CN107233619A - 一种功能化的多孔钛金属骨植入材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种功能化的多孔钛金属骨植入材料及其制备方法，属于生物医用材料技术领域，由多孔钛金属基体和填充于多孔钛金属基体孔隙中的矿化的丝素蛋白材料组成；其中，多孔钛金属基体由钛金属颗粒通过3D打印制得；丝素蛋白材料为钙磷酸盐矿化的丝素蛋白。制备方法包括：1)根据需求制备个体化定制的3D打印多孔钛金属基体，且在多孔钛金属基体表面制备微纳米结构；2)制备含钙丝素蛋白；3)将含钙丝素蛋白填充于多孔钛金属基体的孔隙中，再进行磷酸盐矿化处理，最后经过冷冻干燥，制得功能化的多孔钛金属骨植入材料。该材料能够有效提高多孔材料的骨长入和材料表面的骨质沉积，从而提高医用骨植入物的骨整合效果和稳固性。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种功能化的多孔钛金属骨植入材料及其制备方法。
背景技术
创伤和疾病等造成的骨缺损给患者造成巨大痛苦。在骨损伤修复和功能重建中，由医用金属材料制备的骨骼内植物，比如医用金属螺钉、人工关节、口腔种植体等在骨缺损修复和功能重建中发挥着不可替代的作用。骨植入物与宿主骨组织良好整合并维持长期稳固对患者的临床预后十分关键，而植入物的稳定性取决于材料的骨整合效果。研究显示，骨植入物金属材料的多孔结构由于具有能降低金属的弹性模量，减小材料与骨界面的应力屏障，从而促进材料的骨整合等优点，被认为是未来骨植入物材料设计和制备的大趋势。医用材料的多孔结构需要人工设计和精确的结构制备，而这方面技术方案尚待改进。
患者的骨骼结构存在个体差异，不同部位骨骼也存在形态差异，骨缺损常常形态不规则，因而骨植入物需要形成相匹配的外形和内部结构。这使得根据患者的具体情况精确设计和制备个体化的骨骼植入物成为医学发展的大趋势，也是数字医学、精准医学和生物材料相关领域的研究重点。另一方面，有研究证明，多孔植入物内部不同大小的梯度孔隙设计，能有效优化其多方面的性能，而孔隙结构的精确设计和制备则是技术前提。
3D打印技术是一种融合近净成形和增材制造的新技术，近年来取得了快速发展，它可以完成复杂植入物的一次成形，因此可以完成一些传统制造工艺无法完成的设计，精确制作出更复杂的材料结构。其有望解决材料结构精确设计和制备的难题，也为个性化医疗提供了契机。钛及其合金是医疗中应用最多最可靠的材料之一，尤其在骨骼植入物材料领域始终是最佳选择。近年来随着材料3D打印技术的不断发展，通过3D打印制备结构精确定制的多孔金属植入物材料受到越来越多的重视。然而，3D打印钛植入物还面临两方面问题：一、钛金属材料本身的材料惰性使得骨组织在材料表面的再生和骨质沉积不佳，从而造成骨与材料的直接结合不够牢固；二、材料设计成多孔结构的主要目之一是为了促进骨组织通过孔隙向材料内部长入，然而现有方案制备的多孔植入物材料在体内的骨长入效果始终不够好，是一个待解决难题。
目前尚无在3D打印多孔钛金属孔隙中制备材料表面显微结构的骨植入物材料优化方案。
发明内容
为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种功能化的多孔钛金属骨植入材料及其制备方法，该材料能够有效提高多孔材料的骨长入和材料表面的骨质沉积，从而提高骨植入物的骨整合效果和稳固性。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种功能化多孔钛金属骨植入材料，所述的功能化的多孔钛金属骨植入材料由多孔钛金属基体和填充于多孔钛金属基体孔隙中的仿生矿化丝素蛋白材料组成。其中，多孔钛金属基体由钛金属颗粒通过3D打印技术制得，丝素蛋白材料采用钙磷酸盐矿化的丝素蛋白。
