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CN111759823B - 一种高稳定的非囊泡型纳米颗粒及其在治疗微生物感染中的应用 - Google Patents

一种高稳定的非囊泡型纳米颗粒及其在治疗微生物感染中的应用 Download PDF

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CN111759823B CN202010682875.XA CN202010682875A CN111759823B CN 111759823 B CN111759823 B CN 111759823B CN 202010682875 A CN202010682875 A CN 202010682875A CN 111759823 B CN111759823 B CN 111759823B
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Abstract

本发明提供一种由C8‑C28的脂肪酸、表面活性剂以及任选的脂质构成的非囊泡型纳米颗粒。本发明的非囊泡型纳米颗粒针对微生物，包括细菌和真菌具备显著的抗菌活性。本发明的非囊泡型纳米颗粒还具备优异的稳定性，并且不诱导耐药株的产生，从而能够作为优秀的抗菌药物。

Description

一种高稳定的非囊泡型纳米颗粒及其在治疗微生物感染中的 应用
本申请是2015年09月17日提交的，申请号为2015105949830，发明名称为“一种高稳定的非囊泡型纳米颗粒及其在治疗微生物感染中的应用”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及药物领域。具体地说，本发明涉及一种高稳定的、非囊泡型纳米颗粒，以及这种纳米颗粒在治疗微生物感染中的应用。
背景技术
微生物是个体难以用肉眼观察的一切微小生物的统称，包括细菌、真菌以及一些小型的原生生物、显微藻类等在内的一大类生物群体以及病毒。它们个体微小，与人类关系密切，涵盖了有益和有害的众多种类，广泛涉及食品、医药、工农业、环保等诸多领域。
微生物对人类最重要的影响之一是导致传染病的流行。在疾病的预防和治疗方面，人类取得了长足的进展，但是新出现的和再现的微生物感染还是不断发生。一些微生物感染的致病机制并不清楚，从而导致缺乏有效的治疗药物。而大量的广谱抗生素的滥用又造成强大的选择压力，致使许多菌株发生变异，导致耐药性的产生，人类健康受到新的威胁。例如，耐药性结核杆菌的出现使原本已近控制住的结核感染又在世界范围内猖獗起来。
再例如，葡萄球菌，特别是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种引发致命性院内感染以及社区感染的主要原因之一。在近几十年来，金黄色葡萄球菌经历了数波对抗生素的抵抗并现在对整个β内酰胺类的抗生素具有抗药性，包括青霉素类、头孢霉素类和碳青霉烯类抗生素。这些对β内酰胺类抗生素有抗药性的金黄色葡萄球菌也被称为甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)，或者超级细菌。MRSA感染日益增加导致了万古霉素的普遍使用，万古霉素是目前仅有的仍对MRSA有效的抗生素之一。但是万古霉素也只能抑制MRSA却无法根除它们。此外，自从1990年代后期，万古霉素的大量使用导致了耐万古霉素金黄色葡萄球菌株的出现。所有的这些事实都凸显了对开发新型有效治疗MRSA方法的需求的重要性与迫切性。
最近关于新型抗MRSA的药物研究主要包括在已有抗生素基础上合成新药物，开发免疫球蛋白以靶向清除MRSA毒素，及开发一些天然抗菌素，例如阳离子抗菌肽、脂质体和其他内源物。尽管这些新型合成药物取得了不错的临床试验结果，但是它们与已有抗生素具备相似的结构和抗菌机理，因此，在合成类药物被广泛临床使用后不久，MRSA就会对它们产生抗药性。通过注射抗毒球蛋白和抗体片段来被动中和细菌毒素因子可能对改善急性感染是有益的，但是这种方法并不能够抑制或根除细菌本身。而且在长期看来，还是会导致复发性感染。
有些微生物因为感染特定的部位，从而造成药物或者无法到达或者无法起作用。例如在胃部发现的幽门螺旋杆菌(Helicobacter Pylori)是世界上最常见的细菌性病原体，其感染一半以上的世界人口。幽门螺杆菌感染导致多种胃部疾病，包括慢性胃炎、胃溃疡以及胃癌等。
目前，世界上针对幽门螺旋杆菌感染通用的治疗方案为三联疗法，即，两种抗生素(克拉霉素+阿莫西林或甲硝唑)联用一种质子泵抑制剂。然而，由于耐受现有抗生素的幽门螺旋杆菌菌株的快速出现，目前的治疗方案对它们的根除率迅速下降。例如，三联疗法对于幽门螺旋杆菌的清除率已经降至60到75％。其主要原因在于幽门螺旋杆菌菌株对这些抗生素出现耐药性。尤其是对三联疗法中关键成分甲硝唑的耐药性比较明显。在发达国家，该耐药性为40％，发展中国家则为90％。针对这些出现的耐药性，人们开发了不同类型的抗生素，但是结果均不理想。另外，新开发的抗生素及其应用也受困于患者依从性较差、毒副作用高、以及抗生素治疗高昂的成本。很明显，目前临床急需具有卓越治疗效果、更小副作用的新型治疗方案。
还有一些微生物感染虽然一般不产生严重的，例如致命性的后果，但会严重影响人们的生活质量。例如，痤疮感染是一种常见皮肤病，80％的人都会或曾经受其影响。痤疮的起因主要是皮脂过度分泌，导致毛囊堵塞，因而产生局部的低氧或无氧环境，这会刺激痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)迅速繁殖。痤疮丙酸杆菌是一种革兰氏阳性的厌氧性细菌，与痤疮感染密切相关。痤疮丙酸杆菌的过度生长会导致毛囊壁破裂，于是宿主免疫细胞会对入侵的细菌产生反应，导致炎症性痤疮发生。严重发炎的痤疮病变可引起色素沉淀和永久性皮肤疤痕，给人们带来尴尬、压力和自卑感，从而影响他们的心理健康和心理发育。
许多种抗菌药物已经研发出来并批准用于治疗痤疮，包括阿达帕林、他扎罗汀、红霉素、克林达霉素、过氧化苯甲酰(BPO)，及其它的抗生素。尽管这些抗生素类药物有着显著的抗痤疮疗效，但这些药物通常会产生严重的副作用。例如，BPO是最常用的治疗痤疮的皮肤药物之一；但它导致的红斑、鳞屑、皮肤灼烧和毛发变白的发生率很高。口服抗生素虽然也非常有效，但常常伴随着破坏肠道菌群，诱生耐药性痤疮丙酸杆菌等风险。例如，异维A酸是一种治疗特严重型痤疮的维生素A衍生药维甲酸药物，它的使用受到严格的监管。由于其具有强烈致畸作用，因此绝大多数痤疮患者都不能使用该药。因此，新的抗痤疮药物不仅要具有良好的治疗效果，还要具有非常小的毒副作用并且不诱导耐药株产生。
在过去的几十年，纳米技术在药物学中的应用被广泛地探索。通过物理包覆或化学结合，药物可以被装入纳米颗粒，从而相比于游离药物，显著提高了药物的动力学指数和治疗指数。这些基于纳米颗粒的药物输送系统的优点多集中在：提高药物的血清溶解度、延长药物的体循环周期以及持续、可控地释放药物等方面。由于这些纳米颗粒中的药物多为传统的抗生素，仍然会产生耐药株。而且，所使用的纳米颗粒制备过程复杂，成本高，并且稳定性有限，从而严重影响了这类药物的实际应用价值。
因此，本领域急需高效的、不诱导产生耐药株的抵御微生物感染的新型治疗药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效的、不诱导产生耐药株的抵御微生物感染的新型治疗药物。
在第一方面，本发明提供一种非囊泡型纳米颗粒，所述颗粒由脂肪酸、表面活性剂以及任选的脂质构成。
在优选的实施方式中，所述脂肪酸是C8-C28，优选C12-C24，最优选C12-C18的饱和或不饱和脂肪酸。
在优选的实施方式中，所述不饱和脂肪酸含有1-6个，优选1-4个，例如1个、2个或3个不饱和键，优选双键。
在优选的实施方式中，所述脂肪酸包括但不限于：棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚麻酸、亚油酸、月桂酸、肉豆蔻油酸、花生四烯酸、EPA、DHA、辛葵酸和壬酸。
在具体的实施方式中，所述脂肪酸是亚麻酸、月桂酸、肉豆蔻油酸。
在优选的实施方式中，所述表面活性剂包括但不限于以下的一种或多种：硬脂酸钠、4-(5-十二烷基)苯磺酸盐、聚氧乙烯乙二醇、聚山梨酯20、聚山梨酯80、吐温20、吐温80、聚乙二醇辛基苯基醚和Triton X-100。
在优选的实施方式中，所述脂质为磷脂和/或胆固醇。
在优选的实施方式中，所述磷脂包括但不限于以下的一种或多种：磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰基卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、棕榈酰磷脂酰甘油和二油磷脂酰乙醇胺。
在优选的实施方式中，所述脂质和表面活性剂的质量比为10～0:1；优选5～0:1；更优选2.5～0:1。
在优选的实施方式中，所述脂肪酸的浓度为0.001～5％w/v；优选0.1～5％w/v；更优选0.2～4％w/v；更优选0.3～3％w/v。
在具体的实施方式中，所述的纳米颗粒的粒径为1-90nm；优选2-80nm；更优选5-50nm；更优选5-20nm；最优选5-15nm。
在优选的实施方式中，制得的纳米颗粒的粒径可以为1-30nm；10-40nm；20-50nm；30-60nm；40-70nm；50-80nm；60-90nm；或者，所述纳米颗粒的粒径可以为5-25nm；15-35nm；25-45nm；35-55nm；45-65nm；55-75nm；65-85nm或者，所述纳米颗粒的粒径可以为10-30nm；20-40nm；30-50nm；40-60nm；50-70nm；60-80nm；70-90nm。
在具体的实施方式中，所述纳米颗粒的多分散性系数为<0.3；优选<0.2。
在优选的实施方式中，所述纳米颗粒的粒径处于较窄的范围内，例如约5-10nm、约15-25nm、约20-30nm、约40-50nm、约65-75nm、约80-90nm或约100-110nm。
在具体的实施方式中，所述非囊泡型纳米颗粒的稳定性为：
在室温～37℃下储存3个月后，与新鲜制备的纳米颗粒相比，所述纳米颗粒的“最小抑菌浓度”与“最小杀菌浓度”值的改变小于20％；优选小于10％；或者，
在室温下储存3个月后，与新鲜制备的纳米颗粒相比，所述纳米颗粒的粒径改变小于20％；优选小于15％；更优选小于10％。
在具体的实施方式中，所述纳米颗粒由以下方法制备，所述方法包括：
1).将表面活性剂和任选的脂质悬浮在水中；
2).搅拌1)得到的悬浮液直至形成均相悬浮液；
3).加热2)得到的均相悬浮液到其所含表面活性剂和任选的脂质的熔点以上；
4).将脂肪酸加入3)得到的热悬浮液中并搅拌；
5).降温，静置4)得到的悬浮液，从而得到本发明的非囊泡型纳米颗粒悬浮液。
在具体的实施方式中，本发明的纳米颗粒用于制备抗微生物感染的试剂，或可用于治疗微生物感染。
