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CN106215179A - 免疫原性疫苗 - Google Patents

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CN106215179A
CN106215179A CN201610602144.3A CN201610602144A CN106215179A CN 106215179 A CN106215179 A CN 106215179A CN 201610602144 A CN201610602144 A CN 201610602144A CN 106215179 A CN106215179 A CN 106215179A
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glycolipopeptide
epitope
component
peptide
mucl
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CN201610602144.3A
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G-J.邦斯
M.沃尔费尔特
S.J.金德勒
V.拉克什米纳拉亚南
P.A.科亨
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Mayo Foundation for Medical Education and Research
University of Georgia Research Foundation Inc UGARF
Original Assignee
Mayo Foundation for Medical Education and Research
University of Georgia Research Foundation Inc UGARF
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Abstract

本发明公开了用作治疗或预防疫苗的包含碳水化合物组分、脂质组分和MUC1肽组分的糖脂肽，其诱导体液免疫应答和细胞免疫应答两者。

Description

免疫原性疫苗
本申请是申请日为2011年6月10日，申请号为201180039067.0，发明名称为“免疫原性疫苗”的发明专利的分案申请。本申请要求于2010年6月11日提交的美国临时申请序列号61/354,076和于2010年12月30日提交的美国专利申请序列号13/002,180的利益，所述专利各自通过引用以其整体并入本文。
政府权利声明
本发明在由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)的美国国家癌症研究所(National Cancer Institute)授予的补助号R01 CA088986下由政府支持进行。美国政府在本发明中拥有一定权利。
背景
大量肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)以糖脂和糖蛋白的形式在人癌细胞上表达。致癌转化细胞的共同特征是寡糖例如Globo-H、LewisY和Tn抗原的过表达。众多研究已显示这种异常糖基化可以促进转移，且因此它与癌症患者的弱存活率强烈关联。
作为这些肿瘤相关碳水化合物抗原的特征的差异表达致使其成为用于免疫疗法和癌症疫苗开发的有吸引力的靶。近来，几个一流研究已尝试利用肿瘤相关碳水化合物的差异表达用于开发癌症疫苗(例如Raghupathi，1996，Cancer Immunol；43:152-157；Musselli等人，2001，J Cancer Res Clin Oncol；127:R20-R26；Sabbatini等人，2000，IntJ Cancer；87:79-85；Lo-Man等人，2004，Cancer Res；64:4987-4994；Kagan等人，2005，Immunol Immunother；54:424-430)。
碳水化合物抗原在人免疫缺陷病毒(HIV)——获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的成因剂的表面上也是丰富的。丙型肝炎病毒(HCV)也已知含有碳水化合物抗原。
对于大多数免疫原(包括碳水化合物)，抗体产生取决于两个类型的淋巴细胞B细胞和辅助T细胞的协同相互作用。然而，碳水化合物单独不能激活辅助T细胞，并且因此特征在于弱免疫原性。低亲和力IgM抗体的形成和IgG抗体的不存在体现这种有限的免疫原性。已证明难以克服表征这些抗原的免疫耐受。
在激活辅助T细胞的努力中，研究者已使碳水化合物抗原与外源载体蛋白质缀合，所述外源载体蛋白质例如匙孔血蓝蛋白(KLH)或去毒破伤风类毒素(TT)。载体蛋白质增强碳水化合物对于免疫系统的呈递，且供应可以激活T辅助细胞的T表位(一般为12-15个氨基酸的肽片段)。
然而，碳水化合物与载体蛋白质的缀合具有几个新问题。缀合化学难以控制，导致产生具有可以影响免疫应答的再现性的在组成和结构方面的含糊性的缀合物。此外，外源载体蛋白质可以引发强B细胞应答，其依次又可以导致针对碳水化合物表位的抗体应答的抑制。当采用自身抗原例如肿瘤相关碳水化合物时，后者特别成问题。此外，用于使碳水化合物与蛋白质缀合的接头可以自身是免疫原性的，导致表位抑制。关于在疫苗中基于脂质和碳水化合物的佐剂/载体的综述，还参见McGeary等人(J. Peptide Sci. 9(7)：405-418，2003)。
并不令人惊讶地，用碳水化合物-蛋白质缀合物癌症疫苗的几个临床试验未能在所有患者中诱导足够强的辅助T细胞应答。因此，需要开发可替代策略用于呈递肿瘤相关碳水化合物表位，其将导致更有效的向IgG抗体的类别转换。这些策略可以证明对于基于其他碳水化合物表位(特别是来自致病病毒例如HIV和HCV的那些)的疫苗开发也是有用的。
发明概述
本发明包括在受试者中生成抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的方法，该方法包括用糖脂肽(glycolipopeptide)免疫接种受试者，所述糖脂肽包括：包括B细胞表位的至少一种糖基化MUC1糖肽组分；包括MHC II类限制性辅助T细胞表位的至少一种肽组分；和至少一种脂质组分。在一些方面，ADCC是天然杀伤(NK)细胞介导的。在一些方面，ADCC裂解肿瘤细胞。在一些方面，肿瘤细胞是乳腺癌细胞或上皮癌细胞。在一些方面，ADCC裂解表达MUC1肽序列的细胞。在一些方面，MUC1肽是异常糖基化的。
本发明包括治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括用糖脂肽免疫接种受试者，所述糖脂肽包括：包括B细胞表位的至少一种糖基化MUC1糖肽组分；包括MHC II类限制性辅助T细胞表位的至少一种肽组分；和至少一种脂质组分。
本发明包括减少受试者中的肿瘤负荷的方法，该方法包括用糖脂肽免疫接种受试者，所述糖脂肽包括：包括B细胞表位的至少一种糖基化MUC1糖肽组分；包括MHC II类限制性辅助T细胞表位的至少一种肽组分；和至少一种脂质组分。
本发明包括预防受试者中的肿瘤复发的方法，该方法包括用糖脂肽免疫接种受试者，所述糖脂肽包括：包括B细胞表位的至少一种糖基化MUC1糖肽组分；包括MHC II类限制性辅助T细胞表位的至少一种肽组分；和至少一种脂质组分。
本发明包括预防受试者中的癌症的方法，该方法包括用糖脂肽免疫接种受试者，所述糖脂肽包括：包括B细胞表位的至少一种糖基化MUC1糖肽组分；包括MHC II类限制性辅助T细胞表位的至少一种肽组分；和至少一种脂质组分。
在本发明的方法的一些方面，癌症或肿瘤是乳腺癌或上皮癌。
在本发明的方法的一些方面，癌症或肿瘤表达异常糖基化的MUC1。
本发明包括在受试者中生成针对MUC1表达细胞的细胞毒性T细胞应答的方法，该方法包括用糖脂肽免疫接种受试者，所述糖脂肽包括：包括B细胞表位的至少一种糖基化MUC1糖肽组分；包括MHC II类限制性辅助T细胞表位的至少一种肽组分；和至少一种脂质组分。在一些方面，MUC1表达细胞是肿瘤细胞。
本发明包括促进在受试者中的抗MUC1抗体类别转换的方法，该方法包括用糖脂肽免疫接种受试者，所述糖脂肽包括：包括B细胞表位的至少一种糖基化MUC1糖肽组分；包括MHC II类限制性辅助T细胞表位的至少一种肽组分；和至少一种脂质组分。
本发明包括免疫接种受试者的方法，该方法包括用糖脂肽免疫接种受试者，所述糖脂肽包括：包括B细胞表位的至少一种糖基化MUC1糖肽组分；包括MHC II类限制性辅助T细胞表位的至少一种肽组分；和至少一种脂质组分；其中在受试者中诱导特异性结合在肿瘤细胞上表达的MUC1蛋白质的IgG亚型抗体。
在本发明的方法的一些方面，包括B细胞表位的糖基化MUC1糖肽组分包括在一个或多个丝氨酸和/或苏氨酸残基上的糖基化。
在本发明的方法的一些方面，包括B细胞表位的糖基化MUC1糖肽组分包括用选自下述的糖残基进行的糖基化：GalNAc、GlcNAc、Gal、NANA、NGNA、岩藻糖、甘露糖和葡萄糖。
在本发明的方法的一些方面，糖脂肽包括图19中所示的那些之一。
在本发明的方法的一些方面，包括B细胞表位的糖基化MUC1糖肽组分是I类MHC限制性表位。
在本发明的方法的一些方面，包括B细胞表位的糖基化MUC1糖肽组分和/或包括MHC II类限制性辅助T细胞表位的肽组分包括人MUC1肽序列。
在本发明的方法的一些方面，包括B细胞表位的糖基化MUC1糖肽组分和/或包括MHC II类限制性辅助T细胞表位的肽组分包括与受试者的内源MUC1序列同源的氨基酸序列。
在本发明的方法的一些方面，包括B细胞表位的糖基化MUC1糖肽组分和/或包括MHC II类限制性辅助T细胞表位的肽组分包括MUC1蛋白质序列的约5–30个氨基酸，所述MUC1蛋白质序列包括MUC1蛋白质的胞外区，且包括糖基化的一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基。
在本发明的方法的一些方面，包括B细胞肽表位的MUC1糖肽组分包括与SAPDTRPAP(SEQ ID NO:20)、TSAPDTRPAP (SEQ ID NO:21)、SAPDTRPL (SEQ ID NO:22)或TSAPDTRPL(SEQ ID NO:23)具有至少约50%序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，氨基酸序列包括在一个或多个丝氨酸和/或苏氨酸残基上的糖基化。在本发明的方法的一些方面，包括B细胞肽表位的MUC1糖肽组分包括SAPDTRPAP (SEQ ID NO:20)、TSAPDTRPAP (SEQ ID NO:21)、SAPDTRPL (SEQ ID NO:22)或TSAPDTRPL(SEQ ID NO:23)。在一些方面，氨基酸序列包括在一个或多个丝氨酸和/或苏氨酸残基上的糖基化。
在本发明的方法的一些方面，脂质组分包括一条或多条脂质链、一个或多个半胱氨酸残基和一个或多个赖氨酸残基。
在本发明的方法的一些方面，脂质组分包括Toll样受体(TLR)配体。在一些方面，Toll样受体(TLR)配体包括TLR2配体。在一些方面，TLR2配体包括Pam3CysSK4。
在本发明的方法的一些方面，脂质组分包括TLR9激动剂Pam3CysSK4。在本发明的方法的一些方面，脂质组分包括脂质佐剂。在一些方面，脂质佐剂包括脂质化氨基酸(LAA)。
在本发明的方法的一些方面，包括MHC II类限制性辅助T细胞表位的肽组分包括脊髓灰质炎病毒序列KLFAVWKITYKDT (SEQ ID NO:3)。
在本发明的方法的一些方面，包括MHC II类限制性辅助T细胞表位的肽组分包括T细胞泛DR表位PADRE序列AKFVAAWTLKAAA (SEQ ID NO:24)或FVAAWTLKAAA (SEQ ID NO:25)。
