CN110146702A - 一种检测传染性喉气管炎病毒的试纸条，制备方法，检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测传染性喉气管炎病毒的试纸条，制备方法，检测方法及试剂盒，涉及传染性喉气管炎病毒检测技术领域，具体包括底板以及与底板上边缘粘结的吸水材料，在底板上表面沿层析方向依次铺设有样品垫，胶体金结合垫和预先点有T线和C线的硝酸纤维素膜，且硝酸纤维素膜的上边缘与吸水材料的下边缘搭接，硝酸纤维素膜的下边缘与胶体金结合垫的上边缘粘结，胶体金结合垫的下边缘与样品垫的上边缘粘结，T线上包被有传染性喉气管炎病毒单克隆抗体。该试纸条检测传染性喉气管炎病毒特异性高，重复性好，灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及传染性喉气管炎病毒检测技术领域，具体而言，涉及一种检测传染性喉气管炎病毒的试纸条，制备方法，检测方法及试剂盒。
背景技术
目前，鸡传染性喉气管炎(AILT)是由传染性喉气管炎病毒(infectiouslaryngotracheitis virus，ILTV)引起的一种急性、接触性上呼吸道传染病，该病传播速度快。自1925年在美国洛岛发现该病以来，现已遍及世界各地养鸡区域。该病的主要病变在喉部和气管组织，临床特征为呼吸困难、咳嗽、咳出带血样的渗出物。易感鸡群一旦感染此病，传播迅速，感染率达90％以上，病死率平均在10％～20％，蛋鸡感染后产蛋量下降，给养鸡业造成很大的经济损失。该病的临诊症状和病理变化易与其他病毒引起的疾病如传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus，IBV)、新城疫病毒(newcastle diseasevirus，NDV)等相混淆，容易发生误诊，给临床诊断带来一定的困难，因此通常需要借助实验室方法加以确诊，而实验室方法确诊时间长，不利于实际生产中的快速检测。
免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique)是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域，具有方便快捷，低成本、应用范围广等优势。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种检测传染性喉气管炎病毒的试纸条。该试纸条可以利用胶体金免疫层析法快速检测传染性喉气管炎病毒。
本发明的第二目的在于提供一种检测传染性喉气管炎病毒的试纸条的制备方法。
本发明的第三目的在于提供一种试纸条检测传染性喉气管炎病毒的方法，该检测方法特异性高，重复性好，灵敏度高。
本发明的第四目的在于提供一种传染性喉气管炎病毒检测试剂盒，该检测试剂盒具有操作方便、检测样本范围广、检测速度快、灵敏度高的优势。
本发明是这样实现的：
一种检测传染性喉气管炎病毒的试纸条，包括底板以及与底板上边缘粘结的吸水材料，在底板上表面沿层析方向依次铺设有样品垫，胶体金结合垫和预先点有T线和C线的硝酸纤维素膜，且硝酸纤维素膜的上边缘与吸水材料的下边缘搭接，硝酸纤维素膜的下边缘与胶体金结合垫的上边缘粘结，胶体金结合垫的下边缘与样品垫的上边缘粘结，T线上包被有传染性喉气管炎病毒单克隆抗体。
在本发明应用较佳的实施例中，上述胶体金结合垫上添加有胶体金－传染性喉气管炎病毒单克隆抗体结合物，胶体金－传染性喉气管炎病毒单克隆抗体结合物为胶体金－传染性喉气管炎病毒单克隆抗体结合物的稀释液，稀释比例为1：3－4.2，传染性喉气管炎病毒单克隆抗体稳定1mL胶体金所需的最小抗体量为10ug/ml；
优选的，稀释比例为1：4。
在本发明应用较佳的实施例中，上述T线上传染性喉气管炎病毒单克隆抗体的添加量为36－51ug，C线上包被有X抗鼠IgG抗体，X为羊，兔，猪，马和猴中的任意一种，X抗鼠IgG抗体的添加量为24－30ug；
