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CN114034871A - 一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒及其制备方法 Download PDF

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CN114034871A
CN114034871A CN202111352577.5A CN202111352577A CN114034871A CN 114034871 A CN114034871 A CN 114034871A CN 202111352577 A CN202111352577 A CN 202111352577A CN 114034871 A CN114034871 A CN 114034871A
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张彦玉
郑涛
洪春花
叶晗
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Jiangsu Jinghong Biomedical Technology Co ltd
Original Assignee
Jiangsu Jinghong Biomedical Technology Co ltd
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Abstract

本发明提供一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒包括卡壳、位于卡壳内的试纸条，试纸条由底板、样品垫、滤血膜、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸组成；该试剂盒应用的是基于膜层析作用的定性免疫分析方法，用于检测人血清、血浆或全血中新型冠状病毒中和抗体；在临床上用于评估感染后新型冠状病毒康复患者的中和抗体，或辅助评估新型冠状病毒疫苗的作用；利用本发明制备的检测试剂盒对重组中和抗体进行检测，当重组中和抗体浓度为0.039ug/ml时也能被检测出来且没有假阳性表现，利用浓度为0.312ug/ml的重组中和抗体进行重复性检测，显色一致，本发明制备的试剂盒特异性强，灵敏度高，稳定性好。

Description

一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体是一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
全球抗击新型冠状病毒疫情进入常态化阶段，多款新冠疫苗陆续上市，疫苗接种逐步普及，也陆续发现能有效阻断新冠病毒的中和抗体；中和抗体和疫苗的区别是，疫苗重在预防，是训练人体免疫系统掌握消灭新冠病毒的途径；而中和抗体药物是灵敏有效地杀伤新冠病毒；
目前中和抗体主要有三种；第一种是人感染新冠病毒后，会产生病毒特异性抗体，其中只有一部分是中和抗体；第二种是单克隆抗体，是经过人为筛选和制备的抗体，成分单一，特异性强；第三种是基因工程抗体，是对抗体的氨基酸序列进行修饰，增强疗效；因此，中和抗体的检测可作为评价患者疾病治愈后的指标，作为评价疫苗效果的指标；
传统的中和抗体检测步骤复杂繁琐，公认的是利用活病毒判断中和抗体的水平，通过被感染细胞的蚀斑减少计数；因为必须使用活病毒，所以对实验室的生物安全等级要求高，至少达到P3，且对操作人员要求高，程序复杂，耗费时间长，导致高昂的检测成本，无法大规模推广；现有替代活病毒的假病毒检测方法，虽降低了复杂性，但仍然依靠活细胞，不能达到工业化；
目前对新冠中和抗体的检测手段主要有酶联免疫、化学发光等检测手段，已有对应的试剂盒上市；但是，检测操作仍耗时较长且较为复杂，且检测时灵敏度差、特异性低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒；
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒，包括卡壳、位于卡壳内的试纸条，试纸条由底板、样品垫、滤血膜、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸组成，底板上从下往上依次粘贴有样品垫、滤血膜、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；硝酸纤维素膜上靠近吸水纸一侧设有质控C线，质控C线上包被兔抗鸡IgY抗体；硝酸纤维素膜上靠近胶体金结合垫一侧设有检测T线，检测T线上包被RBD抗原；胶体金结合垫上涂有金标S-RBD抗原和金标鸡IgY抗体。
