CN117321366A - 生物材料的保存方法和装置 - Google Patents

Abstract

一种用于保存生物材料的装置，包括：被配置成布置在外部隔热罐内的插入件，所述插入件开设有用于接收生物材料的隔室，使得在操作中，所述隔室中的生物材料被浸没在热交换流体中以与所述热交换流体进行热交换，以冷冻所述生物材料；所述装置进一步包括泵，所述泵可操作以调节热交换流体在所述隔室中的所述生物材料上的流动，所述泵可操作以在一个或多个冷却阶段对所述生物材料进行冷却。

Description

生物材料的保存方法和装置

发明领域

本发明涉及保存生物材料的方法和保存生物材料的装置。

背景

40多年来，精子低温保存(冷冻)已成功与不孕症治疗结合使用，导致成千上万的新生儿出生。在精液质量非常差的情况下，利用冷冻捐赠的精子可以提供一种受孕机制。冷冻供体精子还有一个额外的好处，即，便于患者重复使用以实现拥有同一生父的家庭，并且还可以最大限度地提高对需要这种通常有限资源的患者群体可用材料的利用效率。在许多情况下，男性在开始癌症治疗之前进行精子冷冻也可以提供保留其生育能力的唯一选择。

1953年首次报道了使用冷冻保护剂甘油冷冻精子。该程序今天继续使用，仅作了微小的修改。常规使用三种冷冻方法：a)将小瓶或吸管悬浮在液氮蒸气中[2]；b)以10℃/min的估计冷冻速率冷却或c)使用控制速率冷冻机冷冻1.5℃/分钟。这些方法之间显然存在很大差异，并且很少进行优化研究。在冷冻和随后的解冻过程中，渗透压和氧化应激、冷冻保护剂的毒性和细胞内冰晶的形成会导致损伤，从而减少解冻后正常功能的精子数量。因此，冷冻保存的效率对于最大程度地降低精子受损的风险至关重要。为了减少渗透变化和氧化应激的影响，在冷冻之前和期间添加了蛋白质和抗氧化剂以减少损伤。然而，这些方法通常只是一种补偿不充分的冷冻和解冻方案的方法。

在辅助生殖治疗(ART)的许多情况下，例如胚胎冷冻保存，只有极少数细胞被冷冻，高细胞存活率对成功结果至关重要。相比之下，通常可用于冷冻的大量精子意味着通常可以容忍较低的存活率而不会产生重大临床影响。因此，关于改善精子冷冻结果的研究很少。然而，这在精子初始数量和质量显著降低的情况下可能会产生重大影响，例如许多不育男性正在接受睾丸活检以恢复精子。与新鲜精子相比，本质上运动性降低的精子样本在冷冻时受精率较低，并且对于具有正常预冷冻特征的精子也描述了类似的现象，导致不愿使用冷冻精子进行宫腔内授精。我们自己从1000多名接受宫腔内人工授精(IUI)的年轻女性那里获得的数据与冷冻精子潜能降低的概念一致，这种情况下的妊娠率(16％)仅为自然生育率的一半。这些类型的数字通常会影响临床决策，以使用更具侵入性和昂贵的IVF技术作为一线治疗，而不是尝试IUI。

由于细胞毒性疗法的改进，在过去几十年中，长期癌症存活率显著提高。超过80％的儿童和青少年在癌症中幸存下来，因此在16-45岁的成年人中，每900名就有1名幸存者。因此，改善这一不断增长的幸存者人口的生活质量，以及包括生育在内的所有正常生活预期，是一项主要的健康优先事项。然而，细胞毒性癌症治疗的结果是卵巢卵泡的破坏导致过早绝经，因此女性的受孕窗口要么短暂存在，要么被根除。到30岁时，40％到97％的女性幸存者可能会经历不孕症，具体取决于治疗的类型和剂量以及治疗时的年龄。这通常反映在卵巢卵泡数量上。

因可能丧失生育能力而给患者带来的痛苦，以及在治疗前未提供保护生育能力的措施的严重遗憾已得到充分证明。讨论癌症治疗对生育能力的影响以及保持生育能力的潜在方法现在已成为国际护理标准。通过卵母细胞(成熟卵子)或包含未成熟原始卵泡的卵巢组织的冷冻保存(通过腹腔镜采集并冷冻以便日后移植回体内)来保存生育力的技术现在已成为儿童和妇女的成熟程序，可为他们提供在癌症存活后使用自己的遗传物质进行繁殖的选择。如果随后的移植成功，它可能会恢复内分泌功能并产生多年的成熟卵母细胞。我们小组从移植到非卵巢部位的冷冻保存的卵巢组织中收集卵母细胞后出生的双胞胎显示了成功保存原始卵泡的明确证据。据报道，全世界只有140例新生儿是将冷冻保存的卵巢组织移植回作为供体的妇女。

多年来，将红细胞(RBC)储存在体外的能力一直被认为是一种拯救生命的做法。最近，对冷藏存储的RBC在输血医学中的用途已进行了广泛的评估。在冷藏过程中，红细胞进行性地退化，输注长期存储的RBC与术后感染、住院时间和死亡率等方面的不良的临床结果相关。

关于输注存储的RBC的担忧依然存在，并且目前倾向于限制性输血策略。这引起了人们对冷冻保存的兴趣。在超低温下储存红细胞会停止细胞代谢，从而防止与不良临床结果相关的进行性细胞退化。

最初，冷冻保存似乎是使RBC长时间存活的有希望的方法。然而，这种保存方法的昂贵、费时和低效的特性阻碍了冷冻保存的RBC(通常称为“冷冻RBC”)的临床应用。

冷藏保存红细胞的要求

当前，取决于所用的保存溶液，通常将RBC在2-6℃下最多保存5至6周。另一方面，冷冻保存可以使红细胞保存数年。冷冻保存目前是用于对来自具有罕见血型的捐献者的红细胞的长期保存以及用于军事部署的有价值的方法。但是，在RBC供不应求的紧急情况或临床情况下，冷冻保存的RBC的储备也可能是有利的。使用当前方法冷冻保存的RBC的保质期长达十年。

