CN116676274B - 可自失活噬菌体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了可自失活噬菌体及其制备方法和应用。Bacillus cereus bacteriophageΔTail DK1，保藏编号为：GDMCC No：62951‑B1。其可制备适用于食品工业、养殖业防控污染菌与致病菌污染及临床上治疗病原菌感染的噬菌体制剂。所述制备方法基于噬菌体进行识别裂解宿主不依赖于基因组中尾部蛋白编码基因，敲除噬菌体基因组中的尾部蛋白编码基因，在噬菌体生产过程中使用质粒辅助尾部蛋白编码基因表达的宿主作为第一次感染子代生产者，实现该噬菌体制剂第一次感染后子代的活性保证。在实际应用中，因杀灭对象不携带尾部基因编码质粒，感染后因缺失尾部蛋白编码而无法合成活性子代，实现噬菌体自我失活。
Description
技术领域：
本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种制备在食品工业、养殖业和临床上使用的可自失活噬菌体及其制备方法和应用。
背景技术
噬菌体作为细菌的病毒，具有高度特异性，可有效避免常规灭菌方法如物理或化学等手段，对非致病菌或益生菌的杀灭。目前，噬菌体防控技术逐步成熟，已应用的领域包括食品安全，畜牧养殖和临床治疗等。同时，基于基因工程手段进行人工改造的噬菌体，也在临床中证实具有卓越的抗菌性能，有效治愈了多重耐药分枝杆菌感染患者，因此，噬菌体制剂有望替代抗菌药物成为新的抗菌手段。
为有效应对外界条件对噬菌体抗菌活性的干扰，在噬菌体制剂生产制备过程中，通常选择具有良好的稳定性的噬菌体；但是，由于噬菌体遗传多样性丰富，大量噬菌体编码基因缺乏足够的实验证据或与已知功能蛋白不具有同源性，导致噬菌体编码基因中约一半至三分之二为未知功能的基因，携带大量未知基因的噬菌体在人体和环境中长期使用并保持活性具有风险性。同时，由于噬菌体是活的病毒，可在抗菌的过程发生繁殖，产生活的子代噬菌体，这导致噬菌体容易在应用环境发生长时间的持留，目前已知在农业和食品环境中，活性噬菌体可以持留超过4个月时间。大剂量噬菌体的使用及长时间的持留特性，可引发的问题包括：1、促进噬菌体耐受菌的出现，影响噬菌体长期使用效果；2、污染生产环境和检验部门实验室，可导致食品领域或临床上感染后的微生物检测出现假阴性结果。更为重要的是，环境中大量存在条件性致病菌，如蜡样芽胞杆菌，可在食品产业中造成污染，在临床上引发疾病；但是，非致病性的蜡样芽胞杆菌可以作为环境重金属治理菌或种植业中植物促生长菌使用。因此，需要发展更可控的噬菌体抗菌手段，能够保证噬菌体使用后的自失活，减少噬菌体使用后对环境中非致病性细菌的影响，保障噬菌体在食品安全、畜牧养殖和临床治疗中抗菌功能的同时，也避免影响功能化细菌在环境中使用。因此，在噬菌体制剂完成细菌杀灭后，如何高效清除应用场景中的活性噬菌体是亟待解决的问题。
基于生物合成学和分子遗传学，构建编码尾部蛋白结构基因缺陷的噬菌体，在噬菌体制备时，通过质粒在宿主表达尾部基因的蛋白，使噬菌体在蛋白水平组装成完整的噬菌体结构，保障噬菌体制剂的抗菌活性；在实际发挥抗菌功能时，由于杀灭对象不携带编码尾部蛋白结构基因的质粒，从而无法合成活性的噬菌体子代，终止噬菌体在环境中持续传播能力，为进一步实现噬菌体安全、高效应用奠定基础。
发明内容：
本发明的目的是提供一种保留特异性宿主裂解能力，但还具有自失活能力，避免在细菌清除完成后活性噬菌体浓度的上升的可自失活噬菌体及其制备方法和应用。
本发明的可自失活噬菌体，即Bacillus cereus bacteriophageΔTail DK1于2022年11月07日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为：GDMCC No：62951-B1，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