在本发明的方法的一些方面，包括MHC II类限制性辅助T细胞表位的肽组分包括MUC1衍生的MHC II类限制性辅助T细胞肽表位。在一些方面，MUC1衍生的B细胞肽表位和MUC1衍生的MHC II类限制性辅助T细胞肽表位包括邻接氨基酸序列。在一些方面，邻接氨基酸序列是在一个或多个苏氨酸和/或丝氨酸残基上糖基化的。
在本发明的方法的一些方面，MUC1衍生的B细胞肽表位和MUC1衍生的MHC II类限制性辅助T细胞肽表位包括邻接氨基酸序列。在一些方面，邻接氨基酸序列包括与氨基酸序列APGSTAPPAHGVTSA (SEQ ID NO:26)、APGSTAPPAHGVTSAPDTRPL (SEQ ID NO:27)、APGSTAPPAHGVTSAPDTRPL (SEQ ID NO:28)或APGSTAPPAHGVTSAPDTRPL (SEQ ID NO:29)具有至少约50%序列同一性的序列。在一些方面，邻接氨基酸序列包括氨基酸序列APGSTAPPAHGVTSA (SEQ ID NO:26)、APGSTAPPAHGVTSAPDTRPL (SEQ ID NO:27)、APGSTAPPAHGVTSAPDTRPL (SEQ ID NO:28)或APGSTAPPAHGVTSAPDTRPL (SEQ ID NO:29)。在一些方面，邻接氨基酸序列是在一个或多个苏氨酸和/或丝氨酸残基上糖基化的。在本发明的方法的一些方面，糖脂肽作为脂质体施用。在一些方面，糖脂肽的脂质组分促进脂质体形成。
在本发明的方法的一些方面，该方法包括进一步施用免疫调节剂。在一些方面，施用包含糖脂肽和免疫调节剂的组合物。在一些方面，免疫调节剂共价连接至糖脂肽。在一些方面，免疫调节剂包括TLR激动剂。在一些方面，TLR激动剂包括TLR9激动剂。在一些方面，TLR9激动剂包括CpG。在一些方面，免疫调节剂是TLR9激动剂、COX-2抑制剂、GM-CSF、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的抑制剂、化学治疗剂或其组合。
本发明包括糖脂肽，其包含：包括B细胞表位的至少一种糖基化MUC1糖肽组分；包括MUC1衍生的MHC II类限制性辅助T细胞表位的至少一种肽组分；和至少一种脂质组分。在本发明的糖脂肽的一些方面，包括B细胞表位的糖基化的MUC1糖肽组分包括在一个或多个丝氨酸和/或苏氨酸残基上的糖基化。
在本发明的糖脂肽的一些方面，包括B细胞表位的糖基化MUC1糖肽组分包括用糖残基进行的糖基化，所述糖残基包括GAlNAc、GlcNAc、Gal、NANA、NGNA、岩藻糖、甘露糖或葡萄糖。
在本发明的糖脂肽的一些方面，包括B细胞表位的糖基化MUC1糖肽组分是I类MHC限制性表位。
在本发明的糖脂肽的一些方面，包括B细胞表位的糖基化MUC1糖肽组分和/或包括MHC II类限制性辅助T细胞表位的肽组分包括人MUC1肽序列。
在本发明的糖脂肽的一些方面，包括B细胞表位的糖脂肽和/或包括MHC II类限制性辅助T细胞表位的肽组分包括MUC1蛋白质序列的约5–30个氨基酸，所述MUC1蛋白质序列包括MUC1蛋白质的胞外区，且包括糖基化的一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基。
在本发明的糖脂肽的一些方面，包括B细胞表位的糖基化MUC1糖肽组分包括与SAPDTRPAP (SEQ ID NO:20)、TSAPDTRPAP (SEQ ID NO:21)、SAPDTRPL (SEQ ID NO:22)或TSAPDTRPL(SEQ ID NO:23)具有至少约50%序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，包括B细胞表位的糖基化MUC1糖肽组分包括在一个或多个丝氨酸和/或苏氨酸残基上的糖基化。
在本发明的糖脂肽的一些方面，包括B细胞表位的糖基化MUC1糖肽组分包括SAPDTRPAP (SEQ ID NO:20)、TSAPDTRPAP (SEQ ID NO:21)、SAPDTRPL (SEQ ID NO:22)或TSAPDTRPL(SEQ ID NO:23)。在一些方面，包括B细胞表位的糖基化MUC1糖肽组分包括在一个或多个丝氨酸和/或苏氨酸残基上的糖基化。
在本发明的糖脂肽的一些方面，脂质组分包括一条或多条脂质链、一个或多个半胱氨酸残基和一个或多个赖氨酸残基。
在本发明的糖脂肽的一些方面，脂质组分包括Toll样受体(TLR)配体。在一些方面，Toll样受体(TLR)配体包括TLR2配体。在一些方面，TLR2配体包括Pam3CysSK4。
在本发明的糖脂肽的一些方面，脂质组分包括脂质佐剂。在一些方面，脂质佐剂包括脂质化氨基酸(LAA)。
在本发明的糖脂肽的一些方面，MUC1衍生的B细胞肽表位和MUC1衍生的MHC II类限制性辅助T细胞肽表位包括邻接氨基酸序列。
在本发明的糖脂肽的一些方面，邻接氨基酸序列包括与氨基酸序列APGSTAPPAHGVTSA (SEQ ID NO:26)、APGSTAPPAHGVTSAPDTRPL (SEQ ID NO:27)、APGSTAPPAHGVTSAPDTRPL (SEQ ID NO:28)或APGSTAPPAHGVTSAPDTRPL (SEQ ID NO:29)具有至少50%序列同一性的序列。在一些方面，邻接氨基酸序列是在一个或多个苏氨酸和/或丝氨酸残基上糖基化的。
在本发明的糖脂肽的一些方面，邻接氨基酸序列包括氨基酸序列APGSTAPPAHGVTSA (SEQ ID NO:26)、APGSTAPPAHGVTSAPDTRPL (SEQ ID NO:27)、APGSTAPPAHGVTSAPDTRPL (SEQ ID NO:28)或APGSTAPPAHGVTSAPDTRPL (SEQ ID NO:29)。在一些方面，邻接氨基酸序列是在一个或多个苏氨酸和/或丝氨酸残基上糖基化的。
在本发明的糖脂肽的一些方面，糖脂肽包括图19中所示的那些中的任一种。在一些方面，氨基酸序列是在一个或多个苏氨酸和/或丝氨酸残基上糖基化的。
在一些方面，糖脂肽进一步包括共价连接的免疫调节剂。在一些方面，免疫调节剂包括TLR9激动剂、COX-2抑制剂、GM-CSF、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的抑制剂、化学治疗剂或其组合。
本发明包括药物组合物，其包含：如本文描述的糖脂肽和药学可接受的载体。
本发明包括包含脂质体的组合物，所述脂质体包括如本文描述的糖脂肽。在一些方面，糖脂肽的脂质组分促进脂质体形成。在一些方面，组合物进一步包含免疫调节剂。在一些方面，免疫调节剂包括TLR激动剂。在一些方面，TLR激动剂包括TLR9激动剂。在一些方面，TLR9激动剂包括CpG。
在一些方面，免疫调节剂包括TLR9激动剂、COX-2抑制剂、GM-CSF、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的抑制剂、化学治疗剂或其组合。
本发明包括免疫原性疫苗，其包括如本文描述的糖脂肽或如本文描述的组合物。
本发明包括如本文描述的糖脂肽或如本文描述的组合物用于制造治疗或预防感染、疾病或病症的药物的用途。
本发明包括试剂盒，其包含：如本文描述的糖脂肽；包装；和使用说明书。
除非另有说明，“一个”、“一种”、“所述”和“至少一个”可互换使用且意指一个或超过一个。
附图简述
图1显示了本发明的示例性糖脂肽。
图2显示了用于特异性抗MUC-1抗体的流式细胞术分析。对MCF-7 (A)和SK-MEL-28(B)细胞测试反应性。在用3免疫接种前(血清对照；空心峰)和后(实心峰)评估血清(1:50稀释的)的荧光强度。
图3显示了在用LPS和合成化合物刺激后，通过鼠巨噬细胞的TNF-α产生。使鼠RAWγNO(-)细胞如所示地与增加浓度的大肠杆菌(E. coli) LPS (■)，1 (●)，Pam2CysSK4 (▼)，2 (♦)，Pam3CysSK4 (▲)或3(□)一起温育5.5小时。
图4显示了TLR配体对细胞摄取的作用。
图5显示了合成抗原的化学结构。
图6显示了在用合成化合物21-24、大肠杆菌LPS和大肠杆菌脂质A刺激后，通过鼠巨噬细胞的TNF-α和IFN-β产生。使鼠264.7 RAW γNO(-)细胞如所示地与增加浓度的21-24、大肠杆菌LPS或大肠杆菌脂质A一起温育5.5小时。使用ELISA测量细胞上清液中的TNF-α(A)和IFN-β (B)。数据代表平均值± SD(n=3)。
图7显示了关于特异性抗MUC1抗体的细胞识别分析。对MCF7细胞测试血清反应性。在用21 (A)、22/23 (B)或22/24 (C)4次免疫接种后的血清样品的系列稀释液与MCF7细胞一起温育。在与FITC标记的抗小鼠IgG抗体一起温育后，在细胞裂解产物中评估荧光强度。用免疫接种前血清和与对照SK-MEL-28细胞一起温育的血清样品观察不到相对于本底的荧光(图9中所示)。AU指示任意荧光单位。
图8显示了在用21、22、22/23、22/24和25/26的4次免疫接种后，ELISA抗MUC1和抗T表位抗体滴度。将ELISA板用BSA-MI-MUC-1缀合物(A-F)或中性抗生物素蛋白(neutravidin)-生物素-T表位(G)包被，并且通过线性回归分析，绘制与吸光度相比的稀释度而测定滴度。滴度定义为获得相对于正常对照小鼠血清而言光密度为0.1或更大的最高稀释度。每个数据点代表在4次免疫接种后个体小鼠的滴度，并且水平线指示五只小鼠的组的平均值。
图9显示了关于特异性抗MUC-1抗体的细胞识别分析。对MCF7和SK-MEL-28细胞测试血清反应性。在用21、22/23或22/24的4次免疫接种后的血清样品(1:30稀释的)与MCF7和SK-MEL-28细胞一起温育。在与FITC标记的抗小鼠IgG抗体一起温育后，在细胞裂解产物中评估荧光强度。还显示的是培养基、缀合物和小鼠(正常对照小鼠血清)对照。数据代表平均值± SD(n=3)。AU指示任意荧光单位。
图10显示了化合物22。
图11显示了化合物23。
图12显示了化合物25。
图13显示了化合物26。
图14显示了化合物27。
图15显示了完全合成的三组分免疫原的结构。
图16：合成抗原1、2、3、4和5的化学结构。
图17：通过三组分疫苗减少MUC1.Tg小鼠的MMT肿瘤负荷。MUC1.Tg小鼠用作为对照的空脂质体(EL)或含有1、2、3、4 + 5或5(25 μg，含有3 μg碳水化合物)的脂质体进行免疫接种。合成抗原1、2、3、4和5的化学结构如图16中显示的。在用MUC1表达MMT肿瘤细胞(1×106个细胞)的肿瘤攻击前，给予三次两周一次的免疫接种，随后为一周后的一次加强。在最后一次注射后7天处死动物，并且测定肿瘤湿重。数据呈现为对照(用空脂质体疫苗接种的小鼠)的百分比。每个数据点代表个体小鼠，并且水平线指示小鼠组的平均值。
图18A和18B：抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的诱导。肿瘤细胞Yac-MUC1(图18A)和C57mg.MUC1 (图18B)用铬标记2小时，且随后与得自小鼠的血清(1:50稀释的)一起在37℃温育30分钟，所述小鼠如所示地用空脂质体(EL)或含有1、2、3、4 + 5或5的脂质体在有或没有(NT)肿瘤诱导的情况下免疫接种。合成抗原1、2、3、4和5的化学结构如图16中显示的。随后使肿瘤细胞与效应细胞(NK细胞KY-1克隆)一起温育4小时。效应物与靶比是50:1。自发释放低于完全释放的15%。每个数据点代表个体小鼠，并且水平线指示小鼠组的平均值。