优选的，T线上传染性喉气管炎病毒单克隆抗体的添加量为45ug，C线上包被有羊抗鼠IgG抗体，羊抗鼠IgG抗体的添加量为30ug。
在本发明应用较佳的实施例中，上述硝酸纤维素膜为Millipore HF135，WhatmanImmunopore PR，Whatman PRIMA40和赛多利斯CN140中的任意一种；
优选的，硝酸纤维素膜为赛多利斯CN140。
一种检测传染性喉气管炎病毒的试纸条的制备方法，包括如下步骤：
(1)提供吸水材料、预先点有T线和C线的硝酸纤维素膜、胶体金结合垫和样品垫；
(2)将吸水材料、硝酸纤维素膜、胶体金结合垫以及样品垫依次铺设在底板上，以形成检测试纸条大板。
在本发明应用较佳的实施例中，上述制备预先点有T线和C线的硝酸纤维素膜具体包括如下步骤：先用PBS将传染性喉气管炎病毒单抗和X抗鼠IgG抗体分别稀释至1.2－1.7mg/ml和0.8－1.1mg/ml，然后在硝酸纤维素膜上以1ul/cm的点样量喷涂传染性喉气管炎病毒单抗作为T线，以1ul/cm的点样量喷涂X抗鼠IgG抗体作为C线，同时保证T线与C线的距离为0.5－0.8cm；
优选的，T线与C线的距离为0.5cm。
在本发明应用较佳的实施例中，上述制备方法还包括胶体金结合垫的制备，具体包括用胶体金在pH为8.0-8.1的条件下标记传染性喉气管炎病毒单克隆抗体；
优选的，胶体金在pH为8.0的条件下标记传染性喉气管炎病毒单克隆抗体。
一种使用试纸条检测传染性喉气管炎病毒的方法，包括如下步骤：在样品垫上加入20－100ul待检样本，在加样5－10min后观察显色结果。
在本发明应用较佳的实施例中，上述待检样本为血清，血浆，细胞培养物上清，尿液，动物组织裂解液和植物组织裂解液中的任意一种。
一种传染性喉气管炎病毒检测试剂盒，包括试纸条，检测试剂盒的检测限为100ng/ml。
本发明具有以下有益效果：
本发明通过提供一种检测传染性喉气管炎病毒的试纸条及其制备方法和检测方法，该试纸条检测样本范围广，检测速度快，灵敏度高，特异性强，有利于在传染性喉气管炎病毒爆发初期进行有效防控。另外，本发明提供的试纸条操作难度小，对操作人员专业水平要求低，特异性高，避免了误诊现象的发生。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为检测试纸条的结构示意图；
图2为检测试纸条的结果判定图(图2a为阳性对照，图2b为阴性对照，图2c和图2d为无效试纸条)；
图3为检测试纸条的特异性实验结果图(图3a为5000ng/ml，图3b为500ng/ml，图3c为50ng/ml，图3d为PBS阴性对照)；
图4为检测试纸条的重复性实验结果图(图4a-d为不同批次的样品，图4e和图4f为阴性PBS对照组)。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本发明提供了一种检测传染性喉气管炎病毒的试纸条。参照图1所示，包括底板以及与底板上边缘粘结的吸水材料。本实施例中，底板优选为PVC胶板，在底板上表面沿层析方向依次铺设有样品垫，胶体金结合垫和预先点有T线和C线的硝酸纤维素膜，且硝酸纤维素膜的上边缘与吸水材料的下边缘搭接，硝酸纤维素膜的下边缘与胶体金结合垫的上边缘粘结，胶体金结合垫的下边缘与样品垫的上边缘粘结，T线上包被有传染性喉气管炎病毒单克隆抗体。图1中的检测线T和质控线C分别代表T线和C线。
进一步地，在制备检测传染性喉气管炎病毒的试纸条时，需要确定如下参数：抗体标记的最适pH，抗体最适标记量，胶体金结合垫上工作液的浓度，硝酸纤维素膜的类型，T线和C线的最适检测条件。
制备检测传染性喉气管炎病毒的试纸条，具体包括如下步骤：
(1)抗体标记最适pH的确定。
传染性喉气管炎病毒单克隆抗体自主研发。用质量体积分数为0.02％，粒径为20nm胶体金标记传染性喉气管炎病毒单克隆抗体2D41D7(简称单抗1)，用胶体金梯度法确定抗体与胶体金结合的最适pH值。具体操作步骤如下：
