIK、JARID1A、JARID1B、JARID1C、JARID1D、JDP2、JUN、JUNB、JUND、KLF1、KLF10、KLF11、KLF12、KLF13、KLF15、KLF16、KLF2、KLF3、KLF3、KLF4、KLF5、KLF6、KLF7、KLF8、KLF9、KRR1、6330416L07RIK、L3MBTL2、LASS2、LASS4、LASS6、LBA1、LBH、LBX1、LCOR、LDB1、LDB2、LEF1、LHX1、LHX2、LHX5、LIMD1、LIN28、LMO1、LMO4、LMX1A、LSM11、LSM4、LYL1、9030612M13RIK、1810007M14RIK、3632451O06RIK、MAF、MAFA、MAFB、MAFF、MAFG、MAFK、MAGED1、MAP3K12、MAPK1、MAPK3、MAPK8、MAPK8IP1、MAX、MAZ、MBD2、MCM2、MCM4、MCM5、MCM6、MCM7、MECOM、MECP2、MED12、MED8、MEF2A、MEF2B、MEF2C、MEF2D、MEIS1、MEIS1、MEIS2、MEOX2、MESP2、MID1、MITF、MKI67IP、MKL1、MLL1、MLL3、MLLT10、MLLT3、MLX、MLXIP、MLXIPL、MNT、MNX1、MPL、MSC、MSRB2、MSX2、MTA3、MTF1、MTF2、MTPN、MXD1、MXD4、MXI1、MYB、MYBBP1A、MYBL2、MYC、MYCBP、MYCL1、MYCN、MYEF2、MYF6、MYNN、MYOCD、MYOD1、MYOG、MYST3、MYST4、MYT1L、MZF1、NAB1、NAB2、NANOG、NARG1、NCOA1、NCOA2、NCOA3、NCOR1、NCOR2、NDN、NEUROD1、NEUROD4、NEUROD6、NEUROG1、NEUROG2、NFAT5、NFATC1、NFATC2、NFATC2IP、NFATC3、NFATC3、NFATC4、NFE2、NFE2L1、NFE2L2、NFIA、NFIA、NFIB、NFIC、NFIL3、NFIX、NFKB1、NFKB2、NFKBIB、NFKBIE、NFKBIZ、NFX1、NFXL1、NFYA、NFYB、NHLH1、NKX2-2、NKX2-3、NKX2-5、NKX2-6、NKX6-2、NMI、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、NPAS1、NPAS2、NPAS3、NR0B1、NR0B2、NR1D1、NR1D2、NR1H3、NR1H4、NR1I2、NR1I3、NR2C1、NR2C2、NR2E3、NR2F1、NR2F2、NR2F6、NR3C1、NR3C2、NR4A1、NR4A2、NR4A2、NR4A3、NR5A1、NR5A2、NRARP、NRIP1、NRIP2、NSBP1、NSD1、NUDT12、NULL、NUPR1、1700065O13RIK、OLIG1、OLIG2、OLIG2、ONECUT1、ONECUT2、ONECUT3、ORC2L、OSGIN1、OSR1、OSR2、OSTF1、OVOL1、OVOL2、PAPOLA、PAPOLG、PAPPA2、PATZ1、PAWR、PAX2、PAX5、PAX6、PAX7、PAX8、PAX9、PBX1、PBX2、PBX3、PBX4、PCBD1、PCGF6、PDCD11、PDLIM4、PDX1、PEG3、PER1、PFDN1、PGR、PHF1、PHF10、PHF12、PHF13、PHF14、PHF20、PHF21A、PHF5A、PHF7、PHOX2A、PHOX2B、PIAS2、PIR、PITX1、PITX2、PKNOX1、PKNOX2、PLA2G6、PLAGL1、PLAGL2、PLRG1、PML、POGK、POLR2B、POLR2E、POLR2H、POLR3E、POLR3H、POLRMT、POU1F1、POU2AF1、POU2F1、POU2F2、POU3F2、POU3F3、POU3F3、POU5F1、POU6F1、PPARA、PPARD、PPARG、PPARGC1A、PPARGC1B、PPP1R12C、PPP1R13B、PPP1R16B、PPP1R1B、PPP2R1A、PPP3CB、PQBP1、PRDM1、PRDM14、PRDM15、PRDM16、PRDM2、PRDM4、PRDM5、PRDM6、PRDM8、PREB、PRKAR1A、PRKCBP1、PROX1、PRRX1、PRRX2、PSMC5、PSMD10、PSMD9、PTF1A、PTGES2、PURB、PWP1、RAB11A、RAB11B、RAB15、RAB18、RAB1B、RAB25、RAB8A、RAB8B、RAI14、RARA、RARB、RARG、RASSF7、RB1、RBBP7、RBL1、RBM14、RBM39、RBM9、RBPJ、RBPJL、RCOR2、REL、RELA、RELB、RERE、REST、REXO4、RFC1、RFX1、RFX2、RFX3、RFX5、RFX7、RFX8、RHOX5、RHOX6、RHOX9、RIPK4、RNF12、RNF14、RNF141、RNF38、RNF4、RORA、RORA、RORB、RORC、RPS6KA4、RREB1、RSRC1、RUNX1、RUNX1T1、RUNX2、RUNX2、RUNX3、RUVBL1、RUVBL2、RXRA、RXRG、RYBP、SAFB2、SALL1、SALL1、SALL2、SALL4、SAP30、SAP30BP、SATB1、SATB2、SATB2、SCAND1、SCAP、SCRT2、SEC14L2、SERTAD1、SF1、SFPI1、SFRS5、SH3D19、SH3PXD2B、SHANK3、SHOX2、SHPRH、SIN3A、SIN3B、SIRT2、SIRT3、SIRT5、SIX1、SIX1、SIX2、SIX3、SIX4、SIX5、SKI、SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD7、SMARCA1、SMARCA2、SMARCA5、SMARCB1、SMYD1、SNAI1、SNAI2、SNAPC2、SNAPC4、SNIP1、SOLH、SOX1、SOX10、SOX11、SOX12、SOX13、SOX15、SOX17、SOX18、SOX2、SOX21、SOX4、SOX5、SOX6、SOX7、SOX8、SOX9、SP1、SP110、SP140L、SP2、SP3、SP4、SP6、SP8、SPDEF、SPEN、SPI1、SPIB、SQSTM1、SREBF1、SREBF2、SREBF2、SRF、SSBP2、SSBP3、SSBP4、SSRP1、ST18、STAG1、STAT1、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT5B、STAT6、SUB1、SUZ12、TADA2L、TAF13、TAF5、TAF5L、TAF7、TAF9、TAL1、TAL1、TARDBP、TBPL1、TBR1、TBX1、TBX10、TBX15、TBX18、TBX2、TBX2、TBX20、TBX21、TBX3、TBX4、TBX5、TBX6、TCEA1、TCEA3、TCEAL1、TCEB3、TCERG1、TCF12、TCF15、TCF19、TCF20、TCF21、TCF21、TCF3、TCF4、TCF7、TCF7L2、TCFAP2A、TCFAP2B、TCFAP2C、TCFCP2L1、TCFE2A、TCFE3、TCFEB、TCFEC、TCFL5、TEAD1、TEAD2、TEAD3、TEAD4、TEF、TFAP2A、TFAP2C、TFCP2L1、TFDP2、TFEB、TFEC、TGFB1I1、TGIF1、TGIF2、TGIF2LX、THRA、THRAP3、THRB、THRSP、TIAL1、TLE1、TLE6、TMEM131、TMPO、TNFAIP3、TOB1、TOX4、TP63、TRERF1、TRIB3、TRIM24、TRIM28、TRIM30、TRIP13、TRIP4、TRIP6、TRP53、TRP53BP1、TRP63、TRPS1、TRPS1、TSC22D1、TSC22D2、TSC22D3、TSC22D4、TSHZ1、TSHZ1、TSHZ3、TTRAP、TUB、TULP4、TWIST1、TWIST2、TYSND1、UBE2W、UBN1、UBP1、UBTF、UGP2、UHRF1、UHRF2、UNCX、USF1、USF2、UTF1、VDR、VEZF1、VGLL2、VSX1、WASL、WHSC1、WHSC2、WT1、WWP1、WWTR1、XBP1、YAF2、YY1、ZBED1、ZBED4、ZBTB1、ZBTB10、ZBTB16、ZBTB16、ZBTB17、ZBTB2、ZBTB20、ZBTB22、ZBTB25、ZBTB32、ZBTB38、ZBTB4、ZBTB43、ZBTB45、ZBTB47、ZBTB7A、ZBTB7B、ZBTB7C、ZCCHC8、ZDHHC13、ZDHHC16、ZDHHC21、ZDHHC5、ZDHHC6、ZEB2、ANK2ZEB2、ZFHX2、ZFHX3、ZFHX4、ZFP105、ZFP110、ZFP143、ZFP148、ZFP161、ZFP192、ZFP207、ZFP219、ZFP238、ZFP263、ZFP275、ZFP277、ZFP281、ZFP287、ZFP292、ZFP35、ZFP354C、ZFP36、ZFP36L1、ZFP386、ZFP407、ZFP42、ZFP423、ZFP426、ZFP445、ZFP451、ATF5ZFP451、ZFP467、ZFP52、ZFP57、ZFP592、ZFP593、ZFP597、ZFP612、ZFP637、ZFP64、ZFP647、ZFP748、ZFP810、ZFP9、ZFP91、ZFPM1、ZFPM2、ZFX、ZHX2、ZHX3、ZIC1、ZIC2、ZIC3、ZIC4、ZIC5、ZKSCAN1、ZKSCAN3、ZMYND11、ZNF143、ZNF160、ZNF175、ZNF184、ZNF192、ZNF213、ZNF217、ZNF219、ZNF22、ZNF238、ZNF24、ZNF267、ZNF273、ZNF276、ZNF280D、ZNF281、ZNF292、ZNF311、ZNF331、ZNF335、ZNF337、ZNF33B、ZNF366、ZNF394、ZNF398、ZNF41、ZNF410、ZNF415、ZNF423、ZNF436、ZNF444、ZNF445、ZNF451、ZNF460、ZNF496、ZNF498、ZNF516、ZNF521、ZNF532、ZNF536、ZNF546、ZNF552、ZNF563、ZNF576、ZNF580、ZNF596、ZNF621、ZNF628、ZNF648、ZNF649、ZNF652、ZNF655、ZNF664、ZNF668、ZNF687、ZNF692、ZNF696、ZNF697、ZNF710、ZNF80、ZNF91、ZNF92、ZNRD1、ZSCAN10、ZSCAN16、ZSCAN20、ZSCAN21、ZXDC和ZZZ3。转录调控子的另外的实例如上所述。转录因子(转录激活蛋白；转录阻遏蛋白)的非限制性实例示出于图37-83中。例如，转录因子可包含与图37-83中的任一个中所示的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些情况下，细胞内结构域的活化(例如，磷酸化、释放)通过转录调控、染色质调控、翻译、运输或翻译后加工来调节细胞的内源性基因的表达。在一些情况下，细胞内结构域的活化(例如，磷酸化、释放)调节细胞对第二细胞或对细胞外基质的细胞粘附。
结合转导子
结合转导子可包含配体诱导型蛋白水解裂解位点，其中特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员的结合在配体诱导型蛋白水解裂解位点处诱导结合转导子的裂解，从而转导结合信号并且通过以蛋白水解方式释放细胞内结构域来激活细胞内结构域。synNotch中的蛋白水解裂解位点的实例如上文所述。
作为其他实例，蛋白水解裂解位点可以是，例如，金属蛋白酶裂解位点，例如选自胶原酶-1、-2和-3(MMP-1、-8和-13)、明胶酶A和B(MMP-2和-9)、溶基质素1、2和3(MMP-3、-10和-11)、基质溶解素(MMP-7)以及膜金属蛋白酶(MT1-MMP和MT2-MMP)的MMP的裂解位点。例如，MMP-9的裂解序列为Pro-X-X-Hy(其中，X表示任意残基；Hy，疏水性残基)，例如Pro-X-X-Hy-(Ser/Thr)，例如Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr-Ser(SEQ ID NO:101)或Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr(SEQ ID NO:102)。蛋白酶裂解位点的另一个实例是纤溶酶原激活剂裂解位点，例如uPA或组织纤溶酶原激活剂(tPA)裂解位点。合适的蛋白酶裂解位点的另一个实例是催乳素裂解位点。uPA和tPA的裂解序列的具体实例包括包含Val-Gly-Arg的序列。可包含在可蛋白水解裂解的接头中的蛋白酶裂解位点的另一个实例是烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶裂解位点，例如ENLYTQS(SEQ ID NO:103)，其中蛋白酶在谷氨酰胺与丝氨酸之间裂解。可包含在可蛋白水解裂解的接头中的蛋白酶裂解位点的另一个实例是肠激酶裂解位点，例如DDDDK(SEQ ID NO:104)，其中裂解发生在赖氨酸残基之后。可包含在可蛋白水解裂解的接头中的蛋白酶裂解位点的另一个实例是凝血酶裂解位点，例如LVPR(SEQ ID NO:105)。包含蛋白酶裂解位点的另外的合适的接头包括包含以下氨基酸序列中的一个或多个的接头：LEVLFQGP(SEQ ID NO:106)，通过PreScission蛋白酶(包括人鼻病毒3C蛋白酶和谷胱甘肽-S-转移酶的融合蛋白；Walker等人(1994)Biotechnol.12:601)裂解；凝血酶裂解位点，例如CGLVPAGSGP(SEQ ID NO:107)；SLLKSRMVPNFN(SEQ ID NO:108)或SLLIARRMPNFN(SEQ IDNO:109)，通过组织蛋白酶B裂解；SKLVQASASGVN(SEQ ID NO:110)或SSYLKASDAPDN(SEQ IDNO:111)，通过埃-巴二氏病毒蛋白酶裂解；RPKPQQFFGLMN(SEQ ID NO:112)，通过MMP-3(溶基质素)裂解；SLRPLALWRSFN(SEQ ID NO:113)，通过MMP-7(基质溶解素)裂解；SPQGIAGQRNFN(SEQ ID NO:114)，通过MMP-9裂解；DVDERDVRGFASFL SEQ ID NO:115)，通过嗜热菌蛋白酶样MMP裂解；SLPLGLWAPNFN(SEQ ID NO:116)，通过基质金属蛋白酶2(MMP-2)裂解；SLLIFRSWANFN(SEQ ID NO:117)，通过组织蛋白酶L裂解；SGVVIATVIVIT(SEQ ID NO:118)，通过组织蛋白酶D裂解；SLGPQGIWGQFN(SEQ ID NO:119)，通过基质金属蛋白酶1(MMP-1)裂解；KKSPGRVVGGSV(SEQ ID NO:120)，通过尿激酶型纤溶酶原激活剂裂解；PQGLLGAPGILG(SEQ ID NO:121)，通过膜1型基质金属蛋白酶(MT-MMP)裂解；HGPEGLRVGFYESDVMGRGHARLVHVEEPHT(SEQ ID NO:122)，通过溶基质素3(或MMP-11)、嗜热菌蛋白酶、成纤维细胞胶原酶和溶基质素1裂解；GPQGLAGQRGIV(SEQ ID NO:123)，通过基质金属蛋白酶13(胶原酶-3)裂解；GGSGQRGRKALE(SEQ ID NO:124)，通过组织型纤溶酶原激活剂(tPA)裂解；SLSALLSSDIFN(SEQ ID NO:125)，通过人前列腺特异性抗原裂解；SLPRFKIIGGFN(SEQ ID NO:126)，通过激肽释放酶(hK3)裂解；SLLGIAVPGNFN(SEQ ID NO:127)，通过嗜中性粒细胞弹性蛋白酶裂解；以及FFKNIVTPRTPP(SEQ ID NO:128)，通过钙蛋白酶(钙激活的中性蛋白酶)裂解。
细胞
本公开的方法可用于调节任何真核细胞的活性。在一些情况下，细胞在体内。在一些情况下，细胞是离体的。在一些情况下，细胞在体外。在一些情况下，细胞为哺乳动物细胞。在一些情况下，细胞为人细胞。在一些情况下，细胞为非人灵长类动物细胞。在一些情况下，细胞为啮齿类动物细胞。在一些情况下，细胞为小鼠细胞。在一些情况下，细胞为大鼠细胞。
合适的细胞包括视网膜细胞(例如，米勒细胞(Müller cell)、神经节细胞、无长突细胞、水平细胞、双极细胞和光感受器细胞(包括视杆和视锥)、米勒神经胶质细胞以及视网膜色素上皮细胞)；神经细胞(例如，丘脑、感觉皮层、未定带(ZI)、腹侧被盖区(VTA)、前额叶皮层(PFC)、伏核(NAc)、杏仁核(BLA)、黑质、腹侧苍白球、苍白球、背侧纹状体、腹侧纹状体、丘脑底核、海马体、齿状回、扣带回、内嗅皮层、嗅皮层、主要运动皮层或小脑的细胞)；肝细胞；肾细胞；免疫细胞；心肌细胞；骨骼肌细胞；平滑肌细胞；肺细胞等。