优选地，本发明所述的多孔钛金属基体材料采用纯钛或医用钛合金粉末通过3D打印制备而成，基体材料化学成分为Ti6Al4V合金或纯Ti。
优选地，本发明所述多孔金属材料孔隙率为60％～80％，弹性模量小于10GPa，孔隙直径为100～1000μm；可根据所需制备的不同植入物种类进行选择。比如制备骨骼骨折固定用金属螺钉时可选200μm的较小孔隙。
作为可选方式，用于3D打印的金属原材料粉末直径为10～50μm。可根据临床需要制备的具体植入物种类进行优化选择，比如对脊柱螺钉可选直径为10μm的小粉末，对于人工关节的制备可选50μm的较大粉末。
优选地，3D打印技术为电子束熔融3D打印、激光3D打印等所有能制备多孔金属材料的3D打印技术。
优选地，本发明所用多孔钛金属基体表面呈复合微纳米双重显微结构(即凹凸不平的微米结构及微米结构表面的纳米管)，复合微纳米双重显微结构由微米坑和管径为15～100nm的纳米管阵列构成。其中，微米结构为凹凸不平的微米坑；
优选地，纳米管采用二氧化钛纳米管，二氧化钛纳米管的直径为15～50nm；更优选地，二氧化钛纳米管的直径为15nm。
本发明所用的钙磷酸盐矿化的丝素蛋白为丝素蛋白纤维上沉积了钙磷酸盐晶体，其本身为一种具有不规则多孔结构的复合材料。优选地，钙磷酸盐与丝素蛋白的干重比例为1:3～8；更优选地，此比例为1:5。
本发明还公开了上述功能化的多孔钛金属骨植入材料的制备方法，包括以下步骤：
1)根据需求制备个体化定制的3D打印多孔钛金属基体，且在多孔钛金属基体表面制备微纳米结构；
2)制备含钙丝素蛋白；
3)将含钙丝素蛋白填充于多孔钛金属基体的孔隙中，再进行磷酸盐矿化处理，最后经冷冻干燥，制得功能化的多孔钛金属骨植入材料。
具体地，步骤1)具体操作为：
首先，采集患者的CT图像数据，在三维图像软件中设计出个体化定制的多孔植入物的外形和内部孔隙结构；设计杆件宽度为100～800μm，孔隙直径为100～1000μm，以正方体或正十二面体结构单位填充和扩展图像，得到目标植入物的三维图像，将该目标植入物的三维图像文件导入金属材料3D打印机，以多孔钛金属材料为原料，制得多孔钛金属基体；优选地，制得的多孔钛金属基体经过酒精、丙酮和蒸馏水超声清洗，每种洗涤液中清洗15～20min，洗去表面污物，50℃烘箱中烘干或者自然晾干后，备用。
其次，将制得的多孔钛金属基体浸入氢氟酸溶液中酸蚀处理，使其表面形成微米坑结构；优选地，所用氢氟酸溶液的浓度为50g/L，酸蚀处理时间为30～60min；阳极氧化电压为1～20V，处理时间为1h。
最后，在含有磷酸和氢氟酸的电解液中阳极氧化处理1h，电压设定为1～20V，在微米坑结构表面形成管径约为15～100nm的纳米管阵列，即在多孔钛金属基体表面制得微米和纳米级的复合微纳米双重显微结构。
优选地，多孔钛金属材料的直径为20～50μm；3D打印多孔钛金属的杆件宽度为100～800μm，孔隙直径为100～1000μm。
步骤2)具体操作为：
首先，按丝素蛋白的干重与材料内部孔隙总体积(可以根据三维图像数据估算需要填充的多孔金属材料的孔隙总体积)的比例称取对应量的丝素蛋白，将丝素蛋白加入9.3mol/L的LiBr溶液中，在60℃下恒温处理使其充分溶解，用去离子水透析72h去除溶液中的LiBr，制备得质量体积比为3％～6％丝素蛋白溶液；称取丝素蛋白的干重与多孔材料内部孔隙总体积的比例为0.1～0.3g：1cm3；透析时间大于等于72h；
其次，向丝素蛋白溶液中加入丝素蛋白干重质量5％的CaCl2，搅拌使其溶解，混合均匀，制得含钙丝素蛋白溶液。
步骤3)具体操作为：
