CN112791239B - 一种超仿生软硬组织复合支架的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种超仿生软硬组织复合支架的制备方法，制备方法包括设计仿生骨组织支架、打印原料的准备、打印墨水的制备、DLP光固化3D打印、冷冻干燥、提取患者的牙髓间充质干细胞及定向分化、细胞的接种和培养、软组织支架的制备和软硬组织复合支架的制备。本发明通过3D打印超仿生生物材料，实现口腔临床软硬组织的同期个性化修复，不仅避免了第二术区的开辟，也缩短了因目前软硬组织分期修复的治疗时间。同时，受启发于颌骨组织的三维微结构，模拟颌骨的哈弗氏管和沃克曼管以早期建立良好的血供，为分层诱导仿生颌骨组织提供了条件，为仿生支架的设计研发提供了新思路。
Description
技术领域
本发明属于组织工程领域仿生支架的制备方法，具体涉及一种超仿生软硬组织复合支架的制备方法。
背景技术
一般而言，骨组织有独特的自我再生和愈合能力，但当骨缺损超过极限范围 (>5-8mm)以后，其自愈能力常不理想。然而在临床上，口腔骨组织缺损，尤其是大范围的牙槽骨量不足，将直接影响患者的口腔修复治疗，即咀嚼功能的重建和美观的恢复。特别地，种植义齿已成为目前口腔修复中最主流的治疗方法，而其对牙槽骨量的要求颇高，若骨量不足则将大幅度的提高种植手术难度，甚至无法进行种植义齿修复。而且，口腔颌骨缺损大多伴随着软组织的退缩，当牙龈软组织尤其是附着龈量不足时，由于其缺乏粘膜下层，极大的增加了骨增量手术时所产生的软组织张力，对手术过程及远期疗效均提出了巨大的挑战。如今临床最为常用的治疗软硬组织合并缺损的手段为通过一期骨增量手术，如骨移植、骨劈开等重建颌骨后，经二期自体软组织移植术达到软硬组织再生修复的目的，为后续治疗及预后提供解剖学基础，但该治疗过程也存在手术次数多、周期长、需开辟第二术区等问题。因此，大面积骨组织缺损伴软组织不足的同期重建治疗是口腔颌面部缺损修复中的难题，研发可用于同期修复的软硬组织复合组织工程材料是目前口腔临床的重大需求。
在骨组织工程领域，被广泛使用的生物支架材料主要集中在生物陶瓷、天然或合成聚合物和复合体。然而，现今大多骨组织工程支架均存在结构简单均一的弊端，而从组织学上看，天然颌骨由表面高密度皮质骨及内部松质骨组成，前者以致密排列的骨单位为基本元素，是骨组织机械强度的主要来源；而后者则由疏松网络状骨小梁直接构成。进一步的，在皮质骨中，富有血管和神经的哈弗氏管和沃克曼管纵横交错，形成营养网络交通，在骨重建修复中起着不可或缺的作用；而松质骨则因本身结构疏松多孔，血运较为丰富，这些结构特点均保证了天然颌骨的生理功能与适应性改建。而在重建骨组织时，当重建尺寸>200μm便会超出营养及氧气的扩散极限，需要构造营养网络方能避免内部营养运输不畅。因此，理想修复复杂形态标准骨缺损的关键要素是充分模拟天然骨组织的微结构，早期在骨支架材料内部形成有效的脉管网络，以保证中央部分的氧与营养交换。而高精度3D打印技术为骨组织工程学中模拟天然纳微结构的骨组织提供了可能。此外，由于颌骨需通过牙齿咬合实现力的传导，且在咬合力作用下需具备良好的适应性改建功能，这便对松质骨中骨小梁的结构与连接方式有了更为独特的要求，而目前用于修复颌骨的生物材料则很少强调其功能特性，仅关注其形态学的重建，因此设计制造口腔领域中颌骨重建特属的骨组织工程支架材料以适应口内环境和功能是目前研究的瓶颈。若移植材料能充分模拟天然颌骨组织的脉管结构，在保证血供的同时负载患者自身来源的多向分化潜能干细胞，不仅能诱导新生骨组织发挥其所应承担的口内生理功能，也不存在异源细胞所带来的免疫源性风险，而目前尚无学者从微观及临床转化的角度，模拟天然颌骨的微结构来制备较大尺寸颌骨支架材料。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，并提供一种超仿生软硬组织复合支架的制备方法。本发明通过解析天然颌骨皮质骨中哈弗氏管、沃克曼管的脉管网络及松质骨的适应口腔咬合力复杂多变的三维多孔复合微观结构，提出梯度矿化多层仿生修复颌骨的新策略，结合高精度电流体力学打印技术和高精度DLP 光固化3D打印技术，构建超仿生软硬组织复合支架，实现口腔软硬组织同期修复。