合适的细胞包括干细胞(例如胚胎干(ES)细胞、诱导的多潜能干(iPS)细胞；生殖细胞(例如，卵母细胞、精子、卵原细胞、精原细胞等)；体细胞，例如成纤维细胞、少突神经胶质细胞、神经胶质细胞、造血细胞、神经元、肌细胞、骨细胞、肝细胞、胰细胞等。
合适的细胞包括人胚胎干细胞、胎儿心肌细胞、成肌纤维细胞、间充质干细胞、自体移植的扩大心肌细胞、脂肪细胞、全能细胞、多潜能细胞、造血干细胞、成肌细胞、成体干细胞、骨髓细胞、间充质细胞、胚胎干细胞、实质细胞、上皮细胞、内皮细胞、间皮细胞、成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、外源性细胞、内源性细胞、干细胞、造血干细胞、源自骨髓的祖细胞、心肌细胞、骨骼细胞、胎儿细胞、未分化细胞、多潜能祖细胞、单能祖细胞、单核细胞、心脏成肌细胞、骨骼成肌细胞、巨噬细胞、毛细管内皮细胞、异种细胞、同种异体细胞以及出生后干细胞。
在一些情况下，细胞为免疫细胞、神经元、上皮细胞和内皮细胞或干细胞。在一些情况下，免疫细胞为T细胞、B细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、树突细胞或巨噬细胞。在一些情况下，免疫细胞为细胞毒性T细胞。在一些情况下，免疫细胞为辅助T细胞。在一些情况下，免疫细胞为调节T细胞(Treg)。
在一些情况下，细胞为干细胞。在一些情况下，细胞为诱导的多潜能干细胞。在一些情况下，细胞为间充质干细胞。在一些情况下，细胞为造血干细胞。在一些情况下，细胞为成体干细胞。
合适的细胞包括细支气管肺泡干细胞(BASC)、隆突上皮干细胞(bESC)、角膜上皮干细胞(CESC)、心脏干细胞(CSC)、表皮神经嵴干细胞(eNCSC)、胚胎干细胞(ESC)、内皮祖细胞(EPC)、肝卵圆细胞(HOC)、造血干细胞(HSC)、角朊干细胞(KSC)、间充质干细胞(MSC)、神经元干细胞(NSC)、胰腺干细胞(PSC)、视网膜干细胞(RSC)以及源自皮肤的前体细胞(SKP)。
在一些情况下，干细胞为造血干细胞(HSC)，并且转录因子诱导HSC的分化，以分化成红细胞、血小板、淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞或嗜酸性粒细胞。在一些情况下，干细胞为间充质干细胞(MSC)，并且转录因子诱导MSC分化成结缔组织细胞，诸如骨、软骨、平滑肌、腱、韧带、基质、骨髓、真皮或脂肪的细胞。
试剂盒
本公开提供了一种用于进行用于调节细胞活性的方法的试剂盒。
在一些情况下，主题试剂盒包括包含编码本公开的嵌合Notch受体多肽的核苷酸序列的表达载体。在一些情况下，主题试剂盒包括本公开的嵌合Notch受体多肽。
在一些情况下，主题试剂盒包括用包含编码本公开的嵌合Notch受体多肽的核苷酸序列的核酸遗传修饰的宿主细胞。在一些情况下，主题试剂盒包括用包含编码本公开的嵌合Notch受体多肽的核苷酸序列的重组表达载体遗传修饰的宿主细胞。试剂盒组分可处于同一容器中，或处于分开的容器中。
上述试剂盒中的任一个还可包括一种或多种另外的试剂，其中此类另外的试剂可选自：稀释缓冲液；重构溶液；洗涤缓冲液；对照试剂；对照表达载体；阴性对照多肽(例如，缺乏一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点，使得在特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员结合时细胞内结构域不被释放的嵌合Notch受体多肽)；阳性对照多肽；用于嵌合Notch受体多肽的体外产生的试剂等。
除了上文提及的组分之外，主题试剂盒还可包括用于使用试剂盒的组分实践主题方法的说明书。用于实践主题方法的说明书通常记录于合适的记录介质上。例如，说明书可以印刷在基材(诸如纸或塑料等)上。这样，说明书可作为包装插件存在于试剂盒中、存在于试剂盒或其组分的容器的标签中(即与包装或分包装相关联)等。在其他实施方案中，说明书作为存在于合适的计算机可读存储介质上的电子存储数据文件存在，所述计算机可读存储介质例如CD-ROM、软磁盘、闪存驱动器等。在其他实施方案中，实际的说明书不在试剂盒中，但是提供了用于例如通过因特网从远程源获得说明书的手段。此实施方案的一个实例为包括网址的试剂盒，可在所述网址查看说明书和/或可从所述网址下载说明书。与说明书一样，用于获得说明书的手段记录在合适的基材上。
实施例
给出以下实施例以便为本领域的普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完整公开和描述，并且既不旨在限制发明人所认为的他们的发明的范围，也不旨在表示以下实验是所进行的全部或仅有的实验。尽管已经努力确保所用数字(例如，量、温度等)的精确性，但是应考虑到一些实验误差和偏差。除非另外指明，否则份为重量份，分子量为重均分子量，温度为摄氏度，并且压力为大气压或接近大气压。可使用标准缩写，例如，bp，碱基对；kb，千碱基；pl，皮升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；kb，千碱基；bp，碱基对；nt，核苷酸；i.m.，肌内；i.p.，腹膜内；s.c.，皮下；等等。
实施例1：嵌合Notch受体多肽的生成和表征
材料和方法
Jurkat T细胞通过具有Tet应答元件(TRE)抗间皮素CAR-EGFP/pGK mCherry双载体的慢病毒稳定转导。转导细胞组成型地表达mCherry并且在Tet反式激活蛋白(tTa)的存在下可诱导地表达抗间皮素CAR-EGFP融合蛋白。然后用抗CD19 Notch tTA受体转导这一稳定系。然后通过与表达抗原CD19、间皮素或两者的慢性脊髓性白血病K562癌细胞共培养对所得Jurkat细胞进行测定。在24h时通过流式细胞术针对EGFP标记的CAR和激活标志物CD69的表达对T细胞进行评估。还收集了共培养上清液并且通过ELISA测定IL-2的分泌。
结果
嵌合Notch受体表征
为了显示出嵌合Notch平台可用于在配体结合时在接收器细胞中诱导转录，生成以下报告细胞系：通过用Tet应答元件(TRE)-->EGFP报告基因/pGK mCherry双载体(TRE报告基因)或Gal4 UAS-->EGFP/pGK嘌呤霉素抗性双载体(UAS报告基因)转导生成小鼠L929成纤维细胞报告系。将嵌合Notch变体转导到对应的L929报告细胞系中，以生成嵌合Notch报告细胞。这些嵌合Notch报告细胞通过两种方法并行刺激。第一，将表达嵌合Notch的细胞暴露于特异性地结合至受体的细胞外结构域的固定抗体。第二，用表达同源嵌合Notch配体的K562细胞或L929成纤维细胞孵育细胞。通过流式细胞术测定表达嵌合Notch的细胞的EGFP荧光，以测量报告基因活性。图30-32示出TRE报告系中具有抗CD19(图30A-B)和抗间皮素(图31A-B)的嵌合Notch的代表性结果，以及UAS报告系的嵌合Notch抗CD19的代表性结果(图32A-B)。
为了显示出嵌合Notch平台可用于阻遏转录，生成在复合物SV40/UAS启动子(SV40/UAS报告基因)下游表达EGFP的另一个报告系。图33A这些SV40/UAS报告细胞系高水平地表达GFP。这些SV40/UAS报告细胞用抗CD19嵌合Notch转导，其中细胞内结构域为Gal4DNA结合结构域与转录阻遏结构域KRAB的融合。如图33B所示，未处理的嵌合Notch SV40/UAS报告细胞表现出高EGFP表达；在嵌合Notch受体的配体的存在下，EGFP表达下调。
为了显示出可构建信号传导中继的级联，以如下方式设计多个嵌合Notch多肽的级联。细胞A表达第一配体A(间皮素)。细胞B表达具有抗间皮素scFv作为细胞外结构域和tTA作为细胞内结构域的嵌合Notch；细胞B还表达第二配体CD19，以及处于TRE序列的控制下的蓝色荧光蛋白(BFP)。细胞C表达具有tTA作为细胞内结构域的抗CD19嵌合Notch；此外，细胞C表达受TRE序列控制的GFP。图34示出细胞A+细胞B+细胞C的一个代表性聚集体的显微镜图片的时间过程。通过细胞A表达的配体激活的细胞B在培养的第1天诱导BFP和CD19的表达；来自细胞B的CD19继而从第2天开始在细胞C中诱导GFP的表达。
嵌合Notch门控嵌合抗原受体表达和对癌细胞的T细胞激活
工程化以表达被称为嵌合抗原受体(CAR)的人工T细胞受体的T细胞作为某些B细胞癌症的治疗剂是有效的。然而，CAR T细胞癌症免疫疗法的一个主要问题是脱靶效应，其中治疗性T细胞破坏正常组织，从而导致严重的副作用以及甚至死亡。缓解此类问题的可能策略是治疗性T细胞仅在处于肿瘤微环境时表达CAR，从而提供更定位的T细胞应答。为了实现这一策略，推断嵌合Notch可用于治疗性T细胞，以首先通过结合肿瘤特异性细胞表面抗原检测肿瘤并且仅对肿瘤中的第二肿瘤特异性抗原引发CAR的表达。有效地，这既提供了关于T细胞活性的双抗原控制，又提供了肿瘤定位性应答。主要体外数据的证明在Jurkat细胞中给出。
将表达装配有驱动间皮素scFv CAR-EGFP的表达的TRE的CD19scFv嵌合Notch tTA的Jurkat T细胞暴露于间皮素+或CD19/间皮素+K562癌细胞并且在24小时时评估CAR表达和T细胞激活(图35A)。激活标志物CD69的上调和IL-2分泌用作T细胞激活的指示物。嵌合Notch工程化的T细胞仅表达CAR并且当暴露于表达两种抗原的癌细胞时被激活(图35B-C)。
图35A-C.嵌合Notch门控嵌合抗原受体表达和对癌细胞的T细胞激活。(A)通过抗间皮素CAR的抗CD19嵌合Notch tTA门控表达实现的T细胞激活的双抗原控制的示意图。(B)在暴露于对于所指示抗原为阳性的癌细胞之后，表达装配有驱动间皮素scFv CAR-EGFP的表达的TRE的CD19scFV嵌合Notch tTA的Jurkat T细胞的CAR-GFP表达(左图)和CD69水平(右图)的流式细胞术分析。(C)来自图B中所述的相同实验的共培养上清液中的IL-2水平。
实施例2：γ分泌酶蛋白酶活性和嵌合Notch信号传导
在1mM N-[(3,5-二氟苯基)乙酰基]-L-丙氨酰-2-苯基]甘氨酸-1,1-二甲基乙基酯(DAPT)的存在或不存在下，使表达嵌合Notch多肽(包括抗CD19 scFv作为细胞外多肽以及tTA转录激活蛋白作为细胞内结构域)且包括pTet-GFP构建体的“接收器”细胞(如图30A中所示且如实施例1中所述)与在表面上表达CD19的“发送器”细胞接触。DAPT为γ分泌酶抑制剂。数据表示为GFP+“接收器”细胞。如图84A和84B所示，在发送器细胞和DAPT的存在下，GFP+“接收器”细胞处于对照的未处理水平；在DAPT的不存在下，与发送器细胞的接触强烈激活嵌合Notch多肽和GFP的表达。
实施例3：合成Notch受体为用于工程化定制细胞感测和应答行为的模块化平台
最小的notch跨膜区域可与新型细胞外和细胞内结构域组合以构建各种不同的嵌合受体。
Notch转导途径的核心在于跨膜区域。这种设计可以被认为是用于工程化检测一系列各种不同的膜呈递配体的一系列受体的平台(图85A)。在细胞内侧，Notch细胞内结构域(NICD)可被正交转录因子替换，以就Notch信号传导激活作报告。在细胞外，内源性δ结合结构域可被蛋白质结合结构域替换(例如FKBP、抗GFP纳米抗体等)并且当同源结合配偶体被结合时诱导裂解。因此，生成了具有各自与不同的细胞内结构域偶联的不同的细胞外结构域的受体分子的文库(图85B)。如图86A所示，通过与表达同源配体的发送器细胞的裂解依赖性方式的细胞-细胞接触激活合成受体应答。关于不同细胞外和细胞内结构域组合的结果提供于图87A中。
合成受体应答的激活在配体表达细胞的移除时是可逆的，并且在24h时的转录应答可通过短至1h的刺激脉冲激活(图87B)；此外，配体量与受体激活之间的剂量/应答关系是渐变的，从而复制内源性Notch信号传导的特征(图87C)。细胞表达的受体的量与报告基因的诱导强度线性相关(图87D)。对于某些细胞外结构域，观察到次优背景活性或差的诱导性。据发现，通过轻微延长合成Notch的调控裂解跨膜区域以并入一个或多个EGF重复序列有时可改善合成受体功能。例如，具有细胞外抗间皮素scFv的synNotch分子在并入这种延长时表现出改善的激活阈值(图88A)。
针对以不同形式呈现的配体-可溶性、细胞表面表达的、以及顺式细胞表面表达的(即，与受体在相同细胞上)对检测synNotch的GFP和CD19进行测试(图86C)。发现synNotch仅在它们的配体存在于相反表面上时转导信号；当同源配体处于溶液中或与受体存在于相同表面上(顺式)时检测不到激活。有趣的是，当配体顺式存在于表达受体的细胞上时，synNotch受体表现出钝化激活(图86C，柱“细胞”相对于“细胞+顺式”，以及图88B-C)，一种在天然Notch中被称为顺式抑制的特征。
在细胞内侧，显示出可指导转录阻遏以及激活。为此，生成具有与Gal4DNA结合结构域融合的转录阻遏结构域(KRAB)作为细胞内结构域的受体型式。表达这种synNotch的细胞当与发送器细胞共培养时通过下调报告基因进行应答(图86B)。
也将其他细胞内结构域插入syn-Notch中，包括Cre重组酶、以及主转录因子诸如MyoD和Snail。虽然这些中的一些显示出调控活性，但是一般来说这些活性相当低，很可能是因为synNotch受体输出结构域按化学计量地起作用并且不显示出放大。因此对于高度放大输出来说，这一受体系统可工作得更好。
在各种不同的原代细胞中起作用的合成Notch受体：神经元和免疫细胞。
SynNotch细胞系在受体激活时显示出强烈的激活。为了测试这一结果是否是细胞系特异性的，通过将以下一系列建立的细胞系工程化来产生synNotch接收器细胞系：上皮MDCK细胞、L929和C3H小鼠成纤维细胞系、HEK293人上皮细胞系、Jurkat T细胞。它们在synNotch受体激活时全部同样显示出报告基因激活的强烈诱导(图89B)。重要的是，原代细胞也可用synNotch受体工程化，并且以此方式它们变得响应于新型配体刺激。在图89A(和图90)中，示出表达synNotch和报告基因的原代海马神经元可通过与配体表达发送器细胞的接触而被诱导表达GFP报告盒。
合成Notch受体可以空间受控方式调控各种不同的细胞行为。
SynNotch接收器细胞可检测相邻细胞是否表达配体。测试了置于上皮细胞层中的synNotch接收器细胞是否可在空间上被诱导以表达报告基因。当将配体表达发送器细胞稀疏地涂板在接收器细胞层中时，只有直接接触发送器细胞的接收器细胞激活合成Notch受体，如通过绿色发送器细胞周围的蓝色细胞(激活的接收器)的环可见，而离得较远的接收器细胞保持没有活性(图91A)。
接着测试了这种合成的细胞-细胞信号传导是否可用于以空间受控方式调控细胞命运。具体地说，测试了syn-Notch受体是否可用于诱导细胞命运主调控子诸如肌细胞命运的控制因子(controller)MyoD的表达。如图89B所示，只有在邻近配体表达细胞的位置处，synNotch成纤维细胞的转分化可被诱导。在此实验中，首先将CD19表达细胞局部涂平板，然后均匀地覆盖抗CD19-synNotch成纤维细胞。在synNotch受体与其配体接合的情况中，接收器成纤维细胞上调myoD(肌生成的原型主转录因子)，这仅在局部导致肌管的转分化和形成(来自接收器细胞中的myoD-GFP的绿色通道与来自发送器细胞中的BFP的蓝色通道在空间上重叠，图89B；时间过程参见图92A)。
在另一个实例中，阐述了synNotch可用于控制上皮向间充质的转换。抗GFP(或抗CD19)用于控制EMT主调控基因snail的表达。在这些上皮细胞中，通过将它们暴露于配体-GFP表达细胞，而不是非配体表达细胞来诱导上皮向间充质的转换(图91C和92B)。
另外示出，synNotch可用于控制多细胞装配体(multicellular assembly)的空间自组织。对于这些实验，将工程化的成纤维细胞以球状体的形式培养于低粘性平板中，这是一个相对细胞-细胞粘附强度决定几何形状的环境。表达抗CD19 synNotch的接收器细胞在受到表达CD19的发送器细胞的刺激时诱导E-钙粘蛋白。在实验开始时，将CD19-发送器和抗CD19-synNotch接收器细胞随机混合(图91D，左)。接收器细胞中synNotch下游的E-钙粘蛋白表达的诱导增加了它们的粘附潜能。激活的接收器细胞现在彼此强烈粘附并且在球状体的内部移动，从而将发送器细胞留在外层(图91D)。作为对照，已示出，当响应于synNotch激活而仅激活荧光蛋白，而不是E-钙粘蛋白时，发送器和接收器细胞的这种内-外不对称性自组织(图92C)。
合成Notch受体彼此正交且为天然notch。
