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CN109069605A - 新免疫原性CD1d结合肽 - Google Patents

新免疫原性CD1d结合肽 Download PDF

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CN109069605A CN201780024518.0A CN201780024518A CN109069605A CN 109069605 A CN109069605 A CN 109069605A CN 201780024518 A CN201780024518 A CN 201780024518A CN 109069605 A CN109069605 A CN 109069605A
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Abstract

本发明涉及分离的免疫原性肽，其包含CD1d结合肽以及与所述CD1d结合肽直接相邻或相隔的氧化还原基序序列，该氧化还原基序序列进一步侧接组氨酸或色氨酸氨基酸。本发明进一步涉及这些肽用作药物。本发明还涉及将这些肽用于生产NKT细胞的方法，该NKT细胞对于呈递同源抗原的细胞是溶细胞的。

Description

新免疫原性CD1d结合肽
技术领域
本发明涉及免疫原性肽。该肽用于体外和体内系统以产生抗原特异性溶细胞的NKT细胞。该肽以及通过这些肽获得的细胞被用作用于多种病症的药学活性肽，该病症包括自身免疫性疾病诸如多发性硬化症。
背景技术
WO2012069568公开了一类新型肽，其包含抗原的CD1d结合肽和氧化还原基序序列。
Fomenko et al.(2003)Biochemistry 42,11214-11225已经综述了氧化还原基序序列。氧化还原基序序列的不同替代物是C-(X)2-C[SEQ ID NO:13]、C-(X)2-S[SEQ ID NO:14、C-(X)2-T[SEQ ID NO:15]、S-(X)2-C[SEQ ID NO:16]和T-(X)2-C[SEQ ID NO:17]。关于氧化还原基序序列的其它现有技术评论了氧化还原基序序列内组氨酸的相关性[Kortemmeet al.(1996)Biochemistry 35,14503-14511]。
WO2012069568解释称，CD1d结合肽表位与氧化还原基序序列在肽中彼此接近的组合提供了之前未被识别的特性。即，这些肽具有引发抗原特异性NKT细胞群的能力，该抗原特异性NKT细胞特异性地杀死呈递抗原的抗原呈递细胞，该抗原包含存在于该肽中的CD1d结合肽表位。
因此，这些肽可用于在非常早期阶段(即在抗原呈递水平处)阻断免疫应答。WO2012/069568证明了这些肽的医学用途。后来，Carlier et al.(2012)Plos one 7,10e45366中公布了该发明的构思。
该出版物讨论了氧化还原基序序列的类型以及氧化还原基序和CD1d表位序列之间的间隔。尚未报道在肽中可为肽提供改进性质的其它决定簇。
发明内容
引言中提到的4种氨基酸氧化还原基序序列的不同替代物也可以写成[CST]-X(2)-C[SEQ ID NO:54]或C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:55]。本发明揭示，紧邻基序的外侧(基序的N末端(位置-1)或基序的C末端(位置5))存在附加的组氨酸或色氨酸氨基酸提高了氧化还原基序的稳定性。因此，本发明涉及具有一般结构[HW]-C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:1]或[CST]-X(2)-C-[HW][SEQ ID NO:4]的经修饰的氧化还原基序。
利用这种改进的稳定性，肽的特定还原活性增加，使得例如与其中不存在附加组氨酸或色氨酸的肽相比，可以使用更少的肽或减少注射的次数。
第一方面涉及用作药物的12至100个氨基酸的分离的免疫原性肽a，其包含抗原的CD1d结合肽表位、以及与该表位直接相邻或相隔至多7个氨基酸[HW]-X(0,2)-C-X(2)-[CST]([SEQ ID NO:1]、[SEQ ID NO:2]、[SEQ ID NO:3])或[CST]-X(2)-C-X(0,2)-[HW]([SEQ ID NO:4]、[SEQ ID NO:5]、[SEQ ID NO:6])的氧化还原基序序列。
在某些实施方式中，所述抗原在其序列中在所述表位的10个氨基酸距离内不含所述基序，或甚至在其序列中不含所述基序。
在特定的实施方式中，该基序是H-X-C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:56]、[CST]-X(2)-C-X-H[SEQ ID NO:57]、[CST]-X(2)-C-X-W[SEQ ID NO:58]或W-X-C-X(2)-[CST][SEQ IDNO:59]。
在其它实施方式中，该基序是[HW]-X(0,2)-C-X(2)-C([SEQ ID NO:7]、[SEQ IDNO:8]、[SEQ ID NO:9])或C-X(2)-C-X(0,2)-[HW]([SEQ ID NO:10]、[SEQ ID N0:11]、[SEQID NO:12])。
在另外其它实施方式中，该基序是[HW]-C-X(2)-C[SEQ ID NO:7]或C-X(2)-C-[HW][SEQ ID NO:10]，即H-C-X(2)-C[SEQ ID NO:48]、C-X(2)-C-H[SEQ ID NO:42]、W-C-X(2)-C[SEQ ID NO:51]或C-X(2)-C-W[SEQ ID NO:45]。
在特定实施方式中，该肽具有在12个至75个之间的氨基酸，在12至50个之间的氨基酸，或在12个至30个之间的氨基酸的长度。
该CD1d结合肽可以与所述基序相隔至多4个氨基酸的序列，例如相隔2个氨基酸的序列。
在特定实施方式中，其中氧化还原基序内的X是Gly或Pro，或者氧化还原基序内的X不是Cys。
在其它特定实施方式中，氧化还原基序外侧的X不是Cys、Ser或Thr。
另一方面涉及12至100个氨基酸的分离的免疫原性肽，其包含抗原的CD1d结合肽、以及与所述表位直接相邻或相隔至多7个氨基酸[HW]-X(0,2)-C-X(2)-[CST]([SEQ ID NO:1]、[SEQ ID NO:2],[SEQ ID NO:3])或[CST]-X(2)-C-X(0,2)-[HW]([SEQ ID NO:4]、[SEQID NO:5]、[SEQ ID NO:6])的氧化还原基序序列，条件是，所述抗原在其序列中在所述表位的10个氨基酸的距离内不含所述基序。
在某些实施方式中，该抗原在其序列中不含有所述基序。
基序的特定实施方式是[HW]-X-C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:2]、[CST]-X(2)-C-X-[HW][SEQ ID NO:5]、[HW]-C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:1]或[CST]-X(2)-C-[HW][SEQ IDNO:4]、[HW]-X(0,2)-C-X(2)-C([SEQ ID NO:7]、[SEQ ID NO:8]、[SEQ ID NO:9])、C-X(2)-C-X(0,2)-[HW]([SEQ ID NO:10]、[SEQ ID NO:11]、[SEQ ID NO:12])[HW]-C-X(2)-C[SEQID NO:7]或C-X(2)-C-[HW][SEQ ID NO:10]。
在肽的特定实施方式中，如果所述基序是[HW]-X(0,2)-C-X(2)-[CST]([SEQ IDNO:1]、[SEQ ID NO:2]、[SEQ ID NO:3])，则该基序位于肽内的CD1d结合肽表位的N末端，并且其中，如果所述基序是[CST]-X(2)-C-X(0,2)-[HW]([SEQ ID NO:4]、[SEQ ID NO:5]、[SEQ ID NO:6])，则该基序位于CD1d结合肽表位的C末端。
该基序可以位于CD1d结合肽表位的N末端。该肽可以具有在12个至75个之间的氨基酸，在12个至50个之间的氨基酸，在12个至30个之间的氨基酸的长度。
在特定的实施方式中，CD1d结合肽与所述基序相隔至多4个氨基酸的序列，或者与所述基序相隔2个氨基酸的序列。
在特定的实施方式中，氧化还原基序内的X是Gly或Pro，或者氧化还原基序内的X不是Cys。
在特定的实施方式中，氧化还原基序外侧的X不是Cys、Ser或Thr。
另一方面是治疗或预防方法，其包含给药有效量的12至100个氨基酸的免疫原性肽的步骤，该免疫原性肽包含抗原的CD1d结合肽、以及与所述表位直接相邻或相隔至多7个氨基酸[HW]-X(0,2)-C-X(2)-[CST]([SEQ ID NO:1]、[SEQ ID NO:2]、[SEQ ID NO:3])或[CST]-X(2)-C-X(0,2)-[HW]([SEQ ID NO:4]、[SEQ ID NO:5]、[SEQ ID NO:6])的氧化还原基序序列。
本发明的另一方面涉及上述a用于产生抗原特异性NKT细胞的体外用途。
另一方面涉及一种用于获得NKT细胞群的方法，该NKT细胞群相对于呈递抗原的细胞是溶细胞的，该方法包括以下步骤：提供外周血细胞；使所述细胞在体外与12至100个氨基酸的免疫原性肽接触，该免疫原性肽包含抗原的CD1d结合肽、以及与所述表位直接相邻或相隔至多7个氨基酸[HW]-X(0,2)-C-X(2)-[CST]([SEQ ID NO:1]、[SEQ ID NO:2]、[SEQID NO:3])或[CST]-X(2)-C-X(0,2)-[HW]([SEQ ID NO:4]、[SEQ ID NO:5]、[SEQ ID NO:6])的氧化还原基序序列；和在IL-2存在下扩增所述细胞。
另一方面涉及可通过上述方法获得的细胞群，其用作药物。
另一方面涉及治疗和预防方法，包括给药有效量的如上所述的细胞的步骤。
本发明涉及一种用作药物的12至100个氨基酸的分离的免疫原性肽，其包含：具有[FWYHT]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWYHT][SEQ ID NO:60]序列基序的抗原的CD1d结合肽表位，以及与所述表位直接相邻或相隔至多7个氨基酸[HW]-X(0,2)-C-X(2)-[CST]([SEQ ID NO:1]、[SEQ ID NO:2]、[SEQ ID NO:3])或[CST]-X(2)-C-X(0,2)-[HW]([SEQ ID NO:4]、[SEQID NO:5]、[SEQ ID NO:6])的氧化还原基序序列，条件是所述肽在其序列中不含有MHC II类T细胞表位。
在其实施方式中，所述抗原在其序列中在所述表位的10个氨基酸的距离内不含有所述CD1d结合肽基序。
在其实施方式中，其中该CD1d结合肽序列基序是[FWY]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWY][SEQ ID NO:63]。
在其实施方式中，该氧化还原基序是[HW]-X-C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:2]或[CST]-X(2)-C-X-[HW][SEQ ID NO:5]。
在其实施方式中，该氧化还原基序是[HW]-C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:1]或[CST]-X(2)-C-[HW][SEQ ID NO:4]。
在其实施方式中，该氧化还原基序是H-C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:101]或[CST]-X(2)-C-H[SEQ ID NO:102]。
在其实施方式中，该氧化还原基序是[HW]-X(0,2)-C-X(2)-C([SEQ ID NO:7]、[SEQ ID NO:8],[SEQ ID NO:9])或C-X(2)-C-X(0,2)-[HW]([SEQ ID NO:10]、[SEQ ID NO:11]、[SEQ ID NO:12])。
在其实施方式中，该氧化还原基序是[HW]-C-X(2)-C[SEQ ID NO:7]或C-X(2)-C-[HW][SEQ ID NO:10]。
在其实施方式中，该氧化还原基序是H-C-X(2)-C[SEQ ID NO:48]或C-X(2)-C-H[SEQ ID NO:42]。
在其实施方式中，所述肽具有在12个至50个之间的氨基酸的长度。
在其实施方式中，该氧化还原基序内的X是Gly或Pro，或者该氧化还原基序内的X不是Cys，或者该氧化还原基序外侧的X不是Cys、Ser或Thr。
本发明进一步涉及一种12至100个氨基酸的分离的免疫原性肽，其包含：具有[FWYHT]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWYHT][SEQ ID NO:60]序列基序的抗原的CD1d结合肽，和与所述表位直接相邻或相隔至多7个氨基酸[HW]-X(0,2)-C-X(2)-[CST]([SEQ ID NO:1]、[SEQ ID NO:2]、[SEQ ID NO:3])或[CST]-X(2)-C-X(0,2)-[HW]([SEQ ID NO:4]、[SEQ IDNO:5]、[SEQ ID NO:6])的氧化还原基序序列，条件是所述肽在其序列中不含有MHC II类T细胞表位。
在其实施方式中，所述抗原在其序列中在所述氧化还原基序序列的10个氨基酸的距离内不含有所述CD1d结合肽基序。
在其实施方式中，所述抗原在其序列中不含有所述CD1d结合肽基序。
在其实施方式中，该氧化还原基序是[HW]-X-C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:2]或[CST]-X(2)-C-X-[HW][SEQ ID NO:5]。
在其实施方式中，该氧化还原基序序列是[HW]-C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:1]或[CST]-X(2)-C-[HW][SEQ ID NO:4]。
在其实施方式中，该氧化还原基序序列是H-C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:101]或[CST]-X(2)-C-H[SEQ ID NO:102]。
在其实施方式中
-如果所述氧化还原基序是[HW]-X(0,2)-C-X(2)-[CST]([SEQ ID NO:1]、[SEQ IDNO:2]、[SEQ ID NO:3])，则该氧化还原基序位于该肽内的CD1d结合肽表位的N末端，并且其中，
-如果所述氧化还原基序是[CST]-X(2)-C-X(0,2)-[HW]([SEQ ID NO:4]、[SEQ IDNO:5]、[SEQ ID NO:6])，则该氧化还原基序位于该肽内的CD1d结合肽表位的C末端。
在其实施方式中，该氧化还原基序是[HW]-X(0,2)-C-X(2)-C([SEQ ID NO:7]、[SEQ ID NO:8]、[SEQ ID NO:9])或C-X(2)-C-X(0,2)-[HW]([SEQ ID NO:10]、[SEQ ID NO:11]、[SEQ ID NO:12])。
在其实施方式中，该氧化还原基序是[HW]-C-X(2)-C[SEQ ID NO:7]或C-X(2)-C-[HW][SEQ ID NO:10]。
在其实施方式中，该氧化还原基序是H-C-X(2)-C[SEQ ID NO:48]或C-X(2)-C-H[SEQ ID NO:42]。
在其实施方式中，所述氧化还原基序位于CD1d结合肽表位的N末端。
在其实施方式中，所述肽具有在12个至50个之间的氨基酸的长度。
在其实施方式中，该氧化还原基序内的X是Gly或Pro，或者其中该氧化还原基序内的X不是Cys，或者其中该氧化还原基序外侧的X不是Cys、Ser或Thr。
本发明进一步涉及如上所述的肽在体外用于产生抗原特异性溶细胞的NKT细胞的用途。
本发明进一步涉及利用CD1d结合肽表位用于获得NKT细胞群，该NKT细胞群对于呈递抗原的细胞是溶细胞的，该方法包括以下步骤：
-提供外周血细胞；
-使所述细胞在体外与12至100个氨基酸的免疫原性肽接触，该免疫原性肽包含具有[FWYHT]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWYHT][SEQ ID NO:60]序列基序的抗原的CD1d结合肽表位、以及与所述表位直接相邻或相隔至多7个氨基酸[HW]-X(0,2)-C-X(2)-[CST]([SEQ IDNO:1]、[SEQ ID NO:2]、[SEQ ID NO:3])或[CST]-X(2)-C-X(0,2)-[HW]([SEQ ID NO:4]、[SEQ ID NO:5]、[SEQ ID NO:6])的氧化还原基序序列，其中所述肽在其序列中不含有MHCII类T细胞表位；和
-在IL-2存在下扩增所述细胞。
本发明还涉及可通过上述方法获得的细胞群，其用作药物。
本发明进一步涉及一种用于制备肽的方法，包括以下步骤：
-在抗原内识别具有[FWYHT]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWYHT][SEQ ID NO:60]序列基序的序列；
-制备12至100个氨基酸的肽，该肽包含上述识别的序列以及与其直接相邻或相隔至多7个氨基酸[HW]-X(0,2)-C-X(2)-[CST]([SEQ ID NO:1]、[SEQ ID NO:2]、[SEQ ID NO:3])或[CST]-X(2)-C-X(0,2)-[HW]([SEQ ID NO:4]、[SEQ ID NO:5]、[SEQ ID NO:6])的氧化还原基序序列，
条件是，所制备的序列在其序列中不含有MHC II类T细胞表位。
具体实施方式
定义