将含钙丝素蛋白溶液从上方缓慢滴加在步骤1)制得的多孔钛金属基体表面，使溶液通过孔隙间的相互连通在材料内充分扩散均匀，滴加的量以溶液刚好充满孔隙为准，然后静置处理12～24h，使含钙丝素蛋白溶液在材料孔隙内形成水凝胶；将水凝胶材料浸没于Na2HPO4的水溶液中，于37℃下恒温静置48h以上，使丝素蛋白水凝胶内的钙离子与溶液中的磷酸根离子形成磷酸钙盐，并结晶于丝素蛋白纤维上，得到复合材料，再将该复合材料真空冷冻干燥，制得功能化的多孔钛金属骨植入材料。
优选地，Na2HPO4水溶液的浓度为10～18mM，pH＝8.5；复合材料在Na2HPO4水溶液中静置的时间为72h。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明公开的功能化的多孔钛金属骨植入材料，由多孔钛金属基体和填充于多孔钛金属基体孔隙中的丝素蛋白材料组成；其中，多孔钛金属基体由钛金属颗粒通过3D打印制得；丝素蛋白材料中为钙磷酸盐矿化的丝素蛋白(丝素蛋白和蛋白纤维表面结合上的钙磷酸盐是两种物质，“矿化”指的就是无机盐在丝素蛋白纤维表面结晶)。丝素蛋白与钙磷酸盐晶体形成的网状多孔结构本身具有“多孔人工仿生骨”的性质：丝素蛋白的本质是纤维蛋白，相当于骨质中的有机成分——胶原纤维，而钙磷酸盐本身就是骨质的主要无机成分，两者的结合方式类似天然骨质中羟基磷灰石晶体与一型胶原的结合方式。因此，本发明将钙磷酸盐矿化的丝素蛋白微孔材料复合于多孔金属孔隙内，可为骨组织细胞在孔隙内的粘附提供良好的微环境，诱导骨组织向孔隙内快速长入，从而解决多孔金属材料骨长入不佳的问题，促进多孔钛金属植入物材料与骨的良好整合和长期稳固。
进一步地，本发明的多孔钛金属基体表面呈复合微纳米双重显微结构，复合微纳米双重显微结构由微米结构和微米结构表面的纳米管构成。将微米级和纳米级表面形貌的优点和功效融合在一起，形成表面材料功能层，可有效降低钛金属材料的生物惰性，提高其组织兼容性；为成骨细胞等多种参与骨再生过程的细胞在金属表面的粘附提供更好的微环境，适宜尺寸的钛纳米微管可通过细胞膜上的粘附分子等对细胞内的代谢进程产生影响，改善材料-骨界面细胞的应激状态，促进细胞的功能发挥和材料表面骨质沉积，从而最终促进金属植入物材料与骨之间形成更牢固的直接结合。
本发明公开的功能化的多孔钛金属骨植入材料的制备方法，整个过程条件温和，能有效保持丝素蛋白等组分的天然原有属性，且不会产生有害的副产物，生物安全性高。
附图说明
图1为实施例1中利用3D打印制备的多孔钛合金材料基体。
图2为实施例1中最后制备得的功能化多孔钛金属骨植入物材料的照片。
图3为实施例1中制备得的复合材料的扫描电镜照片(微观)，显示了孔隙中填充的磷酸钙盐矿化丝素蛋白。
图4为实施例4中不同材料对材料表面成骨细胞细胞增殖的影响。
图5为实施例4中不同材料对材料表面成骨细胞内碱性磷酸酶酶活性(成骨分化程度)的影响。
图6为实施例5中不同骨植入材料植入兔股骨髁部后6周材料的骨结合分数统计数据。
附图中数据都是平均数±标准差；*代表和普通钛片组(普通医用实心钛金属材料)相比，数据有统计学差异(p<0.05)。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明公开了一种功能化多孔钛金属骨植入物材料的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：制备个体化定制的3D打印钛金属骨植入物材料基体。
采集患者的CT图像数据，在三维图像软件CAD中分析和设计出个体化的目标植入物材料外形和内部孔隙大小。以正方体或正六面体结构单位填充和扩展该图像，得到目标植入物的三维图像。将该三维图像文件导入金属材料3D打印机，以Ti6Al4V合金或纯Ti金属微球状粉末为原材料，3D打印制备得外形和孔隙结构与设计图形完全一致的多孔金属植入物。多孔金属植入物材料经过酒精、丙酮和蒸馏水超声清洗，每种洗涤液中20min，洗去表面污物，50℃烘箱中烘干或自然晾干备用。
