CN112345768B

CN112345768B - 一种基于重组蛋白rsPgp3的家畜衣原体抗体的间接ELISA检测方法及试剂盒

Info

Publication number: CN112345768B
Application number: CN202011155394.XA
Authority: CN
Inventors: 胡思顺; 周文; 胡长敏; 舒晓倩; 袁李圣兰; 李自力; 刘梅
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2020-10-26
Filing date: 2020-10-26
Publication date: 2021-05-07
Anticipated expiration: 2040-10-26
Also published as: CN112345768A

Abstract

本发明属于生物医药检测技术领域，尤其涉及一种基于重组蛋白rsPgp3(rsPGP3)的家畜衣原体抗体的间接ELISA检测方法及试剂盒。本发明通过基因克隆表达技术，获取家畜衣原体rsPgp3。以rsPgp3为包被抗原建立起间接ELISA方法，包括抗原rsPgp3的制备、间接ELISA建立、判定标准的建立及临床血清学检测的应用。可用于家畜衣原体Pgp3蛋白特异性抗体的检测，以此判断牛羊群中衣原体发病情况及自然感染水平。目前该方法是国内首次利用家畜衣原体Pgp3蛋白建立检测牛羊衣原体抗体的ELISA。二抗采用HRP标记的链球菌G蛋白(HRP‑SPG)，其特异性和敏感性明显高于传统二抗。

Description

一种基于重组蛋白rsPgp3的家畜衣原体抗体的间接ELISA检测方法及试剂盒

技术领域

本发明属于生物医药检测技术领域，尤其涉及一种基于重组蛋白rsPgp3的家畜衣原体抗体的间接ELISA检测方法及试剂盒。

背景技术

衣原体是一类介于细菌与病毒之间的专性细胞内寄生的单细胞原核微生物，其存在独特的生长发育周期，能引起人和动物的衣原体病，引起多种炎症，并可影响生殖系统，引起重大的公共卫生问题。衣原体的宿主广泛，家畜中以猪牛羊较为易感，没有明显的年龄差别，但不同年龄的畜禽感染后的症状表现不一。近年来，家畜衣原体的感染在中国养殖场十分普遍，可引起母畜流产、死胎等多种疾患，给养殖业带来巨大经济损失。传统衣原体实验室诊断方法存在检测时间长、对操作人员和仪器设备要求高、检测灵敏度有限而导致漏检的不足，血清学诊断方法主要有补体结合实验、正向间接血凝试验、ELISA，补体结合试验操作复杂，不宜推广。间接血凝试验虽然操作简单，但敏感性较差。目前用于诊断抗原用的衣原体蛋白有外膜蛋白ompA、巨噬细胞感染增强蛋白(MIP)，但均存在特异性不足或交叉反应性强等原因未能被推广和商品化。现有的国内文献报道，国内养殖场内动物衣原体感染的阳性率居高不下，而且在某些省份呈逐年增长的趋势，为了更好的诊断和控制国内的动物衣原体病，故亟需建立一种快速准确的衣原体诊断方法。据相关文献报道，衣原体质粒的Pgp3蛋白高度保守，具有种属特异性，抗原性良好。刘东明(2015)对泌尿生殖道沙眼衣原体感染者血清抗衣原体免疫优势蛋白抗体的检测展开研究分析发现，该病原质粒编码蛋白3是抗原性较强、检出率较高(72％)的衣原体蛋白之一。但在动物性衣原体中Pgp3还未曾被关注和应用。

目前国内衣原体感染的血清学监测主要依赖兰州兽医研究所研发的衣原体间接血凝IHA 检测试剂盒，存在耗时较多，灵敏度有待改进等不足，故亟需建立一种快速准确的衣原体诊断方法。酶联免疫吸附试验(ELISA)具有操作简单、敏感性高、特异性高、快速、易标准化等优点，适合于大规模血清学检测。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于重组蛋白rsPgp3的家畜衣原体抗体的间接ELISA检测方法及试剂盒，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明是这样实现的，一种基于重组蛋白rsPgp3的家畜衣原体抗体的非诊断目的的间接 ELISA检测方法，包括以下步骤：