如本文所用的术语“肽”是指包含通过肽键连接的具有在2个至200个之间的氨基酸的氨基酸序列的分子，但其可以包含非氨基酸结构。根据本发明的肽可以含有任何常规的20种氨基酸或其修饰变体，或者可以含有通过化学肽合成或通过化学或酶修饰掺入的非天然存在的氨基酸。本文所用的术语“抗原”是指大分子的结构，通常是蛋白质(有或没有多糖)或由包含一个或多个半抗原并包含T细胞表位的蛋白质组合物制成。如在本文中所用的术语“抗原蛋白”是指包含一个或多个T细胞表位的蛋白质。如在本文中所用的“自身抗原”或“自身抗原蛋白”是指存在于体内的人类或动物蛋白，其在同一人体或动物体内引发免疫应答。
术语“食品或药物抗原蛋白”是指存在于食品或药品中的抗原蛋白，诸如存在于疫苗中的抗原蛋白。在本发明的上下文中，术语“T细胞表位”是指显性、亚显性或次要T细胞表位，即抗原蛋白的一部分，其被T淋巴细胞的细胞表面上的受体特异性识别并结合。表位是显性的、亚显性的或次要的取决于针对该表位引发的免疫应答。显性取决于T细胞在所有可能的蛋白T细胞表位中识别此种表位并能够激活它们的频率。
T细胞表位是由MHC II类分子识别的表位，其由8个或通常9个氨基酸的序列组成，其适合MHC II分子的凹槽。在代表T细胞表位的肽序列内，表位中的氨基酸被编号为P1至P9，表位N-末端的氨基酸被编号为P-1、P-2等，表位C末端的氨基酸被编号为P+1、P+2等。由MHC II类分子而非MHC I类分子识别的肽被称作为MHC II类限制性T细胞表位。识别MHC II类T细胞表位的方法如下所述。
术语“CD1d限制性NKT细胞肽表位”是指抗原蛋白的一部分，其被CD1d分子特异性结合、表达在细胞表面并且被NKT细胞识别。
CD1d限制性NKT细胞肽表位具有一般基序[FWYHT]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWYHT][SEQ ID NO:60]。该一般基序的替代变体在位置1和/或位置7处具有替代物[FWYH]，因此为[FWYH]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWYH][SEQ ID NO:61]。
该一般基序的替代变体在位置1和/或位置7具有替代物[FWYT]，为[FWYT]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWYT][SEQ ID NO:62]。该一般基序的替代变体在位置1和/或位置7具有替代物[FWY]，为[FWY]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWY][SEQ ID NO:63]。
无论位置1和/或7的氨基酸如何，该一般基序的替代变体在位置4处具有替代物[ILM]，例如[FWYH]-X(2)-[ILM]-X(2)-[FWYH][SEQ ID NO:64]或[FWYHT]-X(2)-[ILM]-X(2)-[FWYHT][SEQ ID NO:65]或[FWY]-X(2)-[ILM]-X(2)-[FWY][SEQ ID NO:65]。
通过手工或通过使用算法(诸如ScanProsite De Castro E.et al.(2006)Nucleic Acids Res.34(Web Server issue):W362-W365)扫描的上述序列基序的序列，可以识别蛋白质中的CD1d结合基序。
“自然杀伤T”或“NKT”细胞构成非常规T淋巴细胞的独特子集，其识别由非经典MHC复合物分子CD1d呈递的抗原。目前描述了两个NKT细胞子集。I型NKT细胞，也称为不变NKT细胞(iNKT)，是最丰富的。它们的特征在于存在由不变的α链构成的α-βT细胞受体(TCR)，小鼠中为Valphal4而人类中为Valpha24。该α链缔合到可变但有限数量的β链。2型NKT细胞具有α-βTCR，但具有多态性α链。然而，很明显存在其它NKT细胞子集，其表型仍未完全确定，但其具有由CD1d分子背景中存在的糖脂激活的特征。
NKT细胞通常表达天然杀伤(NK)细胞受体的组合，包括NKG2D和NK1.1。NKT细胞是先天免疫系统的一部分，可以通过它们在获得全效应子能力之前不需要扩增这一事实而将它们与适应性免疫系统区分开来。它们的介体的大多数都是预形成的并且不需要转录。已显示，NKT细胞在针对细胞内病原体和肿瘤排斥的免疫应答中是主要参与者。也主张了它们在控制自身免疫疾病以及在控制移植排斥反应中的作用。
识别单元CD1d分子具有与MHC I类分子非常相似的结构，包括存在β-2微球蛋白。其特征在于由两条α链界定的深裂隙，并含有接受脂质链的高度疏水的残基。裂隙在两端都是开放的，允许其容纳更长的链。CDld的规范配体是合成的α半乳糖苷神经酰胺(αGalCer)。然而，已经描述了许多天然替代配体，包括糖和磷脂、髓磷脂中发现的天然脂质硫苷脂、微生物磷酸肌醇甘露糖苷和α-葡糖醛酸神经酰胺。目前本领域的共识(Matsuda et al(2008),Curr.OpinionImmunol.,20358-368；Godfrey et al(2010),Nature rev.Immunol11,197-206)仍然是CD1d仅结合含有脂质链的配体，或一般来说，由被埋入CD1d中的脂质尾部和从CD1d突出的糖残基头部组制成的共同结构。
关于本发明上下文中使用的表位而如在本文中使用的术语“同源物”是指具有与天然存在的表位至少50％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％氨基酸序列同一性的分子，从而保持了该表位结合CD1d分子的能力。表位的特定同源物对应于在至多3个、更特别是在至多2个、最特别是在一个氨基酸中进行修饰的天然表位。
关于本发明的肽而如在本文中使用的术语“衍生物”是指含有至少肽活性部分(即能够引发溶细胞的NKT细胞活性)的分子，并且除此之外，其还包含可具有不同的目的(诸如稳定肽或改变肽的药代动力学或药效学特性)的互补部分。
如在本文中使用的两个序列的术语“序列同一性”是指，当将该两个序列比对时，具有相同核苷酸或氨基酸的位置的数目除以较短序列中的核苷酸或氨基酸数目。特别地，该序列同一性为从70％至80％，从81％至85％，从86％至90％，从91％至95％，从96％至100％，或100％。
如在本文中使用的术语“肽-编码多核苷酸(或核酸)”以及“编码肽的多核苷酸(或核酸)”是指核苷酸序列，当在适当的环境中表达时，其导致产生相关肽序列或其衍生物或同源物。此类多核苷酸或核酸包括编码该肽的正常序列，以及能够表达具有所需活性的肽的这些核酸的衍生物和片段。编码根据本发明的肽或其片段的核酸，是编码源自哺乳动物或对应于哺乳动物的肽或其片段(最特别是人类肽片段)的序列。
术语“免疫病症”或“免疫疾病”是指这样的疾病，其中免疫系统的反应是造成或维持生物体内的功能障碍或非生理病况的原因。免疫病症尤其包括过敏性病症和自身免疫性病症。
在本文中所用的术语“过敏性疾病”或“过敏性病症”是指以免疫系统对于被称为过敏原的特定物质(如花粉、叮咬、药物或食物)的超敏反应为特征的疾病。过敏是指特应性个体患者在遇到他已致敏的过敏原时观察到的体征和症状的集合，其可能导致各种疾病的发展，特别是呼吸系统疾病和支气管哮喘等症状。存在各种类型的分类，并且大多数过敏性病症具有不同的名称，这取决于它在哺乳动物体内发生的位置。“超敏反应”是个体在暴露于已变得致敏的抗原时产生的不良(有害、产生不适且有时致命)的反应；“即时超敏反应”取决于lgE抗体的产生，因此相当于过敏。
术语“自身免疫性疾病”或“自身免疫性病症”是指由于生物体无法将其自身组成部分(直到亚分子水平)识别为“自身”而导致该生物体对其自身细胞和组织的异常免疫应答所引起的疾病。这组疾病可分为两类，器官特异性疾病和全身性疾病。“过敏原”被定义为一种物质，其通常是大分子或蛋白质组合物，其在易感、特别是遗传性处理的个体(特应性)患者中引起产生lgE抗体。Liebers et al.(1996)Clin.Exp.Allergy 26,494-516中给出了类似的定义。
术语“治疗有效量”是指本发明的肽或其衍生物在患者中产生所需治疗或预防效果的量。例如，关于疾病或病症，其是在一定程度上减少该疾病或病症的一种或多种症状的量，并且更特别地是将与该疾病或病症相关或引起该疾病或病症的生理或生化参数部分或完全恢复正常的量。典型地，治疗有效量是会导致正常生理情况的改进或恢复的本发明的肽或其衍生物的量。例如，当用于治疗性治疗受免疫病症影响的哺乳动物时，它是每日肽量/kg所述哺乳动物的体重。可替代地，当通过基因疗法给药时，调节裸DNA或病毒载体的量以确保局部产生本发明的肽、其衍生物或同源物的相关剂量。
当提及肽时，术语“天然的”涉及该序列与天然存在的蛋白质(野生型或突变体)的片段相同的事实。与此相反，术语“人工”是指在自然界中不存在的序列。通过有限的修饰，例如在天然存在的序列中改变/缺失/插入一个或多个氨基酸，或者通过在天然存在的序列的N-或C-末端添加/去除氨基酸，从天然序列中获得人工序列。
在这种背景下，认识到，通常在表位扫描的背景下，肽片段由抗原产生。碰巧的是，这样的肽可以在它们的序列中包含MHC II类表位并且接近它们包含具有修饰的氧化还原基序[HW]-X(0,2)-C-X(2)-[CST]([SEQ ID NO:1]、[SEQ ID NO:2]、[SEQ ID NO:3])或([SEQ ID NO:4]、[SEQ IDNO:5]、[SEQ ID NO:6])的序列。在本文中，“接近”是指在MHC II类表位序列之间以及在上述[HW]-X(0,2)-C-X(2)-[CST]([SEQ ID NO:1]、[SEQ ID NO:2]、[SEQ ID NO:3])或[CST]-X(2)-C-X(0,2)-[HW]([SEQ ID NO:4]、[SEQ ID NO:5]、[SEQ IDNO:6])基序之间，可以存在至多7个氨基酸、至多4个氨基酸、至多2个氨基酸的氨基酸序列或甚至0个氨基酸(换言之，表位和基序列彼此直接相邻)。
因此，本发明的具体实施方式排除了如下抗原的肽片段，其偶然地还包含彼此直接相邻或通过至多2、4或7个氨基酸的氨基酸序列相隔开的CD1d结合肽表位和氧化还原基序序列。
此外，认识到，鉴于存在上述CD1d结合基序的实施方式，识别为CD1d结合肽的某些肽在某些特殊情况下也含有MCH II类T细胞表位。在序列中包括MCH II类T细胞表位的肽不属于本发明。
更具体地，这种偶然的MHC II类肽存在于氧化还原基序序列外侧的肽部分中的那些肽被放弃。在这种情况下，MCH II类T细胞表位和CD1d结合肽表位的序列可以部分或完全彼此重叠。在后一种情况下，CD1d结合肽的7个氨基酸序列完全被包含在MHC II类T细胞表位的9个氨基酸序列内。
研究了抗原的肽片段的免疫原性，但其通常用作治疗剂(除了过敏和肿瘤疫苗接种领域之外)。因此，在不知道本发明肽的改进性质的情况下，这种肽作为药物的用途是无先例的。
氨基酸在本文中以它们的全名、它们的三字母缩写或它们的一个字母缩写来引用。
本文根据Prosite的格式编写氨基酸序列的基序。基序用于描述序列特定部分处的特定序列品种。符号X用于接受任何氨基酸的位置。通过在方括号('[]')之间列出给定位置的可接受氨基酸来指示替代物。例如：[CST]代表选自Cys、Ser或Thr的氨基酸。通过在大括号('{}')之间列举来指示被排除作为替代物的氨基酸。例如：{AM}代表除Ala和Met之外的任何氨基酸。基序中的不同元素通过连字符-彼此分开。可以通过在元素后面放置数值或括号之间的数值范围来指示在基序内的相同元素的重复。例如：X(2)对应于X-X；X(2,5)对应于2、3、4或5个X氨基酸；A(3)对应于A-A-A。
因此，[HW]-C-X(2)-C[SEQ ID NO:7]可以被写作为[HW]CXXC。
类似地，C-X(2)-C-X(0,2)-[HW]([SEQ ID NO:10]、[SEQ ID NO:11]、[SEQ ID NO:12])代表三种可能性，其中在C和H或W之间不存在或者存在一个或两个氨基酸；即C-X(2)-C-[HW][SEQ ID NO:10]、C-X(2)-C-X-[HW][SEQ ID 11NO:40]和C-X(2)-C-X(2)-[HW][SEQID NO:12]。
同样地，[HW]-X(0,2)-C-X(2)-C([SEQ ID NO:7]、[SEQ ID NO:8]、[SEQ ID NO:9])代表三种可能性，其中在H或W和C之间不存在或者存在一个或两个氨基酸，即[HW]-C-X(2)-C[SEQ ID NO:7]、[HW]-X-C-X(2)-C[SEQ ID NO:8]和[SEQ IDNO:9]。
为了区分氨基酸X，H或W和C之间的氨基酸称为外部氨基酸X(上述序列中带单下划线的X)，氧化还原基序内的那些被称为内部氨基酸X(上述序列中带双下划线的X)。
X代表任何氨基酸，特别是L-氨基酸，更特别是20种天然存在的L-氨基酸之一。
具有还原活性的包含CD1d结合肽表位和修饰的肽基序序列的肽能够产生针对抗原呈递细胞的抗原特异性溶细胞的NKT细胞群。
因此，在它最广泛的意义上，本发明涉及肽，其包含至少一个具有引发免疫反应的潜力的抗原(自身或非自身)的CD1d结合肽表位以及对肽二硫键具有还原活性的经修饰的硫代还原酶序列基序。CD1d结合表位和经修饰的氧化还原基序序列在肽中可以彼此直接相邻或任选地被一个或多个氨基酸(所谓的接头序列)相隔开。任选地，该肽还包含内体靶向序列和/或额外的“侧接”序列。
本发明的肽包含具有引发免疫反应的潜力的抗原(自身或非自身)的CD1d结合肽表位以及经修饰的氧化还原基序。可以测定肽中基序序列还原巯基的能力来检测其还原活性，例如，在胰岛素溶解度测定中，胰岛素的溶解度在还原后被改变，或者用荧光标记的底物如胰岛素来测定其还原活性。在本申请的实验部分中更详细地描述了这种测定的实例。
该经修饰的氧化还原基序可位于CD1d结合肽表位的氨基末端侧处或CD1d结合肽表位的羧基末端处。
在硫代还原酶中遇到了具有还原活性的肽片段，该硫代还原酶是小的二硫化物还原酶，其包括谷氧还蛋白、核氧还蛋白、硫氧还蛋白和其它硫醇/二硫化物氧化还原酶(Holmgren(2000)Antioxid.Redox Signal.2,811-820；Jacquot et al.(2002)Biochem.Pharm.64,1065-1069)。它们是多功能的，普遍存在的，并且存在于许多原核生物和真核生物中。它们通过保守活性结构域共有序列内的氧化还原活性半胱氨酸对蛋白质(如酶)上的二硫键发挥还原活性，该保守活性结构域共有序列为：C-X(2)-C[SEQ ID NO:13]、C-X(2)-S[SEQ ID NO:14]、C-X(2)-T[SEQ ID NO:15]、S-X(2)-C[SEQ ID NO:16]、T-X(2)-C[SEQ ID NO:17](Fomenko et al.(2003)
Biochemistry 42,11214-11225；Fomenko et al.(2002)Prot.Science 11,2285-2296)，其中X代表任何氨基酸。此类结构域也被发现于较大的蛋白质诸如蛋白质二硫键异构酶(PDI)和磷酸肌醇特异性磷脂酶C中。
从例如Fomenko和WO2008/017517获知的4氨基酸氧化还基序在位置1和/或4处包含半胱氨酸；因此，该基序为C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:55]或[CST]-X(2)-C[SEQ ID NO:54]。这样的四肽序列将被称为“基序”。肽中的基序可以是替代物C-X(2)-C[SEQ ID NO:13]、S-X(2)-C[SEQ ID NO:16]、T-X(2)-C[SEQ ID NO:17]、C-X(2)-S[SEQ ID NO:14]或C-X(2)-T[SEQ ID NO:15]中的任何一种。特别地，肽含有序列基序C-X(2)-C[SEQ ID NO:13]。
本发明的肽的“经修饰的”氧化还原基序与现有技术不同之处在于，紧邻半胱氨酸并且在基序外侧存在组氨酸或色氨酸，换言之，该经修饰的氧化还原基序被写成[HW]-X(0,2)-C-X(2)-[CST]([SEQ ID NO:1]、[SEQ ID NO:2]、[SEQ ID NO:3])或[CST]-X(2)-C-X(0,2)-[HW]([SEQ ID NO:4]、[SEQ ID NO:5]、[SEQ ID NO:6])。
其实施方式是[HW]-X(2)-C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:3]、[HW]-X-C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:2]、[HW]-C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:1]、[CST]-X(2)-C-X(2)-[HW][SEQ IDNO:6]、[CST]-X(2)-C-X-[HW][SEQ ID NO:5]和[CST]-X(2)-C-[HW][SEQ ID NO:4]。
更具体的实施方式是：
H-C-X(2)-S [SEQ ID NO:18]
H-X-C-X(2)-S [SEQ ID NO:19]
H-X(2)-C-X(2)-S [SEQ ID NO:20]
W-C-X(2)-S [SEQ ID NO:21]
W-X-C-X(2)-S [SEQ ID NO:22]
W-X(2)-C-X(2)-S [SEQ ID NO:23]
H-C-X(2)-T [SEQ ID NO:24]
H-X-C-X(2)-T [SEQ ID NO:25]
H-X(2)-C-X(2)-T [SEQ ID NO:26]
W-C-X(2)-T [SEQ ID NO:27]
W-X-C-X(2)-T [SEQ ID NO:28]
W-X(2)-C-X(2)-T [SEQ ID NO:29]
S-X(2)-C-H [SEQ ID NO:30]
S-X(2)-C-X-H [SEQ ID NO:31]
S-X(2)-C-X(2)-H [SEQ ID NO:32]
S-X(2)-C-W [SEQ ID NO:33]
S-X(2)-C-X-W [SEQ ID NO:34]
S-X(2)-C-X(2)-W [SEQ ID NO:35]
T-X(2)-C-H [SEQ ID NO:36]
T-X(2)-C-X-H [SEQ ID NO:37]
T-X(2)-C-X(2)-H [SEQ ID NO:38]
T-X(2)-C-W [SEQ ID NO:39]
T-X(2)-C-X-W [SEQ ID NO:40]