步骤二：多孔钛金属表面微纳米结构的制备。
多孔钛金属材料基体浸入氢氟酸酸蚀处理，使其表面形成微米坑结构；然后在含有磷酸和氢氟酸的电解液中阳极氧化，通过调节阳极氧化电压，在微米坑形貌表面形成特定管径的纳米管阵列。从而在金属基体材料表面形成微米和纳米级的双重显微结构。
步骤三：制备丝素蛋白溶液。
根据三维图像数据估算需要填充的多孔金属材料的孔隙总体积。称取适量丝素蛋白，加入9.3M的LiBr溶液在60℃恒温4h使丝素蛋白充分溶解，之后对去离子水透析以除去溶液中的LiBr，制备得质量体积比为3～6％的丝素蛋白溶液，备用。
步骤四：在多孔金属材料孔隙内复合含钙离子的丝素蛋白水凝胶。
向步骤三制备好的丝素蛋白溶液中加入适量CaCl2，混合均匀。将该溶液从上方缓慢滴加在干燥的多孔钛金属基体上，使溶液通过孔隙间的相互连通在材料内充分均匀扩散，滴加的量以溶液刚好充满孔隙为准。将此复合材料放入50℃烘箱静置12-24h，使含钙丝素蛋白溶液在材料孔隙内形成水凝胶。
步骤五：磷酸钙盐在丝素蛋白纤维上的矿化沉积。
将步骤四制备的材料浸没在含Na2HPO4水溶液中，37℃恒温静置超过48h，使丝素蛋白水凝胶内的钙离子与溶液中的磷酸根离子形成磷酸钙盐，并结晶于丝素蛋白纤维上。再将此复合材料在真空冷冻干燥机内冷冻干燥48h，最终制备得表面具有微纳米形貌并在孔隙中复合了磷酸钙盐矿化丝素蛋白的3D打印多孔钛金属骨植入物材料。
实施例1
1.制备个体化定制的3D打印钛合金内植物材料
(1)采集患者骨缺损部位的CT图像数据，导入三维图像软件CAD中，根据患者具体情况分析和设计出个体化的目标内植物材料的外形和内部孔隙结构。其中，杆件宽度为200μm，平均孔隙直径为400μm，以正方体结构单位填充和扩展该图像，得到目标内植物的三维图像。
(2)将该三维图像文件导入电子束熔融(EBM)金属材料3D打印机，利用直径为30μm的Ti6Al4V合金粉末，通过3D打印制备得个体化定制的多孔金属内植物，参见图1。
(3)多孔金属内植物材料经过酒精、丙酮和蒸馏水超声清洗，每种洗涤液中20min，洗去表面污物，50℃烘箱中烘干或自然晾干备用。
2.多孔钛合金材料表面制备微纳米显微结构
(1)步骤1中制备的多孔钛金属材料浸入50g/L的氢氟酸酸蚀处理30min，使其表面形成微米坑结构。
(2)然后在含有磷酸和氢氟酸的电解液中阳极氧化1h，电压设定为7.5V，在微米坑结构表面形成管径约为20nm的纳米管阵列。从而在金属基体材料表面形成微米和纳米级的复合双重显微结构。
3.制备丝素蛋白溶液
根据三维图像数据估算需要填充的多孔金属材料的孔隙总体积。按丝素蛋白干重与材料内部孔隙总体积的比例为0.2g：1cm3的比例称取丝素蛋白。用去离子水配置9.3M的LiBr溶液用于溶解丝素蛋白。在适宜大小的离心管中加入丝素蛋白质量5倍体积的的LiBr溶液，丝素蛋白完全没入其中，60℃恒温4h，使丝素蛋白完全溶解于溶液中。再用截留分子量为3500D的适宜大小的透析袋将该溶液对去离子水进行透析，共72h，以除去溶液中的LiBr。透析完成后12000rmp/min转速离心20min，取上清，得到质量体积比为3～6％的丝素蛋白溶液，备用。
4.在多孔金属材料孔隙内复合含钙离子的丝素蛋白水凝胶。
向丝素蛋白溶液中按5wt％的比例加入CaCl2，搅拌使其溶解，混合均匀。将该溶液从上方缓慢滴加在干燥的多孔钛金属基体上，使溶液通过孔隙间的相互连通在材料内充分均匀扩散，滴加的量以溶液刚好充满孔隙为准。将此复合材料放入50℃烘箱静置12h，使含钙丝素蛋白溶液在材料孔隙内形成水凝胶。
5.磷酸钙盐在丝素蛋白纤维上的矿化沉积。