将重组蛋白抗原重组蛋白rsPgp3用包被液稀释后包被96孔酶标板，100μL/孔，4℃条件下过夜；重组蛋白rsPgp3的氨基酸序列见SEQ ID NO.1，核苷酸序列见SEQ ID NO.2所示(所述序列源于家畜衣原体序列)；

甩去包被液，用洗涤液洗板3次，每次5分钟；

加入100μL/孔的封闭液于37℃封闭2h，取出洗板；

用PBST将血清样品稀释后，100μL/孔，每份血清样品设两个重复，37℃反应1h后，取出洗板；

加入HRP-SPG，100μL/孔，37℃反应1h，取出洗板；

加入TMB底物溶液，避光反应10-15min后加入终止液2M H₂SO₄50μL/每孔，终止反应，立即于酶标仪上读出OD₄₅₀nm处每孔吸光度值，OD450nm＞0.23判定为阳性结果，OD450nm≤0.23判定为阴性。

包被抗原的制备：根据GenBank查找家畜(牛羊亲)衣原体编码质粒蛋白Pgp3的DNA序列(GenBank:KT352923.1)，根据DNAstar生物软件对其编码蛋白的抗原表位进行分析，筛选主要抗原区域，66aa-264aa，相应的DNA片段进行密码子优化后由天一辉远生物有限公司合成并连接至pET-28a(+)载体构建重组质粒pET28a-spgp3。将pET28a-spgp3转化至BL21(DE3)中，经1mM IPTG诱导高效表达了rsPgp3，该蛋白主要以上清形式表达，部分为包涵体表达，采用Ni+亲和层析方法纯化得到重组蛋白rsPgp3。

进一步地，所述包被液为pH为9.6的0.05M碳酸盐缓冲液。

进一步地，重组蛋白抗原的稀释度为8μg/mL。

进一步地，血清样品的稀释度为1：200。

进一步地，HRP-SPG用PBST稀释，稀释度为1：8000。

一种基于重组蛋白rsPgp3的家畜衣原体抗体的间接ELISA检测试剂盒，包括：重组蛋白 rsPgp3，缓冲液，封闭液，样品稀释液，酶标抗体HRP-SPG，显色液和终止液；所述重组蛋白rsPgp3的氨基酸序列见SEQ ID NO.1，核苷酸序列见SEQ ID NO.2所示。本发明中的重组蛋白rsPgp3的序列源于牛羊亲衣原体的序列，并以大肠杆菌作为目的蛋白的表达载体表达得到。

进一步地，封闭液为2％BSA的PBST。

进一步地，样品稀释液为添加2.5％大肠杆菌裂解液的PBST。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

①本发明用于检测家畜衣原体抗体的Pgp3蛋白选择家畜衣原体质粒中Pgp3蛋白主要的抗原区(66aa-264aa)作为靶标抗原，利用原核表达载体pET-28a(+)和受体菌BL21(DE3) 高效表达pET28a-spgp3，获得重组蛋白rsPgp3。该蛋白主要以上清形式表达，部分为包涵体表达，采用Ni+亲和层析方法纯化得到截短重组蛋白Pgp3。本发明所用的sPgp3重组蛋白，是经过纯化的基因表达产物，而不是活的衣原体全菌体，因此在生产过程中避免了操作者受感染、散毒的安全隐患。另外，根据DNAstar软件对Pgp3蛋白进行抗原表位预测，发现主要抗原表位位于C端198个氨基酸，所以对其进行截短表达，特异性明显增强。

②本发明所用的二抗为HRP标记的链球菌G蛋白，简称(HRP-SPG)，链球菌G蛋白是G、C型链球菌细胞壁中的一种蛋白质，能特异性地同免疫球蛋白IgG分子的Fc段结合而不影响其Fab段与抗原分子结合的能力，其特异性和敏感性明显高于传统二抗。它不仅能与人、小鼠、大鼠IgG的全部亚类相结合，还可与豚鼠、兔、山羊、牛、绵羊和马等的IgG相结合，明显优于只能结合人、小鼠IgG的金黄色葡萄球菌蛋白A。所以本发明除了适用于诊断家畜衣原体感染外，也可用于检测其它哺乳动物的衣原体病，为今后产业化开发奠定了基础，为有效防控该病提供有力的技术支持。

