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CN108587898A - 一种数字pcr微滴的制备装置及其制备方法 - Google Patents

一种数字pcr微滴的制备装置及其制备方法 Download PDF

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CN108587898A CN201810427215.XA CN201810427215A CN108587898A CN 108587898 A CN108587898 A CN 108587898A CN 201810427215 A CN201810427215 A CN 201810427215A CN 108587898 A CN108587898 A CN 108587898A
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Abstract

本发明公开了一种数字PCR微滴的制备装置及其制备方法，涉及数字PCR技术领域。该数字PCR微滴的制备装置包括内壁设置有亲水涂层的毛细管、第一容器、移动装置和引流装置，其中，第一容器盛放用于PCR扩增必需物质的样本溶液，且第一容器能位于毛细管的入口端；移动装置与第一容器或毛细管连接，使第一容器和毛细管的入口端相互靠近或远离；引流装置用于将样本溶液和连续相引流至毛细管中。其中，数字PCR微滴的制备方法采用上述的数字PCR微滴的制备装置。本发明通过引流装置和移动装置之间的相互配合，实现将样本溶液和连续相交替引流至毛细管中，使得样本溶液形成数字PCR微滴，改变了常规的数字PCR微滴制备对特殊油相和表面活性剂的依赖，降低了成本。

Description

一种数字PCR微滴的制备装置及其制备方法
技术领域
本发明涉及数字PCR技术领域，尤其涉及一种数字PCR微滴的制备装置及其制备方法。
背景技术
在进行生物研究和实际检测时，有时待测DNA样品的量较少或者从样品中提取的待测DNA分子浓度较低时，为了得到较好的结果，通常需要先对样品分子的量进行聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)。虽然常规的PCR技术已广泛应用于生命科学研究及相关领域，并且在应用过程中不断得到改进，但目前仍然存在着耗时太长，操作繁琐，试剂消耗量大，扩增结果不稳定等缺点。因此人们一直在寻求更快速更简便的PCR方法。
基于微流控技术发展产生的数字PCR，具有比常规的PCR更小的反应体积、更快的反应速度、更低的系统噪声和更高的灵敏度。数字PCR技术在极微量核酸样本检测、复杂背景下稀有突变检测和表达量微小差异鉴定方面表现出的优势已被普遍认可，而其在基因表达研究、microRNA研究、基因组拷贝数鉴定、癌症标志物稀有突变检测、致病微生物鉴定、转基因成分鉴定、NGS测序文库精确定量和结果验证等诸多方面具有的广阔应用前景已经受到越来越多的关注。
数字PCR技术的策略概括起来非常简单，就是“分而治之”，具体通过将单个DNA分子封装到单独的微小的反应器中，其中微小的反应器可以是微滴，实现DNA分子间的相互隔离，每个DNA分子被限制在自己的反应器中单独的进行扩增，避免来自其他序列竞争。在合适的温度条件下完成DNA分子的扩增后，通过记录微滴的总体个数和可以检测到荧光信号的反应器个数，利用泊松分布算法就可以实现对DNA拷贝数的精确定量。
根据数字PCR的要求，目前市场上常见的方式包括了微流控液滴芯片(CN201710429242.6)、硅片微孔阵列(CN201510338390.8)、压电喷头(CN201210551846.5)、PDMS阵列(CN201710334689.5)等方式。
然而，CN201710429242.6专利中微液滴的形成依赖于微流控芯片，微流控芯片的操作需要连接泵等设备，操作复杂；微滴形成和运输对连续相液体要求较高，否则有液滴破裂的风险；通常采用氟油以及氟基表面活性剂，以此来降低微滴形成、扩增和检测过程中的破裂问题，氟油和氟基表面活性剂价格昂贵，因此成本较高。