将步骤4制备的材料浸没在18mM Na2HPO4水溶液(pH＝8.5)中，37℃恒温静置72h，使丝素蛋白水凝胶内的钙离子与溶液中的磷酸根离子形成磷酸钙盐，并结晶于丝素蛋白纤维上。再将此复合材料在真空冷冻干燥机内，真空室中压力值低于1Pa，温度为-20℃，冷冻干燥48h，最终制备得表面具有微纳米形貌并在孔隙中复合了磷酸钙盐矿化丝素蛋白的3D打印多孔钛合金骨植入物材料，参见图2和图3。由图3可见，多孔材料孔隙内填充的磷酸盐矿化丝素蛋白呈现大小不同层级的疏松多孔结构，不仅利于成骨细胞等参与骨再生细胞的粘附和增殖，还可有效吸附体液中的活性蛋白成分，为局部组织再生提供良好的微环境，利于新生骨组织向孔隙内长入，促进材料的骨整合。
实施例2
1.制备个体化定制的3D打印纯钛金属骨植入物材料
(1)采集患者骨缺损部位的CT图像数据，导入三维图像软件CAD中，根据患者具体情况分析和设计出个体化的目标内植物材料的外形和内部孔隙结构。其中，杆件宽度为200μm，平均孔隙直径为400μm，以正十二面体结构单位填充和扩展该图像，得到目标内植物的三维图像。
(2)将该三维图像文件导入电子束熔融(EBM)金属材料3D打印机，利用直径约为30μm的纯钛金属粉末，通过3D打印制备得个体化定制的多孔纯钛金属材料。
(3)多孔纯钛金属材料经过酒精、丙酮和蒸馏水超声清洗，每种洗涤液中20min，洗去表面污物，50℃烘箱中烘干或自然晾干备用。
2.多孔钛合金材料表面制备微纳米显微结构
(1)步骤1中制备的多孔纯钛金属材料浸入50g/L的氢氟酸酸蚀处理30min，使其表面形成微米坑结构。
(2)然后在含有磷酸和氢氟酸的电解液中阳极氧化1h，电压设定为7.5V，在微米坑结构表面形成管径约为20nm的纳米管阵列。从而在金属基体材料表面形成微米和纳米级的复合双重显微结构。
3.制备丝素蛋白溶液
根据三维图像数据估算需要填充的多孔金属材料的孔隙总体积。按丝素蛋白干重与材料内部孔隙总体积的比例为0.2g：1cm3的比例称取丝素蛋白。用去离子水配置9.3M的LiBr溶液用于溶解丝素蛋白。在适宜大小的离心管中加入丝素蛋白质量5倍体积的的LiBr溶液，丝素蛋白完全没入其中，60℃恒温4h，使丝素蛋白完全溶解于溶液中。再用截留分子量为3500D的适宜大小的透析袋将该溶液对去离子水进行透析，共72h，以除去溶液中的LiBr。透析完成后12000rmp/min转速离心20分钟，取上清，得到质量体积比为3～6％的丝素蛋白溶液，备用。
4.在多孔纯钛金属材料孔隙内复合含钙离子的丝素蛋白水凝胶。
向丝素蛋白溶液中按5wt％的比例加入CaCl2，搅拌使其溶解，混合均匀。将该溶液从上方缓慢滴加在干燥的多孔钛金属基体上，使溶液通过孔隙间的相互连通在材料内充分均匀扩散，滴加的量以溶液刚好充满孔隙为准。将此复合材料放入50℃烘箱静置12h，使含钙丝素蛋白溶液在材料孔隙内形成水凝胶。
5.磷酸钙盐在丝素蛋白纤维上的矿化沉积。
将步骤4制备的材料浸没在含18mM Na2HPO4的水溶液(pH＝8.5)中，37℃恒温静置72h，使丝素蛋白水凝胶内的钙离子与溶液中的磷酸根离子形成磷酸钙盐，并结晶于丝素蛋白纤维上。再将此复合材料在真空冷冻干燥机内，真空室中压力值低于1Pa，温度为-20℃，冷冻干燥48h，最终制备得表面具有微纳米形貌并在孔隙中复合了磷酸钙盐矿化丝素蛋白的3D打印多孔纯钛金属骨植入物材料。
实施例3
1.制备个体化定制的3D打印钛合金骨植入物材料
(1)采集患者骨缺损部位的CT图像数据，导入三维图像软件CAD中，根据患者具体情况分析和设计出个体化的目标内植物材料的外形和内部孔隙结构。其中，杆件宽度为400μm，平均孔隙直径为800μm，以正十二面体结构单位填充和扩展该图像，得到目标内植物的三维图像。