本发明所采用的具体技术方案如下：
一种超仿生软硬组织复合支架的制备方法，其步骤如下：
1)通过三维软件模拟颌骨组织微结构，得到仿生薄层皮质骨支架模型和松质骨支架模型；
2)用生理盐水溶解GelMA，随后依次将光引发剂和BMP-2均匀溶解于 GelMA溶液中，调节溶液的pH至中性，分别得到皮质骨GelMA预聚液和松质骨GelMA预聚液；
3)将步骤2)得到的皮质骨GelMA预聚液和松质骨GelMA预聚液分别通过光固化分层打印步骤1)中的皮质骨支架模型和松质骨支架模型，洗净打印过程中未交联固化的GelMA，分别得到具有中空脉管网络流道的皮质骨预备支架和疏松多孔道的海绵状松质骨预备支架；
4)将步骤3)得到的皮质骨预备支架和松质骨预备支架置于超低温环境下，使预备支架内部的水分子快速形成冰晶；随后置于低温环境下回火，使冰晶融合生长并形成连通的微结构；最后梯度升温，真空干燥以去除水分，灭菌后得到皮质骨支架和松质骨支架；
5)将目标自体牙髓间充质干细胞分别培养于成骨诱导培养基和成血管诱导培养基中，诱导7～14天以使目标自体牙髓间充质干细胞向成骨及成血管的分化，消化重悬后得到成骨化诱导的hDPSC和成血管化诱导的hDPSC；
6)将步骤5)得到的成血管化诱导的hDPSC接种于皮质骨支架的中空脉管网络流道内，将成骨化诱导的hDPSC接种于皮质骨支架的上表面和下表面，培养以使细胞遍布于整个皮质骨支架，得到功能化皮质骨支架；将成骨化诱导的 hDPSC和成血管化诱导的hDPSC混合后接种于松质骨支架上，培养以使细胞遍布于整个松质骨支架，得到功能化松质骨支架；
7)通过电流体力学印刷技术，利用聚己内酯打印形成网状支架结构；用生理盐水将GelMA溶解，随后加入光引发剂，得到软组织层预聚液；将所述网状支架结构置于预聚溶液中，通过光固化使其成形，灭菌后得到软组织支架；
8)用生理盐水在无菌条件下溶解GelMA，随后加入光引发剂，得到预聚成型液；将软组织支架、功能化皮质骨支架和功能化松质骨支架按照从上到下的顺序依次叠合，并于叠合界面处均匀滴加所述预聚成型液，光固化以使三者一体化成形，得到超仿生软硬组织复合支架。
作为优选，所述皮质骨GelMA预聚液中GelMA的取代率为90％，质量浓度为10％，光引发剂的质量浓度为0.5％，BMP-2的浓度为600～800ng/mL；所述松质骨GelMA预聚液中GelMA的取代率为60％，质量浓度为10％，光引发剂的质量浓度为0.5％，BMP-2的浓度为200～400ng/L。
进一步的，所述光引发剂为蓝光引发剂LAP。
作为优选，所述步骤1)中三维软件为SolidWorks软件；步骤2)中将溶液的pH调节为7.4；所述灭菌采用Co60辐照24小时。
作为优选，所述步骤3)中通过DLP光固化3D打印机实现皮质骨GelMA 预聚液和松质骨GelMA预聚液的光固化分层打印，并在摇床中通过含有等渗 BMP-2的生理盐水溶液将打印出的皮质骨预备支架和松质骨预备支架中未交联固化的GelMA洗净，并将未被交联的剩余光引发剂浸出。
作为优选，所述步骤4)中，将所述皮质骨预备支架和松质骨预备支架置于 -80℃的冰箱中快速降温，并保持3小时，使预备支架内部的水分子快速形成冰晶；随后置于-20℃的冰箱中回火5小时，使冰晶融合生长并形成连通的微结构；最后置于冻干机中梯度升温，真空干燥24小时以去除水分，灭菌后得到皮质骨支架和松质骨支架。