国际指南要求冷藏的RBC储存单元中的溶血必须保持在允许水平以下(即，欧洲为0.8％，美国为1％)，并且所输注的RBC中至少有75％仍必须在输液24小时后循环。

然而，指南没有具体反映输注后红细胞的作用能力。

存储的RBC的质量

尽管在4℃下储存减慢了RBC中的生化过程，但是在这些温度下细胞代谢并未被完全抑制。在冷藏过程中，已观察到各种变化，这些变化可能会损害红细胞在输注后的作用能力。这些变化包括降低了2,3-二磷酸甘油酸(DPG)、三磷酸腺苷(ATP)和膜唾液酸含量的浓度。其他变化包括：磷脂酰丝氨酸(PS)转运到细胞表面、膜脂质和蛋白质的氧化损伤、球囊细胞的形状变化、膜起泡和钾积累、游离血红蛋白(Hb)、细胞因子、生物活性脂质以及RBC存储单元中的(促凝剂)微泡。

在冷藏过程中，红细胞的流变特性也被削弱。冷藏的RBC表现出增加的聚集和粘附于内皮细胞(EC)的趋势，并且从储存的第二周起变形能力降低。这些变化可能会妨碍RBC在微循环中正常作用的能力。

在超低温下储存RBC会停止RBC的生物学活性，从而使其能够长时间保存。通常，为了防止细胞损伤，需要高浓度的防冻添加剂或快速冷冻速率。在缓慢冷却速率下，将发生细胞外冰形成。随着冰的形成，未冷冻部分的溶质含量变得更浓。引发的渗透性失衡导致液体从RBC中移出，并发生细胞内脱水。另一方面，在快速冷却时，RBC细胞质变得过冷并发生细胞内冰形成，这随后可能导致机械损伤。

为了使冷冻损害最小化，防冻添加剂是至关重要的。多年来，已经研究了用于RBC冷冻保存的不同的非渗透性和渗透性添加剂。诸如羟乙基淀粉和聚乙烯吡咯烷酮之类的非渗透性添加剂以及各种二醇和糖类似乎很有希望，因为有人建议在输血前不需要将其从融化的RBC中去除。

相反，渗透性添加剂甘油以其在超低温下保护RBC的能力而闻名。保护RBC所需的甘油浓度取决于冷却速率和储存温度。甘油通过减缓冰形成的速度和程度来保护RBC，同时最大程度地降低冷冻过程中的细胞脱水和溶质效应。

冷冻保存的红细胞的要求

尽管在超低的零下温度保存RBC使得它们能够保存多年，一旦融化，RBC的保质期限就受到限制。脱甘油的RBC主要在盐水-腺嘌呤-葡萄糖-甘露醇(SAGM)保存液中保存长达48小时，在AS-3保存液中保存长达14天。需要对冷冻保存的RBC进行去甘油处理，以将残留的甘油含量降低到1％以下。此外，RBC受上述国际指南的约束，该国际指南要求RBC单元中的溶血必须保持在允许水平以下(例如，欧洲为0.8％，美国为1％)，并且去甘油后的RBC融化后恢复(即，冻融洗涤回收率)必须超过80％。同样，至少75％的冷冻RBC必须在输注后24小时仍然循环。

使用甘油的冷冻方法

当前，利用甘油保存RBC的冷冻方法有两种。

1.RBC可以使用低甘油方法(LGM)在液氮中快速冷冻，其中，在约为-140℃温度下，甘油的终浓度约为20％(wt/vol)。

2.RBC可以使用高甘油方法(HGM)缓慢冷冻，从而可以在-65℃至-80℃的温度下储存最终浓度约为40％(wt/vol)甘油的RBC单元。

3.使用标准的10％二甲基亚砜(DMSO)溶液可以快速冷冻红细胞。

由于在处理过程中发生的细胞损失，冷冻保存的RBC效率较低。在HGM冷冻保存的RBC中(约10-20％)，这种细胞损失更为明显，因为这些RBC需要更大量的洗涤。然而，尽管使用LGM的RBC的收率更高，但通常认为HGM冷冻保存的RBC可以承受冷冻期间温度的宽幅波动，并且在融化后的储存过程中更稳定。此外，HGM冷冻保存的RBC不需要液氮，从而简化了存储和运输条件。因此，HGM是目前在欧洲和美国最适用的RBC冷冻方法。

由于高甘油含量和储存温度范围，与冷冻保存的HGM相关的储存方法导致细胞内脱水。此外，在许多应用中，HGM方法与增加的细胞死亡有关，因为保存的细胞转变缓慢与周围物质由液态变为固态，反之亦然，导致渗透震动破坏。

相比之下，LGM最大限度地减少了溶质浓度效应，从而降低了渗透震动效应，但如果快速冷却速度不允许水有足够的时间从细胞中迁移出来，细胞内冰的形成可能会成为一个问题。

本发明的优选实施方案试图利用较低的甘油含量，从而使细胞脱水和溶质效应最小化，同时延长冷冻保存的红细胞的保质期。

其他优选的实施方案寻求减少或消除冷冻保护剂的使用同时保持细胞活力。

发明内容

虽然以上背景涉及红细胞，但应理解，本发明的实施例可应用于其他生物材料，例如干细胞(例如来自骨髓、脐带血、羊水等)、其他血液制品(例如白细胞、血浆、血小板和血清)、微生物(例如细菌和真菌)、生殖细胞和相关物质(例如精液、肿瘤细胞、初乳、疫苗和植物细胞)。

如本申请所用，“生物材料”包括以下非穷举的材料清单：血液、血浆、血小板、微生物、细菌、器官、精液、卵、初乳、皮肤、血清、疫苗、干细胞、脐带、骨骨髓，以及上面列出的其他材料。

根据本发明的第一方面，提供了一种用于保存生物材料的装置，包括被配置成布置在外部隔热罐内的插入件，所述插入件开设有用于接收生物材料的隔室，使得在操作中，所述隔室中的生物材料被浸没在热交换流体中以与所述热交换流体进行热交换，以冷冻所述生物材料。所述装置进一步包括泵，所述泵可操作以调节热交换流体在所述隔室中的所述生物材料上的流动，所述泵可操作以在一个或多个冷却阶段对所述生物材料进行冷却。