(2)将该三维图像文件导入激光金属材料3D打印机，利用直径约为40μm的纯钛金属粉末，通过3D打印制备得个体化定制的多孔纯钛金属材料。
(3)多孔钛合金材料经过酒精、丙酮和蒸馏水超声清洗，每种洗涤液中20min，洗去表面污物，50℃烘箱中烘干或自然晾干备用。
2.多孔钛合金材料表面制备微纳米显微结构
(1)步骤1中制备的多孔钛合金材料浸入50g/L的氢氟酸酸蚀处理30min，使其表面形成微米坑结构。
(2)然后在含有磷酸和氢氟酸的电解液中阳极氧化1h，电压设定为10V，在微米坑结构表面形成管径约为30nm的纳米管阵列。从而在金属基体材料表面形成微米和纳米级的复合双重显微结构。
3.制备丝素蛋白溶液
根据三维图像数据估算需要填充的多孔金属材料的孔隙总体积。按丝素蛋白干重与材料内部孔隙总体积的比例为0.2g：1cm3的比例称取丝素蛋白。用去离子水配置9.3M的LiBr溶液用于溶解丝素蛋白。在适宜大小的离心管中加入丝素蛋白质量5倍体积的的LiBr溶液，丝素蛋白完全没入其中，60℃恒温4h，使丝素蛋白完全溶解于溶液中。再用截留分子量为3500D的适宜大小的透析袋将该溶液对去离子水进行透析，共72h，以除去溶液中的LiBr。透析完成后12000rmp/min转速离心20分钟，取上清，得到质量体积比为3～6％的丝素蛋白溶液，备用。
4.在多孔金属材料孔隙内复合含钙离子的丝素蛋白水凝胶。
向丝素蛋白溶液中按5wt％的比例加入CaCl2，搅拌使其溶解，混合均匀。将该溶液从上方缓慢滴加在干燥的多孔钛金属基体上，使溶液通过孔隙间的相互连通在材料内充分均匀扩散，滴加的量以溶液刚好充满孔隙为准。将此复合材料放入50℃烘箱静置18h，使含钙丝素蛋白溶液在材料孔隙内形成水凝胶。
5.磷酸钙盐在丝素蛋白纤维上的矿化沉积。
将步骤4制备的材料浸没在含12mM Na2HPO4的水溶液(pH＝8.5)中，37℃恒温静置72h，使丝素蛋白水凝胶内的钙离子与溶液中的磷酸根离子形成磷酸钙盐，并结晶于丝素蛋白纤维上。再将此复合材料在真空冷冻干燥机内，真空室中压力值低于1Pa，温度为-20℃，冷冻干燥48h，最终制备得表面具有微纳米形貌并在孔隙中复合了磷酸钙盐矿化丝素蛋白的3D打印多孔钛合金骨植入物材料。
实施例4评估功能化多孔钛合金骨植入物材料对成骨细胞细胞功能的影响
本实施例将实施例1中所制备的功能化多孔钛合金骨植入材料对骨组织再生中发挥关键作用的细胞——成骨细胞——细胞功能的影响，即给出该材料对成骨细胞的细胞增殖和成骨分化的提升作用。
实验方法：以普通的实心医用钛合金金属片为对照组材料，以实施例1中所制备的功能化多孔钛合金骨植入物材料为实验组材料，将各组材料在同等条件下在酒精、去离子水两种液体中分别超声清洗10分钟，室温自然晾干，之后利用C60射线照射1小时灭菌。利用分离培养的SD大鼠乳鼠颅骨的成骨细胞，将其按1×104个/毫升的细胞密度在每个材料上接种5×104个细胞，利用含10％FBS的DMEM细胞培养基，于12孔细胞培养板中进行材料与细胞的共培养。
分为2组：
1)普通钛片组
2)功能化多孔钛合金骨植入物材料组
培养的第3和第7天，用MTT法检测不同环境中成骨细胞细胞增殖活力的差异；培养的第7天，用碱性磷酸酶(ALP)酶活力检测试剂盒检测材料成骨细胞成骨分化程度(ALP活性反应成骨分化程度)，评价不同环境对成骨细胞成骨分化状态的影响。
结果参见图4和图5：与普通钛片上的细胞相比，功能化多孔钛合金骨植入材料上的细胞细胞增殖在第3和第7天分别提高了63％和69％(图4)，而ALP酶活性则是前者的1.51倍(图5)，两组间数据差异有统计学意义(p<0.05)。
结果分析：上述结果表明，按本发明所述技术方案制备的功能化多孔钛合金骨植入材料对成骨细胞的细胞增殖和成骨分化功能有明显促进作用，因而能有效促进材料周围的骨再生和材料的骨整合。
