CN114540266A

CN114540266A - 用于治疗用途的岩藻糖基化细胞的制备和冷冻干燥

Info

Publication number: CN114540266A
Application number: CN202210090681.XA
Authority: CN
Inventors: S·D·沃尔夫
Original assignee: Targazyme Inc
Current assignee: Targazyme Inc
Priority date: 2014-07-07
Filing date: 2015-07-07
Publication date: 2022-05-27
Also published as: US20170121673A1; CA2954534C; US20190062694A1; KR102505009B1; SG11201610699XA; CA2954534A1; JP2024099565A; AU2015288052B2; EP3167046A1; AU2015288052A1; JP2017525340A; KR20170041204A; JP2022065029A; CN106687581A; US20230014609A1; WO2016007506A1; AU2022201639A1; EP3167046A4

Abstract

本发明涉及用于治疗用途的岩藻糖基化细胞的制备和冷冻干燥。提供了用于制备岩藻糖基化细胞群体的组合物和方法。该方法可包括在保持最佳水平的细胞表面岩藻糖基化的条件下扩增细胞和/或冷冻保存细胞。

Description

用于治疗用途的岩藻糖基化细胞的制备和冷冻干燥

本申请是申请日为2015年7月7日、发明名称为“用于治疗用途的岩藻糖基化细胞的制备和冷冻干燥”的中国发明专利申请No. 201580036891.9的分案申请。

相关申请的交叉引用/通过引用并入的声明

本申请根据35USC 119(e)要求于2014年7月7日提交的US 系列号62/021,328的权益。上述申请的全部内容在此通过引用明确地并入本文。

关于联邦政府资助的研究或开发的声明

不适用。

背景

用α1,3-岩藻糖基转移酶和岩藻糖供体处理细胞增加它们结合被称为选择素的粘附蛋白种类的能力。在炎症、缺血或组织损伤期间， P-选择素和E-选择素协同地介导白细胞滚动和在血管表面上的粘附 (综述于Zarbock等人(2011)Blood,118:6743-51)。在大多数组织中，P-选择素和E-选择素在激动剂的刺激后在内皮细胞上表达，但它们在骨髓内皮细胞上组成型表达。

选择素使用糖蛋白或糖脂上的α2,3-唾液酸化和α1,3-岩藻糖基化聚糖(例如唾液酸化Lewis X(sLeX))作为配体。例如，P-选择素结合至含有酪氨酸硫酸盐和用sLex封端的O-聚糖的P-选择素糖蛋白配体-1(PSGL-1)的N-末端区域。E-选择素结合PSGL-1上的一个或多个不同位点。为了与E-选择素相互作用，PSGL-1不需要酪氨酸硫酸化，但是sLex在O-聚糖上的表达增强了结合。E-选择素还与其它配体相互作用。HSC上的CD44的同种型已被显示在体外与E-选择素结合(Dimitroff等人(2001)J Cell Biol.,153:1277-1286)。HSC上 E-选择素的另一个潜在配体是E-选择素配体-1(ESL-1)(Wild等人 (2001)J Biol Chem.,276:31602-31612)。这些糖蛋白配体中的每一个被认为具有sLeX结构。

岩藻糖是sLeX中的末端碳水化合物，并且已显示离体岩藻糖基化增加细胞表面sLeX的水平以及细胞从脉管系统外渗进入周围组织的能力(Xia等人(2004)Blood,104:3091-6；Sackstein等人(2008)Nat Med,14:181-7；Sarkar等人(2011)Blood,118:e184-91；Robinson等人(2012)Exp Hematol.,40:445-56；美国专利7,332,334；US 2006/0210558；US申请12/948,489)。

迄今为止描述的离体岩藻糖基化方法涉及在静脉内注射到动物或人体中之前处理细胞。例如，目前正在进行的临床试验 (“ClinicalTrials.gov”标识符NCT01471067)测试在移植前用α1,3- 岩藻糖基转移酶VI加GDP-岩藻糖处理脐带血细胞以改善脐带血细胞归巢和植入骨髓的能力的效用。在此申请中，脐带血在护理点被岩藻糖基化，而无需扩增细胞群体。该试验涉及从脐带血库获得与接受者遗传匹配的脐带血，解冻细胞并洗涤它们以不含冷冻保护剂，在室温下用α1,3-岩藻糖基转移酶VI加GDP-岩藻糖处理30分钟，再次洗涤细胞，并通过静脉内途径将它们输注到患者体内。

然而，对于许多应用，在治疗之前扩大细胞数目是有利的。例如，脐带血中造血细胞的数量足以在移植后植入儿童，而非成人。为此，已经进行了许多尝试以通过在移植之前在各种条件下培养脐带血细胞来扩大可植入细胞的数量(综述参见ahlberg等人(2011)Blood, 117:6083-90；and Delaney等人(2013)Biol Blood Marrow Transplant, 19(1Suppl):S74-8)。

然而，尽管进行了大量的工作，但目前还没有扩增造血细胞而保留原始细胞群体的所有特征的方法。细胞的细胞表面特征以及它们的体外和体内效能都可以改变。例如，在离体扩增期间，与N-钙粘着蛋白、骨桥蛋白和血管细胞粘附分子-1(存在于骨髓壁龛中的配体)的粘附快速减少，这可部分解释扩增的细胞植入骨髓的能力的减少 (Kallinikou等人(2012)Br J Haematol.,158:778-87)。因此，清楚的是，扩增的造血细胞群体不同于原代的或未扩增的细胞群体。到目前为止，还没有研究观察在离体扩增期间粘附分子的损失是否影响细胞被岩藻糖基化的能力，或者岩藻糖基化是否可以挽救伴随离体扩增发生的植入缺陷。

间充质基质细胞(MSC)存在类似的情况。MSC代表小百分比 (0.001-0.01％的总有核细胞)的骨髓细胞。然而，目前的MSC治疗剂量需要1-5×10⁶MSC/kg体重的剂量，并且一些应用可能需要甚至更高的细胞剂量(>5×10⁶MSC/kg体重)以是有效的；因此有必要开发MSC扩增方案，允许从有限的起始体积的初始材料产生高达 5-10×10⁸个MSC。

然而，MSC的离体扩增可以根据使用的条件改变它们的治疗性质 (Menard等人(2013)Stem Cells Dev.,22:1789-801)。此外，在五种 GMP顺应性扩增条件中的任何一种下的传代过程中，MSC的传代使许多细胞表面抗原(整联蛋白α6，整联蛋白αv，CD71，CD140b，CCR4，CD200，CD271，CD349和CXCR7)下调(Fekete等人(2012) PLoS One,7(8):e43255)。然而，迄今为止，还没有研究观察在离体扩增期间这些细胞表面抗原的损失是否影响细胞被岩藻糖基化的能力，或者岩藻糖基化是否可以改善在大规模扩增培养物中制备的MSC 的归巢和植入。

用于治疗用途的细胞的制备通常涉及在组织培养中扩增来自活的或尸体供体的有限数量的原代细胞。用于获得这样的细胞的组织包括但不限于从骨髓、脐带血、脐带、脐带胶质(Wharton’s jelly)、外周血、淋巴组织、子宫内膜、滋养层来源的组织、胎盘、羊水、脂肪组织、肌肉、肝、软骨、神经组织、心脏组织、牙髓组织、脱落的牙齿分离的细胞或源自胚胎干(ES)细胞或诱导多能干(iPS)细胞的细胞。

用于分离源自实体组织的细胞的常用方法是用蛋白水解酶(例如破坏使细胞保持在组织中的基质并将细胞释放到组织培养基中的胶原酶)处理组织；或者，可以使用机械方法如超声处理。

任选地，可以通过使细胞与针对细胞表面抗原的一种或多种抗体 (例如抗CD34或抗STRO1)接触，并通过本领域已知的方法(例如荧光激活细胞分选(FACS)或磁珠分离)分离细胞来选择细胞群。方便地，抗体可以与标记物(例如磁珠，其允许直接分离；生物素，其可以用与支持物结合的抗生物素蛋白或链霉亲和素移除；荧光染料，其可以与荧光激活细胞分选仪(FACS)一起使用，等)缀合以允许容易分离特定细胞类型。可以使用不会对剩余细胞的生存力过度有害的任何技术。可以通过使用结合非期望细胞群体的抗体进行负选择，而不是使用结合所需细胞群体的抗体。

然后将所得细胞在悬浮培养物(细胞例如造血细胞、免疫细胞或淋巴样细胞通常所需的方法)中或作为附着细胞(附着于组织培养塑料的细胞例如MSC、脂肪干细胞、神经元干细胞通常所需的方法)生长。附着细胞可以在烧瓶、滚瓶、细胞工厂中或在随后被保持悬浮在一次性袋、搅拌悬浮生物反应器或摇动式生物反应器中的微载体珠上生长。本领域已知的其它方法包括但不限于在中空纤维装置中生长细胞，在可以是刚性壁搅拌槽、旋转壁、平行板或固定和流化床反应器的生物反应器中生长细胞；或在诸如Aastrom REPLICELL

系统 (Aastrom Biosciences，Ann Arbor，MI)的自动细胞处理单元中生长细胞(对于这些不同方法学的综述参见Rodrigues等人(2011) Biotechnol Adv.,29:815-29)。

在制备期间产生的细胞的性质可以根据所使用的条件而广泛地不同。对于MSC扩增，培养基中通常包括胎牛血清(FBS)。作为在全血凝固并释放血小板和其它血细胞产物后获得的产物，血清是除了在伤口条件下在身体中通常不能见到的病理流体。因此，在血清存在下制备的MSC或其它细胞会见到在正常稳态条件下通常不会原位见到的生物活性因子(例如血小板来源的细胞因子和其它产物)。对于在人血小板裂解物(当在cGMP条件下产生细胞时，其可以用作FBS 的替代物)中生长的细胞也是如此。因此，在血清或血小板裂解物存在下生长的细胞具有不同于从组织获得的原代细胞的性质。

已经尝试开发无血清培养基以生长MSC和其它细胞类型，但是这些存在不同的问题。细胞通常在体内存在于复杂环境中，其中它们不断地从其环境接收信号。它们可以附着于细胞外基质存在，与其它细胞类型紧密接触，并且沐浴在特别地流至是它们所位于的器官、血液或淋巴的复杂蛋白质流体中。相比之下，现有的无血清培养基具有很少的蛋白质，并且不重现原位环境。此外，用于附着细胞的基底(通常是组织培养塑料、玻璃等)提供与细胞通常原位经历的非常不同的环境。在许多情况下，细胞被平铺以最大化对组织培养基底的粘附，并因此丧失它们通常在体内具有的对于维持功能重要的立方结构。

不管制备过程如何，治疗性细胞需要满足严格的管理准则。由于细胞的扩增被认为不仅仅是最小操作(minimal manipulation)，因此扩增的细胞比从供体简单获得并且仅以最小操作给予受体的细胞更严格地调节。在美国，治疗性细胞必须以符合美国食品和药物管理局 (FDA)执行的现行良好制备实践(Current Good Manufacturing Practice)(cGMP)规程的方式制备。已扩增的细胞在人细胞、组织或细胞产品和基于组织的产品(HCT/Ps)的上下文中被考虑。因此，细胞生产必须符合“联邦法规法典”(CFR)、标题21、第1271部分(The Code of Federal Regulation(CFR),Title 21,Part 1271)，并且符合CurrentGood Tissue Practice(CGTP)and Additional Requirements for Manufacturers ofHuman Cells,Tissues,and Cellular and Tissue-Based Products(HCT/Ps)中描述的现行良好组织实践(cGTP)要求。在欧洲，扩增的细胞被认为是高级治疗药物产品 (ATMP)，如欧洲法规EC 1394/2007所定义的。根据来源、制备过程和预期应用，扩增的细胞可以被认为是体细胞治疗产品或组织工程化产品。欧洲法规EC 1394/2007涉及欧洲cGMP指南，并且符合关于人用药物产品的2003/94/EC指导，以及设置用于收集、测试、处理、储存和分配人血液和血液成分的质量和安全标准的2002/98/EC指导。

在cGMP顺从性条件下生长的细胞的性质可以与在实验室条件下生长的细胞实质性不同。在实验室条件下，细胞通常在含有5-10％胎牛血清和比通常在非糖尿病个体中体内发现的水平更高的葡萄糖水平的组织培养基中在5-10％二氧化碳(CO₂)中生长。在实验室条件下使用的培养基通常是标准实验室培养基之一，例如Roswell Park MemorialInstitute(RPMI)1640、Dulbecco改良Eagle培养基 (DMEM)等；细胞被适应于在这些标准培养基之一中生长。在实验室条件下，使细胞生长一段时间，直到它们开始排出组织培养基中的营养物，然后组织培养基通过更换50％-95％的培养基来更换。

在实验室条件下使用的高氧压可以引起细胞的氧化应激。可在实验室条件下广泛波动的营养物和代谢物浓度也可以影响细胞行为。

相反，cGMP工艺开发针对每种细胞类型优化这些参数中的每一个以及许多其它参数(关于综述参见Rodrigues等人(并入上文))。用于cGMP制备的培养容器通常与在实验室条件下使用的培养容器非常不同，并且常常涉及与组织培养瓶相对的生物反应器。通常针对每种细胞类型优化组织培养基组分，而不是使用一种现成的组织培养基，并且使用的生长因子和其它添加剂其本身在cGMP条件下产生。在 cGMP条件下生产的制备商通常努力消除通常在实验室条件下使用的异种添加剂例如FBS。在cGMP工艺开发期间针对每种细胞类型优化进料参数、生长因子和氧合作用，并且营养物和代谢物浓度的波动保持在严格的限度内。最后，cGMP工艺的扩增规模通常比常规实验室条件下的规模大数个数量级。

由于这些原因，治疗性细胞的制备不是简单地按比例扩大基于实验室的方法的问题。相反，必须在工艺开发的每个步骤进行详细的优化研究，并且在学术实验室条件下进行的观察不一定适用于在cGMP 顺应性条件下生长的细胞。此外，如上所述(例如，Kallinikou等人， Menard等人和Fekete等人(各自已经并入上文))，即使在cGMP 顺应性条件(其通常针对细胞生长而不是功能进行优化)下，细胞的性质也可能随着大规模扩增而改变。因此，用原代细胞或在实验室条件下生长的细胞获得的结果可能不适用于以大规模cGMP制备过程程度扩增的细胞和在大规模cGMP制备过程中使用的条件下扩增的细胞。