作为优选，所述成骨诱导培养基为α-MEM培养基，包括100nmol/L的地塞米松、5mmol/L的β-甘油磷酸钠、100μg/mL的抗坏血酸、质量浓度为10％的胎牛血清、100Units/mL的青霉素和100Units/mL的链霉素；所述成血管诱导培养基为EGM-2培养基，包括5ng/mL的VEGF、5ng/mL的EGF、5ng/mL的 FGF、15ng/mL的IGF-1、10mM的谷氨酰胺、0.75Unit/mL的肝素、1μg/mL 的氢化可的松、50μg/mL的抗坏血酸和2％的胎牛血清。
作为优选，所述步骤6)中，培养的时间为7～14天；将成骨化诱导的hDPSC 和成血管化诱导的hDPSC按照1:1的密度比混合后接种于松质骨支架上。
作为优选，所述步骤7)中，首先在直写设备的料筒中装入聚己内酯颗粒，随后在80～100℃的条件下对聚己内酯颗粒预加热1～3小时，使聚己内酯颗粒充分熔融并填充料筒，随后进行打印；打印过程的参数如下：针头基板距离2mm，针头直径150um，针头温度105℃，料筒温度105℃，移动速度700-2000mm/min；所述软组织层预聚液中GelMA的取代率为60％，质量浓度为10％，光引发剂的质量浓度为0.5％；光固化的时间为15秒以上。
作为优选，所述步骤8)中，预聚成型液中GelMA的取代率为90％，质量浓度为10％；光固化的时间为5秒。
本发明相对于现有技术而言，具有以下有益效果：
1)本发明利用GelMA的光固化交联性能，能构建获得软硬组织复合支架，在解决骨增量手术后软组织关闭困难的问题的同时，能同期修复口腔软硬组织。
2)本发明通过调控骨组织支架中BMP-2在皮质骨层和松质骨层中的浓度差异，诱导新生骨自然形成与相邻旧骨相移行、一致的骨密度，实现新生骨组织的功能化密度梯度重建。
3)本发明利用高精度电流体力学打印技术，制备PCL网络，可通过不同设备参数调整网格密度，以实现软组织支架的可缝合性能，这是目前市场上的软组织支架所无法达到的。
4)本发明利用患者自身的牙髓间充质干细胞，进行定向诱导分化，并体外接种于支架，获得组织工程支架，一方面能在体内快速建立血供，诱导新骨的早期形成，另一方面在将自体组织“变废为宝”的同时，避免了免疫原性问题，有利于临床转化。
附图说明
图1为本发明通过SolidWorks软件设计的一种(A)皮质骨支架模型、(B) 松质骨支架模型及两者组合后的(C)复合骨组织支架模型；
图2为PCL网状支架结构示意图；
图3为本发明超仿生软硬组织复合支架的结构示意图；
图4为软组织支架的应力应变实验结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步阐述和说明。本发明中各个实施方式的技术特征在没有相互冲突的前提下，均可进行相应组合。
本发明提供了一种超仿生软硬组织复合支架的制备方法，该制备方法的具体步骤如下：
1)设计仿生骨组织支架：
通过三维软件(如SolidWorks软件)模拟颌骨组织微结构，设计并得到仿生薄层皮质骨支架模型和松质骨支架模型。如图1所示，为本发明提供的一种实施例中皮质骨支架模型(A)、松质骨支架模型(B)和两者组合后的复合骨组织支架模型(C)。其中，皮质骨支架模型含丰富的交互脉管网络，便于后期接种血管向分化的人牙髓间充质干细胞(即hDPSC)，早期建立血供，促进新骨形成。松质骨支架模型为疏松多孔的海绵状结构，相互交错贯通的孔状结构有利于成骨向和成血管向分化的人牙髓间充质干细胞早期粘附爬行。
2)打印墨水的制备：
首先用生理盐水溶解GelMA(即甲基丙烯酸酰化明胶)，随后依次将光引发剂和BMP-2均匀溶解于GelMA溶液中。由于此时的溶液呈弱酸性，因此通过投加适量的氢氧化钠来调节溶液的pH至中性，分别得到皮质骨GelMA预聚液和松质骨GelMA预聚液。