实施例5功能化多孔钛合金骨植入材料对体内骨再生和材料骨整合效果的提升作用
将实施例1中所制备的功能化多孔钛合金骨植入材料对糖尿病动物体内的材料周围骨再生和材料骨整合效果的促进作用。
实验方法：将四氧嘧啶(STZ)50mg/kg尾静脉注射于体重约3.5kg的雄性新西兰白兔，每天1次，连续3天。最后一次注射后7天，测空腹血糖，空腹血糖>300mg/dl为糖尿病动物，用于后续试验。取形态大小完全相同(直径10mm、厚3mm的圆饼状)的普通实心医用钛合金材料和实施例一中所制备的功能化多孔钛合金骨植入材料，在外科手术条件下，植入兔双侧股骨髁部植入。动物随机分为2组，每组12只：
1)普通钛片组；
2)功能化多孔钛合金骨植入材料组。
材料植入后6周取材，取植入了材料的股骨标本，标本经4％甲醛固定3天后用显微CT扫描(GE公司)检测。利用显微CT扫描数据计算骨植入物的骨结合分数，评价各组钛合金材料周围骨再生情况和材料骨整合效果。
结果如图6所示：在骨结合分数上，与普通的医用实心钛合金的55.4％相比，多孔钛合金骨植入材料的提高到了71.3％，组间数据有统计学差异(p<0.05)。
结果分析：上述结果说明，本发明制备的功能化多孔钛合金骨植入材料能有效促进体内骨植入物周围和材料空隙内的骨再生，提升材料的骨整合效果，从而增强金属骨植入物的稳定性。
综上所述，本发明与现有技术相比，优势明显：
1、本发明为了提高多孔材料孔隙内的骨长入效果，在多孔材料孔隙内形成良好的化学和结构微环境，从而诱导和促进骨组织的新生和向孔隙内长入，需要在孔隙内复合数量、结构和化学成分都适宜的功能性活性材料。本发明选择的丝素蛋白是从蚕丝中提取的天然纤维蛋白，含有18种氨基酸，其中的11种为人体必需氨基酸。丝素蛋白本身具有良好的机械性能和理化性质，如良好的柔韧性和抗拉伸强度、透气透湿性、缓释性等，而且经过不同处理可以得到不同的形态，如纤维、溶液、粉、膜以及凝胶等。丝素蛋白来源丰富、易于加工和修饰，安全无毒，可在体内降解，适于开发成功能性材料。
2、通过仿生矿化法使钙磷酸盐在溶液环境中均匀沉积在丝素蛋白形成的不规则多孔网状纤维结构表面，克服了以下问题：一、钙磷酸盐作为天然骨质的主要无机物组成成分，具有良好的骨诱导性，但其在金属材料表面不能牢固附着，很容易脱落，而其在丝素蛋白构成的网状纤维上形成均匀结晶后可牢固复合于材料孔隙内；二、丝素蛋白的骨诱导性有限，与钙磷酸盐的合理复合可有效提高其骨诱导性，能更好地促进材料-骨界面的骨再生。
3、丝素蛋白与钙磷酸盐晶体形成的网状多孔结构本身具有“多孔人工仿生骨”的性质：丝素蛋白的本质是纤维蛋白，相当于骨质中的有机成分——胶原纤维；而钙磷酸盐本身就是骨质的无机成分；两者的结合方式类似天然骨质中羟基磷灰石晶体与一型胶原的结合方式。这种钙磷酸盐矿化的丝素蛋白微孔材料复合于多孔金属孔隙内，可为骨组织细胞在孔隙内的粘附提供良好的微环境，诱导骨组织向孔隙内快速长入，从而解决多孔金属材料骨长入不佳的问题，促进多孔钛金属植入物材料与骨的良好整合和长期稳固。
4、通过溶液中酸蚀和阳极氧化法，可在3D打印多孔钛金属表面(包括孔隙内)均匀地制备微纳米显微结构，将微米级和纳米级表面形貌的优点和功效融合在一起，形成表面材料功能层。其可有效降低钛金属材料的生物惰性，提高其组织兼容性；为成骨细胞等多种参与骨再生过程的细胞在金属表面的粘附提供更好的微环境，适宜尺寸的钛纳米微管可通过细胞膜上的粘附分子等对细胞内的代谢进程产生影响，改善材料-骨界面细胞的应激状态，促进细胞的功能发挥和材料表面骨质沉积，从而最终促进金属植入物材料与骨之间形成更牢固的直接结合。