一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的制备方法包括以下步骤：
S1、制备胶体金溶液，备用；
S2、胶体金结合垫的制备：用S1中胶体金溶液分别标记S-RBD抗原、鸡IgY抗体得到金标S-RBD抗原、金标鸡IgY抗体，然后在金标垫上喷涂金标S-RBD抗原，干燥后将金标鸡IgY抗体喷涂在金标S-RBD抗原上，18℃-26℃在10％-20％湿度下干燥3d后进行大板组装；
S3、硝酸纤维素膜的制备：将RBD抗原包被在硝酸纤维素膜上形成检测T线，将兔抗鸡IgY抗体包被在硝酸纤维素膜上形成质控C线；
S4、切条组装：除去PVC底板25mm处的保护纸，沿上面保护纸的下边缘，将硝酸纤维素膜贴在该区，胶体金结合垫上边缘超出该区1mm处覆盖硝酸纤维素膜，滤血膜贴在所述胶体金结合垫的下面，预处理的样本垫上边缘2mm处覆盖所述胶体金结合垫，预处理的样本垫下边缘与底板边缘齐平，将吸水纸粘在底板上，吸水纸下边缘超出该区2mm处覆盖硝酸纤维素膜；吸水纸上边缘与底板边缘齐平；将装配好的试纸条检测卡用切条机切成3±0.05mm宽；
S5、将S4中试纸条与卡壳组装得到新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒。
在制备胶体金溶液时所用玻璃器具的清洁程度直接关系到胶体金溶液的质量，如果器皿不干净，会导致制备的胶体金溶液粒径不均匀、漂有悬浮物或者浑浊；
制备胶体金的所有玻璃器具先浸入0.1mol/L的氢氧化钠溶液中，充分浸泡2小时，然后用纯化水冲洗玻璃器具至中性，玻璃器具再用超纯水淋洗三遍，将淋洗后的器具放入鼓风干燥箱中，烘烤温度为65℃烘烤时间大于8h，烘烤结束后放入整理箱中备用；
进一步的，步骤S1胶体金溶液的制备方法包括以下步骤：
(1)将待用锥形瓶及转子进行清洁，然后在60-70℃鼓风干燥箱中烘干备用；
(2)在锥形瓶中加入超纯水，再加入氯金酸溶液，搅拌下加热至沸腾，沸腾1min后迅速加入柠檬酸三钠，当溶液变为通透的红色后，继续加热1min，待溶液冷却后即得到胶体金溶液；
(3)紫外检测符合要求后，4℃避光保存。
紫外检测的要求为将胶体金溶液放入比色皿中，肉眼观察应为酒红色液体，质地均匀，无杂质，在紫外分光光度计下检测在525-535nm波长处应有最大吸收峰，则判定达到标准，可以用于抗原和抗体的标记。
进一步的，氯金酸溶液的质量分数为2％，超纯水与氯金酸溶液的体积比为100:(1-1.3)；柠檬酸三钠的质量分数为1％，柠檬酸三钠与超纯水的质量体积比为(2.5-3.45g):100ml。
进一步的，胶体金结合垫的制备包括以下步骤：
(1)抗原和抗体标记
抗原标记：取1mL胶体金溶液于2ml EP管中，取13ul 0.2M的碳酸钾溶液调节pH，缓慢均匀地加入16μg S-RBD抗原，混匀仪室温混匀30分钟；迅速加入100μL 10％牛血清白蛋白溶液，混匀20分钟后室温静置30分钟，13000rpm离心30分钟；弃去上清液，将沉淀溶于150μL胶体金重悬缓冲液中，4℃保存备用；
抗体标记：取1mL胶体金溶液于2ml EP管中，取7ul 0.2M的碳酸钾溶液调节pH，缓慢均匀地加入15μg鸡IgY抗体，混匀仪室温混匀30分钟；迅速加入100μL 10％牛血清白蛋白溶液，混匀20分钟后室温静置30分钟，13000rpm离心30分钟；弃去上清液，将沉淀溶于150μL胶体金重悬缓冲液中，4℃保存备用；
(2)喷金
按“喷金划线仪使用与管理标准操作规程”清洗管道，设定喷金量为8ul/cm、速度为30mm/s、喷金长度为30cm；将重悬好的金标S-RBD抗原加到进样瓶中，将金标垫按固定位置平放在仪器平台，按“GO”键开始喷金，喷金结束后，取下喷好金标抗原的金标垫，室温干燥1h，然后把金标鸡IgY抗体喷到已干燥的金标垫上，取下金标垫放置在电子干燥柜中，干燥时间≥3d，湿度10％-20％。
进一步的，步骤S3中硝酸纤维素膜4的制备包括以下步骤：