取若干小玻璃试管，分别加入1ml制备好的胶体金溶液；用0.2mol/L碳酸钾溶液将胶体金溶液的pH分别调为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5；取50ul 1mg/ml的传染性喉气管炎病毒单抗1分别加入上述含有胶体金的试管中，混匀后室温放置20min；然后向每管分别加入100ul 10％NaCl溶液，混匀，室温静置1-2h；观察胶体金颜色变化，记录保持红色的最低pH；再将pH调为梯度最低pH±0.1；重复上述试验。记录仍保持红色的最低PH，即为最适PH。
经胶体金梯度法试验确定传染性喉气管炎病毒单抗1与胶体金结合的最适PH为8.0。
(2)在胶体金上标记抗体的最适标记量的选择。
采用蛋白梯度法确定传染性喉气管炎病毒单抗1与胶体金结合的最适浓度。具体操作步骤如下：
选取若干支小玻璃试管，分别加入1ml调到最适PH为8.0的胶体金溶液；将传染性喉气管炎病毒单抗1用纯化水稀释成1mg/ml，分别吸取0、5、10、20、30、40、60、80ul的传染性喉气管炎病毒单抗1稀释液，按顺序加入上述盛有胶体金溶液的小试管中，混匀；放置10min后，在每个小试管中加入10％NaCl水溶液0.1ml，混匀，室温静置1-2h，观察小试管颜色变化。
空白对照组由于加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的试管，呈现由红变蓝的聚沉现象。而当试管中加入的蛋白量达到或超过最低稳定量则保持红色不变，找出胶体金液由红变蓝的交界管，其所含的蛋白量即为稳定1ml胶体金所需的最小蛋白量。实际胶体金探针制备工作中，胶体金中加入的抗体量往往为最小蛋白量的120％-130％。
经蛋白梯度法试验显示，传染性喉气管炎病毒单抗1稳定1ml胶体金所需的最小抗体量为10ug/ml。
(3)制备胶体金探针。
取200ug的传染性喉气管炎病毒单抗1加入20mL最适pH的胶体金溶液中，室温下搅拌30min，制得胶体金-抗体结合物溶液。再取2ml 10％的BSA溶液加入制得的胶体金-抗体结合物溶液中(BSA的终浓度为0.4％)，室温搅拌10min；或者在胶体金-抗体结合物溶液中加入10％的聚乙二醇0.2ml，室温搅拌10min。将上述搅拌后的溶液在11000r/min离心40min，弃上清，沉淀溶于2ml胶体金－抗体保存液中，并用0.45um滤膜过滤，所得即为胶体金－抗体结合物原液。
在1ml胶体金－抗体结合物原液中加入10％NaCl水溶液1ml后，溶液仍为无沉淀的紫红色液体，说明制得的胶体金－抗体结合物原液具有良好的稳定性。
(4)胶体金－抗体结合物原液工作浓度的确定和胶体金结合垫的制备。
用工作液将胶体金－抗体结合物原液分别按1:2、1:4、1:8、1:16进行稀释，取1.4ml胶体金－抗体结合物稀释液，均匀地加在玻璃纤维膜上，置37℃烤干，即制得胶体金结合垫，测试后确定胶体金标记抗体的最适工作浓度。
经试验测试结果显示，当胶体金－抗体结合物原液的工作稀释浓度为1:4时，制得的金标垫检测效果最佳。
(5)硝酸纤维素膜的型号确定。
选择Millipore HF135，Whatman Immunopore PR，Whatman PRIMA40和赛多利斯CN140作为硝酸纤维素膜，通过跑板功能测试、胶体金溶液在不同型号硝酸纤维素膜上流动性、滞后度和背景残留的测试和硝酸纤维素膜的重新选择测试等试验，确定最适型号的硝酸纤维素膜为赛多利斯CN140。
(6)T线及C线的最适检测条件。
将硝酸纤维素膜上T线及C线的包被抗体均设置如下几个浓度梯度：1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml，选择显色效果最优的一组作为传染性喉气管炎病毒单克隆抗体1D8 1G3(简称单抗2)使用浓度(T线)和羊抗鼠IgG抗体使用浓度(C线)。
试验结果表明，检测显色效果最优的一组为：传染性喉气管炎病毒单抗2(T线上)工作浓度为1.5mg/ml，羊抗鼠IgG抗体(C线上)工作浓度为1mg/ml。