CN201510338390.8专利中样本分散依赖于硅片上微孔的加工，此方式成本较高，对微孔一致性要求较高；
CN201210551846.5专利中涉及到高精度喷头，设备成本较高，该方法交叉污染风险较高；
CN201710334689.5专利中PDMS芯片批量生产工艺不成熟，需要一直保持负压环境，该方法灵活性较差，PDMS芯片比热较大，在扩增过程中增加了循环时间。
鉴于上述数字PCR方法实践的困难与缺陷，亟需提供一种数字PCR微滴的制备装置及其制备方法解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种数字PCR微滴的制备装置及其制备方法，以实现数字PCR液滴制备简单、高效且成本低。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一种数字PCR微滴的制备装置，包括：
毛细管，其内壁设置有亲水涂层；
第一容器，其盛放用于PCR扩增的样本溶液，且所述第一容器能位于所述毛细管的入口端；
移动装置，其与所述第一容器或所述毛细管连接，使所述第一容器和所述毛细管的入口端相互靠近或远离；
引流装置，其用于将所述样本溶液和连续相引流至所述毛细管中。
采用这种结构后，通过引流装置和移动装置之间的相互配合，实现将样本溶液和连续相交替引流至毛细管中，使得样本溶液形成数字PCR微滴，制备装置结构简单，成本低，解决了硅片微孔、高精度喷头及PDMS芯片等制备方法的设备成本及工艺要求较高、以及存在时间周期长及交叉污染风险等问题。
并且，通过在毛细管内壁设置亲水涂层，改变了常规的数字PCR微滴制备对特殊油相和表面活性剂的依赖，转而使用水相或者空气作为连续相，降低了成本，增加了通用性。
作为数字PCR微滴的制备装置的优选方案，所述毛细管由光致形变材料制成，所述引流装置为光源和光源控制装置，所述光源控制装置能够控制所述光源的强度和所述光源的位置。
由流体力学可知，液体在微小尺寸的管道中(例如毛细管)，浸润的液体会自动向管道尺寸更小的位置移动，这是由于不同的曲率压力导致轴向力的差别，锥形毛细管中完全浸润的液体会自动向较窄一端自驱动。根据该原理，通过光源照射由光致形变材料制成的毛细管，使得毛细管被光源照射部位直径变小，由于毛细管和样本溶液发生浸润，因此样本溶液在光源照射下进入该毛细管中。可见通过采用小型光源替代了传统的注射泵或者蠕动泵等引流装置，并且改变了数字PCR微滴制备对微流控芯片的依赖，因此降低了设备体积，降低了操作复杂程度，降低了成本。
作为数字PCR微滴的制备装置的优选方案，所述光源为LED灯或激光发生装置，所述光源设置有滤光片。
由于不同的光致形变材料需要与其适配的波长光源照射才能使其发生形变，采用普通低成本光源配以滤光片使用，可以减少成本以及增加光源的通用性。
作为数字PCR微滴的制备装置的优选方案，所微滴述制备装置还包括用于盛放所述连续相的第二容器，所述移动装置能够使所述第一容器和所述第二容器交替位于所述毛细管的入口端。
连续相可以为类似空气的气体状态或者聚合物水溶液的液体状态，通过设置第二容器可以用来盛放所述连续相为聚合物水溶液的液体。
作为数字PCR微滴的制备装置的优选方案，所述毛细管远离所述第一容器的一端连接有微滴存储结构。
其中，所述微滴存储结构可以采用生物学领域常用的EP管、96孔板等常用液体储存耗材，也可以采用毛细管。
作为数字PCR微滴的制备装置的优选方案，所述毛细管的内径为20-400μm，所述毛细管的长度为2-20㎝。
由于直径小于20μm的毛细管加工工艺难以实现；而直径大于400μm的毛细管生成微滴时，重力发挥很大作用，难以通过数字PCR微滴的制备装置实现主动上移。优选直径范围为80-100μm的毛细管。
一种数字PCR微滴的制备方法，采用上述的数字PCR微滴的制备装置，所述引流装置将所述样本溶液引流至所述毛细管中，接着所述引流装置将所述连续相引流至所述毛细管中，然后所述引流装置将所述连续相引流至所述毛细管中，重复上述操作至形成预设数量的微滴。
