CN112945878A - 间接光度法测定多巴胺的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种间接光度法测定多巴胺的方法，用盐酸多巴胺将Fe（Ⅲ）还原为Fe(Ⅱ)，还原生成的Fe(Ⅱ)与K₃[Fe(CN)₆]反应生成可溶性的普鲁士蓝，盐酸多巴胺的浓度与反应生成的可溶性的普鲁士蓝的吸光度呈线性关系，根据吸光度间接测定盐酸多巴胺含量所述可溶性的普鲁士蓝最大吸收波长为735 nm。该方法具有简单快速、线性范围宽、灵敏度高的优点，盐酸多巴胺的浓度在0.32～8.96μg/mL范围内与吸光度呈良好线性关系，检出限为0.025μg/mL。

Description

间接光度法测定多巴胺的方法

技术领域

本发明涉及一种测定多巴胺的方法，尤其是涉及一种间接光度法测定多巴胺的方法。

背景技术

多巴胺(Dopamine，DA)是哺乳动物中枢神经系统中最重要的儿茶酚胺神经递质之一，在中枢神经系统、心血管系统、内分泌系统和肾脏系统的功能调节方面发挥着十分重要的作用。生物体液中DA含量的异常，与一些神经系统疾病，如帕金森症、精神分裂症、自闭症、亨廷顿氏舞蹈证和阿尔兹海默症等密切相关。因此，DA的准确检测对于神经生理学、病理学及临床疾病诊断等至关重要。

目前，对多巴胺含量的检测方法主要有：电化学法、高效液相色谱法、荧光光谱法、毛细管电泳法等。这些方法虽然灵敏度高、特异性强，但也存在繁琐复杂、耗时长、仪器昂贵等缺点。

铁氰化钾曾作为化学发光试剂，在化学发光分析中得到广泛的应用。研究表明：一定实验条件下，多巴胺含有的羟基具有一定的还原性，可以将Fe(Ⅲ)还原为Fe(Ⅱ)，还原生成的Fe(Ⅱ)与K₃[Fe(CN)₆]反应，生成产物为可溶性普鲁士蓝KFeⅢ[FeⅡ(CN)₆]，因而发明人以铁氰化钾曾作为化学发光试剂对多巴胺含量的测定进行了深入研究。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种以铁氰化钾为探针试剂，分光光度法检测多巴胺的方法。本法具有检测限低、线性范围大、操作简单、成本低廉等特点，用于药物中多巴胺含量的测定，结果令人满意。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

间接光度法测定多巴胺的方法，用盐酸多巴胺将Fe(Ⅲ)还原为Fe(Ⅱ)，还原生成的Fe(Ⅱ)与K₃[Fe(CN)₆]反应生成可溶性的普鲁士蓝，盐酸多巴胺的浓度与反应生成的可溶性的普鲁士蓝的吸光度呈线性关系，根据吸光度间接测定盐酸多巴胺含量所述可溶性的普鲁士蓝最大吸收波长为735nm；优选的，所述盐酸多巴胺的浓度为0.32～8.96μg/mL。

优选的，所述间接光度法测定多巴胺的方法对盐酸多巴胺的检出限为0.025μg/mL。

更优选的，所述盐酸多巴胺中盐酸的pH为3.

作为本发明的优选方案，所述的间接光度法测定多巴胺的方法，包括如下步骤：

1)测吸光度：取相应体积和浓度的K₃[Fe(CN)₆]溶液和FeCl₃溶液及盐酸多巴胺溶液于比色管中，稀释至刻度，摇匀、反应，735nm处试剂空白为参比，测定吸光度；

2)绘制标准曲线，得线性回归方程；

3)求盐酸多巴胺浓度：根据浓度和吸光度的相关性，即可根据吸光度求盐酸多巴胺的浓度。

优选的，所述步骤1)测吸光度的方法为取K₃[Fe(CN)₆]和FeCl₃溶液及1.00mL 80μg/mL的盐酸多巴胺溶液于25-mL磨口比色管中，调节pH值、稀释至刻度，摇匀、反应，735nm处试剂空白为参比，测定吸光度。

更优选的，K₃[Fe(CN)₆]溶液的摩尔浓度为1.5×10^-2mol/L和/或用量为0.50mL-2.00mL；和/或FeCl₃的摩尔浓度为1.5×10^-2mol/L和/或用量为0.50mL-2.00mL；

优选地，K₃[Fe(CN)₆]溶液的摩尔浓度为1.5×10^-2mol/L和/或用量为0.80mL；和/或FeCl₃溶液的摩尔浓度为1.5×10^-2mol/L和/或用量为0.80mL。