T-X(2)-C-X(2)-W [SEQ ID NO:41]
C-X(2)-C-H [SEQ ID NO:42]
C-X(2)-C-X-H [SEQ ID NO:43]
C-X(2)-C-X(2)-H [SEQ ID NO:44]
C-X(2)-C-W [SEQ ID NO:45]
C-X(2)-C-X-W [SEQ ID NO:46]
C-X(2)-C-X(2)-W [SEQ ID NO:47]
H-C-X(2)-C [SEQ ID NO:48]
H-X-C-X(2)-C [SEQ ID NO:49]
H-X(2)-C-X(2)-C [SEQ ID NO:50]
W-C-X(2)-C [SEQ ID NO:51]
W-X-C-X(2)-C [SEQ ID NO:52]
W-X(2)-C-X(2)-C [SEQ ID NO:53]。
在本发明的具体实施方式中，具有[HW]-C-X(2)-C-[HW][SEQ ID NO:67]基序的肽被排除在本发明的范围之外。
其它具体实施方式是其中氧化还原基序的半胱氨酸氨基酸侧接两个组氨酸序列的肽，如HCHxC[SEQ ID NO:68]。
其它具体实施方式是其中氧化还原基序的半胱氨酸氨基酸侧接两个色氨酸序列的肽，如WCWxC[SEQ ID NO:69]。
如进一步详细解释的，本发明的肽可以通过化学合成制备，其允许掺入非天然氨基酸。因此，在上述氧化还原修饰的氧化还原基序中的“C”表示半胱氨酸或具有硫醇基的另一氨基酸，诸如巯基缬氨酸、高半胱氨酸或具有硫醇官能团的其它天然或非天然氨基酸。为了具有还原活性，存在于经修饰的氧化还原基序中的半胱氨酸不应作为胱氨酸二硫桥的一部分出现。虽然如此，氧化还原修饰的氧化还原基序可包含经修饰的半胱氨酸，诸如甲基化的半胱氨酸，其在体内被转化为具有游离硫醇基团的半胱氨酸。X可以是20种天然氨基酸中的任何一种，包括S、C或T，或者可以是非天然氨基酸。在特定的实施方式中，X是具有小侧链的氨基酸，诸如Gly、Ala、Ser或Thr。在进一步特定的实施方式中，X不是具有庞大侧链的氨基酸，诸如Trp。在进一步特定的实施方式中，X不是半胱氨酸。在进一步特定的实施方式中，在经修饰的氧化还原基序中的至少一个X是His。在其它进一步特定的实施方式中，在经修饰的氧化还原基序中的至少一个X是Pro。
肽可进一步包含修饰以增加稳定性或溶解度，诸如N-末端NH2基团或C末端COOH基团的修饰(例如，将COOH修饰为CONH2基团)。
在包含经修饰的氧化还原基序的本发明的肽中，定位该基序使得当表位含有氧化还原基序序列时，该基序保留在CD1d分子的肽结合部分的外侧。该经修饰的氧化还原基序与肽内的该CD1d结合肽表位序列直接相邻旋转(换言之，在基序与表位之间的接头序列为零个氨基酸)，或者通过包含7个以下氨基酸的氨基酸序列的接头与该CD1d结合肽表位相隔开。更特别地，该接头包含1、2、3或4个氨基酸。具体实施方式是在表位序列和经修饰的氧化还原基序序列之间具有0、1或2个氨基酸接头的肽。可替代地，接头可包含5、6、7、8、9或10个氨基酸。在经修饰的氧化还原基序序列与表位序列相邻的那些肽中，与表位序列相比，这被指示为位置P-4至P-1或P+1至P+4。除肽接头外，其它有机化合物可用作接头以使肽的各部分彼此连接(例如，将经修饰的氧化还原基序序列连接到CD1d结合肽表位序列)。
本发明的肽在包含CD1d结合肽表位和经修饰的氧化还原基序的序列的N或C末端可以进一步包含附加的短氨基酸序列。这种氨基酸序列在本文中通常称为“侧接序列”。侧接序列可位于表位与内体靶向序列之间和/或经修饰的氧化还原基序与内体靶向序列之间。在不包含内体靶向序列的某些肽中，短氨基酸序列可以存在于肽中的经修饰的氧化还原基序和/或表位序列的N和/或C末端。更特别地，侧接序列是1至7个氨基酸的序列，最特别是2个氨基酸的序列。
经修饰的氧化还原基序可位于表位的N末端。
在某些实施方式中，其中经修饰的氧化还原基序含有一个半胱氨酸，该半胱氨酸存在于经修饰的氧化还原基序中远离表位的位置，因此，该经修饰的氧化还原基序例如以W-C-X(2)-T[SEQ ID NO:27]、H-C-X(2)-T[SEQ ID NO:24]、H-C-X(2)-S[SEQ ID NO:18]、W-C-X(2)-S[SEQ ID NO:21]形式存在于表位的N末端或者以T-X(2)-C-H[SEQ ID NO:36]、T-X(2)-C-W[SEQ ID NO:39]、S-X(2)-C-H[SEQ ID NO:30]、S-X(2)-C-W[SEQ ID NO:33]的形式存在于表位的C末端。
在本发明的某些实施方式中，提供了包含一个表位序列和经修饰的氧化还原基序序列的肽。在进一步特定的实施方式中，该经修饰的氧化还原基序在肽中出现多次(1、2、3、4或甚至更多次)，例如作为可以被一个或多个氨基酸彼此相隔开的经修饰的氧化还基序的重复或者作为彼此直接相邻的重复。可替代地，一个或多个经修饰的氧化还原基序设置在CD1d结合肽表位的N和C末端。
本发明的肽的预期其它变化包括含有CD1d结合肽表位序列的重复的肽，其中每个表位序列之前和/或之后是经修饰的氧化还原基序(例如，“经修饰的氧化还原基序-表位”的重复或者“经修饰的氧化还原基序-表位-经修饰的氧化还原基序”的重复)。在本文中，经修饰的氧化还原基序都可以具有相同的序列，但这不是强制性的。应该注意的是，包含本身包含经修饰的氧化还原基序的表位的肽的重复序列，也将产生同时包含‘表位’和‘经修饰的氧化还原基序’的序列。在这样的肽中，一个表位序列内的经修饰的氧化还原基序在第二表位序列外侧发挥经修饰的氧化还原基序的功能。
典型地，本发明的肽仅包含一个CD1d结合肽。如下所述，可以通过扫描蛋白质序列来识别蛋白质序列中的CD1d结合肽，并且其具有7个氨基酸的长度。本发明的肽的CD1d结合肽表位可以对应于蛋白质的天然表位序列或可以是其修饰变体，条件是经修饰的CD1d结合肽表位保留了其结合CD1d分子的能力，类似于天然表位序列。经修饰的表位对MHC蛋白质的结合亲和力可以与天然表位相同，但也可以具有降低的亲和力。特别地，经修饰的肽的结合亲和力不低于原始肽的1/10，更特别地不低于1/5。本发明的肽对蛋白质复合物具有稳定作用。因此，肽-CD1d复合物的稳定作用弥补了经修饰的表位对CD1d分子的亲和力降低。
包含CD1d结合肽表位和肽内还原化合物的序列可以进一步连接到有利于将肽摄取到晚期内体中以进行加工和呈递的氨基酸序列(或另一种有机化合物)。晚期内体靶向由存在于蛋白质的细胞质尾部中的信号介导，并且对应于充分识别的肽基序诸如双亮氨酸-基[DE]XXXL[LI][SEQ ID NO:70]或DXXLL[SEQ ID NO:71]基序、酪氨酸-基YXXΦ基序[SEQID NO:72]或所谓的酸性簇基序。符号Φ表示具有庞大疏水侧链的氨基酸残基，诸如Phe、Tyr和Trp。晚期内体靶向序列允许加工和高效呈递。此类内体靶向序列包含在例如gp75蛋白(Vijayasaradhi et al.(1995)J.Cell.Biol.130,807-820)、人类CD3γ蛋白、HLA-BM 11(Copier et al.(1996)J.lmmunol.157,1017-1027)、DEC205受体的细胞质尾部内(Mahnkeet al.(2000)J.Cell Biol.151,673-683)。Bonifacio and Traub(2003)Annu.Rev.Biochem.72,395-447的综述中公开了作为针对内体的分选信号的肽的其它实例。晚期内体靶向序列可以位于抗原衍生肽的氨基末端处或羧基末端处以便高效摄取和加工，并且也可以通过侧接序列(例如最高达10个氨基酸的肽序列)偶联。
因此，本发明设想了抗原蛋白的肽及其在引发特异性免疫反应中的用途。这些肽可以对应于在序列中包含还原化合物和通过至多10、优选7个以下氨基酸相隔开的CD1d结合肽表位的蛋白质片段。可替代地，并且对于大多数抗原蛋白，本发明的肽是通过将还原性化合物(更特别地是本文所述的还原修饰的氧化还原基序)在N-末端或C-末端偶联到抗原蛋白的CD1d结合肽表位(直接相邻或者使用至多10、更特别地至多7个氨基酸的接头)来产生的。另外，与天然存在的序列相比，蛋白质的CD1d结合肽表位序列和/或经修饰的氧化还原基序可以被修饰和/或可以引入(或修饰)一个或多个侧接序列和/或靶向序列。因此，取决于是否可以在目标抗原蛋白的序列内发现本发明的特征，本发明的肽可以包含“人工”或“天然存在”的序列。
本发明的肽在长度上可以显著变化。该肽的长度可以从12(即由7个氨基酸的CD1d结合分子和与其相邻的具有组氨酸或色氨酸的5个氨基酸的经修饰的氧化还原基序组成)变化到最高达20、25、30、40、50、75、100或200个氨基酸。例如，肽可以包含40个氨基酸的内体靶向序列、约2个氨基酸的侧接序列、如本文所述的5个氨基酸的基序、4个氨基酸的接头和7个氨基酸的CD1d结合肽表位。
因此，在特定的实施方式中，完整的肽由12个氨基酸至最高达20、30、50、75、100或200个氨基酸组成。更特别地，在还原化合物是本文所述的经修饰的氧化还原基序的情况下，包含该表位以及任选通过接头连接的经修饰的氧化还原基序(在本文中称为‘表位-经修饰的氧化还原基序’序列)但不包含内体靶向序列的(人工或天然)序列的长度是至关重要的。该‘表位-经修饰的氧化还原基序’更特别地具有12、13、14、15、16、17、18或19个氨基酸的长度。12至19个氨基酸的此种肽可以任选地偶联到大小不太重要的内体靶向信号。
如上详述的，在特定的实施方式中，本发明的肽包含连接到CD1d结合肽表位序列的本文所述的还原修饰的氧化还原基序。
少数蛋白质序列、蛋白质片段或合成肽可以巧合地包含经修饰的氧化还原基序序列。然而，这些蛋白质在经修饰的氧化还原序列附近包含CD1d结合肽表位细胞表位的机会变得非常小。如果存在，这种肽可能是从表位扫描实验中获知的，其中合成了多组重叠肽片段。在此类出版物中，人们关注的是CD1d结合并且忽视了经修饰的氧化还原基序与组氨酸或色氨酸的相关性以及这些肽在医学应用中的相关性。
因此，这类肽是与本发明的发明构思无关的偶然公开。
在进一步特定的实施方式中，本发明的肽是包含CD1d结合肽表位的肽，该CD1d结合肽表位在其天然序列内不包含具有氧化还原性质的氨基酸序列。
然而，在可替代的实施方式中，CD1d结合肽表位可以包含确保表位与CD1d分子结合的任何氨基酸序列。在抗原蛋白的目标表位在其表位序列内包含如本文所述的经修饰的氧化还原基序的情况下，根据本发明所述的免疫原性肽包含本文所述的经修饰的氧化还原基序的序列和/或以N或C末端偶联到该表位序列的另一种还原序列的序列，使得(与表位内存在的经修饰的氧化还原基序相反，其嵌入裂隙内)所附接的经修饰的氧化还原基序可以确保还原活性。
因此，CD1d结合肽表位和基序彼此紧邻或相隔开并且不重叠。为了评估“紧邻”或“相隔”的构思，确定了结合到CD1d分子并且具有上述CD1d结合基序的7个氨基酸序列，并且确定了这种七肽与经修饰的氧化还原基序五肽之间的距离。
通常，本发明的肽不是天然的(因此无这样的蛋白质片段)，而是除了CD1d结合肽表位之外还含有本文所述的经修饰的氧化还原基序的人工肽，其中该经修饰的氧化还原基序通过由最高达七个、更特别地最高达4个或最高达2个氨基酸组成的接头与该表位直接相隔开。
已经证明，在将本发明的肽(或包含此种肽的组合物)施用(即注射)到哺乳动物后，该肽引发了识别抗原来源的CD1d结合肽表位的NKT细胞的活化，并且通过还原表面受体为NKT细胞提供额外的信号。这种超-最佳活化导致NKT细胞获得了对呈递CD1d结合肽表位的细胞的溶细胞特性，以及对局外T细胞的抑制特性。如此，本发明描述的肽或包含该肽的组合物(该肽含有抗原来源的CD1d结合肽表位以及在该表位外侧的经修饰的氧化还原基序)可用于哺乳动物包括人类的直接免疫。因此，本发明提供了用作药物的本发明的肽或其衍生物。相应地，本发明提供了治疗方法，其包括向有需求的患者给药根据本发明所述的一种或多种肽。
本发明提供了通过用小肽免疫引发具有溶细胞特性的抗原特异性NK细胞的方法。
本发明的肽的免疫原性特性在免疫反应的治疗和预防中是特别令人感兴趣的。
本文所述的肽被用作药物，更特别地用于制造用于在哺乳动物(更特别是人类)中治疗或预防免疫病症的药物。
本发明描述了通过使用本发明的肽、其同源物或衍生物治疗或预防需要这种治疗或预防的哺乳动物的免疫病症的方法，该方法包括以下步骤：向患有免疫病症或具有免疫病症风险的该哺乳动物给药治疗有效量的本发明的肽、其同源物或衍生物，从而减轻该免疫病症的症状或防止免疫病症影响个体。设想了人和动物如宠物和农场动物的治疗。在一个实施方式中，待治疗的哺乳动物是人类。在特定的实施方式中，上述的免疫病症选自过敏性疾病和自身免疫性疾病。过敏性疾病通常被描述为1型介导的疾病或IgE介导的疾病。过敏性疾病的临床表现包括支气管哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、食物超敏反应和对昆虫叮咬或药物的过敏反应。过敏性疾病是由免疫系统针对被称作为过敏原的特定物质(如花粉、叮咬、药物或食物)的超敏反应引起的。最严重的过敏性病症是过敏性休克，这是一种医疗急症。过敏原包括空气中的过敏原，诸如屋尘螨、宠物和花粉中的那些。过敏原还包括引起食物超敏反应的摄入过敏原，包括水果、蔬菜和牛奶。为了治疗上述疾病，根据本发明所述的肽从已知或被认为是该疾病的致病因子的抗原蛋白或过敏原产生。可用于选择T细胞表位的过敏原通常是选自以下的过敏原：花生，鱼例如鳕鱼，蛋清，甲壳动物例如虾，奶例如牛奶，小麦，谷物，酒渣鼻科的果实(苹果、李子、草莓)，百合科、十字花科、茄科和伞形科的蔬菜，坚果，芝麻，花生，大豆及其它豆科植物过敏原，香料，甜瓜，鳄梨，芒果，无花果，香蕉…中存在的食物过敏原；获自尘螨属(Dermatophagoides spp)或屋尘螨(D.pteronyssinus)、粉尘螨(D.farinae)和微角尘螨(D.microceras)、埋内欧尘螨(Euroglyphus maynei)或Blomia sp.的屋尘螨过敏原；来自存在于蟑螂或膜翅目中的昆虫的过敏原；来自花粉的过敏原，特别是树、草和杂草的花粉；来自动物的过敏原，特别是猫、狗、马和啮齿动物；来自真菌的过敏原，特别是来自曲霉属、链格孢菌属或枝孢菌属的过敏原；以及乳胶、淀粉酶等产品中存在的职业过敏原。
本发明进一步涉及用于基因疗法和基因疫苗接种中的具有经修饰的氧化还原基序的肽，其包含病毒蛋白的CD1d结合肽，其是由病毒载体的骨架编码的。本发明进一步涉及治疗或预防针对病毒载体的免疫原性应答的方法。
本发明进一步涉及具有经修饰的氧化还原基序的肽，其包含细胞内病原体蛋白的CD1d结合肽。本发明进一步涉及治疗和预防细胞内病原体感染的方法。细胞内病原体的实例包括病毒，诸如DNA与RNA病毒、单链与双链病毒，具有细胞内生命周期的细菌、分枝杆菌或寄生虫，和WO2009101208中讨论的抗原(例如疱疹病毒科、黄病毒科和小核糖核酸病毒科、流感、麻疹和免疫缺陷病毒、乳头状病毒)。细胞内病原体的实例还包括细菌和分枝杆菌，包括结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)，以及对人类或动物有致病性的其它分枝杆菌，如耶尔森氏菌、布鲁氏菌、衣原体、支原体、立克次氏体、沙门氏菌和志贺氏菌。进一步的实例包括寄生虫，例如疟原虫、利什曼原虫、锥虫、弓形虫(Toxoplasma gondii)、李斯特菌属(Listeria sp.)、组织胞浆菌属(Histoplasma sp.)。
本发明进一步涉及具有经修饰的氧化还原基序的肽，其包含诸如在替代疗法中使用的可溶性同种异体因子(allofactor)的CD1d结合肽。本发明进一步涉及治疗和预防针对可溶性同种异体因子的免疫反应的方法。WO2009101206中公开了可溶性同种异体因子的实例。
本发明进一步涉及具有经修饰的氧化还原基序的肽，其包含肿瘤相关抗原的CD1d结合肽。本发明进一步涉及治疗和预防肿瘤的方法。WO2009101205中公开了相关肿瘤(例如致癌基因、原癌基因、病毒蛋白、存活因子、克隆型决定簇)以及肿瘤相关的抗原的实例。这种肿瘤相关抗原包括引起肿瘤的病毒诸如HPV的病毒抗原，具有野生型序列但在肿瘤中具有增加表达的肿瘤相关的患者抗原，或者通过点突变、缺失、移码或染色体重排而具有突变序列的抗原。
本发明进一步涉及具有经修饰的氧化还原基序的肽，其包含同种异体移植物的同种异体抗原蛋白的CD1d结合肽。本发明进一步涉及治疗和预防同种异体移植物排斥的方法。实例是骨髓移植物，实体器官移植物如肾、肺、心脏、肝脏、胰腺、骨骼或皮肤，或细胞移植物如脐带血细胞移植物、干细胞移植物或胰岛细胞移植物。WO2009100505中公开了同种异体抗原蛋白的实例，诸如次要组织相容性抗原、主要组织相容性抗原或组织特异性抗原。
对于所有上述肽，设想了额外的变体，其中在组氨酸或色氨酸与半胱氨酸之间，存在一个或两个氨基酸X。典型地，这些外部氨基酸X不是His、Trp、Cys、Ser或Thr。
本发明的肽还可以用于体外诊断方法，该方法用于检测样品中的CD1d阳性细胞。在这一方法中，使样品与CD1d分子与根据本发明所述的肽的复合物接触。通过测量该复合物与样品中细胞的结合来检测CD1d细胞，其中该复合物与细胞的结合指示样品中存在CD1d阳性细胞。
该复合物可以是该肽与MHC II类分子的融合蛋白。
可替代地，该复合物中的MHC分子是四聚体。该复合物可以被提供为可溶性分子或可以附接到载体上。
适合于在本发明的背景下的用途的对应于抗原蛋白(或免疫原)的CD1d结合肽可以是空气中的过敏原或食源性过敏原的CD1d结合肽。在特定的实施方式中，过敏原选自鼻-鼻窦炎过敏原、过敏性支气管哮喘过敏原和特应性皮炎过敏原。过敏原也可以是霉菌或各种药物诸如激素、抗生素、酶等中存在的主要过敏原(还参见Clin.Exp.Allergy 26,494-516(1996)以及Molecular Biology of Allergy and Immunology,Ed.R.Bush(1996)中的定义)。与特定过敏性疾病相关的其它过敏原也是本领域公知的，并且可以在因特网上找到，例如www.allergome.org。