该一个或多个不同阶段可以基于生物材料的传热响应。优选地，传热响应基于生物材料的热力学模型。

所述泵的泵送能力为至少50L/min、至少60L/min、至少70L/min、至少约80L/min。附加地或替代地，所述泵的泵送能力高达约100L/min，优选高达120L/min，优选高达约150L/min。

该装置优选地进一步包括用于将传热流体从所述泵输送到隔室的管布置，所述管布置包括通向所述隔室的基本上线性的细长管部分(或直管部分)，并且具有至少大约0.2m，优选至少约0.4m，更优选至少约0.5m的长度。该线性细长管优选地紧接在隔室之前布置。细长管部分优选地具有约1英寸、约0.5英寸或最大约1.5英寸的直径。

在一优选实施例中，从所述外部隔热罐流入的热交换流体是在所述插入件的一个面处或其附近流入所述隔室的，并且从所述隔室流出的所述热交换流体是在所述插入件的该面处或其附近流出至所述外部隔热罐的。

本发明的另一个方面提供了一种保存生物材料的方法，包括：

a.基于一种或多种生物材料特性估计所述样品对渗透震动的敏感性，该一种或多种生物材料特性包括以下至少一者：细胞结构、细胞大小、膜敏感性、密度和供体年龄；

b.基于所述样品对渗透震动的估计敏感性来估计所述样品的液-固相变的开始；

c.确定所述样品的核心在预定样品表面温度下直至大约所述相变开始的平均降温速率以及所需的相应热交换流体流速，以获得预定缓慢冷却速率；

d.确定所述样品的所述核心在预定样品表面温度下从大约所述相变开始的平均降温速率以及所需的相应热交换流体流速，以获得预定快速冷却速率；

e.以所述缓慢冷却速率将先前描述的装置的所述隔室中的样品冷却至大约相变开始；以及

f.以所述快速冷却速率将所述隔室中的所述样品从大约所述相变开始冷却至最终目标温度。

该方法优选地进一步包括立即储存来自隔室的冷却样品。

优选地，根据该方法，样品不含冷冻保护剂。

本发明的另一个方面提供了一种确定在保存之前添加到生物材料中的冷冻保护剂的量的方法，包括：

a.基于一种或多种生物材料特性估计样品对渗透震动的敏感性，所述一种或多种生物材料特性包括以下至少一者：细胞结构、细胞大小、膜敏感性、密度和供体年龄；

b.基于样品对渗透震动的估计敏感性来估计样品的液-固相变的开始；

c.确定所述样品的核心在预定样品表面温度下直至大约所述相变开始的平均降温速率以及所需的相应热交换流体流速，以获得预定缓慢冷却速率；

d.确定所述样品的所述核心在预定样品表面温度下从大约所述相变开始的平均降温速率以及所需的相应热交换流体流速，以获得预定快速冷却速率；以及

e.如果在步骤(c)计算的所述热交换流体流速对应于所述装置的分别高于预定泵负荷或预定蒸发器负荷的泵负荷或蒸发器负荷，则选择比初始量多预定量的冷冻保护剂量以定义新的初始量，或者，如果在步骤(c)计算的所述热交换流体流速对应于分别等于或小于预定泵负荷或预定蒸发器负荷的泵负荷或蒸发器负荷，选择所述保护剂的初始量作为在保存之前添加到生物材料中的所述冷冻保护剂的量；以及

f.如果在步骤(c)计算的热交换流体流速对应于分别高于预定泵负荷或预定蒸发器负荷的泵负荷或蒸发器负荷，则重复步骤(a)至(d)直到在步骤(c)计算的所述热交换流体流速对应于分别等于或小于预定泵负荷或预定蒸发器负荷的泵负荷或蒸发器负荷。

优选地，根据该方法，在步骤(a)至(d)的任何重复之前冷冻保护剂的初始量为零。

缓慢冷却速率可以高达每分钟约10℃。优选地，缓慢冷却速率在每分钟约0.1℃和约10℃之间。

该快速冷却速率可以大于每分钟约100℃。快速冷却速率优选大于每分钟约200℃。

优选地，从以一致的冷却速率经历冷冻的样品的冷却曲线来估计液-固相变的开始。经历冷冻的样品的冷却曲线是从对样品的所述计算流体动力学分析中获得的。

本发明的另一个方面提供了一种对冷冻保存的生物材料进行解冻的方法，包括：

a.确定生物材料的近似几何形状的总表面积，其中，所述生物材料和任何包装构成样品；

b.估计所述样品的热性能；

c.基于一种或多种生物材料特性估计所述样品对渗透震动的敏感性，所述一种或多种生物材料特性包括以下至少一者：起始冷冻温度、细胞结构、细胞大小、膜敏感性、密度和供体年；

d.基于流动约束条件对解冻装置的所述罐内的所述样品进行计算流体动力学分析，所述流动约束条件包括以下任何一项或多项：所述样品的近似几何形状；所述样品的热性能；装置几何形状；所述样品在所述装置中的预定布置；解冻液的预定入口温度；所述解冻流体从入口到出口的预定温度降；

e.估计样品的所述固-液相变的开始；

f.将冷冻保存的生物产品解冻一段时间，直至在步骤(d)中确定的固液转变开始。

解冻流体的入口温度可以在约2℃和100℃之间，包括端值，优选约37℃。

所述固-液相变的开始是从以一致的冷却速率经历冷冻的样品的冷却曲线来估计的。

经历冷冻的所述样品的所述解冻曲线是从对所述样品的所述计算流体动力学分析中获得的。

此处描述了一种用于保存生物材料的装置，包括：被配置为布置在外部隔热罐内的插入件，该插入件开设有用于接收生物材料的隔室，其中，从所述外部隔热罐流入的热交换流体是在所述插入件的一个面处或其附近流入所述隔室的，并且从所述隔室流出的所述热交换流体是在所述插入件的该面处或其附近流出至所述外部隔热罐的。隔室包括具有一系列孔的壁以容纳连续流过该装置的热量交换流体，使得在操作中，隔室中的生物材料浸没在热交换流体中以与热交换流体进行热交换以冷冻所述生物材料。该装置进一步包括泵，该泵可操作以调节热交换流体在该隔室中的该生物材料上的流动，该泵可操作以在一个或多个冷却阶段对该生物材料进行冷却。