到目前为止，尚未确定扩增的细胞群体的岩藻糖基化的最佳方法。具体地，尚未确定在cGMP条件下生长的细胞的岩藻糖基化的最佳方法。取决于预期的用途，岩藻糖基化步骤可以并入治疗性细胞的制备过程中的不同点。对于一些应用，有利的是制备细胞并将其直接递送至患者而不冷冻保存。这种应用的实例包括但不限于造血干细胞或免疫细胞、间充质干细胞、脂肪来源的干细胞、牙髓来源的干细胞、肌肉细胞、羊水细胞、子宫内膜细胞、神经干细胞和源自诱导多能干(iPS) 细胞的细胞的离体扩增，特别是当给予患者的细胞是自体的时(即，其中所述细胞来源于患者或遗传上相同的个体)。

在一些情况下，在中央处理中心制备细胞是有利的。该方法包括在体外生长大批细胞，在受控条件下将它们岩藻糖基化，并冷冻等分试样以分配到临床中心，在那里将施用这些细胞。这样的应用的实例包括但不限于间充质基质细胞(MSC)、脂肪来源的干细胞、牙髓来源的干细胞、肌肉细胞、羊水细胞、子宫内膜细胞和神经干细胞以及源自胚胎干(ES)细胞或诱导多能干(iPS)细胞的细胞，特别是当给予患者的细胞是同种异体的时(即，来自与受体遗传上不同的供体)。在这些情况下，具有经济、质量控制和分布优势的是能够生长大批细胞、将它们批量岩藻糖基化、并且将它们以等分试样冷冻保存随后分配到医疗中心以用于给予患者。

细胞的冷冻保存涉及向培养基中加入冷冻保护剂并使用受控的冷冻速率，然后在低温下储存细胞，通常在液氮冷冻器中储存。冷冻保护剂是用于保护生物组织免受由冰晶形成引起的冻伤的物质。冷冻保护剂分为两大类：可以通过细胞膜的渗透性冷冻保护剂，和不渗透细胞膜并通过降低冷冻过程中存在的高渗透效应而起作用的非渗透性冷冻保护剂。渗透性冷冻保护剂的实例包括但不限于二甲基亚砜(Me₂SO 或DMSO)、甘油、蔗糖、乙二醇、1,2-丙二醇及其任何组合。非渗透性冷冻保护剂的实例包括但不限于羟乙基淀粉、白蛋白、蔗糖、海藻糖、右旋糖、聚乙烯吡咯烷酮及其任何组合。

最广泛使用的渗透性冷冻保护剂是DMSO，其是在冷冻期间防止冰晶形成的吸湿性极性化合物。DMSO通常与非渗透性试剂例如自体血浆、血清白蛋白和/或羟乙基淀粉组合使用。通过使用不同冷冻保护剂的混合物，溶液的毒性降低，因此使得溶液比单试剂冷冻保护剂更有效。例如，最常用于细胞的冷冻保存方法包括在动物或人血清的存在下由5-20％DMSO组成的冷冻培养基。1至2℃/分钟的速率受控冷冻技术和快速解冻的使用被认为是标准的。这可以涉及使用以该速率降低温度的速率受控冷冻器或者使用通常为-80℃的被动冷却装置例如机械冷却器来冷却细胞(所谓的倾倒冷冻(dump-freezing))以产生类似于在速率受控冷冻中所采用的冷却速率。

纽约血液中心的Rubinstein及其同事开发了使用DMSO冷冻脐带血单元的优化方案(Rubinstein等人(1995)PNAS，92：10119-22)。将羟乙基淀粉加入到所述单元中，然后离心以除去过量的红血细胞和血浆，并获得含有基本上所有干细胞和祖细胞的20mL的均匀终体积 (美国专利号5,789,147)。在脐带血单元的体积减少后，将5mL冷冻保存溶液(0.85NaCl，50％DMSO[Cryoserv；Research Industries， Salt Lake City，UT]和5％右旋糖酐40[Baxter Healthcare，Deerfield， IL])缓慢加入至细胞悬浮液并连续混合。使用受控冷冻将所述单元冷冻储存在低温罐中的液氮的液相内。类似的方法用于多种细胞类型(综述于Hunt(2011)Transfus Med Hemother,38:107–123)。

尽管有这样详细的研究报道冷冻保存方法以维持细胞活力，但是还没有工作研究在冷冻保存后保留细胞表面的岩藻糖基化。

在用α1,3-岩藻糖基转移酶和岩藻糖供体离体处理后被岩藻糖基化的确切细胞表面组分对于任何细胞类型都没有被充分表征。已知对于一些细胞，它们包括糖脂和糖蛋白，并且已经鉴定了岩藻糖基化的一些主要靶标，例如PSGL-1、CD44和ESL-1，如上所述。然而，在离体处理后被岩藻糖基化的全范围的蛋白质和糖脂在任何细胞类型中都没有被很好地确定。

Faint等人(J Immunother.(2011)34:588-96)公开淋巴细胞的冷冻保存影响细胞表面抗原。这些研究者观察到降低水平的CD69(一种跨膜蛋白，其在淋巴细胞从组织中流出起关键作用)和趋化因子受体CXCR4(一种主要的化学引诱物受体)在解冻后增加，而CD62L(一种粘附蛋白)和CXCR3(另一种化学引诱蛋白)的水平降低。这些变化与淋巴细胞朝向重组CXCL11和CXCL12迁移穿过细胞因子刺激的内皮细胞单层的能力的调节相关。因此，淋巴细胞的冷冻保存和解冻诱导其粘附表型的变化并调节其迁移穿过内皮单层的能力。

类似地，Koenigsmann等人(Bone Marrow Transplantation (1998)22：1077-1085)研究了在冷冻保存之前和之后CD34+细胞上的粘附分子，发现冷冻将具有L-选择素(CD62L)表达的CD34+细胞的分数从62％显著地降低至11％，并且还减少整联蛋白亚基CD29和CD49d的荧光强度。Hattori等人(Exp.Hemat.29(2001)114-122) 也观察到L-选择素的减少。

Campbell等人(Clin Vaccine Immunol.(2009)16:1648-53)发现冷冻保存显著降低了PBMC-来源的CD3+/CD8+T细胞和 CD45+/CD14+单核细胞上的PD-1和PD-L1的表达。

Aoyagi等人(J Craniofac Surg.(2010)21:666-78)发现了在冷冻保存后在MSC中细胞表面蛋白CD271的表达的显著变化。DMSO可以快速诱导MSC中的神经元样形态，并增加神经元标记物例如 GFAP、巢蛋白、神经元核抗原(NeuN)和神经元特异性烯醇酶(NSE) 的表达，(Mareschi等人(2006)ExpHematol.,34(11):1563-72；and Neuhuber等人(2004)JNeurosci Res.,77:192-204)。

虽然所有这些研究公开了冷冻保存可以改变粘附性质和细胞表面抗原表达，但没有人研究它是否影响细胞表面岩藻糖基化的水平。由于冷冻保存可以以不可预先预测的方式改变多种细胞类型上的细胞表面粘附和其它分子，并且由于在用α1,3-岩藻糖基转移酶和岩藻糖供体处理后变成岩藻糖基化的细胞表面组分的性质还没有被完全确定，冷冻保存对细胞表面岩藻糖基化的影响只能凭经验确定。到目前为止，还没有发表解决这个问题的科学或专利文献。

在离体扩增后不同细胞类型可以被岩藻糖基化的程度以及细胞表面岩藻糖基化相对冷冻保存稳定的程度对于每种细胞类型只能凭经验确定。如前述讨论所指出的，离体扩增和冷冻保存各自可以影响许多细胞粘附分子和其它细胞表面组分的表达和功能；这些变化是细胞类型特异性的并且不能预先预测。尽管蛋白质如L-选择素可能由于冷冻保存和短期孵育后的解冻而从损失中恢复(Hattori等人，并入上文)，这不可能对于在离体岩藻糖基化后的岩藻糖基化水平发生，因为没有岩藻糖基化蛋白质的内部存储来替代暴露于外源酶和岩藻糖供体的那些。鉴定用于制备和冷冻保存具有增加的岩藻糖基化水平的细胞的条件是本申请的主题。

本发明涉及以下实施方案：

1.一种制备岩藻糖基化治疗性细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

分离治疗性细胞；

扩增治疗性细胞；和

通过使所述治疗性细胞与有效量的α1,3-岩藻糖基转移酶和岩藻糖供体接触来岩藻糖基化所述治疗性细胞。

2.一种冷冻保存岩藻糖基化治疗性细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

分离治疗性细胞；

通过使所述治疗性细胞与有效量的α1,3-岩藻糖基转移酶和岩藻糖供体接触来岩藻糖基化所述治疗性细胞；

在包含生理平衡盐溶液和冷冻保护剂的治疗性细胞冷冻保存组合物中冷冻岩藻糖基化的治疗性细胞。

3.一种冷冻保存岩藻糖基化治疗性细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

分离治疗性细胞；

扩增治疗性细胞；

4.实施方案1或3的方法，其中扩增治疗性细胞的步骤进一步定义为在cGMP条件下扩增治疗性细胞。

5.实施方案1-4中任一项的方法，其中所述α1,3-岩藻糖基转移酶选自α1,3-岩藻糖基转移酶III、α1,3-岩藻糖基转移酶IV、α1,3-岩藻糖基转移酶V、α1,3-岩藻糖基转移酶VI、α1,3-岩藻糖基转移酶VII、α1,3- 岩藻糖基转移酶IX、α1,3-岩藻糖基转移酶X、α1,3-岩藻糖基转移酶 XI及其组合。

6.实施方案1-5中任一项的方法，其中所述岩藻糖供体是GDP- 岩藻糖。

7.实施方案1-6中任一项所述的方法，其中所述治疗性细胞分离自选自以下的至少一种分离的组织：骨髓，脐带血，脐带，脐带胶质，外周血，淋巴组织，子宫内膜，滋养层来源的组织，胎盘，羊水，脂肪组织，肌肉，肝，软骨，神经组织，心脏组织，牙髓组织，脱落的牙齿及其组合。

8.实施方案1-7中任一项的方法，其中分离的治疗性细胞是分化的胚胎干细胞和分化的诱导多能干细胞中的至少一种。

9.实施方案1-8中任一项的方法，其中分离的治疗性细胞选自：造血干细胞，免疫细胞，间充质干细胞，肌肉细胞，羊水细胞，子宫内膜细胞，神经干细胞，天然杀伤(NK)细胞，T细胞，B细胞及其组合。

10.实施方案1-3中任一项的方法，其中所述α1,3-岩藻糖基转移酶是α1,3-岩藻糖基转移酶VII，所述岩藻糖供体是GDP-岩藻糖，并且所述分离的治疗性细胞选自T细胞、NK细胞、B细胞、神经干细胞及其组合。

11.实施方案1或3的方法，其中所述生理平衡盐溶液是细胞在其中扩增的组织培养基。

12.实施方案1、3和11中任一项所述的方法，其中所述生理平衡盐溶液含有蛋白质。

13.实施方案12的方法，其中所述蛋白质选自胎牛血清、马血清、人血清、人血小板裂解物、牛白蛋白、人白蛋白及其组合。

14.实施方案2、3和11-13中任一项所述的方法，其中所述冷冻保护剂选自二甲基亚砜、甘油、蔗糖、乙二醇、1、2-丙二醇、羟乙基淀粉、白蛋白、蔗糖、海藻糖、右旋糖、聚乙烯吡咯烷酮及其组合。

15.实施方案2、3和11-14中任一项所述的方法，其中所述冷冻步骤包括以下步骤：

将治疗性细胞在细胞冷冻保存组合物中以约1℃/分钟的速率从约 37℃冷却至约-80℃，以产生冷冻细胞悬浮液；和

将冷冻细胞悬浮液转移至在液氮存在的情况下储存。

16.实施方案2、3和11-15中任一项所述的方法，其中使用玻璃化方法冷冻所述治疗性细胞。

附图说明

图1涉及FTVI/FTVII剂量反应并图示了来自解冻的人脐带血的单核细胞的通过FTVI或FTVII的细胞表面岩藻糖基化的动力学的比较分析。

图2涉及FTVI-FTVII-MSC-1并图示了人间充质干细胞(MSC) 的通过FTVI或FTVII的细胞表面岩藻糖基化的动力学的比较分析。

图3涉及FTVI-FTVII-6并图示了通过FTVI或FTVII对纯化的脐带血来源的CD34+细胞的细胞表面岩藻糖基化的动力学的比较分析。

图4涉及FTVI vs FTVII并图示了新鲜培养的神经干细胞(NSC) 的通过FTVI或FTVII的细胞表面岩藻糖基化的动力学的比较分析。

图5和图6图示了通过FTVI(图5，用10μl FTVI处理的脐带血 MNC)或FTVII(图6，用FTVII 400μl处理的脐带血MNC)对融化的人脐带血来源的单核细胞的细胞表面岩藻糖基化的动力学的比较分析。

图7图示了FTVI处理相对安慰剂处理对人内皮祖细胞(EPC) 的岩藻糖基化的影响的分析。

图8图示了FTVI处理对人羊水干细胞的岩藻糖基化的影响的分析。

图9示出了FTVI处理对人脂肪来源的干细胞的岩藻糖基化的影响的分析。

图10图示了胰蛋白酶消化之前或之后人MSC的岩藻糖基化的影响的分析。

图11示出了用不同浓度的FTVI孵育hNK细胞对岩藻糖基化水平(％)的影响。将hNK细胞扩增14天，收获，洗涤，并用范围从 5μg/mL至25μg/mL的不同浓度的FTVI孵育。在添加GDP-岩藻糖(在所有样品中终浓度为1mM)后，将细胞在室温下孵育30分钟，随后用CLA-FITC染色分析岩藻糖基化的程度，还分析了NK细胞特征性的其它细胞表面标记物(CD62L，CD44，CD16，CD56和PSGL)。

图12示出了孵育对照和TZ101处理的人NK细胞对与E-选择素嵌合体的流体相结合的影响。扩增的hNK细胞在没有或具有5、10、 25和50μg/mL TZ101的情况下以2.5x10⁶个NK细胞/mL在室温下孵育30分钟，洗涤并重悬浮。然后将1μg/10⁵个NK细胞与人或小鼠 E-选择素/Fc嵌合蛋白在4℃孵育30分钟，并用CLA、CD44、人IgG 和膜联蛋白V染色。