用含有稳定剂的磷酸缓冲液将兔抗鸡IgY抗体稀释至0.2mg/mL，用含有稳定剂的磷酸缓冲液将RBD抗原稀释至1.0mg/ml；按“喷金划膜仪使用与管理标准操作规程”清洗管道，设定划线量为1μL/cm、划线长度30cm，划线速度：40mm/s，T-C线之间距离为6±0.5mm，C线距离金标垫端距离为16±0.5mm；将包被液加到对应管道的进样瓶，1号管道为检测带通道，装“T”标记包被液，2号管道为质控带通道，装“C”标记包被液；将硝酸纤维素膜按固定位置平放在仪器平台，按“GO”键开始划线，划线结束后，取下划好线的硝酸纤维素膜在划线不均匀处做好标记；划好的C、T线的硝酸纤维素膜在电子干燥柜干燥，干燥时间≥3d，湿度15％-25％，干燥结束后进行免疫层析试纸条大板的组装；使环境温度保持在18℃-26℃，湿度保持在25％-40％。
进一步的，步骤S4中样本垫用样本垫处理液处理；所述样本垫处理液由基础缓冲液、海藻糖、吐温20、抗人红细胞抗体混合而成；
样本垫的处理及干燥：取配置好的样本垫处理液，铺在样本垫上，当样本垫为30cm长×1.5cm宽时需要用4.5ml样本垫处理液，处理好的样本垫放在电子干燥柜中，干燥时间≥12h,10％-20％湿度，干燥结束后放在放有干燥剂的铝箔袋中备用；
进一步的，所述基础缓冲液为10mmol/LPB，所述基础缓冲液pH为7.4；所述海藻糖在样本垫处理液中的含量为0.5-5％；所述吐温20在样本垫处理液中的含量为0.1-1％；所述抗人红细胞抗体在样本垫处理液中含量为0.1-0.5mg/ml。
抗人红细胞抗体具有与全血或指尖血中红细胞的结合作用，从而降低或避免检测过程中硝酸纤维素膜上显现红色的背景；海藻糖是抗体稳定剂，起到稳定抗人红细胞抗体的作用，防止抗人红细胞抗体降解，导致其作用降低，达不到与红细胞结合的效果，从而影响全血或指尖血的检测结果；吐温20作为表面活性剂，提高待检样品的移行速度，防止待检样品过于黏稠而无法正常层析；本发明制备的样本垫处理液对样本垫进行处理，处理后的样本垫可以直接检测血清、血浆、静脉全血、指尖血，这些待检样品不需要进行任何预处理。
进一步的，试剂盒用于中和抗体检测，包括以下步骤：
a.取全血、血清、血浆中的一种作为待检样品，所用样本稀释液平衡至10-30℃；
b.标记样本编号，去除检测试剂外包装；
c.进行检测。
进一步的，样本稀释液由PBS、吐温20、Proclin300混合而成；PBS的摩尔体积为10mmol/L，pH为7.4；吐温20在样本稀释液中的含量为1％；Proclin300在样本稀释液中的含量为0.05％。
进一步的，当待检样品为血清或血浆，检测步骤如下：取5-10ul待检样品(1滴)，加入样品孔，加60ul样本稀释液(3滴)，反应15min，25min后结果失效；当待检样品为静脉全血，检测步骤如下：取10-20ul待检样品(1滴)，加入样品孔，加60ul样本稀释液(3滴)，反应15min，25min后结果失效；当待检样品为指尖血，检测步骤如下：取第二滴指尖血10-20ul(1滴)，加入样品孔，加60ul样本稀释液(3滴)，反应15min，25min后结果失效。
由于指尖血和静脉全血中红细胞含量较高，其抗原浓度与血清或血浆中抗原浓度相比偏低，所以检测指尖血或静脉全血样本的滴加体积比检测血清或血浆的滴加体积多一倍。
进一步的，指尖血检测包括以下步骤；
(1)撕开一次性酒精棉片，擦拭指尖，自然干燥；
(2)打开采血针帽，压到消毒的指尖，针刺指尖；
(3)挤出第一滴血，棉棒擦掉；
(4)挤出第二滴血10-20ul(1滴)，加入样品孔，加3滴稀释液(60ul)，用棉棒按压止血；
(5)反应15min，25min后结果失效。
全血样本的检测：将样本垫装成试纸卡，检测全血样本，通过37℃高温加速7天观察是否能够完全过滤掉红细胞，优选的样本垫处理液配方为含有10mmol/L、pH7.4 PB，5％海藻糖，0.5％吐温20，0.5mg/ml抗人红细胞抗体。
本发明所用检测方法为夹心法，主要用于检测比较大生物分子、颗粒性抗原；当待检样品液体滴加到试剂条样本垫上后，通过层析作用，液体依次会层析至结合垫、T线、C线；
当待检样品为含有中和抗体的样品，在经过结合垫时，待检样品液体中含有的中和抗体与结合垫上的金标S-RBD抗原结合；在经过T线时，待检样品液体中已经与金标S-RBD抗原结合的中和抗体被T线上的包被RBD抗原捕获，胶体金聚集显红色；在经过C线时，兔抗鸡IgY抗体捕获金标鸡IgY抗体，胶体金聚集显红色；
当待检样品为不含有中和抗体的样品，在经过T线时，包被RBD抗原不捕获待检样品，不显色；在经过C线时，兔抗鸡IgY抗体捕获金标鸡IgY抗体，胶体金聚集显红色；
因此，观察窗内在T线和C线区有两条红色条带，表明样品中待测物质为阳性；观察窗内C线区1条红色条带，T线区没有条带，表明样品中待测物质为阴性；待测物质浓度越高，T线显色强度越强；观察窗内C线区无红色条带，T线区有或没有条带，表明试验无效。