图19A至19C：细胞应答。图19A测定在MUC1.Tg小鼠中的产生IFN-γ的CD8+ T细胞。针对MUC1特异性IFN-γ斑点形成分析CD8+ T细胞，所述CD8+ T细胞从如所示地用空脂质体(EL)或含有1、2、3、4 + 5或5的脂质体在有或没有(NT)肿瘤诱导的情况下免疫接种的小鼠的淋巴结中分离。合成抗原1、2、3、4和5的化学结构如图16中显示的。每个数据点代表个体小鼠，并且水平线指示小鼠组的平均值。图19B测定在MUC1.Tg小鼠中的CD8+细胞毒性T细胞的诱导。从如所示地用空脂质体(EL)或含有1、2、3、4 + 5或5的脂质体在有或没有(NT)肿瘤诱导的情况下免疫接种的小鼠的淋巴结中分离CD8+ T细胞，并且使CD8+ T细胞在无任何体外刺激的情况下经历51Cr释放测定。对于1 (NT)、1、3、4 + 5和5将用MUC1(Tn)肽6 (SAPDT(Tn)RPAP)(SEQ ID NO:26)脉冲的DC用作靶，和对于2将用MUC1肽7 (SAPDTRPAP) (SEQ IDNO:20)脉冲的DC用作靶或对于EL将用空脂质体脉冲的DC用作靶。效应物与靶比是100:1，因为CTL在体外不进行刺激。自发释放低于完全释放的15%。每个数据点代表个体小鼠，并且水平线指示小鼠组的平均值。图19C测定CD8+ T细胞的表位需求。小鼠用含有1或2的脂质体进行免疫接种。通过细胞分选获得表达低水平CD62L的淋巴结衍生的T细胞，并且在对于1用糖肽6或对于2用肽7脉冲的DC的存在下培养14天。在暴露于用(糖)肽6-9脉冲的DC后，分析所得细胞的CD8+IFNγ+ T细胞的存在情况。肽6是SEQ ID NO:26，肽7是SEQ ID NO:20，肽8是SEQ ID NO:27，并且肽9是SEQ ID NO:29。
图20A至20H：在如所示地在有或没有(NT)肿瘤诱导的情况下用1、2、3、4 + 5或5的三次(图20A)或四次(图20B-H)免疫接种后的ELISA抗MUC1和抗辅助T表位(helper T-epitope)抗体滴度。合成抗原1、2、3、4和5的化学结构如图16中显示的。将ELISA板用BSA-MI-MUC-1(Tn)缀合物(图20A-G)或中性抗生物素蛋白-生物素-辅助T表位(图20H)包被，并且通过线性回归分析绘制与吸光度相比的稀释度，而测定滴度。滴度定义为获得相对于正常对照小鼠血清而言光密度为0.1或更大的最高稀释度。每个时间点代表在四次免疫接种后个体小鼠的滴度，并且水平线指示小鼠组的平均值。
图21A和21B：通过MUC1(Tn) 6、未糖基化的MUC1 7和Tn单体，与BSA-MI-MUC1(Tn)缀合物的抗体结合的竞争性抑制。
化合物6和7的序列显示于图19中。将ELISA板用BSA-MI-MUC1(Tn)缀合物包被。将稀释以在不存在抑制剂的情况下获得在ELISA中约1的OD的在用1 (图21A)和2 (图21B)免疫接种后的血清样品，首先与6、7或Tn单体(0-500 μM终浓度)混合，并且随后应用于包被的微量滴定板。光密度值针对用单独的血清(0 μM抑制剂，100%)获得的光密度值标准化。数据报道为小鼠组(n=7)的平均值±s.e.m。
图22A至22J：在用装载有化合物1、2或3或大肠杆菌LPS的脂质体制剂刺激24小时后，通过树突状细胞的细胞因子产生。合成抗原1、2或3的化学结构显示于图16中。使原代树突状小鼠细胞如所示的与增加浓度的装载有化合物1、2或3或大肠杆菌LPS的脂质体制剂一起温育24小时。使用ELISA测量在细胞上清液中的TNF-α (图22A)、IFN-β (图22B)、RANTES(图22C)、IL-6 (图22D)、细胞外IL-1β (图22E和图22F)、IL-10 (图22G)、IP-10 (图22H)、IL-12 p70 (图22I)和IL-12/23 p40 (图22J)。对于ATP处理后的IL-1β分泌的估计，在与诱导物一起温育24小时后，将细胞与ATP(5 mM)一起温育30分钟。数据报道为一式三份处理的平均值± SD。
图23：在用化合物2 (Pam3CysSK4-T辅助细胞表位(T helper ep.) (脊髓灰质炎)-MUC1 (未糖基化的))；化合物1 (Pam3CysSK4-T辅助细胞表位(脊髓灰质炎)- MUC1(Tn))；化合物1加上CpG (CpG 寡脱氧核苷酸(CpG ODN)))；化合物5 (Pam3CysSK4)加上化合物4 (T辅助细胞表位(脊髓灰质炎)- MUC1(Tn))；化合物5；化合物3 (Pam3CysSK4-T辅助细胞表位(脊髓灰质炎))；化合物3加上CpG；EL(空脂质体)加上CpG；或EL的制剂免疫接种的MUC1.Tg小鼠中以克(gm)表示的肿瘤重量。合成抗原1、2、3、4和5的化学结构如图16和26中显示的。
图24：得自MUC1.Tg小鼠的CD8+细胞的细胞毒性活性，所述MUC1.Tg小鼠用化合物2(Pam3CysSK4-T辅助细胞表位(脊髓灰质炎)- MUC1 (未糖基化的))；化合物1 (Pam3CysSK4-T辅助细胞表位(脊髓灰质炎)- MUC1(Tn))；化合物1加上CpG (CpG 寡脱氧核苷酸(CpGODN)))；化合物5 (Pam3CysSK4)加上化合物4 (T辅助细胞表位(脊髓灰质炎)- MUC1(Tn))；化合物5；化合物3 (Pam3CysSK4-T辅助细胞表位(脊髓灰质炎))；化合物3加上CpG；EL (空脂质体)加上CpG；或EL的制剂免疫接种。合成抗原1、2、3、4和5的化学结构如图16和26中显示的。
图25：得自MUC1.Tg小鼠的CD8+ T细胞的IFN-γ产生的测定，所述MUC1.Tg小鼠用化合物2 (Pam3CysSK4-T辅助细胞表位(脊髓灰质炎)- MUC1(未糖基化的))；化合物1(Pam3CysSK4-T辅助细胞表位(脊髓灰质炎)- MUC1(Tn))；化合物1加上CpG (CpG 寡脱氧核苷酸(CpG ODN)))；化合物5 (Pam3CysSK4)加上化合物4 (T辅助细胞表位(脊髓灰质炎)-MUC1(Tn))；化合物5；化合物3 (Pam3CysSK4-T辅助细胞表位(脊髓灰质炎))；化合物3加上CpG；EL(空脂质体)加上CpG；或EL的制剂免疫接种。合成抗原1、2、3、4和5的化学结构如图16和26中显示的。
图26：化合物1 (Pam3CysSK4-T辅助细胞(T-helper)-MUC1)、化合物2(Pam3CysSK4-T辅助细胞)、LAA-T辅助细胞-MUC1和LAA-T辅助细胞的结构。
图27：免疫接种方案。
图28：三组分疫苗减少肿瘤负荷。用含有化合物1 (Pam3CysSK4-T辅助细胞-MUC1)、化合物2 (Pam3CysSK4-T辅助细胞)、LAA-T辅助细胞-MUC1或LAA-T辅助细胞(25 μg，含有3 μg碳水化合物)的脂质体或用作为对照的空脂质体免疫接种MUC1.Tg小鼠。在用MUC1表达MMT肿瘤细胞(1×106个细胞)的肿瘤攻击前，给予三次两周一次的免疫接种，随后为一周后的一次加强。在最后一次注射后7天处死动物，并且测定肿瘤湿重。数据呈现为对照(用空脂质体疫苗接种的小鼠)的百分比。每个数据点代表个体小鼠，并且水平线指示小鼠组的平均值。
图29：通过疫苗诱导MUC1特异性细胞毒性CD8 T细胞。从如所示地用空脂质体或含有化合物1 (Pam3CysSK4-T辅助细胞-MUC1)、化合物2 (Pam3CysSK4-T辅助细胞)、LAA-T辅助细胞-MUC1或LAA-T辅助细胞的脂质体在肿瘤诱导的情况下免疫接种的小鼠的淋巴结中分离CD8+ T细胞，并且使CD8+ T细胞在无任何体外刺激的情况下经历51Cr释放测定。用Tn-MUC1肽(SAPDT(Tn)RPAP) (SEQ ID NO:26)或空脂质体脉冲的DC用作靶。效应物与靶比是100:1，因为CTL在体外不进行刺激。自发释放低于完全释放的15%。每个数据点代表个体。合成抗原1、2、3、4和5的化学结构如图16和26中显示的。
图30：三组分疫苗引发强抗体滴度。在四次免疫接种后的ELISA抗MUC1和抗T表位抗体滴度。抗MUC1和抗T表位抗体滴度作为四到七只小鼠的组的中值呈现。对于抗MUC1抗体滴度，将ELISA板用BSA-MI-MUC-1(Tn)缀合物包被，或对于抗T辅助细胞表位抗体滴度，将ELISA板用中性抗生物素蛋白-生物素-T表位包被。利用对与吸光度相比的稀释度的标绘通过线性回归分析测定滴度。滴度定义为获得相对于正常对照小鼠血清而言光密度为0.1或更大的最高稀释度。
图31：抗体在抗体依赖性细胞毒性(ADCC)方面是有效的。C57mg.MUC1乳房肿瘤细胞用铬标记两小时，且随后与对照血清(MUC1.Tg)或得自荷有MMT肿瘤的小鼠的血清(1:50稀释的)一起在37℃温育30分钟(min)，所述小鼠如所示地用空脂质体或含有化合物1(Pam3CysSK4-T辅助细胞-MUC1)、化合物2 (Pam3CysSK4-T辅助细胞)、LAA-T辅助细胞-MUC1和LAA-T辅助细胞的脂质体免疫接种。随后使肿瘤细胞与效应细胞(KY-1细胞-NK克隆)一起温育四小时。效应物与靶比是50:1。自发释放低于完全释放的15%。每个数据点代表个体小鼠，并且水平线指示小鼠组的平均值。合成抗原1、2、3、4和5的化学结构如图16和26中显示的。
图32：人MUC1的前导序列，其中Rankpep研究结果突出显示。串联重复的起始序列是有下划线的。虚线显示了显示与I-Ab的结合的RANKPEP得分的15聚体。指定了显示与H2-Db (dddd)或H2-Kb (kkkk)的结合或与两者(bbbb)的非种系选择性(promiscuous)结合的RANKPEP得分的9聚体。
图33A和33B：将小鼠用图33A中所述的肽免疫接种，并且通过细胞分选获得表达低水平CD62L的淋巴结衍生的T细胞，并且在用免疫接种肽脉冲的DC的存在下培养14天。在暴露用y轴上所列出的肽脉冲的DC后，针对CD4+IFNγ+和CD8+IFNγ+ T细胞的存在情况通过细胞内细胞因子分析所得到的细胞(图33B)。
图34：利用人MUC1 T辅助细胞序列的合成构建体。
图35显示了完全合成的三组分免疫原52和53和用于其制备的试剂63-65的结构。
图36显示了在用52和53的4次免疫接种后的ELISA抗GSTPVS(β-O-GlcNAc)SANM(68)抗体滴度。将ELISA板用BSA-MI-GSTPVS(β-O-GlcNAc)SANM(BSA-MI-66)缀合物包被，并且通过线性回归分析绘制与吸光度相比的稀释度，测定(a)总IgG、(b) IgG1、(c) IgG2a、(d) IgG2b、(e) IgG3和(f) IgM滴度。滴度定义为获得相对于正常对照小鼠血清而言光密度为0.1或更大的最高稀释度。每个数据点代表在4次免疫接种后个体小鼠的滴度，并且水平线指示五只小鼠的组的平均值。
图37显示了化合物52。
图38显示了化合物53。
图39显示了化合物63。
图40显示了化合物64。
图41显示了化合物65。
图42显示了化合物66。
图43显示了化合物67；SEQ ID NO：12。
图44显示了化合物68。
图45显示了化合物69；SEQ ID NO：11。
图46显示了化合物70。
说明性实施方案的描述
本发明的糖脂肽包含至少一个B表位、至少一个T表位和脂质组分。在优选实施方案中，糖脂肽基本上由三种主要组分组成：含有B表位的至少一种碳水化合物组分；含有辅助T表位的至少一种肽组分；和至少一种脂质组分。示例性碳水化合物、肽和脂质组分在本文中以及例如本文引用的参考文献中描述，所述参考文献包括Koganty等人，于2006年3月30日公开的美国专利公开20060069238；还参见Koganty等人，1996，Drug Disc Today；1(5):190-198。三种组分是直接或间接共价连接的，以形成单个糖脂肽分子。间接连接涉及任选的接头组分“L”的使用，以将两种或更多种主要组分连接在一起。三种主要组分可以以任何次序连接在一起(直接或间接地)。例如，脂质和碳水化合物组分可以各自共价连接至肽组分，以形成糖脂肽。可替代地，脂质组分和肽组分可以各自共价连接至碳水化合物组分。同样地，碳水化合物组分和肽组分可以各自共价连接至脂质组分。或者，所有三种组分可以这样连接，使得三种组分各自共价连接至其他两种组分中的每一种。分子间交联也是可能的，如下文更详细地描述的。