优选的，所述调节pH值为将pH值调节为4以下。

优选的，所述反应的温度为4-50℃；优选的，所述反应的温度为25-50℃；更优选的，所述反应的温度为25℃。

优选的，所述反应时间为5-10min；优选的，所述反应时间为5min。

一种间接光度法测定多巴胺的方法的应用，用于快速测定药剂中盐酸多巴胺的含量。

优选的，所述药剂的剂型包括注射剂、片剂、丸剂、胶囊及其他所有可能含有盐酸多巴胺的剂型。

本发明的有益效果是：

本实验以盐酸多巴胺可以还原Fe(Ⅲ)为基础，建立了以K₃[Fe(CN)₆]-Fe(Ⅲ)体系可见分光光度法测定药剂中盐酸多巴胺含量的新方法。该方法具有简单快速、线性范围宽、灵敏度高的优点，盐酸多巴胺的浓度在0.32～8.96μg/mL范围内与吸光度呈良好线性关系，检出限为0.025μg/mL。且所用试剂简单易得，适用于快速测定各种剂型的药剂中盐酸多巴胺的含量。

附图说明

图1：吸收光谱图

a：产物吸收光谱；b：FeCl₃和K₃[Fe(CN)₆]混合溶液吸收光谱；c：盐酸多巴胺吸收光谱；盐酸多巴胺(80μg/mL)溶液：1.00mL；FeCl₃(1.5×10^-2mol/L)溶液：0.80mL；K₃[Fe(CN)₆](1.5×10^-2mol/L)溶液：1.00mL；

图2：FeCl₃用量的影响

盐酸多巴胺(80μg/mL)溶液：1.00mL；K₃[Fe(CN)₆](1.5×10^-2mol/L)溶液：0.80mL；反应温度：25℃；反应时间：5min；总体积：25mL；

图3 K₃[Fe(CN)₆]用量的影响

盐酸多巴胺(80μg/mL)溶液：1.00mL；Fe Cl₃(1.5×10^-2mol/L)溶液：0.80mL；反应温度：25℃；反应时间：5min；总体积：25mL；

图4反应时间的影响

盐酸多巴胺(80μg/mL)溶液：1.00mL；Fe Cl₃(1.5×10^-2mol/L)溶液：0.80mL；K₃[Fe(CN)₆](1.5×10^-2mol/L)溶液：0.80mL；反应温度：25℃；总体积：25mL；

图5 pH值的影响

盐酸多巴胺(80μg/mL)溶液：1.00mL；FeCl₃(1.5×10^-2mol/L)溶液：0.80mL；K₃[Fe(CN)₆](1.5×10^-2mol/L)溶液：0.80mL；反应温度：25℃；反应时间：5min；总体积：25mL；图6标准曲线

以吸光度为纵坐标，盐酸多巴胺的浓度为横坐标。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。

一、实验部分

1.1实验仪器

Cary 60紫外可见分光光度计(美国安捷伦科技有限公司)；

FD-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(郑州予科仪器设备有限公司)。

1.2实验药品和试剂

多巴胺(A.R.，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)标准储备液1.00mg/mL，置于4℃避光保存，用时稀释为80μg/mL标准溶液；

铁氰化钾(A.R.，北京化工厂)标准溶液：

1.5×10^-2mol/L；三氯化铁(A.R.，天津化工三厂)标准溶液：1.5×10^-2mol/L。

实验所用其他试剂均为分析纯，实验用水均为二次蒸馏水。

1.3实验方法

用吸量管准确移取0.80mL 1.5×10^-2mol/L的K₃[Fe(CN)₆]和0.80mL 1.5×10^{- 2}mol/L的FeCl₃溶液及1.00mL 80μg/mL的盐酸多巴胺溶液于25-mL磨口比色管中，使用二次蒸馏水稀释至刻度，摇匀后25℃反应5min，735nm处试剂空白为参比，测定吸光度。

二、结果与讨论

2.1反应机理

多巴胺中具有邻苯二酚结构，邻苯二酚具有强还原性，能够把三价铁还原为二价铁，二价铁离子与铁氰化钾可以反应生成可溶性普鲁士蓝KFe[Fe(CN)₆]，其溶液对可见光具有较强的吸收。由电子得失情况推测多巴胺与Fe(Ⅲ)反应的化学计量比为1:2，可能的反应机理如下scheme1：

Ⅰ.

Ⅱ.