③本发明用的Pgp3抗原，以大肠杆菌作为目的蛋白的表达载体，培养简单，可以实现质量控制，具有很好的稳定性。该方法是国内首次利用家畜衣原体Pgp3蛋白建立检测牛羊衣原体抗体的ELISA。

④本发明所建立的间接ELISA方法具有特异性强和敏感性高等优点，弥补了间接血凝试验判断阴阳性会存在可疑、弱阳性不好区分的情况。

附图说明

图1是重组质粒pET28a-spgp3在BL21(DE3)中表达的电泳图；M-蛋白质分子量标准，1-pET28a，2-pET28a-spgp3诱导0h，3-pET28a-spgp3诱导4h，4-空白对照，5-pET28a-spgp3 裂解物包涵体，5-pET28a-spgp3裂解物上清；

图2是rsPgp3重组蛋白的Western-blot检测图；M-蛋白质分子量标准，1-pET28a-spgp3， 2-pET28a；

图3是酶标二抗最佳工作浓度的确定；

图4是重组蛋白最佳包被条件的确定。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。

本发明下述各实施例中所述常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。

本发明中涉及的基因、蛋白或其片段可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。

本发明披露了一种基于重组蛋白rsPgp3的家畜衣原体抗体的间接ELISA检测方法及试剂盒，具体如下实施例所示。

实施例1

1、包被抗原的制备

根据GenBank查找家畜衣原体编码质粒蛋白Pgp3的DNA序列(GenBank:KT352923.1)，根据DNAstar生物软件对其编码蛋白的抗原表位进行分析，筛选主要抗原区域，66aa-264aa，相应的DNA片段进行密码子优化后由天一辉远生物有限公司合成并连接至pET28a(+)载体构建截短Pgp3重组质粒pET28a-spgp3。

重组蛋白rsPgp3诱导表达与鉴定：将重组原核表达载体pET28a-spgp3质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，挑单个菌落进行增菌培养，当OD_620nm吸光度为0.6-0.8时，加入适量IPTG诱导5-6h后集菌进行SDS-PAGE分析。结果显示，重组蛋白rsPgp3在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达，主要以上清形式表达，部分以包涵体形式表达，蛋白分子量大小为25kDa，与预测的rsPgp3大小基本一致(参见图1)。参照GE公司HisTrap^TM HP纯化柱说明书进行rsPgp3蛋白纯化，结果表明蛋白纯化效果较好，测定蛋白质浓度为2mg/mL。参照常规Western Blotting方法进行操作，最后采用增强型HRP-DAB底物显色试剂(购自北京天根生化科技公司)进行显色。结果显示：与SDS-PAGE对比，pET28a-spgp3转化BL21诱导后在Western Blotting对应位置出现特异性的条带(参见图2)。结果表明重组蛋白rsPgp3 能与阳性血清中抗体发生特异性抗原抗体反应。

2、以重组蛋白rsPgp3建立间接ELISA

抗原rsPgp3最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定：

①将纯化后的rsPgp3蛋白用包被液稀释成2μg/mL，4μg/ml，6μg/mL，8μg/mL，10μg/mL 横向包被酶标板，100μL/孔，每个浓度包被1列。