在优选实施方案中，本发明的糖脂肽含有一种碳水化合物组分、一种肽组分和一种脂质组分。在另一个实施方案中，糖脂肽含有多种碳水化合物组分，其可以是相同的或可以是不同的。同样地，在另一个实施方案中，糖脂肽含有多种肽组分，其可以是相同的或可以是不同的。进一步地，在另一个实施方案中，糖脂肽含有多种脂质组分，其可以是相同的或可以是不同的。因此，本发明的糖脂肽的多个实施方案可以含有一种或多种碳水化合物组分、一种或多种肽组分和/或一种或多种脂质组分。例如，“多个抗原性糖肽(multipleantigenic glycopeptides)”的观念(Bay等人，美国专利号6,676,946，2004年1月13日，Bay等人；WO 98/43677，1998年10月8日公开，Bay等人)可以适合于在本发明中使用。高抗原密度可以使用延伸的肽“臂”(本发明的糖脂肽的肽组分)与之附着的核心例如聚赖氨酸核心实现，所述肽臂以聚簇呈现来展示糖脂肽的碳水化合物抗原组分。糖脂肽的脂质组分可以同样自赖氨酸核心延伸，特别是在其中肽组分经由非末端氨基酸与赖氨酸核心附着的实施方案中。高抗原密度还可以通过使用脂质体作为递送载体来达到，如实施例2和3中例示的。另外或可替代地，可任选交联糖脂肽，以形成多分子复合物，从而增加抗原密度。
糖脂肽的多种碳水化合物、肽和脂质组分可以在结构上衍生自或基于在天然存在的生物学分子中发现的那些和/或可以模拟在天然存在的生物学分子中发现的那些。糖脂肽组分优选含有等同于或类似于活生物中发现的那些的分子结构或结构的部分(包括表位)。典型地，虽然糖脂肽的组分衍生自、在结构上基于和/或模拟天然存在的结构，但它们是使用例如化学或体外酶促方法合成制备的。在一些实施方案中，可通过形成相同或相似表位的不同化学结构(具有不同的键合次序或模式)，在本发明的糖脂肽中形成由分子元件在天然存在的抗原中形成的表位，所述分子元件在空间中是紧密的但就化学键合而言彼此远离。
本发明的三组分糖脂肽可以视为盒，其中碳水化合物组分、肽组分和脂质组分各自独立地选择用于包括在糖脂肽中。形成糖脂肽的如本文描述的碳水化合物组分、肽组分和脂质组分的任何组合(即混合和匹配)被本发明所包括。
碳水化合物组分
糖脂肽的碳水化合物组分可以是含有碳水化合物的任何组分。合适碳水化合物组分的例子包括寡糖、多糖和单糖，和糖基化生物分子(糖缀合物)，例如糖蛋白、糖肽、糖脂、糖基化氨基酸、DNA或RNA。含有一个或多个碳水化合物部分以及肽或氨基酸的糖基化肽(糖肽)和糖基化氨基酸作为本发明的糖脂肽的碳水化合物组分是特别优选的。糖肽的例子是CD52，其在基本上所有人淋巴细胞上表达且据信在人免疫系统中起重要作用。糖基化氨基酸的例子是Tn抗原。应当理解当碳水化合物组分是糖肽时，糖肽的肽部分任选包括T表位以及B表位，并且因此可以充当糖脂肽的肽组分。含有T表位和B表位的糖肽有时称为具有“B-T”表位或“T-B”表位。存在于本发明的糖脂肽上的B表位和T表位可以重叠或可以不重叠。在优选实施方案中，T表位、B表位和/或T-B表位衍生自MUC1多肽序列，包括但不限于人MUC1多肽序列。
本发明的糖脂肽的碳水化合物组分包括含有一个或多个糖单体的碳水化合物。例如，碳水化合物可以包括单糖、二糖或三糖；它可以包括寡糖或多糖。寡糖是含有两个或更多个糖且特征在于充分确定的结构的寡聚糖。充分确定的结构的特征在于单体的特定身份、次序、连接位置(包括分支点)和连接立体化学(α，β)，并且因此充分确定的结构具有确定的分子量和组成。寡糖通常含有约2-约20个或更多个糖单体。另一方面，多糖是不具有充分确定的结构的多聚糖；身份、次序、连接位置(包括分支点)和/或连接立体化学可在分子间不同。多糖通常含有比寡糖更大数目的单体组分，且因此具有更高的分子量。如本文所使用的术语“聚糖”包括寡糖和多糖在内，并且包括分支和未分支聚合物。当碳水化合物组分含有具有三个或更多个糖单体的碳水化合物时，碳水化合物可以是直链或它可以是支链。在优选实施方案中，碳水化合物组分含有小于约15个糖单体；更优选含有小于约10个糖单体。
糖脂肽的碳水化合物组分包括含有B表位的碳水化合物。应当理解碳水化合物可以与B表位是同延的，或碳水化合物可以包括B表位在内，或碳水化合物可以仅包括B表位的部分(即B表位可以另外包含糖脂肽的其他部分，例如肽组分、脂质组分和/或接头组分)。包括B表位的糖肽的例子是糖基化肽MUC-1 (在本文中也称为MUC1)。因此，“包含”B表位的碳水化合物或碳水化合物组分应理解为意指包含存在于糖脂肽上的B表位的全部或部分的碳水化合物或碳水化合物组分。
B表位可以是天然存在的表位或非天然存在的表位。优选地，碳水化合物的两个或更多个糖单体相互作用，以形成充当B表位的构象表位。B表位是由B细胞识别的表位。含有B表位的任何抗原性碳水化合物可以用作碳水化合物组分，而无限制。在优选实施方案中，B表位衍生自MUC1多肽序列，包括但不限于人MUC1多肽序列。
可以用作本发明的糖脂肽的组分的非天然存在的碳水化合物包括糖模拟物(glycomimetics)，其是模拟糖例如单糖、二糖或寡糖的形状和特征的分子(参见例如，Barchi，2000，Current Pharmaceutical Design；6(4):485-501；Martinez-Grau等人，1998，Chemical Society Reviews；27(2):155-162；Schweizer，2002， AngewandteChemie-International Edition；41(2):230-253)。糖模拟物可以改造为供应所需B表位且潜在提供更大的代谢稳定性。
在另一个实施方案中，碳水化合物组分含有自身抗原的全部或部分。自身抗原是通常存在于动物体内的抗原。它们可以视为“自身分子”，例如存在于动物细胞中或上的分子，或在动物血液中循环的蛋白质如胰岛素。自身抗原的例子是衍生自动物的癌细胞的含碳水化合物组分，例如肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)。通常，此类自身抗原显示出低免疫原性。例子包括肿瘤相关碳水化合物B表位例如Ley抗原(癌症相关四糖；例如Fucα(1,2)-Galβ(1,4)-[Fucα(1,3)]-GlcNAc)；Globo-H抗原(例如L-Fucα(1,2)-Galβ(1,3)-GalNAcβ(1,3)-Galα(1,4)-Galβ(1,4)-Glu)；T抗原(例如Galβ(1,3)-GalNAcα-O-Ser/Thr)；STn抗原(唾液酸基Tn，例如NeuAcα(2,6)-GalNAcα-O-Ser/Thr)；和Tn抗原(例如α-GalNAc-O-Ser/Thr)。自身抗原的另一个例子是衍生自人多态性上皮粘蛋白(PEM)的乳腺肿瘤相关MUC-1的串联重复的糖肽，所述PEM是上皮粘蛋白(Baldus等人，Crit. Rev. Clin. Lab. Sci.，41(2):189-231(2004))。MUC-1糖肽包含至少一个Tn和/或唾液酸基Tn(唾液酸基α-6 GalNAc或"STn")表位，其优选连接至苏氨酸(T-Tn或T-STn)。
在优选实施方案中，碳水化合物组分包括糖基化MUC1糖肽，其在MUC1衍生的氨基酸肽序列的一个或多个丝氨酸和/或苏氨酸残基上糖基化。此类MUC1衍生的氨基酸序列包括但不限于本文描述的任何MUC1序列。
可以用作糖脂肽的组分的示例性肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)的结构包括但不限于显示于方案1和2中的结构。
方案1
应当指出在方案1中所示的Tn、STn和TF结构(单体、三聚体、聚簇的)都显示具有苏氨酸残基。相应丝氨酸类似物也是合适结构。在Tn3、STn3、TF3及其各自的簇的情况下，包括在主链的苏氨酸/丝氨酸组成中具有差异的所有可能的同和异类似物。
方案2
用于在糖脂肽的碳水化合物组分中使用的另一种自身抗原是包含共价连接至单糖的氨基酸或肽的糖肽。优选地，单糖是N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)或N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。优选的糖肽自身抗原是β-N-乙酰葡糖胺(β-O-GlcNAc)修饰的肽。优选地，单糖O联至多肽的丝氨酸或苏氨酸。还适合于用作自身抗原的是相关硫醇(S联)和氨基(N联)类似物。单糖优选经由β连接连接至肽，但它可以是α连接。在特别优选的实施方案中，本发明的糖脂肽的碳水化合物组分(当作为糖肽配制时，其可以与肽组分同延)含有由O-GlcNAc修饰的TPVSS (SEQID NO:10)氨基酸序列。含有β-GlcNAc修饰的糖肽作为B表位的碳水化合物的例子显示为图15中的化合物52 (O联)和53 (S联)。
在另一个实施方案中，碳水化合物组分含有来自微生物的碳水化合物抗原(通常为聚糖)的全部或部分，所述微生物优选致病微生物，例如病毒(例如存在于gp120上的碳水化合物，衍生自HIV病毒的糖蛋白)、革兰氏阴性或革兰氏阳性菌(例如衍生自流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)或脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)的碳水化合物)、真菌(例如1,3-β联聚糖)、寄生性原生动物(例如在原生动物寄生虫例如利什曼原虫属(Leishmania)和布鲁斯锥虫(Trypanosoma brucei)中发现的GPI锚)或蠕虫。优选地，微生物是致病微生物。
来自病毒病原体的示例性聚糖来自HIV-1 gp120的Man9，显示于方案3中。
方案3
示例性HIV碳水化合物和糖肽抗原在Wang等人，Current Opinion in Drug Disc. &Develop.，9(2)：194-206(2006)中描述，并且包括天然存在的HIV碳水化合物和糖肽，以及基于天然存在的HIV碳水化合物和糖肽的合成碳水化合物和糖肽。
示例性HCV碳水化合物和糖肽抗原在Koppel等人 Cellular Microbiology 2005；7(2):157-165和Goffard等人 J. of Virology 2005；79(13):8400-8409中描述，并且包括天然存在的HCV碳水化合物和糖肽，以及基于天然存在的HCV碳水化合物和糖肽的合成碳水化合物和糖肽。
来自细菌病原体的示例性聚糖显示于方案4中。
方案4
来自原生动物病原体的示例性聚糖显示于方案5中。
方案5
来自真菌病原体的示例性聚糖显示于方案6中。
方案6
来自蠕虫病原体的示例性聚糖显示于方案7中。
方案7
本领域技术人员应当理解虽然众多抗原性碳水化合物结构是已知的，但存在许多更多的抗原性碳水化合物结构，因为迄今为止仅鉴定了小部分抗原性或免疫原性碳水化合物。迄今发现的许多碳水化合物抗原的例子可参见：Kuberan等人，Curr. Org. Chem，4，653-677(2000)；Ouerfelli等人，Expert Rev. Vaccines 4(5):677-685(2005)；Hakomori等人，Chem. Biol. 4，97-104(1997)；Hakomori，Acta Anat. 161，79-90(1998)；Croce和Segal-Eiras，Drugs of Today 38(11):759-768(2002)；Mendonca-Previato等人，Curr Opin.Struct. Biol. 15(5):499-505(2005)；Jones，Anais da Academia Brasileira deCiencias 77(2):293-324(2005)；Goldblatt，J. Med. Microbiol. 47(7):563-567(1998)；Diekman等人，Immunol. Rev.，171：203-211，1999；Nyame等人，Arch. Biochem.Biophys.，426(2)：182-200，2004；Pier，Expert Rev. Vaccines，4(5)：645-656，2005；Vliegenthart，FEBS Lett.，580(12)：2945-2950，Sp. Iss.，2006；Ada等人，Clin.Microbiol. Inf.，9(2)：79-85，2003；Fox等人，J. Microbiol. Meth.，54(2)：143-152，2003；Barber等人，J. Reprod. Immunol.，46(2)：103-124，2000；和Sorensen，Persp. DrugDisc. Design，5：154-160，1996。衍生自哺乳动物或传染性生物的任何抗原性碳水化合物可以用作本发明的糖脂肽的碳水化合物组分，而无限制。