研究了多个synNotch受体是否可在相同细胞中没有串扰的起作用。正交功能将允许细胞根据多个输入的存在或不存在细化不同的输出。假设如果不同受体中的细胞内转录调控子不同，因为信号传导的机制-没有可引起串扰的常见中间体(例如活化的激酶)，synNotch受体可彼此正交地起作用。首先测试了synNotch与内源性Notch信号传导之间是否存在任何串扰。为了显示这一点，将细胞工程化以就抗CD19-synNotch以及具有不同荧光蛋白的全长Notch做出报告。当仅用δ刺激细胞时，只有全长Notch应答被激活；这同样适用于响应于CD19的synNotch：两条途径显示出独立的激活(图93A)。
接着测试了两种不同的synNotch受体是否可在相同细胞中独立地起作用。在图93B中，报告了用两种独立的synNotch受体，即抗CD19受体和抗GFP受体的单个配体以及组合配体刺激的结果。其中的每一个连接至不同的细胞内转录激活结构域(分别为Gal4和tTA)，其继而驱动不同的报告荧光蛋白。当通过CD19激活时，只有抗CD19-synNotch应答被激活；相反地，当通过表达GFP的发送器细胞激活时，只有抗GFP-synNotch应答被激活。重要的是，当通过CD19和GFP两者刺激细胞时，两种应答一起被激活(图94B)。因此，多个synNotch受体可在相同细胞中作为隔离的信号转导途径起作用。
多个synNotch受体可用于将组合性地集成多个输入的细胞工程化。
多个synNotch受体可用于相同细胞中，以生成各种不同的应答。设计了仅当满足某些条件时集成组合的环境线索和应答的细胞的工程化。具体地讲，集中于只有在其环境上存在两种不同的抗原时将应答，但是将不对单独的每一种做出应答的细胞的生成。为了实现这一点，将具有抗CD19和抗GFP细胞外结构域的双synNotch表达细胞工程化：每个synNotch的活化激活拆分Gal4蛋白的一半。以此方式，当两个输入独立地呈递给单独的接收器细胞时，看不到激活(图93C，柱1-3)。仅当两个受体被激活时，拆分分子被重构并且接收器细胞中的应答被诱导(图93C，最后一个柱)。
具有多个synNotch受体的细胞-细胞信号传导的工程化级联。
利用用于细胞-细胞通信的多个synNotch受体，设计了细胞-细胞通信的多细胞信号传导系统。具体地讲，集中于上皮细胞层中自组织的多层空间图案化(self-organizedmulti-layer spatial patterning)的诱导。为此，接收器细胞具有两个synNotch，其中的一个诱导另一个的配体。在此具体实例中，抗GFP-synNotch诱导CD19配体表达(以及报告蛋白mCherry)；并且抗CD19-synNotch诱导报告蛋白tagBFP。接着，为了开始层的级联的诱导，将GFP发送器细胞稀疏地接种在双synNotch接收器细胞的单层中。这种电路使得能够在发送器细胞岛的周围形成两个激活同心环：第一邻居在抗GFP-synNotch的激活之后变成红色，并且它们变成CD19发送器(图94A，第1天)。远离发送器细胞一个直径的细胞现在可响应于由第一邻居表达的CD19配体，生成图94A，第2天的双环图案。以此方式，由均匀的接收器细胞群以空间受控方式产生两种不同的细胞类型(图94C)。因此，可使用多个syn-Notch受体工程化更加复杂的多步骤图案化应答，类似于在自然发育过程中所观察到的(图94B)。
图85.synNotch受体的模块化构造
(图85A)synNotch受体系统的概念性设计，呈从野生型Notch开始，至Notch受体、至synNotch受体的连续工程化形式。后者利用了notch受体的细胞内正交转录因子的灵活性，并且建立了通过替换细胞外结构域对新型输入作出应答的平台。
(图85B)平台的模块性：从Notch结构域结构中提取的细胞外、跨膜和细胞内结构域可与外侧上的各种不同结构域(示出基于抗体的或肽标记)和内侧的各种不同效应子(示出具有不同DNA结合结构域的转录激活蛋白，以及转录阻遏蛋白)交换。
图87提供了与图85相关的数据。
(图87A)具有不同细胞外和细胞内结构域的系列synNotch接收器细胞在用同源配体刺激时显示出活化。细胞为小鼠成纤维细胞系L929，并且通过与平板结合的刺激物或利用表达配体的发送器细胞进行刺激，如图中所指出。
(图87B)接收器细胞的激活的时间过程：在发送器细胞添加时(左)；在达到全部激活，移除诱导接收器细胞的失活的发送器细胞之后(右)。
(图87C)在不同量的与平板结合的配体的情况下，接收器细胞的激活的剂量反应。将Myc标记synNotch(左)和抗GFP synNotch(右)接收器细胞暴露于增加量的配体；24h时的报告基因累积强度在图中示出。
(图87D)SynNotch表达水平线性影响报告基因激活的强度。在图中，示出相对于受体表达水平的报告基因强度，n＝24成纤维细胞克隆性群体，其表达具有myc标记细胞外结构域的synNotch，诱导GFP作为报告基因。蓝色圆点为来自未刺激细胞的数据，绿色圆点为在刺激之后记录的数据。可以看出受体表达和GFP强度之间的正相关性。
图86.SynNotch受体可用于程序化接触依赖性转录调控。
(图86A-B).合成notch受体可用于检测内源性疾病抗原并且增加或减少报告基因的转录。
(图86A)在γ-分泌酶抑制剂DAPT的存在下将具有抗CD19/tTA synNotch的小鼠成纤维细胞(L929系)与表达δ、或CD19、或CD19的发送器细胞一起培养。示出接收器细胞中所得GFP强度的FACS曲线图。
(图86B)将具有包括转录阻遏蛋白细胞内结构域的抗CD19synNotch的小鼠成纤维细胞(L929系)与或不与发送器细胞一起共培养。接收器细胞在SV40/UAS组合启动子的下游组成型地表达GFP。示出在膜上具有或不具有CD19的发送器细胞的存在下接收器细胞GFP强度的FACS曲线图。
(图86C)不同形式的配体对表达synNotch的小鼠成纤维细胞(L929)系的刺激。左：用可溶性、或发送器细胞呈递的、或在接收器细胞上顺式呈递的GFP刺激抗GFP/tTAsynNotch接收器细胞。条形图示出在各种配体呈递选择的存在下的报告基因激活：当配体仅存在于相反表面上时发生激活。右：用不同形式的配体刺激myc标记的抗CD19/tTAsynNotch接收器细胞，所述配体为抗myc可溶性抗体、或来自发送器细胞的CD19或相同接收器细胞中的CD19(顺式)。条形图示出报告基因的激活：当配体仅存在于相反表面上时激活被诱导。
图88.与图86相关。
(图88A)在细胞外结构域上添加EGF重复序列减少抗间皮素synNotch中的基础活化。将在抗间皮素ScFv之前具有或不具有EGF重复序列的抗间皮素synNotch受体引入小鼠L929成纤维细胞中。这些受体的活化激活GFP报告基因。所示数据为两种状况的FACS曲线图：上部，没有EGF重复序列，报告基因的诱导是组成型的，即使在不存在配体时；底部，具有EGF重复序列，消除了基础报告基因激活(“关”线)，并且诱导使GFP强度达到“开”状态。
(图88B)脉冲激活。为了短时间量刺激抗GFP synNotch接收器细胞，将接收器细胞接种在平板上24h，然后与发送器细胞(表达跨膜GFP的K562)悬液一起孵育1h或4h，之后洗去发送器细胞悬液，并且在从第一次添加发送器细胞开始t＝24h时，通过FACS测量接收器细胞中的荧光。条形图为每种情况的至少10,000个细胞的累积荧光反应。数据为平均值和标准误差。数据是针对抗GFP LaG17和LaG16/2细胞外结构域的。
(图88C)主要的图86C的顺式抑制结果的FACS曲线图。曲线图是细胞的数量相对于每种情况下至少10,000个细胞的报告基因荧光。发送器细胞为工程化K562并且接收器细胞为工程化L929小鼠成纤维细胞。在左侧示出抗GFP synNotch的数据；在右侧示出抗CD19synNotch的数据。
图89.各种不同细胞类型(包括神经元和淋巴细胞)中的SynNotch受体功能。
(图89A)海马神经元。将原代海马神经元从E18大鼠胚胎中解离出来并且进行核转染以表达抗CD19 synNotch和偶联的GFP报告基因。将神经元涂板在涂有聚D-赖氨酸和层粘连蛋白的玻璃底35mm培养皿上。神经元涂板2小时之后，向培养物中加入发送器细胞(K562)以形成共培养系统。在涂板之后第4天由活细胞获取图像。在右侧示出与普通的K562细胞(上图)或与CD19+K562发送器细胞(下图)共培养的神经元的代表性图像。与呈递发送器细胞的配体共培养的神经元具有比与对照细胞共培养的神经元显著更高的GFP表达。
(图89B)T细胞系。将Jurkat T细胞系工程化以稳定表达驱动作为报告基因的GFP的抗CD19/tTA synNotch受体。右侧的数据示出在t＝24h时用CD19+或CD19-发送器细胞(K562)刺激时Jurkat细胞的荧光。T细胞仅在看到synNotch同源配体时被激活。
图90.与图89相关。
(图90A)实验和在神经元中表达的构建体的阐述。将原代海马神经元从E18大鼠胚胎中解离出来并且用表达cNotch受体以及TetO-GFP报告基因的构建体进行核转染。将神经元涂板在涂有聚D-赖氨酸和层粘连蛋白的玻璃底35mm培养皿上。神经元涂板2小时之后，向培养物中加入K562发送器细胞以形成共培养系统。在涂板之后第4天由活细胞获取图像。
(图90B)对于每种处理，100个神经元中GFP荧光强度的分布。由荧光共焦图像计算GFP强度。
(图90C)对于每种处理，来自约100个神经元的平均GFP荧光强度的量化。
图91.SynNotch受体产生各种不同细胞行为的空间控制
(图91A)上皮细胞单层的边界检测。将上皮细胞(MDCK)如下工程化：发送器细胞表达连接至跨膜结构域的细胞外GFP；接收器细胞表达具有LaG17抗GFP纳米抗体作为细胞外结构域和Gal4-VP64作为细胞内结构域的抗GFP synNotch，以及UAS→BFP报告基因构建体。将1:50比率的发送器和接收器混合在一起并且在汇合单层的涂板之后48h时获取共焦图像。与荧光强度相对于距离的代表性线一起示出高放大倍数和低放大倍数的代表性图片。只有与绿色发送器细胞接触的接收器细胞打开蓝色报告基因，从而围绕发送器细胞形成环。
(图91B)成纤维细胞中的肌生成主调控子(myoD)的synNotch激活以空间受控方式诱导转分化。将C3H小鼠成纤维细胞如下工程化：发送器细胞表达连接至跨膜结构域的细胞外CD19，外加tagBFP标志物；接收器细胞表达具有tTA细胞内结构域的抗CD19synNotch，以及TRE→myoD报告基因构建体和组成型mCherry标志物。首先将发送器成纤维细胞在平板的有限区域中涂板；1h后，使发送器细胞与平板附接，并且将接收器细胞涂板以覆盖所有的玻璃板。所示图像为共培养后48h时(时间过程参见图92)。GFP通道示出与标志发送器细胞的蓝色通道重叠的区域中myoD-GFP的诱导。绿色通道的视场的更高放大倍数在右侧示出。
(图91C)synNotch可在培养的上皮细胞中诱导上皮向间充质的转换。将上皮细胞(MDCK)如下工程化：接收器细胞表达具有LaG17抗GFP纳米抗体作为细胞外结构域和tTA作为细胞内结构域的抗GFP synNotch，以及TRE→Snail-ires-BFP效应子构建体。发送器细胞为表达GFP的K562。示出在加入发送器细胞之前和之后上皮细胞的代表性明场显微镜图像。量化参见图92。
(图91D)成纤维细胞中的粘附性的synNotch诱导可控制成纤维细胞球状体培养物中的对称性破坏重排。将L929小鼠成纤维细胞如下工程化：发送器细胞表达连接至跨膜结构域的细胞外CD19，外加tagBFP标志物；接收器细胞表达具有tTA细胞内结构域的抗CD19synNotch，以及TRE→E-钙粘蛋白-GFP效应子构建体和组成型红色标志物(mCherry)。示出在t＝0(左)和t＝20h(右)时代表性球状体的用显微镜收集的荧光信号。在t＝0时，将细胞混合；在t＝20h时，接收器细胞诱导E-钙粘蛋白(绿色通道)并且在球状体(红色)的内层分选，而发送器细胞(蓝色)处于外侧。
图92.与图91相关。
(图92A；相对于图91B)将C3H小鼠成纤维细胞如下工程化：发送器细胞表达连接至跨膜结构域的细胞外CD19，外加tagBFP标志物；接收器细胞表达具有tTA细胞内结构域的抗CD19 synNotch，以及TRE→myoD效应子构建体和组成型mCherry标志物。首先将发送器成纤维细胞在平板的有限区域中涂板；1h后，使发送器细胞与平板附接，并且将接收器细胞涂板以覆盖所有的玻璃板。在右侧每10h获取图像。
以下示出发送器细胞和接收器细胞的共培养(上部)或单独接收器细胞(底部)的实验的代表性视场。
(图92B；相对于图91C)将上皮细胞(MDCK)如下工程化：接收器细胞表达具有LaG17抗GFP纳米抗体作为细胞外结构域和tTA作为细胞内结构域的抗GFP synNotch，以及TRE→Snail-ires-BFP效应子构建体。发送器细胞为表达GFP的K562。示出在没有发送器细胞的存在下，在表达不相关配体的发送器细胞的存在下，以及在表达同源配体GFP的发送器细胞的存在下，接收器细胞BFP信号的FACS曲线图。在条形图上提供了荧光的量化。
在最右侧，条形图报告了各种条件中的接收器细胞或亲代细胞的E-钙粘蛋白表达水平。E-钙粘蛋白水平仅在同源的抗原GFP表达发送器细胞的存在下降低。
(图92C；相对于图91D)
上图：将L929小鼠成纤维细胞如下工程化：发送器细胞表达连接至跨膜结构域的细胞外CD19，外加tagBFP标志物；接收器细胞表达具有tTA细胞内结构域的抗CD19synNotch，以及TRE→E-钙粘蛋白-GFP效应子构建体和组成型红色标志物(mCherry)。示出在t＝20h时具有发送器和接收器细胞的代表性球状体和如所指示的仅具有接收器细胞的代表性球状体的利用显微镜收集的荧光信号。只有在发送器细胞的存在下，在接收器细胞中诱导绿色荧光(E-钙粘蛋白通道，最右侧)。
下图：将L929小鼠成纤维细胞如下工程化：发送器细胞表达连接至跨膜结构域的细胞外GFP；接收器细胞表达具有tTA细胞内结构域的抗GFP synNotch，以及TRE→mCherry报告基因构建体和组成型蓝色标志物(tagBFP)。示出在t＝0t＝20h时具有发送+接收器细胞的代表性球状体和仅具有接收器细胞的代表性球状体的利用共焦显微镜收集的荧光信号。只有在发送器细胞的存在下，在接收器细胞中诱导了红色荧光(mCherry报告基因通道，最右侧)。发送器和接收器细胞没有明显的重排。
图93.SynNotch受体彼此正交并且可用于组合调控
(图93A)synNotch和野生型Notch激活正交信号通路。将L929小鼠成纤维细胞接收器工程化以表达(i)野生型Notch受体，其具有tTA细胞内结构域和TRE→GFP受体；以及(ii)synNotch受体，其具有抗CD19细胞外结构域和Gal4-VP64细胞内结构域，以及UAS→tagBFP报告基因。右侧的图报告了在不同的情况下BFP和GFP报告基因的接收器细胞荧光信号：黑色圆点为未处理细胞，蓝色圆点为用表达CD19的发送器刺激的接收器细胞；橙色圆点为用δ发送器刺激的接收器细胞，并且红色圆点为用表达CD19和δ两者的发送器细胞刺激的接收器细胞。发送器细胞为小鼠L929成纤维细胞。
(图93B)多个synNotch彼此正交。将L929小鼠成纤维细胞接收器工程化以表达(i)抗CD19 synNotch受体，其具有tTA细胞内结构域和TRE→BFP受体；以及(ii)synNotch受体，其具有抗CD19细胞外结构域和Gal4-VP64细胞内结构域，以及UAS→mCherry报告基因。右侧的图报告了在不同的情况下BFP和GFP报告基因的接收器细胞荧光信号：黑色圆点为未处理细胞，红色圆点为用表达CD19的发送器刺激的接收器细胞；绿色圆点为用GFP发送器刺激的接收器细胞，并且蓝色圆点为用表达GFP和CD19两者的发送器细胞刺激的接收器细胞。发送器细胞为K562。
(图93C)用两种synNotch工程化的细胞可仅在存在两个输入时作出应答。将L929小鼠成纤维细胞接收器工程化以表达(i)抗CD19synNotch受体，其具有tTA细胞内结构域和驱动与亮氨酸拉链结构域融合的Gal4的DNA结合结构域(DBD)的表达的TRE启动子，以及(ii)synNotch受体，其具有抗GFP细胞外结构域和作为细胞内结构域的与互补亮氨酸拉链融合的VP64转录激活结构域，以及(iii)驱动红色荧光蛋白(mCherry)的Gal4应答型启动子。右侧的图示出从与单独表达两种配体(GFP或CD19)或一起表达两种配体的不同发送器细胞(K562)共培养的接收器细胞中收集的归一化mCherry荧光。仅在两个输入的存在下发生激活。
图94.多个synNotch受体可用于生成多层自组织上皮细胞图案。
将上皮细胞(MDCK)如下工程化：发送器细胞表达连接至跨膜结构域的细胞外GFP；接收器细胞表达(i)具有tTA细胞内结构域，以及TRE→CD19-mCherry效应子盒的抗GFPsynNotch，(ii)具有Gal4-VP64细胞内结构域和UAS→tagBFP报告基因的抗CD19受体。
(图94A)示出以1:50的比率共培养10h(开始)34h(第1天)和58h(第2天)的发送器细胞和接收器细胞的上皮细胞层的代表性图像。
(图94B)在第2天共培养的不同视场的多个图像。