图13示出了在用TZ101处理后48小时岩藻糖基化NK细胞的稳定性的检查。将hNK细胞扩增18天，收获，洗涤，并用25μg/mL的FTVI孵育。在加入GDP-岩藻糖(终浓度为1mM)后，将细胞在室温下孵育30分钟，然后在保持在培养基中1小时和48小时后用 CLA-FITC染色分析岩藻糖基化的程度。

图14示出了对照相对于岩藻糖基化NK细胞的细胞毒性潜力的比较分析。将hNK细胞扩增14天，收获，洗涤，并用IL-2孵育24小时，然后与指定的细胞系孵育。在用对照或TZ101-岩藻糖基化的hNK 细胞孵育K562细胞和MM1S细胞后测量毒性。在孵育4小时结束时用测量铬释放来监测细胞毒性。

图15A示出了调节性T(T_reg)细胞的岩藻糖基化。每个点图的左侧显示同种型对照，而右侧显示染色以及CLA阳性细胞百分比的表达。如用HECA-452抗CLA抗体染色所检测的，用TZ101(FTVI+ GDP-岩藻糖)处理使细胞表面sLeX单元的表达从8.8％增加至62％。图15B示出岩藻糖基化(FT)T_reg细胞维持其抑制功能。将来自两个供体的PBMC一起培养以产生MLR(D1+D2)。以1:1的比例向供体混合物(D1+D2)中添加T_reg细胞或FT-T_reg细胞显著抑制MLR。 Y轴表示每分钟的计数(CPM)(平均值±SEM，n＝3)。

图16示出了针对CG1的细胞毒性T细胞(CG1-CTL)的扩增及其岩藻糖基化。使用流式细胞术和抗CLA FITC测量岩藻糖基化水平。未处理的细胞表现出4％的岩藻糖基化，而用TZ101处理的细胞表现出100％的岩藻糖基化。

详述

在通过示例性附图、实验、结果和实验室程序的方式详细解释本发明构思的至少一个实施方案之前，应当理解，本发明的概念不限于其应用到在以下描述中示出或在附图、实验和/或结果中示出的构造的细节和组分的布置。本发明的概念能够进行其它实施方案或者以各种方式实践或执行。因此，本文使用的语言旨在给出最广泛的可能范围和含义；并且实施方案意在是示例性的-而不是穷举性的。此外，应当理解，本文中使用的措辞和术语是为了描述的目的，并且不应被认为是限制性的。

除非本文另有定义，与本文公开和/或要求保护的发明构思相关使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。通常，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学和蛋白质以及寡核苷酸或多核苷酸化学和杂交相关使用的术语以及技术是本领域公知和常用的。将标准技术用于重组DNA、寡核苷酸合成和组织培养和转化(例如电穿孔，脂质转染)。酶促反应和纯化技术根据制备商的说明书或如本领域通常完成的或如本文所述进行。前述技术和程序通常根据本领域熟知的常规方法进行，并且如在各种一般参考文献和更特别的在本说明书通篇引用和讨论的参考文献中描述。参见，例如， Sambrook等人MolecularCloning:A Laboratory Manual(第二版, Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y. (1989)和Coligan等人Current Protocols in Immunology(CurrentProtocols,Wiley Interscience(1994))。与本文所述的分析化学、合成有机化学和医学及药物化学相关使用的命名法以及本文所述的分析化学、合成有机化学和医学及药物化学的实验室程序和技术是本领域公知和常用的那些。将标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及治疗患者。

本说明书中提及的所有专利、公开的专利申请和非专利出版物指示了本文公开和/或要求保护的发明构思所属领域的技术人员的技术水平。在本申请的任何部分中引用的所有专利、公开的专利申请和非专利公开通过引用以其整体明确地并入本文，如同每个单独的专利或出版物被具体地和单独地指明通过引用并入。

根据本公开内容，可以制备和执行本文公开和/或要求保护的所有组合物和/或方法，而无需过多的实验。虽然已经在特定的非限制性的实施方案方面描述了本发明构思的组合物和方法，但是对于本领域技术人员将明显的是，可以对本文描述的组合物和/或方法以及在本文描述的步骤或步骤的顺序上应用变化，而不脱离本文公开和/或要求保护的发明构思的概念、精神和范围。对于本领域技术人员明显的所有这样的类似替代和修改被认为在由所附权利要求限定的本发明构思的精神、范围和概念内。

如根据本公开内容所使用的，除非另有说明，以下术语应理解为具有以下含义：

当在权利要求和/或说明书中与术语“包括/包含”结合使用时，词语“一个”或“一种”的使用可以抑制“一个/一种”，但是它也与“一个或多个/一种或多种”、“至少一个/至少一种”和“一个或多于一个/一种或多于一种”的含义相一致。除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。因此，例如，提及“一个/一种化合物”可以指1个或多个/1种或多种、2个或更多个/2种或更多种、3个或更多个/3种或更多种、4个或更多个/4 种或更多种或更多数量的化合物。术语“多个/多种”是指“两个或更多个/两种或更多种”。权利要求中的术语“或”的使用用于表示“和 /或”，除非明确指出仅指代备选物或备选物是相互排斥的，尽管公开内容支持仅指备选物和“和/或”的定义。在本申请中，术语“约”用于指示值包括设备、用于测定该值的方法的固有误差变化或研究受试者之间存在的变化。例如但不限于，当使用术语“约”时，指定值可以从指定值变化±20％、或±10％、或±5％、或±1％、或±0.1％，因为这些变化适于执行所公开的方法并且是如本领域普通技术人员所理解的。术语“至少一个/种”的使用将被理解为包括一个/种以及多于一个/种的任何数量，包括但不限于2、3、4、5、10、15、20、30、40、 50、100个/种等。根据其所连接的术语，术语“至少一个/种”可延伸至100或1000个/种或更多；此外，100/1000的量不被认为是限制性的，因为更高的限度也可能产生令人满意的结果。此外，术语“X、Y 和Z中的至少一个”的使用将被理解为包括单独的X，单独的Y和单独的Z，以及X、Y和Z的任何组合。序数术语(即，“第一”，“第二”，“第三”，“第四”等)的使用仅用于区分两个或更多个项目的目的，而不意味着暗示一个项目相对另一个的任何序列或顺序或重要性或例如任何添加顺序。

如在本说明书和权利要求中所使用的，术语“包括”(以及任何形式的“包括”，诸如“包括的”和“被包括”)、“具有”(以及任何形式的“具有”，诸如“具有的”和“被具有”)、“包含”(以及“包含”的任何形式，诸如“包含的”和“被包含”)或“含有” (以及任何形式的“含有”，诸如“含有的”和“被含有”)是包含性或开放式的，并且不排除另外的未记载的元素或方法步骤。

如本文所用的术语“或其组合”是指在术语之前列出的项目的所有排列和组合。例如，“A、B、C或其组合”旨在包括A、B、C、 AB、AC、BC或ABC中的至少一个，并且如果顺序在特定上下文中是重要的，还包括CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续该实例，明确包括的是含有一个或多个项目或项目的重复的组合(例如BB，AAA，AAB，BBC，AAABCCCC，CBBAAA，CABABB等)。本领域技术人员将理解，对于任何组合中的项目或项目的数量通常没有限制，除非另外地根据上下文是明显的。

如本文所使用的，术语“基本上”是指随后描述的事件或情况完全发生或者随后描述的事件或情况在很大范围或程度上发生。例如，术语“基本上”是指随后描述的事件或情况在至少90％的时间、或至少95％的时间、或至少98％的时间发生。

如本文所用，“现行良好制备实践”或“cGMP”是指由美国食品和药物管理局(FDA)或非美国国家的等效监管机构强制执行的现行良好制备实践规程。cGMP规程提供了确保生产过程和设施的正确设计、监控和控制的系统。遵守cGMP规程通过要求药物制备商充分控制制备操作来确保药物产品的特性、强度、质量和纯度。这包括建立强大的质量管理体系，获得适当的质量原材料，建立强健的操作程序，检测和调查产品质量偏差，以及维护可靠的测试实验室。

如本文所用，术语“离体扩增”或“扩增”是指在组织培养中生长细胞群体以增加该群体中细胞数目的方法。已经经历离体扩增的细胞称为“扩增的”。

如本文所用，术语“岩藻糖基化”是指在增加细胞结合选择素的能力或增加细胞与本领域已知的结合sLeX的抗体(包括但不限于 HECA-452单克隆抗体)的反应性的条件下用α1,3-岩藻糖基转移酶和岩藻糖供体对细胞群体的处理。已经用α1,3-岩藻糖基转移酶和岩藻糖供体处理并随后表现出与选择素或与HECA-452单克隆抗体或与 sLeX特异性的另一抗体的增加的结合的细胞被称为“岩藻糖基化”。如本文所用，“岩藻糖基化”还可以指存在于细胞群体上的sLeX的水平。

如本文所用，术语“造血干细胞和祖细胞”或“HSPC”是指来源于骨髓、脐带血或动员外周血的细胞群，其用于重建患者的造血系统。如本文所用，术语“造血干细胞和祖细胞”或“HSPC”包括 carlecortemcel-L。

如本文所用，术语“间充质基质细胞”或“MSC”是指满足2006 年由国际细胞治疗学会(ISCT)设定的定义的细胞：(1)对塑料的粘附，(2)表达CD73、CD90和CD105抗原，而是CD14、CD34、 CD45和HLA-DR阴性，和(3)分化为成骨、软骨形成和脂肪形成谱系的能力(Dominici等人(2006)Cytotherapy,8:315-317)。如本文所用，“间充质基质细胞”或“MSC”与“间充质干细胞”同义，因此所述术语在本文中可互换使用。如本文所用，“MSC”可以单数或复数使用。如本文所用，“间充质基质细胞”或“MSC”可源自任何组织，包括但不限于骨髓，脂肪组织，羊水，子宫内膜，滋养层来源的组织，脐带血，脐带胶质和胎盘。如本文所用，“间充质基质细胞”或“MSC”包括在从组织初始分离后为CD34阳性但在扩增后满足 ISCT标准的细胞。本文所用的“MSC”包括使用选自包括NGF-R、 PDGF-R、EGF-R、IGF-R、CD29、CD49a、CD56、CD63、CD73、 CD105、CD106、CD140b、CD146、CD271、MSCA-1、SSEA4、STRO-1 和STRO-3或其任何组合的组的细胞表面标志物从组织分离并且在扩增之前或之后满足ISCT标准的细胞。如本文所用，“间充质基质细胞”或“MSC”包括在文献中被描述为下述细胞的细胞：骨髓基质干细胞(BMSSC)、骨髓分离的成体多能诱导型细胞(MIAMI)、多能成体祖细胞(MAPC)、间充质成体干细胞(MASCS)、 MULTISTEM

(Athersys，Inc.，Cleveland，OH)、PROCHYMAL

(Osiris Therapeutics，Inc.，Columbia，MD)、remestemcel-L、间充质前体细胞(MPC)、牙髓干细胞(DPSC)、PLX细胞、PLX-PAD、 ALLOSTEM

(Allosource,Centennial,CO)、ASTROSTEM

(Osiris Therapeutics,Inc.,Columbia,MD)、Ixmyelocel-T、MSC-NTF、 NurOwn^TM(Brainstorm Cell Therapeutics Inc.,Hackensack,NJ)、 STEMEDYNE^TM-MSC(StemedicaCell Technologies Inc.,San Diego, CA)、STEMPEUCEL

(Stempeudics Research,Bangalore,India)、 StempeucelCLI、StempeucelOA、HiQCell、Hearticellgram-AMI、REVASCOR

(Mesoblast,Inc.,Melbourne,Australia)、 CARDIOREL

(Reliance LifeSciences,Navi Mumbai,India)、 CARTISTEM

(Medipost,Rockville,MD)、PNEUMOSTEM

(Medipost,Rockville,MD)、PROMOSTEM

(Medipost,Rockville, MD)、Homeo-GH、AC607、PDA001、SB623、CX601、AC607、子宫内膜再生细胞(ERC)、使用CELUTION

系统(CytoriTherapeutics, Inc.,San Diego,CA)获得的脂肪来源的干细胞和再生细胞(ADRC)、血管周来源的细胞和周细胞来源的细胞。如本文所用，“间充质基质细胞”或“MSC”包括当在一组条件下培养时仅满足一个或多个ISCT 标准但当在含有10％胎牛血清的组织培养基的存在下在塑料组织培养瓶上培养时满足全套ISCT标准的细胞。

如本文所用，术语“肌肉干细胞”是指源自肌肉的细胞群，包括横纹肌、平滑肌、心肌、肌卫星细胞或经重编程以形成肌肉的骨髓细胞。如本文所用，术语“肌肉干细胞”包括MyoCell

(Bioheart，Inc.， Sunrise，FL)，MyoCell

SDF-1，C3BS-CQR-1和CAP-1002。

如本文所用，“天然杀伤细胞”或“NK”细胞是指缺乏CD3并表达CD56和/或NKp46的细胞群体。

如本文所用，“神经干细胞”或“NSC”是指能够分化成神经细胞或神经胶质细胞的细胞群。如本文所用，术语“神经干细胞”包括 Q-Cells

(Q Therapeutics Inc.,SaltLake City,UT),NSI-566, HuCNS-SC

(Stem Cells,Inc.,Newark,CA)，和ReN001。

如本文所用，“患者”广义地用于指需要治疗性细胞以改善病况、疾病或损伤的任何动物。动物可以是哺乳动物、鸟、鱼、爬行动物或任何其它动物。哺乳动物的一些非限制性实例包括人和其它灵长类动物、马科动物例如马、牛科动物例如母牛、绵羊类动物(ovine)例如绵羊、山羊类动物(caprine)例如山羊、犬例如狗、猫科动物例如猫、啮齿动物例如小鼠或大鼠以及其它哺乳动物如兔、豚鼠等。

如本文所用，“生理平衡盐溶液”是指其中调节盐和其它组分的浓度以使得溶液或培养基与人类细胞等渗的溶液或培养基，其中同渗浓度约为280至310mOsmol/L，并且处于生理pH(约pH 7.3-7.4)。生理平衡盐溶液的实例包括但不限于Hank碱性盐溶液，α最低必需培养基(αMEM)，Dulbecco最低必需培养基(DMEM)，Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)和PlasmaLyte溶液例如PlasmaLyte A。

如本文所用，“治疗性细胞”是指改善患者的病况、疾病和/或损伤的扩增的细胞群体。治疗性细胞可以是自体的(即来源于患者)、同种异体的(即来源于相同物种的与患者不同的个体)或异种的(即来源于与患者不同的物种)。治疗性细胞可以是同质的(即由单个细胞类型组成)或异质的(即由多种细胞类型组成)。术语“治疗性细胞”包括治疗性活性细胞以及能够分化成治疗性活性细胞的祖细胞。

