CN113820413B - 高效液相色谱法分离测定磷酸芦可替尼及杂质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分析化学领域，具体公开了高效液相色谱法分离测定磷酸芦可替尼及杂质的方法。本发明改进了相关色谱条件参数，使得磷酸芦可替尼和杂质能较好的分离，利用该方法对主药及其杂质进行定性、定量分析。本发明方法专属性好，不受空白溶剂和其他未知杂质干扰，且主峰与杂质B间分离度为3.99，其他已知杂质间分离度均大于1.5，本发明方法具有简单、快速、准确度高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学领域，具体涉及高效液相色谱法分离测定磷酸芦可替尼及杂质的方法。
背景技术
磷酸芦可替尼是JAK1/JAK2抑制剂，其主要用于中危或高危的原发性骨髓纤维化(亦称为慢性特发性骨髓纤维化)、真性红细胞增多症继发的骨髓纤维化或原发性血小板增多症继发的骨髓纤维化的成年患者，治疗疾病相关脾肿大或疾病相关症状。
磷酸芦可替尼在治疗过程中需要严格控制剂量，并周期性监控用药患者体内的血小板含量，医生根据相关指标进行剂量调整。然而在其生产过程中有较多杂质的产生，其杂质势必会影响主药有效成分的含量，因此在生产过程中对其杂质的检测显得尤为重要。
高效液相色谱法常应用于各项药物杂质的检测，但是磷酸芦可替尼片剂进口注册标准(JX20140057)有关物质色谱条件并不适用于所有厂家的成品药检测，并且目前未有能同时分离测定主药和相关杂质的具体方法，这对药企的生产效率和成品合格率产生了不良影响。
发明内容
本发明为了解决上述问题，提供了高效液相色谱法分离测定磷酸芦可替尼及杂质的方法，本发明探寻了磷酸芦可替尼和杂质能较好分离的色谱条件，利用该方法对主药及其杂质进行定性、定量分析。
本发明目的之一在于提供一种高效液相色谱法分离磷酸芦可替尼及杂质的方法，具体技术方案如下：
流动相A为磷酸二氢钾，流动相B为甲醇-乙腈；色谱柱填充剂为十八硅烷键合硅胶；杂质包括：
具体的，所述杂质还包括：
具体的，所述甲醇-乙腈中甲醇与乙腈的体积比为50：50。
具体的，洗脱比例为：
0min，流动相A与流动相B的体积比为70：30，
2min，流动相A与流动相B的体积比为70：30，
22min，流动相A与流动相B的体积比为48：52，
27min，流动相A与流动相B的体积比为20：80，
35min，流动相A与流动相B的体积比为20：80，
36min，流动相A与流动相B的体积比为70：30，
45min，流动相A与流动相B的体积比为70：30。
具体的，所述流动相A的pH值为3.5±0.1。
具体的，流速为1±0.1ml/min。
具体的，所述磷酸二氢钾的浓度为0.03±0.005mol/L。
具体的，检测波长为220±10nm。
具体的，柱温为35±2℃。
具体的，稀释剂为甲醇。
本发明目的之二在于提供一种高效液相色谱法测定磷酸芦可替尼及杂质含量的方法，具体技术方案如下：
采用内标法测定磷酸芦可替尼或杂质的含量，流动相A为磷酸二氢钾，流动相B为甲醇-乙腈；色谱柱填充剂为十八硅烷键合硅胶；洗脱比例为：杂质包括：
具体的，所述杂质还包括：
具体的，洗脱比例为：
0min，流动相A与流动相B的体积比为70：30，
2min，流动相A与流动相B的体积比为70：30，
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45min，流动相A与流动相B的体积比为70：30。
具体的，所述甲醇-乙腈中甲醇与乙腈的体积比为50：50。
具体的，所述流动相A的pH值为3.5±0.1。
具体的，流速为1±0.1ml/min。
具体的，所述磷酸二氢钾的浓度为0.03±0.005mol/L。
具体的，检测波长为220±10nm。
具体的，柱温为35±2℃。
具体的，稀释剂为甲醇。
具体的，对照溶液浓度为2±0.05μg/ml，供试品溶液浓度为2.0±0.05mg/ml。
本发明的有益之处在于：本发明方法专属性强，能有效分离所有已知杂质及未知杂质，磷酸芦可替尼成品质量得到有效控制，其能够实现成品中杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I共计8个杂质在一套HPLC方法中有效分离，专属性好，不受空白溶剂和其他未知杂质干扰，且主峰与杂质B间分离度为3.99，大于1.5，其他已知杂质间分离度均大于1.5，符合有关物质要求，该方法具有简单、快速、准确度高等优点。
附图说明