肽组分
糖脂肽的肽组分包括T表位，优选辅助T表位。肽组分可以是任何含肽结构，并且可以含有天然存在的和/或非天然存在的氨基酸和/或氨基酸类似物(例如D-氨基酸)。肽组分可以来自微生物，例如病毒、细菌、真菌和原生动物。T表位因此可以构成病毒抗原的全部或部分。可替代或另外地，T表位可以来自哺乳动物，且任选构成自身抗原的全部或部分。例如，T表位可以是在癌细胞上过表达的糖肽的部分。当本发明的糖脂肽的肽组分是糖肽时，肽组分也可以包括B表位的全部或部分，如本文其他地方描述的。更一般地，应当理解糖脂肽的肽组分可以与T表位是同延的，或肽组分可以包括T表位在内，或肽组分可以包括仅部分T表位(即，T表位可以另外包含糖脂肽的其他部分，例如碳水化合物组分、脂质组分和/或接头组分)。因此，“包含”T表位的肽或肽组分应理解为意指包含存在于糖脂肽上的T表位的全部或部分的肽或肽组分。
肽组分可以含有例如小于约50个氨基酸和/或氨基酸类似物、小于约40个氨基酸和/或氨基酸类似物、小于约30个氨基酸和/或氨基酸类似物、或小于约20个氨基酸和/或氨基酸类似物。肽组分可以含有例如约9-约50个氨基酸和/或氨基酸类似物、约9-约40个氨基酸和/或氨基酸类似物、约9-约30个氨基酸和/或氨基酸类似物、或约9-约20个氨基酸和/或氨基酸类似物。肽组分可以含有例如约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、或约80 个氨基酸和/或氨基酸类似物，或这些引用大小的任何范围。
肽组分的例子包括通用辅助T肽QYIKANSKFIGITEL ("QYI") (SEQ ID NO:1)、通用辅助T肽YAFKYARHANVGRNAFELFL ("YAF") (SEQ ID NO:2)、衍生自脊髓灰质炎病毒的鼠辅助T肽KLFAVWKITYKDT ("KLF") (SEQ ID NO:3)和泛DR结合(PADRE)肽(PCT WO 95/07707；Alexander等人，Immunity 1:751-761(1994)；Alexander等人，J. Immunol. 2000年2月1日；164(3):1625-33；美国专利号6,413,935 (Sette等人，2002年7月2日))。
用于在本发明的糖脂肽中使用的免疫原性肽组分包括通用(简并或“非种系选择性”)辅助T细胞肽，其是在许多主要组织相容性复合物(MHC)单元型的个体中是免疫原性的肽。众多通用辅助T细胞肽结构是已知的；然而，应当理解将在未来鉴定另外的通用T表位，包括具有相似或甚至更高效力的一些通用T表位，并且此类肽非常适合于用作本发明的糖脂肽的肽组分。
用于在糖脂肽中使用的示例性T细胞肽包括但不限于：
合成的非天然PADRE肽DAla-Lys-Cha-Val-Ala-Ala-Trp-Thr-Leu-Lys-Ala-Ala-DAla，包括由Alexander等人在Immunity，第1卷，751-761，1994中描述的所有类似物；
衍生自破伤风毒素的肽，例如(TT830-843) QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO:1)、(TT1084-1099) VSIDKFRIFCKANPK (SEQ ID NO:4)、(TT1174-1189) LKFIIKRYTPNNEIDS(SEQ ID NO:5)、(TT1064-1079) IREDNNITLKLDRCNN (SEQ ID NO:6)和(TT947-967)FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO:7)；
衍生自脊髓灰质炎病毒的肽，例如KLFAVWKITYKDT (SEQ ID NO:3)；
衍生自脑膜炎奈瑟氏球菌的肽，例如YAFKYARHANVGRNAFELFL (SEQ ID NO:8)；和
衍生自恶性疟原虫(P. falsiparum) CSP的肽，例如EKKIAKMEKASSVFNVNN (SEQ IDNO:9)。
糖脂肽的肽组分含有T表位。T表位是由T细胞识别的表位。T表位可以引发CD4+应答，从而刺激辅助T细胞的产生；和/或它可以引发CD8+应答，从而刺激细胞毒性淋巴细胞的产生。优选地，T表位是刺激辅助T细胞产生的表位(例如辅助T细胞表位或Th表位)，其进而使得针对由本发明糖脂肽的碳水化合物组分供应的B表位的体液应答成为可能。
应当理解本发明的糖脂肽可以含有多个T表位，其可以是相同或不同的。进一步地，T表位可以存在于碳水化合物组分和/或脂质组分上(例如，在包括糖肽和/或糖脂作为碳水化合物和/或脂质组分的实施方案中)，附加于或代替肽组分。
在一些实施方案中，B表位和T表位是同源的；即，它们衍生自相同生物。例如，在适合于用作针对微生物病原体的疫苗的糖脂肽中，T表位加上B表位可以是存在于微生物病原体中的表位。在另一个实施方案中，B表位和T表位是异源的；即，它们不衍生自相同生物。例如，适合于用作抗癌疫苗的糖脂肽可具有来自癌细胞的B细胞表位，但具有来自细菌或病毒的T细胞表位。
在本发明的免疫原性疫苗的优选实施方案中，T表位或B表位可以衍生自MUC1多肽。在一些实施方案中，T表位和B表位都衍生自MUC1多肽。MUC1 (在人中的MUC1和在非人物种中的Muc1)是在多种粘膜表面衬里的上皮细胞以及造血细胞中表达的重糖基化的I型跨膜蛋白质。人MUC1由细胞质信号肽、28氨基酸跨膜结构域和由二十个氨基酸的可变数目的串联重复组成的胞外结构域组成。每个重复含有5个潜在O-糖基化位点。MUC1与在粘膜位点上的几种腺癌相关，并且在超过90%的乳腺癌中过表达，且与卵巢、肺、结肠和胰腺癌相关。肿瘤相关MUC1是异常糖基化的，产生截短的碳水化合物结构。
MUC1肽序列可以包括人或小鼠MUC1序列。MUC1肽序列可以包括MUC1串联重复序列。此类MUC1串联重复序列可以含有B表位和辅助T表位两者。
MUC1序列可以是同源的，从而是自身抗原。MUC1序列可以包括来自人或小鼠MUC1肽的一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个氨基酸改变。MUC1序列可以是不规则变化的，包括一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸改变，以增强MUC1肽在I类和/或II类主要组织相容性复合物(MHC)蛋白质上的结合。人MHC在本文中也称为HLA复合物。MUC1序列可以包括来自MUC1蛋白质的胞外区的序列。MUC1序列可以包括负责I类MHC限制的序列。MUC1序列可以包括负责II类MHC限制和/或结合的序列。在一些实施方案中，此类I类和II类限制序列可以是在免疫原性疫苗构建体中的邻接氨基酸序列。MHC限制序列包括但不限于例如本文描述的那些中的任一种和图16、19和32-34中表示的那些中的任一种。
MUC1序列可以包括一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基，其是糖基化的，例如在一个、二个、三个、四个或更多个此类残基上是糖基化的。此类糖基化可以代表正常组织的糖基化模式，或此类糖基化可以反映异常糖基化。MUC1序列可以含有一个或多个B表位和/或辅助T表位。
MUC1序列可以包括MUC1蛋白质序列的约5-约30个氨基酸。MUC1序列可以包括MUC1蛋白质序列的小于约50个氨基酸和/或氨基酸类似物、小于约40个氨基酸和/或氨基酸类似物、小于约30个氨基酸和/或氨基酸类似物、或小于约20个氨基酸和/或氨基酸类似物。MUC1序列可以包括例如约9-约50个氨基酸和/或氨基酸类似物、约9-约40个氨基酸和/或氨基酸类似物、约9-约30个氨基酸和/或氨基酸类似物或约9-约20个氨基酸和/或氨基酸类似物。肽组分可以含有例如MUC1蛋白质序列的约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70或约80个氨基酸和/或氨基酸类似物，或这些引用大小的任何范围。
MUC1序列可以包括显示与人MUC1序列约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或约96%、约97%、约98%或约99%序列同一性的序列。
MUC1序列可以包括本文描述的任何MUC1序列，例如包括但不限于图16、19、33A、33B和34中表示的那些中的任一种。例如MUC1序列可以包括SAPDTRPAP (SEQ ID NO:20)、TSAPDTRPAP (SEQ ID NO:21)、SAPDTRPL (SEQ ID NO:22)、TSAPDTRPL (SEQ ID NO:23)、APGSTAPPAHGVTSA (SEQ ID NO:26)、APGSTAPPAHGVTSAPDTRPL (SEQ ID NO:27)、APGSTAPPAHGVTSAPDTRPL (SEQ ID NO:28)或APGSTAPPAHGVTSAPDTRPL (SEQ ID NO:29)、其中X是L、A或AP的SKKKKGAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPX (SEQ ID NO:30)、SKKKKGSTAPPAHGVTSAPDTRPAP (SEQ ID NO:31)、SKKKKGSLSYTNPAVAAATASNL (SEQ ID NO:32)、SKKKKGCKLFAVWKITYKDTGTSAPDTRPAP (SEQ ID NO:33)、SKKKKGCKLFAVWKITYKDT (SEQID NO:34)、GGKLFAVWKITYKDTGTSAPDTRPAP (SEQ ID NO:35)或APGSTAPPAHGVTSAPDTRPAP(SEQ ID NO:28)。还包括的是这样的MUC1序列，其与这些序列具有约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或约96%、约97%、约98%或约99%序列同一性。还包括的是在一个、二个、三个、四个或更多个丝氨酸或苏氨酸残基的任何组合上糖基化的MUC1序列。
脂质组分
最初假定具有仅两种主要组分即碳水化合物组分和肽组分的糖肽会有效引发动物中的免疫应答。辅助T细胞表位预期诱导T细胞依赖性免疫应答，导致针对肿瘤相关碳水化合物B表位例如Ley和Tn的IgG抗体的产生。然而，在一些应用中，未发现二组分疫苗是非常有效的。推测B细胞和辅助T细胞表位缺乏提供用于树突状细胞(DC)成熟的合适“危险信号”的能力。为了补救这个问题，将脂质组分包含在化合物中，导致产生本发明的糖脂肽。
脂质组分可以是任何含脂质组分，例如脂肽、脂肪酸、磷脂、类固醇或脂质化氨基酸和糖脂例如脂质A衍生物。优选地，脂质组分是非抗原性的；即，它不引发针对脂质组分的特定区的抗体。然而，脂质组分可以是且优选的确充当免疫佐剂。脂质组分可以充当多表位糖脂肽的载体或递送系统。它帮助糖脂肽掺入囊泡或脂质体内，以促进糖脂肽递送至靶细胞，并且它增强靶细胞例如树突状细胞的摄取。进一步地脂质组分刺激细胞因子的产生。
用于在本发明的糖脂肽中使用的一类优选脂质组分包含多种Toll样受体(TLR)的分子配体。存在Toll样受体的许多已知亚类(例如TLR1、TLR2、TRL3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12、TLR13、TLR14、TLR15和TLR16)。关于在Toll样受体之间的关系和进化的综述，参见Roach等人，PNAS 2005,102:9577-9582；关于在疫苗接种中的TLR信号转导的讨论，参见Duin等人，TRENDS Immunol.，2006，27:49-55。