(图94C)由在第2天围绕发送器细胞的图案的荧光图像计算得到的荧光信号的代表性量化。
图95.synNotch受体的模块性扩大了哺乳动物细胞的感测/应答工程化。
(图95A)synNotch受体的激活的推测性结构机制。LNR结构域遮盖住未结合构象中的蛋白酶裂解位点(左)。当配体接合受体时，所述位点暴露并且此事件引发转导(右)。
(图95B)来自早期后生动物的含LNR分子的比对。
(图95C)synNotch受体平台的模块性允许用户指定细胞现在所应答的细胞外线索，以及在受体激活的下游诱导的细胞内应答。
实施例4：使用合成Notch受体利用定制的治疗性应答程序工程化T细胞
材料和方法
除非另外指明，否则以下材料和方法适用于实施例4中所述的结果。
synNotch受体和应答元件构建体设计
通过将CD19 scFv、LaG17(较低亲和力)或LaG16_2(高亲和力)GFP纳米抗体与小鼠Notch1(NM_008714)最小调控区(Ile1427至Arg1752)和Gal4VP64融合来构建synNotch受体。所有synNotch受体均包含用于膜靶向的n末端CD8α信号肽(MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO:129))和用于利用α-myc A647(cell-signaling#2233)容易测定表面表达的myc标记(EQKLISEEDL(SEQ ID NO:75))。将受体克隆到包含用于所有原代T细胞实验的PGK启动子的经修饰的pHR’SIN:CSW载体中。pHR’SIN:CSW载体还经修饰以制备应答元件质粒。将Gal4 DNA结合结构域靶序列(GGAGCACTGTCCTCCGAACG(SEQ ID NO:130))的五个拷贝克隆到最小CMV启动子的5’。在Gal4诱导型启动子下游和IRES mCherry报告基因的5’将人IL-2、IL-10、Tbet或TRAIL密码子优化的mRNA序列克隆到MCS中。通过In-Fusion克隆(Clontech#ST0345))克隆所有构建体。
原代人T细胞分离和培养
在通过负选择(STEMCELL Technologies#15062&15063)进行单采血液成分术之后，从匿名供体血液中分离原代CD4+和CD8+T细胞。血液获自太平洋血液中心(BloodCenters of the Pacific)(San Francisco,CA)，得到大学伦理审查委员会(UniversityInstitutional Review Board)的批准。将T细胞冷冻保存在具有20％人AB血清(ValleyBiomedical Inc.,#HP1022)和10％ DMSO的RPMI-1640(UCSF细胞培养核心)中。融化后，将T细胞在由X-VIVO 15(Lonza#04-418Q)、5％人AB血清和10mM中性N-乙酰基L-半胱氨酸(Sigma-Aldrich#A9165)组成的补充有30单位/mL IL-2(NCI BRB临床前储藏所(NCI BRBPreclinical Repository))的用于实施例4的所有实验的人T细胞培养基中培养。
人T细胞的慢病毒转导
通过使用Fugene HD(Promega#E2312)，利用pHR’SIN:CSW转基因表达载体和病毒包装质粒pCMVdR8.91和pMD2.G转染Lenti-X293T细胞(Clonetech#11131D)产生泛嗜性VSV-G假型慢病毒。同一天将原代T细胞融化，并且在培养24小时之后，利用Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(Life Technologies#11131D)以1:3的细胞:珠粒比对其进行刺激。在48小时时，收获病毒上清液并且将原代T细胞暴露于病毒24小时。在T细胞刺激后第4天，移除Dynabeads并且T细胞扩增，直到第9天，当它们静息并且可用于测定时。利用FACs ARIAII分选T细胞以用于测定。
癌细胞系
所用的癌细胞系为K562骨髓性白血病细胞(ATCC#CCL-243)、Daudi B细胞成淋巴细胞(ATCC#CCL-213)以及HCT115结肠癌细胞(ATCC#CCL-247)。将K562用慢病毒转导以与Daudi肿瘤在相等的水平下稳定表达人CD19。通过用α-CD19 APC(Biolegend#302212)对细胞染色来测定CD19水平。还将K562转导以稳定表达表面GFP(与PDGF跨膜结构域融合的GFP)。将所有细胞系分选以用于转基因的表达。
synNotch T细胞的体外刺激
对于所有体外synNotch T细胞刺激，将2x105个T细胞与发送器细胞以1:1的比率共培养。将T细胞和发送器细胞在圆底96孔组织培养板中混合之后，将细胞在400xg下离心1min以迫使细胞相互作用并且在24小时时利用BD LSR II通过流式细胞术针对报告基因表达或定制基因诱导的表达对培养物进行分析。所有流式细胞术分析在FlowJo软件(TreeStar)中执行。
Luminex MAGPIX细胞因子量化
如上所述用K562骨髓性白血病细胞(CD19-或CD19+)刺激表达α-CD19 synNotchGal4VP64受体以及控制人IL-2或IL-10表达的5x Gal4应答元件的原代CD4+T细胞。如参考文献一样，表达α-CD194-1BBζCAR的CD4+T细胞与用α-CD3/CD28 Dynabeads以1:3比率刺激的未转导T细胞一起被刺激。在24小时时收集上清液并且利用Luminex MAGPIX(LuminexCorp.)Human Cytokine Magentic 25-plex Panel(Invitrogen ref#LHC0009M)根据制造商的方案进行分析。利用xPONENT软件(Luminex Corp.)基于标准曲线计算所有细胞因子水平。
IL-2细胞内细胞因子染色和CD69染色
通过细胞内细胞因子染色(ICS)对控制IL-2产生的synNotch T细胞进行测定，以确定它们是否基础地产生IL-2。将synNotch T细胞和未转导的T细胞对照在GolgiPlug(BDBiosciences#555029)的存在下培养6小时。然后利用BD Biosciences ICS试剂盒(#555028)，用α-IL-2FITC(BD#340448)对T细胞染色。利用BD LSRII通过流式细胞术分析IL-2的水平。
为了评估synNotch受体是否激活T细胞，在刺激之后针对激活标志物CD69对T细胞染色。通过用α-CD69 APC(Biolegend#310910)对细胞染色来测定CD69表达。
驱动T细胞分化的synNotch
如上所述用Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28刺激原代人CD4+T细胞。为了使T细胞在激活期间分化成Th1亚群，如上所述培养细胞，但是加入2.5ng/mL重组IL-12(R&D Systems)和12.5μg/mLα-IL-4克隆MP4-25D2(BD Pharmigen#554481)。至少每周两次加入IL-12和α-IL-4。并行地，将原代CD4 T细胞用慢病毒转导以表达人Tbet T2A mCherry(TBX21,NCBI#EAW94804.1)并且将其在补充有IL-2的T细胞培养基中正常培养。在病毒转导后24小时，将表达α-CD19 synNotch Gal4VP64受体和控制Tbet T2A GFP表达的5x Gal4应答元件的CD4+T细胞在CD19-或CD19+K562发送器细胞的存在下培养。将synNotch T细胞在K562的存在下在补充有IL-2的T细胞培养基中培养。所有T细胞培养11至14天，接着经受细胞内细胞因子染色(ICS)以测定Th1 T细胞的百分比。
对于ICS，首先在GolgiPlug的存在下用50ng/mL豆蔻酰佛波醇乙酯和1μg/mL离子霉素(两种均来自Sigma)将T细胞处理6小时。然后用α-Tbet BV421(Biolegend#644816)和α-IFNγAPC(Biolegend#502512)对T细胞染色。利用BD LSRII通过流式细胞术分析Tbet和IFNγ的水平。
癌细胞系对重组TRAIL的敏感性和在原代T细胞中驱动TRAIL产生的synNotch
将HCT116结肠癌细胞和K562用重组TRAIL(1至200ng/mL；1:2稀释系列)处理24小时。然后收获细胞并且用活/死染色剂SYTOX蓝(Thermo Scientific#S34857)进行染色并且在BD LSR II上通过流式细胞术测定死细胞的分数。通过用α-TRAIL R1(DR4)APC(Biolegend#307208)染色评估K562表达的死亡受体4(DR4)的水平。
对于synNotch驱动的TRAIL细胞毒性的测定，将原代人CD4+T细胞转导以表达α-GFP纳米抗体(LaG17)synNotch Gal4VP64受体和控制LZ-TRAIL或细胞表面野生型TRAIL的表达的5x Gal4应答元件。将synNotch TRAIL杀伤细胞与表面GFP+或GFP-K562一起共培养24小时，并且通过用SYTOX Blue染色确定死亡。通过用α-TRAIL(CD253)APC(Biolegend#308210)对T细胞染色来测定TRAIL的表面水平。LZ-TRAIL的产生和分泌通过TRAIL ELISA(R&D systems#DTRL00)测定。
异种移植肿瘤模型、细胞分离和流式细胞术
利用UCSF临床前治疗核心(UCSF Preclinical Therapeutics Core)按照UCSF研究所动物照管与使用委员会(UCSF Institutional Animal Care and Use Committee)批准的方案进行动物研究。所有体内小鼠实验均使用NOD scidγ(NSG)(雌性，8～12周龄，Jackson Laboratory#005557)小鼠。将表达α-CD19 synNotch Gal4VP64受体和控制人IL-2IRES mCherry的5x Gal4应答元件的原代CD4+和CD8+T细胞分选并用于实验。
在第0天分别在小鼠的右侧肋腹部和左侧肋腹部上向小鼠皮下注射5x106个CD19+和CD19-K562。使肿瘤建立4天，在第4天通过尾静脉(i.v.)或在第8天肿瘤内注射T细胞。对于所有注射，将T细胞悬浮于PBS中。以1:1的比率注射CD4+和CD8+synNotch T细胞。对于i.v.注射，注射共计6x106个T细胞；并且对于肿瘤内注射，注射共计5x105个T细胞。
在第10天将肿瘤收获到补充有1％ FBS的RPMI(UCSF细胞培养核心(UCSF CellCulture Core))中。然后将肿瘤通过刀片切碎并且在37℃下在具有0.1mg/mL DNA酶(Roche#10104159001)和0.2mg/mL胶原酶P(Roche#11249002001)的RPMI中消化1小时。孵育后，使经消化的肿瘤经过75μm细胞过滤器并且通过离心收集肿瘤细胞。然后用红细胞裂解缓冲液(Biolegend#420301)处理细胞并用PBS洗涤。然后用LIVE/DEAD Green(ThermoScientific#34969)以及α-CD4A647(BD 557707)和α-CD8 BV786(BD#583823)对肿瘤染色以分析肿瘤浸润T细胞。利用BD LSR II在CD4+和CD8+T细胞群中评估IL-2IRES mCherry的表达。
统计分析
除非另外指明，通过学生t检验(双侧)确定统计显著性。实施例4的所有统计分析利用Prism 6(Graphpad)执行并且报告p值(n.s.＝p>0.05，*＝p≤0.05，**＝p≤0.01，***＝p≤0.001，****＝p≤0.0001)。所有误差线表示S.E.M.或S.D.。
结果
synNotch受体可在CD4+和CD8+人原代T淋巴细胞中驱动抗原诱导的转录
Notch受体具有三个关键组分：1)配体结合表皮生长因子(EGF)重复序列，2)在激活期间控制受体的裂解的核心调控区，以及3)被释放并调控转录的Notch细胞内结构域(NICD)。为了构建允许完全可定制受体靶向和转录调控的synNotch受体平台，利用控制配体依赖性裂解和激活的Notch核心调控区作为最小支架，但是接着附加上定制的输入识别和输出转录模块(参见实施例3)。Notch核心调控区包括控制S2裂解位点对金属蛋白酶而言的可接近性的Lin12-Notch重复序列(LNR)、异源二聚化结构域(HD)，以及包含Notch细胞内结构域(NICD)的释放所需的γ-分泌酶裂解位点的跨膜结构域(TMD)。通常参与天然配体δ的识别的细胞外EGF重复序列被移除并替换为针对癌抗原CD19的单链可变片段(scFv)或针对正交抗原诸如表面展示的GFP的纳米抗体(图96B-96C)。转录调控通常需要的NICD替换为与四聚体病毒转录激活蛋白结构域VP64融合的Gal4 DNA结合结构域(图96B-96C)。这种一般方法可用于将synNotch受体工程化为感兴趣的任何表面抗原并且将受体活性与由正交转录因子以及它们的相关应答元件所控制的定制细胞输出相关联(参见实施例3)。还显示一系列其他细胞外和细胞内结构域与synNotch一起起作用。
为了示出synNotch受体可在用于基于细胞的疗法的相关细胞类型中起作用，将原代人CD4+和CD8+T细胞用针对癌症相关抗原CD19或针对正交抗原-表面展示的GFP的synNotch受体工程化。将CD4+和CD8+T细胞工程化以表达各synNotch受体和控制BFP报告基因的表达的相关启动子(5x Gal4应答元件)(图97)。用α-CD19synNotch受体工程化的CD4+和CD8+T细胞在与表达同源配体CD19的细胞--天然表达CD19的Daudi B成淋巴细胞肿瘤、或具有异位表达的CD19的K562骨髓性白血病细胞一起共培养的24小时内在80至90％的T细胞中驱动BFP报告基因的表达(图97A-97C和图103A-103C)。这些T细胞在未被刺激或用不表达同源CD19抗原的细胞处理时不显示出BFP表达。这些数据显示，synNotch受体可以受控且抗原依赖性的方式在原代T细胞中起作用，并且可检测癌细胞表面上抗原的天然水平。synNotch受体在CD4+和CD8+T细胞中也具有相当的功能，这常同时用于T细胞免疫疗法(图97C以及图103A和103B)。
还通过构建识别表面表达的GFP的synNotch受体测试了T细胞是否可被工程化以识别正交表面蛋白。使用了具有低(Kd＝50nM)或高亲和力(Kd＝0.036nM)(Fridy等人,2014)的两种α-GFP纳米抗体。这些受体在暴露于表达表面GFP的K562细胞(但是没有缺乏抗原的细胞)时刺激报告基因表达。所得的转录应答类似于对于α-CD19synNotch所观察到的结果，从而突出了synNotch平台的模块性(图97D-97F和图103D-103F)。与较低亲和力受体相比，较高亲和力α-GFP纳米抗体synNotch受体驱动更大分数的T细胞在暴露于K562发送器细胞时上调报告基因表达，然而两种受体均在超过一半的T细胞中激活基因表达(图97D-97F和图103D-103F)。这表明改变synNotch配体结合结构域的亲和力可精细调节细胞应答的量级。
synNotch受体可驱动定制T细胞细胞因子谱
全身的免疫细胞和组织分泌被称为细胞因子的可溶性蛋白以用于通信和调控细胞行为并且调整总体免疫应答。特定的细胞因子谱对于根除病原体和肿瘤是关键的。在许多情况中，不同的细胞因子组具有阻遏免疫应答的相反作用。此外，在其中细胞因子可提高针对癌症的免疫力或在自体免疫环境中阻遏损伤性炎症的某些状况中，这些细胞因子不存在。希望精确控制治疗性T细胞分泌什么细胞因子。然而，在一些情况下，当通过CAR或天然T细胞受体激活T细胞时，对所产生的细胞因子只有很少控制并且通常细胞因子谱取决于疾病和激活环境以及受体特征(图98A-98C)。对于许多T细胞疗法，偏向特定细胞因子的产生以定制特定疾病或治疗所需的免疫应答可为有利的。
据此，将CD4+T细胞用α-CD19 synNotch受体和控制单个细胞因子的表达的相应的转录应答元件工程化。在这些条件下，T细胞响应于CD19抗原选择性地仅产生限定的“照单(a la carte)”细胞因子谱(图98D-98F)。synNotch受体在抗原感测之前驱动T细胞刺激细胞因子IL-2的高水平产生，而没有基础分泌(图104A-104D)。synNotch激活所产生的IL-2的量类似于T细胞响应于CAR或TCR刺激(α-CD3/α-CD28珠粒)所产生的量(图104D)。与通过TCR途径的T细胞的正常刺激不同，synNotch驱动的细胞因子产生不导致T细胞激活，这通过激活标志物CD69的上调的缺乏表明(图104E)。
将T细胞工程化以产生免疫抑制性细胞因子IL-10(图98D-98F和图104F-104H)，其不同于IL-2，在活化CAR T细胞的细胞因子谱中不存在(图98C)。这突出了synNotch受体的应用-增加或调节特定细胞因子的水平的能力，即使是不天然表达的细胞因子(图98和图104)。此外，此类应答不需要T细胞的正常激活。T细胞中synNotch电路的可定制性和精确性应允许依赖于自分泌和旁分泌细胞通信的免疫系统功能的局部控制，以有效地协调对疾病的应答。