本申请进一步描述了一种保存生物材料的方法，包括：

a.确定生物材料样品的近似几何形状的总表面积，其中，该生物材料和任何包装构成样品；

b.估计样品的热性能；

c.基于一种或多种生物材料特性估计样品对渗透震动的敏感性，一种或多种生物材料特性包括以下至少一者：细胞结构、细胞大小、膜敏感性、密度和供体年龄；

d.基于流动约束条件对上述方面的装置的所述隔室内的样品进行计算流体动力学分析，所述流动约束条件包括以下任何一项或多项：样品的近似几何形状；样品的热性能；装置几何形状；样品在装置中的预定布置；热交换流体的预定入口温度；热交换流体从入口到出口的预定温度升高；

e.基于样品对渗透震动的估计敏感性来估计样品的液-固相变的开始；

f.确定所述样品的核心在预定样品表面温度下直至大约所述相变开始的平均降温速率以及所需的相应热交换流体流速，以获得预定缓慢冷却速率；

g.确定所述样品的所述核心在预定样品表面温度下从大约所述相变开始的平均降温速率以及所需的相应热交换流体流速，以获得预定快速冷却速率；

h.以所述缓慢冷却速率冷却上述方面的装置的所述隔室中的样品直至大约相变开始；

i.以所述快速冷却速率将所述隔室中的所述样品从大约所述相变开始冷却至最终目标温度；

j.储存样品。

本申请还描述了一种确定在保存之前添加到生物材料中的冷冻保护剂的量的方法，包括：

a.确定待保存的生物材料的近似几何形状的总表面积，该生物材料包括初始量的冷冻保护剂，其中生物产品、冷冻保护剂和任何包装构成样品；

b.估计样品的热性能；

c.基于流动约束条件对上述方面的装置的所述隔室内的样品进行计算流体动力学分析，所述流动约束条件包括以下任何一项或多项：样品的近似几何形状；样品的热性能；装置几何形状；样品在装置中的预定布置；热交换流体的预定入口温度；热交换流体从入口到出口的预定温度升高；

d.基于一种或多种生物材料特性估计样品对渗透震动的敏感性，该一种或多种生物材料特性包括以下至少一者：细胞结构、细胞大小、膜敏感性、密度和供体年龄；

e.基于样品对渗透震动的估计敏感性来估计样品的液-固相变的开始；

f.确定所述样品的核心在预定样品表面温度下直至大约所述相变开始的平均降温速率以及所需的相应热交换流体流速，以获得预定缓慢冷却速率；

g.确定所述样品的所述核心在预定样品表面温度下从大约所述相变开始的平均降温速率以及所需的相应热交换流体流速，以获得预定快速冷却速率；以及

h.如果在步骤(f)计算的所述热交换流体流速对应于所述装置的分别高于预定泵负荷或预定蒸发器负荷的泵负荷或蒸发器负荷，则选择比初始量多预定量的冷冻保护剂量以定义新的初始量，或者，如果在步骤(f)计算的所述热交换流体流速对应于分别等于或小于预定泵负荷或预定蒸发器负荷的泵负荷或蒸发器负荷，选择所述保护剂的初始量作为在保存之前添加到生物材料中的所述冷冻保护剂的量；以及

i.如果在步骤(f)计算的热交换流体流速对应于分别高于预定泵负荷或预定蒸发器负荷的泵负荷或蒸发器负荷，则重复步骤(a)至(g)直到在步骤(f)计算的所述热交换流体流速对应于分别等于或小于预定泵负荷或预定蒸发器负荷的泵负荷或蒸发器负荷。

本申请进一步描述了一种用于解冻冷冻保存的生物材料的装置，包括：解冻罐，其用于接收生物材料，所述生物材料被保持在该罐内的包括托盘、支架和篮子中的一个或多个的结构中；罐入口，其中，解冻流体经由该罐入口被引入罐中，以及罐出口，其中，解冻流体经由该罐出口从罐中移除。其中，罐被构造成容纳连续的解冻流体流过装置，使得在操作中，罐中的生物材料浸没在解冻流体中以与解冻流体进行热交换以解冻所述生物材料。

本申请还描述了一种对冷冻保存的生物材料进行解冻的方法，包括：

a.确定生物材料的近似几何形状的总表面积，其中生物材料和任何包装构成样品；

b.估计样品的热性能；

c.基于一种或多种生物材料特性估计所述样品对渗透震动的敏感性，所述一种或多种生物材料特性包括以下至少一者：起始冷冻温度、细胞结构、细胞大小、膜敏感性、密度和供体年龄；

d.基于流动约束条件对上述方面的解冻装置的所述罐内的样品进行计算流体动力学分析，所述流动约束条件包括以下任何一项或多项：样品的近似几何形状；样品的热性能；装置几何形状；样品在装置中的预定布置；解冻液的预定入口温度；解冻流体从入口到出口的预定温度降低；

e.估计样品固-液相变的开始；

f.将冷冻保存的生物产品解冻一段时间，直至在步骤(d)中确定的固液转变开始。

简要描述

现在将参考附图仅通过非限制性示例的方式描述本发明的实施例，其中：

图1A至图1C是根据一实施例的用于保存生物材料的装置的不同视图；

图2A和图2B分别是根据一实施例的用于图1的装置的罐的透视图和侧视图；

图3A是根据一实施例的装置的管道和仪表图；

图3B是图3A图中组件的PID图例；

图4A是根据一实施例的罐中的中央冷冻管的温度-时间图，在约65秒内冷冻至约-80℃；

图4B是根据一实施例的罐中的中央冷冻管的温度-时间图，在约80秒内冷冻至约-51℃；以及

图4C是根据一实施例的罐中的中央冷冻管的温度-时间图，其以与图4A的模拟相同的速率冷冻，但挡板从插入件中移除。

详细说明

以Cryogenics Holdings Pty Ltd,的名义申请的国际申请号PCT/AU2019/051279(于2020年5月28日以WO2020/102854公布)的说明书中的装置和方法的详细信息，通过引用的方式并入本申请。

