CN113133956B - 一种用于抗皮肤衰老的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于抗皮肤衰老的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳，它包括以下重量百分比的组分：表面活性剂10％～30％，助表面活性剂5％～10％，丁香精油1％～5％，瓜拉纳提取物5％～50％。本发明的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳同时具有抗氧化和抗紫外线能力，可不需要再添加其他成分就可起到良好的抗皮肤衰老作用，该瓜拉纳丁香精油复合纳米乳渗透性好，稳定性强，刺激性低，具有抗皮肤衰老作用。

Description

一种用于抗皮肤衰老的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳

技术领域

本发明涉及一种用于抗皮肤衰老的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳，属于化妆品及其制备技术领域。

背景技术

皮肤的衰老问题一直是人们关注的焦点，皮肤的衰老受内源性和外源性两大因素的影响。内源性因素主要表现为自然衰老，皮肤代谢减慢、脂质合成下降，出现皮肤松弛、干燥、色斑、皱纹等现象；外源性因素表现为外部环境对皮肤的影响，包括紫外线、恶劣环境、不良生活习惯等，这些因素会导致机体产生过量自由基而无法及时清除，损伤皮肤细胞及胶原质，从而出现皮肤暗沉、水分减少、细纹加深等皮肤问题。然而，目前市场上化妆品中抗皮肤衰老成分多为化学合成的成分，对皮肤有一定的刺激性，同时也易产生耐药性，以天然植物提取物作为主要活性成分的化妆品将成为化妆品开发的主流趋势。

瓜拉纳(Paullinia cupana)属无患子科，原产于巴西北部亚马逊河流域，是当地知名的药用植物，其主要成分咖啡因、儿茶素及多糖具有明显的抗氧化作用，另外咖啡因还具有抗紫外线辐射和加快皮肤血液微循环作用，能协同干预皮肤的衰老。植物精油又称“液体黄金”，是一种功效强、渗透性好、毒副作用低的天然活性物质，可作为化妆品添加剂，具有美白、保湿、延缓衰老、增加皮肤弹性等功效。丁香精油作为日常广泛使用的中药精油之一，具有很强的抗氧化活性，并且能改变皮肤角质层结构，促进药物的经皮渗透，是一种天然的经皮渗透促进剂。

本发明预实验研究发现，将瓜拉纳乙醇提取物与丁香精油进行复配使用，能协同增强药物的抗氧化能力，进而提高药物抗皮肤衰老药效。但同时，瓜拉纳乙醇提取物和丁香精油均为混合物，各成分的溶解性能存在差异，影响了药物的吸收，且二者具有一定的刺激性和挥发性。因此，有必要开发一种制剂来改善药物的溶解度和稳定性，降低给药的刺激性。

纳米乳是由表面活性剂、助表面活性剂、油相和水在适当的配比下自发形成的一种分散体系。纳米乳作为经皮药物的递送系统，不仅能有效提高药物的稳定性，降低给药的刺激性，提高生物利用度，还能实现同时对脂溶性药物和水溶性药物的增溶，尤其适合用于中药提取物复方制剂的开发。基于纳米乳递送系统的多重优势，本发明以瓜拉纳乙醇提取物与丁香精油复配作为基础药物，通过纳米乳化技术制备瓜拉纳丁香精油复合纳米乳具有良好的研发价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于抗皮肤衰老的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳，本发明的另一目的是提供上述瓜拉纳丁香精油复合纳米乳的制备方法，本发明的第三目的是提供上述瓜拉纳丁香精油复合纳米乳在抗皮肤衰老中的应用。

药物的稳定性、刺激性及经皮渗透性能是经皮给药制剂的关键性问题，而表面活性剂、助表面活性剂及油相的质量占比对制剂的稳定性、刺激性及经皮渗透性能具有很大的影响。

继而，我们采用伪三元相图法和DOE试验设计对瓜拉纳丁香精油复合纳米乳的处方进行筛选和优化，并将最佳处方进行了理化性质和稳定性评价，结果表明所制瓜拉纳丁香精油复合纳米乳理化性质符合纳米乳质量要求，且具有良好的热力学和动力学稳定性。