synNotch受体可驱动T细胞分化对抗肿瘤Th1命运的抗原依赖性偏向
精确调整治疗性T细胞的输出的另一种方式是控制其分化。除了产生蛋白质效应子如细胞因子之外，T细胞经历对于增强有效的亚型免疫应答至关重要的特定分化程序。这些亚型分化程序通常通过T细胞激活(具体地讲细胞因子)以及最终的引发特定T细胞命运的主调控转录因子的调控的组合确定。T辅助细胞1(Th1)或T辅助细胞2(Th2)T细胞是分别由主调控转录因子Tbet和GATA3控制的两个典型的CD4+T细胞命运选择(图99A)。Th1细胞对于针对病原体和癌症的细胞免疫性是重要的，而Th2细胞则涉及抗体产生的刺激。在许多疾病中，局部环境使T细胞的分化偏向于沿着错误路径，由此使得它们无效。在癌症中尤其如此，其中T细胞可被推入抑制性表型中，从而阻碍了免疫应答并引起肿瘤扩增。
鉴于T细胞命运选择对癌症清除的重要性，对synNotch受体是否可使T细胞偏向分化成对于抗癌免疫性重要的产生IFNγ的Th1细胞展开了研究。IFNγ对于有助于肿瘤清除的先天免疫细胞(诸如巨噬细胞和树突细胞)的激活是关键的，并且癌细胞直接暴露于IFNγ可提高它们对细胞毒性T细胞的敏感性。为了实现T细胞分化偏向，将CD4+T细胞用控制Th1转录因子Tbet的表达的α-CD19 synNotch受体工程化(图99B)。由于已知Tbet的异位表达足以在CD4+T细胞中驱动Th1命运选择，因此推断synNotch可通过响应于肿瘤抗原CD19调控Tbet的水平来提供对Th1命运调控的抗原依赖性控制。
为了测试这一点，将工程化的原代CD4+T细胞与CD19+靶K562细胞或CD19-对照K562细胞一起共培养11天以诱导分化。作为比较性对照，将匹配的CD4+T细胞群用Th1分化试剂的混合液(IL-12和α-IL-4)进行处理或使其经受Tbet组成型过表达。这两种情况允许synNotch驱动的Th1分化与该领域中先前的金标准的比较。工程化的synNotch CD4+T细胞在刺激的24小时之内响应于CD19表达Tbet(图99C和图105A)。在与CD19+K562长期共培养11天之后，使用用于细胞内细胞因子染色的豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)和离子霉素刺激T细胞以揭示T细胞是否已经变成Th1细胞。对于已经用CD19+K562细胞刺激11天的T细胞，发现>60％为IFNγ+Th1细胞(图99D)。偏向分化的这种量级等于在用Th1分化混合液处理时所观察到的量级且仅稍小于组成型Tbet过表达的情况(图99E和图105A-105E)。因此，synNotch受体可用于使T细胞偏向抗肿瘤Th1命运，并且在原理上可用于使T细胞偏向许多已知的T细胞命运(例如，Th2、Treg、Th17)，只要限定的主调控转录因子的表达对于命运确定是足够的即可。
SynNotch驱动的定制治疗剂的T细胞递送-TRAIL产生
未来T细胞治疗剂的另一个重要组成是将T细胞工程化为具有允许其递送定制治疗剂有效载荷(即使是并非天然的)的新能力。天然T细胞或CAR T细胞直接识别感染细胞或癌细胞并且通过裂解性颗粒的递送杀死它们(图100A)。然而，天然T细胞应答通常不足以安全地根除疾病或太过极端而不能安全地根除疾病。通过T细胞，诸如分泌性生物物质，定制递送治疗有效载荷可有助于难以治疗的疾病，例如通过局部增强细胞毒活性或通过激励有待识别的疾病部位并且通过免疫系统将其杀死。
作为原理实验的证明，对CD4+T细胞(细胞毒性最小的T细胞亚群)的工程化(其中通过将其设计成产生细胞凋亡诱导性有效载荷而将其工程化为合成的“T杀伤细胞”)进行研究。使用了α-GFP纳米抗体synNotch受体和控制肿瘤坏死因子受体配体(TRAIL)的应答元件，细胞凋亡诱导剂和癌症治疗剂(图100B)。T细胞在TCR刺激时通常不产生TRAIL，因此，如果以受控方式合成性地表达，那么这可有助于它们的细胞毒活性(图106A)。TRAIL的可溶形式有效地杀死高易感性结肠癌细胞系HCT116，但是对于其他癌症系如K562细胞，可溶性TRAIL即使在高剂量下也不诱导细胞凋亡(图106A-106D)。然而，近期研究表明如果TRAIL以膜锚定形式(例如，支持的脂质双层或脂质体)递送，那么其可更有效地诱导细胞凋亡，即使是对于抗性癌细胞诸如K562细胞。因此，将CD4+T细胞工程化为产生以下两种TRAIL变体中的一种：1)已知比可溶性单体TRAIL更具效力的与GCN4三聚体亮氨酸拉链(LZ-TRAIL)融合的TRAIL的分泌性形式，或2)天然的表面展示的TRAIL(图106E、106H)。
将驱动TRAIL产生的synNotch T细胞与TRAIL抗性K562细胞共培养，以确定T细胞是否为增强TRAIL的细胞凋亡作用的有效的递送平台。synNotch T细胞在共培养的24小时内驱动细胞表面TRAIL表达(图100C)和LZ-TRAIL分泌(图106F-106H)，但是只有细胞表面TRAIL引起K562细胞死亡，这通过它们的活/死染色剂SYTOX蓝的摄入表明。相比之下，分泌LZ-TRAIL的synNotch T细胞不有效地杀死抗性K562细胞，这与近期研究一致(图100D-100E)。
总体而言，这些发现表明synNotch T细胞可以是治疗剂诸如TRAIL的有效率且有效果的递送剂。在全身递送时无效或有毒性的任何生物试剂如果以此方式局部递送可更有效且更安全。synNotch工程化T细胞具有局部递送任何遗传编码的治疗剂，以增强有效性且降低系统脱靶毒性的潜能。
细胞因子通过synNotch受体工程化T细胞在实体肿瘤中的体内表达
由于synNotch受体可在体外精确地调节T细胞应答谱，因此研究了受体是否可在体内使原代人T细胞选择性地靶向实体肿瘤并且诱导定制有效载荷诸如细胞因子IL-2的递送。对于这些实验，在免疫受损的NOD scidγ(NSG)小鼠中建立双侧K562异种移植实体肿瘤模型，其中非靶CD19-肿瘤和靶CD19+肿瘤分别皮下植入左侧肋腹部和右侧肋腹部(图101A)。允许肿瘤建立4天，然后将用α-CD19synNotch受体和控制IL-2表达的应答元件以及IRES mCherry报告基因工程化的CD4+和CD8+T细胞静脉内(i.v.)注射(图107A)。6天后收获肿瘤并且针对IL-2IRES mCherry报告基因的表达对肿瘤浸润T细胞进行分析(图101A-101C)。只有肿瘤定位性T细胞在靶CD19肿瘤中表达用于IL-2表达的mCherry报告基因，并且报告基因水平类似于当在体外刺激时针对相同T细胞所观察到的水平(图101A–101C以及图107B和107C)。虽然在肿瘤中T细胞的频率并不高(对于CD4+，1000个细胞中有1个；并且对于CD8+T细胞，500个细胞中有1个)，但是T细胞的活性对于靶肿瘤却是高度特异性的(图101B和101C以及图107D)。除了synNotch→IL-2T细胞的i.v.注射之外，还将T细胞直接注射到非靶和靶肿瘤中。然后在注射两天后收获肿瘤并且通过流式细胞术分析，并且在靶肿瘤中还显示出与匹配的体外刺激T细胞类似水平的IL-2报告基因的选择性表达(图107E)。虽然synNotch T细胞浸润这些肿瘤的能力仍可提高，但是这些数据清楚地表明synNotch受体可使T细胞靶向原发性肿瘤并且以局部方式选择性地诱导治疗剂的产生。因此，synNotch工程化的T细胞可以证明对广泛的可遗传编码的治疗剂的递送是有效的，所述治疗剂可受益于局部递送，以提高有效性并减少全身施用的毒性。
图96.使用synNotch受体工程化定制的治疗性T细胞应答的潜能。
(A)TCR和CAR激活基于激酶的信号级联，所述信号级联驱动天然T细胞激活程序，从而提供对重塑T细胞应答的很小控制。synNotch受体识别细胞表面抗原(例如疾病相关抗原)并且以对T细胞应答更精确的控制直接调控定制转录程序。因此，synNotch受体可用于工程化照单应答。(B)synNotch受体可具有检测感兴趣的细胞表面抗原的定制配体结合结构域(例如scFv或纳米抗体)、Notch的核心调控区，以及包含正交转录因子的细胞质结构域(例如Gal4 VP64)。可将控制定制转录程序的正交转录因子的相应的应答元件连同受体一起工程化到T细胞中。(C)将具有针对癌症相关抗原CD19的scFv和针对正交抗原GFP的纳米抗体的synNotch受体工程化并且证实了synNotch受体平台的灵活性。
图97.synNotch受体可在CD4+和CD8+人原代T淋巴细胞中驱动抗原诱导的转录
(A)将CD4+和CD8+原代人T细胞用α-CD19 synNotch Gal4VP64受体和控制BFP报告基因的表达的5x Gal4应答元件工程化。(B)示出在共培养24小时之后响应于用具有CD19-或CD19+K562或Daudi癌细胞(CD19+)的发送器细胞的刺激，BFP报告基因在α-CD19synNotch受体接受器T细胞中的选择性诱导的直方图(代表≥3个实验)。(C)由图B所示的重复数据计算得到的在用发送器细胞刺激24小时之后上调BFP报告基因的α-CD19 synNotchT细胞的百分比(对于所有情况，n≥3；误差线＝SEM)。(D)将CD4+和CD8+原代人T细胞用α-GFP synNotch Gal4VP64受体亲和力变体和BFP报告基因如图A一样工程化。(E)示出在共培养24小时之后响应于表面GFP-或GFP+K562发送器细胞，BFP报告基因在α-GFP synNotch受体接受器T细胞中的选择性诱导的直方图(代表≥3个实验，误差线＝SEM)。(F)由图H所示的重复数据计算得到的在用发送器细胞刺激24小时之后上调BFP报告基因的α-GFP synNotchT细胞的百分比(对于所有情况，n≥3；误差线＝SEM)。
图103.与图97A-97F相关的补充数据。
(A)用α-CD19 synNotch Gal4VP64受体(myc标记的)和控制BFP的表达的5xGal4应答元件转导的CD4+(左图)和CD8+(右图)原代人T细胞的二维点图。应答元件载体还包含驱动mCherry的组成型表达的PGK启动子，以鉴定具有插入的应答元件的T细胞。所有BFP报告基因表达分析均在具有synNotch受体和控制BFP表达的相应5xGal4应答元件的T细胞上执行(群体以右上方的框为轮廓)。(B)示出在共培养24小时之后与CD19-K562对照细胞相比，响应于CD19+K562或Daudi肿瘤细胞，BFP报告基因在synNotch受体接受器T细胞中的选择性诱导的直方图(代表≥3个实验)。(C)示出K562和Daudi肿瘤细胞上的CD19水平的直方图。Daudi肿瘤天然表达CD19并且K562以类似水平异位表达CD19。(D)与图103A类似的表达α-GFP纳米抗体synNotch Gal4VP64受体的CD4(顶行)和CD8(底行)原代人T细胞的二维点图。每个柱针对特定的α-GFP纳米抗体亲和力变体(LaG17、LaG16-2)。所有BFP报告基因表达分析均如图103A中一样在右上方勾勒的门中的T细胞上进行。(E)示出在共培养24小时之后与表面GFP-K562相比，响应于表面GFP+K562癌细胞，BFP报告基因在synNotch受体接受器T细胞中的选择性诱导的直方图(代表≥3个实验)。(F)示出与K562 GFP对照相比，表达表面GFP的K562癌细胞中的总GFP水平的直方图。
图98.synNotch受体可驱动抗原诱导的定制细胞因子程序。
(A)CAR激活驱动T细胞产生各种不同组的细胞因子。(B)示出在刺激24小时后，由用靶CD19+K562细胞(y轴)或阴性对照CD19-K562(x轴)激活的原代人α-CD19 CAR CD4+T细胞产生的25种细胞因子(细胞因子的列表参见图98C)的水平(pg/mL)的散点图(n＝3，误差线＝SEM)。(C)由通过靶CD19+K562刺激的CD4+α-CD19 CAR T细胞产生的25种细胞因子的水平(n＝3，误差线＝SEM)。(D)将CD4+T细胞用α-CD19 synNotch Gal4VP64受体和控制IL-2或IL-10的表达的相应应答元件工程化。将细胞与靶CD19+K562或CD19-非靶K562一起共培养。(E)如图B中一样示出响应于CD19+K562刺激产生单一细胞因子的散点图(n＝3，误差线＝SEM)。(F)由响应于CD19+K562细胞驱动IL-2或IL-10产生的α-CD19 synNotch T细胞产生的细胞因子的水平。只产生了高于背景水平的单一细胞因子(IL-2或IL-10)(n＝3，误差线＝SEM)。
图104.与图98A-98F相关的补充数据。
(A)用α-CD19 synNotch Gal4VP64受体和控制IL-2产生的相关联的5xGal4应答元件将CD4+人原代T细胞工程化。(B)用α-CD19synNotch Gal4VP64受体和控制表达IL-2表达IRES mCherry的5xGal4应答元件转导的CD4原代人T细胞的二维点图(左图)。应答元件载体还包含驱动BFP的组成型表达的PGK启动子，以鉴定具有插入的应答元件的T细胞。将具有synNotch受体和控制IL-2IRES mCherry表达的相应5xGal4应答元件的T细胞分选并且用于图98和104中的所有相应测定。(右上方的框)。左图示出与未转导的T细胞相比，双阳性T细胞中没有IL-2IRES mCherry报告基因的基础诱导。(C)示出未刺激的CD4+和CD8+T细胞、未刺激的控制IL-2产生的α-CD19 synNotch Gal4VP64 T细胞以及用PMA/离子霉素刺激6小时的阳性对照T细胞的IL-2的细胞内细胞因子染色的点图。(D)给出从以下各项中收获的上清液的基础和经刺激的IL-2水平：未转导的CD4+T细胞；α-CD19 4-1BBζCAR T细胞；以及控制IL-2产生的α-CD19 synNotch Gal4VP64 T细胞(n＝4)。(E)用α-CD3/CD28dynabeads刺激的对照CD4+T细胞和用CD19-或CD19+K562刺激的控制IL-2产生的α-CD19 synNotch Gal4VP64T细胞中的CD69水平(左列)和IL-2IRES mCherry报告基因水平。在用同源抗原刺激时，CD69在synNotch T细胞上未上调。(F)用α-CD19 synNotch Gal4VP64受体和控制IL-10产生的相关联的5xGal4应答元件将CD4+人原代T细胞工程化。(G)用α-CD19 synNotch Gal4VP64受体和控制IL-10IRES mCherry的表达的5xGal4应答元件转导的CD4+原代人T细胞的与图B相当的数据。(H)用α-CD19 synNotch Gal4VP64受体和控制IL-10IRES mCherry表达的5xGal4应答元件转导的CD4+原代人T细胞的与图D相当的数据。(I)用α-CD19 synNotch Gal4VP64受体和控制IL-10IRES mCherry表达的5xGal4应答元件转导的CD4原代人T细胞的与图104E相当的数据。
图99.synNotch受体可驱动T细胞分化对抗肿瘤Th1命运的抗原依赖性偏向。
(A)天然T细胞分化：当通过抗原呈递细胞上的MHC分子呈递的病原体衍生肽的接合激活CD4+T细胞时，它们根据感染分化成特定的T细胞亚型。Th1和Th2为驱动不同免疫应答的典型的CD4+T细胞命运。Th1细胞表达转录因子Tbet，产生IFNγ，并且有助于细胞免疫性和肿瘤清除。Th2细胞产生IL-4，一种对于由B细胞进行的抗体产生的刺激重要的细胞因子。(B)SynNotch驱动的T细胞分化：将CD4+α-CD19 synNotch T细胞工程化，以调控Tbet的表达且因此通过T细胞调控Th1命运选择。将synNotch T细胞与靶CD19+或非靶CD19-K562细胞一起共培养11天，以确定synNotch驱动的Tbet表达是否可以CD19-依赖性方式使CD4+T细胞偏向Th1命运。(C)示出在CD4+α-CD19 synNotch T细胞与CD19+K562一起24小时之后Tbet T2AEGFP的选择性表达的直方图(代表至少3个实验)。(D)与CD19+或CD19-K562一起培养11天之后，Tbet和IFNγ的细胞内染色的CD4+α-CD19 synNotch Gal4VP64 T细胞的二维点图。在染色之前将T细胞用PMA/离子霉素刺激4小时，以驱动细胞因子产生(代表至少3个实验)。(E)在所指示处理的11天后IFNγ+(Th1)T细胞的百分比(对于所有处理，n≥3；误差线＝SEM，通过学生t检验确定显著性，n.s.p>0.05)。
图105.与图99A-99E相关的补充数据。
