CN114181868A - 一种青春双歧杆菌及其培养方法和其促进背根神经节的神经元细胞生长中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种青春双歧杆菌及其培养方法和其促进背根神经节的神经元细胞生长中的应用，涉及微生物领域，本发明提供了一种青春双歧杆菌菌株MN‑84，可高产γ‑氨基丁酸，它们是神经系统中的神经抑制剂，对神经元的兴奋程度有着潜在的影响，在改善人抑郁等不良情绪上有着很大的调节作用；MN‑84还能通过促进背根神经节神经元细胞的生长，潜在参与人体神经系统的调节过程。

Description

一种青春双歧杆菌及其培养方法和其促进背根神经节的神经 元细胞生长中的应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及一种青春双歧杆菌及其培养方法和其促进背根神经节的神经元细胞生长中的应用。

背景技术

背根神经节(DRG)属外周感觉神经节，背根神经节神经元是躯干、四肢痛觉的初级传入神经元，具有传输和调节机体感觉、接受和传导伤害性感受的功能。痛觉产生过程中，背根神经节作为痛觉传入的初级神经元，在疼痛机制中发挥重要作用，主要表达于背根神经节神经元，与疼痛机制密切相关的离子通道及其受体是实现背根神经节靶向镇痛的关键。

背根神经节神经元表达多种离子通道或受体，可能具有以下功能。(1)转导：表达于背根神经节神经元末梢区域的将伤害性刺激转导为电冲动的瞬时型感受器电位通道、钠离子通道、酸敏感离子通道、ATP敏感离子通道受体。(2)传导：钠离子和钾离子通道参与动作电位的传递。(3)调控突触传递：表达于脊髓背角初级传入突触前末梢的电压门控性钙离子通道(VGCC)和谷氨酸受体(GluR)调节神经递质的释放。神经损伤后，损伤和未损伤的背根神经节神经元均表现为兴奋性增高和异位放电，这种异常的自发性放电可能与神经损伤引起的背根神经节神经元电压门控性钠离子通道(VGSC)分布、密度和功能改变有关。

背根神经节在疼痛机制中的作用和疼痛治疗始终是疼痛领域的研究重点，因此，开发对于背根神经节的神经元细胞生长的物质对于研究背根神经节在疼痛机制中的作用和疼痛具有重要意义，同时也为相关的治疗方案提供了途径。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种青春双歧杆菌及其培养方法和其促进背根神经节的神经元细胞生长中的应用。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明实施例提供了一种青春双歧杆菌，其保藏号为CGMCC NO.23906。

第二方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的青春双歧杆菌的培养方法，其包括对所述青春双歧杆菌进行厌氧培养。

第三方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的青春双歧杆菌在制备用于促进背根神经节的神经元细胞生长的产品中的应用。

第四方面，本发明实施例提供了一种用于促进背根神经节的神经元细胞生长的产品，其活性成分包括如前述实施例所述的青春双歧杆菌。

第五方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的青春双歧杆菌在促进背根神经节的神经元细胞生长中的应用，所述应用不以疾病的诊断或治疗为直接目的。

第六方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的青春双歧杆菌在制备高产γ-氨基丁酸的产品中的应用。

第七方面，本发明实施例提供了一种高产γ-氨基丁酸的产品，其活性成分包括如前述实施例所述的青春双歧杆菌。

第八方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的青春双歧杆菌在生产γ-氨基丁酸中的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种青春双歧杆菌菌株MN-84，可高产γ-氨基丁酸，它们是神经系统中的神经抑制剂，对神经元的兴奋程度有着潜在的影响，在改善人抑郁等不良情绪上有着很大的调节作用；MN-84还能通过促进背根神经节神经元细胞的生长，潜在参与人体神经系统的调节过程。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实施例2中不同菌株上清液是否具有谷氨酸脱羧酶GAD活性的结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

首先，本发明实施例提供了一种青春双歧杆菌MN-84，Bifidobacteriumadolescentis，其保藏号为CGMCC NO.23906，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101；保藏日期为2021年11月15日。

