CN114891638A - 一种藻菌共培养促进小球藻生长和固碳脱硝的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种藻菌共培养促进小球藻生长和固碳脱硝的方法，具体是将小球藻与一种假单胞菌(Pseudomonas sp.)按照一定比例进行共培养，小球藻在生长过程中释放的氧气和氨基酸、多糖、有机酸等胞外代谢物可以被细菌生长所消耗，细菌通过呼吸作用生成二氧化碳供藻细胞光合利用，同时释放维生素、糖肽类等生长刺激因子促进小球藻生长，进而提高藻细胞的固碳脱硝效率。另外，利用假单胞菌的反硝化特性，以NO₃ ^‑作为电子受体进行产能代谢，将NO₃ ^‑还原为N₂，进一步促进硝态氮的脱除，在促进小球藻快速生长的同时，实现共培养体系的高效固碳脱硝效率。

Description

一种藻菌共培养促进小球藻生长和固碳脱硝的方法

技术领域

本发明涉及生物能源及微藻固碳技术领域，具体涉及一种藻菌共培养促进小球藻生长和固碳脱硝的方法。

背景技术

随着工业化快速发展，人类对能源的消耗日益攀升。全球对化石资源过分依赖的同时，烟道气排放量急剧增加，环境问题日益突出。燃煤烟道气包含CO₂、NO_X、SO_X等无机污染物，排放到环境中易造成温室效应、光化学烟雾及酸雨等污染问题，对人类活动和环境生态系统造成严重的损害。

传统的电厂烟气处理技术包括烟气脱硫、脱硝和除尘等工艺，存在工艺设备复杂、能耗高、处理成本高及二次污染重等问题，难以达到减排节能的双重要求。相较于传统物化法，生物法因具有反应条件温和、二次污染较低、可实现资源再利用等特点而受到广泛关注。

微藻是一类可以利用水和CO₂通过光合作用合成有机质的生物，具有生长速度快、光合效率高、环境适应性强等特点。微藻细胞可以通过光合作用固定烟气中的CO₂，同时吸收NO_X，作为生长所需的碳源及氮源，获得的微藻生物质可进一步转化为高附加值产品具有广阔的发展前景。相比于传统燃煤电厂烟气减排技术，微藻固碳脱硝技术具有工艺设备简单、操作方便和绿色环保等优势。

然而，利用微藻减排烟气技术仍存在许多限制性问题：(1)烟气中CO₂浓度高、总量大，并含有NO_X、SOx等有毒气体，单一微藻耐受性差，处理效率较低；(2)面对复杂波动的烟气环境，单一微藻系统难以耐受生产过程中烟道气成份及浓度的剧烈波动，稳定运行性较差，限制了微藻固碳脱硝的规模化应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过藻菌共培养提高小球藻生物量和固碳脱硝速率的方法，该方法将小球藻与假单胞菌按照一定比例进行共培养，共培养体系能够在BG11培养基中提高小球藻的生物量和固碳脱硝效率，为微藻生物固碳脱硝的规模化应用提供理论基础。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

将小球藻(Chlorella vulgaris)与假单胞菌属(Pseudomonas sp.)按照一定初始比例进行共培养。在藻菌共培养体系中，微藻为微生物的生长提供所需氧气和养分，而微生物可以消耗藻类光合作用释放的氧气并产生二氧化碳供微藻利用，同时能够消耗微藻分泌的胞外多聚物来减少其对藻细胞生长的抑制作用。另外，利用假单胞菌的反硝化特性，以NO₃ ^-作为电子受体进行产能代谢，将NO₃ ^-还原为N₂，进一步促进硝态氮的脱除，这样在促进小球藻生长的同时，还可以实现共培养体系的高效固碳脱硝，具体培养方法如下：

(1)首先将小球藻在BG11培养基中培养至对数生长期，随后藻细胞用离心机6000×g离心5min去掉上清，藻细胞沉淀加入适量BG11培养基进行悬浮且将OD₇₅₀调至为1；

(2)取40mL小球藻藻液接种至250mL锥形瓶中，同时将培养至对数期的假单胞菌株(OD₆₀₀调至为10)分别按照藻菌初始比例50:1、10:1、1:1和1:10的体积比例接种至已有小球藻的培养基中，用BG11培养基定容至100mL；