现在描述本文公开和/或要求保护的发明构思，其一个实施方案通常涉及制备用α1,3-岩藻糖基转移酶和岩藻糖供体处理的并且与其非岩藻糖基化对应物相比在体内施用时显示增强的迁移和植入的治疗性细胞的组合物和方法。

本文公开和/或要求保护的发明构思的实施方案还涉及在美国 (US)食品和药物管理局(FDA)或非美国国家的等效监管机构强制执行的现行良好制备实践(cGMP)规程下制备和任选冷冻保存治疗性细胞的可能性的商业提供。治疗性细胞可用于治疗多种疾病和病症，包括但不限于缺血性病症(例如肢体缺血，充血性心力衰竭，心脏缺血，肾脏缺血和ESRD，中风和眼睛缺血)，需要器官或组织再生的病况(例如肝、胰腺、肺、唾液腺、血管、骨、皮肤、软骨、腱、韧带、脑、毛、肾、肌肉、心肌、神经和肢体的再生)，炎性疾病(例如，心脏病，糖尿病，脊髓损伤，类风湿性关节炎，骨关节炎，由髋关节置换或翻修引起的炎症，克罗恩病和移植物抗宿主病)，自身免疫疾病(例如1型糖尿病，牛皮癣，系统性红斑狼疮，多发性硬化)，退行性疾病，先天性疾病血液系统病症，例如贫血，中性粒细胞减少症，血小板增多症，骨髓增生性疾病或血液肿瘤和癌症如白血病和淋巴瘤。

本文公开和/或要求保护的发明构思的实施方案通常涉及制备和/ 或储存岩藻糖基化细胞群体的组合物和方法，更具体地但不限于涉及从骨髓、脐带血、脐带、脐带胶质、外周血、淋巴组织、子宫内膜、滋养层来源的组织、胎盘、羊水、脂肪组织、肌肉、肝、软骨、神经组织、心脏组织、牙髓组织、脱落的牙齿分离的治疗性细胞、源自胚胎干(ES)细胞或诱导多能干(iPS)细胞的细胞或其任何组合。

在特定的非限制性实施方案中，分离的治疗性细胞是分化的胚胎干细胞和/或分化的诱导多能干细胞。

特别地，本文公开和/或要求保护的发明构思的一个实施方案涉及大量生产这样的细胞、用有效量的α1,3-岩藻糖基转移酶和岩藻糖供体 (例如α1,3-岩藻糖基转移酶VI或α1,3-岩藻糖基转移酶VII连同岩藻糖供体GDP-岩藻糖)处理细胞、然后任选地在解冻细胞后保持由酶处理产生的细胞表面岩藻糖基化水平增加的条件下将它们冷冻保存的方法。

本文公开和/或要求保护的发明构思也可以用于兽医目的，因为在人和动物之间在选择素配体的岩藻糖基化后增强与选择素的结合中所牵涉的机制之间存在并行性。

在本文考虑的方法中，岩藻糖基转移酶可以选自包括下列的组：α1,3-岩藻糖基转移酶III，α1,3-岩藻糖基转移酶IV，α1,3-岩藻糖基转移酶V，α1,3-岩藻糖基转移酶VI，α1,3-岩藻糖基转移酶VII，α1,3- 岩藻糖基转移酶IX，α1,3-岩藻糖基转移酶X和α1,3-岩藻糖基转移酶XI，或其任何组合。岩藻糖供体可以是例如GDP-岩藻糖。

在一个实施方案中，本文公开和/或要求保护的发明构思包括制备岩藻糖基化治疗性细胞的方法，包括以下步骤：在组织培养中提供一定量的治疗性细胞或分离治疗性细胞，扩增治疗性细胞，通过使其在体外与有效量的α1,3-岩藻糖基转移酶和岩藻糖供体接触来岩藻糖基化该治疗性细胞数量或群体。岩藻糖基化的治疗性细胞具有增强的与 P-选择素或E-选择素的结合。岩藻糖基化的治疗性细胞可任选地进一步在解冻细胞后保持与P-选择素或E-选择素的增强的结合的条件下冷冻保存。

在另一个非限制性实施方案中，本文公开和/或要求保护的发明构思包括冷冻保存岩藻糖基化治疗性细胞的方法。在该方法中，分离治疗性细胞并通过使其与有效量的α1,3-岩藻糖基转移酶和岩藻糖供体接触来岩藻糖基化治疗性细胞。然后将岩藻糖基化的治疗性细胞在包含生理平衡盐溶液和冷冻保护剂的治疗性细胞冷冻保存组合物中冷冻。

该方法可以进一步包括在岩藻糖基化之前扩增治疗性细胞的步骤。当细胞被扩增时，在特定的非限制性实施方案中，在其中细胞被冷冻的生理平衡盐溶液可以是在其中细胞被扩增的组织培养基。另外，生理平衡盐溶液还可以含有蛋白质。根据本文公开的和/或要求保护的发明构思可以利用的蛋白质的非限制性实例包括胎牛血清，马血清，人血清，人血小板裂解物，牛白蛋白，人白蛋白及其任何组合。

在特定的非限制性实施方案中，冷冻步骤包括将治疗性细胞在细胞冷冻保存组合物中以约1℃/分钟的速率从约37℃冷却至约-80℃，以产生冷冻细胞悬浮液，然后将冷冻细胞悬浮液转移至在液氮存在的情况下储存。另外或(备选地)，治疗性细胞可使用玻璃化方法冷冻。

在特定的非限制性实施方案中，将粘附细胞首先从其上生长它们的组织培养塑料或微珠或其它基底上移除，用α1,3-岩藻糖基转移酶和岩藻糖供体处理，然后任选地冷冻保存。本文公开和/或要求保护的发明构思的令人惊讶的发现是，与在附着于组织培养塑料时岩藻糖基化细胞然后用胰蛋白酶移除它们相比，通过暴露于胰蛋白酶将细胞从组织培养塑料和其它基底移除然后进行岩藻糖基化是更有效的方法。

在特定的非限制性实施方案中，所述方法在cGMP条件下进行。

在一个特定的非限制性实施方案中，本文公开的和/或要求保护的发明构思的治疗性细胞是从骨髓、脐带血、脐带、脐带胶质、外周血、淋巴组织、子宫内膜、滋养层来源的组织、胎盘、羊水、脂肪组织、肌肉、肝、软骨、神经组织、心脏组织、牙髓组织、脱落的牙齿分离的细胞、源自胚胎干(ES)细胞或诱导多能干(iPS)细胞的细胞或其任何组合。

在一个特定的非限制性实施方案中，本文公开和/或要求保护的发明构思的治疗性细胞选自造血干细胞、免疫细胞、间充质干细胞、肌细胞、羊水细胞、子宫内膜细胞、神经干细胞、自然杀伤(NK)细胞、 T细胞、B细胞或其任何组合。例如但不限于，治疗性细胞可以是T 细胞(包括但不限于调节性T细胞和细胞毒性T细胞(例如但不限于 CD8+细胞毒性T细胞))、NK细胞、B细胞、CD38+细胞、神经干细胞或其任何组合，其中所述细胞通过岩藻糖基转移酶VII(FT VII) 进行岩藻糖基化。本文公开和/或要求保护的发明构思的一个令人惊讶的发现是，一些细胞优先被FT VII而非FT VI岩藻糖基化。考虑到酶的体外岩藻糖供体特异性-FucT-Ⅵ对中性和3'-唾液酸化的岩藻糖供体均有活性，而FucT-VII仅作用于3'-唾液酸化的2型链，这是出乎意料的。因此，可以预先预期FTVI会岩藻糖基化细胞至与FTVII 大致相同的程度；这对于一些细胞被观察到而对于其它细胞则未观察到。

在本文公开和/或要求保护的发明构思的一个实施方案中，将已扩增的造血细胞与未扩增的岩藻糖基化造血细胞混合。本文公开和/或要求保护的发明构思的令人惊讶的发现是，岩藻糖基化和非岩藻糖基化的扩增的造血细胞的混合物比单独使用的任一群体更有效。

在本文公开和/或要求保护的发明构思的一个实施方案中，自然杀伤细胞被扩增，然后被岩藻糖基化。在本申请的申请之前，既没有描述也没有暗示自然杀伤细胞可以离体地被岩藻糖基化。

在本文公开和/或要求保护的发明构思之前，既没有描述也没有暗示开发岩藻糖基化治疗性细胞的冷冻保存方法。此外，本发明人令人惊讶地发现，通过遵循本文公开和/或要求保护的发明构思的冷冻保护方法，在冷冻保存后回收具有高保留的岩藻糖基化的治疗性细胞。

在一个实施方案中，本发明公开的和/或要求保护的发明构思包括处理治疗性细胞的方法，包括如下步骤：提供/分离一定量或群体的治疗性细胞，在组织培养中扩增治疗性细胞，用α1,3-岩藻糖基转移酶和岩藻糖供体体外处理所述量或群体的治疗性细胞，其中经处理的治疗性细胞具有增强的与P-选择素和E-选择素的结合，然后任选地冷冻保存所述细胞。此外，治疗性细胞通常特征在于包含不有效结合P-选择素或E-选择素的P-选择素糖蛋白配体-1(PSGL-1)、CD44和/或其它选择素配体。在如本文所述的岩藻糖基化之前的处于其未处理状态的治疗性细胞在发炎、缺血或受损组织中的保留减少。

在本文公开和/或要求保护的发明构思的一个特定的非限制性实施方案中，治疗性细胞源自包括以下的列表：骨髓、脐带血、脐带、脐带胶质、外周血、淋巴组织、子宫内膜、滋养层来源的组织、胎盘、羊水、脂肪组织、肌肉、肝、软骨、神经组织、心脏组织、牙髓组织和脱落的牙齿，尽管它们可来源于在组织培养中生长的细胞或者是源自胚胎干(ES)细胞或诱导多能干(iPS)细胞的细胞。治疗性细胞还可以是上述的任何组合。

在本文公开和/或要求保护的发明构思的一个特定的非限制性实施方案中，治疗性细胞在cGMP条件下扩增。

如上所述，在本文所述的岩藻糖基化处理后，与未处理的治疗性细胞相比，经处理的治疗性细胞具有增强的与P-选择素或E-选择素的结合。增强的与P-选择素(或E-选择素)的结合被定义为至少10％的经处理的治疗性细胞在P-选择素(或分别地E-选择素)结合测定中具有大于预定的荧光阈值(如下所定义)的荧光。在另一个实施方案中，至少25％的经处理的治疗性细胞超过预定的荧光阈值。在另一个实施方案中，至少50％的经处理的治疗性细胞超过预定的荧光阈值。在另一个实施方案中，至少75％的经处理的治疗性细胞超过预定的荧光阈值。在另一个实施方案中，至少90％的经处理的治疗性细胞超过预定的荧光阈值。在另一个实施方案中，至少95％的经处理的治疗性细胞超过预定的荧光阈值。

本发明公开的和/或要求保护的发明构思进一步涉及通过下述方法产生的治疗性细胞产物，该方法包括以下步骤：提供一定量或群体的细胞，在组织培养中扩增细胞，和用α1,3-岩藻糖基转移酶和岩藻糖供体体外处理所述量的治疗性细胞，其中大部分经处理的治疗性细胞具有如本文所述的增强的与P-选择素(或E-选择素)的结合，并任选地冷冻保存所述细胞。细胞的量可以来源于，例如但不限于，骨髓、脐带血、脐带、脐带胶质、外周血、淋巴组织、子宫内膜、滋养层来源的组织、胎盘、羊水、脂肪组织、肌肉、肝、软骨、神经组织、心脏组织、牙髓组织、脱落的牙齿，尽管它们可来源于在组织培养中生长的细胞或者是源自胚胎干(ES)细胞或诱导多能干(iPS)细胞的细胞。治疗性细胞还可以是上述的任何组合。

在一个实施方案中，本发明公开的和/或要求保护的发明构思包括处理治疗性细胞的方法，包括提供一定量或群体的治疗性细胞，其缺乏或具有减少表达的(低于CD38的正常表达水平)表面蛋白CD38，并且用α1,3-岩藻糖基转移酶和岩藻糖供体体外处理所述量或群体的治疗性细胞，其中这样处理的治疗性细胞具有超过未处理的治疗性细胞的增强的与P-选择素或E-选择素的结合。此外，未处理的治疗性细胞通常特征在于主要包含不充分结合P-选择素或E-选择素的 PSGL-1、CD44和/或其它选择素配体，或治疗性细胞可能缺乏任何选择素配体的表达。在治疗性细胞上出现的PSGL-1或其它选择素配体缺少或具有减少数目的岩藻糖基化聚糖，例如O-聚糖，并且可以例如具有PSGL-1，其具有包含NeuAcα2,3Galβ1,4GlcNAc但缺少至 GlcNAc的α1,3键联中的岩藻糖的核心-2O-聚糖。治疗性细胞在岩藻糖基化之前的未处理状态具有降低的针对骨髓或表达选择素的其它期望位点的归巢能力。在一个特定的非限制性实施方案中，治疗性细胞源自包括以下的列表：骨髓、脐带血、脐带、脐带胶质、外周血、淋巴组织、子宫内膜、滋养层来源的组织、胎盘、羊水、脂肪组织、肌肉、肝、软骨、神经组织、心脏组织、牙髓组织、脱落的牙齿，尽管它们可来源于源自胚胎干(ES)细胞或诱导多能干(iPS)细胞的生长的细胞，以及它们的特征在于需要或受益于进一步的岩藻糖基化以增强其骨髓归巢能力。在本文考虑的方法中，α1,3-岩藻糖基转移酶可以是例如α1,3-岩藻糖基转移酶IV、α1,3-岩藻糖基转移酶VI或α1,3- 岩藻糖基转移酶VII。岩藻糖供体可以是例如GDP-岩藻糖。

在一个实施方案中，本公开的和/或要求保护的发明构思考虑了包含在cGMP-顺从性条件下生长的细胞群的经处理的治疗性细胞的组合物，其中所述经处理的细胞包含被适当岩藻糖基化(例如，包含唾液酸化的Lewis X)并且能够结合P-选择素(或E-选择素)的PSGL-1 或其它选择素配体。经处理的治疗性细胞可以置于药学上可接受的载体或媒介物中以用于储存或施用至患者。任选地，经处理的治疗性细胞可以在施用至患者之前冷冻保存用于储存。