青春双歧杆菌MN-84的16s rDNA的序列如下(5’-3’)：GCGGGGGGGTGCTTACCATGCAGTCGAACGGGATCCCAGGAGCTTGCTCCTGGGTGAGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATGCGTGACCGACCTGCCCCATACACCGGAATAGCTCCTGGAAACGGGTGGTAATGCCGGATGCTCCAGTTGAACGCATGGCCCTCTGGGAAAGATTTTGCGGTATGGGATGGGGTCGCGTCCTATCAGCTTGATGGCGGGGTAACGGCCCACCATGGCTTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACATTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGCGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCGCTTTTGACTGGGAGCAAGCCCTTCGGGGTGAGTGTACCTTTCGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGTAGGCGGTTCGTCGCGTCCGGTGTGAAAGTCCATCGCTTAACGGTGGATCCGCGCCGGGTACGGGCGGGCTTGAGTGCGGTAGGGGAGACTGGAATTCCCGGTGTAACGGTGGAATGTGTAGATATCGGGAAGAACACCAATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCCGTCACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGATGCTGGATGTGGGGACCATTCCACGGTCTCCGTGTCGGAGCCAACGCGTTAAGCATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGAAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGCTTGACATGTTCCCGACAGCCCCAGAGATGGGGCCTCCCTTCGGGGCGGGTTCACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCTGTGTTGCCAGCACGTCGTGGTGGGAACTCACGGGGGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAGATCATCATGCCCCTTACGTCCAGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAACGGGATGCGACACTGTGAGGTGGAGCGGATCCCTTAAAACCGGTCTCAGTTCGGATTGGAGTCTGCAACCCGACTCCATGAAGGCGGAGTCGCTAGTAATCGCGGATCAGCAACGCCGCGGTGAATGCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCATGAAAGTGGGTAGCACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCTTTTGGGGGGAGCCGTCTAAGGTAGACTCTGAT。

该菌株已经过全基因组测序，经Blast比对后，未发现与该菌株基因组序列完全相同的菌株。

本发明经筛选获得了一株青春双歧杆菌MN-84，其可高产γ-氨基丁酸，它们是神经系统中的神经抑制剂，对神经元的兴奋程度有着潜在的影响，在改善人抑郁等不良情绪上有着很大的调节作用；MN-84还能通过促进背根神经节神经元细胞的生长，潜在参与人体神经系统的调节过程。

本发明实施例还提供了如前述实施例所述的青春双歧杆菌的培养方法，其包括对所述青春双歧杆菌进行厌氧培养。

在没有限定的情况下，可选用现有的用于培养青春双歧杆菌的方法对MN-84进行培养。

优选地，所述培养的温度为32～42℃，培养的温度具体可以在32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃和42℃中的任意一项或任意两项之间的范围，更优选为37℃，培养效果更好。

优选地，所述培养采用的培养基为适用于青春双歧杆菌的培养基；

优选地，所述培养采用的培养基为乳酸细菌培养基MRS。

本发明还提供了如前述实施例所述的青春双歧杆菌在制备用于促进背根神经节的神经元细胞生长的产品中的应用。

优选地，所述青春双歧杆菌为活菌体、灭菌体、菌体培养物或菌体发酵物中的至少一种。

可以理解的是，活菌体可以为青春双歧杆菌的菌悬液(活菌状态)，灭菌体，可以通过将菌悬液进行灭菌操作后获得，菌体培养物可以通过将菌体接种到种子培养基中培养获得，菌体发酵物可以通过将菌体或菌体培养物接种到发酵培养基中发酵获得。

背根神经节DRG是指各椎间孔内侧面附近脊髓背根的膨胀结节，主要由神经元细胞组成。

在一些实施例中，背根神经节可以选自所有脊椎动物的背根神经节，优选为哺乳动物，更有选为非人哺乳动物。优选地，所述背根神经节为小鼠的背根神经节。

本发明实施例还提供了一种用于促进背根神经节的神经元细胞生长的产品，其活性成分包括如前述实施例所述的青春双歧杆菌。

优选地，所述青春双歧杆菌为活菌体、灭菌体、菌体培养物或菌体发酵物中的至少一种。

优选地，所述背根神经节为小鼠的背根神经节。

可选地，所述产品选自食品、药品和保健品中的任意一种。

优选地，所述产品还可以包括另一种具有背根神经节的神经元细胞生长的物质。

本发明实施例还提供了如前述实施例所述的青春双歧杆菌在促进背根神经节的神经元细胞生长中的应用，所述应用不以疾病的诊断或治疗为直接目的，比如在体外进行相关研发和新药开发时的应用。