图1至图3示出了根据一实施例的用于保存生物材料的装置100，其包括构造成接收插入件140的隔热罐(或浸没罐)120。插入件140开设有用于接收生物材料的隔室，其中从外部隔热罐120通过入口流入的热交换流体是在插入件140的一个面处或其附近流入隔室的。通过出口从隔室流出的热交换流体是在插入件140的所述面处或其附近流出到外部隔热罐的。

该装置包括泵180，其可操作以调节传热流体在隔室中的生物材料上的流动。特别地，泵可操作以在一个或多个不同的冷却阶段对生物材料进行冷却。一个或多个不同的阶段可以基于生物材料的传热响应。传热响应基于生物材料的热力学模型。泵180具有至少50L/min的泵送能力。在其他示例中，泵具有至少60L/min，优选至少70L/min，并且进一步优选至少约80L/min的泵送能力。附加地或替代地，泵可具有大于50L/min的泵送能力。进一步附加地或备选地，该泵可具有高达约100L/min、或高达120L/min、或高达约150L/min的泵送能力。该装置有一个高温压缩机，可以加快生物材料的温度下降时间，并允许通过隔室的温度和流量一致性更高。

装置100包括用于将传热流体从泵180输送到插入件140的管布置160。流量计联接到管布置以监测通过管布置的传热流体的流量。流量计向泵提供反馈以控制传热流体通过管布置并进入隔室的流量。为管布置提供流量调节器，用于在输送至插入件之前均匀地分布传热流体。管布置160具有两个间隔开的、平行的、基本上线性的细长入口管部分(或基本上直的入口管部分)162，其通向插入件140。入口管部分各自具有至少约0.2m的长度。在其他示例中，入口管部分可具有至少约0.4m或至少约0.5m的长度。线性细长管紧接在隔室之前布置。以这种方式，传热流体可以以基本上没有湍流或基本上没有任何压位差(pressurehead)的方式进入隔室。特别地，本设计使得从泵到隔室的管布置中的弯曲最小化，以便提供到隔室的传热流体的平稳且不间断的流动。管布置160的管部分具有大约1英寸的直径。在其他示例中，管布置的管部分具有约0.5英寸或高达约1.5英寸的直径。

插入件140包括具有一系列孔的壁以容纳流过装置的连续热交换流体，使得在操作中，隔室中的生物材料浸入热交换流体中以与热交换流体交换热量以冷冻所述生物材料。每个孔的直径或宽度在约5mm和20mm之间，优选约10mm。

插入件140包括配置成引导热交换流体沿着一个或多个特定路径流过隔室的挡板。在图示的实施例中，热交换流体被引导从与插入件的前侧相邻的入口流入，通过隔室并流出中间出口，然后返回到插入件的前侧并从出口流出。由挡板引导的特定流动路径改善了热交换流体通过隔室的循环并减少了热点。此外，在插入件140的公共面处或附近的热交换流体流入和流出的特定构造迫使流体循环通过整个隔室，流体从插入件140的相对面反弹以改善循环。

隔室被配置成接收用于保持生物材料的结构，该结构是托盘、支架和篮子中的一种或多种。该隔室包括限定多个子隔室的多个内部分隔件，每个子隔室被构造成接收所述结构中的一种。

当插入件140被布置在罐120内时，罐120的与插入件140的面相邻的一侧包括至少一个入口和至少一个出口。根据本发明的优选实施例的罐具有两个入口和一个出口。使用时，入口将外部隔热罐120的外部连通到隔室，在使用时出口将隔室连通到外部隔热罐的外部(通过排放管142)，使得在操作中，热交换流体经由所述至少一个入口被引入罐120(并由此进入隔室)并且经由所述至少一个出口从隔室和罐120移除。

罐120的侧壁与插入件140的该面间隔开，从而限定空隙(未示出)。罐120优选地由钢制成以符合ASTM A240。

在使用中，罐120填充有在-80℃以上不冻结的热交换流体。热交换流体经由管布置160以及罐120的热交换流体入口被泵入罐120中并且以预定的体积流速进入空隙中。当热交换流体被迫通过孔的受限区域时，在空隙中生成压力，从而降低体积流速但增加流体进入隔室的速度。孔和隔板改善了冷流体向隔室所有部分的分布，并最大限度地减少了热点的出现，否则热点可能会在远离入口区域的地方出现。当传热流体连续流过罐120和隔室时，热量从位于隔室内的生物材料中被带走，并且离开隔室和罐120的被加热的热交换流体随后将与装置的制冷系统交换，该装置的制冷系统连续冷却热交换流体。热交换流体本身与制冷系统中的制冷剂进行热交换。

图3A是根据一实施例连续冷却热交换流体的装置100的制冷系统的管道和仪表图。制冷系统包括用于在传热流体和制冷剂之间交换热量的热交换器。热交换器包括钎焊板式热交换器和盘管式热交换器。制冷系统包括以下PID图例中列出的组件。

两相冷却保存方法

发明人已经发现，通过增加特定冷冻阶段的冷却速率，生物产品可以在冷冻保护剂水平降低的情况下，并且在一些甚至不使用冷冻保护剂的情况下，进行保存。具体地，本保存方法实施两相冷却，缓慢冷却直至大约液-固相变开始，然后从大约液-固相变开始快速冷却。成核开始于相变的开始，并且继续进入固体冻结阶段。发明人已经发现，减少成核的持续时间从而减少样品中的冰晶形成产生类似于液氮冷冻的快速冷冻效果，但与常规液氮方法相比具有减少的渗透破坏。具体而言，本方法涉及从大约液-固相变开始时增加冷却速率(即开始样品的快速冷冻)以减少生物材料成核的持续时间。在某些情况下，冷冻损伤的减少非常显著，以至于不需要冷冻保护剂。