在特定的非限制性实施方案中，治疗性细胞选自包括下列的列表：在cGMP-顺从性条件下扩增的脐带血造血细胞，在cGMP-顺从性条件下扩增的骨髓来源的细胞，在cGMP-顺从性条件下扩增的脐带血来源细胞，在cGMP-顺从性条件下扩增的间充质基质细胞，在cGMP- 顺从性条件下扩增的神经干细胞，在cGMP-顺从性条件下扩增的肝细胞，在cGMP-顺从性条件下扩增的天然杀伤细胞，和在cGMP-顺从性条件下扩增的T细胞。

在一个实施方案中，治疗性细胞在cGMP-顺从性条件下扩增，在保持岩藻糖基化的最佳水平的条件下冷冻保存，然后在递送至患者之前解冻和岩藻糖基化。

在一个特定的非限制性实施方案中，治疗性细胞在cGMP-顺从性条件下扩增，经岩藻糖基化，然后在细胞解冻后保持岩藻糖基化的最佳水平的条件下冷冻保存。

在一个特定的非限制性实施方案中，在cGMP-顺从性条件下扩增的骨髓来源的细胞选自包括以下的列表：AMR-001

(Amorcyte,Inc., Allendale,NJ)ALD-301，ALD-201，ALD-401，在Notch配体Delta1 的存在下扩增的骨髓来源的细胞，和在MSC的存在下扩增的骨髓来源的细胞。

在特定的非限制性实施方案中，在cGMP-顺从性条件下扩增的脐带血来源的细胞选自包括以下的列表：NiCord

(Gamida Cell Ltd., Jerusalem,Israel)，Hemacord，ProHema，在Notch配体Delta1的存在下扩增的脐带血来源的细胞，和在MSC的存在下扩增的脐带血来源的细胞。

在特定的非限制性实施方案中，在cGMP-顺从性条件下扩增的间充质基质细胞选自包括以下的列表：MULTISTEM

(Athersys,Inc., Cleveland,OH),PROCHYMAL

(OsirisTherapeutics,Inc., Columbia,MD),remestemcel-L，间充质前体细胞(MPC)，牙髓干细胞(DPSC)，PLX细胞，PLX-PAD，ALLOSTEM

(Allosource, Centennial,CO),ASTROSTEM

(Osiris Therapeutics,Inc., Columbia,MD),Ixmyelocel-T,MSC-NTF,NurOwn^TM(Brainstorm Cell Therapeutics Inc.,Hackensack,NJ),STEMEDYNE^TM-MSC (StemedicaCell Technologies Inc.,San Diego,CA),STEMPEUCEL

(Stempeudics Research,Bangalore,India),StempeucelCLI, StempeucelOA,HiQCell,Hearticellgram-AMI,REVASCOR

(Mesoblast,Inc.,Melbourne,Australia)CARDIOREL

(Reliance LifeSciences,Navi Mumbai,India),CARTISTEM

(Medipost, Rockville,MD),PNEUMOSTEM

(Medipost,Rockville,MD), PROMOSTEM

(Medipost,Rockville,MD),Homeo-GH,AC607,PDA001,SB623,CX601,AC607，子宫内膜再生细胞(ERC)，和使用CELUTION

系统(CytoriTherapeutics,Inc.,San Diego,CA)获得的脂肪来源的干细胞和再生细胞(ADRC)。

在特定的非限制性实施方案中，在cGMP-顺从性条件下扩增的神经干细胞选自包括以下的列表：NSI-566,HuCNS-SC

(Stem Cells, Inc.,Newark,CA),CTX0E03,ReN001,ReN009, STEMEDYNE^TM-NSC(Stemedica Cell Technologies Inc.,San Diego, CA),Q-CELLS

(Q Therapeutics Inc.,Salt Lake City,UT),TBX-01, TBX-02,RhinoCyte^TM嗅觉干细胞(RhinoCyte Inc.，Louisville，KY)， MOTORGRAFT

(California Stem Cell，Inc.，Irvine，CA)和 CellBeads^TMNeuro。

在特定的非限制性实施方案中，在cGMP-顺从性条件下扩增的心脏来源的细胞是心脏来源的干细胞(CDC)。

在特定的非限制性实施方案中，在cGMP-顺从性条件下扩增的肝细胞是hpSC-来源的肝细胞、异源人成体肝祖细胞(HHALPC)、hLEC 和PROMETHERA

HepaStem(PrometheraBiosicences SA/NV， Belgium)。

在一个实施方案中，经处理的治疗性细胞的组合物包含具有增强的与P-选择素(或E-选择素)的结合的在cGMP-顺从性条件下扩增的人HSPC群体。增强的与P-选择素(或E-选择素)的结合被定义为至少10％的经处理的HSPC在P-选择素结合测定(或分别地E-选择素结合测定)中具有大于预定的荧光阈值的荧光。在另一个实施方案中，至少25％的经处理的HSPC超过预定的荧光阈值。在另一个实施方案中，至少50％的经处理的HSPC超过预定的荧光阈值。在另一个实施方案中，至少75％的经处理的HSPC超过预定的荧光阈值。在另一个实施方案中，至少90％的经处理的HSPC超过预定的荧光阈值。在另一个实施方案中，至少95％的经处理的HSPC超过预定的荧光阈值。人HSPC的组合物可以置于药学上可接受的载体或媒介物中用于储存或用于施用至受试者。

在一个实施方案中，经处理的治疗性细胞的组合物包含具有增强的与P-选择素(或E-选择素)的结合的在cGMP-顺从性条件下扩增的人MSC群体。增强的与P-选择素(或E-选择素)的结合被定义为至少10％的经处理的MSC在P-选择素结合测定(或分别地E-选择素结合测定)中具有大于预定的荧光阈值的荧光。在另一个实施方案中，至少25％的经处理的MSC超过预定的荧光阈值。在另一个实施方案中，至少50％的经处理的MSC超过预定的荧光阈值。在另一个实施方案中，至少75％的经处理的MSC超过预定的荧光阈值。在另一个实施方案中，至少90％的经处理的MSC超过预定的荧光阈值。在另一个实施方案中，至少95％的经处理的MSC超过预定的荧光阈值。人MSC的组合物可以置于药学上可接受的载体或媒介物中用于储存或用于施用至受试者。

在一个实施方案中，经处理的治疗性细胞的组合物包含具有增强的与P-选择素(或E-选择素)的结合的在cGMP-顺从性条件下扩增的人神经干细胞群体。增强的与P-选择素(或E-选择素)的结合被定义为至少10％的经处理的神经干细胞在P-选择素结合测定(或分别地 E-选择素结合测定)中具有大于预定的荧光阈值的荧光。在另一个实施方案中，至少25％的经处理的神经干细胞超过预定的荧光阈值。在另一个实施方案中，至少50％的经处理的神经干细胞超过预定的荧光阈值。在另一个实施方案中，至少75％的经处理的神经干细胞超过预定的荧光阈值。在另一个实施方案中，至少90％的经处理的神经干细胞超过预定的荧光阈值。在另一个实施方案中，至少95％的经处理的神经干细胞超过预定的荧光阈值。人神经干细胞的组合物可以置于药学上可接受的载体或媒介物中用于储存或用于施用至受试者。

在一个实施方案中，经处理的治疗性细胞的组合物包含具有增强的与P-选择素(或E-选择素)的结合的在cGMP-顺从性条件下扩增的人肝细胞群体。增强的与P-选择素(或E-选择素)的结合被定义为至少10％的经处理的肝细胞在P-选择素结合测定(或分别地E-选择素结合测定)中具有大于预定的荧光阈值的荧光。在另一个实施方案中，至少25％的经处理的肝细胞超过预定的荧光阈值。在另一个实施方案中，至少50％的经处理的肝细胞超过预定的荧光阈值。在另一个实施方案中，至少75％的经处理的肝细胞超过预定的荧光阈值。在另一个实施方案中，至少90％的经处理的肝细胞超过预定的荧光阈值。在另一个实施方案中，至少95％的经处理的肝细胞超过预定的荧光阈值。人肝细胞的组合物可以置于药学上可接受的载体或媒介物中用于储存或用于施用至受试者。

在一个实施方案中，经处理的治疗性细胞的组合物包含具有增强的与P-选择素(或E-选择素)的结合的在cGMP-顺从性条件下扩增的人NK细胞群体。增强的与P-选择素(或E-选择素)的结合被定义为至少10％的经处理的NK细胞在P-选择素结合测定(或分别地E-选择素结合测定)中具有大于预定的荧光阈值的荧光。在另一个实施方案中，至少25％的经处理的NK细胞超过预定的荧光阈值。在另一个实施方案中，至少50％的经处理的NK细胞超过预定的荧光阈值。在另一个实施方案中，至少75％的经处理的NK细胞超过预定的荧光阈值。在另一个实施方案中，至少90％的经处理的NK细胞超过预定的荧光阈值。在另一个实施方案中，至少95％的经处理的NK细胞超过预定的荧光阈值。人NK细胞的组合物可以置于药学上可接受的载体或媒介物中用于储存或用于施用至受试者。

在一个实施方案中，经处理的治疗性细胞的组合物包含具有增强的与P-选择素(或E-选择素)的结合的在cGMP-顺从性条件下扩增的人T细胞(例如但不限于调节性T细胞和细胞毒性T细胞(例如但不限于CD8+细胞毒性T细胞细胞))群体。增强的与P-选择素(或E-选择素)的结合被定义为至少10％的经处理的T细胞在P-选择素结合测定(或分别地E-选择素结合测定)中具有大于预定的荧光阈值的荧光。在另一个实施方案中，至少25％的经处理的T细胞超过预定的荧光阈值。在另一个实施方案中，至少50％的经处理的T细胞超过预定的荧光阈值。在另一个实施方案中，至少75％的经处理的T细胞超过预定的荧光阈值。在另一个实施方案中，至少90％的经处理的T 细胞超过预定的荧光阈值。在另一个实施方案中，至少95％的经处理的T细胞超过预定的荧光阈值。人T细胞的组合物可以置于药学上可接受的载体或媒介物中用于储存或用于施用至受试者。

在一个实施方案中，预定荧光阈值通过首先获得治疗性细胞的样品来确定。使用本文其它地方描述的P-选择素结合测定(或E-选择素结合测定)或通过本领域已知的任何其它P-选择素荧光结合测定(或分别地E-选择素结合测定)或通过用HECA-452抗体染色来测定治疗性细胞的该对照(基线)样品。测量对照(基线)样品中的治疗性细胞的P-选择素(或E-选择素或HECA-452)结合荧光水平。在一个实施方案中，选择超过对照样品中至少95％的治疗性细胞的P-选择素 (或E-选择素或HECA-452)结合荧光水平的荧光值。所选择的荧光值被指定为经处理的(即岩藻糖基化的)治疗性细胞的P-选择素(或 E-选择素或HECA-452)结合荧光针对其进行比较的预定的荧光阈值。

本文公开和/或要求保护的发明构思还考虑了通过下述方法产生的治疗性细胞产品，所述方法提供一定量或群体的治疗性细胞并在体外用α1,3-岩藻糖基转移酶和岩藻糖供体处理所述量的治疗性细胞，其中大多数经处理的治疗性细胞结合P-选择素(或E-选择素或 HECA-452)。治疗性细胞的量可以来源于骨髓，但也可来源于脐带血、脐带、外周血、淋巴组织、脂肪组织、神经组织、肌肉、胎盘、羊水、子宫内膜、肝，或它们可以来源于源自胚胎干(ES)细胞或诱导多能干(iPS)细胞的细胞。治疗性细胞还可以是上述的任何组合。

一般来说，本文公开的和/或要求保护的发明构思考虑了在cGMP 条件下制备治疗性细胞的方法，其中在治疗性细胞上表达的非功能性或亚最佳功能性PSGL-1或其它选择素配体通过体外α1,3-岩藻糖基化技术修饰以矫正归巢缺陷，这改善其在细胞治疗中的应用。

如先前所解释的，治疗性细胞可表达PSGL-1或其它选择素配体，但显著的量不结合P-选择素(或E-选择素)或仅结合少量的P-选择素(或分别地E-选择素)。PSGL-1是在几乎所有白细胞包括CD34+ 细胞上表达的同二聚体粘蛋白。为了发挥功能，即能够结合P-选择素或E-选择素，PSGL-1需要导致在其上形成sLex基团的几个翻译后修饰，包括α1,3-岩藻糖基化。例如，不足的α1,3-岩藻糖基化导致幼稚 T细胞与血管选择相互作用的能力受损。在本文公开和/或要求保护的发明构思中，已经发现治疗性细胞不能结合P-选择素或E-选择素粘附分子可以在cGMP条件下扩增后在冷冻保存之前或之后用离体岩藻糖基化进行矫正。考虑到随着扩增(例如，Kallinikou等人，Menard 等人，Feneke等人(其各自已并入上文))和冷冻保存(例如，Faint 等人，Koenigsmann等人，Hattori等人，Campbell等人，Aoyagi等人，Mareschi等人和Neuhuber等人(其各自已并入上文))而下调的粘附分子的数量，这是令人惊讶的发现。

因此，本文公开和/或要求保护的发明构思的基础是用α1,3-岩藻糖基转移酶和岩藻糖供体(例如，与GDP-岩藻糖一起的FT-VI或 FT-VII)对治疗性细胞的体外处理(这还催化sLex结构的合成)将增加PSGL-1或其它选择素配体的岩藻糖基化，从而即使在cGMP培养物中的大规模扩增后也矫正治疗性细胞的归巢缺陷。本文公开和/ 或要求保护的发明构思的另一个基础是岩藻糖基化的细胞可以被冷冻保存并在解冻后保持其岩藻糖基化水平。