所述微生物包括：细菌、真菌；所述细菌包括：革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌；所述革兰氏阳性菌包括：葡萄球菌(Staphylococcus)；优选金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)；更优选甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcusaureus)；丙酸杆菌(Propionibacterium)；优选费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudennreichii)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、卵白丙酸杆菌(Propionibacterium avidum)、颗粒丙酸杆菌(Propionibacterium granulosum)；更优选痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)；和
所述革兰氏阴性菌包括：幽门螺旋杆菌(Helicobacter Pylori)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)；优选幽门螺旋杆菌；
所述真菌包括：白色念珠菌(Canidia albicans)、红色毛癣菌(Trichophytonrubrum)、黄癣菌(Mycelium yellow ringworm)。
在第二方面，本发明提供本发明第一方面所述的非囊泡型纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
1).将表面活性剂和任选的脂质悬浮在水中；
2).搅拌1)得到的悬浮液直至形成均相悬浮液；
3).加热2)得到的均相悬浮液到其所含表面活性剂和任选的脂质的熔点以上；
4).将脂肪酸加入3)得到的热悬浮液中并搅拌；
5).降温，静置4)得到的悬浮液，从而得到权利要求1-5中任一项所述的非囊泡型纳米颗粒。
在优选的实施方式中，所述方法中的熔点温度为20℃-80℃，例如20℃，30℃，40℃、50℃、60℃、70℃或80℃。
在优选的实施方式中，所述方法还可包括检测所得纳米颗粒的流体动力学尺寸。
在优选的实施方式中，所述脂肪酸是C8-C28，优选C12-C24，最优选C12-C18的饱和或不饱和脂肪酸。
在优选的实施方式中，所述不饱和脂肪酸是含有一个或多个，优选1-4个双键的脂肪酸。
在优选的实施方式中，所述脂肪酸包括但不限于：棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚麻酸、亚油酸、月桂酸、肉豆蔻油酸、花生四烯酸、EPA、DHA、辛葵酸和壬酸。
在优选的实施方式中，所述表面活性剂包括但不限于以下的一种或多种：硬脂酸钠、4-(5-十二烷基)苯磺酸盐、聚氧乙烯乙二醇、聚山梨酯20、聚山梨酯80、吐温20、吐温80、聚乙二醇辛基苯基醚和Triton X-100。
在优选的实施方式中，所述脂质为磷脂和/或胆固醇。
在优选的实施方式中，所述磷脂包括但不限于以下的一种或多种：磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰基卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、棕榈酰磷脂酰甘油和二油磷脂酰乙醇胺。
在优选的实施方式中，所述脂质和表面活性剂的质量比为10～0:1；优选5～0:1；更优选2.5～0:1。
在优选的实施方式中，所述脂肪酸的浓度为0.001～5％w/v；优选0.1～5％w/v；更优选0.2～4％w/v；更优选0.3～3％w/v。
在优选的实施方式中，制得的纳米颗粒的粒径为1-90nm；优选2-80nm；更优选5-50nm；更优选5-20nm；最优选5-15nm。
在优选的实施方式中，制得的纳米颗粒的粒径可以为1-30nm；10-40nm；20-50nm；30-60nm；40-70nm；50-80nm；60-90nm；或者，所述纳米颗粒的粒径可以为5-25nm；15-35nm；25-45nm；35-55nm；45-65nm；55-75nm；65-85nm或者，所述纳米颗粒的粒径可以为10-30nm；20-40nm；30-50nm；40-60nm；50-70nm；60-80nm；70-90nm。
在优选的实施方式中，所述纳米颗粒的多分散性系数为<0.3；优选<0.2。
在优选的实施方式中，所述纳米颗粒的粒径处于较窄的范围内，例如约5-10nm、约15-25nm、约20-30nm、约40-50nm、约65-75nm、约80-90nm或约100-110nm。
在优选的实施方式中，所述非囊泡型纳米颗粒的稳定性为：
在室温～37℃下储存3个月后，与新鲜制备的纳米颗粒相比，所述纳米颗粒的“最小抑菌浓度”与“最小杀菌浓度”值的改变小于20％；优选小于10％；或者，
在室温下储存3个月后，与新鲜制备的纳米颗粒相比，所述纳米颗粒的粒径改变小于20％；优选小于15％；更优选小于10％。
在第三方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本发明第一方面所述的非囊泡型纳米颗粒以及任选的药学上可接受的载体。
在优选的实施方式中，所述药物组合物的剂型包括但不限于：适合全身性给药的剂型、或外用或局部给药的剂型；
进一步地，所述剂型包括但不限于：片剂、溶液剂、混悬液、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、注射剂、贴剂、喷剂、软膏剂、油膏剂、乳膏剂、凝胶剂、霜剂、滴剂、喷雾剂、洗剂；
优选外用或局部给药的剂型，包括但不限于：贴剂、喷剂、软膏剂、油膏剂、乳膏剂、凝胶剂、霜剂、滴剂、喷雾剂、洗剂。
在优选的实施方式中，所述药学上可接受的载体包括但不限于：水；生理盐水；结合剂(例如聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填料(例如乳糖和其它糖类、明胶或硫酸钙)；润滑剂(例如淀粉、聚乙二醇或乙酸钠)；崩解剂(例如淀粉或羟基乙酸淀粉钠)；以及润湿剂(例如月桂基硫酸钠)。
在优选的实施方式中，所述药物组合物还可含有穿透促进剂；所述穿透促进剂包括但不限于：表面活性剂(例如十二烷基硫酸钠、聚氧乙烯-9-月桂基醚和聚氧乙烯-20-十六烷基醚)；胆汁酸盐(例如胆酸、脱氢胆酸和脱氧胆酸)；螯合剂(例如乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸和水杨酸盐)；以及非螯合性非表面活性剂(例如不饱和环脲)。
在具体的实施方式中，所述药物组合物还可包含其它抗生素。
在优选的实施方式中，所述抗生素是治疗葡萄球菌，优选金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)；更优选甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)感染的抗生素，包括但不限于：万古霉素、头孢菌素、利奈唑胺、替考拉宁、阿贝卡星、奎宁始霉素、达福普汀、喹努普丁、克林霉素、达托霉素、利福平、替拉万星、四环素类如替加环素等药物；或者，
所述抗生素是治疗痤疮丙酸杆菌感染的抗生素，包括但不限于：阿达帕林、他扎罗汀、红霉素、克林达霉素、阿奇霉素、米诺环素、罗红霉素、异维A酸和过氧化苯甲酰(BPO)；
或者，所述抗生素是治疗幽门螺旋杆菌(Helicobacter Pylori)感染的抗生素，包括但不限于：克拉霉素、阿莫西林、甲硝唑、替硝唑、呋喃唑酮、四环素等药物；
或者，所述抗生素还可以是喹诺酮类、β-内酰胺类、大环内酯类、氨基糖甙类、酰胺醇类、硝基咪唑类等。
在具体的实施方式中，所述药物组合物是水性药物组合物。
在第四方面，本发明提供本发明第一方面所述的纳米颗粒或本发明第三方面所述的药物组合物在制备抗微生物试剂中的用途。
在具体的实施方式中，所述微生物包括：细菌、真菌。
在具体的实施方式中，所述细菌包括：革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌。
在具体的实施方式中，所述革兰氏阳性菌包括：葡萄球菌(Staphylococcus)；优选金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)；更优选甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)；丙酸杆菌(Propionibacterium)；优选费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudennreichii)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、卵白丙酸杆菌(Propionibacterium avidum)、颗粒丙酸杆菌(Propionibacterium granulosum)；更优选痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)；和
所述革兰氏阴性菌包括：幽门螺旋杆菌(Helicobacter Pylori)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)；优选幽门螺旋杆菌。
在具体的实施方式中，所述真菌包括：白色念珠菌(Canidia albicans)、红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)、黄癣菌(Mycelium yellow ringworm)。
在第五方面，本发明提供一种治疗方法，所述治疗方法包括将本发明第一方面所述的纳米颗粒给予对象以治疗微生物感染。
本发明还提供一种治疗方法，所述治疗方法包括将本发明第一方面所述的纳米颗粒与其它抗生素联合给予对象以治疗微生物感染。
在优选的实施方式中，所述抗生素是治疗葡萄球菌，优选金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)；更优选甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)感染的抗生素，包括但不限于：万古霉素、头孢菌素、利奈唑胺、替考拉宁、阿贝卡星、奎宁始霉素、达福普汀、喹努普丁、克林霉素、达托霉素、利福平、替拉万星、四环素类如替加环素等药物；
所述抗生素是治疗丙酸杆菌，例如痤疮丙酸杆菌、卵白丙酸杆菌、颗粒丙酸杆菌，优选痤疮丙酸杆菌感染的抗生素，包括但不限于：阿达帕林、他扎罗汀、红霉素、克林达霉素、阿奇霉素、米诺环素、罗红霉素、异维A酸和过氧化苯甲酰(BPO)；