②包被后在4℃条件下过夜。

③用洗涤液洗涤3次，每次5min，每孔300μL洗涤液，洗涤完将板子在吸水纸上拍干。

④用2％BSA 100μL/孔进行封闭，37℃孵育2h后洗涤。

⑤将阴阳血清先以1：100稀释后，纵向倍比稀释做方阵滴定确定表达产物的最佳包被浓度，100μL/孔，每个浓度一行，37℃孵育1h，洗涤，拍干。

⑥再加入1：8000的二抗HRP-SPG，100μL/孔，37℃孵育1h，洗涤，拍干。

⑦加入TMB底物缓冲液100μL/孔，37℃反应10min。

⑧加入50μL/孔终止液反应，用酶标仪测定OD₄₅₀的值。

根据表1方阵滴定结果，当血清的稀释倍数为1：200，抗原的稀释度为8μg/mL时阳性血清OD450nm值可达到1.041，P/N的值也最大。因此选择1：200为最佳血清稀释倍数，抗原的最佳包被浓度为8μg/mL。

表1方阵滴定的OD450nm值结果

酶标二抗最佳工作浓度的确定：

采用最佳包被度和最佳血清稀释度纵向包被酶标板，二抗HRP-SPG用PBST做稀释，从 1:4000、1：6000、1：8000、1：10000，来确定酶标二抗的最佳工作浓度。

从图3结果示意，当酶标二抗HRP-SPG稀释1：8000时，阳性血清与阴性血清的OD450nm 值相差最大(P/N＝24)，因此将重组蛋白的酶标二抗的最佳工作浓度确定为1：8000。

抗原最佳包被条件的确定：

以①37℃1h加4℃过夜；②37℃2h加4℃过夜；③37℃2h；④4℃过夜，4种不同的条件下包被的重组蛋白Pgp3，用牛衣原体病阴阳血清进行ELISA测定，确定抗原的最佳包被条件。

从图4可以看出，重组蛋白在4℃过夜和37℃1h再4℃过夜的包被条件下，阳性血清与阴性血清的OD450值相差不大，说明包被效果较好，为了条件简便，因此4℃过夜包被条件确定为重组蛋白的最佳包被条件。

最佳封闭液以及封闭时间的确定：

以①明矾BSA；②2％BSA；③5％BSA；④5％脱脂奶粉分别对酶标板进行封闭，确定最佳封闭液。再以最佳封闭液分别封闭酶标板45min、90min、2h、4℃过夜。结果最终确定2％BSA 为最佳封闭剂，4℃封闭过夜。

血清和酶标二抗最佳反应时间的确定：

用重组蛋白以其最佳抗原包被浓度条件下包被酶标板，4℃过夜，将血清及其酶标二抗都做最佳稀释倍数，分别在37℃下反应90min，1h，45min，0.5h进行ELISA测定，确定血清，二抗的最佳结合时间。最终选择37℃下反应45min作为血清和酶标二抗最佳反应时间。

ELISA的操作步骤：

上述条件确定后本ELISA试验的操作步骤如下：

将重组蛋白抗原用包被液(pH为9.6的0.05M碳酸盐缓冲液)稀释至最佳浓度(8μg/mL) 后包被96孔酶标板，100μL/孔，4℃条件下过夜。甩去包被液，用洗涤液洗板3次，每次5分钟。然后加入100μL/孔的封闭液(2％BSA的PBST)于37℃封闭2h，取出洗板同上。用样品稀释液(添加2.5％大肠杆菌裂解液的PBST)将血清样品稀释至最佳稀释度(1：200) 后，100μL/孔，每份血清样品设两个重复，37℃反应1h后，取出洗板同上。再加入最佳浓度 (1：8000)的HRP-SPG，100μL/孔，37℃反应1h，取出洗板同上。然后加入TMB底物溶液，避光反应10-15min后加入终止液2M H₂SO₄50μL/每孔，终止反应，立即于酶标仪上读出OD₄₅₀nm处每孔吸光度值，同时设空白对照孔。

确定ELISA阴阳性临界值：用上述确定的ELISA最适条件，对本实验室保存的50份牛阴性血清进行检测，每个样品设置2个重复，读取OD450nm值，计算所有阴性样本的 OD平均值X为0.122，标准差S为0.036，根据公式X+3S＝0.23为阴、阳性结果判定值，即OD450nm＞0.23判定为阳性结果，OD450nm≤0.23判定为阴性。结果见下表2：