本发明的有益效果：
本发明提供一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒是利用了基于膜层析作用的定性免疫分析方法，用于检测人血清、血浆或全血中新型冠状病毒中和抗体；在临床上用于评估新型冠状病毒感染后康复患者的中和抗体，或辅助评估新型冠状病毒疫苗的作用；
用本发明制备的试剂盒对待检样品进行检测，在T线和C线区有两条红色条带，表明待检样品中含有中和抗体；C线区1条红色条带，T线区没有条带，表明待检样品中不含有中和抗体；中和抗体浓度越高，T线显色强度越强；C线区无红色条带，T线区有或没有条带，表明试验无效；
本发明制备的试剂盒检测中和抗体的灵敏度高，用该试剂盒对浓度为0.039ug/ml的重组中和抗体进行检测，依旧显色良好且没有假阳性表现，对浓度为0.312ug/ml的重组中和抗体进行重复性检测，显色一致，本发明制备的试剂盒不仅特异性强，灵敏度高，而且稳定性好。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为本发明制备的试剂盒的结构示意图；
图2为本发明实施例3、实施例4、实施例5、实施例6的检测结果示意图；
图3为本发明实施例3制备的试剂盒对重组中和抗体浓度为0.312ug/ml进行重复检测10次的检测结果示意图；
附图标记：1-底板，2-样品垫，3-胶体金结合垫，4-硝酸纤维素膜，41-检测T线，42-质控C线，5-吸水垫，6-滤血膜。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明，若本发明实施例及附图中有涉及方向性指示诸如上、下、左、右、前、后……，则该方向性指示仅用于解释在某一特定姿态如各部件之间的相对位置关系、层析情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
S1、胶体金溶液的准备：制备胶体金溶液，步骤如下：
(1)将待用锥形瓶及转子先浸入0.1mol/L的氢氧化钠溶液中，充分浸泡2小时，然后用纯化水冲洗玻璃器具至中性，玻璃器具再用超纯水淋洗三遍，将淋洗后的器具有序放入鼓风干燥箱中，然后在60℃烘烤9h，烘烤结束后放入干净的整理箱中备用；
(2)在锥形瓶中加入100mL超纯水，用移液器加入2％氯金酸1ml，混匀后放置在电炉上加热，沸腾约1min后加入1％柠檬酸三钠2.5g，当溶液变为通透的红色后，继续加热1min，待溶液冷却后即得到胶体金溶液；
(3)将适量胶体金溶液放入比色皿中，肉眼观察应为酒红色液体，质地均匀，无杂质，在紫外分光光度计下检测在525-535nm波长处应有最大吸收峰，则判定达到标准，4℃避光保存；
S2、胶体金结合垫3的制备：
(1)抗原和抗体标记
抗原标记：取1mL上述胶体金溶液于2ml EP管中，取13ul 0.2M的碳酸钾溶液调节pH，缓慢均匀地加入16μg S-RBD抗原，混匀仪室温混匀30分钟；迅速加入100μL 10％牛血清白蛋白溶液，混匀20分钟后室温静置30分钟，13000rpm离心30分钟；弃去上清液，将沉淀溶于150μL胶体金重悬缓冲液中，4℃保存备用；
抗体标记：取1mL上述胶体金溶液于2ml EP管中，取7ul 0.2M的碳酸钾溶液调节pH，缓慢均匀地加入15μg鸡IgY抗体，混匀仪室温混匀30分钟；迅速加入100μL 10％牛血清白蛋白溶液，混匀20分钟后室温静置30分钟，13000rpm离心30分钟；弃去上清液，将沉淀溶于150μL胶体金重悬缓冲液中，4℃保存备用；
(2)喷金
按“喷金划线仪使用与管理标准操作规程”清洗管道，设定喷金量为8ul/cm、速度为30mm/s、喷金长度为30cm；将重悬好的金标S-RBD抗原加到进样瓶中，将金标垫按固定位置平放在仪器平台，按“GO”键开始喷金，喷金结束后，取下喷好金标抗原的金标垫，室温干燥1h，然后把金标鸡IgY抗体喷到已干燥的金标垫上，取下金标垫放置在电子干燥柜中，干燥时间3d，湿度1％-10％，干燥，干燥结束后进行免疫层析试纸条大板的组装；
S3、硝酸纤维素膜4的制备：用含有稳定剂的磷酸缓冲液将兔抗鸡IgY抗体稀释至0.2mg/mL，用含有稳定剂的磷酸缓冲液将RBD抗原稀释至1.0mg/ml；按“喷金划膜仪使用与管理标准操作规程”清洗管道，设定划线量为1μL/cm、划线长度30cm，划线速度：40mm/s，T-C线之间距离为6.0mm±0.5mm，C线距离金标垫端距离为16.0mm±0.5mm；将包被液加到对应管道的进样瓶，1号管道为检测带通道，装“T”标记包被液，2号管道为质控带通道，装“C”标记包被液；将硝酸纤维素膜4按固定位置平放在仪器平台，按“GO”键开始划线，划线结束后，取下划好线的硝酸纤维素膜4在划线不均匀处做好标记；划好的C、T线的硝酸纤维素膜4在电子干燥柜干燥，干燥时间3d，湿度5％-15％，干燥结束后进行免疫层析试纸条大板的组装；开启空调，使环境温度保持在18℃-26℃，湿度保持在25％-40％；