本发明还提供了上述Bacillus cereus bacteriophageΔTail DK1的制备方法，其是将噬菌体DK1的尾部基因敲除而获得的。
优选，将噬菌体DK1的尾部基因敲除是以亲本噬菌体DK1为对象进行体内同源重组、CRISPR-Cas基因编辑或体外基因合成等方法对噬菌体尾部结构基因进行敲除。
优选，在质粒pcrF11-erm中加入靶向DK1尾部基因的crRNA和插入在crRNA识别区进行同义突变使其无法被crRNA识别的尾部基因得到质粒pcrF11-erm-1；并将质粒pcrF11-erm-1、pXCR6-S依次直接转化至相同的宿主蜡样芽胞杆菌233-1中，得到携带两个质粒的重组宿主；
将噬菌体DK1与重组宿主混合，分别通过双层琼脂法获取单个噬菌斑，其中，琼脂中需要加入终浓度为3g/L的木糖，选择其中可观察到单个噬菌斑形态的平板，进行噬菌斑PCR鉴定基因敲除结果，成功获得尾部基因敲除突变株ΔTail DK，即Bacillus cereusbacteriophageΔTail DK1。
优选，所述的噬菌斑PCR鉴定是采用引物为Tail-TF1和Tail-TR1，敲除成功的ΔTail DK扩增片段长度为1,786bp，野生DK1扩增长度为4,117bp；
Tail-TF1：AGAATATTCGTATAGCTCAAACAGATAATGATGGTATTTC；
Tail-TR1：CTTACCAGTGTTATCTCCACCACAACTATTGATAG。
本发明还提供了Bacillus cereus bacteriophageΔTail DK1在清除致病菌或污染菌制剂中的应用。
优选，是在食品工业、养殖业或临床上中高效防控和清除污染菌和致病菌制剂中的应用，如蜡样芽胞杆菌。
优选，是Bacillus cereus bacteriophageΔTail DK1在细菌检测中的应用。
本发明还提供了一种抗菌剂，其含有Bacillus cereus bacteriophageΔTailDK1作为活性成分。
所述的抗菌剂可以为食品添加剂或食品生产环境消杀剂。
本发明基于噬菌体进行识别裂解宿主不依赖于基因组中尾部蛋白编码基因，敲除噬菌体基因组中的尾部蛋白编码基因，在噬菌体生产过程中使用质粒辅助尾部蛋白编码基因表达的宿主作为第一次感染子代生产者，实现该噬菌体制剂第一次感染后子代的活性保证。在实际应用中，因杀灭对象不携带尾部基因编码质粒，感染后因缺失尾部蛋白编码而无法合成活性子代，实现噬菌体自我失活。
本发明的有益效果为：
(1)本发明中所制备的噬菌体，保留特异性宿主裂解能力，就有良好的致病菌清除效果；
(2)本发明中所制备的噬菌体，具有自失活能力，避免在细菌清除完成后活性噬菌体浓度的上升；
(3)本发明中的制备方法，适用于以不同噬菌体为对象进行相同操作，以应用于食品工业、养殖业和临床上致病菌的高效清除和噬菌体制剂的自失活。
Bacillus cereus bacteriophageΔTail DK1(下称自失活噬菌体ΔTail DK)，该噬菌体于2022年11月07日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为：GDMCCNo：62951-B1。
附图说明
图1为本发明制备方法的示意图。
图2为本发明制备方法中敲除噬菌体尾部基因方法的示意图。
图3为本发明制备方法中敲除噬菌体尾部基因结果。
图4本发明中制备的噬菌体制剂裂解活性检测。
图5为本发明中制备的噬菌体制剂在细菌清除能力上的评估结果。
图6为本发明中制备的噬菌体制剂在完成细菌清除后活性检测结果。
图7为野生噬菌体和自失活噬菌体裂解细菌后释放的子代噬菌体形态的透射电子显微镜形态图。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例和附图详细说明本发明的技术方案。