所述抗生素是治疗幽门螺旋杆菌感染的抗生素，包括但不限于：克拉霉素、阿莫西林、甲硝唑、替硝唑、呋喃唑酮、四环素等药物；
所述抗生素是治疗绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)感染的抗生素，包括但不限于：哌拉西林、阿洛西林、头孢曲松、头孢哌酮舒巴坦、阿米卡星、庆大霉素、多粘霉素B等；
所述抗生素是治疗白色念珠菌(Canidia albicans)感染的抗生素，包括但不限于：咪康唑、伊曲康唑、氟康唑、克霉唑、制霉菌素、两性霉素B等。
在优选的实施方式中，所述纳米颗粒与其它抗生素利用相同或不同的给药途径，在相同或不同的给药时间给予。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1是一组本发明纳米颗粒的照片；其中：图A显示亚麻酸(linolenic acid)浓度从(a)0.1％w/v到(h)中的4％w/v(其中％w/v等于wt％)；图B显示月桂酸(lauric acid)浓度从(a)0.1％w/v至(f)5％w/v；图C显示肉豆蔻油酸(myristoleic acid)浓度从(a)0.1％w/v到(h)中的4％w/v。根据这些样品的聚集度和澄清度等物理性质，可以确定理想的纳米颗粒剂型。
图2显示了通过动态光散射法检测含不同浓度的肉豆蔻油酸的本发明纳米颗粒的(A)流体动力学尺寸(直径，nm)和(B)多分散性(PDI)。
图3显示了含1％w/v亚麻酸的本发明纳米颗粒的长期稳定性，通过在3个月的时间跨度中检测它们的流体动力学直径。在这个时间跨度中，这些纳米颗粒被分别保存在4℃、25℃和37℃，直径却增长不到2nm。
图4显示了不同温度下含有1％w/v月桂酸的本发明纳米颗粒的流体动力学直径(nm)，在较大范围的温度下(-40℃至+100℃)，纳米颗粒的尺寸保持稳定状态。
图5显示了20℃条件下含有1％w/v月桂酸的本发明纳米颗粒的存储稳定性，在5个月的检测期内，纳米颗粒的尺寸保持稳定状态。
图6显示了含0.3％w/v肉豆蔻油酸的本发明纳米颗粒的悬浮液分别在-20℃、4℃、25℃和37℃保存3个月，直径增加不到2nm。
图7显示了含1％w/v亚麻酸的本发明纳米颗粒对MRSA252的体外最小抑菌浓度(MIC)。不同浓度的纳米颗粒在与MRSA252(1*106CFU/mL)(CFU：菌落形成单位)一起培育，分别在5小时和24小时测量细菌在OD600下的吸收度。结果表明本发明纳米颗粒在浓度高于0.1％w/v或更高的情况下能够抑制细菌的生长。5小时和24小时细菌和本发明纳米颗粒混合悬浮液的图片显示0.1％w/v纳米颗粒的溶液清澈透明，表明0.1％w/v是本发明纳米颗粒的MIC。
图8显示了含有1％w/v月桂酸的本发明纳米颗粒对痤疮丙酸杆菌的体外最小抑菌浓度(MIC)，其中图(b)是图(a)的放大图
图9显示了含0.3％w/v肉豆蔻油酸的本发明纳米颗粒对幽门螺旋杆菌(悉尼菌株1，HPSS1)的体外最小抑菌浓度(MIC)。不同浓度的本发明纳米颗粒在与HPSS1(5*106CFU/mL)(CFU：菌落形成单位)一起培育18小时，测量细菌在OD600下的吸收度。结果表明本发明纳米颗粒在浓度大于或等于0.0015％w/v时能够有效抑制细菌的生长。表明0.0015％w/v是本发明纳米颗粒的MIC。
图10显示了含1％w/v亚麻酸的本发明纳米颗粒对MRSA252的体外最小杀菌浓度(MBC)。不同浓度的本发明纳米颗粒与MRSA252(1*106CFU/mL)共同培育了24小时，然后5μL的悬浮液在37℃下隔夜培育并在TSB琼脂板上被观察。MRSA252的CFU值得以量化。(A)图像显示不同浓度的本发明纳米颗粒和MRSA252在琼脂板上共育24小时后观察到的MRSA252的CFU；(B)结果表明0.2％w/v的本发明纳米颗粒杀死了99.9％的MRSA252。此外细菌在本发明纳米颗粒的浓度到达0.4％w/v或者更高时被全部杀死。
图11显示的是本发明纳米颗粒(1％w/v月桂酸)对不同浓度的痤疮丙酸杆菌的抗菌活性曲线图：(a)1x106CFU/mL，(b)1x107CFU/mL，(c)1x108CFU/mL和(d)1x109CFU/mL。本发明纳米颗粒与每个浓度的菌样品共孵育5小时。之后，样品用PBS稀释，稀释倍数为1:10至1:106，每个样品取10μL接种到RCM琼脂平板上。然后在37℃厌氧条件下培养3天，计数痤疮丙酸杆菌的菌落形成单位(CFU)(UD：检测不到)。
图12显示本发明纳米颗粒(1％w/v月桂酸)对1x107CFU/mL痤疮丙酸杆菌的抗菌活性与时间的关系图。孵育5小时之后，痤疮丙酸杆菌完全被杀死(UD：检测不到)。
图13显示经过5小时孵育后，本发明纳米颗粒(1％w/v月桂酸)对1x107CFU/mL痤疮丙酸杆菌的抗菌活性与温度的关系图。结果显示，在室温(20℃)或更高温度下，痤疮丙酸杆菌完全被杀死(UD：检测不到)。
图14显示了含有1％w/v月桂酸的本发明纳米颗粒对痤疮丙酸杆菌的体外最小杀菌浓度(MBC)，其中图(b)是图(a)的放大图。
图15显示了含0.3％w/v肉豆蔻油酸的本发明纳米颗粒对HPSS1的体外最小杀菌浓度(MBC)。不同浓度的TNAN-3与HPSS1(5*106CFU/mL)共同培育了18小时，然后5μL的悬浮液在37℃下隔夜培育。HPSS1的CFU值得以量化。(A)图像显示不同浓度的本发明纳米颗粒和HPSS1在琼脂板上共育18小时后观察到的HPSS1的CFU。(B)结果表明0.0015％w/v的本发明纳米颗粒杀死了99.9％的HPSS1。此外细菌在本发明纳米颗粒浓度达到0.003％w/v或者更高时被全部杀死。
图16显示了MRSA252在含1％w/v亚麻酸的本发明纳米颗粒处理前的形态(A)和处理后的形态(B)。在(B)中，细菌与本发明纳米颗粒培育了24小时后成像。在所有的实验中，细菌的初始浓度都是1*106CFU/mL。图片中的比例尺为1μm。
图17显示扫描电镜(SEM)图片：(a)未处理的痤疮丙酸杆菌，(b)含有1％w/v月桂酸的本发明纳米颗粒处理的痤疮丙酸杆菌。电镜观察到本发明纳米颗粒处理后痤疮丙酸杆菌的菌膜受到了破坏。
图18显示了HPSS1在含0.3％w/v肉豆蔻油酸的本发明纳米颗粒处理前(A)和(B)处理后的形态。在(B)中，细菌与0.003％w/v的本发明纳米颗粒培育18小时后成像。在所有的实验中，细菌的初始浓度都是2.5*106CFU/mL。图片中的比例尺为1μm。
图19显示了含1％w/v亚麻酸的本发明纳米颗粒的长期抗菌活性。本发明纳米颗粒在室温下保存两个月后和新鲜制备的本发明纳米颗粒显示出了相似的MIC与MBC值。储存3个月后的样本MIC略微提高到0.2％w/v，而MBC值则与之前一致。
图20显示在不同温度下存储5个月的本发明纳米颗粒(1％w/v月桂酸)对1x107CFU/mL痤疮丙酸杆菌的抗菌活性。在37℃存储条件下，痤疮丙酸杆菌完全被杀死(UD：检测不到)。
图21显示了含0.3％w/v肉豆蔻油酸的本发明纳米颗粒的长期抗菌活性。所述纳米颗粒以悬浮液形式在室温下保存3个月后显示与新鲜制备的纳米颗粒相似的MIC和MBC值。
图22显示了含0.3％w/v肉豆蔻油酸的本发明纳米颗粒的长期抗菌活性。所述纳米颗粒以冻干的形式在-20℃保存3个月后显示与新鲜制备的纳米颗粒相似的MIC与MBC值。
图23显示了含1％w/v亚麻酸的本发明纳米颗粒对MRSA252的体内抗菌活性。小鼠被感染了1*107CFU的MRSA252。然后含有本发明纳米颗粒的凝胶每天使用一次，连续5天。载菌量在MRSA252接种5天后，小鼠身上的感染皮肤被取下来，均化并在琼脂板上培育，以记录细菌CFU。数据表明了六个单独实验的平均值±标准差。*代表了p值的显著性(**p<0.01)
图24显示了含1％w/v亚麻酸的本发明纳米颗粒对MRSA252皮下感染的小鼠的体内抗菌活性。试验中小鼠被皮下注入了1*106CFU的MRSA252，随后在相同位置20分钟后又注射了本发明纳米颗粒。图片显示了注射处在MRSA注射24、48和72小时后，损伤部位的情况。
图25显示了含1％w/v亚麻酸的本发明纳米颗粒外用凝胶剂型的7天体内毒性研究。用Draize打分系统表明本发明纳米颗粒剂型的使用没有产生明显的水肿或红斑。图像是每组5只小鼠的代表。
图26显示了H&E(左列)和TUNEL(右列)的评价结果以评估含1％w/v亚麻酸的本发明纳米颗粒的体内毒性。空白的PBS凝胶被用作阴性对照组。本发明纳米颗粒剂型没有产生炎症和没有明显的细胞死亡。图像是每组5只小鼠的代表。
图27显示了巨噬细胞对皮肤浸润的评价结果-评估含1％w/v亚麻酸的本发明纳米颗粒的使用安全性。皮肤的冰冻切片制备出来后，用DAPI给细胞核染色，用FITC-抗小鼠f4/80抗体给皮肤巨噬细胞染色。染色过后，皮肤样本立即使用Nikon Delta Macroview荧光显微镜成像。图像是每组5只小鼠的代表。图片中的比例尺为400μm。
图28显示用小鼠耳朵模型测试本发明纳米颗粒(1％w/v月桂酸)在活体内对痤疮丙酸杆菌的抗菌活性。ICR小鼠的耳朵(左耳和右耳)经皮内注射了痤疮丙酸杆菌(1x107CFU，混于20μL的PBS中)。痤疮丙酸杆菌注射部位再分别注射本发明纳米颗粒(1wt％月桂酸)或PBS。注射24小时后，取出被细菌感染的皮肤组织进行细菌计数。(a)注射后24小时，注射部位的组织损伤。(b)注射后24小时，注射部位的微生物负载(UD：检测不到)。
图29显示本发明纳米颗粒(1％w/v月桂酸)对小鼠背部皮肤的毒性测试结果。凝胶形式的本发明纳米颗粒贴在小鼠剃毛的背部皮肤上。24小时后取下凝胶，对皮肤进行分析。本发明纳米颗粒处理过的皮肤保持了正常结构，未观察到红斑或水肿。苏木精&伊红染色(H&E)结果显示本发明纳米颗粒处理过的皮肤结构完好，真皮层上带有一层健康的表皮细胞。使用本发明纳米颗粒处理的观察结果与使用PBS处理的结果相同，表明本发明纳米颗粒不会对皮肤造成可检测到的毒性。
图30显示98名痤疮志愿者使用本发明纳米颗粒凝胶后的反馈结果。在第3天、第7天和第21天分别采集反馈结果。
图31显示了含1％w/v亚麻酸的本发明纳米颗粒的尺寸分布曲线。
图32显示了本发明纳米颗粒(1％w/v月桂酸)的尺寸分布曲线。
图33显示了本发明纳米颗粒的结构示意图。
图34对比了含1％w/v亚麻酸的本发明纳米颗粒与游离脂肪酸在水性环境中的最小杀菌浓度。
图35对比了本发明纳米颗粒(1％w/v月桂酸)与游离脂肪酸在水性环境中的最小杀菌浓度。
图36显示在PBS缓冲液中，游离的肉豆蔻油酸不能表现出抗幽门螺旋杆菌的活性，但是以本发明纳米颗粒形式存在的肉豆蔻油酸表现出抗幽门螺旋杆菌的活性。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现将脂肪酸、表面活性剂以及任选的脂质制成的非囊泡型纳米颗粒(胶束纳米颗粒结构)不仅具备显著的抗菌活性，还能具备优异的稳定性，并且本发明的非囊泡型纳米颗粒不诱导耐药株的产生，从而能够作为优秀的抗菌药物。在此基础上完成了本发明。
脂肪酸