通过上述的数字PCR微滴的制备装置使得PCR微滴的制备方法更简单、成本更低。
作为上述的数字PCR微滴的制备方法的优选方案，所述连续相为聚合物水溶液，所述样本溶液中包括色甘酸钠。
由于常规数字PCR微滴的制备方法通常采用油相作为连续相，水相作为样本溶液；本发明的数字PCR微滴的制备方法中为了能通过毛细管制备微液滴，连续相使用水相，并且为了避免连续相和样本溶液之间水相和水相互溶，在样本溶液添加色甘酸钠，在连续相中添加聚合物，以此增加两相溶液界面张力，避免互溶；同时，通过在毛细管1内壁设置亲水涂层，改变了常规的数字PCR微滴制备对特殊油相和表面活性剂的依赖，转而使用水相作为连续相，降低了成本，增加了通用性。
作为上述的数字PCR微滴的制备方法的优选方案，所述聚合物为聚乙烯醇、丙烯酸树脂和聚乙二醇中的任意一种或至少两种的组合。
作为上述的数字PCR微滴的制备方法的优选方案，在所述连续相中，所述聚合物浓度在2-15wt％，在所述样本溶液中，所述色甘酸钠的浓度在5-15wt％；所述毛细管中相邻所述样本溶液和所述连续相的体积比为1:4-1:10。
采用这种方法后，样本溶液和连续相能够形成稳定的W/W(水/水)微滴体系，且该体系能够承受运输以及扩增过程的升降温度变化而不发生破裂。同时，通过在毛细管内壁设置亲水涂层，改变了常规的数字PCR微滴制备对特殊油相和表面活性剂的依赖，转而使用水相作为连续相，降低了成本，增加了通用性。
本发明的有益效果：
1)本发明的数字PCR微滴的制备装置，通过引流装置和移动装置之间的相互配合，实现将样本溶液和连续相交替引流至毛细管中，使得样本溶液形成数字PCR微滴，制备装置结构简单，成本低，解决了硅片微孔、高精度喷头及PDMS芯片灯制备方法的设备成本及工艺要求较高、以及存在时间周期长及交叉污染风险等问题。
2)本发明的数字PCR微滴的制备方法，通过使用添加适量色甘酸钠的样本溶液和采用聚合物水溶液作为连续相，使得样本溶液和连续相能够形成稳定的W/W(水/水)微滴体系，且该微滴体系能够承受运输以及扩增过程的升降温度变化而不发生破裂。同时，通过在毛细管内壁设置亲水涂层，改变了常规的数字PCR微滴制备对特殊油相和表面活性剂的依赖，转而使用空气或水相作为连续相，降低了成本，增加了通用性。
附图说明
图1是本发明提供的一种数字PCR微滴的制备装置的结构示意图。
图中：
1、毛细管；2、光源；3、光源控制装置；4、第一容器；5、第二容器；6、移动装置；61、容器托盘；7、微滴存储结构；8、温控板。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
本实施例公开了一种数字PCR微滴的制备装置，如图1所示。该数字PCR微滴制备装置包括毛细管1、第一容器4、移动装置6和引流装置。其中，毛细管1内壁设置有亲水涂层，这样可以确保毛细管1内壁和水相样本溶液相亲；第一容器4盛放用于PCR扩增的样本溶液，并且第一容器4能位于毛细管1的入口端；移动装置6与第一容器4或毛细管1连接，使第一容器4和毛细管1的入口端相互靠近或远离；引流装置用于将样本溶液和连续相引流至毛细管1中，其中引流装置可以为设置在毛细管1远离第一容器4一端的负压装置。采用这种结构后，通过引流装置和移动装置6之间的相互配合，实现将样本溶液和连续相交替引流至毛细管1中，使得样本溶液形成数字PCR微滴，制备装置结构简单，成本低，解决了硅片微孔、高精度喷头及PDMS芯片灯制备方法的设备成本及工艺要求较高、以及存在时间周期长及交叉污染风险等问题。并且，通过在毛细管1内壁设置亲水涂层，改变了常规的数字PCR微滴制备对特殊油相和表面活性剂的依赖，转而使用水相或者空气作为连续相，降低了成本，增加了通用性。