在本实施例中，皮质骨GelMA预聚液中GelMA的取代率为90％，质量浓度为10％，光引发剂的质量浓度为0.5％，BMP-2的浓度为600～800ng/mL(优选为800ng/mL)。松质骨GelMA预聚液中GelMA的取代率为60％，质量浓度为10％，光引发剂的质量浓度为0.5％，BMP-2的浓度为200～400ng/mL。光引发剂可以采用蓝光引发剂LAP，调节溶液的pH至7.4。
由于BMP-2在安全使用范围内时，诱导形成的新生骨密度具有浓度依赖性，即BMP-2在安全范围内时，使用浓度越高，形成的新生骨密度则越高，因此拟通过调控骨组织支架中BMP-2在皮质骨层和松质骨层中的浓度差异，诱导新生骨自然形成与相邻旧骨相移行、一致的骨密度，实现新生骨组织的功能化密度梯度重建。
此外，GelMA的理化性能可调节区间大，可根据需要选择不同取代率、不同浓度的GelMA，以满足不同需要，因此，本设计中所选择的GelMA的取代率和浓度为相对最优的，能满足同时可打印性、生物相容性及可降解性的需求，在有需要的情况下可进行调整。如在软组织支架层，通过选择GelMA取代率为90％，浓度为15％，可进一步增加其机械性能。
3)DLP光固化3D打印：
将步骤2)得到的皮质骨GelMA预聚液装入DLP光固化3D打印机的墨水槽内，通过光固化GelMA分层打印步骤1)在SolidWorks软件上设计的皮质骨支架模型，打印完毕后取出支架，并将其置于含有等渗BMP-2的生理盐水溶液中，通过摇床洗净支架在打印过程中未交联固化的GelMA，以通畅支架中的中空脉管网络流道结构，同时浸出未交联的光引发剂。
同样的，将步骤2)得到的松质骨GelMA预聚液装入DLP光固化3D打印机的墨水槽内，通过光固化GelMA分层打印步骤1)在SolidWorks软件上设计的松质骨支架模型，打印完毕后取出支架，并将其置于含有等渗BMP-2的生理盐水溶液中，通过摇床洗净支架在打印过程中未交联固化的GelMA，以通畅支架中疏松多孔的孔状结构，同时浸出未交联的光引发剂。
通过DLP光固化3D打印，最终得到具有中空脉管网络流道的皮质骨预备支架和疏松多孔的海绵状松质骨预备支架。
4)冷冻干燥：
将步骤3)制备得到的皮质骨预备支架和松质骨预备支架置于超低温环境下，使预备支架内部的水分子快速形成冰晶。随后置于低温环境下回火，使冰晶融合生长，由于预备支架的已光固化部分的内部存在有分子网络微观结构，在冰晶融合生长的过程中会刺破分子网络微观结构，并形成连通的通道微结构。最后梯度升温，真空干燥以去除水分，得到皮质骨支架和松质骨支架。
在本实施例中，将皮质骨预备支架和松质骨预备支架置于-80℃ 的冰箱中快速降温，并在该温度下保持3小时，以使预备支架内部的水分子快速形成密集而细小的冰晶颗粒。随后将支架置于-20℃ 的冰箱中回火5小时，使冰晶颗粒之间融合生长，并形成连通的通道微结构。最后将支架置于冻干机中梯度升温，真空干燥24小时以去除水分，得到皮质骨支架和松质骨支架。将皮质骨支架和松质骨支架置于Co 60辐照条件下24小时进行灭菌，储存待用。
5)提取患者的牙髓间充质干细胞及定向分化：
将患者的智齿或无功能牙拔除后，在无菌环境下提取其牙髓，经过剪碎、消化、鉴定、培养和扩增等操作后，最终获得目标自体牙髓间充质干细胞。
将目标自体牙髓间充质干细胞分别培养于成骨诱导培养基和成血管诱导培养基中，诱导7～14天以使目标自体牙髓间充质干细胞向成骨及成血管的分化，实现目标自体牙髓间充质干细胞的功能化，经过消化重悬后得到成骨化诱导的 hDPSC和成血管化诱导的hDPSC。
在本实施例中，成骨诱导培养基为α-MEM培养基，该培养基包括100 nmol/L的地塞米松、5mmol/L的β-甘油磷酸钠、100μg/mL的抗坏血酸、质量浓度为10％的胎牛血清、100Units/mL的青霉素和100Units/mL的链霉素。成血管诱导培养基为EGM-2培养基，该培养基包括5ng/mL的VEGF、5ng/mL的 EGF、5ng/mL的FGF、15ng/mL的IGF-1、10mM的谷氨酰胺、0.75Unit/mL 的肝素、1μg/mL的氢化可的松、50μg/mL的抗坏血酸和2％的胎牛血清。