S4、切条组装：除去PVC底板25mm处的保护纸，沿上面保护纸的下边缘，将硝酸纤维素膜4贴在该区，胶体金结合垫3上边缘超出该区1mm覆盖硝酸纤维素膜4，胶体金结合垫3下面贴有滤血膜，预处理的样本垫2上边缘2mm覆盖胶体金结合垫3，下边缘与底板边缘齐平，将吸水纸5粘在底板上，吸水纸5下边缘超出该区2mm覆盖硝酸纤维素膜4；上边缘与底板边缘齐平；将胶体金免疫层析试纸条大板切成3.00mm±0.05mm宽，放入卡壳底座的凹槽里，盖上上盖，成品置于铝箔袋中，加入干燥剂，封口机封口，干燥环境保存备用；
样本垫处理液的配制：以10mmol/L、pH7.4 PB为基础缓冲液，添加0.5％的海藻糖，0.1％的吐温20，0.1mg/ml的抗人红细胞抗体；
样本垫2的处理及干燥：取配置好的样本垫处理液，铺在样本垫2上，30cm长×1.5cm宽需4.5ml样本垫处理液，处理好的样本垫2放在电子干燥柜中，干燥时间12h,1％-10％湿度，干燥结束后放在放有干燥剂的铝箔袋中备用；
样本稀释液的配制：配制0.01M PBS pH 7.4+1％吐温20+0.05％Proclin300的样本稀释液；
S5、将S4中试纸条与卡壳组装得到新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒；
检测：
(1)将含有中和抗体的血清用样本稀释液平衡至10-30℃；
(2)标记样本编号，去除检测试剂外包装；
(3)取5ul-10ul(一滴)加入样品孔，加60ul稀释液(三滴)，反应15min，25min后结果失效。
在T线和C线区有两条红色条带，表明为阳性。
实施例2
S1、胶体金溶液的准备：制备胶体金溶液，步骤如下：
(1)将待用锥形瓶及转子先浸入0.1mol/L的氢氧化钠溶液中，充分浸泡2小时，然后用纯化水冲洗玻璃器具至中性，玻璃器具再用超纯水淋洗三遍，将淋洗后的器具有序放入鼓风干燥箱中，然后在70℃烘烤9h，烘烤结束后放入干净的整理箱中备用；
(2)在锥形瓶中加入100mL超纯水，用移液器加入2％氯金酸1.1ml，混匀后放置在电炉上加热，沸腾约1min后加入1％柠檬酸三钠3.45g，当溶液变为通透的红色后，继续加热1min，待溶液冷却后即得到胶体金溶液；
(3)将适量胶体金溶液放入比色皿中，肉眼观察应为酒红色液体，质地均匀，无杂质，在紫外分光光度计下检测在525-535nm波长处应有最大吸收峰，则判定达到标准，4℃避光保存；
S2、胶体金结合垫3的制备：
(1)抗原和抗体标记
抗原标记：取1mL上述胶体金溶液于2ml EP管中，取13ul 0.2M的碳酸钾溶液调节pH，缓慢均匀地加入16μg S-RBD抗原，混匀仪室温混匀30分钟；迅速加入100μL 10％牛血清白蛋白溶液，混匀20分钟后室温静置30分钟，13000rpm离心30分钟；弃去上清液，将沉淀溶于150μL胶体金重悬缓冲液中，4℃保存备用；
抗体标记：取1mL上述胶体金溶液于2ml EP管中，取7ul 0.2M的碳酸钾溶液调节pH，缓慢均匀地加入15μg鸡IgY抗体，混匀仪室温混匀30分钟；迅速加入100μL 10％牛血清白蛋白溶液，混匀20分钟后室温静置30分钟，13000rpm离心30分钟；弃去上清液，将沉淀溶于150μL胶体金重悬缓冲液中，4℃保存备用；
(2)喷金
按“喷金划线仪使用与管理标准操作规程”清洗管道，设定喷金量为8ul/cm、速度为30mm/s、喷金长度为30cm；将重悬好的金标S-RBD抗原加到进样瓶中，将金标垫按固定位置平放在仪器平台，按“GO”键开始喷金，喷金结束后，取下喷好金标抗原的金标垫，室温干燥1h，然后把金标鸡IgY抗体喷到已干燥的金标垫上，取下金标垫放置在电子干燥柜中，干燥时间3d，湿度20％-30％，干燥，干燥结束后进行免疫层析试纸条大板的组装；