本文所用的术语“脂肪酸”具有本领域技术人员常规理解的含义；即，所述脂肪酸是由一个疏水的碳氢链和亲水的羧酸头基组成的两亲性分子。
本领域技术人员已知某些脂肪酸具备一定的抗微生物的能力，但脂肪酸本身的特殊性质，例如不溶于水的特性，使得脂肪酸无法直接作为药物应用，或者需要利用有机溶剂进行给药。例如，月桂酸是存在于人的皮脂中的一种游离脂肪酸，其抗菌活性强于过氧化苯甲酰。但其水溶性较差，因此必须用二甲亚砜(DMSO)等溶剂来溶解月桂酸以形成外用剂型，而DMSO具有刺激性和毒性副作用。因此，在现有技术中，将脂肪酸用作药物存在诸多限制。
相比于现有技术，本发明能够在不利用有机溶剂的条件下递送脂肪酸从而产生抗微生物感染的作用，打破了脂肪酸在作为药物应用中的限制，可以利用大量在现有技术中难以用作药物的脂肪酸。适用于本发明的脂肪酸是C8-C28，优选C12-C24，更优选C12-C18的饱和或不饱和脂肪酸。在优选的实施方式中，所述不饱和脂肪酸含有1-6个，优选1-4个，例如，1、2、3或4个不饱和键，优选双键。在具体的实施方式中，适用于本发明的脂肪酸包括但不限于：棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚麻酸、亚油酸、月桂酸、肉豆蔻油酸、花生四烯酸、EPA、DHA、辛葵酸和壬酸。在进一步优选的实施方式中，适用于本发明的脂肪酸包括但不限于：亚麻酸、月桂酸、肉豆蔻油酸。鉴于本发明的教导，本领域技术人员应理解，本文所述的“脂肪酸”包含脂肪酸的酸、盐和酯三种形式。
非囊泡型纳米颗粒
本文所用的术语，“纳米颗粒”、“本发明纳米颗粒”、“非囊泡型纳米颗粒”以及“本发明的非囊泡型纳米颗粒”具备相同的含义，均是指不具有囊泡型式的纳米颗粒。具体地说，本发明的非囊泡型纳米颗粒是相对于其它的具有空腔结构的纳米颗粒而言的，即，本发明的非囊泡型纳米颗粒是其中不具备空腔的纳米颗粒。此外，基于下文所述的本发明纳米颗粒的制备方法，本领域技术人员可以理解，本发明的纳米颗粒是一种纳米颗粒体系，即，处于水性体系中的纳米颗粒，或包含纳米颗粒的水性体系整体；换言之，本发明所述的纳米颗粒是一种纳米颗粒的水性体系，即，一种不含有机溶剂的纳米颗粒体系。
本发明提供的非囊泡型纳米颗粒由脂肪酸、表面活性剂以及任选的脂质构成。这些组成成分的分子都具有亲水的部分和一个伸长的碳氢链构成的疏水部分。例如，脂肪酸是由一个疏水的碳氢链和亲水的羧酸头基组成的两亲性分子，这种结构使得脂肪酸能够纳入纳米胶束这样具有两亲性环境的纳米颗粒中。在水的存在下，它们的亲水部分和表面活性剂排列形成一个面对着水的表面，与此同时疏水部分排列形成一个远离水的核心，从而形成了胶束的纳米结构(如图30所示)。
本发明的非囊泡型纳米颗粒包含的脂质可以是磷脂和/或胆固醇。在具体的实施方式中，所述脂质为磷脂，包括但不限于以下的一种或多种：磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰基卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、棕榈酰磷脂酰甘油和二油磷脂酰乙醇胺。
适用于本发明的表面活性剂包括但不限于以下的一种或多种：硬脂酸钠、4-(5-十二烷基)苯磺酸盐、聚氧乙烯乙二醇、聚山梨酯20、聚山梨酯80、吐温20、吐温80、聚乙二醇辛基苯基醚和Triton X-100。
在具体的实施方式中，本发明的纳米颗粒的赋形剂材料可以包含磷脂酰胆碱、胆固醇、卵磷脂、吐温20、吐温80和十二烷基硫酸钠。
在本发明的非囊泡型纳米颗粒中，脂质和表面活性剂的配比可以为10～0:1；优选5～0:1；更优选2.5～0:1。
本发明的非囊泡型纳米颗粒成分包含适量的脂肪酸。在具体的实施方式中，所述脂肪酸的浓度为0.001～5％w/v；优选0.1～5％w/v；更优选0.2～4％w/v；更优选0.3～3％w/v。在优选的实施方式中，本发明的纳米颗粒中可以包含1.0％w/v的亚麻酸或月桂酸，或0.3％w/v的肉豆蔻油酸。本领域技术人员应理解，本文所述的脂肪酸的浓度是指该脂肪酸在包含本发明纳米颗粒的体系，特别是水性体系，例如水性悬浮液的浓度。
本发明的非囊泡型纳米颗粒具备一系列的理化特征，例如纳米颗粒的直径和亚麻酸的浓度(即，亚麻酸在整个纳米颗粒悬浮液中的质量百分比)。纳米颗粒的直径可以采用动态光散射法来测量。本发明的非囊泡型纳米颗粒的平均直径约为1至90nm；优选2-80nm；更优选5-50nm；更优选5-20nm；最优选5-15nm。
在其它实施方式中，所述纳米颗粒的粒径可以为1-30nm；10-40nm；20-50nm；30-60nm；40-70nm；50-80nm；60-90nm；或者，所述纳米颗粒的粒径可以为5-25nm；15-35nm；25-45nm；35-55nm；45-65nm；55-75nm；65-85nm或者，所述纳米颗粒的粒径可以为10-30nm；20-40nm；30-50nm；40-60nm；50-70nm；60-80nm；70-90nm。
本发明的非囊泡型纳米颗粒的粒径分布均一，其多分散性系数为<0.3；优选<0.2。在优选的实施方式中，所述纳米颗粒的粒径处于较窄的范围内，例如约5-10nm、约15-25nm、约20-30nm、约40-50nm、约65-75nm、约80-90nm或约100-110nm。
本发明的非囊泡型纳米颗粒具备优异的稳定性。在具体的实施方式中，在各种温度下储存3个月后，与新鲜制备的纳米颗粒相比，本发明纳米颗粒的“最小抑菌浓度”与“最小杀菌浓度”值的改变小于20％；优选小于10％。在另一实施方式中，在室温下储存3个月后，与新鲜制备的纳米颗粒相比，本发明纳米颗粒的粒径改变小于20％；优选小于15％；更优选小于10％。
本发明的非囊泡型纳米颗粒具备优异的抗微生物感染的活性。在具体的实施方式中，本发明的纳米颗粒能够抑制或杀灭细菌或真菌。
在具体的实施方式中，所述细菌包括但不限于：革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌；
所述革兰氏阳性菌包括但不限于：葡萄球菌(Staphylococcus)；优选金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)；更优选甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)；丙酸杆菌(Propionibacterium)；优选费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudennreichii)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、卵白丙酸杆菌(Propionibacterium avidum)、颗粒丙酸杆菌(Propionibacteriumgranulosum)；更优选痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)；
所述革兰氏阴性菌包括但不限于：幽门螺旋杆菌(Helicobacter Pylori)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)。
在另一具体的实施方式中，所述真菌包括但不限于：白色念珠菌(Canidiaalbicans)、红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)、黄癣菌(Mycelium yellow ringworm)。
在具体的实施方式中，本发明的纳米颗粒针对1×106CFU的MRSA最小抑菌浓度(MIC)为0.1％w/v，最小杀菌浓度(MBC)为0.2％w/v；在另一具体的实施方式中，本发明的纳米颗粒针对痤疮丙酸杆菌的最小抑菌浓度(MIC)为0.0125％w/v，最小杀菌浓度(MBC)为0.02％w/v；在还有另一具体的实施方式中，本发明的纳米颗粒针对5×106CFU的幽门螺旋杆菌的最小抑菌浓度(MIC)为0.0015％w/v，最小杀菌浓度(MBC)也为0.0015％w/v。
本发明的纳米颗粒抑制微生物的能力可以如下测定。例如，将待测微生物与本发明的纳米颗粒在体外培养基中共孵育，或者在动物模型中共孵育。然后测量微生物的菌落数(表征为CFU)。本文使用的术语“抑制生长”指本发明的纳米颗粒与某种微生物共育时抑制CFU增长的能力。因此，当某种微生物与本发明的纳米颗粒接触时，其CFU不会变化或者会下降。
本文使用的术语“最小抑菌浓度”(MIC)是指能够抑制微生物，例如某种细菌，例如金黄色葡萄球菌生长的药物，例如本发明纳米颗粒的最小浓度。MIC值可以通过测量该微生物在接触各种浓度的本发明纳米颗粒后的光密度来确定，尤其是比较OD600值是否发生变化。经过一段时间后，如果OD600并未升高，则表明培养液中的细菌数量没有升高。
本文使用的术语“最小杀菌浓度”(MBC)是指能够杀死微生物细胞的药物，例如本发明纳米颗粒的最低浓度。MBC可以通过，例如计数某种特定条件下(例如37℃)与不同浓度的本发明颗粒共育的培养基上的菌落生长情况来测定。
本文所用的术语“约”是指所引用的实际数字或数值，以及在所引用数字或数值的上下10％范围内。
本发明的非囊泡型纳米颗粒的制备方法
本发明的非囊泡型纳米颗粒可采用以下方法制备，包括以下步骤：
1).将表面活性剂和任选的脂质悬浮在水中；
2).搅拌1)得到的悬浮液直至形成均相悬浮液；
3).加热2)得到的均相悬浮液到其所含表面活性剂和任选的脂质的熔点以上；
4).将脂肪酸加入3)得到的热悬浮液中并搅拌；
5).降温，静置4)得到的悬浮液，从而得到本发明的非囊泡型纳米颗粒悬浮液。
在具体的实施方式中，所述方法中的熔点温度为20℃-80℃，例如20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃或80℃。
在进一步的实施方式中，所述方法还可包括检测所得纳米颗粒的流体动力学尺寸。
本发明的非囊泡型纳米颗粒的制备需要考虑如下参数，例如原材料和将被包含进纳米颗粒里的材料的物理化学性质，用来分散纳米颗粒的介质的性质，被载物质的有效浓度和他的潜在毒性，应用/运送纳米颗粒所涉及的加工过程，最适尺寸，多聚分散性和保质期，批次重现性和大规模生产安全且高效产品的可能性。
本发明的纳米颗粒的制备并不是自发形成的，当有足够的能量提供给水中的脂肪酸，例如亚麻酸和赋形剂材料时才能形成(例如通过超声处理、均化、振动或加热)。
本发明的纳米颗粒可以通过多种本发明所提供的成分和方法制备。适用于本发明纳米颗粒的其它制备方法包括搅拌法和加热法，包括高速搅拌。这种技术的优点在于设备简单，生产容易。
在有些实施方式中，所述纳米颗粒可以通过高压匀浆法形成。高压匀浆法广泛用于多种行业，被认为是最可行的工业应用方法。这项技术包含了在高于或低于室温下制备固态脂质纳米颗粒，气蚀和涡流作用可使颗粒尺寸减小。使用热高压匀浆法可使脂质体和药物融化，并在同等温度下与表面活性剂水溶液组合。热的预乳浊液再在控温的高压匀浆机中进行加工，一般要在500bar的条件下进行最多3个循环。所获得的纳米乳浊液在冷却至室温后重结晶，形成固态脂质体纳米颗粒。冷高压匀浆法可用于加工亲水性药物。