能够转移α1,3键联中的岩藻糖至GlcNAc的岩藻糖基转移酶是本领域熟知的。几种是可商购获得的，例如来自R&D Systems (Minneapolis，MN)。此外，至少八种不同类型的α1,3-岩藻糖基转移酶(FTIII-VII)由人类基因组编码。这些包括：Lewis酶(FTIII)，其可以转移α(1,3)或α(1,4)岩藻糖至Galβ4GlcNAc或Galβ3GlcNAc (Kukowska-Latallo等人(1990)Genes Dev.,4:1288)；FTIV，其形成α(1,3)键联，其不偏好唾液酸化的前体(Goelz,等人(1989)Cell, 63:1349；Lowe,等人(1991)J.Biol.Chem.,266:17467)；FTV (Weston,等人(1992)J.Biol.Chem.,267:4152)和FTVI(Weston, 等人(1992)J.Biol.Chem.,267:24575)，其形成α(1,3)键联，其可以使唾液酸化或非唾液酸化的前体岩藻糖基化，和FTVII(Sasaki,等人 (1994)J.Biol.Chem.,269:14730；Natsuka,等人(1994)J.Biol.Chem.,269:16789)，其可以仅岩藻糖基化唾液酸化前体。FTIX优先将岩藻糖转移至聚乳糖胺链的非还原末端处的GlcNAc残基，导致末端Lex 结构，而其它α1,3FUT优先将Fuc转移至倒数第二个位置处的GlcNAc 残基，导致内部Lex结构(Nishihara等人(1999)FEBS Lett., 462:289–294)。FTX和FTXI将α-l-岩藻糖连接到伴白蛋白糖肽和双天线N-聚糖受体上，但不连接到短的乳糖胺基受体底物上(如经典的单外显子(monoexonic)α1,3-岩藻糖基转移酶所作用的)(Mollicone 等人(2009)J Biol Chem.,284:4723-38)。

FTIII的序列信息公开于GC19M005843；FTIV公开于 GC11P094277；FTV公开于GC19M005865；FTVI公开于 GC19M005830；FTVII公开于GC09M139924，FTIX公开于GC06P096463，FTX公开于GC08M033286和FTXI公开于 GC10P075532(GeneCards

(WeizmannInstitute of Science， Rehovot，Israel)是由Weizmann Institute维护的人类基因的可搜索的整合数据库，其提供关于所有已知和预测的人类基因的简明基因组相关信息以及到其它数据库的链接)。本文公开和/或要求保护的发明构思还考虑使用本领域普通技术人员已知的和可用的其它非人α1,3- 岩藻糖基转移酶，例如美国专利号6,399,337和6,461,835中所示的。

可以获得人HSPC用于用α1,3-岩藻糖基转移酶处理，例如通过与脐带血、外周血或骨髓来源中的其它细胞分离。可以使用本领域公知的各种技术来获得HSPC，包括但不限于密度梯度分离、红细胞的低渗裂解、离心淘析或使用荧光激活细胞分选仪(FACS)或磁珠分离装置利用单克隆抗体进行分离。单克隆抗体特别可用于鉴定与特定细胞谱系和/或分化阶段相关的标记物(表面膜蛋白)。抗体例如抗CD34 或抗CD133可以用于通过FACS或通过磁珠使用仪器如来自Miltenyi Biotec Inc.(Bergish Gladbach，Germany)的CliniMACS

系统在 cGMP-顺从性条件下分离HSPC。或者，可以使用试剂例如 ALDEFLUOR^TM(STEMCELLTechnologies，Inc.，Vancouver，BC) 分离HSPC，所述试剂在细胞中被醛脱氢酶(ALDH)氧化成带电的荧光产物，该产物在细胞中积累并允许通过FACS分离包括HSPC的亮荧光细胞。所采用的分离技术应使待收集的级分的存活性的保留最大化。所采用的具体技术将取决于分离效率、方法的细胞毒性、性能的容易性和速度、以及精密设备和/或技术技能的必要性。

经分离后，可以使用本领域已知的多种cGMP扩增方案(关于综述参见Tung等人(2010)Best Pract Res Clin Haematol.,23:245-57) 扩增HSPC。细胞可以在含有因子混合物的组织培养基中生长，所述混合物包括但不限于来自包括以下的因子的列表的一种或多种因子：由红细胞生成素，kit配体，G-CSF，GM-CSF，IL-6，IL-11，血小板生成素，flt配体，FGF-1，血管生成素样5，胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP2)，notch配体δ1，PIXY321，前列腺素E2，芳烃核受体蛋白质拮抗剂例如SR1，和四亚乙基五胺(TEPA)。细胞还可以在与MSC的共培养物中扩增，MSC被认为对HSPC的扩增产生有利的环境。在cGMP条件下的扩增可以在含有FBS的组织培养基中进行，但可以优选的是避免异种血清并使用无血清培养基，例如STEMLINE

培养基(StemLine Therapeutics，Inc.，New York，NY)， CellGro

培养基(MediaTech，Inc.，Manassas，VA)QBSF-60等。在某些实施方案中，在岩藻糖基化和输注到患者中之前，将细胞扩增 5-21天。所使用的岩藻糖基化程序如下所述。

可以获得人MSC用于用α1,3-岩藻糖基转移酶处理，例如通过与骨髓、脐带血、脐带胶质、脂肪组织、月经液、羊水或胎盘中的其它细胞分离。细胞来源可以是自体的、同种异体的或异种的。MSC可以从胚胎干细胞或诱导多能干细胞的培养物获得。取决于来源，可以采用本领域中已知的各种技术来获得MSC。对于源自其中MSC被捕获在基质中的来源(包括但不限于脐带胶质、脂肪组织和胎盘)的MSC，可以通过用蛋白水解酶处理来释放MSC，所述蛋白水解酶包括但不限于胶原酶、透明质酸酶、胰蛋白酶和分散酶。一旦MSC在单细胞混合物中分离后，它们可以通过本领域已知的方法与其它细胞类型分离，所述方法包括但不限于粘附于塑料、密度梯度分离、红血细胞的低渗裂解、离心淘析、如来自Kaneka的骨髓MSC分离装置中的结合至无纺纤维、或使用荧光激活细胞分选仪(FACS)或磁珠分离装置如来自Miltenyi Biotec Inc.(Bergish Gladbach，Germany)的CliniMACS

系统利用单克隆抗体进行分离。可用于这种分离的单克隆抗体包括但不限于抗NGF-R，抗PDGF-R，抗EGF-R，抗IGF-R，抗CD29，抗 CD49a，抗CD56，抗CD63，抗CD73，抗CD105，抗CD106，抗 CD140b，抗CD146，抗CD271，抗MSCA-1，抗SSEA4，抗STRO-1 和抗STRO-3。所采用的分离技术应使待收集的级分的存活性的保留最大化。所采用的具体技术将取决于分离效率、方法的细胞毒性、性能的容易性和速度、以及精密设备和/或技术技能的必要性。

经分离后，使用本领域已知的方法在cGMP条件下在扩增培养物中生长MSC。MSC可以在含有FBS的培养基中生长，但也可以在含有人血小板裂解物而不是FBS的培养基中或在无血清培养基如 STEMPRO

MSC SFM(Thermo Fisher Scientific Inc.，Carlsbad， CA)、STEMLINE

间充质干细胞扩增培养基(StemLine Therapeutics，Inc.，New York，NY)、CellGro

MSC培养基 (MediaTech，Inc.，Manassas，VA)等中生长。将细胞以5,000- 5,000,000/cm²接种，通过洗涤除去未粘附细胞。在7-28天后，通常在 50-100％汇合时传代细胞。传代后，细胞可在组织培养烧瓶、细胞工厂、滚瓶或生物反应器(包括使用珠、多孔结构、纤维、无纺纤维或中空纤维作为细胞生长的基底的填充床生物反应器)中扩增。MSC可以安全地传代多达25次，但在某些实施方案中，在3-8次传代后收获，经岩藻糖基化，并且递送至患者或冷冻保存。下文讨论岩藻糖基化和冷冻保存的方法。

可以获得人NSC用于用α1,3-岩藻糖基转移酶处理，例如通过与尸体脑组织中的其它细胞分离。细胞来源可以是自体的、同种异体的或异种的。NSC可以从胚胎干细胞或诱导多能干细胞的培养物获得。可以采用本领域已知的各种技术来获得NSC。可以使用机械解聚和/ 或可以通过用蛋白水解酶(包括但不限于胶原酶，透明质酸酶，胰蛋白酶和分散酶)处理来释放细胞。一旦NSC在单细胞混合物中分离后，它们可以通过本领域已知的方法与其它细胞类型分离，所述方法包括但不限于粘附于塑料、密度梯度分离、离心淘析、或使用淘选的荧光激活细胞分选仪(FACS)或磁珠分离装置如来自Miltenyi Biotec Inc. (BergishGladbach，Germany)的CliniMACS

系统利用单克隆抗体进行分离。可用于这种分离的单克隆抗体包括但不限于抗整联蛋白α1β5，抗CD15，抗CD24，抗CD33，抗CXCR4，抗EGFR，抗Notch1和抗PSA-NCAM。所采用的分离技术应使待收集的级分的存活性的保留最大化。所采用的具体技术将取决于分离效率、方法的细胞毒性、性能的容易性和速度、以及精密设备和/或技术技能的必要性。

经分离后，在cGMP条件下使用本领域已知的方法在扩增培养物中生长NSC。NSC可以在含有FBS的培养基中生长，但也可以替代地在含有人血小板裂解物的培养基中或在无血清培养基STEMPRO

MSC SFM(Thermo Fisher Scientific Inc.，Carlsbad，CA)、STEMLINE

间充质干细胞扩增培养基(StemLine Therapeutics，Inc.， New York，NY)、CellGro

MSC培养基(MediaTech，Inc.，Manassas， VA)等中生长。将细胞以5,000-5,000,000/cm²接种，通过洗涤除去未粘附细胞。在7-28天后，通常在50-100％汇合时传代细胞。传代后，细胞可在组织培养烧瓶、细胞工厂、滚瓶或生物反应器(包括使用珠、多孔结构、纤维、无纺纤维或中空纤维作为细胞生长的基底的填充床生物反应器)中扩增。MSC可以安全地传代多达25次，但在某些实施方案中，在6-8次传代后收获，经岩藻糖基化，并递送至患者或冷冻保存。或者，NSC可以被条件性永生化如例如CTX0E03细胞中的 c-mycER^TAM转基因。下文讨论岩藻糖基化和冷冻保存的方法。

岩藻糖基化过程在cGMP条件下进行。这要求所使用的所有试剂在cGMP条件下产生。例如，可以通过本领域已知的方法获得FTVI 的cDNA，例如使用PCR从cDNA文库例如Clontech Quick-Clone II 人肺cDNA文库中扩增基因。一旦获得，可以将cDNA克隆到克隆载体例如Invitrogen PCR-Blunt Topo PCR克隆载体中。DNA测序可用于通过将获得的序列与DNA数据库进行比较来验证克隆了正确的序列。然后可以将cDNA克隆到含有亲和标签的载体例如含有HPC4表位的来自Invitrogen的pCDNA 3.1(+)中，然后亚克隆入表达载体如Lonza pEE14.1表达载体(Lonza Walkersville,Inc.,Walkersville, MD)。Lonza pEE14.1使用谷氨酰胺合成酶(GS)用于高水平基因扩增，其通常仅需要单轮选择用于扩增以实现最大表达水平。细胞如 CHO-K1细胞(ATCC：CCL-61)可以用在其N末端含有FTVI cDNA 和HPC4标签的构建体转染。扩增后，可以选择以高水平表达 FT-VI/HPC4的克隆。

如果选择CHO细胞用于蛋白质生产，则可以利用本领域已知的方法来制备用于蛋白质的cGMP生产的主细胞库和工作细胞库。

也可以使用本领域已知的蛋白质生产的替代方法，包括但不限于在原核生物如细菌如大肠杆菌(E.coli)、酵母如毕赤酵母(Pichia pastoris)、昆虫细胞如经由杆状病毒的昆虫细胞和其它哺乳动物细胞系如NSO、HEK等中表达。可以使用本领域已知的其它亲和标签，包括但不限于FLAG标签，V5标签，c-myc标签，His标签，HA标签等。或者，可以在不存在标签的情况下表达蛋白质，并使用本领域已知的各种色谱技术纯化蛋白质，包括但不限于离子交换、凝胶过滤、反相HPLC等。也可以使用亲和纯化和色谱的组合。类似的技术可用于任何α1,3-岩藻糖基转移酶的cGMP生产。不需要表达全长α1,3-岩藻糖基转移酶蛋白；截短的蛋白质以及通过本领域已知的方法工程化以改善稳定性、特异性或活性的蛋白质也可以用于治疗性细胞的离体岩藻糖基化，只要它们保留酶活性。α1,3-岩藻糖基转移酶蛋白可以在溶液中作为游离酶使用，或者可以固定在底物例如珠或柱上，以便于从治疗性细胞中移除酶。

实施例

下文提供了实施例。然而，本文公开的和/或要求保护的发明构思应理解为其应用不限于具体实验、结果和实验室程序。相反，实施例仅作为各种实施方案之一提供，并且意在是示例性的，而不是穷举性的。

实施例1

不同的细胞类型需要不同的岩藻糖基化条件。如下所示，神经干细胞不能用FTVI岩藻糖基化，但用FTVII完全岩藻糖基化(实验D)；类似地，用FTVII但不用FTVI使B(CD19+)/T(CD3+或CD4+) 和CD38+细胞岩藻糖基化(实施例5，下文描述)。其它细胞类型用任一种酶同等地岩藻糖基化。不可能先验地确定哪些酶将岩藻糖基化哪种细胞类型。

为了比较离体岩藻糖基化对不同细胞类型的影响，在Aragen Bioscience(MorganHill，CA；最终浓度1100μg/mL)制备在CHO 细胞中产生的重组FTVI和在小鼠淋巴细胞系中产生的FTVII从 Kyowa Hakko Kirin(Japan，终浓度150μg/mL)获得。冷冻的人脐带血购自San Diego Blood Bank。人间充质干细胞和人CD34+脐带血细胞购自Lonza(LonzaWalkersville，Inc.，Walkersville，MD)。新鲜人神经干细胞获自Sanford/Burnham的EvanSnyder的实验室。内皮祖细胞(EPC)是来自Joyce Bischoff博士(Vascular BiologyProgramme and Department of Surgery，Children's Hospital， Harvard MedicalSchool，Boston，MA)的礼物。人羊水干细胞系来自Wake Forest大学的Shay Soker实验室。人类脂肪来源的干细胞来自印第安纳大学的Brian Johnstone的实验室。将细胞在来自Lonza (#CC-3162；Lonza Walkersville，Inc.，Walkersville，MD)的EGM-2 子弹试剂盒中的EGM-2、20％热灭活的胎牛血清、1％GPS和所有生长因子(不包括氢化可的松)中在5％CO₂、37℃培养箱中生长。在室温下用含有1％人血清白蛋白(HSA,Baxter HealthcareCorp., Westlake Village,CA.)的磷酸缓冲盐水(PBS)中的1mM GDPβ-岩藻糖(EMDBiosciences，San Diego，CA.)和在先前优化的100mU/mL FT-VI或75μg/mL FT-VII的浓度中在室温以10⁶个细胞/mlL处理细胞30分钟。未处理的细胞如上培养，只是不加酶。通过使用HECA-452 抗体(BD Biosciences)(一种与岩藻糖基化(唾液酸化Lewis X(sLeX) 修饰的)形式的P-选择素糖蛋白配体(PSGL)-1(CD162)(也称为皮肤淋巴细胞抗原(CLA))反应的直接偶联(FITC)的大鼠IgM 抗体)，通过流式细胞术测定岩藻糖基化水平。针对CD抗原的其它抗体也获自BD Biosciences。