图1为实施例2中空白溶剂HPLC图；
图2为实施例2中混合溶液HPLC图；
图3为实施例2中杂质G定位溶液HPLC图；
图4为实施例2中杂质B定位溶液HPLC图；
图5为实施例2中杂质C定位溶液HPLC图；
图6为实施例2中杂质D定位溶液HPLC图；
图7为实施例2中杂质E定位溶液HPLC图；
图8为实施例2中杂质F定位溶液HPLC图；
图9为实施例2中杂质H定位溶液HPLC图；
图10为实施例2中杂质I定位溶液HPLC图；
图11为实施例2中供试品溶液HPLC图；
图12为实施例3中洗脱梯度比例1的HPLC图；
图13为实施例3中洗脱梯度比例2的HPLC图；
图14为实施例3中洗脱梯度比例3的HPLC图；
图15为实施例3中洗脱梯度比例4的HPLC图；
图16为实施例3中洗脱梯度比例5的HPLC图；
图17为实施例3中洗脱梯度比例6的HPLC图；
图18为实施例4中混合溶液1的HPLC图；
图19为实施例4中混合溶液2的HPLC图；
图20为实施例4中混合溶液3的HPLC图；
图21为实施例4中混合溶液4的HPLC图；
图22为实施例4中混合溶液5的HPLC图；
图23为实施例4中混合溶液6的HPLC图；
图24为实施例4中混合溶液7的HPLC图；
图25为实施例4中混合溶液8的HPLC图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行进一步详细说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的结构思路、使用范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明主要分离测定了表1所示的化合物，探寻了高效液相色谱法的相关洗脱条件参数，使得其主药与相关杂质有较好的分离度，从而能准确测定各物质含量。
表1分离测定物质
实施例1
本实施例具体记载高效液相色谱法分离磷酸芦可替尼及杂质的方法，具体技术方案为：流动相A为磷酸二氢钾，流动相B为甲醇-乙腈；色谱柱填充剂为十八硅烷键合硅胶；
杂质包括：
该方法还能分离如下杂质：
具体的，洗脱比例为：
0min，流动相A与流动相B的体积比为70：30，
2min，流动相A与流动相B的体积比为70：30，
22min，流动相A与流动相B的体积比为48：52，
27min，流动相A与流动相B的体积比为20：80，
35min，流动相A与流动相B的体积比为20：80，
36min，流动相A与流动相B的体积比为70：30，
45min，流动相A与流动相B的体积比为70：30。
具体的，甲醇-乙腈中甲醇与乙腈的体积比为50：50。
具体的，所述流动相A的pH值为3.5±0.1。
具体的，流速为1±0.1ml/min。
具体的，所述磷酸二氢钾的浓度为0.03±0.005mol/L。
具体的，检测波长为220±10nm。
具体的，柱温为35±2℃。
具体的，稀释剂为甲醇。
本实施例记载的方法不仅能分离磷酸芦可替尼及杂质，同时也能根据常规方法测量其各物质含量，包括但不限于外标法和内标法，本实施例仅仅是记载了最佳的分离和/或测定磷酸芦可替尼及杂质的方法，其相关参数条件包括洗脱梯度比例、缓冲盐种类及浓度、流速、柱温等可在一定范围内进行调整，即本发明请求保护的范围不仅仅限于实施例1涵盖的范围，例如后续实施例3记载了其它可行的高效液相色谱法的条件参数。
实施例2
本实施例在实施例1的基础上进一步说明了高效液相色谱法测定磷酸芦可替尼及杂质含量的方法，即具体限定了相关条件参数，具体如下：
1、洗脱条件参数
本实施例利用高效液相色谱法分离测定磷酸芦可替尼及杂质含量，具体实验条件和参数如表2所示。
表2高效液相色谱法分离测定磷酸芦可替尼及杂质的条件参数
2、溶液配制
杂质B贮备液：精密称取杂质B对照品25.56mg，置25ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质C贮备液：精密称取杂质C对照品10.46mg，置25ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质D贮备液：精密称取杂质D对照品24.69mg，置25ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质E贮备液：精密称取杂质E对照品25.04mg，置25ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质F贮备液：精密称取杂质F对照品25.67mg，置25ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质G贮备液：精密称取杂质G对照品8.10mg，置25ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。