本发明试验用于验证技术方案可行性的噬菌体DK1(GenBank：MK284526)由本实验室在前期工作中分离，构建的尾部基因敲除株ΔTail DK1由DK1敲除尾部基因得到，命名为Bacillus cereus bacteriophageΔTail DK1(下称自失活噬菌体ΔTail DK)，该噬菌体于2022年11月07日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为：GDMCC No：62951-B1。尾部蛋白表达所用质粒pHT304-PDK1-GFP由华中农业大学孙明教授惠赠的pHT304(也可以商业化途径购买到)经过本实验前期改造而成，改造方法为，在质粒上EcoRI和SalI间插入启动子PDK1(来源于噬菌体DK1头部蛋白上游100bp)和绿色荧光蛋白基因，具有在蜡样芽胞杆菌中表达外源蛋白的能力。本发明中所用基因敲除质粒pcrF11-erm和pXCR6-S由江南大学刘龙教授馈赠的pcrF11和pXCR6(可通过商业途径购买)，经本实验室前期改造而成，改造方法为，将质粒pHT304质粒红霉素抗性基因erm插入至pcrF11，得到具有红霉素抗性标记的质粒pcrF11-erm；质粒pXCR6质粒长度约14kb，不易转化入蜡样芽胞杆菌，前期经过冗余序列删除，保留质粒上Cas12a表达框和crRNA表达框，获得质粒长度约12kb的质粒，以实现高效转入蜡样芽胞杆菌。
本发明试验用的胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB培养基)、技术琼脂、注射器、0.22μm微孔滤膜购自环凯公司；2×PrimerSTAR购自Takara；HieffPlus Multi One StepCloning Kit购自翊圣生物，引物合成和一代测序服务由华大公司提供。
实施例1、噬菌体尾部基因的敲除
根据本发明制备方法(图1)，选择噬菌体DK1进行方法验证。根据CRISPR-Cas12a基因敲除方法(图2)，设计所需的crRNA和片段扩增引物(表1)，其中，在质粒pcrF11-erm中加入靶向DK1尾部基因的crRNA和插入在crRNA识别区进行同义突变使其无法被crRNA识别的尾部基因(表达尾部蛋白辅助噬菌体活性子代合成)，得到质粒pcrF11-erm-1；并将质粒pcrF11-erm-1、pXCR6-S依次直接转化至相同的宿主蜡样芽胞杆菌233-1中，得到携带两个质粒的重组宿主。
将滴度约108PFU/mL噬菌体DK1梯度稀释，分别与重组宿主混合，并分别通过双层琼脂法获取单个噬菌斑，其中，琼脂中需要加入终浓度为3g/L的木糖(诱导Cas12a表达已实现基因敲除)。选择其中可观察到单个噬菌斑形态的稀释度平板，进行噬菌斑PCR鉴定基因敲除结果，采用引物为Tail-TF1和Tail-TR1，敲除成功的ΔTail DK扩增片段长度为1,786bp，野生DK1扩增长度为4,117bp。经PCR鉴定，成功获得尾部基因敲除突变株ΔTail DK(图3)，将PCR产物送华大基因进行一代测序，确认结果无误，命名为Bacillus cereusbacteriophageΔTail DK1(下称自失活噬菌体ΔTail DK)，该噬菌体于2022年11月07日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为：GDMCC No：62951-B1。
表1.实验所用引物
实施例2、自失活噬菌体制备
将用于携带pcrF11-erm-1和pXCR6-S两个重组质粒的宿主菌株蜡样芽胞杆菌233-1用于制备ΔTail DK1悬液，制备方法为，取1ml宿主菌，离心去除上清，加入1mL TSB重悬，再次离心去除上清，重复2次以洗涤细菌中残留的抗生素，将洗涤后的菌体重悬至1mL TSB中，并取菌液和自失活噬菌体ΔTail DK各500μL加至50mL TSB培养基(含1mM氯化钙)，25℃、100rpm振荡培养过夜。将培养液以10,000g、4℃离心20min，用0.22μM的过滤器过滤获得上清，上清于4℃保存。