在一实施例中，一种保存生物材料的方法包括：首先确定生物材料的近似几何形状的总表面积，其中生物材料和任何包装构成样品，估计样品的热性质，包括估计基于一种或多种生物材料特性(包括细胞结构、细胞大小、膜敏感性、密度和供体年龄)估计生物材料对渗透震动的敏感性，并通过模拟冷冻在装置2中(更具体地说，在隔室6内)的正在冷冻的样品，对样品进行计算流体动力学分析，以研究保存系统的不同输入参数的影响。可以研究的模拟的输入/约束包括包装的特性和所使用的支架系统的特性、样品的近似几何形状、样品的热特性、装置几何形状、样品在装置中的预定布置，热交换流体的预定入口温度，以及热交换流体从入口到出口的预定温度升高。

根据一实施例的计算流体动力学分析涉及将生物材料分成几何增量(例如，用于瓶子或试管的圆柱壳)。对于这些增量中的每一个，求解能量守恒方程，即对于给定的时间步长，一定量的能量从壳中移除，导致该壳的温度降低。移除的能量取决于相邻壳的温度以及壳之间的热流阻力。这涉及考虑生物材料根据温度的热特性。

假设样品可被视为起始温度为2℃且具有可使用本领域技术人员已知的方法识别、估计或计算的热性质的固体物质来进行分析。

基于产品的总表面积、罐中产品的装载体积、预选的热交换流体的入口温度、预选的可接受的热交换流体出口温度(例如3℃大于入口温度)，产品(包括冷冻保护剂)和包装的热性能以及流体通过罐的预选速度等，产品温度降低的速率可以如上详述的那样被模拟。图4A和图4B中的温度-时间图对应于中央0.5ml冷冻管的分析，该冷冻管位于隔室的中央，分别在约65秒内冷冻至约-80℃，并在约80秒内冷冻至约-51℃秒。从这两个图中，根据本发明的优选实施例，与冷冻至约-80℃的冷冻管相比，冷冻至约-51℃的冷冻管实现了更好的保存效果。该图绘制了通过冷冻管的各种壳的温度，从外部(“PG温度2.99mmPPoutside”)到核心(“PG温度0mm”)。图4C是中央冷冻管的温度-时间图，以与图8的模拟相同的速率冷冻，但挡板从插入件中移除，说明挡板在改善传热流体通过隔室的循环方面的有效性.

样品的液-固相变的开始被估计。在一实施例中，液-固相变的开始是从以一致的冷却速率经历冷冻的材料样品的一个或多个测试结果获得的冷却曲线并且基于生物材料对渗透震动的估计敏感性来进行估计的。液-固相变的开始可以额外地或备选地从经由上述计算流体动力学分析获得的样品的冷却曲线来确定/确认。

对于预定的缓慢冷却速率，确定样品核心在预定样品表面温度直至大约相变开始的平均温度降低速率(从计算流体动力学模型)。然后可以确定进入浸没槽的实现缓慢冷却速率所需的热交换流体流速。

实现预定快速冷却速率所需的热交换流体流速类似地通过分析从大约相变开始时在预定样品表面温度下样品核心的平均降温速率来确定。

一旦分析完成，样品然后可以如上所述在装置100的隔室中冷却，首先以缓慢冷却速率冷却直到大约相变开始，然后从大约相变开始以快速冷却速率进行冷却。样品以每分钟至少约100℃的速度冷却，直到达到预定的最终温度。

为了实现快速冷却所需的热交换流体流速，增加装置100的泵的泵负荷，该泵将热交换流体输入到罐120中。

设想在一些实施例中，上述方法可用于在不使用任何冷冻保护剂的情况下有效地保存生物材料。

保存过程所需冷冻保护剂用量的确定方法

在某些情况下，可能需要冷冻保护剂以尽量减少保存过程中的细胞损伤。因此，另一方面，提供了一种确定在保存之前添加到生物材料中的冷冻保护剂的量的方法。该方法包括首先确定要保存的生物材料(包括初始量的冷冻保护剂)的近似几何形状的总表面积，其中生物材料、冷冻保护剂和任何包装构成样品，估计样品的热特性和对装置内(更具体地说，在隔室6内)的样品进行计算流体动力学分析，以研究保存系统的不同输入参数的影响。可以研究的模拟的输入/约束包括包装的特性和所使用的支架系统的特性、样品的近似几何形状、样品的热特性、装置几何形状、样品在容器中的预定布置装置、热交换流体的预定入口温度以及热交换流体从入口到出口的预定温度升高。

该方法进一步包括基于一种或多种生物材料特性估计样品对渗透震动的敏感性，该一种或多种生物材料特性包括以下至少一者：细胞结构、细胞大小、膜敏感性、密度和供体年龄。

样品的液-固相变的开始是估计的。在一实施例中，液-固相变的开始是从以一致的冷却速率经历冷冻的材料样品的一个或多个测试结果获得的冷却曲线中估计的。液-固相变的开始可以额外地或备选地从经由上述计算流体动力学分析获得的样品的冷却曲线来确定/确认。在一优选的实施方案中，根据估计的生物材料对渗透震动的敏感性来估计开始。

对于预定的缓慢冷却速率，确定样品核心在预定样品表面温度直至约相变开始的平均温度降低速率(根据上述计算流体动力学模型)。然后可以确定实现缓慢冷却速率所需的进入浸没槽2的热交换流体流速。

实现预定快速冷却速率所需的热交换流体流速类似地通过分析从大约相变开始时在预定样品表面温度下样品核心的平均降温速率来确定。如果在该步骤计算的热交换流体流速对应于装置的分别高于预定泵负荷或预定蒸发器负荷的泵负荷或蒸发器负荷，则多于该初始量的预定量作为冷冻保护剂的量被选来定义新初始量。另一方面，如果在该步骤计算的热交换流体流速对应于分别等于或小于预定泵负荷或预定蒸发器负荷的泵负荷或蒸发器负荷(即，热交换流体流速从实际的角度来看是可以接受的，例如，如果根据选定温度下的热交换流体的粘度，泵的负荷是可以接受，或者，如果基于所需的除热量，蒸发器负荷是可接受的)，则选择冷冻保护剂的初始量作为保存前添加到生物材料中的冷冻保护剂的量。