TLR是由微生物的特定组分和某些宿主分子激活的模式识别受体家族。它们构成针对许多病原体的第一线防御，并且在先天性免疫系统的功能中起关键作用。在哺乳动物中的TLR首先在1997年鉴定，并且已估计大多数哺乳动物物种具有十到十五类Toll样受体。已知TLR包括：TLR1 (TLR1配体包括三酰基脂蛋白)；TLR2 (TLR2配体包括脂蛋白、革兰氏阳性肽聚糖、脂磷壁酸、真菌和病毒糖蛋白)；TLR3 (TLR3配体包括如在某些病毒中发现的双链RNA，和聚I:C)；TLR4 (TLR4配体包括脂多糖和病毒糖蛋白)；TLR5 (TLR5配体包括鞭毛蛋白)；TLR6 (TLR6配体包括二酰基脂蛋白)；TLR7 (TLR7配体包括小的合成免疫改性剂(例如咪喹莫特、R-848、洛索立宾和溴匹立明)和单链RNA)；TLR8 (TLR8配体包括小的合成化合物和单链RNA)；和TLR9 (TLR9配体包括未甲基化的CpG DNA基序)。参见例如，通过Akira，"Mammalian Toll-like receptors," Curr Opin Immunol 2003；15(1)：5-11和Akira和Hemmi，"Recognition of pathogen-associated molecular patterns by TLR family,"Immunol Lett 2003；85(2)：85-95的综述。
特别优选的是与TLR2和TLR4相互作用的脂质组分。TLR2涉及来自革兰氏阳性和革兰氏阴性菌以及支原体和酵母的广泛多样的微生物分子的识别。TLR2配体包括脂聚糖、脂多糖、脂磷壁酸和肽聚糖。TLR4识别革兰氏阴性脂多糖(LPS)和脂质A——其毒性部分。TLR配体是例如自Apotech和InvivoGen广泛商购可得的。优选地，脂质组分是促进糖脂肽通过抗原呈递细胞的摄取的TLR配体(参见实施例3)。
用于用作本发明的糖脂肽的脂质组分的合适脂质包括PamCys型脂质结构，例如衍生自Pam3Cys (S-[(R)-2，3-二棕榈酰氧基-丙基]-N-棕榈酰-(R)-半胱氨酸)和Pam2Cys (S-[(R)-2，3-二棕榈酰氧基-丙基]-(R)-半胱氨酸)的那些，Pam2Cys缺乏Pam3Cys的N-棕榈酰基。Pam3Cys和Pam2Cys衍生自大肠杆菌的主要脂蛋白的免疫活性N末端序列。这类脂质也包括Pam3CysSK4 (N-棕榈酰-S-[(R)-2,3-双(棕榈酰氧基)-丙基]-(R)–半胱氨酰-(S)-丝氨酰-(S)-赖氨酸-(S)-赖氨酸-(S)-赖氨酸-(S)-赖氨酸)和Pam2CysSK4 (S-[(R)-2,3-双(棕榈酰氧基)-丙基]-(R)–半胱氨酰-(S)-丝氨酰-(S)-赖氨酸-(S)-赖氨酸-(S)-赖氨酸-(S)-赖氨酸(lysyne))，其缺乏Pam3CysSK4的N-棕榈酰基；应当理解在这些结构中的赖氨酸数目可以是0、1、2、3、4、5或更多(即Kn，其中n = 0、1、2、3、4、5或更多)。在一些实施方案中，脂质组分包括一条或多条脂质链、一个或多个半胱氨酸残基和一个或多个赖氨酸残基。
另一个优选类别的脂质包括脂质A (LpA)类型的脂质，例如衍生自大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌(S. typhimurium)和脑膜炎奈瑟氏球菌的脂质A。脂质A可以通过接头附着至糖脂肽的碳水化合物组分(含有B表位)和/或肽组分(含有T表位)，所述接头例如连接至异头中心或异头磷酸酯，C-4’磷酸酯或C-6’位置。磷酸酯可经修饰例如以包括一个或多个磷酸乙醇胺二酯。示例性脂质A衍生物在例如Caroff等人，2002，Microbes Infect；4:915-926；Raetz等人，2002，Annu Rev Biochem；71:635-700；和Dixon等人，2005，J Dent Res；84：584-595中描述。
在一些实施方案中，脂质组分是脂质化氨基酸。在一些实施方案中，脂质TLR2激动剂组分的脂质方面被不同类别的佐剂化合物取代，例如TLR4激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂或TLR9激动剂。在一些实施方案中，激动剂是TLR9激动剂 CpG。
下文在方案8中是用于掺入本发明的糖脂肽内的示例性免疫原性脂质。在第一行中的第一个结构是Pam3CysSKn；在第一行中的第二个结构是Pam2CysSKn；并且最后4个结构是脂质A衍生物。
方案8
在结构上基于Pam3Cys的脂质对于用作脂质组分是特别优选的。Pam3Cys衍生自大肠杆菌的主要脂蛋白的免疫活性N末端序列。这些脂肽是有力的免疫佐剂。近期研究已显示Pam3Cys通过与Toll样受体2 (TLR2)的相互作用发挥其活性。
不受理论束缚，认为在脂质组分和TLR之间的相互作用导致促炎细胞因子和趋化因子的产生，其进而刺激抗原呈递细胞(APC)，从而起始辅助T细胞发育和激活。TLR配体与B和T表位的共价连接确保细胞因子在其中疫苗与免疫细胞相互作用的位点上产生。这导致细胞因子的高局部浓度，促进有关免疫细胞的成熟。脂肽促进抗原呈递细胞和B淋巴细胞的选择性靶向和摄取。另外，脂肽促进糖脂肽掺入脂质体内。脂质体作为疫苗设计中的载体已吸引关注，这是由于其低固有免疫原性，从而避免不希望有的载体诱导的免疫应答。
本发明的免疫原性疫苗可以例如通过化学选择性连接、更特别地天然化学连接(NCL)合成，如WO 2007/146070和美国专利公开2009/0196916A1中描述的。简言之，疫苗的一种或多种个别组分在脂质结构内包埋或溶解，所述脂质结构例如脂质单层、脂质双层、脂质体、微团、薄膜、乳状液、基质或凝胶。在连接反应中使用的反应物可以包括碳水化合物组分、肽组分、脂质组分或其缀合物或组合。设计或选择这些反应物以包含所需抗原性或免疫原性特征，例如本发明的免疫原性疫苗的T表位或B表位。
任选接头
一个或多个接头(“L”)任选用于糖脂肽的三种组分的装配。在一个实施方案中，接头是双功能接头，其具有在两个不同位置中的官能团(优选在第一个和第二个末端上)，以便将三种组分中的两种共价连接在一起。双功能接头可以是同功能的(即含有两个等同的官能团)或异功能的(即含有两个不同的官能团)。在另一个实施方案中，接头是三功能的(异功能或同功能)，并且可以将糖脂肽的所有三种组分连接在一起。合适的官能团具有针对下述中的任一种的反应性或包含下述中的任一种：氨基、醇、羧酸、硫氢基、链烯烃、炔烃、叠氮化物、硫酯、酮、醛或肼。氨基酸例如半胱氨酸可以构成接头。
双功能接头在方案9中例示。
方案9
图1显示了示例性完全合成的本发明的糖脂肽，其含有基于碳水化合物的B表位、肽T表位和脂肽。图1中所示的化合物含有充当B表位的L-甘油-D-甘露-庚糖，已鉴定为人T细胞的MHC II类限制识别位点且衍生自脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白质的肽序列YAFKYARHANVGRNAFELFL (SEQ ID NO:2)，和脂肽S-2-3[二棕榈酰氧基]-(R/S)-丙基-N-棕榈酰-R-半胱氨酸(Pam3Cys)。如本文其他地方指出的，脂肽Pam3Cys和有关化合物Pam3CysSK4是高度有效的B细胞和巨噬细胞激活物。
如实施例中例示的，制备糖脂肽的方法也被本发明所包括。优选地，用于制备糖脂肽的方法利用化学合成，导致产生完全合成的糖脂肽。在利用一个或多个接头的实施方案中，任选接头组分是官能化的，以便促进主要组分之一与主要组分中的另一种的共价连接。例如，接头可以在每个末端上用硫醇反应基团例如马来酰亚胺或溴乙酰基官能化，并且将待连接的组分修饰为包括反应性硫醇。用于连接化学的其他选项包括天然化学连接、Staudinger连接和Huisgen连接(也称为“点击化学”)。实施例2举例说明碳水化合物组分(在那种情况下为寡糖)和肽组分可如何用含硫醇接头官能化。优选地，如果使用的话，那么接头组分是非抗原性的。
本发明的糖脂肽能够在哺乳动物中生成免疫应答。糖脂肽是抗原性的，因为它可以生成体液应答，导致B细胞的激活和抗体(免疫球蛋白)例如IgM的产生。另外，糖脂肽是免疫原性的，因为它可以生成细胞应答；例如，它促进T细胞特别是辅助T细胞的激活，T细胞在包括IgG的产生在内的更复杂抗体应答的生成中也是有帮助的。最后，在动物中引发的免疫应答包括抗碳水化合物抗体的产生。
在本发明的另一个实施方案中，免疫原性疫苗是二组分疫苗，其包含共价连接的至少一种肽组分和至少一种佐剂组分。肽组分包括T表位，优选MUC1起源的辅助T表位，包括但不限于本文描述的那些中的任一种。虽然疫苗的这个实施方案可能不能生成针对特定B表位的特异性免疫性，但它显示出抗肿瘤性质。二组分疫苗的例子是共价连接至辅助T表位的Pam3CysSK4；参见例如，实施例8中的化合物3。在一个实施方案中，免疫原性疫苗的佐剂组分包含toll样受体(TLR)配体。至少15种不同的哺乳动物TLR是已知的(例如TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12、TLR13、TLR14和TLR15)，并且其配体显示出显著的结构变化。一些TLR配体在本文中描述，但应当理解此类列表不以任何方式限制本发明。在一些实施方案中，二组分免疫原性疫苗可以配制用于作为组合物施用，所述组合物进一步包含另外的试剂，例如免疫调节剂、佐剂、TLR激动剂和/或赋形剂。TLR配体是技术人员众所周知的。它们可以采取脂肽、糖脂、脂蛋白、碳水化合物、小有机分子、核酸例如单或双链DNA或RNA的形式，并且已知许多TLR配体充当免疫刺激剂。免疫刺激性TLR配体的一个例子是TLR2配体，包括但不限于本文描述的那些中的任一种。另一个例子是通常称为“CpG”的TLR9配体。这种化合物是含有CpG基序的免疫刺激性寡脱氧核苷酸(ODN)。CpG基序被TLR9识别为配体(Rothenfusser等人，2002，Human immunology 63(12)：1111-1119)。优选地，CpG ODN是未甲基化的。CpG ODN是短的单链DNA分子，其含有胞嘧啶(“C”核苷酸)随后为鸟嘌呤(“G”核苷酸)。“p”一般指DNA的磷酸二酯主链。任选地，CpG基序可以修饰为含有硫代磷酸酯(PS)主链，以便保护ODN不被核酸酶例如DNA酶降解(Dalpke等人，2002，Immunology 106(1):102-12)。CpG ODN通常的长度范围为约18个核苷酸到约28个核苷酸。任选地，它们含有回文序列。用于在本发明中使用的CpG的一个例子是5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3' (SEQ ID NO:36)。存在于脊椎动物DNA中的CpG基序由于转录调节机制所致通常是甲基化的(Sulewska等人，2007，Folia Histochemica etCytobiologica 45(3):149-158)。未甲基化的CpG基序已显示充当免疫刺激剂(Weiner等人，1997，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，94:10833-10837)。CpG已用于研究中以增强肿瘤免疫(Nierkens等人，2009，PLoS One. 4(12):e8368；Cooper等人，2004，J. Clin.Immunol. 24(6):693-701；Leichman等人，2005，J. Clin. Oncol. 2005 ASCO AnnualMeeting Proceedings. 23(16S):7039)。
许多CpG ODN是商购可得的。例如，CpG ODN可以作为A型、B型或C型分子通过InvivoGen (San Diego，CA)购买。这些类别基于结构差异及其免疫刺激活性(Krug等人，2001. Eur J Immunol，31(7)：2154-63；Marshall等人，2005 DNA Cell Biol. 24(2):63-72；Martinson等人，2006，Immunology 120:526-535)。