表2 50份家畜衣原体抗体阴性血清的ELISA检测结果

特异性试验检测：采用确立的ELISA条件，用牛口蹄疫阳性血清、牛副结核阳性血清、牛支原体阳性血清进行ELISA交叉试验。结果牛口蹄疫阳性血清、牛副结核阳性血清、牛支原体阳性血清均为阴性。表明建立的ELISA方法特异性较好。结果见表3。

表3：特异性试验结果

敏感性试验：用已经确定的ELISA程序检测家畜衣原体阳性血清，将阳性血清以1：100， 1：200，1：400，1：800，1：1600，1：3200，1：6400，1：12800进行倍比稀释，其余条件按照ELISA最佳反应条件进行。当阳性血清稀释到1：1600时，肉眼观察酶标板孔颜色变化，很难判断出阴、阳性，但酶标仪可以检出，当阳性血清稀释到1：3200时，酶标仪检测结果为阴性，结果见表4。

表4：敏感性试验结果

重复性试验：

(1)批内重复性试验：选取经IHA检测为阴性、阳性、疑似阳性的血清6份，以 1:200稀释，在同一批次纯化的rsPgp3包被的不同酶标板上进行批内重复试验，每个样品设置5孔平行，根据OD450 nm值计算标准差，变异系数均小于10％，结果见表5。

表5：批内重复试验

(2)批间重复性试验：将三个不同批次纯化的rsPgp3蛋白包被同一块酶标板上，加入上述血清进行批间重复试验，每个样品设置2孔平行，根据OD450 nm值计算标准差，变异系数均小于10％。结果见表6。

表6：批间重复试验

对比试验结果：利用建立的间接ELISA检测方法和目前国内通用的IHA方法，对68份采集与武汉周边的羊血清分别进行检测，IHA试验以1：16为判定孔，检测出4份阳性，64份阴性，其中IHA检测为阳性的4份血清间接ELISA法检测全部为阳性，IHA检测为阴性的64份血清间接ELISA法测得12份为阳性，52份为阴性，由此得出二者均测得阳性的血清有 4份，都为阴性的血清有52份，二者的阳性符合率为100％，阴性符合率为92.3％，总符合率为94.1％。结果见表7。

表7.IHA与ELISA检测牛血清的对比试验结果

稳定性试验：包被酶标板并封存，分别置于4℃，37℃保存一周后，检测阴阳血清，结果包被酶标板在37℃保存一周后的检测结果未见明显变化。

表8.稳定性试验

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种基于重组蛋白rsPgp3的家畜衣原体抗体的间接ELISA检测方法及试剂盒