S3、硝酸纤维素膜4的制备：用含有稳定剂的磷酸缓冲液将兔抗鸡IgY抗体稀释至0.2mg/mL，用含有稳定剂的磷酸缓冲液将RBD抗原稀释至1.0mg/ml；按“喷金划膜仪使用与管理标准操作规程”清洗管道，设定划线量为1μL/cm、划线长度30cm，划线速度：40mm/s，T-C线之间距离为6.0mm±0.5mm，C线距离金标垫端距离为16.0mm±0.5mm；将包被液加到对应管道的进样瓶，1号管道为检测带通道，装“T”标记包被液，2号管道为质控带通道，装“C”标记包被液；将硝酸纤维素膜4按固定位置平放在仪器平台，按“GO”键开始划线，划线结束后，取下划好线的硝酸纤维素膜4在划线不均匀处做好标记；划好的C、T线的硝酸纤维素膜4在电子干燥柜干燥，干燥时间3d，湿度25％-35％，干燥结束后进行免疫层析试纸条大板的组装；开启空调，使环境温度保持在18℃-26℃，湿度保持在25％-40％；
S4、切条组装：除去PVC底板25mm处的保护纸，沿上面保护纸的下边缘，将硝酸纤维素膜4贴在该区，胶体金结合垫3上边缘超出该区1mm覆盖硝酸纤维素膜4，胶体金结合垫3下面贴有滤血膜，预处理的样本垫2上边缘2mm覆盖胶体金结合垫3，下边缘与底板边缘齐平，将吸水纸5粘在底板上，吸水纸5下边缘超出该区2mm覆盖硝酸纤维素膜4；上边缘与底板边缘齐平；将胶体金免疫层析试纸条大板切成3.00±0.05mm宽，放入卡壳底座的凹槽里，盖上上盖，成品置于铝箔袋中，加入干燥剂，封口机封口，干燥环境保存备用；
样本垫处理液的配制：以10mmol/L、pH7.4 PB为基础缓冲液，添加3％的海藻糖，1％的吐温20，0.3mg/ml的抗人红细胞抗体；
样本垫2的处理及干燥：取配置好的样本垫处理液，铺在样本垫2上，30cm长×1.5cm宽需4.5ml样本垫处理液，处理好的样本垫2放在电子干燥柜中，干燥时间12h,20％-30％湿度，干燥结束后放在放有干燥剂的铝箔袋中备用；
样本稀释液的配制：配制0.01M PBS pH 7.4+1％吐温20+0.05％Proclin300的样本稀释液；
S5、将S4中试纸条与卡壳组装得到新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒；
检测：
(1)将含有中和抗体的全血用样本稀释液平衡至10-30℃；
(2)标记样本编号，去除检测试剂外包装；
(3)取15ul-20ul样本(一滴)，加入样品孔，加60ul稀释液(三滴)，反应15min，25min后结果失效。
在T线和C线区有两条红色条带，表明为阳性。
实施例3
S1、胶体金溶液的准备：制备胶体金溶液，步骤如下：
(1)将待用锥形瓶及转子先浸入0.1mol/L的氢氧化钠溶液中，充分浸泡2小时，然后用纯化水冲洗玻璃器具至中性，玻璃器具再用超纯水淋洗三遍，将淋洗后的器具有序放入鼓风干燥箱中，然后在65℃烘烤9h，烘烤结束后放入干净的整理箱中备用；
(2)在锥形瓶中加入100mL超纯水，用移液器加入2％氯金酸1.3ml，混匀后放置在电炉上加热，沸腾约1min后加入1％柠檬酸三钠2.6g，当溶液变为通透的红色后，继续加热1min，待溶液冷却后即得到胶体金溶液；
(3)将适量胶体金溶液放入比色皿中，肉眼观察应为酒红色液体，质地均匀，无杂质，在紫外分光光度计下检测在525-535nm波长处应有最大吸收峰，则判定达到标准，4℃避光保存；
S2、胶体金结合垫3的制备：
(1)抗原和抗体标记
抗原标记：取1mL上述胶体金溶液于2ml EP管中，取13ul 0.2M的碳酸钾溶液调节pH，缓慢均匀地加入16μg S-RBD抗原，混匀仪室温混匀30分钟；迅速加入100μL 10％牛血清白蛋白溶液，混匀20分钟后室温静置30分钟，13000rpm离心30分钟；弃去上清液，将沉淀溶于150μL胶体金重悬缓冲液中，4℃保存备用；
抗体标记：取1mL上述胶体金溶液于2ml EP管中，取7ul 0.2M的碳酸钾溶液调节pH，缓慢均匀地加入15μg鸡IgY抗体，混匀仪室温混匀30分钟；迅速加入100μL 10％牛血清白蛋白溶液，混匀20分钟后室温静置30分钟，13000rpm离心30分钟；弃去上清液，将沉淀溶于150μL胶体金重悬缓冲液中，4℃保存备用；
(2)喷金
按“喷金划线仪使用与管理标准操作规程”清洗管道，设定喷金量为8ul/cm、速度为30mm/s、喷金长度为30cm；将重悬好的金标S-RBD抗原加到进样瓶中，将金标垫按固定位置平放在仪器平台，按“GO”键开始喷金，喷金结束后，取下喷好金标抗原的金标垫，室温干燥1h，然后把金标鸡IgY抗体喷到已干燥的金标垫上，取下金标垫放置在电子干燥柜中，干燥时间3d，湿度10％-20％，干燥，干燥结束后进行免疫层析试纸条大板的组装；