除了上述方法以外，其它任何用于制备固态脂质体纳米颗粒的方法都可以用来生产本发明的纳米颗粒。此类方法包括微乳液法、乳化-溶剂挥发法、乳化溶剂扩散法、溶剂注入法和倒相法。
本发明的制备方法得到的纳米颗粒在结构和生物学活性上具备优异的稳定性；本发明的制备方法对脂肪酸的利用率也非常充分。
药物组合物及其使用方法
本发明的纳米颗粒可以制成药物组合物以便用于人和其它哺乳动物。使用的时候可以与其它药物载体或稀释剂混合在一起，并根据哺乳动物病情的特征和严重性来确定给药的剂量和周期。通常情况下，本发明纳米颗粒中的脂肪酸，应能达到药学有效剂量；例如，能够有效减少哺乳动物，例如人感染的微生物，例如金黄色葡萄球菌数量的剂量。
制剂和给药方法都是本行业有经验的人所熟知的。通常情况下，根据所治疾病病情的严重性与药效反应来给药，疗程持续数日至数月，直到病情缓解为止。最佳给药剂量、给药方法和重复率也是本领域普通人士所能决定的。最佳给药剂量可以根据本发明纳米颗粒的相对疗效进行调整，一般可根据体外和体内动物模型的MIC和MBC值来估测使用效量。给药频率可以为每天一次或多次、一周两次，每周一次或更长时间一次。治疗成功后，应继续进行一些维护治疗，以防感染复发。
本文所用的术语“药学上可接受的载体”与“赋形剂”具备相同的含义，均是指用于向使用对象输送本发明纳米颗粒的药学认可的溶剂、悬浮剂或任何其它药学惰性的赋形剂。药学可接受载体可以为液体或固体，应根据所计划的给药方式来选择载体，从而当本发明的纳米颗粒和一种或多种有治疗作用的化合物或其他药学成分联用时，可以达到理想的剂量、一致性、及其它药物传输和化学的特性。
不会与本发明的纳米颗粒产生有害反应或破坏本发明纳米颗粒的纳米结构的药学可接受载体包括但不限于：水；生理盐水；结合剂(例如聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填料(例如乳糖和其它糖类、明胶或硫酸钙)；润滑剂(例如淀粉、聚乙二醇或乙酸钠)；崩解剂(例如淀粉或羟基乙酸淀粉钠)；以及润湿剂(例如月桂基硫酸钠)。
本发明的纳米颗粒可以采用多种方法给药，但通常是局部给药。本发明的纳米颗粒可以与其它分子混合，或者与其它分子、分子结构或化合物的混合物一起使用，例如聚乙二醇、凡士林，或其它外用制剂，从而促进药物的摄取、分布和/或吸收。局部给药的剂型可包括无菌和非无菌水溶液，以及常用溶剂的非水溶液(例如乙醇或液体或固体油基质溶液)。此类溶液也可以含有缓冲液、稀释剂和其它合适的添加剂。局部给药的药物剂型包括透皮贴、软膏、洗剂、霜剂、凝胶剂、滴剂、喷雾剂、液体和粉末；其中尤其优选洗剂、霜剂和凝胶剂。在使用的时候常可能需要常规药物载体(水基质、粉末基质或油基质的)，也可能会用到增稠剂等其它物质。在有些情况下，本发明的纳米颗粒可能悬浮在水基质、非水基质或混合基质中的悬浮液中。悬浮液中还可以含有增加悬浮液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。悬浮液还可以包含稳定剂。
在优选的实施方式中，本发明的药物组合物还可含有穿透促进剂以提高本发明纳米颗粒有效穿透哺乳动物皮肤的功能。穿透促进剂可同时提高亲脂性与非亲脂性药物穿过细胞膜的能力。穿透促进剂包括但不限于：表面活性剂(例如十二烷基硫酸钠、聚氧乙烯-9-月桂基醚和聚氧乙烯-20-十六烷基醚)；胆汁酸盐(例如胆酸、脱氢胆酸和脱氧胆酸)；螯合剂(例如乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸和水杨酸盐)；以及非螯合性非表面活性剂(例如不饱和环脲)。
另外，在某些实施方式中，本发明的纳米颗粒可以通过离子电渗法进行递送，利用带有电荷的透皮贴来“驱使”该纳米颗粒达到真皮。
本发明的药物组合物中通常也可以含有一些其它辅助药物成分。这些包括相容的药物活性材料，如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或消炎药、以及其它用来改进剂型物理性能的材料(例如染色剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂等)。另外还可以加入一些辅助试剂，如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲液、着色剂和芳香物质等。当然，这些辅助物质的加入不应该干扰本发明纳米颗粒的活性和使用效果。如有需要，制剂配好后应进行灭菌处理。
鉴于本发明的内容以及现有技术中的教导，本领域技术人员可将本发明的药物组合物制成各种剂型。在具体的实施方式中，本发明的药物组合物的剂型包括但不限于：适合全身性给药的剂型、或外用或局部给药的剂型。进一步地，所述剂型包括但不限于：片剂、溶液剂、混悬液、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、注射剂、贴剂、喷剂、软膏剂、油膏剂、乳膏剂、凝胶剂、霜剂、滴剂、喷雾剂、洗剂。在优选的实施方式中，本发明的药物组合物是外用或局部给药的剂型，包括但不限于：贴剂、喷剂、软膏剂、油膏剂、乳膏剂、凝胶剂、霜剂、滴剂、喷雾剂、洗剂。
本发明的药物组合物可以用作抗微生物感染的试剂。所述微生物包括细菌或真菌。例如，所述细菌包括但不限于：革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌；所述革兰氏阳性菌包括但不限于：葡萄球菌；优选金黄色葡萄球菌；更优选甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌；或者，丙酸杆菌；优选费氏丙酸杆菌、痤疮丙酸杆菌、卵白丙酸杆菌、颗粒丙酸杆菌；更优选痤疮丙酸杆菌；所述革兰氏阴性菌包括但不限于：幽门螺旋杆菌、绿脓杆菌。再例如，所述真菌包括但不限于：白色念珠菌、红色毛癣菌、黄癣菌。
本发明的药物组合物尤其可以通过减少哺乳动物(例如人类)皮肤上或皮肤内存活的微生物，例如葡萄球菌或丙酸杆菌数量来治疗这些微生物的感染。这些方法包括将本发明的药物组合物或本发明的纳米颗粒施加到受感染的哺乳动物的皮肤上，来减少所感染的葡萄球菌或丙酸杆菌细胞的数量。本发明的药物组合物或纳米颗粒还可以减轻微生物，例如金黄色葡萄球菌或痤疮丙酸杆菌感染的症状。
本发明的药物组合物还可包含其它常规抗生素，从而与其它抗生素联用，只要这些其它常规抗生素与本发明纳米颗粒不对彼此产生不良影响。与单用常规抗生素相比，上述联用起到降低常规抗生素的用量、降低毒副作用以及提高治疗效果等有益效果。所述其它抗生素可以是治疗与本发明纳米颗粒所治疗的相同微生物感染的抗生素，从而提高疗效；也可以是治疗与本发明纳米颗粒所治疗的不同微生物感染的抗生素，从而能够治疗不同的微生物感染或复杂的微生物感染。例如，所述其它常规抗生素包括但不限于：万古霉素、头孢菌素、利奈唑胺、替考拉宁、阿贝卡星、奎宁始霉素、达福普汀、喹努普丁、克林霉素、达托霉素、利福平、替拉万星、四环素类如替加环素等药物；或者，所述其它常规抗生素包括但不限于：阿达帕林、他扎罗汀、红霉素、克林达霉素、阿奇霉素、米诺环素、罗红霉素、异维A酸和过氧化苯甲酰(BPO)；或者，所述其它常规抗生素包括但不限于：克拉霉素、阿莫西林、甲硝唑、替硝唑、呋喃唑酮、四环素等药物。
此外，本领域技术人员应该知晓，上文所述的其它抗生素可以采用与本发明的纳米颗粒相同的给药途径、在同一给药时间给予；也可以采用与本发明的纳米颗粒不同的给药途径、在同一给药时间给予；也可以采用与本发明的纳米颗粒相同的给药途径、在不同的给药时间给予。例如，上述其它抗生素可以与本发明的纳米颗粒离散地存在于同一药物组合物中(例如，试剂盒中)，从而可以利用相同或不同的给药途径，在相同或不同的给药时间给予。
在优选的实施方式中，本发明的药物组合物是水性药物组合物，即，不含有机溶剂的药物组合物。本领域技术人员可根据本发明的教导以及实际需求决定药物组合物中脂肪酸的浓度。
本发明的优点：
1.本发明的非囊泡型纳米颗粒具备显著的抗菌活性；
2.本发明的非囊泡型纳米颗粒选用天然来源的成分，安全性高，无毒副作用；
3.本发明的非囊泡型纳米颗粒具备优异的稳定性；
4.本发明的非囊泡型纳米颗粒避免使用诸如DMSO等有机溶剂来递送药物；
5.本发明非囊泡型纳米颗粒的制备方法简单，无需使用氯仿等有毒有害的有机溶剂，从而降低了生产成本并且对环境友好；
6.本发明非囊泡型纳米颗粒粒径小，更易进入组织内部发挥杀菌作用；
7.本发明非囊泡型纳米颗粒多分散性小，均一性好，杀菌效果稳定。
除非特别说明，本发明中使用的所有技术术语和科学术语都为本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的。虽然本发明可以使用与本专利所阐述的相似或等同的方法与材料来实施，但下文仍然阐述了适合的方法与材料。本专利中所提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考资料一经引用即全文纳入。如这些出版物、专利申请、专利和其它参考资料与本专利申请有冲突，以本说明书(包括定义在内)为准。此外，本专利申请中的材料、方法和实例仅用作说明，并不是限制性的。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例
材料和方法
材料：
蛋黄卵磷脂(egg PC)、胆固醇、C6-NBD植物鞘氨醇(C6NBD)和1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-丽丝胺若丹明B磺酰基(DMPE-RhB)购自Avanti Polar Lipids有限公司(Alabaster,AL)；亚麻酸、胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)、磷酸盐缓冲盐(PBS)、三氟乙酸(TFA)、乙腈和葡聚糖凝胶G-75购自Sigma Aldrich(St.Louis,MO)；琼脂购自BD(sparks，MD)。
月桂酸购自Sigma Aldrich(St.Louis,MO)。KHCO3购自Fisher Scientific司(Pittsburgh,PA)。3,4-二氟苯甲酰甲基溴购自Maybridge公司(Cambridge,英国)。布氏培养基(批号211088)，吸气装置(批号260683)和人琼脂(批号214010)购自BD公司(Sparks,MD)。每升布氏培养基含有10.0g酪蛋白的胰蛋白酶消化物、10.0g动物组织的胃蛋白酶消化物、1.0g葡萄糖、2.0g酵母浸膏、5.0g氯化钠和0.1g亚硫酸氢钠。去纤维蛋白绵羊血(批号为R54016和R54008)与氯高铁血红素和维生素K溶液(批号R450951)购自Remel公司(Lenexa,KS)。强化梭菌培养基(批号OXCM0149B)购自Oxoid公司(Hampshire,英国)。