本发明的第一方面，是提供一种瓜拉纳丁香精油复合纳米乳。

一种瓜拉纳丁香精油复合纳米乳，其组分及重量百分比为：瓜拉纳提取液5％～50％，丁香精油1％～5％，表面活性剂10％～30％，助表面活性剂5％～15％，余量为水。其中丁香精油作为油相。其平均粒径小于100nm，为O/W型纳米乳，外观为澄清透明或半透明，粘度低，流动性好、稳定性好的均一体系。

进一步地，优选的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳最佳处方：瓜拉纳提取液10％，丁香精油1％，表面活性剂10％，助表面活性剂5％，余量为水。

进一步地，所述的表面活性剂为聚氧乙烯氢化蓖麻油(RH 40)、聚山梨酯-80(Tween80)、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(Labrasol)和司盘20(Span 20)，优选的，是RH 40；所述的助表面活性剂为无水乙醇、1,2-丙二醇、1,3-丁二醇和正丁醇，优选的，是无水乙醇；所述的水为去离子水、纯化水。

进一步地，所述的瓜拉纳提取物为瓜拉纳种子粗粉提取所得，其提取方法如下：瓜拉纳种子粗粉在80～100℃，用10倍量的70％乙醇提取2次，每次1h，合并两次提取液，提取液浓缩至原体积的1/4，即得含瓜拉纳生药量2g/mL的瓜拉纳提取液。

进一步地，所述的丁香精油为水蒸气蒸馏法提取所得，将丁香干燥花蕾用小型粉碎机粉碎成粗粉，称取丁香粗粉200g，加入8倍量水，浸泡40min，水蒸气蒸馏提取6h即得。

本发明的第二方面，是提供上述瓜拉纳丁香精油复合纳米乳的制备方法。

所述的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳的制备方法如下：

(1)将表面活性剂RH 40、助表面活性剂无水乙醇和油相丁香精油按比例混合搅拌均匀；

(2)加入处方量的去离子水，继续搅拌直至混合物呈澄清透明状，即得空白纳米乳基质；

(3)向空白纳米乳基质中加入处方量的瓜拉纳提取物，涡旋震荡，即得瓜拉纳精油纳米乳。

所述的搅拌速度为600rpm/min，搅拌时间为10～20min。

本发明制备的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳为细腻均一的棕红色透明液体，对皮肤无刺激。本发明的纳米乳制剂，其促透机制可能与影响细胞膜的流动性有关，另外丁香精油作为天然的透皮吸收促进剂，能改变皮肤角质层结构，利于药物的经皮渗透，且纳米乳能在皮肤中形成贮库，起到缓释的作用，同时提高药物的生物利用度。

本发明制备的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳具有良好的抗氧化性能，能提高皮肤含水量，提高皮肤内抗氧化酶活性，减少脂质过氧化物的产生，改善皮肤胶原纤维，增厚表皮真皮层，起到抗皮肤衰老作用，并且还能降低药物经皮给药的刺激性。

本发明提供的一种用于抗皮肤衰老的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳，其有益效果是：

(1)本发明的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳，首次将瓜拉纳提取物与植物精油配伍使用，同时具有抗氧化和抗紫外的能力，可不需再添加其他成分就可起到良好的抗皮肤衰老作用。

(2)瓜拉纳丁香精油复合纳米乳粒径小，稳定性强，经皮渗透性能好。

(3)瓜拉纳丁香精油复合纳米乳的pH值为5.0～7.0，符合皮肤弱酸性的要求，对皮肤无刺激，使用安全。

(4)通过配方的筛选，使得纳米乳的制备过程简单，对仪器设备和反应条件要求低，适合大规模产业化生产。

附图说明

图1为未载药的空白丁香精油纳米乳(左)与瓜拉纳丁香精油复合纳米乳(右)。

图2为瓜拉纳丁香精油复合纳米乳粒径分布图。

图3为瓜拉纳丁香精油复合纳米乳的冻融循环稳定性考察。

图4为瓜拉纳丁香精油复合纳米乳的加热-冷却循环稳定性考察。

图5为瓜拉纳丁香精油复合纳米乳的存储稳定性考察。

图6为儿茶素在纳米乳和普通混合液中的累积透过量。

图7为咖啡因在纳米乳和普通混合液中的累积透过量。

图8为丁香酚在纳米乳和普通混合液中的累积透过量。

图9为维生素C对DPPH自由基的清除能力折线图。

图10为各供试品对DPPH自由基的清除能力折线图。

图11为各组小鼠皮肤含水量测定结果。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

制备本发明所用的瓜拉纳提取物

取瓜拉纳种子粉碎成粗粉，取100g，以体积分数为70％的乙醇为提取溶剂，料液比1:10(质量体积比)，提取温度为100℃，提取时间为1h，提取2次，将2次提取液合并，过滤。将过滤的提取液旋转蒸发浓缩、定容至500mL，即得含生药量0.2g/mL的瓜拉纳提取液。