6)细胞的接种和培养：
将步骤5)得到的成血管化诱导的hDPSC接种于皮质骨支架的中空脉管网络流道内，将成骨化诱导的hDPSC接种于皮质骨支架的上表面和下表面，培养以使细胞遍布于整个皮质骨支架，得到功能化皮质骨支架。该过程具体如下：首先将皮质骨支架水平放置于操作台上，将成血管化诱导的hDPSC接种于皮质骨支架的中空脉管网络流道内，将成骨化诱导的hDPSC接种于皮质骨支架的上表面，由于重力作用，成血管化诱导的hDPSC会贴附于中空脉管网络流道的内部下表面，并在该表面进行增殖生长，但是难以遍布整个中空脉管网络流道。因此，培养一天后将皮质骨支架翻转180°，使其原先的下表面朝上放置，再进行同样的接种操作，即将成血管化诱导的hDPSC接种于皮质骨支架的中空脉管网络流道原先的上表面，将成骨化诱导的hDPSC接种于皮质骨支架此时的上表面，从而使得细胞能够遍布于整个支架，于培养基中培养7～14天后待用。
将成骨化诱导的hDPSC和成血管化诱导的hDPSC混合后接种于松质骨支架上，培养以使细胞遍布于整个松质骨支架，得到功能化松质骨支架。在本实施例中，可以将成骨化诱导的hDPSC和成血管化诱导的hDPSC按照1:1的密度比混合后接种于松质骨支架上，于培养基中培养7～14天使细胞增殖并遍布于整个支架后待用。在本实施例中，将成骨化诱导的hDPSC和成血管化诱导的hDPSC按照1:1的密度比混合能更好的发挥其生物学功能，在不影响相互生长的同时，加强各自的成骨及成血管功能。
将接种细胞7～14天后的功能化皮质骨支架进行了激光扫描共聚焦显微镜表征，通过confocol图可以看出，细胞密集的粘附于脉管流道内，勾勒出一条血管样结构，同时支架上下表面及支架实体部分内亦可见大量细胞，说明细胞能在皮质骨支架的内外表面均匀粘附并增殖。
将接种细胞7～14天后的功能化松质骨支架进行了激光扫描共聚焦显微镜表征，通过confocol图可以看出，大量细胞密集的粘附于松质骨支架孔隙的内外表面，勾勒出松质骨支架的多孔样形态，说明细胞能在松质骨支架的内外表面均匀粘附并增殖。
7)软组织支架的制备：
通过高精度电流体力学印刷技术，利用聚己内酯打印形成网状支架结构。用生理盐水将GelMA溶解，随后加入光引发剂，得到软组织预聚液。将网状支架结构置于软组织预聚液中，通过光固化使其成形，得到软组织支架。
在本实施例中，通过高精度电流体力学打印技术，在直写设备的金属料筒中装入聚己内酯(PCL)颗粒，随后在80～100℃的条件下对聚己内酯颗粒预加热 1～3小时，使聚己内酯颗粒充分熔融并填充料筒。而后开始正式打印，打印过程中的参数如下：针头基板距离2mm，针头直径150μm，针头温度105℃，料筒温度105℃，移动速度700-2000mm/min，将聚己内酯打印成高精网络状结构，如图2所示。随后制备成型溶液，成型溶液中GelMA的取代率为60％，质量浓度为10％，光引发剂的质量浓度为0.5％。将成型溶液浇注于一个成型容器中，最后将网状支架结构置于其中，光固化15秒以上使其成形，得到软组织支架。将软组织支架置于Co 60辐照条件下24小时进行灭菌，储存待用。
8)软硬组织复合支架的制备：
用生理盐水在无菌条件下溶解GelMA和光引发剂，得到预聚成型液。预聚成型液中GelMA的取代率为90％，质量浓度为10％。光固化的时间为5秒。将软组织支架、功能化皮质骨支架和功能化松质骨支架按照从上到下的顺序依次叠合，并于叠合界面处完全的均匀滴加预聚成型液，光固化以使三者一体化成形，得到超仿生软硬组织复合支架，如图3所示。从上到下依次为可缝合软组织支架，中层为和相邻皮质骨相连续的含功能化脉管网络的皮质骨支架，下层为和相邻松质骨相连续的功能化松质骨支架。