(3)添加硝酸钠浓度为88.25mM，并通过CO₂气瓶及空气压缩机以0.05L/min和0.95L/min的速度通入CO₂和空气，以纯小球藻的培养体系作为对照。

(4)最后将藻细胞放入光照培养箱进行培养，培养温度25±1℃，光照周期14h:10h，光照强度9600lx。

本发明方法具有如下优点：

(1)本发明在小球藻BG11培养基条件下将小球藻与假单胞菌按照一定比例进行共培养，利用藻菌之间的互利共生关系对共培养体系的营养物质调控，促进小球藻的固碳生长，生物质产量提高160％；

(2)结合假单胞菌的反硝化特性，藻菌共培养体系可实现同步固碳脱硝处理，与纯藻培养相比，共培养体系的固碳速率提高了28％，脱硝速率提高了30％。此外，这种混合体系中的物质交换不仅能为藻菌各自的生长提供有利的条件，而且混合体系有利于分摊来自环境的压力，对抗多变的外部环境或外来物种的侵袭，利于对抗单一微藻处理烟道气过程中面临的难以耐受烟道气成份及浓度的剧烈波动，稳定运行性较差等问题。

附图说明

图1是小球藻与假单胞菌共培养藻菌比对小球藻生长变化的影响；

图2是小球藻与假单胞菌共培养对小球藻生物量和固碳、脱硝速率的影响；

图3是小球藻与假单胞菌共培养对小球藻光合活性的影响；

图4是小球藻与假单胞菌共培养培养基上清液的三维荧光光谱分析；

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例

一、小球藻的培养

A、小球藻的选取：藻种购于中国科学院淡水藻种库(FACHB)；

B、小球藻的纯化：无菌小球藻经含有抗生素的BG11平板(配方如表1所示)筛选获得。先将50μL小球藻藻液均匀涂布至含有100mg/L氨苄青霉素、50mg/L壮观霉素和50mg/L硫酸卡那霉素的BG11固体平板上，平板放入光照培养箱中培养，培养10d后挑取小球藻单藻落，划线至新鲜的含有抗生素的BG11平板上，重复三次并通过显微镜鉴定以获得无菌小球藻；

C、小球藻的培养：采用BG11液体培养基进行培养，培养温度25±1℃，光照周期14h:10h，光照强度9600lx。

表1 BG11培养基配方

(说明：培养基总体积为1000mL，固体培养基添加1.5％的琼脂)

二、假单胞菌的培养

A、假单胞菌的选取：假单胞菌属(Pseudomonas sp.)购于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)；

B、假单胞菌的培养：将蛋白胨5.0g，牛肉浸取物3.0g，NaCl 5.0g依次加入纯水中，定容至1L，调节pH＝7，用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20min后冷却使用。

三、构建小球藻与菌株的共培养体系

将小球藻培养至对数生长期，6000×g离心5min去掉上清，藻细胞沉淀加入适量BG11培养基进行悬浮且将OD₇₅₀调至为1。取40mL小球藻藻液接种至250mL锥形瓶中，同时将培养至对数期的菌株(OD₆₀₀调至为10)分别按照藻菌初始比例50:1、10:1、1:1和1:10的体积比例接种至已有小球藻的培养基中，用BG11培养基定容至100mL。添加硝酸钠浓度为88.25mM，通过CO₂气瓶及空气压缩机以0.05L/min和0.95L/min的速度通入CO₂和空气，以纯小球藻培养体系作为对照。在光照培养箱中进行培养。

四、结果分析

A、藻菌初始接种比例对小球藻生物量积累的影响

通过测量纯藻培养和藻菌共培养体系中叶绿素的含量来表征小球藻生物量的变化。小球藻叶绿素含量采用100％甲醇提取法进行测定，步骤如下：取0.5mL藻液10000×g离心10min去掉上清，藻细胞沉淀用蒸馏水洗涤两次后加入1mL 100％甲醇，涡旋混匀3min后超声浸提40min，期间避光加冰防止叶绿素受热见光分解。待藻体颜色变白离心取上清液，测量OD_652.4和OD_665.2。叶绿素浓度根据以下公式进行计算：Chla(mg/L)＝16.72×OD_665.2-9.16×OD_652.4；Chlb(mg/L)＝34.09×OD _652.4-15.28×OD_665.2；Chla+b(mg/L)＝1.44×OD_665.2+24.93×OD_652.4。

按照上述步骤得到的图1结果表明：随着藻菌比的增加，小球藻叶绿素含量逐渐递增。当藻菌比为1:10时，小球藻叶绿素积累量最高，叶绿素含量可达30.1mg/L，是对照组11.8mg/L的2.6倍。