制备本发明所用的丁香精油

采用水蒸气蒸馏法提取丁香精油。将丁香干燥花蕾用小型粉碎机粉碎成粗粉，称取丁香粗粉200g，加入8倍量水，浸泡40min，水蒸气蒸馏提取6h，出油率为11.53％。

以下各实施例所采用的瓜拉纳提取物和丁香精油均采用上述方法制备。

实施例1：制备载药量为10％的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳

称取2.0005g RH40，1.0012g无水乙醇，0.2014g丁香精油600rpm磁力搅拌15min，再加入14.8036g双蒸水继续搅拌15min，最后加入2.0004g瓜拉纳提取液涡旋3min混匀，即得棕红色透明的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳。

其中瓜拉纳提取液质量占纳米乳总质量的10％，油相(丁香精油)1％，表面活性剂(RH40)10％，助表面活性剂(无水乙醇)5％，水74％，该纳米乳平均粒径为15.80nm。实施例2：制备载药量为20％的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳

称取2.0002g RH40，1.0002g无水乙醇，0.2042g丁香精油600rpm磁力搅拌15min，再加入12.8012g双蒸水继续搅拌15min，最后加入4.0002g瓜拉纳提取液液涡旋3min混匀，即得棕红色透明的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳。

其中瓜拉纳提取液质量占纳米乳总质量的20％，油相(丁香精油)1％，表面活性剂(RH40)10％，助表面活性剂(无水乙醇)5％，水64％，该纳米乳平均粒径为17.65nm。

实施例3：制备载药量为5％的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳

称取2.0002g RH40，1.0002g无水乙醇，0.2042g丁香精油600rpm磁力搅拌15min，再加入15.8024g双蒸水继续搅拌15min，最后加入1.0002g瓜拉纳提取液液涡旋3min混匀，即得棕红色透明的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳。

其中瓜拉纳提取液质量占纳米乳总质量的5％，油相(丁香精油)1％，表面活性剂(RH40)10％，助表面活性剂(无水乙醇)5％，水79％。

实施例4：制备载药量为10％的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳

称取2.0002g RH40，1.0002g无水乙醇，01.002g丁香精油600rpm磁力搅拌15min，再加入14.8036g双蒸水继续搅拌15min，最后加入1.0002g瓜拉纳提取液液涡旋3min混匀，即得棕红色透明的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳。

其中瓜拉纳提取液质量占纳米乳总质量的10％，油相(丁香精油)1％，表面活性剂(RH40)10％，助表面活性剂(无水乙醇)5％，水74％。

实施例5：制备载药量为30％的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳

称取2.0006g RH40，1.0025g无水乙醇，0.2016g丁香精油600rpm磁力搅拌15min，再加入10.8094g双蒸水继续搅拌15min，最后加入6.0009g瓜拉纳提取液涡旋3min混匀，即得棕红色透明的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳。

其中瓜拉纳提取液质量占纳米乳总质量的30％，油相(丁香精油)1％，表面活性剂(RH40)10％，助表面活性剂(无水乙醇)5％，水54％。

实施例6：制备载药量为40％的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳

称取2.0010g RH40，1.0030g无水乙醇，0.2025g丁香精油600rpm磁力搅拌15min，再加入8.8003g双蒸水继续搅拌15min，最后加入8.0020g瓜拉纳提取液涡旋3min混匀，即得棕红色透明的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳。

其中瓜拉纳提取液质量占纳米乳总质量的40％，油相(丁香精油)1％，表面活性剂(RH40)10％，助表面活性剂(无水乙醇)5％，水44％。

实施例7：制备载药量为50％的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳

称取2.0012g RH40，1.0008g无水乙醇，0.2050g丁香精油600rpm磁力搅拌15min，再加入6.8047g双蒸水继续搅拌15min，最后加入10.0001g瓜拉纳提取液涡旋3min混匀，即得棕红色透明的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳。