(A)来自图99C的重复数据的量化。将具有控制Tbet T2A GFP表达的α-CD19synNotch Gal4VP64受体应答元件的CD4+T细胞与CD19+或CD19-K562共培养24小时。将具有Tbet T2A GFP表达的T细胞的百分比定量，显示出Tbet仅在T细胞暴露于CD19+K562时上调(n＝3)。(B)用α-CD3/CD28 dynabeads刺激且在培养11天之后针对Th1细胞因子IFNγ进行细胞内染色的CD4 T细胞的代表性点图。IFNγ阳性门用红色框出。(C)与图B类似的在Th1分化条件(IL-12+α-IL-4)中培养11天的CD4+T细胞的代表性点图(n＝4)。(D)在转导后48小时时具有Tbet T2A mCherry的组成型过表达的CD4 T细胞的代表性直方图。(E)在培养11天后，具有Tbet T2A mCherry的组成型过表达的CD4+T细胞的针对Tbet和IFNγ的细胞内染色的代表性点图(n＝6)。双阳性Tbet和IFNγT细胞以红色框出。(F)与对照CD19-K562共培养的具有控制Tbet T2A GFP表达(组成型表达mCherry)的-α-CD19 synNotch Gal4VP64受体应答元件的CD4+T细胞的代表性显微图像。synNotch T细胞(红色细胞)不与癌细胞相缔合或上调Tbet的报告基因表达(GFP)。(G)与图F中一样的代表性显微图像，但是T细胞与CD19+T细胞共培养。synNotch T细胞(红色细胞)与CD19+K562形成装配体并且上调Tbet T2A GFP表达。由于mCherry和GFP的共表达，激活的synNotch T细胞为黄色的。
图100.SynNotch驱动的TRAIL产生-非天然治疗剂的定制T细胞递送。
(A)天然T细胞细胞毒性：CD8+细胞毒性T细胞通过它们的TCR识别感染细胞并且通过利用穿孔素在细胞中产生孔，从而允许引起程序性细胞死亡的颗粒酶的递送而直接杀死感染细胞。(B)SynNotch定制的T杀伤细胞：将CD4+T细胞用响应于表面GFP控制细胞凋亡调控子TRAIL的表达的α-GFP synNotch工程化。(C)示出在CD4+α-GFP synNotch T细胞与表面GFP+K562一起24小时之后表面TRAIL的选择性表达的直方图。(D)示出在与所指示的T细胞类型共培养24小时之后(T细胞:靶细胞比率＝1:1)通过死染色剂SYTOX蓝的摄取显示的表面GFP+K562细胞死亡的直方图。(E)由图D所示的重复数据计算得到的靶细胞存活百分比(n＝4，误差线＝SEM)。
图106.与图100A-100E相关的补充数据。
(A)将静息的CD4+和CD8+T细胞用α-CD3/CD28 dynabeads重新刺激24小时并且针对细胞表面TRAIL进行染色。没有任何一个T细胞亚型急剧上调TRAIL表达。(B)癌细胞对重组TRAIL介导的细胞凋亡的敏感性变化。HCT116结肠癌具有TRAIL结合的死亡受体并且对于低水平TRAIL处理是敏感的。K562表达TRAIL的死亡受体，但是对于TRAIL处理不敏感。(C)将表面GFP-或GFP+K562或HCT116癌细胞用0至200ng/mL的重组TRAIL处理24小时并且通过用死染色剂SYTOX蓝染色，通过流式细胞术监测死亡(n＝4)。(D)针对TRAIL结合的死亡受体4(DR4)染色的K562的直方图。K562表达对TRAIL介导的细胞凋亡具有抗性的受体。(E)用LaG17α-GFP纳米抗体synNotch Gal4VP64和控制亮氨酸拉链TRAIL(LZ-TRAIL左图)或全长表面TRAIL(右图)的表达的5xGal4应答元件转导的CD4+T细胞的代表性点图。在下面示出双阳性T细胞和对照未转导T细胞的TRAIL的mCherry报告基因的表达水平。(F)将用LaG17α-GFP纳米抗体synNotch Gal4VP64和控制LZ-TRAIL表达的5xGal4应答元件转导的CD4+T细胞与表面GFP-或GFP+K562共培养24小时，以确定LZ-TRAIL是否仅响应于GFP+K562而分泌。(G)示出与表面GFP＝或GFP+K562共培养的图106E所示的分选的synNotch CD4LZ-TRAIL T细胞中的TRAIL产生的mCherry报告基因水平的直方图。报告基因仅响应于表面GFP+K562被激活。(H)来自与表面GFP-或GFP+K562共培养24小时的分选的synNotch CD4 LZ-TRAIL T细胞的上清液的TRAIL ELISA(n＝2)。
图101.细胞因子通过synNotch受体工程化T细胞在实体肿瘤中的体内局部表达。
(A)分别在NSG小鼠的左侧肋腹部和右侧肋腹部皮下注射CD19-非靶K562和靶CD19+。在肿瘤建立后将控制IL-2iRES mCherry表达的α-CD19 synNotch T细胞注射到小鼠中，并且在指示的时间点收获肿瘤以确定synNotch T细胞是否已经浸润肿瘤以及是否诱导了IL-2和mCherry报告基因的表达。(B)i.v.注射的肿瘤浸润的CD4+和CD8+synNotch T细胞中IL-2IRES mCherry报告基因水平的直方图，示出mCherry报告基因在靶CD19+肿瘤中的选择性表达(数据代表3只重复小鼠)。(C)由图B所示的重复数据得到的诱导IL-2的mCherry报告基因的表达的肿瘤浸润的T细胞的百分比的量化(n＝3，通过学生t检验确定显著性，**p<0.01)。
图107.与图101A-101C相关的补充数据。
(A)用α-CD19 synNotch Gal4VP64受体(myc标记的)和控制IL-2IRES mCherry的表达的5xGal4应答元件转导的CD4+(左图)和CD8+(右图)原代人T细胞的二维点图。应答元件载体还包含驱动BFP的组成型表达的PGK启动子，以鉴定具有插入的应答元件的T细胞。将右上方阴影框中的T细胞分选并且用于所有的体内和体外实验。(B)用CD19-或CD19+K562体外刺激的控制IL-2表达的CD4+和CD8+synNotch T细胞的代表性直方图。IL-2IRES mCherry表达仅在CD19的存在下发生。(C)由图107B所示的重复数据得到的诱导IL-2表达的mCherry报告基因的表达的CD4+和CD8+T细胞的百分比的量化(n＝3，通过学生t检验确定显著性，***p<0.001且****p<0.0001)。(D)肿瘤内注射的肿瘤浸润的CD4+和CD8+synNotch T细胞中IL-2IRES mCherry报告基因水平的直方图，示出mCherry报告基因在靶CD19+肿瘤中的选择性表达(数据代表3只重复小鼠)。示出了肿瘤内注射实验的方案。结果类似于对于i.v.注射的T细胞和体外刺激的T细胞所观察到的结果。(E)在i.v.和肿瘤内注射之后浸润了CD19-和CD19+肿瘤的CD4+和CD8+T细胞的百分比(n＝3，误差线＝SEM，通过学生t检验确定显著性，n.s.p>0.05)。
图102.SynNotch受体是允许T细胞监测和选择性地调节它们的微环境的万能调控子。
(A)synNotch受体为T细胞应答的万能调控子：synNotch受体可在原代人T细胞中驱动各种不同的行为。synNotch受体可驱动定制细胞因子产生谱，有效地递送非天然治疗剂，并且控制T细胞分化，全部均以抗原依赖性且不依赖T细胞活化的方式。(B)synNotch足以在体内靶向T细胞以局部产生治疗有效载荷。
实施例5：集成了合成Notch和嵌合抗原受体信号传导以检测组合抗原签名(Antigen Signature)的治疗性T细胞的精确肿瘤识别
材料和方法
除非另外指明，否则以下材料和方法适用于实施例5中所述的结果。
synNotch受体和应答元件构建体设计
通过将CD19 scFv、LaG17(较低亲和力)或LaG16_2(高亲和力)纳米抗体与小鼠Notch1(NM_008714)最小调控区(Ile1427至Arg1752)和Gal4VP64或TetR VP64(tTa)融合来构建synNotch受体。所有synNotch受体均包含用于膜靶向的n末端CD8α信号肽(MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO:129))和用于利用α-myc A647(cell-signaling#2233)容易测定表面表达的myc标记(EQKLISEEDL(SEQ ID NO:75))。将受体克隆到包含用于所有原代T细胞实验的PGK启动子的经修饰的pHR’SIN:CSW载体中。pHR’SIN:CSW载体还经修饰以制备应答元件质粒。将Gal4 DNA结合结构域靶序列(GGAGCACTGTCCTCCGAACG(SEQ IDNO:130))的五个拷贝克隆到最小CMV启动子的5’。还包括在此应答元件质粒中的是组成型地驱动mCherry表达的PGK启动子，因此可容易地辨别经转导的T细胞。对于所有诱导型CAR载体，用GFP在CAR的c末端标记，并且通过Gal4应答元件3’的多克隆位点中的BamHI位点克隆。通过In-Fusion克隆(Clontech#ST0345))克隆所有构建体。
原代人T细胞分离和培养
在通过负选择(STEMCELL Technologies#15062&15063)进行单采血液成分术之后，从匿名供体血液中分离原代CD4+和CD8+T细胞。血液获自太平洋血液中心(SanFrancisco,CA)，得到大学伦理审查委员会的批准。将T细胞冷冻保存在具有20％人AB血清(Valley Biomedical Inc.,#HP1022)和10％ DMSO的RPMI-1640(UCSF细胞培养核心)中。融化后，将T细胞在由X-VIVO 15(Lonza#04-418Q)、5％人AB血清和10mM中性N-乙酰基L-半胱氨酸(Sigma-Aldrich#A9165)组成的补充有30单位/mL IL-2(NCI BRB临床前储藏所)的用于所有实验的人T细胞培养基中培养。
人T细胞的慢病毒转导
通过使用Fugene HD(Promega#E2312)，利用pHR’SIN:CSW转基因表达载体和病毒包装质粒pCMVdR8.91和pMD2.G转染Lenti-X293T细胞(Clonetech#11131D)产生泛嗜性VSV-G假型慢病毒。同一天将原代T细胞融化，并且在培养24小时之后，利用Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(Life Technologies#11131D)以1:3的细胞:珠粒比对其进行刺激。在48小时时，收获病毒上清液并且将原代T细胞暴露于病毒24小时。在T细胞刺激后第4天，移除Dynabeads并且T细胞扩增，直到第9天，当它们静息并且可用于测定时。利用FACs ARIAII分选T细胞以用于测定。
癌细胞系
所用的癌细胞系为K562骨髓性白血病细胞(ATCC#CCL-243)、Daudi B细胞成淋巴细胞(ATCC#CCL-213)以及HCT115结肠癌细胞(ATCC#CCL-247)。将K562用慢病毒转导以与Daudi肿瘤相等的水平稳定表达人CD19。通过用α-CD19 APC(Biolegend#302212)对细胞染色来测定CD19水平。还将K562转导以稳定表达表面GFP(与PDGF跨膜结构域融合的GFP)。将所有细胞系分选以用于转基因的表达。
synNotch T细胞的体外刺激
对于所有体外synNotch T细胞刺激，将2x105个T细胞与发送器细胞以1:1的比率共培养。将T细胞和发送器细胞在圆底96孔组织培养板中混合之后，将细胞在400xg下离心1min以迫使细胞相互作用并且在24小时时利用BD LSR II针对CD4+T细胞的激活标志物(例如CD69)和CD8+T细胞的靶肿瘤细胞的特异性裂解对培养物进行分析。所有流式细胞术分析在FlowJo软件(TreeStar)中执行。
Luminex MAGPIX细胞因子量化
如上所述用所指示的靶癌细胞系刺激表达α-CD19 synNotch Gal4VP64受体和控制CAR的5x Gal4应答元件的原代CD4+T细胞。在24小时时收集上清液并且利用LuminexMAGPIX(Luminex Corp.)Human Cytokine Magentic 25-plex Panel(Invitrogen ref#LHC0009M)根据制造商的方案进行分析。利用xPONENT软件(Luminex Corp.)基于标准曲线计算所有细胞因子水平。
IL-2ELISA和CD69染色
将CD4+synNotch与门T细胞如上所述用所指示的癌细胞系刺激24小时并且收获上清液。通过IL-2ELISA(eBiosciences#BMS2221HS)测定上清液中的IL-2水平。另外收集T细胞并且用α-CD69 APC(Biolegend#310910)染色以确定它们是否被激活。
synNotch与门T细胞细胞毒性的评估
将CD8+synNotch与门T细胞如上所述用表达所指示抗原的靶细胞刺激24小时。通过将培养物中存活的靶细胞的分数与利用未转导T细胞对照处理的相比较来确定靶癌细胞的特异性裂解的水平。通过活/死染色剂SYTOX蓝的摄取和靶细胞远离通常由靶细胞填充的正常的SSC/FSC区的偏移(Thermo Scientific#S34857)来监测细胞死亡。
synNotch T细胞中荧光素酶报告基因活性的体外量化
将被工程化表达α-GFP纳米抗体(LaG17)synNotch Gal4VP64受体和控制α-CD194-1BBζCAR IRES effluc表达的相应应答元件的经分选的CD4+和CD8+原代人T细胞使用GFP+或GFP-K562细胞刺激24小时(2x105个T细胞和2x105个K562)。effluc的产生使用ONE-glo荧光素酶测定系统(Promega#E6110)评估。生物发光使用FlexStation 3(MolecularDevices)测量。
synNotch T细胞的体内荧光素酶成像
利用UCSF临床前治疗核心按照UCSF研究所动物照管与使用委员会批准的方案进行动物研究。在T细胞注射之前10天，向NOD scidγ(NSG)小鼠(雌性，8～12周龄，JacksonLaboratory#005557)的左侧和右侧皮下注射Daudi肿瘤和表面GFP Daudi肿瘤。在肿瘤植入10天后，将被工程化表达α-GFP纳米抗体(LaG17)synNotch Gal4VP64受体和控制α-CD19 4-1BBζCAR IRES effluc表达的相应应答元件的经分选的CD4+和CD8+原代人T细胞以1:1的CD4+与CD8+T细胞比率(每种T细胞类型1x106个)i.v.注射到携带肿瘤的小鼠中。在所指示的时间点利用使用IVIS100(Xenogen)临床前成像系统执行的生物发光成像经11天监测荧光素酶表达。在150mg/kg的D-虫荧光素(Gold Technology#LUCK-100)的i.p注射之后10min获取图像。累积生物发光强度的量化在ImageJ(NIH)中定量。
synNotch与门T细胞的体内双抗原肿瘤靶向
分别在NSG小鼠的左侧肋腹部和右侧肋腹部皮下植入5x106个CD19 K562和GFP/CD19 K562肿瘤细胞。肿瘤植入四天后，将1x106个用α-GFP synNotch Gal4VP64受体和调控α-CD19 4-1BBζCAR表达的相应应答元件工程化的原代人CD4+和CD8+T细胞(共计2x106个T细胞)或未转导的T细胞i.v.注射到小鼠中。由UCSF临床前治疗核心的员工通过卡尺监测T细胞注射之后20天的肿瘤尺寸。对于卡普兰-梅尔(Kaplan-Meier)实验，使用相同的方案，但是注射单一肿瘤。当肿瘤尺寸达到安乐死的标准(2000mm3)时，认为小鼠死亡。
统计分析和曲线拟合
除非另外指明，通过学生t检验(双侧)确定统计显著性。所有统计分析和曲线拟合利用Prism 6(Graphpad)执行并且报告p值(n.s.＝p>0.05，*＝p≤0.05，**＝p≤0.01，***＝p≤0.001，****＝p≤0.0001)。所有误差线表示S.E.M.或S.D.。
结果
双抗原与门电路的设计：synNotch受体诱导CAR表达
简单的双受体与门电路的设计概括于图108D中。将T细胞工程化以基础地表达识别抗原A的synNotch受体。此外，CAR的识别抗原B的基因也将被插入细胞中，但是其将受到需要通过synNotch诱导的转录因子激活的启动子的控制(synNotch接合导致受体裂解和转录激活结构域的释放，参见实施例3)。因此，在synNotch受体被激活之前，细胞中应不存在CAR表达或活性。由于两种受体的抗原识别特性可通过交换细胞外结构域容易地改变，这种顺序受体激活电路应在设计上高度模块化。
在Jurkat T细胞中测试synNotch门控的CAR表达-对Jurkat T细胞激活的组合抗原需要
为了测试利用synNotch受体控制CAR的表达的这种方法，尝试工程化对Jurkat T细胞的激活的组合抗原控制。在这些实验中，两个模型肿瘤抗原CD19和间皮素被靶向。将Jurkat T细胞用携带细胞内四环素控制的反式激活蛋白(tTa)结构域的α-CD19 synNotch受体工程化。插入α-间皮素4-1BBζCAR基因，处于具有通过synNotch受体激活的相应四环素应答元件(TRE)的启动子的控制下(图109A和109B)。将工程化Jurkat在体外与具有CD19、间皮素或两种抗原一起的异位表达的靶K562骨髓性白血病细胞共培养(图109A)。由于这些工程化Jurkat细胞仅响应于α-CD19 synNotch刺激表达α-间皮素CAR，因此T细胞应不响应于单独的间皮素而活化。如果将T细胞暴露于CD19，那么α-间皮素CAR被表达并且T细胞被致敏以激活(图109A和109B以及图114A)。T细胞接着感测间皮素并活化。