S3、硝酸纤维素膜4的制备：用含有稳定剂的磷酸缓冲液将兔抗鸡IgY抗体稀释至0.2mg/mL，用含有稳定剂的磷酸缓冲液将RBD抗原稀释至1.0mg/ml；按“喷金划膜仪使用与管理标准操作规程”清洗管道，设定划线量为1μL/cm、划线长度30cm，划线速度：40mm/s，T-C线之间距离为6mm±0.5mm，C线距离金标垫端距离为16mm±0.5mm；将包被液加到对应管道的进样瓶，1号管道为检测带通道，装“T”标记包被液，2号管道为质控带通道，装“C”标记包被液；将硝酸纤维素膜4按固定位置平放在仪器平台，按“GO”键开始划线，划线结束后，取下划好线的硝酸纤维素膜4在划线不均匀处做好标记；划好的C、T线的硝酸纤维素膜4在电子干燥柜干燥，干燥时间3d，湿度15％-25％，干燥结束后进行免疫层析试纸条大板的组装；开启空调，使环境温度保持在18-26℃，湿度保持在25-40％；
S4、切条组装：除去PVC底板25mm处的保护纸，沿上面保护纸的下边缘，将硝酸纤维素膜4贴在该区，胶体金结合垫3上边缘超出该区1mm覆盖硝酸纤维素膜4，胶体金结合垫3下面贴有滤血膜，预处理的样本垫2上边缘2mm覆盖胶体金结合垫3，下边缘与底板边缘齐平，将吸水纸5粘在底板上，吸水纸5下边缘超出该区2mm覆盖硝酸纤维素膜4；上边缘与底板边缘齐平；将胶体金免疫层析试纸条大板切成3mm±0.05mm宽，放入卡壳底座的凹槽里，盖上上盖，成品置于铝箔袋中，加入干燥剂，封口机封口，干燥环境保存备用；
样本垫处理液的配制：以10mmol/L、pH7.4 PB为基础缓冲液，添加5％的海藻糖，0.5％的吐温20，0.5mg/ml的抗人红细胞抗体；
样本垫2的处理及干燥：取配置好的样本垫处理液，铺在样本垫2上，30cm长×1.5cm宽需4.5ml样本垫处理液，处理好的样本垫2放在电子干燥柜中，干燥时间12h，10％-20％湿度，干燥结束后放在放有干燥剂的铝箔袋中备用；
样本稀释液的配制：配制0.01M PBS pH 7.4+1％吐温20+0.05％Proclin300的样本稀释液；
S5、将S4中试纸条与卡壳组装得到新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒；
检测：
(1)标记样本编号，去除检测试剂外包装；
(2)撕开一次性酒精棉片，擦拭指尖，自然干燥；
(3)打开采血针帽，压到消毒的指尖，针刺指尖；
(4)挤出第一滴血，棉棒擦掉；
(5)挤出第二滴血10-20ul(1滴)，加入样品孔，加3滴样本稀释液(60ul)平衡至10-30℃，用棉棒按压止血；
(7)反应15min，25min后结果失效。
指尖血取自打完新冠疫苗的志愿者，在T线和C线区有两条红色条带，表明为阳性，如图2所示。
实施例4
用实施例3制备的试剂盒对不含有中和抗体的全血进行检测；C线区1条红色条带，T线区没有条带，表明待检样品中不含有中和抗体，表明为阴性，如图2所示。
实施例5
用实施例3制备的试剂盒对不含有中和抗体的全血进行检测；T线区1条红色条带，C线区没有条带，检测结果无效，如图2所示。
实施例6
用实施例3制备的试剂盒对不含有中和抗体的全血进行检测；T线区、C线区都没有条带，检测结果无效，如图2所示。
性能测试：用实施例3制备的试剂盒检测不同浓度的重组中和抗体；
外购伊佰新(货号：XGZH-1)新型冠状病毒重组中和抗体，利用样本稀释液把重组中和抗体稀释至5ug/ml、2.5ug/ml、1.25ug/ml、0.625ug/ml、0.312ug/ml、0.156ug/ml、0.078ug/ml、0.039ug/ml进行检测，分别取每个浓度的样品30份，通过本申请公开的检测试剂盒进行检测，检测结果如表1，重组中和抗体浓度在0.039ug/ml也能被检测出来在没有假阳性表现的同时准确率也高达96.7％；对重组中和抗体浓度为0.312ug/ml进行重复检测10次，如图3，显色一致，说明此试剂盒特异性强，灵敏度高，稳定性好。
样品浓度 样品数 阳性数 准确率
5ug/ml 30 30 100％
2.5ug/ml 30 30 100％
1.25ug/ml 30 30 100％
0.625ug/ml 30 30 100％
0.312ug/ml 30 30 100％
0.156ug/ml 30 30 100％
0.078ug/ml 30 30 100％
0.039ug/ml 30 29 96.7％
表1
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图所做的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于：包括卡壳、位于卡壳内的试纸条，所述试纸条由底板(1)、样品垫(2)、滤血膜(6)、胶体金结合垫(3)、硝酸纤维素膜(4)、吸水纸(5)组成，所述底板(1)上从下往上依次粘贴有样品垫(2)、滤血膜(6)、胶体金结合垫(3)、硝酸纤维素膜(4)和吸水纸(5)；所述硝酸纤维素膜(4)上靠近所述吸水纸(5)一侧设有质控C线(42)；所述硝酸纤维素膜(4)上靠近所述胶体金结合垫(3)一侧设有检测T线(41)。