5、材料与骨的直接结合效果取决于骨修复过程中材料表面的骨质沉积效果。材料表面的拓扑形貌对周围组织细胞的行为产生显著影响，材料表面的显微结构优化可促进材料表面的骨再生和骨质沉积。不同尺度的材料表面形貌对细胞行为产生不同影响，微米级和纳米级的表面结构会通过不同机制促进金属表面的细胞活力、蛋白吸附、骨质再生和沉积。
Claims (10)
1.一种功能化的多孔钛金属骨植入材料，其特征在于，该多孔钛金属骨植入材料由多孔钛金属基体和填充于多孔钛金属基体孔隙中的丝素蛋白材料组成；其中，多孔钛金属基体由钛金属颗粒通过3D打印制得；丝素蛋白材料为钙磷酸盐矿化的丝素蛋白。
2.根据权利要求1所述的功能化的多孔钛金属骨植入材料，其特征在于，多孔钛金属为纯钛或医用钛合金。
3.根据权利要求1所述的功能化的多孔钛金属骨植入材料，其特征在于，多孔钛金属基体表面呈复合微纳米双重显微结构，复合微纳米双重显微结构由微米结构和微米结构表面的纳米管构成。
4.根据权利要求1所述的功能化的多孔钛金属骨植入材料，其特征在于，钙磷酸盐矿化的丝素蛋白是在丝素蛋白纤维上通过仿生矿化沉积磷酸钙盐结晶，丝素蛋白采用蚕丝丝素蛋白。
5.根据权利要求1所述的功能化的多孔钛金属骨植入材料，其特征在于，按每立方厘米的孔隙体积填充0.1～0.3g丝素蛋白材料的比例，将丝素蛋白材料填充于多孔钛金属基体的孔隙中。
6.根据权利要求1所述的功能化的多孔钛金属骨植入材料，其特征在于，多孔钛金属基体的孔隙率为60％～80％，弹性模量小于10GPa，孔隙直径为100～1000μm。
7.权利要求1～6中任意一项所述的功能化的多孔钛金属骨植入材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)根据需求制备个体化定制的3D打印多孔钛金属基体，且在多孔钛金属基体表面制备微纳米结构；
2)制备含钙丝素蛋白；
3)将含钙丝素蛋白填充于多孔钛金属基体的孔隙中，再进行磷酸盐矿化处理，最后经冷冻干燥，制得功能化的多孔钛金属骨植入材料。
8.根据权利要求7所述的功能化的多孔钛金属骨植入材料的制备方法，其特征在于，步骤1)具体操作为：
首先，采集患者的CT图像数据，在三维图像软件中设计出个体化定制的多孔植入物的外形和内部孔隙结构；设计杆件宽度为100～800μm，孔隙直径为100～1000μm，以正方体或正十二面体结构单位填充和扩展图像，得到目标植入物的三维图像，将该目标植入物的三维图像文件导入金属材料3D打印机，以钛金属材料颗粒为原料，打印制得多孔钛金属基体；
其次，将制得的多孔钛金属基体浸入氢氟酸溶液中酸蚀处理，使其表面形成微米坑结构；
最后，在含有磷酸和氢氟酸的电解液中阳极氧化处理，电压设定为1～20V，在微米坑结构表面形成管径约为15～100nm的纳米管阵列，即在多孔钛金属基体表面制得微米和纳米级的复合微纳米双重显微结构。
9.根据权利要求7所述的功能化的多孔钛金属骨植入材料的制备方法，其特征在于，步骤2)具体操作为：
首先，按丝素蛋白的干重与材料内部孔隙总体积的比例称取对应量的丝素蛋白，将丝素蛋白加入LiBr溶液中，在60℃下恒温处理使其充分溶解，透析去除溶液中的LiBr，制备得丝素蛋白溶液；
其次，向丝素蛋白溶液中加入丝素蛋白干重质量5％～8％的CaCl2，搅拌使其溶解，混合均匀，制得含钙丝素蛋白溶液。
10.根据权利要求9所述的功能化的多孔钛金属骨植入材料的制备方法，其特征在于，步骤3)具体操作为：
将含钙丝素蛋白溶液从上方滴加在步骤1)制得的多孔钛金属基体表面至充满基体表面的孔隙，静置处理12～24h，浸没于Na2HPO4的水溶液中，于37℃下恒温静置48h以上，得到复合材料，再将该复合材料真空冷冻干燥，制得功能化的多孔钛金属骨植入材料。
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