由流体力学可知，液体在微小尺寸的管道中(例如毛细管)，浸润的液体会自动向管道尺寸更小的位置移动，这是由于不同的曲率压力导致轴向力的差别，锥形毛细管1中完全浸润的液体会自动向较窄一端自驱动。根据该原理，本实施例中，毛细管1由光致形变材料制成，引流装置为光源2和光源控制装置3，光源控制装置3能够控制光源2的强度和光源2的位置。通过光源2照射由光致形变材料制成的毛细管1，使得毛细管1被光源2照射部位直径变小，由于毛细管1和样本溶液发生浸润，因此样本溶液在光源2照射下进入该毛细管1中。可见通过采用小型光源2替代了传统的注射泵或者蠕动泵等引流装置，并且改变了数字PCR微滴制备对微流控芯片的依赖，因此降低了设备体积，降低了操作复杂程度，降低了成本。其中，毛细管1的内径为20-400μm，毛细管1的长度为2-20㎝。由于直径小于20μm的毛细管加工工艺难以实现；而直径大于400μm的毛细管生成微滴时，重力发挥很大作用，难以通过数字PCR微滴的制备装置实现主动上移。优选直径范围为80-100μm的毛细管。
由于不同的光致形变材料需要与其适配的波长光源2照射才能使其发生形变，于本实施例中，光源2为LED灯或激光发生装置，光源2设置有滤光片。采用普通低成本光源2配以滤光片使用，可以减少成本以及增加光源2的通用性。
为了间隔毛细管1中相邻两部分样本溶液形成微滴，连续相可以为类似空气的气体状态或者聚合物水溶液的液体状态，但是空气并不能确保形成的微滴能够承受运输以及扩增过程中不发生破裂，为此，微滴制备装置还包括用于盛放液态连续相的第二容器5，通过设置第二容器5可以用来盛放连续相为聚合物水溶液的液体，移动装置6能够使第一容器4和第二容器5交替位于毛细管1的入口端。
具体的，移动装置6包括用于放置第一容器4和第二容器5的容器托盘61，这样可以保证第一容器4和第二容器5能够平稳地靠近或远离毛细管1的入口端。
另外，毛细管1远离第一容器4的一端连接有微滴存储结构7，其中，微滴存储结构7可以采用生物学领域常用的EP管、96孔板等常用液体储存耗材，也可以采用毛细管。并且微滴存储结构的一端可以根据PCR不同种类的需要进行连接温控板8，但并不是必须，例如恒温扩增数字PCR，不需要升降温过程。采用这种结构后，通过调节温控板8使得微滴存储结构7中的微滴处于合适温度，以便微滴中的样品进行聚合酶链反应(Polymerase ChainReaction，PCR)。其中微滴存储结构7可以为普通材质的毛细管，其中一端与光致形变材料的毛细管1连接，另一端连接负压装置，将样本溶液形成的微滴在微滴存储结构7中存储。在此，本发明并不对微滴存储结构7进行任何限制。
此外，本实施例还公开了一种数字PCR微滴的制备方法，该制备方法采用上述的数字PCR微滴的制备装置，引流装置将样本溶液引流至毛细管1中，接着引流装置将连续相引流至毛细管1中，然后引流装置将连续相引流至毛细管1中形成间隔，重复上述操作至形成预设数量的微滴。具体的，连续相为聚合物水溶液，聚合物为聚乙烯醇、丙烯酸树脂和聚乙二醇中的任意一种或至少两种的组合，其中，聚合物浓度在2-15wt％。并且，样本溶液中包括色甘酸钠，色甘酸钠的浓度在5-15wt％。毛细管1中相邻样本溶液和连续相的体积比为1:4-1:10。相比于常规数字PCR微滴的制备方法通常采用油相作为连续相，水相作为样本溶液；本发明的数字PCR微滴的制备方法中为了能通过毛细管制备微液滴，连续相使用水相，并且为了避免连续相和样本溶液之间水相和水相互溶，在样本溶液添加色甘酸钠，在连续相中添加聚合物，以此增加两相溶液界面张力，使得样本溶液和连续相能够形成稳定的W/W(水/水)微滴体系，且该体系能够承受运输以及扩增过程的升降温度变化而不发生破裂。同时，通过在毛细管1内壁设置亲水涂层，改变了常规的数字PCR微滴制备对特殊油相和表面活性剂的依赖，转而使用水相作为连续相，降低了成本，增加了通用性。
具体的，以检测突变类型p.L858R肺癌，目标基因为EGFR为例。
首先采购市售的EGFR(L858R)试剂盒，将样本溶液进行必要处理和核酸提取后，根据试剂盒说明书，将样本核酸溶液和试剂盒中的酶、引物、探针等试剂按比例混合，制成样本溶液，最后加入5-15wt％色甘酸钠，充分混匀脱泡后制成样本溶液。
然后，制取作为连续相的聚合物水溶液，连续相为2-15wt％的聚乙烯醇，充分搅拌，并过滤脱泡。