肉豆蔻油酸、胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)、磷酸盐缓冲盐(PBS)、三氟乙酸(TFA)、乙腈和葡聚糖凝胶G-75购自Sigma Aldrich(St.Louis,MO)。琼脂购自BD(sparks，MD)。
细菌的培养：
MRSA252菌株(获自ATCC)从冰冻存储中取出，在37℃胰蛋白酶大豆琼脂板上培养过夜。接下来一个单独菌落在胰蛋白酶大豆培养基(TSB)接种，并在37℃下培育，摇晃直到培养介质的OD600到达0.7左右(对数生长阶段)。细菌然后通过离心4000*g 3分钟后得到，之后使用无菌PBS清洗两次。当通过离心去除PBS后，获得的细菌被悬浮在适量新鲜的TSB中供以后使用。
痤疮丙酸杆菌(ATCC 6919)用布氏培养基培养，培养基中添加5％(v/v)去纤维蛋白绵羊血、维生素K(5μg/mL)和氯高铁血红素(50μg/mL)，在吸气装置产生的37℃无氧环境中进行培养。挑取单克隆接种到强化梭菌培养基中，并在37℃无氧条件下培养，直到OD600达到约1.0(对数生长期)为止。5000g离心10分钟，收菌并用PBS洗涤，然后用适当量的PBS重溶用于试验。
幽门螺旋杆菌悉尼菌株1(HPSS1，来自ATCC)从冰冻存储中取出，于37℃常规保存在哥伦比亚琼脂(含5％裂解马血(FBS))的微需氧环境下(10％CO2、85％N2和5％O2)。在实验中，将琼脂板上培育的新鲜菌落接种到添加了5％胎牛血清的脑心浸液(BHI)中，然后在37℃微需氧条件下适度的来回振荡并培养过夜，从而制得幽门螺旋杆菌的肉汤培养物。HPSS1的过夜肉汤培养物以5000*g离心10分钟以获得细菌沉淀物。离心除去培养基后，将获得的细菌悬浮在适量的含5％FBS的新鲜BHI中待用。
本发明纳米颗粒的制备及表征：将200mg表面活性剂(吐温20或吐温80)和脂质(蛋黄卵磷脂:胆固醇＝9:1重量比)的混合物悬浮在4mL的水中，其中表面活性剂：脂质体的比率分别为10:0、8:2、5:5、3:7、1:9或0:10。悬浮液搅拌直至形成均相溶液，然后加热到表面活性剂和脂质的熔点以上(20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃或80℃，取决于使用的表面活性剂和脂质及其比率)。相应浓度的脂肪酸，例如亚麻酸(0.1％w/v到4％w/v)、月桂酸(0.1％w/v-5％w/v)或肉豆蔻油酸(0.1wt％到4wt％)被加入至悬浮液中并搅拌30分钟。此后溶液室温下放置过夜。本发明纳米颗粒的流体动力学尺寸，用马尔文Zetasizer ZS仪器(英国马尔文仪器公司，英国)测量。本发明纳米颗粒的平均直径是通过动态光散射(DLS)测定。所有的性质测量在25℃重复3次。
本发明纳米颗粒的稳定性：本发明纳米颗粒的长期稳定性通过将纳米颗粒溶液在不同温度下储存一定时间来考察；在每个预先确定的时间点，测量样品的粒径以判断本发明纳米颗粒在不同温度下的稳定性。
本发明纳米颗粒的体外抗菌活性(MIC与MBC值)：采用本领域的常规方法检测本发明纳米颗粒对不同细菌的体外MIC和MBC。
本发明纳米颗粒处理的细菌的形态学：通过常规方法，利用扫描电子显微镜(SEM)测量经本发明纳米颗粒处理过或未处理过的细菌的形态。
本发明纳米颗粒对MRSA252的体内抗菌活性的测定：
在以下两个模型中评估本发明纳米颗粒对MRSA252感染的体内抗菌活性和治疗效果：小鼠表皮伤口感染模型和小鼠皮下感染模型。
为了建立表皮伤口模型，小鼠(来自Charles River laboratories)被进行氯胺酮和甲苯噻嗪腹腔注射，麻醉过后，小鼠的黑色毛发被剃掉，皮肤被乙醇垫清洗。皮肤擦伤伤口在小鼠后背表皮被制造出来，通过在指定的1*1cm2区域用28G针头划成6*6的交叉线。这些划痕制造的方式确保他们只划伤角质层和表皮上层，但不划伤真皮。划伤5分钟后，50μL含有1×107CFU的MRSA252细菌PBS悬浮液通过微量移液管被接种在交互划伤的区域。接种30分钟后，本发明纳米颗粒的PBS凝胶用于损伤区域。所用凝胶是由羟乙基纤维素，甘油，聚乙二醇按适当比率调制而成的水凝胶。这些药物在连续5天内每天涂抹一次。空白的悬浮凝胶也被涂抹用作对照实验。在第6天，小鼠被实施安乐死；皮肤组织通过8mm的皮肤穿孔机取下并将其包含的细菌数量进行记数。
为了建立皮下感染模型，小鼠的黑色毛发被剃掉，皮肤被乙醇垫清洗。之后，20μL的1×106CFU的MRSA252细菌PBS悬浮液被皮下注射到剃毛区域，继而在相同区域注射入200μL的本发明纳米颗粒。无菌PBS作为空白对照实验被注入。(感染处的)生理表象和形态被仔细观察。细菌接种3天后，记录伤口的组织学分析结果。
本发明纳米颗粒对痤疮丙酸杆菌的体内抗菌活性测定：用ICR小鼠(来自CharlesRiver laboratories)进行皮内注射来检测生理环境下本发明纳米颗粒对痤疮丙酸杆菌的抗菌活性。具体来说，皮内注射痤疮丙酸杆菌(1x107 CFU，溶于20μL PBS)到ICR小鼠双耳上(包括左耳和右耳)，随后痤疮丙酸杆菌的注射部位再分别注射本发明纳米颗粒(1％w/v月桂酸)或PBS(用作阴性对比试验)。注射24小时后，用8mm活检穿孔采集小鼠耳朵样品，然后用1mL无菌PBS(Mini-BeadbeaterTM)匀浆。匀浆液用PBS稀释，稀释比为1:10至1:106。每个稀释液取10μL涂布在RCM琼脂平板上。琼脂平板在37℃、无氧条件下培养3天，然后再计数痤疮丙酸杆菌的CFU。每组使用6只小鼠(n＝6)，实验重复三次以验证统计学显著性。
本发明纳米颗粒(1％w/v亚麻酸)的体内毒性研究：用ICR小鼠的背部皮肤测试本发明纳米颗粒的皮肤毒性。具体地说，小鼠的背部在研究前24小时被剃毛。之后在7天之内每天用本发明纳米颗粒凝胶在剃毛区域涂抹一次。用PBS涂抹的小鼠用作对照组。为了避免凝胶干燥，(小鼠)皮肤被纱布覆盖着。最后一次外用给药的24小时后，小鼠被实施安乐死，皮肤被8mm的截面切片横切用作组织学检查。每只小鼠的皮肤组织在10％的缓冲福尔马林处理18小时，然后置入石蜡中。这些组织切片用H&E法染色。上皮细胞的凋亡用TUNEL法进行分析评估。切片继而被Hamamatsu NanoZoomer2.0HT(数字切片扫描仪)成像。图片用NDP图像软件处理。每组实验中有5只小鼠(n＝5)。为了评估毒性，组织样品根据Draize系统评分。评分系统如下：0-没有刺激的证明；1-极小，几乎难以察觉；2-表皮层中明确，可见的刺激；3-表皮层中严重的刺激；4-表皮层中严重刺激，伴随着真皮层刺激；5-表皮层和真皮层严重的刺激。为了分析巨噬细胞浸润，小鼠的皮肤组织通过8mm截面切片被采集。这些冰冻的皮肤切片，对皮肤巨噬细胞使用FITC-抗-小鼠f4/80抗体进行染色，而对细胞核使用DAPI进行染色。染色后，皮肤样品立刻通过Nikon Delta Macroview荧光显微镜成像。
皮肤毒性：在ICR小鼠的背部皮肤上检测本发明纳米颗粒的皮肤毒性。具体来说，研究开始之前24小时，小鼠背部进行脱毛，然后局部给服本发明纳米颗粒(1％w/v月桂酸)纤维素凝胶(由羟乙基纤维素、甘油、聚乙二醇按适当比率调制而成的水凝胶)。空白PBS凝胶(不含本发明纳米颗粒)用作阴性对比试验。24小时后，检测皮肤的形态学并拍照。根据Draize打分系统对皮肤受刺激结果进行打分。用8mm活检穿孔取皮肤的横截面切片，用苏木精和伊红(H&E)染色，然后用显微镜拍照来观察皮肤的组织学。每组使用6只小鼠(n＝6)，实验重复三次以验证统计学显著性。
实施例1本发明纳米颗粒的制备和表征
如“材料和方法”部分所述制备本发明的纳米颗粒。
本发明纳米颗粒的流体动力学粒径通过两个参数来描述：z-平均粒径和多分散性指数，两个参数都是通过动态光散射测量的累积量分析计算得来的。
通过改变亚麻酸浓度，本发明人制备了一系列的纳米颗粒并检测以判断最适剂型。如图1A所示，当亚麻酸浓度是1％w/v，溶液呈现澄清而透明(d)，其中的本发明纳米颗粒的平均粒径为10nm，以及0.2的多分散性指数。因此，在后续实验中选择的纳米颗粒包含1％w/v亚麻酸，其中脂质与表面活性剂的质量比为2:1(本文也称为TNAN-2)。此外，本发明人还检测了当所含亚麻酸的浓度在0.2％w/v到0.9％w/v之间时本发明纳米颗粒在水中的表面电势在-3mV～-6mV。
通过改变月桂酸的浓度，本发明人制备了一系列本发明纳米颗粒，通过反复试验来鉴定最佳配方。如图1B所示，当月桂酸浓度为1％w/v时，溶液看上去澄清且透明(图c)，该纳米颗粒的平均直径为11.1nm，平均多分散性指数为0.09。因此，在后续实验中选择的制剂是1％w/v月桂酸(脂质与表面活性剂的质量比为2:1，本文也称为TNAN-1)。此外，本发明人还检测了本发明纳米颗粒在水中的表面电势在-5mV～-15mV。
本发明人还制备了0.1-4％w/v的不同肉豆蔻油酸加载率的本发明纳米颗粒，如图1C所示，从而选出纳米颗粒的最佳收率，同时保持可接受的纳米颗粒尺寸(约9nm)。本发明人发现，当肉豆蔻油酸的初始加载浓度增加时，纳米颗粒尺寸也增加(图2)。为后续实验选择的最佳制剂是0.3％w/v肉豆蔻油酸(脂质与表面活性剂的质量比为2:1，本文也称为TNAN-3)，平均粒径约为8.6nm，低于10nm的阈值。纳米颗粒的质量通过动态光散射法检测，以多聚分散性参数来表征。0.3％w/v肉豆蔻油酸的纳米颗粒的PDI约为0.2，表明相对较窄的粒径分布。
本发明人还通过表面Z-电势确定肉豆蔻油酸掺入本发明纳米颗粒制剂。加载有0.1～0.5％w/v肉豆蔻油酸的制剂在去离子水中的表面Z-电势范围在-3到-13mV。制剂中肉豆蔻油酸的载量较高导致更多的表面负电荷。表面z-电势的这种降低与肉豆蔻油酸加载相关是肉豆蔻油酸掺入本发明纳米颗粒所致，因为肉豆蔻油酸的羧酸基团在接近生理pH值7.4的条件下会脱质子变成COO-。
实施例2-1.本发明的纳米颗粒的体外抗菌活性-1
本发明的纳米颗粒(亚麻酸)对MRSA252的体外抗菌活性是通过检查当细菌和不同浓度的本发明的纳米颗粒共育时出现的抑菌和杀菌作用来评估的。在研究中，首先测量最小抑制细菌生长的本发明的纳米颗粒浓度(MIC)。具体地说，1×106CFU的MRSA252与0-0.6％w/v浓度的本发明纳米颗粒共育。与不少于0.1％w/v浓度的本发明纳米颗粒培养的细菌保持明显的澄清液，说明了这一浓度对细菌生长有显著抑制作用(图7A)。相比之下，当本发明纳米颗粒的浓度低于0.1％w/v时，细菌培养液就变得浑浊，表现出大量的细菌生长。为了量化分析细菌的生长，在培育的5小时或24小时后，混合液需被测量OD600来判断细菌数量(1OD600对应着108CFU/mL)。如图7B和C所示，当本发明纳米颗粒的浓度高于0.1％w/v时，细菌的生长得以抑制。综上所述，0.1％w/v便是本发明纳米颗粒针对MRSA252的MIC。