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 199

<212> PRT

<213> Chlamydia

<400> 1

Thr Ile Glu Phe Ser Leu Asp Thr Pro Lys Ile Ala Gln Ala Val Leu

1 5 10 15

Glu Ser Val Thr Asn Asp Ile Met Gln Glu Ile Val Ser Asn Leu Ser

20 25 30

Gln Glu Leu Ile Glu Asp Val Leu Glu Lys Ile Asp Thr Asp Ser Ser

35 40 45

Phe Ser Phe Ser Arg Ala Phe Lys Ala Ile Glu Ile Lys Asp Cys Ile

50 55 60

Gln Cys Asn Gly Leu Phe Thr Ser Glu Asn Ile Gly Asn Leu Leu Gly

65 70 75 80

Gly Thr Glu Ile Ala Lys Phe Thr Val Thr Pro Glu Asn Ala Asn Ser

85 90 95

Ala Phe Leu Ile Asp Ala Asn Ile Ile Ala Ser Arg Met Glu Gly Ala

100 105 110

Val Val Leu Ala Leu Val Lys Glu Gly Asn Ser Ser Pro Ser Ala Ile

115 120 125

Ser Tyr Gly Phe Ser Ser Gly Leu Pro Asn Val Cys Ser Leu Lys Ala

130 135 140

Val Ile Glu Asn Thr Thr Thr Thr Pro Ala Thr Phe Ser Leu Arg Ile

145 150 155 160

Gly Gly Met Glu Ser Gly Val Val Trp Val Asn Ala Met Pro Asn Gly

165 170 175

Asn Lys Ile Leu Asn Ala Glu Thr Thr Ser Thr Ile Ser Val Leu Glu

180 185 190

Val Ile Pro Gln Thr Asn Gly

195

<210> 2

<211> 615

<212> DNA/RNA

<213> Chlamydia

<400> 2

gcgacaactc ctgcaacaat tgaattctct ctagatacac caaaaatcgc tcaagctgtt 60

ttggaaagtg ttactaatga cattatgcaa gagattgtaa gtaatttatc gcaagaattg 120

atagaagatg tgctagaaaa gattgataca gattcatctt tttccttctc tagagctttt 180

aaagctatag aaatcaagga ttgtatccaa tgtaatggac tatttacttc tgaaaatata 240

ggcaatcttc ttggaggaac agagatagca aaatttacag ttacaccaga gaacgctaat 300

agtgcatttt taattgatgc caatattata gcttctagaa tggaaggagc tgttgtctta 360

gctctggtta aagaaggaaa ctcatctcca agtgccatta gttacggttt ttcttccgga 420

ctaccgaatg tatgttccct gaaagctgtt atcgaaaata ccacaacaac tcctgcaaca 480

ttttccctaa gaataggtgg aatggaaagt ggggttgtgt gggtcaacgc aatgccaaat 540

gggaacaaaa tccttaatgc agaaacaaca tcaacaatta gtgtattaga agtaattcct 600

caaactaatg gataa 615

Claims

1.一种基于重组蛋白rsPgp3的家畜衣原体抗体的非诊断目的的间接ELISA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

将重组蛋白抗原rsPgp3用包被液稀释后包被96孔酶标板，100μL/孔，4℃条件下过夜；重组蛋白抗原rsPgp3的氨基酸序列见SEQ ID NO.1，核苷酸序列见SEQ ID NO.2所示；

甩去包被液，用洗涤液洗板3次，每次5分钟；

加入100μL/孔的封闭液于37℃封闭2h，取出洗板；

加入HRP-SPG，100μL/孔，37℃反应1h，取出洗板；

加入TMB底物溶液，避光反应10-15min后加入终止液2M H₂SO₄50μL/每孔，终止反应，立即于酶标仪上读出OD₄₅₀nm处每孔吸光度值，OD₄₅₀nm ＞0.23判定为阳性结果，OD₄₅₀nm ≤0.23判定为阴性。

2.根据权利要求1所述的一种基于重组蛋白rsPgp3的家畜衣原体抗体的非诊断目的的间接ELISA检测方法，其特征在于：所述包被液为pH为9.6的0.05M碳酸盐缓冲液。

3.根据权利要求1所述的一种基于重组蛋白rsPgp3的家畜衣原体抗体的非诊断目的的间接ELISA检测方法，其特征在于：重组蛋白抗原的稀释度为8μg/mL。

4.根据权利要求1所述的一种基于重组蛋白rsPgp3的家畜衣原体抗体的非诊断目的的间接ELISA检测方法，其特征在于：血清样品的稀释度为1：200。

5.根据权利要求1所述的一种基于重组蛋白rsPgp3的家畜衣原体抗体的非诊断目的的间接ELISA检测方法，其特征在于：HRP-SPG用PBST稀释，稀释度为1：8000。

6.一种基于重组蛋白rsPgp3的家畜衣原体抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括：重组蛋白rsPgp3，缓冲液，封闭液，样品稀释液，酶标抗体HRP-SPG，显色液和终止液；所述重组蛋白rsPgp3的氨基酸序列见SEQ ID NO.1，核苷酸序列见SEQ ID NO.2所示。

7.根据权利要求6所述的一种基于重组蛋白rsPgp3的家畜衣原体抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：封闭液为2％BSA的PBST。

8.根据权利要求6所述的一种基于重组蛋白rsPgp3的家畜衣原体抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：样品稀释液为添加2.5％大肠杆菌裂解液的PBST。