所有以下实验已经用在重复中相似的(如果不是几乎相同的)结果重复。

图1示出了FTVI(10μl＝11μg/mL)相对于FTVII (100μl＝15μg/mL，200μl＝30μg/mL和400μl＝60μg/mL)对使用在指定的时间点孵育的来自解冻的人脐带血的单核细胞的细胞表面岩藻糖基化的动力学(％CLA-FITC)的比较分析。

实施例2

图2示出了FTVI(11和1.1μg)相对于FTVII(15和60μg)对使用人间充质干细胞(MSC)的岩藻糖基化动力学(％CLA-FITC) 的比较分析。使用与实施例1所述相同的条件。

图2示出100μl(15μg)和400μl(60μg)的FTVII能够在早期时间点(15分钟)实现间充质干细胞(MSC)的显著岩藻糖基化，证明FTVII在岩藻糖基化和产生CLA位点上比10μl(11μg)的FTVI 更具活性。到30分钟，FTVII相对FTVI的差异效应不再观察到。重复的结果证明岩藻糖基化对MSC的最大效应在FT的两种同种型之间没有显著差异，并且最大实现的百分比CLA表达为约70％-80％。

图3示出了FTVI(11和1.1μg)相对于FTVII(15和60μg)对使用纯化的脐带血来源的CD34+细胞的岩藻糖基化动力学(％ CLA-FITC)的比较分析。使用与实施例1所述相同的条件。

通过使用来源于脐带血的纯化的CD34+细胞，图3中的结果与图 1中的CB MNC制剂所观察到的结果平行；即，在10μl(11μg)的 FTVI和400μl(60μg)的FTVII下观察到最大的％岩藻糖基化，其中在每种FT的较低浓度下时间依赖性达到最大效应。与在图1中的 MNC制备物中的相同时间点观察到的岩藻糖基化水平(30％)相比，较低剂量的FTVII(100μl，15μg)在15分钟的早期时间点实现更高水平的岩藻糖基化(70％)。

图4示出了FVI(33、11和3.3μg)相对于FTVII(15、30和60μg) 对使用新鲜培养的神经干细胞(NSC)的岩藻糖基化动力学(％CLA-FITC)的比较分析。使用与实施例1中所述相同的条件。

图4中的结果没有显示纯化的神经干细胞(NSC)群体的岩藻糖基化的基线水平。该图还显示，完全岩藻糖基化CD34+细胞的浓度为 10μl(11μg)和以上(30μl，33μg)的FTVI不能改变岩藻糖基化的基线水平。只有在两个浓度(100μl和400μl)的FTVII能够岩藻糖基化这些细胞，从而在最早的15分钟时间点达到最大的岩藻糖基化。

图5和图6示出了FTVI(11μg；图5)相对于FTVII(60μg；图 6)对使用解冻的人脐带血来源的单核细胞的岩藻糖基化动力学的比较分析。使用与实施例1中所述相同的条件。

上述结果示出，FTVI(图5)能够岩藻糖基化仅从脐带血的混合细胞群中选择的细胞。在用完全岩藻糖基化CD34+、CD33+和CD56 细胞的剂量(10μl，11μg)的FTVI孵育后，B和T淋巴细胞(CD3， CD4，CD19)仅受到适度的影响；类似地，CD38+细胞仅被FTVI最低限度地岩藻糖基化。相比之下，在400μl(60μg；图6)的FTVII 能够实现对所有检查的细胞类型(包括脐带血单核细胞(MNC)制剂中的各种淋巴细胞亚群)的接近100％的岩藻糖基化。

实施例3

图7示出了FTVI处理相对安慰剂处理对人内皮祖细胞(EPC) 的岩藻糖基化的影响的分析。使用与实施例1中所述相同的条件。所有细胞通过用FTVI的离体处理进行岩藻糖基化。

图8示出了FTVI处理对人羊水干细胞的岩藻糖基化的影响的分析。使用与实施例1中所述相同的条件，除了还测试在37℃下的孵育 (蓝线)。

图9示出了FTVI处理对人脂肪来源的干细胞的岩藻糖基化的影响的分析。使用与实施例1中所述相同的条件。如图所示，大于90％的脂肪来源的干细胞被FTVI岩藻糖基化。

实施例4

进行本实施例中的实验以测试冷冻保存后间充质干细胞(MSC) 的岩藻糖基化的稳定性。从Lonza(Lonza Walkersville，Inc.，Walkersville，MD)获得MSC的冷冻等分试样并解冻。洗涤细胞以除去冷冻保护剂，然后重悬于加有1％人血清白蛋白(HAS)的Hank 碱性盐溶液(HBSS)中。一个等分试样用作对照，另一个根据以下程序进行岩藻糖基化：向800μl含有MSC的HBSS+1％HSA中的MSC 中加入100μl HBSS+1％HAS、100μl GDP-岩藻糖(10mM储备液) 和10μl的FTVI以开始反应，30分钟后通过洗涤终止反应。对照细胞遵循相同的方案但不添加酶。

将细胞在室温下温和混合地孵育45分钟，然后通过离心洗涤。将所得沉淀重悬于HBSS+1％HAS中。取出细胞的等分试样用于通过 FACS使用如上的CLA-FITC和抗CD73作为特异性MSC细胞表面标记物进行分析。碘化丙锭用于测量活力。

通过加入2mL HBSS+1％HSA洗涤剩余的细胞，并根据以下方案冷冻保存：(1)沉淀的细胞在等体积(0.5mL)的100％FBS和20％ DMSO中；和(2)将细胞置于-70℃冷冻器中2小时，然后转移至液氮中。

第二天，将细胞解冻，通过离心洗涤并重悬浮于1.0mL HBSS+1％ HSA中，并如上通过流式细胞术测定。测定的结果显示在表1中。

可以看出，在冷冻保存后，岩藻糖基化水平在岩藻糖基化的细胞的百分比和MFI方面得到维持，尽管存在细胞存活力的损失。

实施例5

为了比较胰蛋白酶消化之前或之后人MSC的岩藻糖基化的影响，进行以下实验。将人MSC在无血清培养基中扩增11天，接种在6孔板中，并使其粘附数天。将板1-3中的无血清培养基用指定的培养基 (板1：培养基+10％FBS，板2：无血清培养基，板3：HBSS)交换，之后将细胞在已知实现最大岩藻糖基化和MFI的条件下暴露于 TZ101。将来自板4的细胞悬浮于HBSS中，然后暴露于TZ101，以获得％CLA-FITC和MFI的最大表达水平。结果显示在表2中，并且是来自两个独立孔的值的平均值。

如图10所示，在岩藻糖基化之前的胰蛋白酶化在任何条件下导致比粘附细胞的岩藻糖基化更高的MFI值。HBSS中细胞的岩藻糖基化导致比无血清培养基中细胞的岩藻糖基化更高的MFI。

实施例6

MSC在cGMP条件下生长和岩藻糖基化。在供体的书面知情同意后，从髂嵴收获15mL骨髓。将骨髓以10⁵个有核细胞/cm²接种在补充有8％人血小板裂解物(Mill Creek LifeSciences，Rochester， Minnesota)的300mL培养基(αMEM(Life Technologies，GrandIsland，NY))中的两层CellSTACK

培养室(1272cm²,Corning,Acton, MA)。整个培养基每周更新两次，直到细胞达到汇合(P0结束)。然后使用胰蛋白酶(Hyclone)分离细胞，计数活细胞，并将细胞以 10³个细胞/cm²重新接种在5个两层CellSTACK

培养室上。在两个星期后(P1结束)，通过胰蛋白酶消化分离细胞，计数活细胞，并重复该过程两次(P2和P3)。

在P3结束时，通过胰蛋白酶消化分离细胞，在加有1％重组人血清白蛋白(HSA)(InVitria，Ft.Collins，CO)的Hank碱性盐溶液 (HBSS)中洗涤，并以10⁷/mL重新接种在HBSS+1％HSA中。通过用重组FTVI(0.01mg/mL)+1mM GDP-岩藻糖(均源自America StemCell，San Diego，CA)在室温下孵育30分钟将细胞岩藻糖基化，洗涤并冷冻保存。

对于冷冻保存，将总共10mL的10⁷个细胞/mL的MSC与10mL 由在plasmalyte A中的10％DMSO、12％Pentastarch和8％人血清白蛋白(HSA)组成的冷冻混合物混合，并转移至定制的20mL FEP冷冻袋(AFC Kryosure VP-20f，Gaithersburg，MD)中。使用速率受控的冷冻器(Kryosave，Cryo Associates，Gaithersburg，MD)将细胞冷冻保存，并储存在液氮罐的气相中。

实施例7

在直立的75cm²组织培养烧瓶中，将2x10⁷个100Gy辐照并洗涤过的Epstein-Barr病毒转化的淋巴母细胞样(EBV-LCL)细胞与 10⁶个磁珠纯化的人自然杀伤(hNK)细胞在添加有10％热灭活的人 AB血清(Gemini BioProducts，West Sacramento，CA)、500IU/mL rhIL-2(50ng/mL，Tecin^TM,Hoffmann-La Roche Inc.,Nutley,NJ)和 2mM GlutaMAX-1(Invitrogen，Carlsbad，CA)的15mL X-VIVO 20 (Lonza，Walkersville，MD)中在37℃和6.5％CO₂下共培养。培养 5天后，更换一半培养基。从第7天开始，NK细胞用含有IL-2的生长培养基每24-72小时稀释至0.6×10⁶个细胞/mL，持续14天。

通过流式细胞术在FACSCalibur^TM流式细胞仪(BD Biosciences， San Jose，CA)上用以下抗人单克隆抗体评估NK细胞的表型：抗 CD56-APC(克隆B159)，CD16-FITC(克隆3G8)，抗CD3-PE(克隆UCHT1)，抗CD25-PE(克隆M-A251)，抗NKG2D-APC(克隆1D11)，抗CD244-PE(2B4，克隆2 69)，抗CD48-FITC(克隆

)，抗CD11a/LFA-1-PE(克隆G43-25B)，抗FasL-生物素(克隆NOK-1)，抗穿孔素-FITC(克隆δG9)，CD158b-PE(KIR2DL2/3，克隆CH-L)和抗CLA(HECA)-FITC抗体；通过用Via-Probe^TM(BD Bisociences，San Jose，CA)(7AAD)染色测定细胞活力。对使用 BD Biosciences的Cytofix/Cytoperm^TM透化和固定的细胞进行细胞内染色。上述抗体和试剂购自BD Biosciences(San Diego，CA)，并根据制备商的说明书使用。抗粒酶A-FITC(克隆CB9)、抗粒酶B-PE (克隆GB11)和抗TRAIL-PE(克隆RIK-2)购自AbcamInc. (Cambridge，MA)。抗NKG2A-APC(CD94/CD159a，克隆131411) 和抗NKG2C-PE(CD94/CD159c，克隆134591)购自R&D Systems (Minneapolis，MN)。抗KIR3DL1-PE(克隆DX9)获自BioLegend Inc.(San Diego，CA)。细胞还用其相应的同种型匹配的对照单克隆抗体染色。

图11中的结果显示了在用具有不同浓度的FTVI的TZ101孵育后，人扩增的hNK细胞的岩藻糖基化水平。虽然在所检测的最低剂量的FTVI(5μg/mL)下观察到最大％的实现岩藻糖基化的细胞(如与CLA-FITC的反应性反映的)，但是在20-25μg/mL的更高的FTVI 剂量下实现最大MFI(对于对照的MFI＝36，在5μg/mL FTVI＝2033，在10μg/mL FTVI＝2097，在15μg/mL FTVI＝1943，在20μg/mL FTVI ＝2205和在25μg/mL FTVI＝2116)。来自本实施例的其它观察结果包括表型没有变化，如通过CD16和CD56染色的稳定水平、几乎不可检测水平的L-选择素和NK细胞上的高基线水平的CD44和PSGL 所反映的。

NK细胞与E-选择素的流体相结合通过用TZ101预孵育NK细胞来增强。检查了用TZ101预处理扩增的hNK细胞对与E-选择素嵌合体的液相结合的影响。图12示出了FTVI对E-选择素与NK细胞的结合的剂量-反应效应，其中在以25μg/mL的FTVI剂量孵育后获得最大结合，其与MFI结果相关。因此，使用25μg/mL的FTVI进行所有进一步的研究。

在室温下孵育后实现岩藻糖基化的稳定性。图13中的结果显示，在组织培养中孵育48小时(25μg/mL的FTVI和1mM的GDP-岩藻糖)后，hNK细胞保持其岩藻糖基化水平。此外，数据表明NK细胞上的CD44可能是酶促介导的岩藻糖至四糖(装饰这种细胞表面糖蛋白的siLeX部分)的转移中FTVI的主要作用位点。

在岩藻糖基化后维持NK细胞的细胞毒性效力。图14中的结果表明岩藻糖基化的hNK细胞在体外表现出类似于用对照细胞所观察到的细胞毒性特征谱。特别地，通过暴露于IL-2预活化的对照或TZ101 处理的(10μg/mL或25μg/mL FTVI)NK细胞的孵育表现出针对K562 和MM1S(多发性骨髓瘤)细胞的强细胞毒性作用。