对得到的软组织支架进行应力应变实验以验证其的力学性能，结果如图4 所示。图中GM60为不含有网状支架结构，而直接通过软组织预聚液制备得到的无增强软组织支架；composite为通过本发明方法制备得到的PCL增强的软组织支架。从图中可以看出，含有PCL网状支架结构的composite相比于GM60 具有更优的力学性能，从而赋予软组织支架的可缝合性能，直接通过将软组织直接和口腔软硬组织缺损区域周围的牙龈组织缝合，既能实现软硬组织同期修复，也能避免开辟第二术区。
本发明结合了高精度电流体力学打印技术和高精度DLP光固化3D打印技术的超仿生软硬组织复合支架的制备方法，包括可缝合软组织支架及模拟颌骨微结构的双层骨组织支架。软组织支架主要由甲基丙烯酸化水凝胶(GelMA)构成，内部含高精度电流体力学打印形成的聚己内酯(PCL)增强网络，具备良好的生物相容性及可缝合性；双层骨组织支架由上层含脉管网络的皮质骨支架和下层疏松多孔的松质骨支架组成，通过双层支架内的梯度浓度骨形态发生蛋白-2 (BMP-2)控制新生骨的梯度密度，以诱导颌骨组织的超仿生重建。
本发明旨在通过3D打印超仿生生物材料，实现口腔临床软硬组织的同期个性化修复，不仅避免了第二术区的开辟，也缩短了因目前软硬组织分期修复的治疗时间。同时，受启发于颌骨组织的三维微结构，模拟颌骨的哈弗氏管和沃克曼管以早期建立良好的血供，为分层诱导仿生颌骨组织提供了条件，为仿生支架的设计研发提供新思路。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，然其并非用以限制本发明。有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此凡采取等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种超仿生软硬组织复合支架的制备方法，其特征在于，步骤如下：
1)通过三维软件模拟颌骨组织微结构，得到仿生薄层皮质骨支架模型和松质骨支架模型；
2)用生理盐水溶解GelMA，随后依次将光引发剂和BMP-2均匀溶解于GelMA溶液中，调节溶液的pH至中性，分别得到皮质骨GelMA预聚液和松质骨GelMA预聚液；
3)将步骤2)得到的皮质骨GelMA预聚液和松质骨GelMA预聚液分别通过光固化分层打印步骤1)中的皮质骨支架模型和松质骨支架模型，洗净打印过程中未交联固化的GelMA，分别得到具有中空脉管网络流道的皮质骨预备支架和疏松多孔道的海绵状松质骨预备支架；
4)将步骤3)得到的皮质骨预备支架和松质骨预备支架置于超低温环境下，使预备支架内部的水分子快速形成冰晶；随后置于低温环境下回火，使冰晶融合生长并形成连通的微结构；最后梯度升温，真空干燥以去除水分，灭菌后得到皮质骨支架和松质骨支架；
5)将目标自体牙髓间充质干细胞分别培养于成骨诱导培养基和成血管诱导培养基中，诱导7～14天以使目标自体牙髓间充质干细胞向成骨及成血管的分化，消化重悬后得到成骨化诱导的hDPSC和成血管化诱导的hDPSC；
6)将步骤5)得到的成血管化诱导的hDPSC接种于皮质骨支架的中空脉管网络流道内，将成骨化诱导的hDPSC接种于皮质骨支架的上表面和下表面，培养以使细胞遍布于整个皮质骨支架，得到功能化皮质骨支架；将成骨化诱导的hDPSC和成血管化诱导的hDPSC混合后接种于松质骨支架上，培养以使细胞遍布于整个松质骨支架，得到功能化松质骨支架；
7)通过电流体力学印刷技术，利用聚己内酯打印形成网状支架结构；用生理盐水将GelMA溶解，随后加入光引发剂，得到软组织层预聚液；将所述网状支架结构置于预聚溶液中，通过光固化使其成形，灭菌后得到软组织支架；