优选地，所述背根神经节为小鼠的背根神经节。

本发明还提供了如前述实施例所述的青春双歧杆菌在制备高产γ-氨基丁酸的产品中的应用。

本发明实施例还提供了一种高产γ-氨基丁酸的产品，其活性成分包括如签署实施例所述的青春双歧杆菌。

优选地，所述青春双歧杆菌为活菌体、灭菌体、菌体培养物或菌体发酵物中的至少一种。

本发明实施例还提供了如前述实施例所述的青春双歧杆菌在生产γ-氨基丁酸中的应用。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

一种青春双歧杆菌MN-84，来源于25岁左右健康成人粪便中，在乳酸细菌培养基(MRS)中混合2.5mg/L莫匹罗星锂盐分离得到。于乳酸细菌培养基(MRS)中，pH 6.2～6.6，在37℃恒温培养箱静置过夜培养。

实施例2

MN-84菌株促进大鼠背根神经节神经元细胞(DRG)生长的检测。

方法：培养大鼠背根神经节神经元细胞(DRG)，使用待测灭活菌株上清液刺激，用MTT法检测细胞生长。

MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。

一、基本原理：其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法己广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。MTT法能用来检测细胞相对数和相对活力。

二、MTT溶液的配制方法

MTT全称：3-<(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide；汉语化学名：3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐商品名：噻唑蓝，是一种黄颜色的染料。

MTT溶液的配制方法：通常，此法中的MTT浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT0.5克，溶于100ml的磷酸缓冲液(PBS)或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。

注意:

1.在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住，实验的时候一般关闭超净台上的日光灯来避光；

2.配制MTT时用PBS(pH＝7.4)溶解；

PBS配方：NaCl8g十KCl 0.2g十Na₂HPO₄ 1.44g十KH₂PO₄ 0.24g调pH 7.4，定容1L；

3.MTT一般最好现用现配，过滤后4℃避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml，保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。

4.MTT有致癌性，用的时候小心，有条件最好带那种透明的簿膜手套配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竞时间较短，或者把操作台上的照明灯关掉。

三、MN-84发酵液的制备

将青春双歧杆菌MN-84用MRS液体培养基连续活化3代，用无菌PBS缓冲液洗涤细菌，调整密度为3×10⁸mL。按2％体积量向MRS液体培养基接种，摇匀、密闭封口，37℃气浴恒温振荡器中发酵；1周后，取发酵液以4000r/min离心30min，对上清液用0.2μm的微孔滤膜过滤器过滤除菌，调节pH值至7.2，分装冻存备用。

四、药物MTT法检测MN-84发酵液对大鼠背根神经节神经元细胞生长的作用。

1.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100μl，铺板使待测细胞调密度1000-10000孔，(边缘孔用无菌PBS填充)；

2.5％CO₂，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，吸弃20μl细胞培养基，加入20μl细菌发酵液，原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，本实施例在前一天下午铺板，次日上午加药，一般5-7个梯度，每孔100μl，设3-5个复孔；

3.5％CO₂，37℃孵育48小时，倒置显微镜下观察；

4.每孔加入20μlMTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液；

5.终止培养，小心吸去孔内培养液；

6.每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解；在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

7.同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)(CK对照)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)(空白对照)。