自身免疫性疾病大致分为两类，器官特异性疾病和全身性疾病。没有确定系统性自身免疫性疾病的确切病因。相反，器官特异性自身免疫性疾病与包括B和T细胞的特异性免疫应答有关，该B和T细胞靶向器官，从而诱导并维持慢性局部炎症状态。器官特异性自身免疫性疾病的实例包括1型糖尿病、重症肌无力、甲状腺炎和多发性硬化症。在这些病况的每一种中，已经鉴定出单个或少量自身抗原，分别包括胰岛素、乙酰胆碱肌肉受体、甲状腺过氧化物酶和主要碱性蛋白。众所周知，抑制这种器官特异性免疫应答是有益的，并导致器官功能的部分或完全恢复。然而，没有治疗可以以抗原特异性方式抑制这种免疫应答。相反，目前的治疗利用通过使用皮质类固醇和免疫抑制剂获得的非特异性抑制，所有这些都表现出与其缺乏特异性相关的显著副作用，从而限制了它们的使用和它们的总体功效。在本发明的上下文中设想的器官特异性自身免疫病症和其中涉及的自身抗原的实例的非限制性列表是：
根据本发明，提供了免疫原性肽，其包含抗原(自身或非自身)的CD1d结合肽表位，具有引发免疫反应的潜力。
因此，在特定的实施方式中，本发明的治疗和预防方法包含给药如本文所述的免疫原性肽，其中该肽包含抗原蛋白的CD1d结合肽表位，其在待治疗的疾病(例如，如上所述的那些)中起作用。
本发明还涉及产生具有CD1d结合肽表位和经修饰的氧化还原基序的肽的方法。
在第一步中，该方法包括以下步骤：提供目的抗原蛋白的序列，和使用上述用于CD1d结合肽的肽基序识别出该抗原中的CD1d结合肽序列。
对于所考虑的抗原蛋白，可能已经描述了这种表位序列。可替代地，它们通过计算机方法、体外方法或体内方法确定。此外，筛选出存在经修饰的氧化还原基序的抗原蛋白，这不需要特定的计算机方法。
抗原蛋白在其序列中在紧靠CD1d结合肽表位序列附近(即由7个以下氨基酸与CD1d结合肽表位相隔开)含有[HW]-X(0,2)-C-X(2)-[CST]([SEQ ID NO:1]、[SEQ ID NO:2]、[SEQ ID NO:3])或[CST]-X(2)-C-X(0,2)-[HW]([SEQ IDNO:4]、[SEQ ID NO:5]、[SEQID NO:6])基序的可能性较小，但存在这种可能性。如果是这样，包含CD1d结合肽表位和基序的抗原蛋白片段可用于本发明的方法和用途。这些蛋白质中的表位可能已经在现有技术中讨论过，但是没有讨论过存在这种经修饰的氧化还原基序，更不用说这种经修饰的氧化还原基序的相关性。因此，现有技术中没有选择这种肽片段或者将这种肽片段用于本文所述的方法的动机。在某些实施方式中，其中该肽基于含有CD1d结合肽和经修饰的氧化还原基序的蛋白质的片段，可以通过改变表位和经修饰的氧化还原基序之间序列的长度、改变接头序列中的氨基酸、将基序中的Ser或Thr变成半胱氨酸或者改变基序中一个或两个X位置的氨基酸来进一步修饰这种肽序列。
用于设计肽的其它抗原蛋白可以在其序列中含有[HW]-X(0,2)-C-X(2)-[CST]([SEQ ID NO:1]、[SEQ ID NO:2]、[SEQ ID NO:3])或[CST]-X(2)-C-X(0,2)-[HW]([SEQ IDNO:4]、[SEQ ID NO:5]、[SEQ ID NO:6])序列，该序列进一步远离CD1d结合肽(与表位序列之间超过7个氨基酸)。
在这种情况下，可以产生其中只有表位和基序之间的距离被缩短并借此保留了基序序列和邻近氨基酸序列的肽。如果认为合适，基序外侧的氨基酸、基序中的丝氨酸或苏氨酸或者一个或两个X位置的氨基酸被改变。
通常，用于肽设计的抗原蛋白在它们的蛋白质序列中将不含有[HW]-X(0,2)-C-X(2)-[CST]([SEQ ID NO:1]、[SEQ ID NO:2]、[SEQ ID NO:3])或[CST]-X(2)-C-X(0,2)-[HW]([SEQ ID NO:4]、[SEQ ID NO:5]、[SEQ ID NO:6])序列。将通过合成其中CD1d结合肽表位与经修饰的氧化还原基序被0至7个氨基酸相隔开的肽，由此制备根据本发明所述的肽。在某些实施方式中，可以通过在表位序列的外侧引入1、2或3个突变来获得经修饰的氧化还原基序，从而保持蛋白质中存在的序列背景。在其它实施方式中，表位的序列N末端或C末端与含有CD1d结合肽表位序列的抗原蛋白的序列无关。
在其它具体实施方式中，如WO2012069568中所公开的，通过使用CD1d结合肽表位和C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:55]或[CST]-X(2)-C[SEQ ID NO:54]基序修饰肽来制备肽。添加组氨酸或色氨酸或者将氨基酸改变为组氨酸或色氨酸，产生本发明的具有[HW]-X(0,2)-C-X(2)-[CST]([SEQ ID NO:4]、[SEQ ID NO:5]、[SEQ ID NO:6])或[CST]-X(2)-C-X(0,2)-[HW]([SEQ ID NO:4]、[SEQ ID NO:5]、[SEQ ID NO:6])序列的肽。
因此，基于上述设计肽的方法，通过化学肽合成、重组表达方法或在更特殊的情况下通过蛋白质的蛋白水解或化学片段化来产生肽。
可以在体外和体内方法中测试上述方法中产生的肽的CD1d结合，并且可以在体外测定中测试它们的还原活性。作为最终的质量控制，通过呈递抗原的抗原呈递细胞的细胞凋亡途径，可以在体外测定中测试该肽以验证该肽是否可以产生溶细胞的NKT细胞，该抗原含有在具有经修饰的氧化还原基序的该肽中也存在的该表位序列。
如前所述，肽可以在其序列中特别包含CD1d结合肽表位和MHC II类表位。这些肽被排除在本发明之外并且本文公开了识别T细胞表位的方法。从抗原蛋白中识别和选择T细胞表位是本领域技术人员已知的。
为了识别表位，例如通过T细胞生物学技术测试分离的抗原蛋白肽序列，确定该肽序列是否引发T细胞应答。会引发T细胞应答的那些肽序列被定义为具有T细胞刺激活性。
通过使用来源于过敏原的肽/表位培养获得自例如对螨过敏原敏感的个体(即具有lgE介导的对螨过敏原的免疫应答的个体)的T细胞，并且通过例如氚化胸苷的细胞摄取确定是否响应于所测量的肽/表位而发生了T细胞增殖，从而可以进一步测试人类T细胞刺激活性。T细胞对肽/表位的应答的刺激指数可以被计算为：响应肽/表位的最大CPM除以对照CPM。将等于或大于背景水平两倍的T细胞刺激指数(S.I.)视为“阳性”。阳性结果用于计算所测试的肽/表位组中每个肽/表位的平均刺激指数。
可以进一步任选地测试非天然(或经修饰的)T细胞表位对MHC II类分子的结合亲和力。这可以以不同方式执行。例如，通过裂解对于给定II类分子为纯合的细胞，获得可溶性HLAII类分子。该给定的II类分子通过亲和色谱法纯化。将可溶性II类分子与生物素标记的参考肽一起温育，该参考肽是根据其对该II类分子的强结合亲和力而产生的。然后以不同浓度温育待评估II类结合的肽，并且通过加入中性抗生物素蛋白计算它们从II类结合中置换出参考肽的能力。例如，在Texier et al.,(2000)J.Immunology 164,3177-3184.)可以找到方法。
为了通过例如精细定位技术确定最佳T细胞表位，通过在肽的氨基末端或羧基末端添加或缺失氨基酸残基来修饰如通过T细胞生物技术确定具有T细胞刺激活性并因此包含至少一个T细胞表位的肽，并且进行测试以确定T细胞对该修饰肽的反应性的变化。通过T细胞生物学技术确定，如果发现在天然蛋白质序列中共有重叠区域的两种或更多种肽具有人类T细胞刺激活性，那么可以生产包含此类肽的全部或部分的其它肽，并且可以通过类似的方法测试这些其它肽。遵循该技术，选择并重组或合成产生肽。基于各种因素选择T细胞表位或肽，包括T细胞对肽/表位应答的强度(例如刺激指数)以及个体群体中T细胞对肽的应答频率。
附加地和/或可替代地，可以使用一种或多种体外算法来识别抗原蛋白中的T细胞表位序列。合适的算法包括但不限于Zhang et al.(2005)Nucleic Acids Res 33,W180-W183(PREDBALB)；Salomon&Flower(2006)BMC Bioinformatics 7,501(MHCBN)；Schuler etal.(2007)Methods Mol.Biol.409,75-93(SYFPEITHI)；Donnes&Kohlbacher(2006)NucleicAcids Res.34,W194-W197(SVMHC)；Kolaskar&Tongaonkar(1990)FEBS Lett.276,172-174,Guan et al.(2003)Appl.Bioinformatics 2,63-66(MHCPred)和Singh and Raghava(2001)Bioinformatics17,1236-1237(Propred)中描述的那些。
更特别地，这样的算法允许预测抗原蛋白内的一个或多个八肽或九肽序列，这些序列将适合MHC II分子的凹槽，并且这适用于不同的HLA类型。
可以使用重组DNA技术在细菌、酵母、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞中产生本发明的肽。鉴于肽的长度有限，它们可以通过化学肽合成来制备，其中通过将不同的氨基酸彼此偶联来制备肽。化学合成特别适合于纳入例如D-氨基酸、具有非天然存在的侧链的氨基酸或具有修饰侧链的天然氨基酸诸如甲基化半胱氨酸。
化学肽合成方法已被充分描述，并且可以从Applied Biosystems和其他公司的公司订购肽。
肽合成可以以固相肽合成(SPPS)或与溶液相肽合成相反来进行。最著名的SPPS方法是t-Boc和Fmoc固相化学法。
在肽合成期间，使用多个保护基团。例如，通过叔丁基保护羟基和羧基官能团，通过t-Boc基团保护赖氨酸和色氨酸，通过三苯甲基保护天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸和组氨酸，并且通过pdf基团保护精氨酸。如果合适，在合成后可以将这类保护基团留在肽上。使用连接策略(两个未被保护的肽片段的化学选择性偶联)可以将肽彼此连接以形成更长的肽，如Kent(Schnelzer&Kent(1992)lnt.J.Pept.Protein Res.40,180-193)最初描述和例如Tam et al.(2001)Biopolymers 60,194-205中所综述的，这提供了实现蛋白质合成的巨大潜力，超出了SPPS的范围。通过该方法已成功合成了许多大小为100-300个残基的蛋白质。由于SPPS的巨大进步，合成肽在生物化学、药理学、神经生物学、酶学和分子生物学等研究领域继续发挥着越来越重要的作用。
可替代地，可以通过使用编码本发明的肽的核酸分子在包括编码核苷酸序列的适当表达载体中合成该肽。使用自动DNA合成仪和众所周知的遗传密码的密码子-氨基酸关系可以容易地制备这种DNA分子。这种DNA分子也可以使用寡核苷酸探针和常规杂交方法作为基因组DNA或cDNA而获得。可以将这种DNA分子掺入到表达载体(包括质粒)中，该载体适合于在适合的宿主(诸如细菌例如大肠杆菌，酵母细胞，动物细胞或植物细胞)中表达该DNA和生产多肽。
检查目的肽的物理和化学特性(例如溶解性、稳定性)以确定所述肽是否/是否将适合于用于治疗组合物中。通常，通过调节肽的序列来优化物理和化学特性。任选地，在合成后可以使用现有技术已知的技术来修饰该肽(化学修饰，例如添加/去除官能团)。
本发明提供了在体内或体外产生抗原特异性溶细胞的NKT细胞的方法，以及独立于此，基于特征性表达数据区分NKT细胞与其它细胞群诸如Foxp3+Tregs的方法。
本发明描述了用于产生抗原特异性NKT细胞的体内方法。一个特定的实施方式涉及用于产生或分离NKT细胞的方法，其通过使用如本文所述的本发明的肽免疫动物(包括人类)，然后从免疫动物中分离NKT细胞。本发明描述了用于生产针对APC的抗原特异性溶细胞的NKT细胞的体外方法。本发明提供了用于产生针对APC的抗原特异性溶细胞的NKT细胞的方法。
在一个实施方式中，提供了这样的方法，其包括：分离外周血细胞，通过根据本发明所述的免疫原性肽在体外刺激该细胞群，和扩增该经刺激的细胞群，更特别地在存在γ链家族的细胞因子的条件下进行。根据本发明所述的方法具有优点：产生了大量NKT细胞，并且可以产生对抗原蛋白特异的NKT细胞(通过使用包含抗原特异性表位的肽)。
在可替代的实施方式中，在体内可以产生NKT细胞，即通过将本文所述的免疫原性肽注射到受试者体内，并且收集在体内产生的溶细胞的NKT细胞。
特别令人感兴趣的是，可通过本发明的方法获得的针对APC的抗原特异性溶细胞的NKT细胞，可施用于哺乳动物进行免疫治疗以预防过敏反应和治疗自身免疫性疾病。同时设想了同种异体和自体细胞的使用。
本文所述的抗原特异性溶细胞的NKT细胞可用作药物，更特别地用于过继性细胞疗法，更特别地用于治疗急性过敏反应以及治疗自身免疫疾病(诸如多发性硬化症)的复发。分离的溶细胞的NKT细胞或细胞群(更特别地如上所述产生的抗原特异性的溶细胞的NKT细胞群)被用于制造用于预防或治疗免疫病症的药物。公开了通过使用分离的或产生的溶细胞的NKT细胞的治疗方法。
这种机制也暗示且实验结果表明，虽然本发明的肽包含某种抗原的特异性CD1d结合肽表位，但仍可用于预防或治疗由针对相同抗原的其它CD1d结合肽表位的免疫反应引起的病症，或者在某些情况下，甚至可以用于治疗由针对其它不同抗原的其它CD1d结合肽表位的免疫反应引起的病症，如果该其它不同抗原是通过由本发明的肽激活的T细胞附近的CD1d分子以相同的机制呈递的。
公开了具有上述特性并另外是抗原特异性(即能够抑制抗原特异性免疫应答)的细胞类型的分离细胞群。
本发明的肽也可以用于本领域熟知的基因治疗方法中，并且说明根据本发明所述肽的用途的本文使用的术语还包括编码或表达根据本发明的免疫原性肽的核酸的用途。
本发明描述了编码本发明肽的核酸序列以及它们的使用方法。在本发明的背景下，设想了通过基因疗法在哺乳动物体内实现根据本发明所述的肽、其同源物或衍生物的不同方法。
编码蛋白质序列的重组核酸分子可以用作裸DNA或用于脂质体或其它脂质系统中以递送至靶细胞。用于将质粒DNA直接转移到细胞中的其它方法是本领域技术人员熟知的用于人类基因治疗的方法，并且涉及通过将质粒DNA与蛋白质复合以将DNA靶向细胞上的受体。在其最简单的形式中，基因转移可以通过显微注射方法简单地将微量DNA注入细胞核中来实施。一旦将重组基因导入细胞，它们就可被细胞正常机制识别以进行转录和翻译，并表达基因产物。还尝试了其它方法以将DNA导入到更大数量的细胞中。这些方法包括：转染，其中用磷酸钙沉淀DNA并通过胞饮作用进入细胞；电穿孔，其中将细胞暴露于大电压脉冲以将孔引入膜中；脂质转染/脂质体融合，其中将DNA包装到与靶细胞融合的亲脂性囊泡中；和使用与小抛射体结合的DNA进行粒子轰击。将DNA导入细胞的另一种方法是将DNA偶联到化学修饰的蛋白质上。腺病毒蛋白能够破坏内体的稳定并增强DNA对细胞的摄取。将腺病毒与含有DNA复合物的溶液混合，或使用蛋白质交联剂将DNA与共价连接腺病毒的聚赖氨酸结合，可显著提高重组基因的摄取和表达。腺相关病毒载体也可用于将基因递送到血管细胞中。如在本文中所用的“基因转移”是指将外来核酸分子导入到细胞的过程，其通常进行以使得能够表达由该基因编码的特定产物。该产物可包括蛋白质、多肽、反义DNA或RNA、或酶活性RNA。基因转移可以在培养的细胞中进行，也可以直接施用到哺乳动物体内。在另一实施方式中，提供了包含编码根据本发明所述的肽的核酸分子序列的载体。在特定的实施方式中，产生载体使得该核酸分子序列仅在特定组织中表达。实现组织特异性基因表达的方法是本领域熟知的。例如，这可以通过将编码根据本发明所述的肽的序列置于启动子的控制下来实现，该启动子引导在一种或多种特定组织中的表达。
来源于病毒(诸如逆转录病毒、痘苗病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒，RNA病毒或牛乳头瘤病毒)的表达载体可以用于将编码根据本发明所述的肽、其同源物或衍生物的核苷酸序列(例如cDNA)递送到靶组织或细胞群。可以使用本领域技术人员熟知的方法来构建含有这类编码序列的重组病毒载体。
因此，本发明公开了将能够在体内表达本发明的肽的核酸用于治疗和/或预防由对外源或自身抗原的免疫应答驱动的疾病的用途。根据一个实施方式，能够在体内表达根据本发明所述的肽的核酸是编码这种肽的序列，其与启动子可操作地连接。这种序列可以直接或间接施用。例如，可以将含有根据本发明所述肽用的编码序列的表达载体插入到细胞中，之后在体外生长细胞，然后注射或输注到患者体内。可替代地，能够在体内表达根据本发明所述的肽的核酸是修饰细胞内源表达的序列。该基因疗法可以包括使用包括编码根据本发明所述的肽、其同源物或衍生物的核苷酸序列的腺病毒载体，或者编码根据本发明该的肽的裸核酸分子。可替代地，可以注射含有编码根据本发明所述的肽的核酸分子的工程细胞。
在通过基因转移确保施用了一种或多种根据本发明所述的肽的情况下(核酸的施用，其确保在施用后体内表达根据本发明所述的肽)，可以基于核酸表达的肽的量来确定核酸的合适剂量，例如通过测定施用后血液中肽的浓度。因此，在特定的实施方式中，通过使用处于或未处于表达载体中的编码本发明的肽的多核苷酸来施用该肽，因此本发明还涉及基因治疗方法。另一个特定的实施方式涉及使用诱导局部过表达本发明的肽的方法来治疗或预防免疫病症。
本发明提供了包含一种或多种本发明肽的药物组合物，其进一步包含药学上可接受的载体。如上详述，本发明还涉及用作药物的组合物或通过使用该组合物来治疗哺乳动物的免疫病症的方法以及该组合物用于制造用于预防或治疗免疫病症的药物的用途。该药物组合物可以是例如适用于治疗或预防免疫病症的疫苗，该免疫病症例如空气传播过敏和食源性过敏以及过敏起源的疾病。作为本文进一步描述的药物组合物的实例，根据本发明所述的肽被吸附在适于施用给哺乳动物的佐剂上，例如氢氧化铝(alum)。典型地，通过皮下途径以2周的间隔注射50μg吸附在alum上的肽3次。对于本领域技术人员来说显而易见的是，其它给药途径也是可能的，包括口服、鼻内或肌内。而且，注射次数和注射量可以根据待治疗的病况而变化。另外，可以使用除了alum之外的佐剂，只要它们有助于肽呈递CD1d呈递和T细胞活化即可。因此，尽管活性成分可以单独给药，但它们通常被提供为药物配方。本发明的用于兽医和人用的配方包含至少一种如上所述的活性成分和任选地一种或多种药学上可接受的载体。本发明涉及药物组合物，其包含与药学上可接受的载体混合的作为活性成分的一种或多种本发明的肽。本发明的药物组合物应包含治疗有效量的活性成分，例如下文关于治疗或预防方法所指出的。任选地，该组合物还包含其它治疗成分。合适的其它治疗成分以及它们的常用剂量取决于它们所属的类别，这是本领域技术人员公知的，并且可以选自用于治疗免疫病症的其它已知药物。