在另一个实施方案中，免疫原性疫苗的佐剂组分是如本文描述的脂质组分(还参见WO 2007/079448、美国专利公开2009/0041836 A1和WO 2010/002478)。一些TLR配体例如TLR2的配体也构成脂质组分，但免疫原性疫苗的脂质组分并不限于TLR配体；即脂质组分可以是可以充当佐剂的任何合适的免疫原性或抗原性脂质，例如脂质化氨基酸(“LAA”)。
在另一个方面，本发明的糖脂肽用于产生多克隆或单克隆抗体，其识别碳水化合物组分和肽组分中的任一种或两者。本发明包含制备所述抗体的方法，以及抗体自身和产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤。
用于在生产抗体中使用的本发明的免疫原性糖脂肽可以含有本文描述的任何碳水化合物组分，而无限制。优选地，它含有糖肽作为其碳水化合物组分。糖肽包括糖基化肽序列，其包括碳水化合物部分例如糖。糖可以是单糖、寡糖或多糖。优选地，用于生成抗体的糖脂肽的碳水化合物组分含有如上所述的自身抗原。有利地，即使碳水化合物组分例如糖肽是弱抗原性的(例如自身抗原)，碳水化合物组分与肽组分和脂质组分的共价连接也产生显著免疫原性的糖脂肽。
结合糖脂肽的本发明的抗体优选结合B表位，其包括糖部分，并且在优选实施方案中包括形成糖肽的肽的至少一部分。优选的抗体与用作碳水化合物组分的糖肽结合，但不与单独的脱糖基化肽或糖残基结合。
当用于生成抗体时，本发明的糖脂肽成功生成高亲和力IgG抗体。这对于具有弱抗原性碳水化合物组分例如自身抗原的糖脂肽的实施方案是尤其令人惊讶和出乎意料的。多克隆或单克隆抗体因此优选是IgG同种型抗体。不受理论束缚，认为本发明的糖脂肽是优良抗原(与非脂质化糖肽相比较)，因为它刺激细胞因子的局部产生，上调共刺激蛋白质，增强通过巨噬细胞和树突状细胞的摄取和/或避免表位抑制。
本发明的抗体包括但不限于识别B表位的那些，所述B表位含有O-GlcNAc、O-GalNAc、O-甘露糖或其他糖修饰。可被本发明的抗体识别的其他B表位包括含有糖胺聚糖的片段的那些，糖胺聚糖例如肝素、硫酸类肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、乙酰透明质酸和一般的任何糖胺聚糖。在通过重复二糖单位形成的糖胺聚糖的情况下，B表位可以含有一个或多个二糖单位。被本发明的抗体识别的B表位可以含有戊糖、己糖或包括酸的其他糖部分，包括但不限于葡糖醛酸、艾杜糖醛酸、透明质酸、葡萄糖、半乳糖、半乳糖胺、葡糖胺等。本发明的抗体优选使用本发明的糖脂肽作为免疫原产生，其中碳水化合物组分含有目的B表位。天然存在的B表位的类似物例如含有N联或S联结构的那些或糖模拟物，可以用作碳水化合物组分，例如以使得糖脂肽免疫原更加代谢稳定。
使用本发明的糖脂肽产生的抗体有利地包括高亲和力IgG抗体，其识别广谱糖蛋白。因此，即使使用本发明的糖脂肽作为免疫原产生的抗体对于用作碳水化合物组分的糖肽是特异性的，它们也可以结合广谱糖蛋白。对于含有目的B表位组分的糖基化肽或蛋白质具有相对广泛选择性的抗体在本文中被称为“泛特异性”抗体。本发明的多克隆或单克隆抗体可以是泛特异性或位点特异性的。如该术语在本文中使用的，泛特异性抗体是这样的抗体，其特异性识别所选B表位例如含有O-GlcNAc的B表位，但对于含有该B表位的蛋白质和肽具有相对广泛的选择性。泛特异性抗体因此能够结合含有目的B表位的多种不同的糖基化蛋白质或肽，尽管它不一定结合含有所选B表位的所有糖基化蛋白质或肽。
不预期受理论束缚，被本发明的泛特异性抗体识别的不同糖蛋白可以共享在糖基化位点上的基本上相似或等同的(糖)肽序列(即一级序列)或基本上相似的二级或三级结构，从而导致广谱结合靶被该抗体识别。由抗体与之结合的O-GlcNAc修饰的糖蛋白共享的二级或三级表位结构可以有利地维持在糖脂肽免疫原中，如由识别广谱糖蛋白的IgG抗体的成功产生证明的。
优选地，本发明的抗体结合具有包含O-GlcNAc、O-GalNAc或其他糖修饰的表位的多种糖基化蛋白质或肽，但不能可检测地结合不含有该糖的蛋白质或肽。更优选地，抗体结合具有包含O-GlcNAc、O-GalNAc或其他糖修饰的表位的蛋白质或肽，但不会可检测地结合不含有O-GlcNAc、O-GalNAc或其他糖修饰的相同蛋白质或肽。
优选多克隆或单克隆抗体的例子是结合含有O-GlcNAc单糖残基的糖肽的多克隆或单克隆抗体。在特别优选的实施方案中，抗体具有对于O-GlcNAc修饰的蛋白质相对广泛的选择性。例如，许多目的蛋白质具有由O-GlcNAc修饰的TPVSS (SEQ ID NO:10)序列，并且优选的单克隆抗体识别这个和/或相似的糖基化肽序列。对O-GlcNAc修饰的序列特异的优选单克隆抗体的例子包括由杂交瘤细胞系1F5.D6、9D1.E4、18B10.C7和5H11.H6产生的单克隆抗体。这些单克隆抗体使用化合物52和/或53作为免疫原产生。因此，在一个实施方案中，本发明的抗体结合化合物52或化合物53的碳水化合物组分。杂交瘤细胞系1F5.D6、9D1.E4和18B10.C7于2008年7月1日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 UniversityBlvd.，Manassas，VA，20110-2209，USA，并且分别指定ATCC保藏号PTA-9339、PTA-9340和PTA-9341。本发明包括杂交瘤细胞系以及它们所产生的单克隆抗体。
优选多克隆或单克隆抗体的另一个例子是结合硫酸类肝素片段的那种。
应当理解具有临床意义或兴趣的任何碳水化合物或糖肽可以作为本发明的糖脂肽的碳水化合物和/或肽组分掺入，且用于根据本发明的方法生成多克隆和单克隆抗体。此类碳水化合物和肽包括具有医学和兽医学兴趣的那些，以及具有其他商业或研究应用的那些。应当理解本发明的单克隆和多克隆抗体并不限于识别任何特定配体的那些，但包括而不限于且仅作为例子，针对任何类型的肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)和衍生自任何微生物的任何糖的抗体。
概言之，使用本发明的糖脂肽制备本发明的单克隆抗体在产生对于其碳水化合物或糖肽抗原具有高亲和力的单克隆IgG抗体中是令人惊讶地有效的，即使当抗原是弱抗原性的时。这打开了产生对于研究、诊断和治疗免疫有关疾病或具有自身免疫或炎性组分的疾病有用的抗体的大门，所述疾病包括癌症、II型糖尿病、变态反应、哮喘、克罗恩(Crohn's)病、阿尔茨海默氏病、肌营养不良、微生物感染等。例如识别O-GlcNAc修饰的糖蛋白的本发明的单克隆抗体远远优于商购可得的抗体，例如CTD110.6 (Covance ResearchProducts，Inc.)。本发明的糖脂肽可以使用模块合成进行装配，其中脂质、肽和碳水化合物组分根据所需应用进行选择。此外，本发明的糖脂肽是用于产生泛特异性抗体特别是泛特异性单克隆IgG抗体的显著有效的抗原，所述抗体识别含有O联单糖例如O-GlcNAc的糖基化肽和蛋白质。
本发明的抗体和通过本发明的方法产生的那些是用于鉴定和表征蛋白质、肽和与多种疾病状态相关的其他生物分子的重要研究工具。例如，本发明的泛特异性抗体可以用于自复杂生物样品的获取(pull down)糖蛋白。这种方法可以用于检测和鉴定迄今未知与特定病症或疾病状态相关的蛋白质，从而鉴定潜在的治疗或诊断靶。在一个实施方案中，本发明的抗体可以在使得抗体能够结合多种糖基化蛋白质或糖基化肽并检测抗体-蛋白质结合的条件下与生物样品接触。任选地，该方法可以包括分离糖基化蛋白质或糖基化肽。该方法可以进一步包括鉴定在多种糖基化蛋白质或糖基化肽内的一种或多种蛋白质或肽。糖基化蛋白质和肽的鉴定可以提供探究糖基化的作用及其在多种生物过程中的生物牵涉的机会。例如，蛋白质或肽的糖基化可以涉及许多生物过程，包括但不限于转录、翻译、信号转导、遍在蛋白途径、细胞内囊泡的顺行运输和翻译后修饰(例如SUMO化和磷酸化)。用于鉴定蛋白质或肽的方法是本领域众所周知的，并且可以包括但不限于诸如质谱法和埃德曼(Edman)降解等技术。
本发明的泛特异性抗体也可以用于鉴定在疾病状态中具有改变的糖基化的蛋白质或肽。O-GlcNAc修饰与多种疾病状态相关。例如，在骨骼肌和胰腺糖肽中O-GlcNAc修饰的增加与II型糖尿病的发展关联，而在神经糖肽中O-GlcNAc修饰的减少与阿尔茨海默氏病的发作关联(Dias和Hart；Mol. BioSyst. 3:766-772(2007))。因此，在O-GlcNAc修饰的水平方面的改变的检测可以用作诊断或预后工具。另外，此类蛋白质或肽的糖基化状态可以与疾病状态关联。用于鉴定具有与疾病状态关联的改变糖基化的蛋白质或肽的方法包括使本发明的抗体与具有已知疾病状态的第一生物样品一起温育，和在使得抗体能够结合在第一样品内的多种糖基化蛋白质和肽和在第二样品内的多种糖基化蛋白质和肽的条件下，使抗体与具有非患病状态的第二生物样品一起温育，独立地从所述样品中分离糖基化蛋白质和糖基化肽，并且鉴定所述糖基化蛋白质和糖基化肽。该方法可以进一步包括比较在第一样品中鉴定的糖基化蛋白质和糖基化肽与在第二样品中的糖基化蛋白质和糖基化肽，其中显示在第一和第二样品之间的糖基化状态中的变化的蛋白质或肽指示糖基化蛋白质或糖基化肽与疾病状态相关。在糖基化和疾病状态之间的关联包括相对于非患病状态具有增加或减少的糖基化的疾病状态。此外，疾病状态可以显示出糖基化，而非疾病状态显示糖基化的完全不存在，或相反地，疾病状态可以显示糖基化的完全不存在，而无疾病显示出糖基化的存在。在每个例子中，蛋白质或肽视为在疾病状态中具有差异或改变的糖基化。使用本发明的抗体检测糖基化的存在情况或过表达和检测糖基化水平中的变化的方法先前已得到描述。
本发明的抗体在诊断或治疗应用中是广泛有用的，如本文其他地方更详细地描述的。比较分析可以对两种或更多种不同的生物样品进行。例如，大规模免疫沉淀可以对治疗干预前和后的样品执行，或随着时间过去执行，以监控疾病的进展，或比较正常样品与来自怀疑患有特征在于蛋白质糖基化中的变化的疾病、感染或病症的患者的样品。
在一个实施方案中，本发明包括诊断受试者中的疾病状态的存在情况的方法。该方法包括使来自受试者的生物样品与本发明的抗体一起温育，并且检测抗体与在疾病状态中具有差异糖基化的蛋白质或肽的结合。检测抗体结合的方法先前已得到描述。在其中糖基化在疾病状态中完全不存在的情况下，抗体与蛋白质或肽的结合的缺乏指示受试者具有疾病状态。在其中糖基化存在于疾病状态中但在非疾病状态中完全不存在的情况下，抗体与蛋白质或肽的结合指示受试者中疾病状态的存在。任选地，该方法可以进一步包括使第二个非患病的生物样品与本发明的抗体一起温育，检测抗体与蛋白质或肽的结合，并且比较在第一个和第二个样品中的抗体结合。
另外，对于其中糖基化存在于疾病状态和非疾病状态两者中，但在疾病状态中改变(即增加或减少)的蛋白质和肽，该方法可以进一步包括定量第一个样品中的抗体结合水平，定量第二个非患病样品中的抗体结合水平，并且比较所述结合水平。与非患病样品相比较，在第一个样品中的抗体结合的变化指示受试者中感染、疾病或病症的存在情况。
对于本发明的抗体的制备，可以使用提供通过培养中的连续细胞系产生抗体分子的任何技术。例如，可以使用最初由Kohler和Milstein (256 Nature 495-497(1975))开发的杂交瘤技术。还参见Ausubel等人，Antibodies：a Laboratory Manual,(Harlow & Lane编辑，Cold Spring Harbor Lab. 1988)；Current Protocols in Immunology,(Colligan等人，编辑，Greene Pub. Assoc. & Wiley Interscience N.Y.，1992-1996)。
本发明还提供了产生单克隆抗体、优选针对其抗原具有高度特异性和亲和力的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。本发明进一步包括杂交瘤细胞系的变体和突变体。此类细胞系可以使用已知方法人工产生且仍具有原材料的特有性质。例如，它们可以仍然能够产生根据本发明的抗体或其衍生物，并将其分泌到周围介质内。任选地，杂交瘤细胞系可以自发出现。杂交瘤细胞系的克隆和亚克隆应理解为杂交瘤，其通过反复克隆由起始克隆产生，且仍具有起始克隆的主要特征。