2.2吸收光谱

以水为参比，分别测得试剂空白和盐酸多巴胺、以及以试剂空白为参比测得反应产物普鲁士蓝的吸收光谱见图1。图1表明，反应生成物的最大吸收波长在735nm，盐酸多巴胺在500～800nm范围内没吸收，试剂空白在735nm附近有较小吸收。为消除试剂干扰，以试剂空白为参比，于735nm处测定生成物普鲁士蓝KFe^Ⅲ[Fe^Ⅱ(CN)₆]的吸光度。

2.3三氯化铁用量的影响

固定1.5×10^-2mol/L K₃[Fe(CN)₆]的用量为0.80mL，80μg/mL盐酸多巴胺的用量为1.00mL，考察FeCl₃用量对吸光度的影响。结果如图2所示，当FeCl₃加入量为0.80mL时，吸光度达到最大。继续加入FeCl₃量至2.00mL，吸光度仍保持不变。这表明溶液中的盐酸多巴胺已完全被Fe(Ⅲ)氧化，生成的Fe(Ⅱ)量达到最大，与之形成可溶性普鲁士蓝浓度也达到了最大。故后续实验中，FeCl₃用量选择为0.80mL。

2.4铁氰化钾用量的影响

固定1.5×10^-2mol/L FeCl₃用量为0.80mL，80μg/mL盐酸多巴胺的用量为1.00mL，其它条件不变，考察K₃[Fe(CN)₆]用量对吸光度的影响。结果如图3所示，当K₃[Fe(CN)₆]加入量为0.80mL时，吸光度达到最大，且不再随K₃[Fe(CN)₆]用量的增加而增大，表明溶液中生成的普鲁士蓝浓度达到了最大。为使盐酸多巴胺与Fe(Ⅲ)反应完全，选择K₃[Fe(CN)₆]的用量为0.80mL。

2.5反应时间的影响

固定1.5×10^-2mol/L K₃[Fe(CN)₆]的用量为0.80mL，1.5×10^-2mol/L FeCl₃用量为0.80mL，80μg/mL盐酸多巴胺的用量为1.00mL，反应温度为25℃，考察了不同反应时间对吸光度的影响。结果如图4所示，当反应时间为5min时，吸光度达到最大，且能保持45min不变，满足实验测得要求。故后续实验中最佳反应时间选择为5min。

2.6pH的影响

固定FeCl₃和K₃[Fe(CN)₆]用量均为0.80mL，80μg/mL盐酸多巴胺的用量为1.00mL，反应温度为25℃，反应时间为5min。用1mol/L的HCl和0.5mol/L的NaOH调节溶液酸度，考察不同pH值对吸光度的影响，结果如图5所示。当pH值小于4时，溶液吸光度稳定，当pH值大于4时，溶液吸光度明显降低。这是由于Fe(Ⅲ)在较高的pH值条件下，容易水解生成Fe(OH)₃沉淀，影响了Fe(Ⅲ)与盐酸多巴胺的反应，使溶液吸光度降低。这也与实验中观察到当pH大于4.0时，反应溶液变浑浊的现象相一致。为使反应进行的更加完全，实验中控制溶液的pH值在4.0以下。

3.7共存组分的影响

按照实验方法，固定多巴胺用量为3.20μg/mL，控制相对误差在5％以内，对一些常见药物赋形剂(淀粉、葡萄糖、精氨酸)、氨基酸和矿物质离子进行了干扰试验。结果表明：320μg/mL葡萄糖，160μg/mL淀粉，20μg/mL精氨酸、胱氨酸，40μg/mL谷氨酸，10μg/mL Co²⁺、Cd²⁺，0.1μg/mL Cu²⁺、Zn²⁺，大量的K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Ba²⁺、Al³⁺、Mn²⁺、NO₃ ^－、SO₄ ^2－、Br^－、和Cl^－不影响测定结果。

3.8标准曲线的绘制

固定FeCl₃(1.5×10^-2mol/L)用量为0.80mL，K₃[Fe(CN)₆](1.5×10^-2mol/L)用量为0.80mL，反应温度为25℃，反应时间为5min。在25mL比色管中分别准确移取0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60、1.80、2.00、2.20、2.40、2.60、2.80mL80μg/mL的盐酸多巴胺标准溶液，稀释至刻度线(此时pH为3.0)，摇匀后使其在室温下反应5min，分别测定溶液在735nm处的吸光度。以吸光度为纵坐标，盐酸多巴胺的浓度为横坐标绘制标准曲线，结果如图6所示。结果表明，盐酸多巴胺的浓度在0.32～8.96μg/mL范围内与吸光度呈良好线性关系，线性回归方程A＝0.0089+0.0879c(μg/mL)，相关系数R＝0.9997，摩尔吸光系数ε＝2.3×10⁴L/mol·cm。平行测定15份空白溶液的吸光度，按照标准偏差的3倍除以线性回归方程的斜率，求其检出限为0.025μg/mL。