在测试这些细胞时，确实观察到仅由表达CD19和间皮素两者的肿瘤细胞造成的激活，如通过激活标志物CD69的上调和IL-2的分泌所测量的(图109C和109D以及图114A-114B)。表达任意单一抗原的肿瘤细胞不引起激活。在双抗原刺激的情况下，观察到JurkatsynNotch与门T细胞能够响应于肿瘤细胞在6小时内上调CAR表达并且到24小时达到它们的激活峰值(图114A和114B)。T细胞激活(通过CD69监测)发生在CAR表达起始后不久，具有数小时的期望的另外延迟(图114B)。
为了进一步表征synNotch诱导的CAR表达的动力学，将synNotch T细胞暴露于致敏抗原CD19的替代品。由于α-CD19synNotch受体在其细胞外结构域上具有myc标记，因此发现也可通过将细胞暴露于α-myc抗体涂布的平板来激活受体。这种激活方法允许通过将细胞从与平板结合的抗原中移除来快速地终止synNotch激活。在用α-myc抗体刺激24小时之后，将T细胞移除并且经24小时监测α-间皮素CAR表达的衰减。到24小时时，T细胞将CAR表达完全下调至未刺激水平(表达的半衰期＝8小时)(图114C和114D)-。
人原代T细胞中SynNotch门控的CAR表达-对T细胞激活和肿瘤杀死的组合抗原控制
鉴于synNotch与门在Jurkat T细胞中的成功，测试了相同类型的synNotch驱动的CAR表达电路是否可在原代T细胞中起作用以区分多个抗原。发现不同synNotch Gal4VP64受体谱在原代T细胞中表达很好并且Gal4应答元件在原代T细胞中具有最小基础活性。这对于synNotch驱动的CAR表达与门来说是一个理想的状况，因为在T细胞感测到synNotch抗原之前应不存在活化性CAR的基础表达。
作为这种方法的原理阐述的证明，利用了用以驱动α-CD194-1BBζCAR的表达(图110A)的α-GFP纳米抗体synNotch Gal4VP64受体(识别表面表达的GFP)。选择这一模型设置的基本原理是α-CD19 CAR是免疫疗法领域中的金标准，并且其显示出有效的体内肿瘤清除。
将人原代CD4+T细胞用α-GFP纳米抗体synNotch Gal4VP64受体和控制α-CD19 4-1BBζCAR表达的相应应答元件工程化，然后暴露于仅表达CD19、仅表达GFP或表达GFP和CD19的K562靶细胞。在用表达synNotch配体GFP的细胞刺激时，CD4+T细胞仅表现出α-CD19 4-1BBζCAR的表达(图110B)。此外，这些T细胞仅在暴露于在表面上表达两种抗原GFP和CD19的靶细胞时显示出激活，如通过细胞因子产生所测定的(图110B和110C)。
包含相同双受体电路的人原代CD8+细胞也显示出与门行为，仅当GFP和CD19存在于靶细胞表面上时杀死靶标(图110D-110F)。因此，synNotch与门在人的T细胞免疫疗法所需的关键细胞类型中是有功能的。为了显示这种方法的灵活性和模块性，测试了三种其他的synNotch/CAR与门构造。全部显示出对CD4+和CD8+T细胞激活的组合抗原需要(图115A–115I)。
synNotch受体在体内驱动肿瘤定位性CAR表达
由于synNotch受体在体外在原代T细胞中可靠地门控CAR表达，测试了T细胞在体内是否可通过synNotch受体靶向肿瘤并且仅当在肿瘤微环境中时表达CAR。对于此实验，将双侧异种移植的CD19 Daudi B细胞成淋巴细胞肿瘤注射到免疫受损的NOD scid IL-2Rγ-/-(NSG)小鼠中。在左侧肋腹部中皮下注射野生型Daudi细胞(不包含synNotch配体)，同时在右侧肋腹部中注射表达表面GFP的Daudi肿瘤细胞。在使肿瘤植入10天后，注射装配有α-GFP synNotch Gal4VP64受体以及控制α-CD19 4-1BBζCAR和IRES增强的萤火虫荧光素酶(effluc)报告基因的表达的相应应答元件的原代CD4+和CD8+人T细胞(图116A和116B)。经11天的过程作为CAR表达的报告基因监测荧光素酶的表达(图111A、图116C)。到第1天时T细胞开始选择性地在GFP+Daudi肿瘤中表达CAR，并且在双抗原肿瘤中经11天的时间段持续增加CAR的局部表达(图111B和111C)。靶肿瘤中荧光素酶信号的增加可能是synNotch驱动的CAR表达和细胞在双抗原靶肿瘤中的扩增的组合(图116B)。在对照GFP-肿瘤中未观察到荧光素酶的增加。
通过synNotch门控的CAR表达实现的体内高选择性组合抗原肿瘤清除
显示出α-GFP synNotch受体可使T细胞靶向肿瘤并且控制α-CD19 CAR的局部表达。接着测试了synNotch与门T细胞是否可在体内选择性地清除双抗原肿瘤。对于这些实验，利用K562肿瘤细胞建立类似的双侧肿瘤模型(图112A以及图117A和117B)。植入肿瘤并且允许植入4天(与Daudi细胞相比，K562肿瘤生长更快速并且建立大的肿瘤)。在第4天，注射携带α-GFP synNotch→α-CD19 CAR与门电路的CD4+和CD8+T细胞，并且通过卡尺监测肿瘤生长，持续20天(图112A)。用未转导的对照T细胞处理一组小鼠以具有肿瘤生长的参考。在此实验中，直接激发T细胞以将双抗原“疾病”肿瘤与单抗原“旁观”组织区分开，所有均在同一动物体内。
synNotch与门T细胞针对同一动物中存在的两种肿瘤表现出相当高且可再现的区分作用。在所有动物中，它们选择性地清除双抗原“疾病”肿瘤(GFP/CD19+)，同时使单抗原“旁观”肿瘤(仅CD19+)保持不受干扰。这些旁观单抗原肿瘤以与用未转导的T细胞处理的阴性对照肿瘤类似的速度生长(图112B、112C、117B)。因此，存在很少“旁观”单抗原肿瘤的可检测的脱靶杀死。
建立单肿瘤实验，其中向小鼠中植入单抗原(仅CD19+)或双抗原(GFP/CD19+)K562肿瘤。接着用synNotch与门T细胞或未转导的对照T细胞处理小鼠。无论是什么肿瘤类型，用对照T细胞处理的小鼠均快速达到安乐死标准。具有用synNotch与门T细胞处理的GFP/CD19肿瘤的小鼠全部存活并且到肿瘤注射后第25天时肿瘤被完全清除(图112D)。具有用synNotch与门T细胞处理的仅CD19肿瘤的小鼠以与用未转导的T细胞处理的小鼠相同的速度达到安乐死标准，表明不存在单抗原肿瘤的脱靶杀死(图112D)。这些体内数据共同表明，synNotch门控的CAR表达是使T细胞将其活性限制于肿瘤微环境且仅响应于多个抗原激活和杀伤的有效的与门。
一个问题是与门T细胞是否可接合表达synNotch配体(GFP)的肿瘤，通过表达a-CD19 CAR变得被致敏，然后迁移到别处以接着杀死单抗原(仅CD19+)旁观组织。为了测试这一点，利用双侧肿瘤模型进行实验，并且在此情况中，使用具有仅CD19+细胞的一个肿瘤和具有仅GFP+细胞的另一个肿瘤(即两个单抗原肿瘤)(图117D)。在这些小鼠中，T细胞将可被仅GFP+肿瘤致敏，然后杀死仅CD19+肿瘤。在使用与门细胞监测CD19+肿瘤的生长时，发现其与在用阴性对照T细胞(未转导的)处理时所观察到的相同。因此，似乎没有证据证明与门T细胞的致敏和随后的别处旁观CD19+细胞的杀死。假设在这些与门T细胞中，诱导的CAR表达的衰减速率可能快于或相当于迁移出致敏肿瘤的速率，这将解释对高度局部双抗原的需要。
图108.用于T细胞中的组合抗原感测的synNotch受体
(A)CAR或肿瘤特异性TCR T细胞通常靶向单一抗原，从而通常导致脱靶组织损伤。改善的治疗性T细胞将需要多个传感器，其识别两种肿瘤抗原和组织特异性抗原的组合，从而允许细胞评估它们的环境并对何时激活做出更精确的决定。此类治疗性细胞将更好地装配，以将靶标患病组织与正常组织区分开。(B)可构建感测抗原的组合并调控T细胞信号传导和转录的新型受体，以允许做出复杂的细胞决定和更精确的治疗性T细胞应答。(C)将synNotch受体用定制细胞外配体结合结构域诸如针对感兴趣的抗原(例如肿瘤或组织特异性抗原)的scFv或纳米抗体工程化。在通过synNotch受体识别配体时，正交转录因子(例如TetRVP64或Gal4VP64)从调控定制基因电路的细胞质尾中裂解。(D)需要T细胞感测两种抗原以活化的synNotch与门电路的设计。这种与门信号传导电路以两个顺序步骤起作用：1)synNotch受体允许T细胞识别第一抗原A，以及2)T细胞表达针对第二肿瘤抗原B的CAR。如果存在A和B，那么T细胞可活化并且杀死靶肿瘤。
图109.synNotch门控的CAR表达-对Jurkat T细胞激活的组合抗原需要
(A)工程化两个受体与门电路：α-CD19 synNotch受体诱导α-间皮素CAR表达。(B)将Jurkat T细胞用α-CD19 synNotch tTa受体和控制α-间皮素CAR表达的相应应答元件工程化。Jurkat T细胞必须首先通过它们的synNotch受体识别靶肿瘤上的CD19以激励CAR表达。在T细胞通过CD19被致敏活化之后，α-间皮素CAR可接着结合间皮素并激活Jurkat细胞。T细胞激活的两种典型的标志物为CD69上调和IL-2产生。ssynNotch与门Jurkat T细胞应仅在暴露于表达CD19和间皮素两者的靶肿瘤细胞时活化。(C)与单抗原(仅间皮素)或双抗原(CD19/间皮素)K562肿瘤细胞共培养48小时的synNotch与门Jurkat T细胞中的激活标志物CD69的直方图。CD69仅在T细胞暴露于双阳性K562时被表达(代表3个独立实验)。(D)示出仅当暴露于双抗原K562时synNotch与门Jurkat的IL-2产生的IL-2ELISA(n＝3，误差线为SEM，通过学生t检验确定显著性，****＝p≤0.0001)。
图110.人原代T细胞中SynNotch门控的CAR表达-对治疗性T细胞激活和肿瘤杀死的组合抗原控制
(A)用α-GFP纳米抗体synNotch Gal4VP64受体和控制α-CD194-1BBζCAR的表达的相应应答元件将人原代CD4+和CD8+T细胞工程化。这些CD4+或CD8+synNotch与门T细胞首先必须通过它们的synNotch受体感测到表面GFP并且直到那时它们才表达α-CD19CAR并且被致敏活化。synNotch与门原代T细胞应仅在它们感测到GFP和CD19两者时激活并产生细胞因子或杀死靶细胞。(B)将图A所述的原代CD4+synNotch与门T细胞与仅CD19或表面GFP/CD19K562一起共培养。α-CD19 CAR GFP受体表达水平的直方图显示CAR仅在靶细胞的表面上存在GFP时被表达(代表至少3个独立实验)。(C)通过Luminex针对25种细胞因子的存在对来自通过仅CD19或GFP/CD19 K562激活的CD4+synNotch与门T细胞的上清液进行分析。仅当T细胞暴露于GFP/CD19 T细胞时产生细胞因子(误差线为SEM，n＝3)。(D)如图A所述将CD8+synNotch与门原代T细胞工程化。与CD4+T细胞一样，α-CD19 CAR GFP受体表达水平的直方图显示CAR仅在靶细胞的表面上存在GFP时被表达(代表至少3个独立实验)。(E)在CD8+synNotch与门原代T细胞与仅CD19或GFP/CD19肿瘤细胞共培养24小时之后的前向和侧向流式细胞术散点图。T细胞落入蓝色门内并且靶K562在红色门中。synNotch与门T细胞仅杀死GFP/CD19 K562，通过K562门中细胞的减少示出(代表3个实验)。(F)图E所示的复制性CD8+synNotch与门原代T细胞细胞毒性数据的量化。(n＝3，误差线为SEM，通过学生t检验确定显著性，*＝p≤0.05)。
图111.synNotch受体在体内驱动肿瘤定位性CAR表达
(A)将原代人CD4+和CD8+T细胞用α-GFP synNotch Gal4VP64受体和调控α-CD194-1BBζCAR IRES effluc表达的对应应答元件工程化，并且i.v.注射到在左侧肋腹部上具有Daudi肿瘤(仅CD19)且在右侧肋腹部上具有表面GFP Daudi(GFP/CD19)肿瘤的小鼠中。在工程化T细胞的i.v.注射后经11天监测荧光素酶表达。(B)在T细胞注射后第7天如图A所述处理的小鼠中的荧光素酶表达的代表性图像。只有GFP/CD19肿瘤中的荧光素酶表达高，表明了在双抗原肿瘤中的定位性CAR表达(n＝2只小鼠)。(C)左侧肋腹部Daudi肿瘤(仅CD19)和右侧肋腹部中的表面GFP Daudi肿瘤(GFP/CD19)中荧光素酶水平的累积强度的量化。在所有时间点，荧光素酶表达均富集于双抗原肿瘤中(误差为SD，n＝2)。
图112.通过synNotch门控的CAR表达实现的体内选择性组合抗原肿瘤杀死
(A)将原代人CD4+和CD8+T细胞用α-GFP synNotch Gal4VP64受体和调控α-CD194-1BBζCAR表达的对应应答元件工程化，并且i.v.注射到在左侧肋腹部上具有CD19 K562且在右侧肋腹部上具有表面GFP/CD19 K562肿瘤的小鼠中。在工程化T细胞或未转导的T细胞对照的i.v.注射后经16天监测肿瘤尺寸。(B)示出用synNotch与门T细胞(顶部)和未转导的对照T细胞(底部)处理的小鼠的CD19和GFP/CD19肿瘤体积的图。synNotch与门T细胞只靶向双抗原肿瘤并且仅CD19的肿瘤以与用未转导的对照T细胞处理的小鼠相同的速度生长(n＝5只小鼠，误差线为SEM，通过学生t检验确定显著性，**＝p≤0.01，***＝p≤0.001)。(C)用synNotch与门T细胞处理的各个小鼠的肿瘤体积测量。所有小鼠均显示出双抗原肿瘤的选择性杀死。(D)示出synNotch与门T细胞以100％的小鼠存活率清除GFP/CD19肿瘤的卡普兰-梅尔图。具有仅CD19肿瘤的小鼠未被synNotch与门T细胞清除并且具有不受控的肿瘤生长。在图D右侧给出相应的肿瘤生长曲线(n＝5只小鼠，误差线为SEM，通过学生t检验确定显著性，**＝p≤0.01)。
图113.synNotch受体控制和定位CAR T细胞应答，以用于精确的免疫疗法。
(A)将T细胞用(遗传修饰以产生)感测肿瘤抗原并上调第二抗原的CAR的表达的synNotch受体工程化。因此，这些synNotch与门T细胞仅响应于肿瘤微环境中的组合抗原识别而激活，从而防止了由单抗原识别介导的脱靶毒性。(B)与靶向单抗原的治疗性T细胞不同，synNotch与门T细胞可以可靠地将组合抗原靶标与单抗原旁观组织区分开。通过synNotch-CAR T细胞感测组合抗原可有助于使T细胞精确地靶向肿瘤，从而防止了脱靶毒性。(C)可靶向抗原空间的扩展。与肿瘤相关抗原(正常组织上表达，但是在肿瘤上更高度表达的抗原)相比，肿瘤特异性抗原极少。由于CAR完全激活T细胞导致靶组织的杀死，单CAR T细胞必须靶向肿瘤特异性抗原以便减少致命的脱靶毒性(顶部维恩图)。synNotch受体可门控CAR表达并且控制T细胞武装的地方。当靶向肿瘤特异性抗原组合时，现在可以使用针对肿瘤相关抗原的CAR受体。这应减少对身体其他部分中表达CAR抗原的组织的脱靶损伤。
图114.synNotch门控的CAR表达-对Jurkat T细胞激活的组合抗原需要。
(A)将控制与GFP融合的α-间皮素CAR的表达的α-CD19synNotch Jurkat T细胞与仅Meso或CD19和Meso+K562一起孵育48小时。α-间皮素CAR GFP水平的直方图显示，CAR仅当Jurkat暴露于CD19时被表达。(B)由图A和图2B中的直方图计算得到的归一化α-间皮素CARGFP和CD69水平的曲线图。CAR和CD69的半最大表达时间(half time for maximalexpression)分别为6小时和13小时。(C)将synNotch与门Jurkat T细胞用结合synNotch受体的细胞外结构域上的myc标记的与平板结合的α-myc抗体刺激24小时。24小时之后，将细胞从α-myc刺激中移除，并且持续24小时监测CAR表达。(D)在移除synNotch刺激之后α-间皮素CAR GFP表达的直方图。将归一化CAR作图并拟合至一相衰减，从而示出8小时的半下调时间(half-time of down regulation)。
图115.人原代T细胞中SynNotch门控的CAR表达-对治疗性T细胞激活和肿瘤杀死的组合抗原控制