在本文中所用的术语“药学上可接受的载体”是指任何材料或物质，其与活性成分一起配制以便促进活性成分应用或散播到待治疗的部位，例如通过溶解、分散或扩散该组合物，和/或有助于活性成分的储存、运输或处理而不会影响其有效性。它们包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂(例如苯酚、山梨酸、氯丁醇)、等渗剂(诸如糖或氯化钠)等。可以包括附加成分以控制组合物中免疫原性肽的作用持续时间。药学上可接受的载体可以是固体或液体或已被压缩形成液体的气体，即本发明的组合物可适合用作浓缩物、乳液、溶液、颗粒、粉剂、喷雾剂、气溶胶、悬浮液、软膏、乳膏、片剂、丸剂或粉末。适用于药物组合物及其配方的药物载体是本领域技术人员众所周知的，并且在本发明中对它们的选择没有特别限制。它们还可以包括添加剂，如润湿剂、分散剂、粘补剂、粘合剂、乳化剂、溶剂、包衣、抗细菌和抗真菌剂(例如苯酚，山梨酸，氯丁醇)、等渗剂(诸如糖或氯化钠)等，只要它们与药学实践一致即可，即不会对哺乳动物造成永久性伤害的载体和添加剂。可以以任何已知的方式制备本发明的药物组合物，例如通过在一步或多步骤程序中，通过将活性成分与选定的载体材料和适当的其它添加剂(如表面活性剂)均匀混合、包被和/或研磨。它们也可以通过微粉化来制备，例如以获得通常直径为约1至10μm微球形式获得它们，即用于制造用于受控释放或持续释放活性成分的微胶囊。
待在本发明的药物组合物中使用的合适的表位活性剂(也称为乳剂或乳化剂)是具有良好乳化、分散和/或润湿性能的非离子、阳离子和/或阴离子材料。合适的阴离子表面活性剂包括水溶性皂和水溶性合成表面活性剂。合适的皂是高级脂肪酸(C10-C22)的碱金属或碱土金属盐、未取代或取代的铵盐，例如油酸或硬脂酸的钠盐或钾盐，或者可从椰子油或牛油中获得的天然脂肪酸混合物的钠盐或钾盐。合成表面活性剂包括聚丙烯酸的钠盐或钙盐；脂肪磺酸盐和硫酸盐；磺化苯并咪唑衍生物和烷基芳基磺酸盐。脂肪磺酸盐或硫酸盐通常为碱金属或碱土金属盐、未取代的铵盐或者取代有具有8-22个碳原子的烷基或酰基的铵盐的形式，例如木质素磺酸或十二烷基磺酸的钠盐或钙盐，或由天然脂肪酸得到的脂肪醇硫酸盐的混合物，硫酸或磺酸酯的碱金属或碱土金属盐(诸如月桂基硫酸钠)以及脂肪醇/环氧乙烷加合物的磺酸的碱金属或碱土金属盐。合适的磺化苯并咪唑衍生物通常含有8-22个碳原子。烷基芳基磺酸盐的实例是十二烷基苯磺酸或二丁基-萘磺酸或萘-磺酸/甲醛缩合产物的钠、钙或链烷醇胺盐。还适合的是相应的磷酸盐，例如磷酸酯的盐，以及对壬基苯酚与乙烯和/或环氧丙烷的加合物，或磷脂。用于此目的的合适的磷脂是脑磷脂或卵磷脂类型的天然(源自动物或植物细胞)或合成磷脂，诸如例如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、溶血卵磷脂、心磷脂、二辛基磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱以及它们的混合物。
合适的非离子表面活性剂包括烷基酚、脂肪醇、脂肪酸、分子中含有至少12个碳原子的脂族胺或酰胺、烷基芳烃磺酸酯和二烷基磺基琥珀酸酯的聚乙氧基化和聚丙氧基化衍生物，诸如脂族和脂环族醇、饱和及不饱和脂肪酸和烷基酚的聚乙二醇醚衍生物，该衍生物典型地含有3至10个乙二醇醚基团、在(脂族)烃部分中含有8至20个碳原子且在烷基酚的烷基部分中含有6至18个碳原子。其它合适的非离子表面活性剂是聚环氧乙烷与聚丙二醇、烷基链中含有1至10个碳原子的乙二胺基聚丙二醇的水溶性加合物，该加合物含有20至250个乙二醇醚基和/或10至100个丙二醇醚基。这类化合物通常相对于每个丙二醇单元含有1至5个乙二醇单元。非离子表面活性剂的代表性实例是壬基酚-聚乙氧基乙醇、蓖麻油聚乙醇醚、聚丙烯/聚环氧乙烷加合物、三丁基苯氧基聚乙氧基乙醇、聚乙二醇和辛基苯氧基聚乙氧基乙醇。聚乙烯脱水山梨糖醇(诸如聚氧乙烯脱水山梨糖醇三油酸酯)、甘油、脱水山梨糖醇、蔗糖和季戊四醇的脂肪酸酯也是合适的非离子表面活性剂。合适的阳离子表面活性剂包括季铵盐，特别是卤化物，该季铵盐具有4个任选被卤素、苯基、取代的苯基或羟基取代的烃基；例如，含有至少一个C8C22烷基(例如十六烷基、月桂基、棕榈基、肉豆蔻基、油烯基等)作为N-取代基以及包含未取代的或卤代的低级烷基、苄基和/或羟基-低级烷基作为进一步取代基的季铵盐。
例如，可以在“McCutcheon's Detergents and Emulsifiers Annual”(MCPublishing Crop.,Ridgewood,New Jersey,1981)、“Tensid-Taschenbucw',2d ed.(Hanser Verlag,Vienna,1981)和”Encyclopaedia of Surfactants”(ChemicalPublishing Co.,New York,1981)中找到适用于这一目的的表面活性剂的更详细的说明。可以通过适合于待治疗的病况且适合于待给药的化合物、此处的蛋白质和片段的任何途径，来给药根据本发明该的肽、其同源物或衍生物(以及它们的生理学上可接受的盐或药物组合物，这些全部包括在术语“活性成分”中)。可能的途径包括区域性、全身性、口服(固体形式或吸入剂)、直肠、鼻腔、局部(包括眼、颊和舌下)、阴道和肠胃外(包括皮下、肌肉内、静脉内、皮内、动脉内、鞘内和硬膜外)。优选的给药途径可以根据例如接受者的病况或待治疗的疾病而变化。如本文所述，载体最佳地在与配方的其它成分相容并且对其接受者无害的意义上是“可接受的”。配方包括适用于口服、直肠、鼻腔、局部(包括口腔和舌下)、阴道或肠胃外(包括皮下、肌肉内、静脉内、皮内、动脉内、鞘内和硬膜外)给药的那些配方。该配方可以方便地以单位剂型存在，并且可以通过药学领域熟知的任何方法制备。这类方法包括使活性成分与构成一种或多种辅助成分的载体结合的步骤。通常，通过将活性成分与液体载体或细碎的固体载体或两者均匀且紧密地结合在一起，然后如果需要，将产品成形，由此制备该配方。适于口服给药的本发明配方可以作为离散单位存在，例如胶囊剂、扁囊剂或片剂，各自含有预定量的活性成分；作为粉末或颗粒；作为处于水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液；或作为水包油液体乳液或油包水液体乳液。活性成分也可以以大丸剂、药糖剂或糊剂形式存在。片剂可以任选地使用一种或多种辅助成分通过压缩或模塑制备。可以通过在合适的机器中压制任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂混合的自由流动形式的活性成分(如粉末或颗粒)来制备压缩片剂。可以通过在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末化合物的混合物来制备模制片剂。片剂可任选地包衣或刻痕，并可经配制以提供其中活性成分的缓慢或受控释放。
为了例如在皮肤(诸如关节的皮肤)上的局部治疗，任选地将该配方应用为以例如0.075至20％w/w的量的含有该活性成分的外用软膏或乳膏(包括处于0.1％至20％范围的活性成分，该范围中的增量为0.1％w/w，诸如0.6％w/w、0.7％w/w等)，特别地为0.2至15％w/w，且更特别地为0.5至10％w/w。当配制成软膏时，活性成分可与石蜡基或水混溶性软膏基质一起使用。可替代地，活性成分可以与水包油乳膏基质一起配制成的乳膏。如果需要，乳膏基质的水相可以包括例如至少30％w/w的多元醇，即具有两个或更多个羟基的醇，例如丙二醇、丁烷1,3-二醇、甘露醇、山梨糖醇、甘油和聚乙二醇(包括PEG400)及其混合物。局部配方可以理想地包括增强活性成分吸收或渗透通过皮肤或其它受影响区域的化合物。这种皮肤渗透促进剂的实例包括二甲基亚砜和相关的类似物。本发明乳液的油相可以以已知方式由已知成分构成。虽然该相可以仅包含乳化剂(也称为乳化剂)，但可取的是包含至少一种乳化剂与脂肪或油或与脂肪和油两者的混合物。任选地，亲脂性乳化剂与亲脂性乳化剂一起包含在内，它们起到稳定剂的作用，通常通过包括油和脂肪。具有或不具有稳定剂的乳化剂一起构成所谓的乳化蜡，并且该蜡与油和脂肪一起构成所谓的乳化软膏基质，该基质形成乳膏配方的油性分散相。
由于活性化合物在可能用于药物乳液配方的大多数油中的溶解度非常低，所以用于该配方的合适的油或脂肪的选择取决于实现所需的化妆品特性。因此，乳膏剂任选地应当是一种不油腻、无污染且可洗涤的产品，其具有适当的稠度以避免从管或其它容器中泄漏。可以使用直链或支链，一元烷基酯或二元烷基酯，诸如二异己二酸酯、异十六烷基硬脂酸酯、椰子脂肪酸的丙二醇二酯、肉豆蔻酸异丙酯、油酸癸酯、棕榈酸异丙酯和特别地硬脂酸丁酯、棕榈酸2-乙基己酯或被称为Crodamol CAP的支链酯的混合物。这些可以单独使用或组合使用，这取决于所需的性质。可替代地，可以使用高熔点脂质，如白色软石蜡和/或液体石蜡或其它矿物油。适于局部给药于眼睛的配方还包括滴眼剂，其中活性成分溶解或悬浮在合适的载体中，尤其是用于活性成分的水性溶剂中。活性成分可任选地以0.5至20％、有利地0.5至10％、特别是约1.5％w/w的浓度存在于此种配方中。适于在口腔中局部给药的配方包括在调味基质中包含活性成分的锭剂，该调味基质通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶；在惰性基质(诸如明胶和甘油或者蔗糖和阿拉伯树胶)中包含活性成分的软锭剂；和在合适的液体载体中包含活性成分的漱口水。用于直肠给药的配方可以作为栓剂存在，其具有包含例如可可脂或水杨酸酯的合适基质。其中载体为固体的适用于鼻腔给药的配方包括粒径例如为20至500微米(包括处于20至500微米范围内增量为5微米的粒径，诸如30微米、35微米等)的粗粉，其采用鼻吸的方式进行给药，即从靠近鼻子的粉末容器中通过鼻腔快速吸入。其中载体为液体的适合作为例如鼻喷雾剂或滴鼻剂给药的配方包括活性成分的水溶液或油溶液。适合于气雾剂给药的配方可以根据常规方法制备，并且可以与其它治疗剂一起递送。适用于阴道给药的配方可以作为含有除了该活性成分之外还含有本领域已知适合的载体的阴道栓剂、棉塞、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾剂配方而存在。适用于肠胃外给药的配方包括水性和非水性无菌注射溶液，该注射溶液可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂以及使该配方与预期接受者的血液等渗的溶质；和水性和非水性无菌悬浮液，该无菌悬浮液可以包含助悬剂和增稠剂。该配方可以存在于单剂量或多剂量容器(例如密封的安瓿和小瓶)中，并且可以在刚要使用之前仅需要添加无菌液体载体(例如注射用水)的冷冻干燥(冻干)条件存储。可以由前述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备临时注射溶液和悬浮液。
典型的单位剂量配方是含有如上所述每日剂量或每日亚剂量或其适当部分的活性成分的那些。应当理解的是，除了上述特别提及的成分之外，本发明的配方可以包括考虑到所讨论配方类型的本领域常规的其它试剂，例如适合于口服给药的配方可以包括调味剂。根据本发明所述的肽、其同源物或衍生物可以用来提供含有本发明的一种或多种化合物作为活性成分的控释药物配方(“控释配方”)，其中可以控制和调节活性成分的释放以允许更少的给药频率或者改进给定发明化合物的药代动力学或毒性特征。可以按照常规方法制备适于口服给药的控释配方，其中离散单位包含一种或多种本发明化合物。可以包括附加成分以控制组合物中活性成分的作用持续时间。因此，可通过选择合适的聚合物载体来得到控释组合物，该聚合物载体如聚酯、聚氨基酸、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、硫酸鱼精蛋白等。通过将活性成分掺入到聚合物质(例如水凝胶、聚乳酸、羟甲基纤维素、聚甲基丙烯酸甲酯和其它上述聚合物)的颗粒(例如微胶囊)中可以控制药物的释放速率以及作用持续时间。此类方法包括胶体药物递送系统，如脂质体、微球、微乳液、纳米粒子、纳米胶囊等。根据给药途径，药物组合物可能需要保护性包衣。适于注射的药物形式包括无菌水溶液或分散液和用于其临时制备的无菌粉末。因此，用于此目的的典型载体包括生物相容的水性缓冲液、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇等及其混合物。当几种活性成分组合使用时，它们不一定在待治疗的哺乳动物中同时直接发挥其联合治疗作用，鉴于这一事实，相应的组合物也可以是在分开但相邻的储存库或隔室中含有两种成分的医疗试剂盒或包装的形式。在后一种情况下，每种活性成分因此可以以适合于不同于其它成分的给药途径的方式配制，例如其中之一可以是口服或肠胃外配方的形式，而另一者是用于静脉注射的安瓿或者气雾剂的形式。
本发明中获得的溶细胞的NKT细胞在CD1d依赖同源激活后诱导APC细胞凋亡，影响树突细胞和B细胞(如体外和体内所证明的)并且在不存在IL-10和/或TGF-β的情况下通过接触依赖性机制抑制旁观T细胞。如WO 2012/069568中所讨论的，溶细胞的NKT细胞可以与天然和适应性Tregs区分开来。
现在将通过以下实施例说明本发明，提供该实施例没有任何限制意图。此外，本文描述的所有参考文献通过引证明确包括在本文中。
实施例
实施例1：评估肽的还原活性的方法
使用在Tomazzolli et al.(2006)Anal.Biochem.350,105–112中描述的荧光性来确定肽的还原酶活性。两个具有FITC标记的肽当它们经由二硫桥共价连接时变成自猝灭。在通过根据本发明所述的肽还原后，被还原的单个肽再次变为具有荧光。
使用具有“正常”还原肽的肽(即具有氧化还原基序但不具有附加组氨酸或色氨酸的肽)以及使用不包含氧化还原基序的肽进行对照实验。
在实践上，合成了FITC–NH-Gly-Cys-Asp-COOH肽(Eurogentec,Belgium)并且通过溶解在DMSO中进行自猝灭((FITC-Gly-Cys-Asp)ox)。随后，在96孔板上在PBS中使用附表中所列的肽(25μM)或使用2mM二硫苏糖醇(DTT)温育40分钟(25℃)，将2.5μM(FITC-Gly-Cys-Asp)ox还原。使用多板读出器(Applied Biosystems)，将还原测量为在494nm下激发后在530nm下荧光读数增加的函数。
实施例2：细胞激活(活化，activation)的确定
通过本发明的肽获得的抗原特异性NKT细胞能够驱使抗原呈递细胞凋亡。为了评估溶细胞的细胞的激活以及防止会驱使他们自身细胞调亡的溶细胞的细胞的最终过度激活，Akt和Shp的磷酸化状态允许在细胞激活(能够凋亡)和细胞过度激活(自身凋亡)之间建立相关性。
实施例3：人类重组CD1d的聚合
在68℃下，使用50μM具有CD1d结合基序和氧化还原基序的肽在Hepes缓冲液中将人类重组CD1d(300ng)温育15分钟。将50μM DTT在相同条件下用作阳性对照。然后将LDS样品缓冲液(7.5μl；非还原性)添加到15μl该肽/CD1d混合物中。然后将该混合物进行非还原PAGE。在考马斯蓝染色后，分析蛋白质条带中单体、二聚体或多聚体recCD1d的存在，通过降低的向凝胶中的迁移能力来识别。
实施例4：通过用在侧接残基中含有CD1d-限制性T细胞表位和硫醇还原酶基序的肽进行免疫来控制对因子VIII特异的NKT细胞的激活
以1周的时间间隔，用50μg含有CD1d限制性NKT细胞的肽对4组BALB/c因子VIII KO小鼠进行免疫4次。所使用的不同肽为：
GG FTNMFATWSPSK [SEQ ID NO:73]
CGHC GG FTNMFATWSPSK [SEQ ID NO:74]
HCGHC GG FTNMFATWSPSK [SEQ ID NO:75]
WCGHC GG FTNMFATWSPSK [SEQ ID NO:76]
然后通过皮下途径注射人的因子VIII，每次注射10IU，注射5次，每次间隔一周。最后一次免疫后10天，处死小鼠并通过磁性细胞分选制备脾NKT细胞。在通过IL-4和IFN-γ的产生来测量评估激活状态之前，用免疫肽和FVIII在体外刺激这类细胞两次。对照组根据相同的方案进行处理，但不接受任何肽疫苗接种。
与对照组相比，测量从用不同肽免疫的小鼠获得的因子VIII特异性NKT对IL-4和IFN-γ产生的减少。
实施例5：通过用含有CD1d限制性NKT细胞表位和硫代还原酶基序的肽进行免疫来抑制抗-Ad5IgG抗体应答
以一周的时间间隔，通过四次皮下注射50μg处于alum中的肽对不同组C57BL/6小鼠(n＝6)进行免疫。
所使用的不同肽为：
GG FIGLMYY [SEQ ID NO:77]
CHGC GG FIGLMYY [SEQ ID NO:78]
HCHGC GG FIGLMYY [SEQ ID NO:79]
WCHGC GG FIGLMYY [SEQ ID NO:80]
这些肽含有腺病毒(Ad5)的六位体蛋白的CD1d限制性NKT细胞表位。对照组(n＝6)小鼠接受处于alum中的生理血清而非肽。
然后，所有小鼠通过IV途径接受2次注射109个Ad5病毒颗粒，间隔1周。最后一次注射Ad5后10天，对小鼠进行放血，并在直接结合ELISA中测量针对Ad5颗粒的总IgG抗体的浓度。简而言之，Ad5病毒颗粒在聚苯乙烯板上不溶解，然后用稀释的小鼠血清洗涤并温育。在第二次洗涤后，通过向小鼠IgG中添加山羊抗血清来检测小鼠抗Ad5抗体的结合。
实施例6：通过由使用肽免疫小鼠引发的CD4+NKT细胞来诱导肿瘤细胞凋亡，该肽包含含有硫代还原酶基序的CD1d限制性NKT表位
以一周的时间间隔，通过四次皮下注射50μg处于alum中的肽，对不同组C57BL/6小鼠(n＝6)进行免疫。
所使用的不同肽为：
GG FDKLPGF [SEQ ID NO:81]
CGHC GG FDKLPGF [SEQ ID NO:82]
HCGHC GG FDKLPGF [SEQ ID NO:83]
WCGHC GG FDKLPGF [SEQ ID NO:84]