表1结果

备注：表1为3次重复实验的结果；

编号cb7y2、cb7y3以及cb39Y4为3组菌体对照组，其来源方法(实施例1)和检测方法均同MN-84。

实施例3

菌株MN-84产γ-氨基丁酸(GABA)检测。

方法：

(1)初筛：将供试菌株活化培养后，收集菌体并用0.9％NaC1清洗3次。菌体按湿重加入1％的谷氨酸溶液，调pH至4.7，反应24h后离心取上清液，加入混合酸碱指示剂，观察颜色反应，初步判断溶液变绿的具有GAD活性。溶液变绿的具有GAD活性，见图1，由结果可知，编号1、2、4、21(可基于表2对应菌株)是显绿色的试纸条。

(2)高效液相色谱检测：①γ-氨基丁酸标准溶液的配制：精确称取γ-氨基丁酸标准品，用超纯水溶解，得到的标准溶液，于4℃冰箱保存备用。②样品衍生化：取浓度为5mg/mL的标准γ-氨基丁酸溶液1mL置于10mL棕色量瓶中，加人0.5mol/L碳酸氢钠(pH 9.0)溶液1mL，再分别加入1％(2，4-二硝基氟苯)FDNB乙腈溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5mL，置于60℃水浴中避光加热0.5、1、1.5h后取出，冷却，分别添加pH7.0的磷酸盐缓冲液至10mL，混匀，10000r/min，离心15min，经0.22μm微孔过滤，测定γ-氨基丁酸衍生物的含量，根据衍生化产物2，4-二硝基氟苯丁酸的峰面积，作出γ-氨基丁酸标准曲线，根据标准曲线计算γ-氨基丁酸含量。③UPLC色谱条件：流动相A：5mM甲酸铵+0.1％甲酸水，B：0.1％甲酸-乙腈，色谱柱：Waters BEH C18 2.1×100mm×1.7μm，流速：0.3mL/min，梯度：0-1min(5％B)；1-2min(90％B)；2-4.5min(90％B)；4.5-4.6min(5％B)；4.6-7min(Stop)。

结果见表2。

表2液相色谱检测结果

备注：表2为3次重复试验的结果，Cb7y3、Cb7y2、cb39Y4的来源方法与MP-569相同，具体见实施例1，进行检测的方法也与MP-569相同。

综上结果可知，益生菌菌株MN-84可高产γ-氨基丁酸，它们是神经系统中的神经抑制剂，对神经元的兴奋程度有着潜在的影响，在改善人抑郁等不良情绪上有着很大的调节作用；MN-84(青春双歧杆菌)还能通过促进背根神经节神经元细胞的生长，潜在参与人体神经系统的调节过程。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种青春双歧杆菌，其特征在于，其保藏号为CGMCC NO.23906。

2.如权利要求1所述的青春双歧杆菌的培养方法，其特征在于，其包括对所述青春双歧杆菌进行厌氧培养；

优选地，所述培养的温度为32～42℃；

优选地，所述培养采用的培养基为适用于青春双歧杆菌的培养基；

优选地，所述培养采用的培养基为MRS培养基。

3.如权利要求1所述的青春双歧杆菌在制备用于促进背根神经节的神经元细胞生长的产品中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述青春双歧杆菌为活菌体、灭菌体、菌体培养物或菌体发酵物中的至少一种。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述背根神经节为小鼠的背根神经节。

6.一种用于促进背根神经节的神经元细胞生长的产品，其特征在于，其活性成分包括如权利要求1所述的青春双歧杆菌；

优选地，所述青春双歧杆菌为活菌体、灭菌体、菌体培养物或菌体发酵物中的至少一种；

优选地，所述背根神经节为小鼠的背根神经节。

7.如权利要求1所述的青春双歧杆菌在促进背根神经节的神经元细胞生长中的应用，所述应用不以疾病的诊断或治疗为直接目的；

优选地，所述背根神经节为小鼠的背根神经节。

8.如权利要求1所述的青春双歧杆菌在制备高产γ-氨基丁酸的产品中的应用。

9.一种高产γ-氨基丁酸的产品，其特征在于，其活性成分包括如权利要求1所述的青春双歧杆菌；

优选地，所述青春双歧杆菌为活菌体、灭菌体、菌体培养物或菌体发酵物中的至少一种。

10.如权利要求1所述的青春双歧杆菌在生产γ-氨基丁酸中的应用。

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