实施例8

在当前良好制备实践(cGMP)条件下制备NK细胞并使其岩藻糖基化。所有使用的试剂，包括FTVI，都是cGMP级的。将12-24×10⁶个经磁珠纯化的NK细胞与包含获自CellGenixInc.(Portsmouth， New Hampshire)的rhIL-2的培养基中的120-240×10⁶个经辐射的EBV-TM-LCL细胞在100-140mL在Baxter 180cm² 300mL袋(Fenwal Lifecell，BaxterHealthcare Corporation，Deerfield，IL)中组合。在培养开始后4至5天，更换一半培养基。两天后，使用含有IL-2的生长培养基将NK细胞的浓度调节至10⁶个细胞/mL。计数扩增细胞并每24-72小时稀释直至第28天。将一部分细胞在补充有4％人血清白蛋白(HSA，TalecrisBiotherapeutics，Inc.，Research Triangle Park， NC)、6％pentastarch(Hypoxyethylstarch，NIH PDS)、10μg/mL DNA 酶I(Pulmozyme，Genentech，Inc.，SouthSan Francisco，CA)、 15U/mL肝素(Abraxis Pharmaceutical Products，IL)和5％DMSO 的PlasmaLyte A培养基(Baxter)中以20-50×5％DMSO个细胞/mL /小瓶使用速率受控的冷冻器冷冻保存，随后转移至液氮罐的气相。两周后，使用含有X-VIVO 20、10％人AB血清、4％HSA和10U/mL 肝素的解冻培养基解冻细胞。将细胞在37℃下解冻，用10mL解冻培养基缓慢稀释，并在离心前在室温下放置1-2小时以避免细胞破碎。在解冻后2小时测试解冻的细胞的岩藻糖基化水平，使用7AAD染色对活细胞门控。应观察到的岩藻糖基化水平(通过MFI测量)为在冷冻保存之前观察到的水平的±10％。

实施例9

从脐带血(CB)扩增调节性T细胞(T_regs)。将冷冻保存的CB 单元解冻并在含有0.5％HSA(Baxter Healthcare，Westlake Village， CA)的CliniMACS缓冲液(MiltenyiBiotec，Bergish Gladbach，Germany)中洗涤以产生CB单核细胞(MNC)。CB MNC然后根据制备商的说明书(Miltenyi Biotec，Bergish Gladbach，Germany)使用磁激活细胞分选(MACS)进行CD25+细胞富集。将阳性选择的细胞与CD3/28共表达的Dynabeads

(ClinExVivo^TMCD3/CD28, Invitrogen Dynal AS,Oslo,Norway)以1个细胞:3个珠的比率共培养，并以1×10⁶个细胞/mL在补充有10％人AB血清(Gemini BioProducts， Sacramento，CA)、2mM L-谷氨酰胺(Sigma，St.Louis，MO)、1％青霉素-链霉素(Gibco/Invitrogen,GrandIsland,NY)和200IU/mL 白细胞介素(IL)-2(CHIRON Corporation，Emeryville，CA)的X-VIVO 15培养基(Cambrex BioScience，Walkersville，MD)中，在37℃、空气氛围中的5％CO₂下在组织培养烧瓶中共培养。

通过每48-72小时加入新鲜培养基和IL-2(维持200IU/mL)将 CB-来源的CD25+富集的T细胞维持在1×10⁶个细胞/mL。从一个CB 分离的CD25+细胞的平均数为0.78×10⁶；在两周的扩增后，可以获得高达400×10⁶个T_reg细胞。

岩藻糖基化通过sLeX残基的存在表征，如通过使用抗体 HECA-452(BDBiosciences，San Jose，CA)的流式细胞术所评估的。在岩藻糖基化之前和之后移除一部分细胞用于用CLA、CD4、CD127 和CD25抗体进行流式染色。

当收获培养的细胞并在PBS 1％HSA中洗涤后，在第11天进行扩增的T_reg细胞的离体岩藻糖基化。然后将细胞用TZ101(10μg/mL 的FTVI+1mM GDP-岩藻糖)在室温下在偶尔混合的情况下孵育30 分钟，然后洗涤并重悬于PBS中。在岩藻糖基化之前和之后移除一部分细胞用于用CLA、CD4、CD127和CD25抗体进行流式染色。结果显示在图15A中，并且证明FTVI将T_reg细胞上的岩藻糖基化水平从 8.8％提高到62％。此外，岩藻糖基化的T_reg能够抑制体外同种异体混合的(allo-mixed)淋巴细胞反应(MLR)(图15B)。

实施例10

调节性T细胞(T_reg)从脐带血(CB)扩增，然后岩藻糖基化，均在cGMP条件下进行。将冷冻保存的CB单元在37℃无菌盐水浴中使用10％葡聚糖40/5％人血清白蛋白作为洗涤溶液进行解冻。使用 MgCl₂/rHuDNAse/柠檬酸钠混合物来防止在免疫磁性选择之前的凝集。通过用直接缀合的抗CD25磁性微珠(Miltenyi Biotec，Bergish Gladbach，Germany)和CliniMACS装置(Miltenyi)进行阳性选择来完成CD25+T_reg细胞的富集。在柱选择后，将CD25+细胞以约1× 10⁶个细胞/mL的浓度在组织培养瓶((37℃/5％CO₂))中悬浮于补充有10％人AB血清、热灭活的L-谷氨酰胺(2mM；Valley Biomedical Products and Services,Inc.,Winchester,VA)和2.5mL青霉素/庆大霉素(10mg/mL)的X-VIVO 15(Cambrex BioScience，Walkersville， Maryland，USA)中。通过使用流式细胞术对所得群体的纯度进行表征。然后将分离的细胞与抗CD3/抗CD28单克隆抗体(mAb)包被的 Dynabead(Invitrogen)以3:1的珠与细胞比率培养14±1天。在第0 天，用200IU/mL IL-2(Proleukin，Chiron Corporation，Emeryville， CA)补充培养物。通过每48-72小时分开细胞，持续14天直至收获，将细胞维持在1.0×10⁶个有核细胞/mL的密度。通过批释放标准的所有产品包括：7AAD活力≥70％，CD4+CD25+纯度≥60％，小于10％ CD4-/CD8+细胞，抗CD3/抗CD28 mAB珠计数<100/3×10⁶细胞，“无生物体”的革兰氏染色，和内毒素<5EU/kg。使用对于cGMP扩增的 T_regs显示为最佳的浓度的FTVI+1mM的GDP-岩藻糖在室温下进行岩藻糖基化30分钟。将一部分细胞悬浮于补充有丙酮酸盐(0.02mM)、青霉素(100U/mL)、链霉素(100mg/mL)、20％人混合血清(HPS) 和15％二甲基亚砜的RPMI 1640中，并使用速率受控的冷冻器冷冻保存，然后转移至液氮罐的气相。两周后，细胞在37℃水浴中快速解冻，并在使用前洗涤两次。在解冻后2小时测试解冻的细胞的岩藻糖基化水平，使用7AAD染色对活细胞进行门控。应观察到岩藻糖基化水平(如通过MFI测量的)为在冷冻保存之前观察到的水平的±10％。

实施例11

将细胞毒性T细胞针对结合HLA-A2的CG1肽(氨基酸序列 FLLPTGAEA；SEQ ID NO：1)扩增。通过粘附和免疫刺激从HLA-A *0201健康供体单核细胞产生树突状细胞(DC)，然后与来自相同健康供体的PBMC共培养。在37℃的粘附步骤后，除去保持悬浮的细胞(淋巴细胞)，并用40μg/mL的CG1肽脉冲，然后用IL-7(10ng/mL) 和IL-2(10ng/mL)5天。通过加入GM-CSF(100ng/mL)、IL-4 (50ng/mL)和TNF-α(25ng/mL)将来自初始步骤的粘附细胞成熟为单核细胞来源的DC。5天后，分离DC并用40μg/mL的合适肽脉冲，随后与剩余的自体淋巴细胞群体合并。然后用IL-7(10ng/mL) 和IL-2(25ng/mL)再次刺激共培养物7天，以允许CTL增殖。在第12天，收获细胞并通过dextramer染色和体外细胞毒性测定进行分析以确认CTL扩增和特异性。然后通过在室温下孵育30分钟，然后洗涤(“FTVII处理”)，用TZ102(1mM GDP-岩藻糖+75μg/mL FTVII) 将细胞岩藻糖基化，或在不存在FTVII酶的情况下进行模拟孵育(“未处理”)。使用HECA-452抗体(BD Biosciences)自体淋巴细胞群通过流式细胞术测定岩藻糖基化水平。然后用IL-7(10ng/mL)和IL-2 (25ng/mL)再次刺激共培养物7天，以允许CTL增殖。在第12天，收获细胞并通过dextramer染色和体外细胞毒性测定进行分析以确认 CTL扩增和特异性。然后通过在室温下孵育30分钟，然后洗涤 (“FTVII处理”)，用TZ102(1mM GDP-岩藻糖+75μg/mL FTVII) 将细胞岩藻糖基化，或在不存在FTVII酶的情况下进行模拟孵育(“未处理”)。使用抗CLA-FITC(HECA-452)抗体(BD Biosciences) 通过流式细胞术测定岩藻糖基化水平。从图16可以看出，几乎100％的细胞通过用TZ102处理而被岩藻糖基化。

实施例12

使用实施例11中所述的方法在cGMP条件下制备和岩藻糖基化细胞毒性T细胞。所有试剂均为cGMP级，包括CG1肽和FTVII。如实施例11中所述使用抗CLA-FITC测量岩藻糖基化水平。将一部分细胞悬浮于补充有丙酮酸盐(0.02mM)、青霉素(100U/mL)、链霉素(100mg/mL)、20％人混合血清(HPS)和15％二甲基亚砜的 RPMI 1640中，并使用速率受控的冷冻器冷冻保存，然后转移至液氮罐的气相中。两周后，将细胞在37℃水浴中快速解冻，并在使用前洗涤两次。在解冻后2小时测试解冻的细胞的岩藻糖基化水平，使用 7AAD染色对活细胞进行门控。应该观察到通过MFI测量的岩藻糖基化水平为在冷冻保存之前观察到的水平的±10％。

虽然已经详细描述了本文公开的和/或要求保护的发明构思及其优点，但是应当理解，在不脱离如本公开内容中定义的本文公开和/ 或要求保护的发明构思的精神和范围的情况下，可以进行各种改变、替换和变更。此外，本申请的范围不旨在限于说明书中描述的工艺的特定的非限制性的实施方案、物质组成、装置、方法和步骤。本领域普通技术人员将从本文公开和/或要求保护的发明构思的公开内容中容易地理解，目前存在的或以后将开发的执行与本文所述的相应实施方案基本相同的功能或实现基本上相同的结果的工艺、物质组成、装置、方法或步骤可以根据本文公开和/或要求保护的发明构思进行利用。因此，本文公开和/或要求保护的发明构思旨在在其范围内包括所有这样的工艺、物质组成、装置、方法或步骤。

序列表

<110> Targazyme, Inc.

<120> 用于治疗用途的岩藻糖基化细胞的制备和冷冻干燥

<130> 1001.043wo

<150> 62/021,328

<151> 2014-07-07

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Phe Leu Leu Pro Thr Gly Ala Glu Ala

1 5

Claims

1.一种冷冻保存岩藻糖基化治疗性细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

分离治疗性细胞；

将岩藻糖基化治疗性细胞与包含生理平衡盐溶液、至少一种渗透性冷冻保护剂和至少一种非渗透性冷冻保护剂的治疗性细胞冷冻保存组合物相混合以形成混合物；

通过以在约1℃至约2℃/分钟的范围内的速率冷却至在约-70℃至约-80℃的范围内的温度来冷冻所述混合物以产生冷冻细胞悬浮液，并且将所述冷冻细胞悬浮液转移至在液氮存在的情况下储存；和

在解冻后保持在冷冻保存岩藻糖基化治疗性细胞之前所存在的岩藻糖基化水平的约90％至约110％的岩藻糖基化水平。

分离治疗性细胞；

扩增治疗性细胞；

3.权利要求1或2的方法，其中所述至少一种渗透性冷冻保护剂选自二甲基亚砜、甘油、蔗糖、乙二醇、1、2-丙二醇及其组合，并且所述至少一种非渗透性冷冻保护剂选自羟乙基淀粉、白蛋白、蔗糖、海藻糖、右旋糖、聚乙烯吡咯烷酮及其组合。

4.权利要求2或3的方法，其中扩增治疗性细胞的步骤进一步定义为在现行良好制备实践(cGMP)条件下扩增治疗性细胞。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述α1,3-岩藻糖基转移酶选自α1,3-岩藻糖基转移酶III、α1,3-岩藻糖基转移酶IV、α1,3-岩藻糖基转移酶V、α1,3-岩藻糖基转移酶VI、α1,3-岩藻糖基转移酶VII、α1,3-岩藻糖基转移酶IX、α1,3-岩藻糖基转移酶X、α1,3-岩藻糖基转移酶XI及其组合。

6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述岩藻糖供体是GDP-岩藻糖。

7.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述治疗性细胞分离自选自以下的至少一种分离的组织：骨髓，脐带血，脐带，脐带胶质，外周血，淋巴组织，子宫内膜，滋养层来源的组织，胎盘，羊水，脂肪组织，肌肉，肝，软骨，神经组织，心脏组织，牙髓组织，脱落的牙齿及其组合。

8.权利要求1-7中任一项的方法，其中分离的治疗性细胞是分化的胚胎干细胞和分化的诱导多能干细胞中的至少一种。

9.权利要求1-8中任一项的方法，其中分离的治疗性细胞选自：造血干细胞，免疫细胞，间充质干细胞，肌肉细胞，羊水细胞，子宫内膜细胞，神经干细胞，天然杀伤(NK)细胞，T细胞，B细胞及其组合。

10.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述α1,3-岩藻糖基转移酶是α1,3-岩藻糖基转移酶VII，所述岩藻糖供体是GDP-岩藻糖，并且所述分离的治疗性细胞选自T细胞、NK细胞、B细胞、神经干细胞及其组合。

11.权利要求2-10中任一项的方法，其中所述生理平衡盐溶液是细胞在其中扩增的组织培养基。

12.权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述生理平衡盐溶液含有蛋白质。

13.权利要求12的方法，其中所述蛋白质选自胎牛血清、马血清、人血清、人血小板裂解物、牛白蛋白、人白蛋白及其组合。

14.权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述至少一种渗透性冷冻保护剂为二甲基亚砜，并且其中所述至少一种非渗透性冷冻保护剂为血清和/或白蛋白。

15.权利要求14的方法，其中所述生理平衡盐溶液选自下组：Roswell Park MemorialInstitute(RPMI)1640培养基、Hank碱性盐溶液(HBSS)、α最低必需培养基(αMEM)、Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)和PlasmaLyte溶液。

16.权利要求14的方法，其中所述生理平衡盐溶液是Dulbecco最低必需培养基(DMEM)。

17.权利要求15的方法，其中所述治疗性细胞冷冻保存组合物包含plasmalyte A、二甲基亚砜、人血清白蛋白(HSA)和pentastarch。

18.权利要求15的方法，其中所述治疗性细胞冷冻保存组合物包含RPMI 1640培养基、二甲基亚砜、人混合血清(HPS)和丙酮酸盐。

19.权利要求18的方法，其中所述治疗性细胞冷冻保存组合物还包含青霉素和链霉素。