8μL样本溶液加入到第一容器4中，以及45μL连续相加入第二容器5中。
在移动装置6的作用下，第一容器4和第二容器5交替与光致形变材料的毛细管1的入口端接触，同时能够使毛细管1发生形变的光源2在光源控制装置3的作用下实时调节，即逐步扫描毛细管1从靠近毛细管1入口端逐步移动到靠近微滴存储结构7，光致形变材料的毛细管1在光源2照射下直径变小，因此样本溶液和连续相自动向直径更小的一端移动，最终达到微滴存储结构7。
并且，毛细管1入口端与盛放样本溶液的第一容器4接触时，光源2在光源控制装置3的作用下使得毛细管1的变形量小；毛细管1入口端与盛放连续相的第二容器5接触时，光源2在光源控制装置3的作用下使得毛细管1的变形量大；这样保证了样本溶液形成微滴后分散在大量连续相中，从而避免微滴在运输过程中破裂或者相邻微滴之间发生溶质交换。
重复上述过程，最终形成5000个微滴，每个微滴体积大约为1nL。
其中，本实施例中的样本溶液和连续相形成的W/W(水/水)微滴体系储存在微滴存储结构7中，进行变温或者恒温扩增，最终进行终点检测，完成整个数字PCR过程。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为了清楚说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种数字PCR微滴的制备装置，其特征在于，包括：
毛细管(1)，其内壁设置有亲水涂层；
第一容器(4)，其盛放用于PCR扩增的样本溶液，且所述第一容器(4)能位于所述毛细管(1)的入口端；
移动装置(6)，其与所述第一容器(4)或所述毛细管(1)连接，使所述第一容器(4)和所述毛细管(1)的入口端相互靠近或远离；
引流装置，其用于将所述样本溶液和连续相引流至所述毛细管(1)中。
2.根据权利要求1所述的数字PCR微滴的制备装置，其特征在于，所述毛细管(1)由光致形变材料制成，所述引流装置为光源(2)和光源控制装置(3)，所述光源控制装置(3)能够控制所述光源(2)的强度和所述光源(2)的位置。
3.根据权利要求2所述的数字PCR微滴的制备装置，其特征在于，所述光源(2)为LED灯或激光发生装置，所述光源(2)设置有滤光片。
4.根据权利要求1所述的数字PCR微滴的制备装置，其特征在于，所述制备装置还包括用于盛放所述连续相的第二容器(5)，所述移动装置(6)能够使所述第一容器(4)和所述第二容器(5)交替位于所述毛细管(1)的入口端。
5.根据权利要求1所述的数字PCR微滴的制备装置，其特征在于，所述毛细管(1)远离所述第一容器(4)的一端连接有微滴存储结构(7)。
6.根据权利要求1所述的数字PCR微滴的制备装置，其特征在于，所述毛细管(1)的内径为20-400μm；所述毛细管(1)的长度为2-20㎝。
7.一种数字PCR微滴的制备方法，其特征在于，采用权利要求1-6任意一项所述的数字PCR微滴的制备装置，所述引流装置将所述样本溶液引流至所述毛细管(1)中形成一个微滴，然后所述引流装置将所述连续相引流至所述毛细管(1)中，重复上述操作至形成预设数量的微滴。
8.根据权利要求7所述的数字PCR微滴的制备方法，其特征在于，所述连续相为聚合物水溶液，所述样本溶液中包括色甘酸钠。
9.根据权利要求8所述的数字PCR微滴的制备方法，其特征在于，所述聚合物为聚乙烯醇、丙烯酸树脂和聚乙二醇中的任意一种或至少两种的组合。
10.根据权利要求8或9所述的数字PCR微滴的制备方法，其特征在于，在所述连续相中，所述聚合物浓度在2-15wt％，所述样本溶液中，所述色甘酸钠的浓度在5-15wt％；所述毛细管(1)中相邻所述样本溶液和所述连续相的体积比为1:4-1:10。
CN201810427215.XA 2018-05-07 2018-05-07 一种数字pcr微滴的制备装置及其制备方法 Active CN108587898B (zh)

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