如果计算出的热交换流体流速对应于分别高于预定泵负荷或预定蒸发器负荷的泵负荷或蒸发器负荷，则重复该方法步骤直到计算出的热交换流体流速对应于泵负荷或蒸发器负荷，该泵复核或蒸发器负荷分别等于或小于预定泵负荷或预定蒸发器负荷。

在一实施例中，冷冻保护剂的初始量为零。如果要重复计算步骤，则可以定期增加比初始量多的冷冻保护剂的预定量，例如每次重复增加1％。

一旦使用上述方法确定了适当量的冷冻保护剂，然后可以使用计算出的冷冻保护剂量制备生物材料的样品以使用如上所述的装置10进行保存。

预定的缓慢和/或快速冷却速率可以基于常规方案或基于对生物材料的特定样品进行的试验或分析来识别。在一实施例中，缓慢冷却速率高达每分钟约10℃。缓慢冷却速率可以在每分钟约0.1℃和约10℃之间。

在一实施例中，快速冷却速率大于每分钟约100℃。快速冷却速率可以大于每分钟约200℃。

生物制品渗透震动敏感性测定方法

渗透震动或渗透胁迫是由细胞周围溶质浓度突然变化引起的生理功能障碍，这会导致水穿过细胞膜的运动发生快速变化。在上清液中盐、底物或任何溶质浓度较高的条件下，水会通过渗透作用从细胞中抽出。这也抑制了底物和辅因子进入细胞的运输，从而“冲击”细胞。或者，在低浓度溶质下，大量水进入细胞，导致细胞膨胀并破裂或发生细胞凋亡。

所有生物体都有对渗透震动做出反应的机制，传感器和信号转导网络向细胞提供有关其周围环境渗透压的信息；这些信号会激活应对极端条件的反应。尽管单细胞生物更容易受到渗透震动的影响，因为它们直接暴露在环境中，但哺乳动物的细胞在某些条件下仍会承受这些压力。

所有生物都有不同的细胞结构。包括细胞大小、膜敏感性、生物体年龄和细胞密度在内的参数会影响生物体对渗透压的敏感性。

本领域技术人员将理解以上参数。基于上述分析，所有生物体都可以绘制在灵敏度等级上。

包括温度和冷冻保护剂在内的保存参数会受到生物体渗透敏感性的影响。上述分析将告知泵负荷和加工温度参数。

高渗透敏感性需要将加工温度提高到-50c以上。

低渗透敏感性需要将加工温度降低到-50c或以下。

高渗透敏感性需要增加泵负荷以实现与较低温度比较相同的传热速率。

解冻装置和方法

在一实施例中，一种对冷冻保存的生物材料进行解冻的方法，包括首先确定生物材料的近似几何形状的总表面积，其中生物材料和任何包装构成样品，估计样品的热性质并进行计算通过模拟在解冻罐内解冻的样品对样品进行流体动力学分析，以研究解冻系统不同输入参数的影响。可以研究的模拟的输入/约束包括包装的特性和所使用的货架系统的特性，样品的近似几何形状；样品的热性能；装置几何学；样品在装置中的预定布置；解冻液的预定入口温度；解冻流体从入口到出口的温度的预定降低。

该方法进一步包括基于一种或多种生物材料特性估计样品对渗透震动的敏感性，该一种或多种生物材料特性包括以下至少一者：起始冷冻温度、细胞结构、细胞大小、膜敏感性、密度和供体年龄。

样品的固-液相变的开始是估计的。在一实施例中，固-液相变的开始是从冷却曲线估计的，该冷却曲线是从以一致的冷却速率经历冷冻的材料样品的一个或多个测试结果获得的。固-液相变的开始可以额外地或备选地从经由上述计算流体动力学分析获得的样品的解冻曲线来确定/确认。在一优选的实施方案中，固-液相变的开始是基于样品对渗透震动的估计敏感性来估计的。

然后将样品解冻一段时间，直至开始固液转变。已经发现，将冷冻样品解冻直至转变开始会增加细胞活力。解冻后，样品保持在约2℃的温度。

在一些实施例中，解冻流体是在37℃的温度下输入的水。

虽然上面已经描述了本发明的各种实施例，但是应该理解它们只是以示例的方式呈现的，而不是以限制的方式呈现的。对于相关领域的技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对其中的形式和细节进行各种改变。因此，本发明不应受限于上述示例性实施例中的任一个。

本说明书中对任何先前出版物(或从中得出的信息)或任何已知事项的引用不是，也不应被视为认可或承认或任何形式的暗示该先前出版物(或信息从它派生)或已知物质构成本说明书相关的行业领域的一般公共知识是一部分。

贯穿本说明书和随后的权利要求，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”以及诸如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”的变体将被理解为暗示包括规定的整数或步骤或一组整数组或步骤，但不排除任何其他整数或步骤或一组整数或步骤。

Claims (24)

1.一种用于保存生物材料的装置，包括

被配置成布置在外部隔热罐内的插入件，所述插入件开设有用于接收生物材料的隔室，使得在操作中，所述隔室中的生物材料被浸没在热交换流体中以与所述热交换流体进行热交换，以冷冻所述生物材料；

所述装置进一步包括泵，所述泵可操作以调节热交换流体在所述隔室中的所述生物材料上的流动，所述泵可操作以在一个或多个冷却阶段对所述生物材料进行冷却。

2.如权利要求1所述的装置，其中，所述泵的泵送能力为至少50L/min、至少60L/min、至少70L/min、至少约80L/min，和/或优选高达约100L/min，优选高达120L/min，优选高达约150L/min。

3.如权利要求1或2所述的装置，进一步包括用于将所述传热流体从所述泵输送到隔室的管布置，所述管布置包括通向所述隔室的基本上线性的细长管部分，并且具有至少大约0.2m，优选至少约0.4m，更优选至少约0.5m的长度。