还检测了本发明纳米颗粒对MRSA252的最小杀菌浓度(MBC)。具体地说，确定的MBC值定义为能够杀死99.9％目标细菌MRSA252的最低抗菌浓度。在一个体外实验中，不同的浓度的本发明纳米颗粒与MRSA252(1*106CFU)共育24小时。这样的培育使得本发明纳米颗粒与MRSA252接触并进行杀菌。培育过后，从细菌培养液中取5μL放在琼脂板上，继而在37℃下隔夜培育，然后对MRSA252的CFU进行计数。图10A便是不同浓度的本发明纳米颗粒与细菌液共育24小时后取样5μL于琼脂板培育的代表照片。很明显，使用的药物浓度越高，琼脂板剩下可见的菌落越少。之后每组细菌培养基取5μL，进行1:10到1:105稀释，之后放在TSB琼脂板上观察并计量CFU。如图10B所示，0.2％w/v的本发明纳米颗粒杀死了99.9％的MRSA252。当亚麻酸的浓度升到0.2％w/v以上时，细菌全部死亡。因此，0.2％w/v即为本发明纳米颗粒针对MRSA252的MBC值。
以上结果显示出本发明纳米颗粒对MRSA252的MBC：MIC比值大致是2:1，表明此纳米颗粒对该细菌是杀菌剂。同时，此纳米颗粒在24小时内使得细菌数量降低3个对数级，表明此纳米颗粒对MRSA的杀菌作用。此研究可以为将来体内评价的浓度和药物接触时间起指导作用。
为了对本发明纳米颗粒杀死MRSA252的机制有更深刻的理解，本发明人进一步检查了MRSA252细菌在本发明纳米颗粒处理前后的形态学变化。在处理之前，SEM成像表示MRSA252细胞有着典型0.6-1μm直径的葡萄状，聚集形态，和完整的细胞壁/膜结构(图16A)。经过本发明的纳米颗粒处理24小时后，SEM成像显示出细菌形态的实质性变化，包括显著的细胞结构破坏，不规则的聚集形态，和破损模糊的细胞边缘(图16B)。此形态改变意味着本发明纳米颗粒对细菌细胞的强烈破坏性效应，从而抑制细菌生长。
实施例2-2.本发明的纳米颗粒的体外抗菌活性-2
本发明纳米颗粒(1％w/v月桂酸)与不同浓度的痤疮丙酸杆菌(1x106CFU/mL，1x107CFU/mL，1x108CFU/mL和1x109CFU/mL)在37℃下共孵育5小时，以此来检测其在体外的抗菌活性。共孵育完成后，样品用PBS稀释，稀释比为1:10至1:106，然后每个样品取10μL，涂布在RCM琼脂平板上。样品在37℃、无氧条件下培养3天，然后计数痤疮丙酸杆菌的CFU。如图11所示，当细菌浓度低于1x107CFU/mL时，本发明纳米颗粒能够完全杀死痤疮丙酸杆菌。当细菌浓度升高至1x109CFU/mL时，本发明纳米颗粒可降低细菌负载达5个数量级，剩余细菌浓度大约为1x104CFU/mL。这表明细菌在高浓度下，所述纳米颗粒(1％w/v月桂酸)不足以清除所有细菌，原因可能是溶液中纳米颗粒的量不足。
本发明纳米颗粒的时间依赖性抗菌活性试验结果显示只有当本发明纳米颗粒与细菌(1x107CFU/mL)共孵育5小时后，才能完全杀死细菌。随着共孵育时间减少，抗菌性能也随之减弱(图12)。
本发明纳米颗粒的这种抗菌活性还和操作温度相关。当所述纳米颗粒(1％w/v月桂酸)与细菌(1x107CFU/mL)共孵育5小时后，结果显示，在室温(20℃)或更高温度下，细菌被完全清除(图13)。
为测定本发明纳米颗粒对痤疮丙酸杆菌的体外MIC，在厌氧条件下，将不同浓度的本发明纳米颗粒与痤疮丙酸杆菌(1*106CFU/mL)培育5小时，然后检测样品在600nm处的吸收度(600nm处的光密度，OD600)。所有的检测都平行操作三次。结果显示当本发明的纳米颗粒浓度为0.0125％w/v或更高时，其抑制细菌的生长，如图8所示。
为测定本发明纳米颗粒对痤疮丙酸杆菌的体外MBC，在37℃，厌氧条件下，将不同浓度的本发明纳米颗粒与痤疮丙酸杆菌(1*106CFU/mL)培育5小时。培育后，样品用PBS作1:10至1:106稀释，取5μL稀释液接种于RCM琼脂板上。琼脂板在37℃，厌氧条件下培养3天，之后定量测定痤疮丙酸杆菌的CFU(菌落形成单位)。结果显示，0.02％w/v的本发明纳米颗粒杀死了99.9％的痤疮丙酸杆菌。此外，0.05％w/v和更高的本发明纳米颗粒杀死全部细菌，如图14所示。
以上结果显示出本发明纳米颗粒对痤疮丙酸杆菌的MBC:MIC比值大致是1.6:1，表明此纳米颗粒对该细菌是杀菌剂。
定量分析本发明纳米颗粒对痤疮丙酸杆菌的体外抗菌活性之后，用扫描电镜来观察所述纳米颗粒处理对细菌形态产生的影响。痤疮丙酸杆菌与所述纳米颗粒共孵育5小时后，用2％的戊二醛固定，然后再用扫描电镜观察。如图8所示，未处理样品(即与PBS缓冲液共孵育)的扫描电镜图显示痤疮丙酸杆菌具有规则的杆状结构，菌表面光滑，具有菌毛。相反，使用本发明纳米颗粒处理过的细菌表现出明显的异常；细菌表面出现不规则变形和收缩，无菌毛(图17)。以上结果表明，本发明纳米颗粒可能会破坏细菌膜的结构，从而实现其杀菌的功能。
实施例2-3.本发明的纳米颗粒的体外抗菌活性-3
通过针对幽门螺旋杆菌的MIC(定义为抑制细菌生长的最低浓度)和MBC(定义为杀死99.9％目标细菌的最低)值来确定本发明纳米颗粒(肉豆蔻油酸)对幽门螺旋杆菌(悉尼菌株1，HPSS1)的体外抗菌活性。
为测定MIC，0.05OD600(对应于5×106CFU/mL)的幽门螺旋杆菌与不同浓度(0到0.012％w/v)的本发明纳米颗粒共同培养。为了量化细菌生长情况，培养18小时后，测定细菌培养物的OD600值，记录与初始值相比的变化值。变化值反映了细菌在本发明纳米颗粒影响下的生长情况。如图9所示，当本发明纳米颗粒的浓度低于0.0015％w/v时，共培育后的OD600值与初始值相比变化明显(>5％)，提示即使在此浓度的TNAN-3存在下，细菌生长明显。相反，当肉豆蔻油酸的浓度高于0.0015％w/v，OD600的变化值小于5％，说明了细菌生长得到了有效抑制。所以，0.0015％w/v确定为本发明纳米颗粒的MIC。
本发明人还测定了本发明纳米颗粒对幽门螺旋杆菌的杀菌作用。将幽门螺旋杆菌(5×106CFU)和不同浓度的本发明纳米颗粒共同培养18小时。这种培养过程使得本发明纳米颗粒与幽门螺旋杆菌相互作用，从而杀伤它们。培育后，将5μL细菌培养液接种于哥伦比亚琼脂上，然后在37℃下培育4天，来对细菌计数。图15A显示了将不同浓度的本发明纳米颗粒处理18小时后的5μL细菌，接种于琼脂板培育过夜的代表性照片。很明显，本发明纳米颗粒的浓度越高，琼脂板上可见的菌落越少。
如图15B所示，0.0015％w/v的本发明纳米颗粒杀死了99.9％的幽门螺旋杆菌。当肉豆蔻油酸的浓度升到0.0015％w/v以上时，细菌全部死亡。因此，0.0015％w/v即为本发明纳米颗粒针对幽门螺旋杆菌的MBC值。
本发明的结果显示本发明纳米颗粒对HPSS1的MBC:MIC比值大致是1:1，表明此制剂对该病原菌是杀菌剂。同时，此制剂在18小时内将细菌计数降低超过3个数量级，表明此药物对HPSS1的杀菌作用，从而为进一步体内评价浓度和药物接触时间起指导作用。
为了对本发明纳米颗粒制剂杀死幽门螺旋杆菌的机制有更深刻的理解，本发明人进一步检查了幽门螺旋杆菌细胞在本发明纳米颗粒处理前后的形态学变化。在处理之前，SEM图像显示幽门螺旋杆菌细胞有着正常的弯曲形态和完整的细胞膜(图18A)。典型的螺旋状幽门螺旋杆菌细胞有2-4μm长、0.5-0.8μm宽，拥有可见的护套鞭毛。本发明纳米颗粒处理18小时后，SEM图像显示细菌形态的显著变化，包括正常弯曲形态的完全丧失，原生质体圆柱体型的破坏，细胞溶解，细菌细胞膜的片段化以及严重的聚团形态(图18B)。此形态改变表明本发明纳米颗粒制剂的强烈破坏作用，从而抑制细菌生长。
实施例3.本发明纳米颗粒的储存稳定性
本发明人考察了本发明纳米颗粒(1％w/v亚麻酸)在不同温度下的3个月的长期稳定性。稳定性的变化通过检测粒径来体现。如图3中所示，在4℃、25℃和37℃下储存的纳米颗粒的粒径仅仅从11nm增长到13nm，变化可以忽略不计，表明了本发明的纳米颗粒在所有储存条件下的高稳定性。
作为药用，本发明纳米颗粒很关键的一点就要能够在长时间保存下保持有效杀菌作用，即，在要有稳定的结构之余，还要有稳定的活性。为了评估这种能力，本发明人检查了在储存3个月的时间内本发明纳米颗粒的MIC和MBC值。如图19所示，当在室温下储存三个月后，本发明纳米颗粒显示了与新鲜制备的样品近似的MIC和MBC值。
研究显示，本发明纳米颗粒(1％w/v月桂酸)的抗菌活性与样品的储存温度也有关系。本发明纳米颗粒在37℃下储存5个月后，其抗菌活性与新鲜纳米颗粒相同，可以完全杀死1x107CFU/mL的痤疮丙酸杆菌。然而，当储存温度为20℃或4℃时，其抗菌活性下降，分别只能杀死4.4和1.8个数量级的原始痤疮丙酸杆菌量(1x107CFU/mL)(图20)。
基于此，本发明人进一步对本发明的纳米颗粒(1％w/v月桂酸)在极端高温和极端低温条件下的稳定性和药效进行了检测。根据颗粒尺寸(图4)和最小杀菌浓度(MBC)结果(实施例2，图13)，处在20至100℃温度下的颗粒很稳定，其抗菌活性保持不变。此外，更低温度(4至-80℃)下保存的颗粒不能完全清除浓度为1x107CFU/mL的痤疮丙酸杆菌，-80℃下冷冻的TNAN-1极不稳定。
进一步的长期稳定试验发现该纳米颗粒在20℃下可以稳定保存5个月。在试验期间，颗粒体积和多分散性指数均保持几乎恒定不变(图5)。
通过监测纳米颗粒的尺寸，本发明人还考察了其它所选制剂(0.3％w/v肉豆蔻油酸)在不同保存温度下在3个月时间跨度下的长期稳定性。如图6所示，在包括-20℃(冻干制剂)、4℃、25℃和37℃(悬浮液形式)的各种条件下保存的纳米颗粒胶束显示尺寸改变在8.2-9.7nm之间，可忽略不计，提示本发明纳米颗粒在各种保存条件下的高稳定性。
对于本发明的纳米颗粒制剂，能够在长时间保存下保持有效杀菌作用是很关键的。为评估这种能力，本发明人检查了储存3个月的时间内本发明纳米颗粒的MIC和MBC值。如图21和22所示，无论是室温下以悬浮液保存3个月，还是在-20℃以冻干形式保存3个月，本发明的纳米颗粒均显示与新鲜制备的样品相当的MIC和MBC值。
实施例4-1.本发明纳米颗粒的体内抗菌功效-1
本发明纳米颗粒(1％w/v亚麻酸)对MRSA252感染的体内抗菌活性和治疗效果通过使用ICR小鼠的皮肤擦伤感染模型进一步被评估。(小鼠的)感染由MRSA252引起被连续5天内每天涂以内分泌纳米颗粒的凝胶和空白凝胶。细菌载量在MRSA252感染后的第6天被测定。皮肤组织首先在PBS中匀质化，并用MRSA特异性的琼脂板(甘露醇盐琼脂)上进行隔夜培育。专门选择甘露醇琼脂板进行MRSA培养是因为琼脂的颜色会随着MRSA的生长从粉色变成黄色。如图23A所示，本发明纳米颗粒处理过的MRSA琼脂板保持粉色，然而那些(使用空白凝胶)对照组的琼脂板变成了黄色。这项观察意味着本发明纳米颗粒在皮肤擦伤感染处有强大的杀菌活性。除目测观察外，本发明人还进一步对样本的CFU值进行了计数量化。结果表明，空白凝胶处理过的小鼠皮肤上的细菌存留量是本发明纳米颗粒处理过的大约66倍，其中t分布检的假定值低于0.01(图23B)。