其中瓜拉纳提取液质量占纳米乳总质量的50％，油相(丁香精油)1％，表面活性剂(RH40)10％，助表面活性剂(无水乙醇)5％，水34％。

实施例8：制备载药量5％的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳

称取2.0006g Tween80，1.0008g无水乙醇，0.2022丁香精油600rpm磁力搅拌15min，再加入15.8043g双蒸水继续搅拌15min，最后加入1.0007g瓜拉纳提取液涡旋3min混匀，即得棕红色透明的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳。

其中瓜拉纳提取液质量占纳米乳总质量的5％，油相(丁香精油)1％，表面活性剂(Tween80)10％，助表面活性剂(无水乙醇)5％，水79％。

实施例9：制备载药量5％的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳

称取2.0003g RH40，3.0012g无水乙醇，0.2014丁香精油600rpm磁力搅拌15min，再加入13.8015g双蒸水继续搅拌15min，最后加入1.0002g瓜拉纳提取液涡旋3min混匀，即得棕红色透明的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳。

其中瓜拉纳提取液质量占纳米乳总质量的5％，油相(丁香精油)1％，表面活性剂(RH40)10％，助表面活性剂(无水乙醇)15％，水69％。

瓜拉纳丁香精油复合纳米乳理化性质考察

按照实施例1制备所得瓜拉纳丁香精油复合纳米乳为棕红色透明液体，见附图1。分别用pH计和旋转粘度计对纳米乳酸碱度和粘度进行测定，用马尔文粒度仪测定纳米乳粒径分布。结果显示纳米乳pH为5.85±0.02，粘度为26.8±0.2mPa·s，粒径分布见附图2，粒径大小为15.81±0.130nm。由此可知，所制瓜拉纳丁香精油复合纳米乳粒径大小符合质量要求，粘度适中，且酸碱度也符合皮肤弱酸性的要求。

瓜拉纳丁香精油复合纳米乳的稳定性考察

取实施例1方法制备所得瓜拉纳丁香精油复合纳米乳，对其进行离心稳定性、冻融稳定性、加热-冷却循环稳定性和存储稳定性考察。

(1)离心稳定性:将制备好的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳置于离心机内，10000r/min离心20min后，纳米乳外观仍然均匀透明，未出现分层现象，表明所制纳米乳具有较好的离心稳定性

(2)冻融稳定性：将制备好的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳放于-20℃冰箱，冻融循环4次，每次循环周期为24h，分别测定其每次冻融循环后的粒径和PDI，结果见附图3，结果显示，纳米乳经历4次冻融循环，平均粒径均稳定在15～16nm，PDI均未超过0.15，未发生显著变化，且试验期间均未出现分层、破乳等不稳定现象，表明所制纳米乳具有较好的冻融稳定性。

(3)加热-冷却循环稳定性：将制备好的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳放于40℃恒温恒湿箱内，加热-冷却循环4次，每次循环周期为24h，分别测定其每次加热-冷却循环后的粒径和PDI，结果见附图4，结果显示，纳米乳经历4次加热-冷却循环，平均粒径均稳定在15～16nm，PDI均未超过0.15，未发生显著变化，且试验期间均未出现分层、破乳等不稳定现象，表明所制纳米乳具有较好的加热-冷却循环稳定性。

(4)存储稳定性：将制备好的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳E分成3份，分别置于4℃、25℃和40℃下密闭保存90d，并于制备的第0、7、15、30、60、90d测定其粒径大小和PDI，结果见附图5，结果显示，纳米乳分别在4、25和40℃保存90d，其平均粒径均稳定在15～16nm，PDI均未超过0.15，未发生显著变化，且试验期间均未出现分层、破乳等不稳定现象，表明所制纳米乳在4、25和40℃下均具有良好的存储稳定性。

体外透皮试验

1.含量测定方法的建立

1.1色谱条件：以瓜拉纳丁香精油复合纳米乳中主要药效成分儿茶素、咖啡因和丁香酚作为指标成分，色谱柱为ACE Excel C18(250×4.6mm，5μm)；流动相为甲醇-0.1％磷酸溶液，梯度洗脱：0～5min，32％～33％甲醇；5～6min，33％～80甲醇；6～12min，80％甲醇；12～17min，80～32％甲醇；检测波长为225nm(儿茶素、丁香酚)、275nm(咖啡因)；柱温25℃；体积流量1mL/min；进样体积5μL。