8)用生理盐水在无菌条件下溶解GelMA，随后加入光引发剂，得到预聚成型液；将软组织支架、功能化皮质骨支架和功能化松质骨支架按照从上到下的顺序依次叠合，并于叠合界面处均匀滴加所述预聚成型液，光固化以使三者一体化成形，得到超仿生软硬组织复合支架。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述皮质骨GelMA预聚液中GelMA的取代率为90％，质量浓度为10％，光引发剂的质量浓度为0.5％，BMP-2的浓度为600～800ng/mL；所述松质骨GelMA预聚液中GelMA的取代率为60％，质量浓度为10％，光引发剂的质量浓度为0.5％，BMP-2的浓度为200～400ng/L。
3.根据权利要求1或2任一所述的制备方法，其特征在于，所述光引发剂为蓝光引发剂LAP。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中三维软件为SolidWorks软件；步骤2)中将溶液的pH调节为7.4；所述灭菌采用Co60辐照24小时。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中通过DLP光固化3D打印机实现皮质骨GelMA预聚液和松质骨GelMA预聚液的光固化分层打印，并在摇床中通过含有等渗BMP-2的生理盐水溶液将打印出的皮质骨预备支架和松质骨预备支架中未交联固化的GelMA洗净，并将未被交联的剩余光引发剂浸出。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中，将所述皮质骨预备支架和松质骨预备支架置于-80℃ 的冰箱中快速降温，并保持3小时，使预备支架内部的水分子快速形成冰晶；随后置于-20℃ 的冰箱中回火5小时，使冰晶融合生长并形成连通的微结构；最后置于冻干机中梯度升温，真空干燥24小时以去除水分，灭菌后得到皮质骨支架和松质骨支架。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述成骨诱导培养基为α-MEM培养基，包括100nmol/L的地塞米松、5mmol/L的β-甘油磷酸钠、100μg/mL的抗坏血酸、质量浓度为10％的胎牛血清、100Units/mL的青霉素和100Units/mL的链霉素；所述成血管诱导培养基为EGM-2培养基，包括5ng/mL的VEGF、5ng/mL的EGF、5ng/mL的FGF、15ng/mL的IGF-1、10mM的谷氨酰胺、0.75Unit/mL的肝素、1μg/mL的氢化可的松、50μg/mL的抗坏血酸和2％的胎牛血清。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤6)中，培养的时间为7～14天；将成骨化诱导的hDPSC和成血管化诱导的hDPSC按照1:1的密度比混合后接种于松质骨支架上。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤7)中，首先在直写设备的料筒中装入聚己内酯颗粒，随后在80～100℃的条件下对聚己内酯颗粒预加热1～3小时，使聚己内酯颗粒充分熔融并填充料筒，随后进行打印；打印过程的参数如下：针头基板距离2mm，针头直径150um，针头温度105℃，料筒温度105℃，移动速度700-2000mm/min；所述软组织层预聚液中GelMA的取代率为60％，质量浓度为10％，光引发剂的质量浓度为0.5％；光固化的时间为15秒以上。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤8)中，预聚成型液中GelMA的取代率为90％，质量浓度为10％；光固化的时间为5秒。
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