这类肽含有源自卵清蛋白的CD1d限制性NKT细胞表位。对照组(n＝6)小鼠接受处于alum中的生理血清而非肽。最后一次免疫后10天，处死小鼠，并且通过磁性细胞分选制备脾CD4+T细胞。这些细胞在体外用免疫肽刺激两次，然后通过IL-4和IFN-γ的产生来测量评估它们的激活状态。然后，在体外测定CD4+NKT细胞系杀死EG7肿瘤细胞的能力。EG7肿瘤细胞(H-2b)来源于用卵子(ova)构建体转导的胸腺瘤。由这些细胞呈递CD1d限制性卵子表位，已知这些细胞不足以触发NKT激活和肿瘤细胞杀伤。使用1μM DiOC18(3,3'-双十八环氧羰花青高氯酸盐，来自Invitrogen)在膜水平上标记EG7细胞。然后，在37℃下在NKT细胞系存在下将EG7细胞(1x105/孔)培养18小时，其中EG7细胞与NKT细胞的比率为1/1至1/5。首先用载有上述各肽的抗原呈递细胞在体外将NKT细胞系刺激4小时。18小时后，收获细胞并按照制造商的说明用Annexin V和7-AAD(细胞凋亡检测试剂盒；BD Biosciences)进行染色并且在FACSCantoll流式细胞仪(BD Biosciences)上进行分析。
实施例7：使用CD1d分子的四聚体检测MOG特异性CD4+NKT淋巴细胞
多发性硬化症是一种慢性脱髓鞘疾病，其中CD4+NKT细胞对自身抗原如髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)可能起关键作用。其实验等效物EAE(实验性自身免疫性脑脊髓炎)模仿大多数人类疾病的标志，并且被用于了解致病机制和描述新的治疗方法。因此，列举MOG特异性CD4+NKT细胞可以预测疾病结果。通过如上所述的算法和功能测定的组合，在小鼠MOG蛋白中识别了CD1d结合表位，对应于序列200至206。由已经诱导EAE的C57BL/6小鼠的脾制备了CD4+NKT细胞。首先使用磁珠从脾细胞悬浮液中除去CD4(-)细胞。如本领域已知的那样制备CD1d分子(H-2b)的四聚体，其包括荧光标记物诸如藻红蛋白。产生了合成肽，其包括CD1d限制性MOG NKT细胞表位。
所使用的肽是：
GG FLRVPCWKI [SEQ ID NO:85]
CGPC GG FLRVPCWKI [SEQ ID NO:86]
HCGPC GG FLRVPCWKI [SEQ ID NO:87]
WCGPC GG FLRVPCWKI [SEQ ID NO:88]
四聚体在室温下加载肽过夜。然后洗涤经加载的四聚体并且在37℃下用CD4+T细胞温育2小时。然后用荧光激活细胞分选系统读取悬浮液，并评估对MOG肽特异的NKT细胞的比例。
实施例8：通过用来源于间变性淋巴瘤激酶(ALK)的CD1d限制性NKT细胞表位引发的NKT细胞直接杀死H-2b肿瘤细胞(R113)
间变性淋巴瘤激酶是一种跨膜受体酪氨酸激酶，其在个体发育过程中在许多细胞上表达，但在成人生命中仅限于在外胚层来源的肿瘤上表达。因此，其被认为是与外胚层来源的所有肿瘤直接相关的致癌物，如动物模型和人类肿瘤所证明的。例如，高达60％的人乳腺癌表达ALK。小鼠来源的ALK+肿瘤细胞系是可获得的并且可用于评估本发明的ALK特异性溶细胞的NKT细胞是否能够杀死肿瘤细胞。使用加载了ALK的CD1d限制性NKT细胞表位(该表位添加有硫醇还原酶基序)的自体树突状细胞，将从幼稚小鼠的脾脏中获得的NKT细胞(C57BL/6,H-2b背景)刺激四次。
所使用的肽为：
GG WLQIVTWWGPGS [SEQ ID NO:89]
CHGC GG WLQIVTWWGPGS [SEQ ID NO:90]
HCHGC GG WLQIVTWWGPGS [SEQ ID NO:91]
WCHGC GG WLQIVTWWGPGS [SEQ ID NO:92]
由于NKT细胞本身具有溶细胞活性，我们包括在平行实验中通过暴露于不具有硫氧还蛋白基序的作为天然序列的相同CD1d-限制性NKT表位而刺激的细胞。最后一次刺激后10天，洗涤NKT细胞并加入到含有104个R113肿瘤细胞的细胞培养微孔板中，CD4与肿瘤细胞的比率为2比1。R113是从C57BL/6小鼠获得的肿瘤B细胞系，其组成型表达ALK。在共培养20小时后，评估R113肿瘤细胞的用作细胞凋亡标记的膜联蛋白V结合。
在第二个实验中，从未试验过的小鼠(naive mice)的脾脏中获得来自替代遗传背景的天然NKT细胞(BALB/c小鼠，H-2d背景)，并用装载有不同肽的自体树突细胞刺激四次。如上所述进行与BALB/c来源的ALK+肿瘤细胞系(VAC)的共培养。通过FACS评估膜联蛋白-V结合来测量肿瘤细胞的凋亡。
实施例9：通过用含有CD1d结合和硫代还原酶基序的肽的预免疫来预防EAE
EAE(实验性自身免疫性脑脊髓炎)是一种模型疾病，其中发生中枢神经系统脱髓鞘，并被认为是多发性硬化症的实验等效物。少数自身抗原被认为与疾病的诱发和维持有关，其中包括MOG(髓鞘少突胶质细胞糖蛋白)。使用包含MOG氨基酸35-55的CD1d结合肽表位，通过MOG免疫可以在C57BL/6小鼠中引发疾病。MOG含有与CD1d结合并激活NKT细胞的序列。
所使用的肽是：
GG FLRVPCWKI [SEQ ID NO:85]
CHGC GG FLRVPCWKI [SEQ ID NO:86]
HCHGC GG FLRVPCWKI [SEQ ID NO:87]
WCHGC GG FLRVPCWKI [SEQ ID NO:88]
使用SEQ ID NO:86、87或88或者作为对照使用天然序列的肽将C57BL/6小鼠组皮下免疫(50μg)四次。最后一次免疫后10天，将全部小鼠(包括未试验过、未免疫的动物)通过皮下注射处于CFA中的100μg MOG35-55肽/400μg乳酪分枝杆菌(Mycobacteriumbutyricum)并且腹腔注射处于NaCl中的300ng百日咳博德特氏菌(Bortetella pertussis)来诱导产生疾病。在第+2天，第二次注射百日咳博德特氏菌。跟踪随时间的变化的EAE迹象。
实施例10：用GAD65来源的肽预防和抑制自发性胰岛素依赖性糖尿病
非肥胖糖尿病(NOD)小鼠构成自发胰岛素依赖性糖尿病的合适动物模型。在这些动物中，如在人类中，在可以看到胰岛炎的时候观察到对自身抗原谷氨酸脱羧酶(GAD65)的早期免疫应答，其中该应答通过分子内和分子间扩散而延伸。通过向新生小鼠施用蛋白质诱导对GAD65的耐受性可防止糖尿病的发作。GAD65含有能够与CD1d结合的氨基酸序列。
所使用的肽是：
GG HTNVCFWFV [SEQ ID NO:93]
CHGC GG HTNVCFWFV [SEQ ID NO:94]
HCHGC GG HTNVCFWFV [SEQ ID NO:95]
WCHGC GG HTNVCFWFV [SEQ ID NO:96]
通过4次皮下注射从4周龄开始对雌性NOD小鼠进行免疫接种，并且通过与未免疫组相比，跟踪这些组中的每一组的血糖。
实施例11：预防因暴露于过敏原Der p 1引起的哮喘
来自屋尘螨(D.pteronyssinus)的过敏原经常与过敏性哮喘有关。Der p I是屋尘螨的主要过敏原。Der p I的序列含有对应于氨基酸序列38至44的CD1d结合基序。
所使用的肽是：
GG FSGVAATES [SEQ ID NO:97]
CGPC GG FSGVAATES [SEQ ID NO:98]
HCGPC GG FSGVAATES [SEQ ID NO:99]
WCGPC GG FSGVAATES [SEQ ID NO:100]
可通过连续3天鼻内滴注100μg Derp 1以在BALB/c小鼠中诱导过敏性哮喘。哮喘的特征在于支气管反应过度和嗜酸性粒细胞浸润到肺部的吸力。通过4次注射50μg SEQ IDNO:98、99或99的肽或者作为对照的天然序列的肽对BALB/c小鼠进行免疫。在最后一次免疫后10天，通过鼻腔滴注施用Der p1。测定气道对浸润嗜酸性粒细胞的肺部吸入乙酰甲胆碱的反应性。
序列表
<110> ImCyse SA
<120> 新免疫原性CD1d结合肽(Novel immunogenic CD1d binding peptides)
<130> IMCY-015-PCT
<150> 16166054.3
<151> 2016-04-19
<160> 102
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是His或Trp
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(4)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是Cys、Ser或Thr
<400> 1
Xaa Cys Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> misc
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是His或Trp
<220>
<221> misc
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> misc
<222> (4)..(5)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> misc
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是Cys、Ser或Thr
<400> 2
Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> misc
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是His或Trp
<220>
<221> misc
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> misc
<222> (5)..(6)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> misc
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是Cys、Ser或Thr
<400> 3
Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> misc
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是Cys、Ser或Thr
<220>
<221> misc
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> misc
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是His或Trp
<400> 4
Xaa Xaa Xaa Cys Xaa
1 5
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是Cys、Ser或Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是His或Trp
<400> 5
Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa
1 5
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是Cys、Ser或Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(6)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是His或Trp
<400> 6
Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是His或Trp
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(4)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 7
Xaa Cys Xaa Xaa Cys
1 5
<210> 8
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是His或Trp
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(6)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 8
Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys
1 5
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是His或Trp
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(6)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 9
Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys
1 5
<210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是His或Trp
<400> 10
Cys Xaa Xaa Cys Xaa
1 5
<210> 11
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是His或Trp
<400> 11
Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa
1 5
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(6)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是His或Trp
<400> 12
Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 13
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 13
Cys Xaa Xaa Cys
1
<210> 14
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> misc
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 14
Cys Xaa Xaa Ser
1
<210> 15
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 15
Cys Xaa Xaa Thr
1
<210> 16
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> misc
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 16
Ser Xaa Xaa Cys
1
<210> 17
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> misc
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 17
Thr Cys Cys Xaa
1
<210> 18
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H-C-X(2)-S
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(4)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 18
His Cys Xaa Xaa Ser
1 5
<210> 19
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 19
His Xaa Cys Xaa Xaa Ser
1 5
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(6)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 20
His Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Ser
1 5
<210> 21
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> misc
<222> (3)..(4)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 21
Trp Cys Xaa Xaa Ser
1 5
<210> 22
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> misc
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> misc
<222> (4)..(5)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 22
Trp Xaa Cys Xaa Xaa Ser
1 5
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> misc
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> misc
<222> (5)..(6)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 23
Trp Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Ser
1 5
<210> 24
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> misc
<222> (3)..(4)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 24