以上结果表明，初始藻菌接种比例对于共培养体系持续高效固碳脱硝至关重要。细菌接种比例过高时，细菌大量消耗掉培养基中的营养物质，从而导致微藻生长迟缓产率较低。同样，细菌接种比例过低时，细菌含量太低，生长状态达不到藻细胞正常生长所需的“群体效应”，导致微藻生长状态不好，整个共培养体系固碳脱硝效率较低。当初始接种藻菌比例为1:10时，假单胞菌对小球藻生物量积累的促进效果最佳。

B、共培养对小球藻固碳、脱硝速率的影响

共培养体系中硝酸根的含量测定采用紫外分光光度法或离子色谱法进行。固碳速率测定通过TOC分析仪测定藻细胞中总有机碳的含量计算固碳速率，根据以下公式计算：RCO₂＝Cc×P×(MCO₂/MC)，Cc为用总有机碳(TOC)方法测试微藻生物质中碳元素含量(Cc，X％)，P为微藻干基生物质生产能力，MCO₂为CO₂的摩尔质量，MC为C元素的摩尔质量。

通过测量小球藻细胞叶绿素含量，发现藻菌共培养确实可以促进小球藻细胞的生长。为进一步明确共培养组合是否在提高固碳速率方面也占据优势。需要先对藻细胞的总有机碳(TOC)含量和生物质生产力进行测定，实验结果如图2A和图2B所示。共培养后，小球藻细胞的TOC含量445mg/L，是纯培养小球藻110.4mg/L的4.03倍。通入CO₂后，共培养小球藻细胞的TOC含量达1052.5mg/L，是纯培养小球藻823.2mg/L的1.28倍。生物质生产力也表现出相同的变化趋势。

根据测得的TOC和生物质生产力情况，即可测定出小球藻的固碳速率。共培养通入CO₂后，小球藻细胞的固碳速率达0.482g/L/d，是纯培养小球藻0.377g/L/d的1.28倍。共培养组合在促进小球藻细胞生长的同时也提高了藻细胞的固碳速率。

假单胞菌是一株好氧反硝化细菌，可利用NO₃ ^-作为电子受体进行产能代谢，并将NO₃ ^-还原为N₂。为确定假单胞菌在促进小球藻生长的同时，是否可以结合自身的特性，辅助小球藻进行脱硝处理，因此，我们对共培养组合的脱硝速率进行了测定，结果如图2C所示。共培养组合的脱硝速率为116.2mg/L/d，是纯藻55.6mg/L/d的2.1倍；通入CO₂后，共培养组合的脱硝速率可达129.6mg/L/d，是纯藻101.7mg/L/d的1.3倍。共培养脱硝速率提高的原因，一方面可能是假单胞菌促进了小球藻的生物量而提高了脱硝速率；另一方面可能是假单胞菌利用自身的反硝化作用脱除了部分硝态氮。

C、共培养通对小球藻光合活性的影响

光合活性通过叶绿素分析仪测量Fv/Fm参数表征，检测共培养前后微藻光合能力变化。叶绿素荧光参数Fv/Fm代表了PSII的最大光化学量子产量，反应植物潜在最大光合能力，非胁迫条件下该参数的变化极小,不受物种和生长条件的影响，胁迫条件下该参数明显下降。如图3所示，纯培养条件下小球藻细胞的Fv/Fm值为0.514，是共培养0.449的1.14倍，说明假单胞菌的加入一定程度上对小球藻细胞造成胁迫；通入CO₂后，纯培养与共培养小球藻细胞的光合活性均得到提高，说明CO₂作为微藻光合碳源促进了微藻的生长，此时，共培养条件下Fv/Fm值提升为0.617，高于小球藻纯培养，这表明共培养组合更有利于小球藻进行固碳培养。