1.2溶液的制备

精密称取儿茶素、咖啡因、丁香酚对照品适量，加甲醇溶解，制成含儿茶素100.4μg/mL、咖啡因200.8μg/mL、丁香酚1401.4μg/mL的混合对照品溶液。所需瓜拉纳丁香精油复合纳米乳制备方法同实施例3。

1.3标准曲线的建立

将混合对照品溶液用甲醇稀释至系列浓度的溶液：儿茶素质量浓度分别为0.784、1.569、3.138、6.275、12.55、25.1、50.2、100.4μg/mL；咖啡因质量浓度分别为1.569、3.138、6.275、12.55、25.1、50.2、100.4、200.8μg/mL；丁香酚质量浓度分别为10.948、21.897、43.794、87.588、175.175、350.35、700.7、1401.4μg/mL，摇匀，经0.22μm滤膜滤过后，按“1.1”项下色谱条件进样分析。以质量浓度为横坐标(X)，色谱峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，并计算线性回归方程，结果见表一。

表1线性关系考察结果

1.4精密度试验

取任一供试品透皮接收液，按“1.1”项下色谱条件，连续进样6次，记录峰面积，计算色谱峰面积的RSD。测定结果见表2，结果表明仪器精密度良好。

表2精密度试验结果

1.5稳定性试验

取同一供试品透皮接收液分别于0、2、4、8、12、24h时，按“1.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积，计算色谱峰面积的RSD。测定结果见表3，结果表明样品在处理8h内基本稳定。

表3稳定性试验结果

1.6加样回收试验

取已知含量的透皮接收液6份，分别加入低、中、高3个质量浓度的儿茶素对照品、咖啡因对照品和丁香酚对照品溶液，每个质量浓度供试品为2份，按“1.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积，计算加样回收率和RSD。测定结果见表4至表6，结果表明本方法回收率良好，制剂中其他成分对儿茶素、咖啡因和丁香酚的含量测定无干扰。

表4儿茶素加样回收试验结果

表5咖啡因加样回收试验结果

表6丁香酚加样回收试验结果

2.经皮渗透性能考察

离体皮肤制备：选择健康小鼠，腹腔注射5％水合氯醛溶液(0.01mL/g)麻醉，用电动剃毛机剃掉腹部体毛，处死小鼠，立即剪下腹部皮肤，用蘸有生理盐水的医用棉花小心擦去皮下脂肪组织和粘连物，然后用滤纸吸取皮肤表面多余水分，最后将其包裹于铝箔中-20℃冷冻保存，一周内用完。

采用Franz扩散池法进行：将皮肤固定于上、下池中间，角质层面朝向释放池，真皮层面朝向接受池，向接受池内加入15mL磷酸盐缓冲液(pH7.4)与无水乙醇的混合溶液(7:3，v/v)作为接收液。将装置置于37±0.5℃恒温水浴中，接受池中转子搅拌速度控制在300rpm左右，向释放池中分别加入1mL实施例1方法所得瓜拉纳丁香精油复合纳米乳，分别于1、2、4、6、8、10、12h、24h取接收液0.8mL进行含量检测。并以相同浓度的瓜拉纳丁香精油普通缓和溶液作为对照。

体外累积渗透量的计算：按以下公式进行计算

其中：Qn为第n个时间点单位面积的累积透过量，Cn为第n个时间点测得的药物质量浓度，V为接收液加入体积，Vi为每次取样体积，A为有效透皮面积。

在不同取样点的体外累积透皮渗透量如附图6～8。结果显示，三种指标成分在纳米乳中的累积透过量及透皮速率均优于普通混合溶液，说明本发明的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳的体外透皮效果更好，更能有效地透过皮肤屏障。

3.皮肤滞留量试验

透皮试验结束后，将皮肤取下，用生理盐水洗净皮肤表面多余药物，将给药部分皮肤剪碎，加入甲醇1mL，超声30min，4000r/min离心10min，取上清液经0.22μm滤膜滤过后，按“1.1”项下色谱条件，测定皮肤中药物的滞留量儿茶素、咖啡因和丁香酚的皮肤滞留量见表7，结果显示，瓜拉纳丁香精油复合纳米乳中儿茶素、咖啡因和丁香酚的皮肤滞留量均大于其普通混合液，表明瓜拉纳丁香精油复合纳米乳更能在皮肤中形成储库，延长药物在皮肤中的滞留时间，从而减少给药次数。

