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CN112011591A - 一种基于核酸适配体的荧光传感器检测抗生素的方法 - Google Patents

一种基于核酸适配体的荧光传感器检测抗生素的方法 Download PDF

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CN112011591A
CN112011591A CN202010728421.1A CN202010728421A CN112011591A CN 112011591 A CN112011591 A CN 112011591A CN 202010728421 A CN202010728421 A CN 202010728421A CN 112011591 A CN112011591 A CN 112011591A
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ata aac
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黄和
张幸
李昺之
林蕾
李静敏
张立慧
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Nanjing Normal University
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Nanjing Normal University
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract

本发明公开了一种基于核酸适配体荧光传感器检测抗生素的方法，该方法选择可以与抗生素特异性结合的DNA单链作为适配体，并设计多条与适配体配对强度各异的互补链，利用荧光染料与双链DNA的特性结合进行检测。当加入抗生素时，抗生素和适配体互补链竞争与适配体结合，互补链被释放，被随后加入的核酸外切酶I(Exonuclease I)全部剪切。接着，利用双链特异性荧光染料对DNA浓度进行报告检测，得到抗生素浓度与荧光强度的关系并定量分析。本方法优点在于操作简便，所需样品量少，灵敏度高，且具有良好的实用价值，有望应用于医疗、环境、畜牧养殖业中抗生素的检测。