(A)将CD4+原代T细胞用α-CD19 synNotch Gal4VP64受体和控制α-间皮素4-1BBζCAR EGFP表达的相应应答元件工程化。然后将T细胞与仅间皮素、仅CD19或CD19/间皮素K562共培养24小时并且测定CD69上调和IL-2产生。(B)示出如图A所述培养的CD4+synNotch原代T细胞上的α-间皮素CAR EGFP水平和CD69水平的直方图。α-间皮素CAR仅在CD19在靶K562上时被表达并且T细胞仅在CD19和间皮素两者在靶K562上时表达激活标志物CD69(代表3个实验)。(C)来自从图A所述的培养物中收获的上清液的IL-2水平。IL-2仅在T细胞暴露于表达CD19和间皮素两者的靶细胞时产生(n＝3，误差线为SEM，通过学生t检验确定显著性，***＝p≤0.001)。(D)如图A所述将CD8+原代人T细胞工程化。针对CD8+T细胞，测定了仅间皮素、仅CD19或CD19/间皮素靶K562的特异性细胞毒性。synNotch与门CD8+T细胞应仅杀死双阳性K562。(E)示出如图A所述培养的CD8+synNotch原代T细胞上的α-间皮素CAR EGFP水平的直方图。α-间皮素CAR仅在CD19在靶K562上时被表达(代表3个实验)。(F)重复性CD8+synNotch与门原代T细胞细胞毒性的量化，示出具有CD19和间皮素表达的靶K562的特异性杀死(n＝3，误差线为SEM，***＝p≤0.001)。(G)将CD4+原代T细胞用α-GFP纳米抗体synNotch Gal4VP64受体和控制α-间皮素4-1BBζCAR EGFP表达的相应应答元件工程化。然后将T细胞与仅间皮素、仅GFP或GFP/间皮素K562共培养24小时并且测定CD69上调和IL-2产生。(H)示出如图G所述培养的CD4+synNotch原代T细胞上的α-间皮素CAR EGFP水平和CD69水平的直方图。α-间皮素CAR仅在GFP在靶K562上时被表达并且T细胞仅在GFP和间皮素两者在靶K562上时表达激活标志物CD69(代表3个实验)。(I)来自从图G所述的培养物中收获的上清液的IL-2水平。IL-2仅在T细胞暴露于表达GFP和间皮素两者的靶细胞时产生(n＝3，误差线为SEM，****＝p≤0.0001)。
图116.synNotch受体在体内驱动肿瘤定位性CAR表达
(A)示出原代CD4+和CD8+T细胞中α-GFP synNotch Gal4VP64受体和调控α-CD194-1BBζCAR IRES effluc的相应应答元件的表达的代表性点图。将通过红框划出的T细胞分选并且用于体内和体外实验。(B)示出在暴露于GFP-或GFP+K562 24小时之后来自图A的synNotch与(synNotch AND)CD4+和CD8+T细胞中的荧光素酶活性的条形图。荧光素酶响应于GFP而特异性地表达(n＝3，误差线为SEM，****＝p≤0.0001)。(C)给出在图4C中分析的小鼠的肿瘤生长曲线。
图117.通过synNotch门控的CAR表达实现的体内选择性组合抗原肿瘤杀死
(A)示出原代人CD4+和CD8+T细胞中α-GFP synNotch Gal4VP64受体和调控α-CD194-1BBζCAR的相应应答元件的表达的工程化的代表性点图。将红色框出的象限内的T细胞分选并用于图112中的实验。(B)示出用于体外和体内实验的K562中的CD19(紫色)和GFP以及CD19(绿色)的表达的流式细胞术图。(C)具有用对照未转导的CD4+和CD8+T细胞处理的双侧CD19(左侧肋腹部)和GFP以及CD19(右侧肋腹部)肿瘤的各个小鼠的肿瘤生长曲线。(D)将原代人CD4+和CD8+T细胞用α-GFP synNotch Gal4VP64受体和调控α-CD19 4-1BBζCAR表达的对应应答元件工程化，并且将其i.v.注射到在左侧肋腹部上具有CD19 K562且在右侧肋腹部上具有表面GFP K562肿瘤的小鼠中，以测试T细胞是否从GFP+“致敏肿瘤”中迁移并杀死脱靶的仅CD19肿瘤。在工程化T细胞或未转导的T细胞对照的i.v.注射后经16天监测肿瘤尺寸。(E)示出用synNotch与门T细胞(实线)或未转导的对照T细胞(虚线)处理的小鼠的CD19肿瘤体积的图。CD19肿瘤未被靶向，表明不存在致敏T细胞从GFP+肿瘤中的迁移(n＝5，误差线为SEM；基于学生t检验，在任何时间点上均没有显著差异；p>0.05)。
实施例6：人CD4 T细胞中SynNotch诱导的Foxp3的表达
使用Foxp3的直接细胞内染色测量表达抗CD19 synNotch的人CD4 T细胞中的Foxp3诱导。将表达抗CD19 synNotch的CD4 T细胞用CD19+(CD19阳性)K562细胞或CD19-(CD19阴性)K562细胞刺激。当用CD19+K562细胞刺激时，Foxp3在CD19 synNotch细胞中被诱导(图118，“cN Foxp3+stim K562”)。相比较而言，当用CD19-K562细胞刺激CD19 synNotch细胞时，未观察到诱导(图118，“cN Foxp3+不相关K562”)。使用未转导细胞作为阴性对照(图118，“未转导”)。
使用CD19应答型SynNotch实现的发育过程中的调控途径的主调控子Foxp3以及调节T细胞的功能的诱导证明了调节T细胞命运的局部抗原驱动的诱导。
实施例7：通过表达抗CD19 synNotch的CD4 T细胞实现的受控的抗体产生
设计了用于人T细胞synNotch诱导的抗体分泌的抗体表达构建体。示出一般抗体构建体设计的示意图提供于图119中。在图119中，从左到右，一般构建体设计的结构域为人IgG重链单肽、Myc标记、VH结构域、CH结构域、弗林蛋白酶裂解位点、SGSG间隔子、T2A序列、人IgG轻链信号肽、HA标记、VL结构域以及CL结构域。构建体被设计用于以下抗体的synNotch诱导的分泌：派姆单抗(抗PD-1)、曲美木单抗(抗CTLA4)以及9E10(抗myc)。
用于测试synNotch诱导的抗体分泌的体外测定的一般方案提供于图120中。简而言之，用抗CD19 synNotch构建体转导CD4 T细胞，在被激活时其驱动来自引入的抗体构建体的表达(参见，例如图119)以及抗体的随后分泌。抗体构建体的表达通过抗CD19synNotch细胞内结构域(在此情况下为tTA细胞内结构域)激活。在该测定中，使此类经转导的T细胞与表达CD19的(CD19+；也称为“synNotch配体+”)K562靶细胞或未转导的(CD19-)K562靶细胞接触。将经转导的CD4 T细胞和K562靶细胞共培养24、48和72小时，之后收集培养上清液。
通过细胞表面“夹心ELISA”流式细胞术测定对抗CD19 synNotch CD T细胞分泌的抗体进行定量(参见图121)。简而言之，使表达抗体配体的细胞(“抗体配体+靶细胞”)，即在派姆单抗抗体测定的情况中的表达PD-1的细胞，经受10min的人Fc封闭。在阻断之后，加入50μl来自CD19+或CD19-靶细胞共培养的系列稀释的上清液，并且与细胞一起孵育30min。在一抗孵育之后，将细胞洗涤三次并且加入50μl的荧光缀合的二抗。在本发明的情况下，使用抗myc-AF647作为二抗并且二抗孵育进行30min。在用二抗孵育之后，将细胞洗涤三次，然后使用BD LSR II流式细胞术对其进行分析。
经修饰分泌派姆单抗的SynNotch T细胞的这一分析的结果提供于图122中。在图122中，从顶部至底部，结果与以下测试组相对应：
表1：
当用来自与表达CD19的K562细胞共培养的抗CD19 synNotch T细胞的上清液(“配体+K562上清液”)孵育时，表达PD-1的靶细胞显示出高的抗myc-AF674次级染色，其随共培养时间的增加而增加(24h、48h和72h)。相比较而言，当用来自与未转导的(CD19-)K562细胞共培养的抗CD19 synNotch T细胞的上清液(“未转导的K562上清液”)孵育时，表达PD-1的靶细胞显示出低的抗myc-AF674次级染色。
此数据证实了通过表达CD19的(CD19+)K562细胞诱导了抗CD19 synNotch T细胞表达和分泌异源派姆单抗抗体。相应地，当与未转导的K562细胞共培养时，抗CD19synNotch T细胞不被诱导分泌派姆单抗。图139提供了用替代性表达构建体UAS_Prembro_IRES_mC_pGK_tBFP修饰以分泌派姆单抗的SynNotch CD4 T细胞的类似分析的结果。图140提供了使用图138的构建体修饰以分泌派姆单抗的SynNotch E6-1 Jurkat细胞的类似分析的结果。图141提供了使用图139的替代性构建体修饰以分泌派姆单抗的SynNotch E6-1Jurkat细胞的类似分析的结果。图142和图143分别提供了用UAS_曲美木单抗_pGK_mC表达构建体修饰以分泌曲美木单抗(抗CLTA4)的SynNotch CD4 T细胞和E6-1 Jurkat细胞的类似分析的结果。图139-143中呈现的每行数据大体对应于以上在表1中呈现的组。
因此，SynNotch可用于在人CD4 T细胞中诱导异源抗体的产生，其中仅在通过相应抗原(例如，CD19)刺激SynNotch细胞时产生抗体。这样，在一个实施方案中，SynNotch系统可用于响应于特定靶抗原的识别而指导治疗性抗体的局部产生。
实施例8：具有衔接子分子的拆分SynNotch调节
拆分SynNotch信号传导系统被构建成具有结合GFP的不同表位的两种不同的抗GFP纳米抗体，其中一种纳米抗体(“LaG2”)在“锚细胞”上表达，另一种抗体(“LaG17”)作为SynNotch受体的一部分在“接收器细胞”上表达，并且GFP充当可溶性衔接子(参见图123)。将LaG17纳米抗体SynNotch受体工程化为具有tTa细胞内结构域，其在激活时诱导mCherry报告基因从TRE表达构建体中的表达。因此，在所设计的拆分SynNotch系统中，可溶性衔接子分子(即GFP)的添加仅在锚细胞的存在下在接收器细胞中诱导SynNotch信号传导。
所述拆分SynNotch系统的组分在共培养时在它们相应的细胞中表达。具体地讲，表面结合的LaG2抗GFP纳米抗体在L929细胞(即“锚细胞”)中表达，并且具有细胞外LaG17抗GFP纳米抗体和细胞内tTa的SynNotch在具有TRE/mCherry表达报告盒的“接收器细胞”中表达。作为阴性对照，将接收器细胞与不表达表面结合的LaG2(即“锚”)的L929细胞共同孵育。以系列浓度(0nM、0.1nM、1nM、10nM和1000nM)向共培养培养基中加入GFP，并且通过流式细胞术对作为接收器细胞激活的指示的mCherry表达进行定量。
仅在表达LaG2的锚细胞存在时观察到接收器细胞激活，并且mCherry表达是GFP“衔接子”剂量依赖性的(参见图124)。在0nM下，将纯化的GFP加入与表达LaG2的L929锚细胞共同孵育的接收器细胞中，接收器细胞保持“关”(即，mCherry表达和与L929阴性对照细胞共同孵育的接收器细胞的mCherry表达基本上相同，并且两个峰重叠)。在增加浓度的纯化可溶性GFP下，在与表达LaG2的L929锚细胞共同孵育的接收器细胞中观察到激活(如通过mCherry表达所指示的)(最右边的峰处于0.1nM、1nM、10nM和1000mM GFP)。即使在增大浓度的GFP的存在下，与L929阴性对照细胞共同孵育的接收器细胞也不被激活且保持“关”(最左边的峰处于0.1nM、1nM、10nM和1000mM GFP)。
因此，接收器细胞激活取决于配偶体锚细胞和足够浓度的可溶性GFP衔接子分子两者的存在。因此，接收器细胞激活可通过锚细胞的局部存在而在空间上控制，并且通过调节足够浓度的衔接子分子的存在条件性地控制。
拆分SynNotch信号传导范例用于进一步说明其中通过系统的细胞产生的可溶性衔接子调节接收器细胞激活的3细胞系统。
三细胞拆分SynNotch信号传导系统的示意图提供于图125中。简而言之,利用了上文在图123中描述的双细胞拆分SynNotch系统，然而，向系统中加入组成型地分泌GFP的第三细胞。被称为“发送器细胞”，可溶性GFP由受组成型活性E1a启动子的控制的表达盒表达。使用0.5:0.25:0.25的发送器细胞与接收器细胞与锚细胞的比率，接收器细胞与表达表面LaG2抗GFP纳米抗体的锚细胞在分泌GFP的发送器细胞的存在下的共同孵育，观察到接收器细胞的激活(如通过增加的mCherry表达所指示的)(参见图126，中图，“开”)。相比较而言，当使用相同的细胞比率，但是锚细胞替换为不表达LaG2的阴性对照L929细胞时，观察不到接收器细胞激活(参见图126，顶图，“关”)。此外，当比率改变以包含少量表达GFP的发送器细胞(发送器细胞与接收器细胞与锚细胞的比率为0.01:0.495:0.495)时，接收器细胞也不被激活(参见图126，底图，“关”)。
因此，接收器细胞激活取决于配偶体锚细胞和表达GFP的发送细胞两者的存在。因此，接收器细胞激活可通过锚细胞的局部存在而在空间上控制，并且通过调节衔接子分子表达细胞的存在条件性地控制。通过调节发送器细胞内衔接子分子的表达可获得额外水平的控制，例如通过在发送器细胞中衔接子分子的表达期间使用可调控启动子。
三细胞拆分SynNotch信号传导系统允许synNotch信号传导的多输入控制。此外，通过控制来自发送器细胞的可扩散衔接子的表达和分泌，SynNotch激活不必依赖于相邻的细胞-细胞接触并且可基于可扩散的分泌性衔接子的半径在空间上调整。
拆分SynNotch信号传导范例用于进一步说明其中通过系统的细胞产生的可溶性衔接子调节接收器细胞激活的抑制的3细胞系统。
三细胞拆分SynNotch抑制性信号传导系统的示意图提供于图127中。利用了上文在图123中描述的双拆分SynNotch系统的接收器细胞。表面表达的GFP细胞用作“发送器细胞”，其在表面表达的GFP与接收器细胞表达的SynNotch的LaG17抗GFP纳米抗体部分结合时激活“接收器细胞”。与上文类似，接收器细胞的激活可通过测量来自TRE/mCherry报告基因盒的表达来定量。被称为“抑制细胞”的该系统的第三细胞组成型地表达可溶性LaG16-LaG2抗GFP纳米抗体，其用作发送器细胞的表面表达GFP与接收器细胞的LaG17的结合的竞争性抑制剂。因此，将抑制细胞引入发送器细胞和接收器细胞的共培养物中竞争性地抑制发送器细胞与接收器细胞之间的结合，从而抑制接收器细胞的激活，这可通过减少的mCherry表达来测量。
仅发送器细胞的对照培养物，即不包含发送器或抑制剂细胞的接收器细胞的培养物，不导致接收器细胞的激活(参见图128，顶图，“关”)。在包含发送器细胞、接收器细胞和不表达竞争性抑制剂的亲代L929细胞系的阴性对照抑制细胞的共培养物中观察到接收器细胞的激活(0.25:0.25:0.5的发送器细胞与接收器细胞与阴性对照抑制细胞的比率)(参见图128，中图，“开”)。当在发送器细胞、接收器细胞和表达竞争性抑制剂的抑制剂细胞(表达sLaG16-LaG2的L929细胞)的共培养物中使用相同的细胞比率(0.25:0.25:0.5)时，观察到接收器细胞激活的抑制，如通过mCherry表达的减少所指示的(参见图128，底图，“关”)。
因此，通过由抑制剂细胞表达的可溶性竞争性抑制剂的表达抑制取决于接收器细胞的SynNotch与发送器细胞的表面GFP的结合的接收器细胞激活。因此，具有正和负信号传导的3细胞调控系统可用于控制表达SynNotch的接收器细胞的激活。因此，空间和条件性接收器细胞调节不限于正信号，并且可使用负信号以及它们的组合进行控制。
虽然已经参考其具体实施方案对本发明进行了描述，但是本领域技术人员应理解，在不脱离本发明的真正精神和范围的情况下可作出各种改变并可替换等效方案。此外，可以进行许多修改，以便使特定的情况、材料、物质组成、方法、方法步骤或步骤适应本发明的目标、精神和范围。所有此类修改旨在随附权利要求书的范围之内。

Claims (10)

1.一种嵌合多肽，其从N末端至C末端包括以下，且以共价键联：
a)包括特异性结合对的第一成员的细胞外结构域；
b)Notch受体多肽，其中所述Notch受体多肽具有50个氨基酸至1000个氨基酸的长度，并且包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及
c)细胞内结构域，
其中所述特异性结合对的所述第一成员对于所述Notch受体多肽是异源性的，并且其中所述特异性结合对的所述第一成员与所述特异性结合对的第二成员的结合在所述一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点处诱导所述Notch受体多肽的裂解，从而释放所述细胞内结构域。
2.根据权利要求1所述的嵌合多肽，其中所述Notch受体多肽具有300个氨基酸至400个氨基酸的长度。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽包括插置在所述细胞外结构域与所述Notch受体多肽之间的接头。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的嵌合多肽，其中所述细胞内结构域为转录激活蛋白。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的嵌合多肽，其中所述细胞内结构域为转录阻遏蛋白。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的嵌合多肽，其中所述细胞内结构域为位点特异性核酸酶。
7.根据权利要求6所述的嵌合多肽，其中所述位点特异性核酸酶为Cas9多肽。
8.根据权利要求1-3中任一项所述的嵌合多肽，其中所述细胞内结构域为重组酶。
9.根据权利要求1-3中任一项所述的嵌合多肽，其中所述细胞内结构域为抑制性免疫受体。
10.根据权利要求1-3中任一项所述的嵌合多肽，其中所述细胞内结构域为活化性免疫受体。
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