表7儿茶素、咖啡因和丁香酚的皮肤滞留量

瓜拉纳丁香精油复合纳米乳的皮肤刺激性试验

取实施例1方法所制瓜拉纳丁香精油复合纳米乳，以瓜拉纳丁香精油普通混合溶液作为对照，利用白色豚鼠同体左右自身对比，考察了药物的皮肤刺激性。结果显示，瓜拉纳丁香精油复合纳米乳对皮肤无刺激，而普通混合液则表现为轻度刺激，说明纳米乳作为瓜拉纳和丁香精油经皮给药的载体能降低药物对皮肤的刺激性。

瓜拉纳丁香精油复合纳米乳的抗氧化性能考察

样品制备：精密称取3.0mg DPPH，无水乙醇定容于50mL棕色容量瓶中，超声10min，得到浓度为0.06mg/mL的DPPH溶液，避光保存，3.5h内用完；分别将实施例1方法所制备的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳、瓜拉纳丁香精油普通混合液、瓜拉纳提取液和丁香精油用无水乙醇稀释至浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mg/mL的不同浓度供试品溶液；精密称定5.0mg维生素C，95％乙醇定容于50mL棕色容量瓶中，得到浓度为0.1mg/mL的阳性对照，分别用95％乙醇稀释至浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mg/mL不同浓度的维生素C对照品溶液。

分别在试管中加入6mL DPPH溶液和2mL不同浓度待测样品溶液，摇匀，避光反应30min，在517nm处测定吸光值。依照此法同时测定阳性对照(维生素C)对DPPH自由基的清除率作为对比。

DPPH自由基清除率(％)＝[1-(A₁–A₂)/A₀]×100％

其中：A₀为6mL DPPH溶液与2mL无水乙醇反应的吸光值，A₁为6mL DPPH溶液与2mL样品反应的吸光值，A₂为6mL样品溶剂与2mL样品反应的吸光值。

供试品对DPPH自由基清除率曲线见附图9和附图10。通过线性回归，拟合供试品浓度(X)与清除率(Y)的回归方程，并计算供试品对DPPH自由基的半抑制率IC₅₀(mg/mL)，结果见表8。结果显示，瓜拉纳丁香精油复合纳米乳和瓜拉纳丁香精油普通混合液的IC₅₀与VC阳性对照较接近，但都略大于VC；丁香精油的IC₅₀约为VC的2倍，瓜拉纳提取液的IC₅₀约为VC的7.5倍。供试品的IC₅₀越低说明抗氧化能力越强，反之则越弱。表明瓜拉纳提取液、丁香精油、瓜拉纳丁香精油普通混合液和瓜拉纳丁香精油复合纳米乳四种供试药品均具有一定的抗氧化能力，但相比之下瓜拉纳丁香精油复合纳米乳和瓜拉纳丁香精油普通混合液的抗氧化能力较强，且二者抗氧化能力相近，丁香精油次之，而瓜拉纳提取液的抗氧化能力较弱，说明瓜拉纳提取液与丁香精油复配使用能协同增强抗氧化效果，且纳米乳辅料不影响药物的抗氧化活性。

表8供试药物清除DPPH自由基的半抑制浓度

瓜拉纳丁香精油复合纳米乳药效学考察

小鼠随机分组，使用剃毛器在小鼠背部脱毛约3cm×5cm，造模组小鼠每日颈背部皮下注射D-半乳糖溶液1000mg/(kg·d)，并进行紫外照射30min/d，持续时间42d；正常组小鼠每日注射等体积的生理盐水，正常光照，持续时间与造模组相同。从造模第11d开始，小鼠每日按300mg·kg^-1·d^-1给药剂量经皮涂抹瓜拉纳丁香精油普通混合液(GE-CO-M)、瓜拉纳丁香精油复合纳米乳(GE-CO-NE)、空白纳米乳基质(Blank-NE)及阳性对照药物维生素E(VE)，正常组和模型组小鼠每日涂抹生理盐水，持续给药32d。

测定各组小鼠皮肤含水量：将给药完成的小鼠处死后，立即取下颈背部皮肤(1cm×1cm)，精密称量其湿重，然后放于80℃烘箱烘烤24h后称量干重，并计算皮肤含水量。计算公式：皮肤含水量(％)＝(湿重-干重)/湿重×100％。测定结果见附图11。结果显示，相较于正常组小鼠皮肤含水量71.66％，模型组小鼠皮肤的含水量只有63.78％呈显著降低(P<0.01)；而在对小鼠进行了药物干预后，瓜拉纳丁香精油复合纳米乳皮肤含水量达到70.64％，较模型组均有显著增加(P<0.01)，表明药物能减少皮肤表面的水分散失，提高皮肤的保水能力。