(7)使用划膜机在硝酸纤维素膜上点T线和C线。
具体使用浓度为0.01mol/L PH为8.0的PBS将传染性喉气管炎病毒单抗2和羊抗鼠IgG抗体分别稀释至1.5mg/ml和1mg/ml，用划膜机在硝酸纤维素膜上点膜。T线与C线的距离为0.5cm，以1ul/cm的点样量喷涂羊抗鼠IgG抗体作为C线，以1ul/cm的点样量喷涂传染性喉气管炎病毒单抗2作为T线，将喷好的硝酸纤维素膜置于37℃烤干，干燥8h以上。
(8)准备PVC底板、吸水材料、步骤(7)中的硝酸纤维素膜、步骤(4)中的胶体金结合垫和样品垫，参照图1所示，在PVC底板中间粘贴硝酸纤维素膜，使硝酸纤维素膜的上边缘保持于PVC底板的上边缘1.5cm的距离，在硝酸纤维素膜的下边缘粘贴胶体金结合垫，使胶体金结合垫与硝酸纤维素膜重叠0.1cm，然后在胶体金结合垫的下边缘粘贴1.7cm宽的样品垫，使样品垫与胶体金结合垫重叠0.1cm。最后在硝酸纤维素膜的上边缘(靠近硝酸纤维素膜的C线端)粘贴1.7cm款的吸水材料，并使吸水材料与硝酸纤维素膜的上边缘重叠0.2cm，制得试纸条大板。将试纸条大板裁切成2.8mm宽，6cm长的试纸条。
实施例2
本实施例提供了传染性喉气管炎病毒检测试纸条的结果判定方法。
随机抽取试纸条，对标准传染性喉气管炎病毒阴性样品(样本稀释液)和标准传染性喉气管炎病毒阳性样品进行检测，检测结果参照图2所示。图2结果显示，阴性样品(图2b)仅在C线出现一条玫瑰红线；而标准传染性喉气管炎病毒阳性样品(图2a)出现T线和C线2条玫瑰红线。
本发明提供的传染性喉气管炎病毒检测试纸条的结果判定原理为：当加入待测样品至样品垫上后，样品在层析的作用下进入胶体金结合垫中，若待测样品感染有传染性喉气管炎病毒，则待测样品中的传染性喉气管炎病毒特异性被胶体金结合垫中的胶体金标记的抗体识别，形成传染性喉气管炎病毒-抗体-胶体金复合物，复合物沿层析方向继续向前泳动至硝酸纤维素膜上，抗原与检测T线上配对抗体结合，形成T线配对抗体-传染性喉气管炎病毒-抗体-胶体金复合物，当胶体金在T线配体处大量聚集时，在T线上肉眼可见红色或粉红色斑点，从而实现抗原的检测识别。过量的样品溶液将胶体金结合垫上的抗体迅速泳动至C线上，使胶体金结合垫上的抗体与C线上包被的羊抗鼠抗体特异性结合聚集，从而C线也呈红色或粉红色斑点。
若样品没有感染传染性喉气管炎病毒，不含传染性喉气管炎病毒抗原，则当样品从样品垫上进入胶体金结合垫，样品由于不携带抗原，因此不与胶体金结合垫和T线上的抗体结合，在层析的作用下前行至C线，仅在C线显色。
因此，由图2可知，本申请制备的试纸条有效。若C线不显色，无论T线是否显色，都判断试纸条无效。
实施例3
本实施例提供了检测传染性喉气管炎病毒的灵敏度试验。使用样本稀释液50ng/ml，500ng/ml，5000ng/ml代替样本原液，使用PBS液作为阴性对照，对实施例1中的试纸条进行特异性测定。测定结果参照图3所示，由图3c，3d可得，阴性对照和50ng/ml的样本稀释液仅在C线出现1条玫瑰红线，由图3a，3b可得，500ng/ml，5000ng/ml的样本稀释液出现T线、C线2条玫瑰红线。因此，根据病毒的总蛋白浓度判断本发明提供的检测试纸条检测灵敏度为100ng/ml。
实施例4
本实施例提供了检测传染性喉气管炎病毒的重复性试验。取实施例1中的检测试纸条检测5份不同批次的样品和5份同批次的样品，每个样品重复检测10次，检测结果完全一致，不同批次间、同一批次内检测结果趋势一致，检测部分结果参照图4所示，由图4a，4b，4c，4d，4e和4f可知，本发明提供的检测试纸条重复性好。