2.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于：所述质控C线(42)上包被兔抗鸡IgY抗体；所述检测T线(41)上包被RBD抗原，所述胶体金结合垫(3)上涂有金标S-RBD抗原和金标鸡IgY抗体。
3.一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、制备胶体金溶液，备用；
S2、胶体金结合垫(3)的制备：用S1中胶体金溶液分别标记S-RBD抗原、鸡IgY抗体得到金标S-RBD抗原、金标鸡IgY抗体，然后在金标垫上喷涂金标S-RBD抗原，干燥后将金标鸡IgY抗体喷涂在金标S-RBD抗原上；
S3、硝酸纤维素膜(4)的制备：将RBD抗原包被在硝酸纤维素膜(4)上形成检测T线(41)，将兔抗鸡IgY抗体包被在硝酸纤维素膜(4)上形成质控C线(42)；
S4、切条组装：将样本垫(2)、滤血膜(6)、胶体金结合垫(3)、硝酸纤维素膜(4)、吸水纸(5)从左到右依次搭接贴在底板(1)上，得到试纸条；
S5、将S4中试纸条与卡壳组装得到新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒。
4.根据权利要求3所述的一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤S1中制备胶体金溶液包括以下步骤：
(1)将超纯水、氯金酸溶液混合，搅拌条件下加热至沸腾，沸腾1min后加入柠檬酸三钠，当溶液变为通透的红色后，继续加热1min，待溶液冷却后得到胶体金溶液；
(2)进行紫外检测。
5.根据权利要求4所述的一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述氯金酸溶液的质量分数为2％，所述超纯水与氯金酸溶液的体积比为100:(1-1.3)；所述柠檬酸三钠的质量分数为1％，所述柠檬酸三钠与超纯水的质量体积比为(2.5-3.45g):100ml。
6.根据权利要求4所述的一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于：紫外检测波长为525-535nm。
7.根据权利要求3所述的一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤S4中样本垫用样本垫处理液处理；所述样本垫处理液由基础缓冲液、海藻糖、吐温20、抗人红细胞抗体混合而成；所述基础缓冲液为10mmol/LPB，所述基础缓冲液pH为7.4；所述海藻糖在样本垫处理液中的含量为0.5-5％；所述吐温20在样本垫处理液中的含量为0.1-1％；所述抗人红细胞抗体在样本垫处理液中含量为0.1-0.5mg/ml。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述试剂盒用于中和抗体检测，包括以下步骤：
a.取全血、血清、血浆中的一种作为待检样品，所用样本稀释液平衡至室温；
b.标记样本编号，去除检测试剂外包装；
c.进行检测。
9.根据权利要求8所述的一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于：当待检样品为血清或血浆，检测步骤如下：取5-10ul待检样品，加入样品孔，加60ul样本稀释液，反应15min，25min后结果失效；当待检样品为静脉全血，检测步骤如下：取10-20ul待检样品，加入样品孔，加60ul样本稀释液，反应15min，25min后结果失效；当待检样品为指尖血，检测步骤如下：取第二滴指尖血，加入样品孔，加60ul样本稀释液，反应15min，25min后结果失效。
10.根据权利要求8所述的一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述样本稀释液由PBS、吐温20、Proclin300混合而成；所述PBS的摩尔体积为10mmol/L，pH为7.4；所述吐温20在样本稀释液中的含量为1％；所述Proclin300在样本稀释液中的含量为0.05％。
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