His Cys Xaa Xaa Thr
1 5
<210> 25
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 25
His Xaa Cys Xaa Xaa Thr
1 5
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(6)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 26
His Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Thr
1 5
<210> 27
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(4)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 27
Trp Cys Xaa Xaa Thr
1 5
<210> 28
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 28
Trp Xaa Cys Xaa Xaa Thr
1 5
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(6)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 29
Trp Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Thr
1 5
<210> 30
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 30
Ser Xaa Xaa Cys His
1 5
<210> 31
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 31
Ser Xaa Xaa Cys Xaa His
1 5
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(6)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 32
Ser Xaa Xaa Cys Xaa Xaa His
1 5
<210> 33
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 33
Ser Xaa Xaa Cys Trp
1 5
<210> 34
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 34
Ser Xaa Xaa Cys Xaa Trp
1 5
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(6)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 35
Ser Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Trp
1 5
<210> 36
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 36
Thr Xaa Xaa Cys His
1 5
<210> 37
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 37
Thr Xaa Xaa Cys Xaa His
1 5
<210> 38
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(6)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 38
Thr Xaa Xaa Cys Xaa Xaa His
1 5
<210> 39
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 39
Thr Xaa Xaa Cys Trp
1 5
<210> 40
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 40
Thr Xaa Xaa Cys Xaa Trp
1 5
<210> 41
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(6)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 41
Thr Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Trp
1 5
<210> 42
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 42
Cys Xaa Xaa Cys His
1 5
<210> 43
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 43
Cys Xaa Xaa Cys Xaa His
1 5
<210> 44
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(6)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 44
Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa His
1 5
<210> 45
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 45
Cys Xaa Xaa Cys Trp
1 5
<210> 46
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 46
Cys Xaa Xaa Cys Xaa Trp
1 5
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(6)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 47
Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Trp
1 5
<210> 48
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 48
His Cys Xaa Xaa Cys
1 5
<210> 49
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 49
His Xaa Cys Xaa Xaa Cys
1 5
<210> 50
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(6)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 50
His Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys
1 5
<210> 51
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 51
Trp Cys Xaa Xaa Cys
1 5
<210> 52
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 52
Trp Xaa Cys Xaa Xaa Cys
1 5
<210> 53
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(6)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 53
Trp Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys
1 5
<210> 54
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是Cys、Ser或Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 54
Xaa Xaa Xaa Cys
1
<210> 55
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是Cys、Ser或Thr
<400> 55
Cys Xaa Xaa Xaa
1
<210> 56
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> Xaa是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是Cys、Ser或Thr
<400> 56
His Xaa Cys Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 57
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> misc
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是Cys、Ser或Thr
<220>
<221> misc
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> misc
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 57
Xaa Xaa Xaa Cys Xaa His
1 5
<210> 58
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是Cys、Ser或Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 58
Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Trp
1 5
<210> 59
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是Cys、Ser或Thr
<400> 59
Trp Xaa Cys Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 60
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD1d结合基序
<220>
<221> misc
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是Phe、Trp、Tyr、His或Thr
<220>
<221> misc
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> misc
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是Val、Ile、Leu或Met
<220>
<221> misc
<222> (5)..(6)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> misc
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是Phe、Trp、Tyr、His或Thr
<400> 60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 61
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD1d结合基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是Phe、Trp、Tyr或His
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是Val、Ile、Leu或Met
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(6)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是Phe、Trp、Tyr或His
<400> 61
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 62
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD1d结合基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是Phe、Trp、Tyr或Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是Val、Ile、Leu或Met
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(6)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是Phe、Trp、Tyr或Thr
<400> 62
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 63
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD1d结合基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是Phe、Trp或Tyr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是Val、Ile、Leu或Met
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(6)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是Phe、Trp或Tyr
<400> 63
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 64
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD1d结合基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是Phe、Trp、Tyr或His
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是Ile、Leu或Met
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(6)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是Phe、Trp、Tyr或His
<400> 64
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 65
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD1d结合基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是Phe、Trp、Tyr、His或Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是Ile、Leu或Met
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(6)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是Phe、Trp、Tyr、His或Thr
<400> 65
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 66
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD1d结合基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是Phe、Trp或Tyr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是Ile、Leu或Met
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(6)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是Phe、Trp或Tyr
<400> 66
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 67
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是His或Trp
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(4)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是His或Trp
<400> 67
Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa
1 5
<210> 68
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 68
His Cys His Xaa Cys
1 5
<210> 69
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 69