Description

一种基于核酸适配体的荧光传感器检测抗生素的方法
技术领域
本发明涉及生物传感器检测方法，具体为一种基于核酸适配体的荧光传感器检测抗生素的方法。
背景技术
抗生素的生产和使用广泛，据统计仅在中国每年就有约6000吨抗生素用于饲料添加剂，75％的抗生素不被动物机体吸收而随动物粪便排出，导致畜禽养殖废水成为自然界水体环境中抗生素污染的主要来源。抗生素残留对人体健康有着十分严重的危害，包括致癌、致畸、致突变作用、人体对此类药物的长期暴露，通常不会造成急性中毒，而主要是引起慢性中毒。抗生素污染已被视为一类新型的重要的水体污染物而成为国际研究的前沿课题。
磺胺类药物为人工合成的抗菌药，用于临床已近50年，它具有抗菌谱较广、性质稳定、使用简便、生产时不耗用粮食等优点。磺胺间二甲氧嘧啶，常温下为一种白色或类白色结晶或结晶形粉末，几乎无味。不溶于水、氯仿，微溶于乙醇，可溶于丙酮，易溶于稀无机酸和强碱溶液。遇光易变质，色渐变深。磺胺间二甲氧嘧啶是一种长效磺胺原药，其抗菌谱与磺胺嘧啶相似，但抗菌作用较强，适用于菌痢、肠炎、扁桃体炎、泌尿道感染、蜂窝织炎、皮肤化脓感染等疾病，吸入粉尘，皮肤接触和不慎吞咽有害。对眼睛、呼吸道和皮肤有刺激作用。长期服用容易损伤肾功能及神经系统，磺胺药中毒。
现有的抗生素分析检测方法繁琐，依赖HPLC、LC-MS等大型仪器，检测所需时间且灵敏度有待进一步提升，所需样品中抗生素的含量达到一定程度才能检测出，所以需要进一步探索性能更好分析方法。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于提供一种基于核酸适配体的荧光传感器检测抗生素的方法，该方法操作简便，所需样品量少，灵敏度高。
技术方案：本发明所述的基于核酸适配体荧光传感器检测抗生素的方法，将适配体与互补链结合，然后加入抗生素，抗生素和适配体互补链竞争性地与适配体结合，部分互补链被释放，随后加入核酸外切酶I，加入与DNA双链结合的荧光染料，利用加入抗生素前后体系荧光信号的变化，实现对目标物的定量检测。
所述的基于核酸适配体荧光传感器检测抗生素的方法，具体包括如下步骤：
(1)构建荧光适配体传感器：将配好的浓度相同的适配体溶液与互补链溶液混合，加入含有缓冲液和抗菌水的离心管中，振荡均匀；
(2)将步骤(1)中的离心管置于85-95℃振荡仪中振荡5-10min，取下自然冷却后离心并混匀；
(3)加入不同体积或不同浓度的的抗生素溶液，在室温下避光振荡；
(4)加入核酸外切酶I，在室温下避光振荡；
(5)加入荧光染料，在室温下避光振荡10min-20min；
(6)转移至酶标板中，测每个样品的荧光强度。
所述的基于核酸适配体荧光传感器检测抗生素的方法，所述适配体的序列为：
5’-GAG GGC AAC GAG TGT TTA TAG A-3’；
所述互补链的序列为：
C:5′-TCT ATA AAC ACT CGT TGC CCT C-3′
A1:5′-TCT ATA AAC ACT CGT TGC CCT C-3′
A2:5′-TCT ATA AAC ACT TGT TGC CCT C-3′
A3:5′-TCT ATA AAC ACT TTT TGC CCT C-3′
A4:5′-TCT ATA AAC ATA TGT TGC CCT C-3’
A5:5’-TCT ATA AAC ACA TAT TGC CCT C-3’
A6:5’-TCT ATA AAC TTA TGT TGC CCT C-3’
B1:5′-TCT ATA AAC ACT-3′
B2:5′-TCT ATA AAC ACT CG-3′
B3:5′-TCT ATA AAC ACT CGT T-3′
所述的基于核酸适配体荧光传感器检测抗生素的方法，步骤(1)中，适配体及其互补链的总体积范围在10μL～20μL。
所述的基于核酸适配体荧光传感器检测抗生素的方法，步骤(1)中，缓冲液为2×TBSM缓冲液，体积范围在0.5μL～10μL，pH范围在7.0～8.0；抗菌水的体积在40μL～100μL。
所述的基于核酸适配体荧光传感器检测抗生素的方法，步骤(3)中，加入的抗生素为磺胺类。
所述的基于核酸适配体荧光传感器检测抗生素的方法，步骤(3)中，加入不同体积的抗生素溶液，体积梯度的设置范围为0～100μL，在室温下避光振荡1h～2h。
所述的基于核酸适配体荧光传感器检测抗生素的方法，步骤(5)中加入荧光染料的体积为2μL～10μL。
所述的基于核酸适配体荧光传感器检测抗生素的方法，步骤(6)中，荧光检测条件为：测定体系在522-602nm处的荧光强度，激发波长为460-500nm。
有益效果：本发明与现有技术相比，其显著优点是：建立了一个简单、快速、灵敏的检测方法，够快速检测磺胺二甲氧嘧啶钠盐，并且所需的样品量少，只需一点点样品就可以检测。
具体实施方式
实施例1
创建荧光测试的方法
从文献中查阅荧光染料Sybr-green的激发波长和发射波长。由于该数据受到温度及离子强度等因素的影响，需要根据自己的体系进行重新设定。
最终发现创建的Sybr-green与DNA双链结合的方法最有效。Sybr-green的激发波长为482nm，发射光谱的范围为522-602nm，荧光光谱出峰的位置为532nm，即确定了在(482nm,532nm)处扫点的方法。
探索荧光染料与DNA结合的最适比例
材料/试剂：磺胺二甲氧嘧啶钠盐适配体和互补链由生工生物(上海)试剂公司合成；Sybr-green、Tris、MgCl2 .6H2O、20×TBS均购买于生工生物(上海)试剂公司，抗菌水购买于invitrogen生命科技公司。20×TBSM缓冲液由0.081gMgCl2 .6H2O溶于10mL20×TBS缓冲液得到，将20×TBSM稀释10倍即可得到2×TBSM缓冲液。
购买的适配体的序列为：
5’-GAG GGC AAC GAG TGT TTA TAG A-3’；
互补链的序列为：
C:5′-TCT ATA AAC ACT CGT TGC CCT C-3′
A1:5′-TCT ATA AAC ACT CGT TGC CCT C-3′
A2:5′-TCT ATA AAC ACT TGT TGC CCT C-3′
A3:5′-TCT ATA AAC ACT TTT TGC CCT C-3′
A4:5′-TCT ATA AAC ATA TGT TGC CCT C-3’
A5:5’-TCT ATA AAC ACA TAT TGC CCT C-3’
A6:5’-TCT ATA AAC TTA TGT TGC CCT C-3’5
B1:5′-TCT ATA AAC ACT-3′
B2:5′-TCT ATA AAC ACT CG-3′
B3:5′-TCT ATA AAC ACT CGT T-3′
方法：取7个0.2mL的离心管，按照依次加入抗菌水，20×TBSM缓冲溶液，Sul-Apt，Sul-C，探索荧光染料与双链DNA结合的最适比例时，可以先将两条互补的单链混合，将两者的混合液加入离心管中，然后加入荧光染料1/1000的Sybr-green，体积分别为0uL、0.5uL、2uL、5uL、10uL、20uL、30uL。在25℃避光振荡10min。转移至酶标板测7个样品的荧光强度。
结果：1/1000Sybr-green与双链结合的最适体积为5uL。
探索荧光染料与DNA结合的最适时间
由于荧光强度可能受到DNA与荧光染料结合时间的影响，现以两者的结合时间为自变量，探索最合适的结合时间。
方法：在加入荧光染料的10min、15min、30min、45min、60min、90min、120min测定荧光强度。
结果：加入荧光染料最适合的结合时间为10min-30min。
探索不同磺胺二甲氧嘧啶钠盐含量与荧光强度的定性关系
探索不同磺胺二甲氧嘧啶钠盐含量与荧光强度的定性关系，即找出荧光现象明显的适配体的互补链。
方法：控制变量，比较加入磺胺二甲氧嘧啶钠盐与不加时荧光强度的变化，若差距明显，则进一步探究其含量与荧光强度的定量关系。
探索不同磺胺二甲氧嘧啶钠盐含量与荧光强度的定量关系
方法：从A1-A6，B1-B3，或设计的其他互补链中找出现象明显的互补链，改变磺胺二甲氧嘧啶钠盐的浓度或体积，测不同条件下的荧光强度与抗生素浓度的关系。重复测量多次，确保结果的准确性。
结果：互补链的序列为A1和A2时，可以检测到磺胺二甲氧嘧啶钠盐Sul与荧光强度的关系成定量关系，可以高灵敏度检测到样品中磺胺二甲氧嘧啶钠盐的含量，具体结果见表1和表2。
表1.dsDNA与Sul作用(互补链为A1)
Figure BDA0002599736950000051
表2.dsDNA与Sul作用(互补链为A2)
Figure BDA0002599736950000052