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种检测传染性喉气管炎病毒的试纸条，其特征在于，包括底板以及与底板上边缘粘结的吸水材料，在所述底板上表面沿层析方向依次铺设有样品垫，胶体金结合垫和预先点有T线和C线的硝酸纤维素膜，且所述硝酸纤维素膜的上边缘与所述吸水材料的下边缘搭接，所述硝酸纤维素膜的下边缘与所述胶体金结合垫的上边缘粘结，所述胶体金结合垫的下边缘与所述样品垫的上边缘粘结，所述T线上包被有传染性喉气管炎病毒单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的检测传染性喉气管炎病毒的试纸条，其特征在于，所述胶体金结合垫上添加有胶体金－传染性喉气管炎病毒单克隆抗体结合物，优选的，所述胶体金－传染性喉气管炎病毒单克隆抗体结合物为胶体金－传染性喉气管炎病毒单克隆抗体结合物的稀释液，所述胶体金－传染性喉气管炎病毒单克隆抗体结合物的稀释比例为1：3－4.2，单位体积胶体金标记所述传染性喉气管炎病毒单克隆抗体的最低量为10ug；
优选的，所述稀释比例为1：4。
3.根据权利要求1所述的检测传染性喉气管炎病毒的试纸条，其特征在于，所述T线上传染性喉气管炎病毒单克隆抗体的添加量为36－51ug，所述C线上包被有X抗鼠IgG抗体，所述X为羊，兔，猪，马和猴中的任意一种，所述X抗鼠IgG抗体的添加量为24－30ug；
优选的，所述T线上传染性喉气管炎病毒单克隆抗体的添加量为45ug，所述C线上包被有羊抗鼠IgG抗体，所述羊抗鼠IgG抗体的添加量为30ug。
4.根据权利要求1所述的检测传染性喉气管炎病毒的试纸条，其特征在于，所述硝酸纤维素膜为Millipore HF135，Whatman Immunopore PR，Whatman PRIMA40和赛多利斯CN140中的任意一种；
优选的，所述硝酸纤维素膜为赛多利斯CN140。
5.一种如权利要求1-4任一项所述的检测传染性喉气管炎病毒的试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提供吸水材料、预先点有T线和C线的硝酸纤维素膜、胶体金结合垫和样品垫，所述T线上预先包被有传染性喉气管炎病毒单克隆抗体；
(2)将所述吸水材料、所述硝酸纤维素膜、所述胶体金结合垫以及所述样品垫依次铺设在底板上，使所述硝酸纤维素膜的上边缘与所述吸水材料的下边缘搭接，所述硝酸纤维素膜的下边缘与所述胶体金结合垫的上边缘粘结，所述胶体金结合垫的下边缘与所述样品垫的上边缘粘结，以形成检测试纸条大板。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，制备所述预先点有T线和C线的硝酸纤维素膜具体包括如下步骤：先用PBS将传染性喉气管炎病毒单抗和X抗鼠IgG抗体分别稀释至1.2－1.7mg/ml和0.8－1.1mg/ml，然后在硝酸纤维素膜上以1ul/cm的点样量喷涂传染性喉气管炎病毒单抗作为T线，以1ul/cm的点样量喷涂X抗鼠IgG抗体作为C线，同时保证T线与C线的距离为0.5－0.8cm；
优选的，所述T线与C线的距离为0.5cm。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，还包括胶体金结合垫的制备，具体包括用胶体金在pH为8.0-8.1的条件下标记传染性喉气管炎病毒单克隆抗体；
优选的，胶体金在pH为8.0的条件下标记传染性喉气管炎病毒单克隆抗体。
8.一种使用如权利要求1-4任一项所述的试纸条检测传染性喉气管炎病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：在样品垫上加入待检样本20－100ul，在加样5－10min后观察显色结果。
9.根据权利要求8所述的试纸条检测传染性喉气管炎病毒的方法，其特征在于，所述待检样本为血清，血浆，细胞培养物上清，尿液，动物组织裂解液和植物组织裂解液中的任意一种。
10.一种传染性喉气管炎病毒检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的试纸条，所述检测试剂盒的检测限为100ng/ml。
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