D、共培养培养基三维荧光光谱分析

在大多数情况下营养物质的交流是藻菌体系存在的物质基础。随着微藻的生长，藻液中会不断累积多种有机物，例如衰亡或破碎的藻细胞以及微藻分泌到细胞外的有机质，可以作为藻际异养型菌群生长的有机碳源，经过细菌的代谢产生CO₂为微藻提供无机碳源，从而完成环境中的碳循环。通过三维荧光光谱法，对共培养第4天培养基中的荧光有机物进行了表征，结果如图4所示。对于纯培养小球藻(图B)来说，第一个峰(峰1)出现在265-275nm/330-370nm的激发/发射波长，第二个峰(峰2)出现在250-270nm/430-480nm的激发/发射波长，第三个峰(峰3)出现在335-375nm/430-475nm的激发/发射波长。峰1是芳香类蛋白质的峰，峰2和峰3为类腐殖酸的峰。对于纯培养的假单胞菌(图C)来说，也出现了3个峰，同小球藻类似，峰1是芳香类蛋白质的峰，峰2和峰3为类腐殖酸的峰。共培养后，也出现了3个峰，类似的峰1也是芳香类蛋白质的峰，峰2和峰3为类腐殖酸的峰。共培养后，峰1和峰2的荧光强度增加，这可能是由于共培养后小球藻和假单胞菌的细胞数量增加，导致胞外分泌物含量增加，从而使峰1及峰2的荧光强度增强。但是共培养后峰3的荧光强度降低，而该峰代表类腐殖酸物质。腐殖酸在农业领域的开发利用是最多的，开展腐殖酸综合利用的最初目的是为了缓解我国20世纪70年代的化肥总量不足的困难，所以腐殖酸类物质具有促进植物生长的作用。峰3的荧光强度降低，说明藻菌之间可能发生了物质交换，假单胞菌分泌的类腐殖酸物质可能被小球藻细胞利用，从而促进了小球藻细胞的生长。

五、实验总结

本发明利用固碳藻株小球藻与好氧反硝化菌株假单胞菌共培养，以纯培养小球藻为对照组，考察反硝化细菌的添加对小球藻生长和固碳脱硝效果的影响。当藻菌比为1:10时，小球藻叶绿素积累量最高，叶绿素含量可达30.1mg/L，是对照组11.8mg/L的2.6倍。共培养后，小球藻细胞的固碳速率可达0.482g/L/d，是纯培养小球藻0.377g/L/d的1.28倍；脱硝速率可达129.6mg/L/d，是纯藻101.7mg/L/d的1.3倍。共培养组合在促进小球藻细胞生长的同时也提高了体系的固碳、脱硝速率。

单一微藻处理烟道气可能存在处理效率低，稳定性差的问题。通过构建藻菌共培养体系，利用藻菌之间的互利共生关系对共培养体系中营养物质的调控以及假单胞菌对硝态氮的利用特性，在促进小球藻正常生长的同时，又可以实现共培养体系的高效固碳脱硝效率。此外，这种混合体系中的物质交换不仅能为藻菌各自的生长提供有利的条件，而且混合体系有利于分摊来自环境的压力，对抗多变的外部环境或外来物种的侵袭，利于对抗单一微藻处理烟道气过程中面临的难以耐受烟道气成份及浓度的剧烈波动，稳定运行性较差等问题。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.一种藻菌共培养促进小球藻生长和固碳脱硝的方法，其特征在于，将小球藻与假单胞菌按照体积比50:1～1:10的比例在BG11培养基中共培养，从而促进藻细胞的正常生长和高效固碳脱硝效率，

包括以下步骤：(1)首先将小球藻在BG11培养基中培养至对数生长期，随后藻细胞用离心机6000×g离心5min去掉上清，藻细胞沉淀加入适量BG11培养基进行悬浮且将OD₇₅₀调至为1；

(2)其次取40mL小球藻藻液接种至250mL锥形瓶中，同时将培养至对数期的假单胞菌菌株(OD₆₀₀调至为10)分别按照藻菌初始比例50:1、10:1、1:1和1:10的体积比例接种至已有小球藻的培养基中，用BG11培养基定容至100mL；

(3)添加硝酸钠浓度为88.25mM，通过CO₂气瓶及空气压缩机以0.05L/min和0.95L/min的速度通入CO₂和空气，以纯小球藻培养体系作为对照；

(4)最后将藻细胞放入光照培养箱进行培养，培养温度25±1℃，光照周期14h:10h，光照强度9600lx。

2.根据权利要求1所述的藻菌共培养促进小球藻生长和固碳脱硝的方法，其特征在于，所述小球藻经含有100mg/L氨苄青霉素、50mg/L壮观霉素和50mg/L硫酸卡那霉素的BG11平板筛选获得。

3.根据权利要求1所述的藻菌共培养促进小球藻生长和固碳脱硝的方法，其特征在于，所述反硝化细菌为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)。

4.根据权利要求1所述的藻菌共培养促进小球藻生长和固碳脱硝的方法，其特征在于，所述小球藻与假单胞菌的最优藻菌体积比为1:10。

5.根据权利要求1所述的藻菌共培养促进小球藻生长和固碳脱硝的方法，其特征在于，所述藻菌共培养体系对小球藻生长和固碳脱硝速率等方面都有促进作用。

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