3.9样品分析

取2mL盐酸多巴胺注射液针剂(2mL：20mg，远大医药(中国)有限公司)于250mL容量瓶，并用二次蒸馏水清洗药瓶3-5次，定容至250mL，所得溶液浓度为80μg/mL。按照实验方法测定注射液中多巴胺的含量，结果见表1。

表1样品及回收率的测定

三、结论

本实验以盐酸多巴胺可以还原Fe(Ⅲ)为基础，建立了以K₃[Fe(CN)₆]-Fe(Ⅲ)体系可见分光光度法测定药剂中盐酸多巴胺含量的新方法。研究表明：Fe(Ⅲ)可被盐酸多巴胺还原为Fe(Ⅱ)，还原生成的Fe(Ⅱ)与K₃[Fe(CN)₆]反应生成可溶性的普鲁士蓝KFe^Ⅲ[Fe^Ⅱ(CN)₆]，根据吸光度可间接测定盐酸多巴胺含量。该方法具有简单快速、线性范围宽、灵敏度高等特点，且所用试剂简单易得，适用于快速测定药剂中盐酸多巴胺的含量。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.间接光度法测定多巴胺的方法，其特征在于，用盐酸多巴胺将Fe（Ⅲ）还原为Fe(Ⅱ)，还原生成的Fe(Ⅱ)与K₃[Fe(CN)₆]反应生成可溶性的普鲁士蓝，盐酸多巴胺的浓度与反应生成的可溶性的普鲁士蓝的吸光度呈线性关系，根据吸光度间接测定盐酸多巴胺含量所述可溶性的普鲁士蓝最大吸收波长为735 nm；优选的，所述盐酸多巴胺的浓度为0.32～8.96 μg/mL。

2.根据权利要求1所述的间接光度法测定多巴胺的方法，其特征在于，所述方法对盐酸多巴胺的检出限为0.025 μg/mL。

3.根据权利要求1或2所述的间接光度法测定多巴胺的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）测吸光度：取相应体积和浓度的K₃[Fe(CN)₆]溶液和FeCl₃溶液及盐酸多巴胺溶液于比色管中，稀释至刻度，摇匀、反应，735 nm处试剂空白为参比，测定吸光度；

2）绘制标准曲线，得线性回归方程；

3）求盐酸多巴胺浓度：根据浓度和吸光度的相关性，即可根据吸光度求盐酸多巴胺的浓度。

4.根据权利要求1-3任一项所述的间接光度法测定多巴胺的方法，其特征在于，所述步骤1）测吸光度的方法为取K₃[Fe(CN)₆]和FeCl₃溶液及1.00 mL 80μg/mL的盐酸多巴胺溶液于25-mL磨口比色管中，调节pH值、稀释至刻度，摇匀、反应，735 nm处试剂空白为参比，测定吸光度。

5.根据权利要求1-4任一项所述的间接光度法测定多巴胺的方法，其特征在于，K₃[Fe(CN)₆]溶液的摩尔浓度为1.5×10^-2 mol/L和/或用量为0.50 mL -2.00mL；和/或FeCl₃的摩尔浓度为1.5×10^-2 mol/L和/或用量为0.50 mL -2.00mL；

优选地，K₃[Fe(CN)₆]溶液的摩尔浓度为1.5×10^-2 mol/L和/或用量为0.80 mL；和/或FeCl₃溶液的摩尔浓度为1.5×10^-2 mol/L和/或用量为0.80 mL。

6.根据权利要求4所述的间接光度法测定多巴胺的方法，其特征在于，所述调节pH值为将pH值调节为4以下。

7.根据权利要求1-4任一项所述的间接光度法测定多巴胺的方法，其特征在于，所述反应的温度为4-50 ºC；优选的，所述反应的温度为25-50 ºC；更优选的，所述反应的温度为25ºC。

8.根据权利要求1-4任一项所述的间接光度法测定多巴胺的方法，其特征在于，所述反应时间为5-10min；优选的，所述反应时间为5min。

9.一种权利要求1-8任一项所述方法的应用，其特征在于，用于快速测定药剂中盐酸多巴胺的含量。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药剂的剂型包括注射剂、片剂、丸剂、胶囊及其他所有可能含有盐酸多巴胺的剂型。

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