杂质H(D-DMTA)贮备液：精密称取杂质H对照品25.02mg，置25ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质I(对甲氧基苯甲酸)贮备液：精密称取对甲氧基苯甲酸对照品25.32mg，置25ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
空白溶剂，其HPLC图如图1所示。
杂质混合贮备液：精密移取杂质B、杂质D、杂质E、杂质F、杂质H、杂质I贮备液3.0ml，杂质C贮备液7.5ml，置同一100ml量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。
混合溶液：精密称取供试品49.98mg，置25ml量瓶中，精密量取杂质混合贮备液2.5ml、杂质G定位溶液5ml，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得，其HPLC图如图2所示。
各杂质定位溶液：分别精密移取杂质C贮备液0.25ml，其余各杂质贮备液0.1ml，分别置不同10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得，其HPLC图如图3-10所示。
供试品溶液：精密称取供试品50.03mg，置25ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得，其HPLC图如图11所示。
3、实验结果
结合图1-11可以得到表3所示的实验结果，其中，空白溶剂不干扰本品有关物质的测定，各已知杂质峰之间、主峰与邻近杂质峰间分离度均大于1.5，互不干扰测定，分离度良好。
表3各物质分离实验结果
实施例3
本实施例记载了其它可行性色谱条件，包括洗脱梯度比例、缓冲盐种类及浓度、流速、柱温等。
1、不同洗脱梯度比例的研究
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18 4.6mm×250mm，5μm
柱温：25℃
流速：1.0ml/min
流动相A：0.03mol/L磷酸二氢钾水溶液(用磷酸调节PH至3.5)
流动相B：甲醇
流动相C：乙腈
洗脱梯度比例1：(HPLC图如图12，各杂质分离度符合要求)
洗脱梯度比例2：(HPLC图如图13，各杂质分离度符合要求)
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) | 流动相C(％) |
| 0 | 70 | 15 | 15 |
| 2 | 70 | 15 | 15 |
| 20 | 60 | 20 | 20 |
| 25 | 20 | 40 | 40 |
| 40 | 20 | 40 | 40 |
| 41 | 70 | 15 | 15 |
| 50 | 70 | 15 | 15 |
洗脱梯度比例3：(HPLC图如图14，各杂质分离度符合要求)
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) | 流动相C(％) |
| 0 | 75 | 12.5 | 12.5 |
| 2 | 75 | 12.5 | 12.5 |
| 22 | 48 | 26 | 26 |
| 27 | 20 | 40 | 40 |
| 45 | 20 | 40 | 40 |
| 46 | 75 | 12.5 | 12.5 |
| 55 | 75 | 12.5 | 12.5 |
洗脱梯度比例4：(HPLC图如图15，各杂质分离度符合要求)
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) | 流动相C(％) |
| 0 | 70 | 15 | 15 |
| 35 | 20 | 40 | 40 |
| 45 | 20 | 40 | 40 |
| 46 | 70 | 15 | 15 |
| 55 | 70 | 15 | 15 |
洗脱梯度比例5：(HPLC图如图16，各杂质分离度符合要求)
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) | 流动相C(％) |