实施例3、自失活噬菌体裂解实验
通过噬菌斑实验确定自失活噬菌体ΔTail DK裂解能力。将待测蜡样芽胞杆菌233-1接种至培养基中过夜培养，随后分别取出100μL加至4mL融化的上层琼脂中，混匀后倾倒于TSB固体平板上，静置凝固。将噬菌体梯度稀释后，每个稀释度取4μL噬菌体悬液，分别点于琼脂上，静置待液体吸收。于37℃静置培养4-6h，观察噬菌斑，如存在清晰的噬菌斑，表明噬菌体可以裂解该细菌，反之，则表示噬菌体无法裂解。结果表明自失活噬菌体ΔTailDK保持对宿主菌的裂解能力(图4)，同时，由于自失活特性，无法像野生株DK1在低滴度下形成单个噬菌斑。
实施例4、自失活噬菌体与非自失活噬菌体的抗菌能力自失活能力比较
通过细菌的清除实验比较野生DK1和自失活噬菌体ΔTail DK的抗菌能力。将对数期蜡样芽胞杆菌233-1细菌稀释并分别添加至三瓶含45mL TSB锥形瓶中，菌终浓度为1×105CFU/mL；分别取出500μL测定初始细菌量，并定义为0h，随后，稀释噬菌体并将分别向锥形瓶中加入5mL噬菌体终浓度为106CFU/mL使MOI＝10。混匀后取1mL过滤测定初始噬菌体量，定义为0h，将锥形瓶静置于25℃下恒温孵育3h后取样测定，通过菌落计数计算存活的细菌，通过噬菌斑计数计算存活的噬菌体滴度，上述实验重复三次，确定改变宿主后的噬菌体制剂的细菌清除能力。结果显示(图5)，自失活噬菌体ΔTail DK可以有效杀灭细菌，降低活细菌数量；同时，在完成细菌清除后，野生DK1活性噬菌体滴度上升，ΔTail DK下降(图6)，即实现自我失活。
实施例5、透射电子显微镜观察完成细菌体后的自失活噬菌体裂解物
将自失活噬菌体ΔTail DK与蜡样芽胞杆菌233-1以MOI＝0.1混合，加入到3mLTSB(含1mM氯化钙)，37℃、200rpm振荡培养3h，用0.22μM的过滤器过滤获得上清悬液，同时将野生DK1悬液进行同步操作。分别将悬液滴于铜网上，自然沉淀15min，用滤纸从侧面吸去多余液体，加一滴2％的磷钨酸于铜网上对噬菌体染色10min，然后用滤纸吸去染色液，待样品干燥后用电子显微镜观察噬菌体形态。透射电镜结果显示(图7)，野生DK1具有完整的噬菌体结构(图7A)，自失活噬菌体ΔTail DK呈现两种结构，仅有头部结构(图7B)或头部结构加缺乏附肢蛋白的尾部结构(图7C)，两种形态与野生噬菌体DK1相比，都缺乏敲除的尾部基因编码的结构蛋白(图7A白色箭头)。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，包括更换其他细菌或噬菌体进行相似操作，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (5)
1.Bacillus cereus bacteriophage ΔTail DK1，保藏编号为：GDMCC No：62951-B1。
2.权利要求1所述的Bacillus cereus bacteriophage ΔTail DK1在制备临床上防控和清除污染菌或致病菌的制剂中的应用，所述的污染菌或致病菌为蜡样芽胞杆菌。
3.权利要求1所述的Bacillus cereus bacteriophage ΔTail DK1在制备细菌检测试剂中的应用，所述的细菌为蜡样芽胞杆菌。
4.一种抗菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的Bacillus cereus bacteriophage ΔTail DK1作为活性成分。
5.根据权利要求4所述的抗菌剂，其特征在于，所述的抗菌剂为食品生产环境消杀剂。
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