试验结束后将皮肤制备成组织匀浆液：精确称取皮肤组织0.1g，加入0.9mL预冷的生理盐水，将皮肤组织剪碎，用组织匀浆机进行匀浆，制备成10％的皮肤组织匀浆，4000r/min，离心15min，取上清液-20℃保存备用。

测定各组小鼠皮肤生化指标：试验取小鼠皮肤组织匀浆上清液，进行SOD酶活性、MDA含量及Hyp含量测定，试验结果见表8。结果表明，模型组小鼠皮肤中SOD活性、Hyp含量显著低于正常组，MDA含量明显高于正常组，说明D-半乳糖联合紫外光照射导致小鼠皮肤的内生性氧化酶活性降低，胶原纤维含量减少，脂质过氧化产物升高，加速了皮肤的衰老。经过一段时间的药物干预后，GE-CO-NE组小鼠皮肤MDA含量显著降低，SOD酶活性和Hyp含量有了显著提高，表明GE-CO-NE具有一定的抗皮肤衰老功效。

表9小鼠皮肤组织SOD、MDA、Hyp测试结果(n＝10)

注：^△与正常组比较，^△P<0.05，^△△P<0.01；^*与模型组比较，^*P<0.05，^**P<0.01。

综上，本发明所制备的用于抗皮肤衰老的瓜拉纳提取物精油纳米乳稳定性好，渗透性强，对皮肤无刺激，在化妆品方向有较好的前景，且本发明提供的方法所需仪器设备、操作步骤简单，可用于工业化生产。

以上所述实施例，仅为本发明较佳的具体方案，并非对本发明做任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其他的变体和改型。

Claims (9)

1.一种用于抗皮肤衰老的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳，其特征在于：由以下重量百分比组分组成：表面活性剂10%~30%，助表面活性剂5%~10%，丁香精油1%~5%，瓜拉纳提取液5%~50%，余量为水。

2.根据权利要求1所述的用于抗皮肤衰老的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳，其特征在于，由以下组分按重量百分比组成：瓜拉纳提取液10%，丁香精油1%，聚氧乙烯氢化蓖麻油10%，无水乙醇5%，余量为水。

3.根据权利要求1所述的用于抗皮肤衰老的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳，其特征在于，所述的瓜拉纳提取液为瓜拉纳种子粗粉提取所得，其提取方法如下：瓜拉纳种子粗粉在80~100℃，用10倍量的70%乙醇提取2次，每次1h，合并两次提取液，提取液浓缩至原体积的1/4，即得含瓜拉纳生药量2g/mL的瓜拉纳提取液。

4.根据权利要求1所述的用于抗皮肤衰老的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳，其特征在于，所述的丁香精油为丁香干燥花蕾提取所得，其提取方法如下：丁香干燥花蕾粗粉加入8倍量水，浸泡40 min，水蒸气蒸馏提取6 h即得。

5.根据权利要求1所述的用于抗皮肤衰老的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳，其特征在于，所述的表面活性剂选自聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚山梨酯-80、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯、司盘20中的一种。

6.根据权利要求1所述的用于抗皮肤衰老的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳，其特征在于，所述的助表面活性剂选自无水乙醇、1,2-丙二醇、1,3-丁二醇、正丁醇中的一种。

7.一种权利要求1所述的用于抗皮肤衰老的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将表面活性剂、助表面活性剂和丁香精油按比例混合搅拌均匀；

（2）加入处方量的去离子水，继续搅拌直至混合物呈澄清透明状，即得空白纳米乳基质；

（3）向空白纳米乳基质中加入处方量的瓜拉纳提取液，涡旋震荡，即得瓜拉纳精油纳米乳。

8.根据权利要求7所述的用于抗皮肤衰老的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳的制备方法，其特征在于，步骤（1）和（2）的搅拌速度为600rpm/min，搅拌时间为10 ~ 20min。

9.如权利要求1至6 任一项所述的用于抗皮肤衰老的瓜拉纳丁香精油复合纳米乳在制备治疗皮肤衰老药物中的应用。

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