Claims (9)

1.一种基于核酸适配体荧光传感器检测抗生素的方法，其特征在于，将适配体与互补链结合，然后加入抗生素，抗生素和适配体互补链竞争性地与适配体结合，部分互补链被释放，随后加入核酸外切酶I，加入与DNA双链结合的荧光染料，利用加入抗生素前后体系荧光信号的变化，实现对目标物的定量检测。
2.根据权利要求1所述的基于核酸适配体荧光传感器检测抗生素的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)构建荧光适配体传感器：将配好的浓度相同的适配体溶液与互补链溶液混合，加入含有缓冲液和抗菌水的离心管中，振荡均匀；
(2)将步骤(1)中的离心管置于85-95℃振荡仪中振荡5-10min，取下自然冷却后离心并混匀；
(3)加入不同体积或不同浓度的的抗生素溶液，在室温下避光振荡；
(4)加入核酸外切酶I，在室温下避光振荡；
(5)加入荧光染料，在室温下避光振荡10min-20min；
(6)转移至酶标板中，测每个样品的荧光强度。
3.根据权利要求1所述的基于核酸适配体荧光传感器检测抗生素的方法，其特征在于，所述适配体的序列为：
5’-GAG GGC AAC GAG TGT TTA TAG A -3’；
所述互补链的序列为：
C:5′-TCT ATA AAC ACT CGT TGC CCT C-3′
A1:5′-TCT ATA AAC ACT CGT TGC CCT C-3′
A2:5′-TCT ATA AAC ACT TGT TGC CCT C-3′
A3:5′-TCT ATA AAC ACT TTT TGC CCT C-3′
A4:5′-TCT ATA AAC ATA TGT TGC CCT C-3’
A5:5’-TCT ATA AAC ACA TAT TGC CCT C-3’
A6:5’-TCT ATA AAC TTA TGT TGC CCT C-3’
B1:5′-TCT ATA AAC ACT-3′
B2:5′-TCT ATA AAC ACT CG-3′
B3:5′-TCT ATA AAC ACT CGT T-3′
4.根据权利要求2所述的基于核酸适配体荧光传感器检测抗生素的方法，其特征在于，步骤(1)中，适配体及其互补链的总体积范围在10μL～20μL。
5.根据权利要求2所述的基于核酸适配体荧光传感器检测抗生素的方法，其特征在于，步骤(1)中，缓冲液为2×TBSM缓冲液，体积范围在0.5μL～10μL，pH范围在7.0～8.0；抗菌水的体积在40μL～100μL。
6.根据权利要求2所述的基于核酸适配体荧光传感器检测抗生素的方法，其特征在于，步骤(3)中，加入的抗生素为磺胺类。
7.根据权利要求2所述的基于核酸适配体荧光传感器检测抗生素的方法，其特征在于，步骤(3)中，加入不同体积的抗生素溶液，体积梯度的设置范围为0～100μL，在室温下避光振荡1h～2h。
8.根据权利要求2所述的基于核酸适配体荧光传感器检测抗生素的方法，其特征在于，步骤(5)中加入荧光染料的体积为2μL～10μL。
9.根据权利要求2所述的基于核酸适配体荧光传感器检测抗生素的方法，其特征在于，步骤(6)中，荧光检测条件为：测定体系在522-602nm处的荧光强度，激发波长为460-500nm。
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