4.如权利要求3所述的装置，其中，所述细长管部分具有约1英寸、约0.5英寸或最大约1.5英寸的直径。

5.如权利要求1所述的装置，其中，

从所述外部隔热罐流入的热交换流体是在所述插入件的一个面处或其附近流入所述隔室的，并且

从所述隔室流出的所述热交换流体是在所述插入件的该面处或其附近流出至所述外部隔热罐的。

6.如权利要求1所述的装置，其中，所述插入件包括挡板，所述挡板配置成引导所述热交换流体沿着一个或多个特定路径流过所述隔室。

7.如权利要求1至6中任一项所述的装置，包括可容纳在所述隔室中用于保持所述生物材料的结构，其中所述结构是托盘、支架和篮子中的一种或多种。

8.如权利要求7所述的装置，其中，所述隔室包括限定若干子隔室的若干内部分隔件，每个子隔室被配置成接收所述结构中的一者。

9.如前述权利要求中任一项所述的装置，其中，所述外部隔热罐包括：一个侧面，当所述插入件布置在所述外部隔热罐内时，所述侧面与所述插入件的所述面相邻；所述侧面包括至少一个入口和至少一个出口，所述入口在使用时将所述外部隔热罐的外部连通到所述隔室内，并且所述出口在使用时将所述隔室连通到所述外部隔热罐的外部；

其中，在运行中，所述热交换流体通过所述至少一个入口被引入所述罐，并通过所述至少一个出口从所述罐中移除。

10.一种保存生物材料的方法，包括：

a.基于一种或多种生物材料特性估计所述样品对渗透震动的敏感性，该一种或多种生物材料特性包括以下至少一者：细胞结构、细胞大小、膜敏感性、密度和供体年龄；

b.基于所述样品对渗透震动的估计敏感性来估计所述样品的液-固相变的开始；

c.确定所述样品的核心在预定样品表面温度下直至大约所述相变开始的平均降温速率以及所需的相应热交换流体流速，以获得预定缓慢冷却速率；

d.确定所述样品的所述核心在预定样品表面温度下从大约所述相变开始的平均降温速率以及所需的相应热交换流体流速，以获得预定快速冷却速率；

e.以所述缓慢冷却速率将如权利要求1至9中任一项所述的装置的所述隔室中的样品冷却直至大约所述相变开始；以及

f.以所述快速冷却速率将所述隔室中的所述样品从大约所述相变开始冷却至最终目标温度。

11.如权利要求10所述的方法，进一步包括立即储存来自所述隔室的冷却样品。

12.如权利要求10或11所述的方法，其中，所述样品不含冷冻保护剂。

13.一种确定在保存之前添加到生物材料中的冷冻保护剂的量的方法，包括：

a.基于一种或多种生物材料特性估计样品对渗透震动的敏感性，所述一种或多种生物材料特性包括以下至少一者：细胞结构、细胞大小、膜敏感性、密度和供体年龄；

b.基于样品对渗透震动的估计敏感性来估计样品的液-固相变的开始；

c.确定所述样品的所述核心在预定样品表面温度下直至大约相变开始的平均降温速率以及所需的相应热交换流体流速，以获得预定缓慢冷却速率；

d.确定所述样品的所述核心在预定样品表面温度下从大约所述相变开始的平均降温速率以及所需的相应热交换流体流速，以获得预定快速冷却速率；以及

e.如果在步骤(c)计算的所述热交换流体流速对应于所述装置的分别高于预定泵负荷或预定蒸发器负荷的泵负荷或蒸发器负荷，则选择比初始量多预定量的冷冻保护剂量以定义新的初始量，或者，如果在步骤(c)计算的所述热交换流体流速对应于分别等于或小于预定泵负荷或预定蒸发器负荷的泵负荷或蒸发器负荷，选择所述保护剂的初始量作为在保存之前添加到生物材料中的所述冷冻保护剂的量；以及

f.如果在步骤(c)计算的热交换流体流速对应于分别高于所述预定泵负荷或所述预定蒸发器负荷的泵负荷或蒸发器负荷，则重复步骤(a)至(d)直到在步骤(c)计算的所述热交换流体流速对应于分别等于或小于预定泵负荷或预定蒸发器负荷的泵负荷或蒸发器负荷。

14.如权利要求13所述的方法，其中在步骤(a)至(d)的任何重复之前冷冻保护剂的初始量为零。

15.如权利要求10至14中任一项所述的方法，其中，所述缓慢冷却速率高达每分钟约10℃。

16.如权利要求10至15中任一项所述的方法，其中，所述缓慢冷却速率在每分钟约0.1℃至约10℃之间。

17.如权利要求10至16中任一项所述的方法，其中，所述快速冷却速率大于约100℃/分钟。

18.如权利要求10至17中任一项所述的方法，其中，所述快速冷却速率大于约200℃/分钟。

19.如权利要求10至18中任一项所述的方法，其中，从以一致的冷却速率经历冷冻的样品的冷却曲线来估计液-固相变的开始。

20.如权利要求19所述的方法，其中，经历冷冻的样品的冷却曲线是从对样品的所述计算流体动力学分析中获得的。

21.一种对冷冻保存的生物材料进行解冻的方法，包括：

a.确定生物材料的近似几何形状的总表面积，其中，所述生物材料和任何包装构成样品；

b.估计所述样品的热性能；

c.基于一种或多种生物材料特性估计所述样品对渗透震动的敏感性，所述一种或多种生物材料特性包括以下至少一者：起始冷冻温度、细胞结构、细胞大小、膜敏感性、密度和供体年龄；

d.基于流动约束条件对解冻装置的所述罐内的所述样品进行计算流体动力学分析，所述流动约束条件包括以下任何一项或多项：所述样品的近似几何形状；所述样品的热性能；装置几何形状；所述样品在所述装置中的预定布置；解冻液的预定入口温度；所述解冻流体从入口到出口的预定温度降低；

e.估计样品的所述固-液相变的开始；

f.将冷冻保存的生物产品解冻一段时间，直至在步骤(d)中确定的固液转变开始。

22.如权利要求21所述的方法，其中，所述解冻流体的入口温度在约2℃和100℃之间，包括端值，优选约37℃。

23.如权利要求21或22所述的方法，其中，所述固-液相变的开始是从以一致的冷却速率经历冷冻的样品的冷却曲线来估计的。

24.如权利要求23所述的方法，其中，经历冷冻的所述样品的所述解冻曲线是从对所述样品的所述计算流体动力学分析中获得的。