为了更好的评估本发明纳米颗粒的抗MRSA活性，还在ICR小鼠皮下感染的模型中得到进一步测试了该纳米颗粒。在这项研究中，感染24小时后，空白凝胶治疗的小鼠在感染处显示出了含脓损伤。本发明纳米颗粒的凝胶治疗的小鼠在感染处附近显示出皮疹，但是严重程度轻得多(图24)。72小时后，空白凝胶治疗的小鼠的病变变得更加明显，意味着小鼠体内感染的扩散。相比之下，本发明纳米颗粒的凝胶治疗的小鼠表现出不明显的病变。此项比较表明本发明纳米颗粒的优异抗MRSA疗效。
实施例4-2.本发明纳米颗粒的体内抗菌功效-2
对ICR小鼠进行皮内注射，以此来检测本发明纳米颗粒(1％w/v月桂酸)对痤疮丙酸杆菌的体内抗菌活性。在本实施例中，选择小鼠耳朵进行皮内注射，因为小鼠耳朵的结构能使接种细菌停留在注射区域。为了检测生理环境下本发明的纳米颗粒对痤疮丙酸杆菌的抗菌活性，在ICR小鼠的双耳(左耳和右耳)皮内注射痤疮丙酸杆菌(1x107CFU，溶于20μLPBS)。注射痤疮丙酸杆菌的部位再分别注射本发明的纳米颗粒(1％w/v月桂酸)或PBS(用作阴性对比试验)。注射24小时后，用直径为8-mm活检穿孔采集小鼠耳朵样品，然后进行匀浆及培养，以计数剩余的痤疮丙酸杆菌菌数。如图28所示，使用本发明纳米颗粒治疗可完全清除小鼠耳朵上接种的痤疮丙酸杆菌。相反，阴性对照组(PBS缓冲液处理)检测到的菌数为1.2×104CFU/mL。以上结果证明本发明的纳米颗粒在生理环境下(例如在真皮内)能够有效杀死痤疮丙酸杆菌。
实施例5-1.本发明纳米颗粒对正常皮肤组织的毒性-1
通过5天内将本发明纳米颗粒(1％w/v亚麻酸)的凝胶剂型外用在剃毛小鼠的表皮上来测试本发明纳米颗粒的毒性。如图25所示，没有发现本发明纳米颗粒引起任何红斑或水肿刺激。
为了进一步评估刺激性和细胞凋亡，进行了H&E染色和末端脱氧核苷酸转移酶标记(TUNEL)实验。如图26所示，本发明纳米颗粒处理过的皮肤表面保持着未被破坏的结构，真皮层上方有一层清晰的健康表皮细胞，这和未经处理的皮肤样本一模一样。H&E染色同样证明了，与未经处理的皮肤相比，本发明纳米颗粒处理没有引起任何组织内炎症。除此之外，还进行了TUNEL分析来评估皮肤组织中产生严重DNA破坏和坏死细胞生成的数量。在图26中，本发明纳米颗粒处理过的皮肤组织比起未处理皮肤并没有显示出明显的凋亡染色增加。
为了进一步验证本发明纳米颗粒的安全性，尤其是是否引起皮肤炎症，我们测量了皮肤渗透的巨噬细胞水平。在此研究中，经本发明纳米颗粒处理过的和未被处理过的皮肤组织中的皮肤巨噬细胞，用FITC-抗-小鼠f4/80抗体进行染色。如图27所示，可以在真皮层上方的表皮层的较低部位中观测到皮肤巨噬细胞，本发明纳米颗粒的处理并没有改变这样的组织分布。比起未经处理的皮肤样品，那些本发明纳米颗粒处理过的样品没有表现很出渗透巨噬细胞的明显增加，表明没有明显的炎症。
实施例5-2.本发明纳米颗粒对正常皮肤组织的毒性-2
在ICR小鼠的背部皮肤上局部使用本发明纳米颗粒(1％w/v月桂酸)的凝胶之后，通过检查皮肤形态学的变化来检测所述纳米颗粒对正常皮肤组织可能产生的毒性。在本实施例中，给药前24小时对小鼠背部皮肤进行刮毛，这样有足够的时间让皮肤角质层从可能受到的刮伤中恢复过来，在实验开始之前用PBS润湿皮肤。然后将本发明纳米颗粒样品局部用药到皮肤上，过24小时后除去药物，并用PBS清洗润湿。如图29所示，本发明纳米颗粒处理过的皮肤保持了正常结构，未出现红斑或水肿。所述纳米颗粒处理过的皮肤结构与阴性对照，即空白PBS凝胶处理过的皮肤结构相似。根据Draize的皮肤刺激打分系统，本发明纳米颗粒处理过的皮肤红斑和水肿打分均为0分，表明并未出现明显的皮肤刺激。采集皮肤活检样品，并用苏木精和伊红(H&E)染色进行组织学检测和分析，结果显示(图29，下行)本发明纳米颗粒处理过的皮肤结构完好，真皮层上带有一层健康的表皮细胞，与PBS处理的结果相同。这一结果进一步确认了本发明纳米颗粒的使用安全性。
实施例6.本发明纳米颗粒的人体测试
招募98名志愿者使用本发明纳米颗粒(1％w/v月桂酸)的凝胶，这些志愿者都患有不同阶段的痤疮感染。凝胶每天使用两次，连续使用3周。在第3、7和21天收集使用者的反馈结果。统计结果表明在第3、7和21天，正面肯定本发明纳米颗粒的凝胶有效果的比率分别为72.4％、82.7％和90.8％(图30)。志愿者提供的反馈结果表明，本发明的纳米颗粒能够有效减少或清除痤疮丙酸杆菌导致的痤疮感染。
实施例7.脂肪酸在水性体系中的抗菌作用
本发明人进一步测试了水性体系中的本发明纳米颗粒以及游离脂肪酸的抗菌作用。
结果如图34-36所示，在水性体系中(PBS)，包含亚麻酸的本发明纳米颗粒能够显著杀灭MRSA，而游离的亚麻酸在水性体系中几乎没有杀菌作用；
包含月桂酸的本发明纳米颗粒能够显著杀灭痤疮丙酸杆菌，而游离的月桂酸在水性体系中几乎没有杀菌作用；
相同浓度的肉豆蔻油酸的游离形式并不显示针对幽门螺旋杆菌的杀菌活性，而本发明纳米颗粒形式的肉豆蔻油酸显示出针对幽门螺旋杆菌的杀菌活性。
这证明，只有将游离的脂肪酸制备成本发明的纳米颗粒形式，脂肪酸才能发挥其抗菌作用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (18)

1.一种非囊泡型纳米颗粒，所述颗粒由脂肪酸、表面活性剂以及任选的脂质构成；
所述的纳米颗粒的粒径为5-25 nm；
所述脂肪酸是亚麻酸、月桂酸、肉豆蔻油酸；
所述脂肪酸的浓度为0 .3~2%w/v；
所述脂质和表面活性剂的质量比为2: 1；
所述纳米颗粒由以下方法制备，所述方法包括：
1). 将表面活性剂和任选的脂质的混合物以5%w/v的浓度悬浮在水中；
2). 搅拌1)得到的悬浮液直至形成均相悬浮液；
3). 加热2)得到的均相悬浮液到其所含表面活性剂和任选的脂质的熔点以上；
4). 将脂肪酸加入3)得到的热悬浮液中并搅拌；
5). 降温，静置4)得到的悬浮液，从而得到所述的非囊泡型纳米颗粒悬浮液；
所述表面活性剂选自以下的一种或多种：吐温20和吐温80；
所述脂质为重量比为9: 1的蛋黄卵磷脂和胆固醇。
2.如权利要求1所述的非囊泡型纳米颗粒，其特征在于，所述的纳米颗粒的粒径为5-10nm。
3.如权利要求1或2所述的非囊泡型纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒的多分散性系数为<0.3。
4.如权利要求3所述的非囊泡型纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒的多分散性系数为<0.2。
5.如权利要求1或2所述的非囊泡型纳米颗粒，其特征在于，所述非囊泡型纳米颗粒的稳定性为：
在室温～37℃下储存3个月后，与新鲜制备的纳米颗粒相比，所述纳米颗粒的“最小抑菌浓度”与“最小杀菌浓度”值的改变小于20%；或者，
在室温下储存3个月后，与新鲜制备的纳米颗粒相比，所述纳米颗粒的粒径改变小于20%。
6.如权利要求5所述的非囊泡型纳米颗粒，其特征在于，所述非囊泡型纳米颗粒的稳定性为：
在室温～37℃下储存3个月后，与新鲜制备的纳米颗粒相比，所述纳米颗粒的“最小抑菌浓度”与“最小杀菌浓度”值的改变小于10%；或者，
在室温下储存3个月后，与新鲜制备的纳米颗粒相比，所述纳米颗粒的粒径改变小于15%。
7.如权利要求6所述的非囊泡型纳米颗粒，其特征在于，所述非囊泡型纳米颗粒的稳定性为：
在室温下储存3个月后，与新鲜制备的纳米颗粒相比，所述纳米颗粒的粒径改变小于10%。
8.权利要求1-7中任一项所述的非囊泡型纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
1). 将表面活性剂和任选的脂质的混合物以5%w/v的浓度悬浮在水中；
2). 搅拌1)得到的悬浮液直至形成均相悬浮液；
3). 加热2)得到的均相悬浮液到其所含表面活性剂和任选的脂质的熔点以上；
4). 将脂肪酸加入3)得到的热悬浮液中并搅拌；
5). 降温，静置4)得到的悬浮液，从而得到权利要求1-7中任一项所述的非囊泡型纳米颗粒。
9.一种药物组合物，其包含权利要求1-7中任一项所述的非囊泡型纳米颗粒以及任选的药学上可接受的载体。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还可包含其它抗生素。
11.如权利要求9或10所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物是水性药物组合物。
12.权利要求1-7中任一项所述的纳米颗粒或权利要求9-11中任一项所述的药物组合物在制备抗微生物试剂中的用途。
13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述微生物包括：细菌、真菌。
14.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述细菌包括：革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌。
15.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述革兰氏阳性菌包括：葡萄球菌(Staphylococcus)；丙酸杆菌 (Propionibacterium)；和
所述革兰氏阴性菌包括：幽门螺旋杆菌 (Helicobacter Pylori)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)。
16.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述革兰氏阳性菌是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudennreichii)、痤疮丙酸杆菌 (Propionibacterium acnes)、卵白丙酸杆菌 (Propionibacterium avidum)、颗粒丙酸杆菌 (Propionibacteriumgranulosum)；和
所述革兰氏阴性菌是幽门螺旋杆菌。
17.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述革兰氏阳性菌是甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌 (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)。
18.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述真菌包括：白色念珠菌(Canidia albicans)、红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)、黄癣菌(Mycelium yellow ringworm)。
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