| 0 | 70 | 15 | 15 |
| 40 | 20 | 40 | 40 |
| 50 | 20 | 40 | 40 |
| 51 | 70 | 15 | 15 |
| 60 | 70 | 15 | 15 |
洗脱梯度比例6：(HPLC图如图17，各杂质分离度符合要求)
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) | 流动相C(％) |
| 0 | 70 | 15 | 15 |
| 45 | 20 | 40 | 40 |
| 55 | 20 | 40 | 40 |
| 56 | 70 | 15 | 15 |
| 65 | 70 | 15 | 15 |
2、缓冲盐种类及浓度
(1)流动相A：0.03mol/L磷酸二氢铵水溶液(用磷酸调节PH至3.5)，其余色谱条件同实施例2，各杂质分离度符合要求。
(2)流动相A：0.03mol/L磷酸二氢钠水溶液(用磷酸调节PH至3.5)，其余色谱条件同实施例1，各杂质分离度符合要求。
(3)流动相A：0.02mol/L和0.04mol/L磷酸二氢钾水溶液(用磷酸调节PH至3.5)，其余色谱条件同实施例2，各杂质分离度符合要求。当浓度为0.01mol/L时，其余色谱条件同实施例2，其分离度不符合要求。
3、流速对杂质分离情况的影响
流速为0.8ml/min和1.2ml/min，其余色谱条件同实施例2，各杂质分离度均符合要求。
4、柱温
柱温为25℃，35℃和40℃时，其余色谱条件同实施例2，各杂质分离度均符合要求。
实施例4
本实施例对前期实验方法的相关重要参数进行了比较探寻，其中包括流动相的种类、pH值、比值和洗脱梯度的改进，突出了本发明方法的创新性。
1、已有标准色谱条件检测不能较好分离主药及本身记载的相关杂质
前期发现采用磷酸芦可替尼片剂采用进口注册标准(JX20140057)有关物质色谱条件并不能有效的分离主药及相关杂质。如图18所示，其为磷酸芦可替尼片剂采用进口注册标准(JX20140057)有关物质色谱条件(如表4所示)得到的HPLC图。可见，有关物质方法对我司各已知杂质及主成分混合溶液的分离结果显示：杂质C与杂质F未分开，杂质B与主峰未分开，各杂质峰拖尾，该方法不适用，因此磷酸芦可替尼片剂进口注册标准(JX20140057)有关物质色谱条件不适宜用于我司成品的相关杂质的检测。
表4磷酸芦可替尼片剂采用进口注册标准(JX20140057)有关物质色谱条件
2、符合标准的流动相的探寻
用水为流动相A，甲醇为流动相B时，具体色谱条件和洗脱方式如表5所示，其HPLC如图19所示，多个杂质无法达到有效分离。在该色谱条件下，杂质H和杂质C未分开，且出峰较早，无保留；对甲氧基苯甲酸和杂质F重合；杂质E与杂质G未达到基线分离，故此色谱条件不适合用于本品相关杂质的检测。
表5流动相的探寻
3.流动相pH值对杂质分离情况的影响
表6流动相pH值对杂质分离情况的影响
4.流动相比例对杂质分离情况的影响
表7流动相比例对杂质分离情况的影响
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.高效液相色谱法测定磷酸芦可替尼及杂质的方法，其特征在于，所述方法为：采用十八硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂，以浓度为0.03±0.005mol/L的磷酸二氢盐为流动相A，以甲醇-乙腈为流动相B进行梯度洗脱，流速为1±0.1ml/min；检测波长为220±10nm；所述色谱柱的规格为4.6mm×250mm，5μm；所述流动相A的pH值为3.5±0.1，用磷酸调节pH；
所述甲醇-乙腈中甲醇与乙腈的体积比为50：50；
洗脱比例为：
0min，流动相A与流动相B的体积比为70：30，
2min，流动相A与流动相B的体积比为70：30，
22min，流动相A与流动相B的体积比为48：52，
27min，流动相A与流动相B的体积比为20：80，
35min，流动相A与流动相B的体积比为20：80，
36min，流动相A与流动相B的体积比为70：30，
45min，流动相A与流动相B的体积比为70：30；
所述杂质包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，供试品溶液的制备方法为：精密称取供试品，加甲醇溶解并稀释，摇匀，即得。
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