Trp Cys Trp Xaa Cys
1 5
<210> 70
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 晚期内体靶向信号
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是Asp或Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(4)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是Ile或Leu
<400> 70
Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa
1 5
<210> 71
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 晚期内体靶向信号
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 71
Asp Xaa Xaa Leu Leu
1 5
<210> 72
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 晚期内体靶向序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是Phe、Tyr或Trp
<400> 72
Tyr Xaa Xaa Xaa
1
<210> 73
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子VIII
<400> 73
Gly Gly Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys
1 5 10
<210> 74
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子VIII
<400> 74
Cys Gly His Cys Gly Gly Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro
1 5 10 15
Ser Lys
<210> 75
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子VIII
<400> 75
His Cys Gly His Cys Gly Gly Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser
1 5 10 15
Pro Ser Lys
<210> 76
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子VIII
<400> 76
Trp Cys Gly His Cys Gly Gly Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser
1 5 10 15
Pro Ser Lys
<210> 77
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 六位体Ad5
<400> 77
Gly Gly Phe Ile Gly Leu Met Tyr Tyr
1 5
<210> 78
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 六位体Ad5
<400> 78
Cys His Gly Cys Gly Gly Phe Ile Gly Leu Met Tyr Tyr
1 5 10
<210> 79
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 六位体Ad5
<400> 79
His Cys His Gly Cys Gly Gly Phe Ile Gly Leu Met Tyr Tyr
1 5 10
<210> 80
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 六位体Ad5
<400> 80
Trp Cys His Gly Cys Gly Gly Phe Ile Gly Leu Met Tyr Tyr
1 5 10
<210> 81
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 卵清蛋白
<400> 81
Gly Gly Phe Asp Lys Leu Pro Gly Phe
1 5
<210> 82
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 卵清蛋白
<400> 82
Cys Gly His Cys Gly Gly Phe Asp Lys Leu Pro Gly Phe
1 5 10
<210> 83
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 卵清蛋白
<400> 83
His Cys Gly His Cys Gly Gly Phe Asp Lys Leu Pro Gly Phe
1 5 10
<210> 84
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 卵清蛋白
<400> 84
Trp Cys Gly His Cys Gly Gly Phe Asp Lys Leu Pro Gly Phe
1 5 10
<210> 85
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MOG
<400> 85
Gly Gly Phe Leu Arg Val Pro Cys Trp Lys Ile
1 5 10
<210> 86
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MOG
<400> 86
Cys Gly Pro Cys Gly Gly Phe Leu Arg Val Pro Cys Trp Lys Ile
1 5 10 15
<210> 87
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MOG
<400> 87
His Cys Gly Pro Cys Gly Gly Phe Leu Arg Val Pro Cys Trp Lys Ile
1 5 10 15
<210> 88
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MOG
<400> 88
Trp Cys Gly Pro Cys Gly Gly Phe Leu Arg Val Pro Cys Trp Lys Ile
1 5 10 15
<210> 89
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ALK
<400> 89
Gly Gly Trp Leu Gln Ile Val Thr Trp Trp Gly Pro Gly Ser
1 5 10
<210> 90
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ALK
<400> 90
Cys His Gly Cys Gly Gly Trp Leu Gln Ile Val Thr Trp Trp Gly Pro
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 91
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ALK
<400> 91
His Cys His Gly Cys Gly Gly Trp Leu Gln Ile Val Thr Trp Trp Gly
1 5 10 15
Pro Gly Ser
<210> 92
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ALK
<400> 92
Trp Cys His Gly Cys Gly Gly Trp Leu Gln Ile Val Thr Trp Trp Gly
1 5 10 15
Pro Gly Ser
<210> 93
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Gad65
<400> 93
Gly Gly His Thr Asn Val Cys Phe Trp Phe Val
1 5 10
<210> 94
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Gad65
<400> 94
Cys His Gly Cys Gly Gly His Thr Asn Val Cys Phe Trp Phe Val
1 5 10 15
<210> 95
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Gad65
<400> 95
His Cys His Gly Cys Gly Gly His Thr Asn Val Cys Phe Trp Phe Val
1 5 10 15
<210> 96
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Gad65
<400> 96
Trp Cys His Gly Cys Gly Gly His Thr Asn Val Cys Phe Trp Phe Val
1 5 10 15
<210> 97
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Derp1
<400> 97
Gly Gly Phe Ser Gly Val Ala Ala Thr Glu Ser
1 5 10
<210> 98
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Derp1
<400> 98
Cys Gly Pro Cys Gly Gly Phe Ser Gly Val Ala Ala Thr Glu Ser
1 5 10 15
<210> 99
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Gad65
<400> 99
His Cys Gly Pro Cys Gly Gly Phe Ser Gly Val Ala Ala Thr Glu Ser
1 5 10 15
<210> 100
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Derp1
<400> 100
Trp Cys Gly Pro Cys Gly Gly Phe Ser Gly Val Ala Ala Thr Glu Ser
1 5 10 15
<210> 101
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(4)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是Cys、Ser或Thr
<400> 101
His Cys Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 102
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氧化还原基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是Cys、Ser或Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 102
Xaa Xaa Xaa Cys His
1 5

Claims (15)

1.一种12至100个氨基酸的分离的免疫原性肽，其包含具有[FWYHT]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWYHT][SEQ ID NO:60]序列基序的抗原的CD1d结合肽表位、以及与所述表位直接相邻或相隔至多7个氨基酸的[HW]-X(0,2)-C-X(2)-[CST]([SEQ ID NO:1]、[SEQ ID NO:2]、[SEQ ID NO:3])或[CST]-X(2)-C-X(0,2)-[HW]([SEQ ID NO:4]、[SEQ ID NO:5]、[SEQ IDNO:6])氧化还原基序序列，该分离的免疫原性肽用于作为药物而应用，条件是所述肽在其序列中不含有MHC II类T细胞表位。
2.根据权利要求1所述的肽，其用于权利要求1所述的应用，条件是所述抗原在其序列中在所述表位的10个氨基酸的距离内不含有CD1d结合肽基序。
3.根据权利要求1或2所述的肽，其用于权利要求1所述的应用，其中CD1d结合肽序列基序是[FWY]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWY][SEQ ID NO:63]。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的肽，其用于权利要求1所述的应用，其中所述氧化还原基序是[HW]-C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:1]或[CST]-X(2)-C-[HW][SEQ ID NO:4]。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的肽，其用于权利要求1所述的应用，其中所述氧化还原基序是[HW]-C-X(2)-C[SEQ ID NO:7]或C-X(2)-C-[HW][SEQ ID NO:10]。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的肽，其用于权利要求1所述的应用，其中所述氧化还原基序是H-C-X(2)-C[SEQ ID NO:48]或C-X(2)-C-H[SEQ ID NO:42]。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的肽，其用于根据权利要求1的用途，其中所述肽具有在12至50个氨基酸的长度。
8.一种12至100个氨基酸的分离的免疫原性肽，其包含具有[FWYHT]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWYHT][SEQ ID NO:60]序列基序的抗原的CD1d结合肽、以及与表位直接相邻或相隔至多7个氨基酸的[HW]-X(0,2)-C-X(2)-[CST]([SEQ ID NO:1]、[SEQ ID NO:2]、[SEQ IDNO:3])或[CST]-X(2)-C-X(0,2)-[HW]([SEQ ID NO:4]、[SEQ ID NO:5]、[SEQ ID NO:6])氧化还原基序序列，
条件是所述肽在其序列中不含有MHC II类T细胞表位。
9.根据权利要求8所述的肽，条件是所述抗原在其序列中在所述氧化还原基序序列的10个氨基酸的距离内不含有CD1d结合肽基序。
10.根据权利要求8或9所述的肽，其中所述肽具有在12至50个氨基酸的长度。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的肽，其中所述氧化还原基序序列是[HW]-C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:1]或[CST]-X(2)-C-[HW][SEQ ID NO:4]。
12.根据权利要求8至11中任一项所述的肽，其中所述氧化还原基序序列是H-C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:101]或[CST]-X(2)-C-H[SEQ ID NO:102]。
13.根据权利要求8至12中任一项所述的肽，其中所述氧化还原基序是H-C-X(2)-C[SEQID NO:48]或C-X(2)-C-H[SEQ ID NO:42]。
14.一种用于获得NKT细胞群的方法，所述NKT细胞对于呈递具有CD1d结合肽表位的抗原的细胞是溶细胞的，所述方法包括以下步骤：
-提供外周血细胞；
-在体外使所述细胞与12至100个氨基酸的免疫原性肽接触，所述免疫原性肽包含具有[FWYHT]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWYHT][SEQ ID NO:60]序列基序的抗原的CD1d结合肽表位、以及与所述表位直接相邻或相隔至多7个氨基酸的[HW]-X(0,2)-C-X(2)-[CST]([SEQ IDNO:1]、[SEQ ID NO:2]、[SEQ ID NO:3])或[CST]-X(2)-C-X(0,2)-[HW]([SEQ ID NO:4]、[SEQ ID NO:5]、[SEQ ID NO:6])氧化还原基序序列，其中所述肽在其序列中不含有MHC II类T细胞表位；和
-在IL-2存在下扩增所述细胞。
15.一种用于制备肽的方法，其包括以下步骤：
-识别抗原内的具有[FWYHT]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWYHT][SEQ ID NO:60]序列基序的序列；
-制备12至100个氨基的肽，该肽包含上述识别的序列以及与所述序列直接相邻或相隔至多7个氨基酸的[HW]-X(0,2)-C-X(2)-[CST]([SEQ ID NO:1]、[SEQ ID NO:2]、[SEQ IDNO:3])或[CST]-X(2)-C-X(0,2)-[HW]([SEQ ID NO:4]、[SEQ ID NO:5]、[SEQ ID NO:6])氧化还原基序序列，
条件是所制备的序列在其序列中不含有MHC II类T细胞表位。
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