抗体可以通过用本发明的糖脂肽免疫接种在动物宿主中引发，或可以通过免疫细胞的体外免疫接种(致敏)形成。抗体也可以在重组系统中产生，其中合适的细胞系用合适的抗体编码DNA进行转化、转染、感染或转导。可替代地，抗体可以通过纯化的重链和轻链的生物化学重构进行构建。
一旦抗体分子已由动物产生、化学合成或重组表达，它就可以通过本领域已知用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法进行纯化，例如通过层析(例如离子交换、亲和力特别是在蛋白A后通过对特定抗原的亲和力、和分筛柱层析)、离心、差异溶解度或通过用于纯化蛋白质的任何其他标准技术。此外，本发明的抗体或其片段可以融合至本领域已知的异源多肽序列，以促进纯化。
在优选实施方案中，单克隆抗体识别和/或结合存在于本发明的糖脂肽的碳水化合物组分或肽组分上的抗原。在特别优选的实施方案中，单克隆抗体结合存在于碳水化合物组分的所选特征上的抗原。所选特征的例子包括在糖肽上的修饰例如O-GlcNAc。其他修饰包括但不限于GalNAc及其他糖修饰。
术语“抗体”以最广泛的含义使用，且特别涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)和抗体片段，只要它们显示出所需生物活性。“抗体片段”包含全长抗体的部分，一般为其抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括但不限于Fab、Fab'和Fv片段；双抗体；线性抗体；和单链抗体分子。如本文使用的术语“单克隆抗体”指高度特异性的、针对单个抗原位点的抗体。如本文使用的术语“抗体”还包括天然存在的抗体以及非天然存在的抗体，包括例如单链抗体，嵌合、双功能和人源化抗体，以及其抗原结合片段。此类非天然存在的抗体可以使用固相肽合成进行构建，可以重组产生且可以例如通过筛选由可变重链和可变轻链组成的组合文库获得，如由Huse等人(Science 246:1275-1281(1989))描述的。这些及其他制备功能抗体的方法是本领域技术人员众所周知的(Winter和Harris，Immunol. Today 14:243-246(1993)；Ward等人，Nature 341:544-546(1989)；Harlow和Lane，同上，1988)；Hilyard等人，Protein Engineering：A practical approach(IRL Press 1992)；Borrabeck，Antibody Engineering，第2版(Oxford University Press 1995))。
在所有哺乳动物物种中，抗体肽含有恒定(即高度保守的)区和可变区，并且在后者内，存在互补决定区(CDR)，和由在重或轻链的可变区内但在CDR外的氨基酸序列构成的所谓的“构架区”。优选地，本发明的单克隆抗体已是人源化的。如本文使用的，术语“人源化”抗体指其中非人(通常来自小鼠或大鼠) CDR从非人免疫球蛋白的重和轻可变链转移到以下可变区内的抗体，所述可变区设计为含有在人IgG中的构架区内发现的许多氨基酸残基。小鼠/人嵌合抗体至人源化抗体的相似转换先前已得到描述。用于克隆鼠免疫球蛋白可变结构域的一般技术例如由Orlandi等人，Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86：3833(1989)的出版物描述，所述文献通过引用以其整体并入。用于产生人源化MAbs的技术例如由Jones等人，Nature 321：522(1986)，Riechmann等人，Nature 332：323(1988)，Verhoeyen等人，Science 239：1534(1988)，和Singer等人，J. Immun. 150：2844(1993)描述，所述文献各自在此通过引用并入。
使用识别和/或结合糖脂肽的组分的单克隆抗体的方法也由本发明包含。关于本发明的单克隆抗体的用途包括但不限于诊断、治疗和研究用途。在优选实施方案中，单克隆抗体可以用于诊断目的。因为O-GlcNAc修饰与多种疾病状态相关，所以O-GlcNAc修饰的水平中的变化的检测可以解释为此类疾病发作的早期指示物。例如，在骨骼肌和胰腺糖肽中O-GlcNAc修饰的增加与II型糖尿病的发展关联，而在神经糖肽中O-GlcNAc修饰的减少与阿尔茨海默氏病的发作关联(Dias和Hart，Mol. BioSyst. 3:766-772(2007)；Lefebvre等人，Exp. Rev. Proteomics 2(2):265-275(2005))。因此，相对于非疾病对照样品，鉴定在骨骼肌组织的样品中O-GlcNAc量的增加可以指示II型糖尿病的发展。
应当理解本发明的单克隆和多克隆抗体并不限于识别任何特定配体的那些，但包括而不限于且仅作为例子，针对任何类型的肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)和衍生自任何微生物的任何糖的抗体。本发明的抗体在诊断或治疗应用中是广泛有用的。
本发明的抗体可以用于检测特定蛋白质或特定修饰的存在情况或过表达。用于检测的技术是本领域已知的，并且包括但不限于蛋白质印迹、斑点印迹、免疫沉淀、凝集、ELISA测定、免疫ELISA测定、组织成像、质谱法、免疫组织化学、和对多种组织或体液的流式细胞术，和多种夹心测定。参见例如，在此通过引用并入的美国专利号5,876,949。
为了检测O-GlcNAc修饰的糖肽的水平的变化，本发明的单克隆抗体可以用许多已知可检测标记中的任一种共价或非共价标记，所述可检测标记例如荧光、放射性或酶促物质，如本领域已知的。可替代地，将对本发明的单克隆抗体特异的次级抗体用已知的可检测标记进行标记，并用于在上述技术中检测O-GlcNAc特异性抗体。
优选的可检测标记包括生色染料。在最常用的那些中有3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)和3,3’-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)。这些可以使用光学显微镜检查进行检测。还优选的是荧光标记。在最常用的荧光标记化合物中有异硫氰酸荧光素(例如FITC和TRITC)、吲哚三羰花青(Idotricarbocyanines)(例如Cy5和Cy7)、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺。还可以使用化学发光和生物发光化合物，例如鲁米诺、异鲁米诺、theromatic吖啶酯、咪唑、吖啶盐、草酸酯、萤光素、萤光素酶和水母发光蛋白。当荧光标记的抗体暴露于合适波长的光时，由于它的荧光可以检测到它的存在。还优选的是放射性标记。对于标记本发明的抗体特别有用的放射性同位素包括3H、125I、131I、35S、32P和14C。放射性同位素可以通过此类方法进行检测，如使用γ计数器、闪烁计数器或通过放射自显影术。可以用于可检测标记抗体和可以例如通过分光光度计测量、荧光测定或目视方法检测的酶包括但不限于苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母乙醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、尿素酶、过氧化氢酶、6-磷酸葡糖脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。标记和检测抗体的其他方法是本领域已知的且在本发明的范围内。
包括TLR激动剂、T辅助细胞表位和糖基化MUC1表位(B/T细胞表位)的本发明的三组分免疫原性疫苗显示出许多优点。糖基化B/T细胞表位可以是比非糖基化表位更有效的。疫苗引发引发的强细胞裂解性T细胞应答，裂解表达MUC1的细胞。通常通过CD4+和CD8+ T细胞的干扰素γ分泌指示T细胞细胞应答的激活。进一步地，B细胞应答的激活通过Ig类别转换和在诱导表达MUC1的细胞(肿瘤细胞和YAC细胞两者)的ADCC (抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)方面有效的抗体的产生来指示。因此，基于MUC1的三组分免疫原性癌症疫苗双重引发体液和细胞免疫应答，包括抗体形成、干扰素γ产生和细胞毒性活性，获得优良的治疗结果。在一些实施方案中，第二种TLR激动剂的添加进一步增加有效性，例如显示出减少的肿瘤负荷、增加的IFN-γ产生和增加的T细胞介导的细胞毒性。
本发明包括通过用本文描述的一种或多种免疫原性疫苗构建体免疫接种受试者，在受试者中生成抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的方法。在一些方面，ADCC是天然杀伤(NK)细胞介导的。在一些方面，ADCC裂解肿瘤细胞。在一些方面，肿瘤细胞是乳腺癌细胞或上皮癌细胞。在一些方面，ADCC裂解表达MUC1肽序列的细胞。在一些方面，MUC1肽是异常糖基化的。
本发明包括通过用本文描述的一种或多种免疫原性疫苗构建体免疫接种受试者，在受试者中治疗癌症、减少肿瘤负荷、预防肿瘤复发和/或预防癌症的方法。在本发明的方法的一些方面，癌症或肿瘤是乳腺癌或上皮癌。在本发明的方法的一些方面，癌症或肿瘤表达异常糖基化的MUC1。
本发明包括通过用本文描述的一种或多种免疫原性疫苗构建体免疫接种受试者，在受试者中生成针对MUC1表达细胞的细胞毒性T细胞应答，生成抗MUC 1抗体，和/或促进抗MUC1抗体类别转换的方法。在一些方面，MUC1表达细胞是肿瘤细胞。在本发明的方法的一些方面，癌症或肿瘤表达异常糖基化的MUC1。
本发明包括用糖脂肽免疫接种受试者的方法，所述糖脂肽包括包含B细胞表位的至少一种糖基化MUC1糖肽组分；包括MHC II类限制性辅助T细胞表位的至少一种肽组分；和至少一种脂质组分。在一些方面，在受试者中诱导特异性结合在肿瘤细胞上表达的MUC1蛋白质的IgG亚型的抗体。因为它是抗原性和免疫原性的，所以本发明的糖脂肽非常适合于在免疫治疗药物组合物中使用。本发明因此包括药物组合物，其包含本发明的糖脂肽以及药学可接受的载体。在优选实施方案中，药物组合物含有脂质体，例如基于磷脂的脂质体，并且糖脂肽由于非共价相互作用例如疏水作用所致而掺入脂质体内。可替代地，糖脂肽可以共价连接至脂质体的组分。脂质体制剂可以包括具有相同或不同B表位、相同或不同T细胞表位和/或相同或不同脂质组分的糖脂肽。
本发明的三组分免疫原性疫苗具有共价连接的至少一种碳水化合物组分、至少一种肽组分和至少一种佐剂组分。三组分免疫原性疫苗含有B表位和T表位，优选辅助T表位。通常地，碳水化合物组分包括B表位，并且肽组分含有T表位。B表位可以进一步包括T表位。然而，这些表位可以重叠，并且单个糖肽例如MUC-1糖肽可以包括B表位和T表位两者。
本发明的糖脂肽容易地配制为用于兽医或人用途的药物组合物。药物组合物任选包含赋形剂或稀释剂，其作为载体是药学可接受的且与糖脂肽相容的。术语“药学可接受的载体”指这样的一种或多种载体，其在与组合物的其他成分相容且对于其接受者或糖脂肽无害的意义上是“可接受的”。合适的赋形剂包括例如水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等及其组合。此外，需要时，药物组合物可以含有微量辅助物质例如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂、盐和/或佐剂，其增强免疫刺激组合物的有效性。对于经口施用，糖脂肽可以与植物或动物起源的蛋白质或油混合。制备和使用此类药物组合物的方法也包括在本发明中。
本发明的药物组合物可以施用于任何受试者，包括人和驯养动物(例如猫和犬)。在优选实施方案中，药物组合物可用作疫苗，并含有在受试者中有效诱导免疫应答的量的糖脂肽。本发明的糖脂肽疫苗的剂量、用于疫苗接种的时间表等可通过本领域技术人员容易地测定。疫苗可以使用任何方便的方法施用于受试者，优选胃肠外(例如经由肌内、真皮内或皮下注射)或经由经口或鼻施用。取决于待疫苗接种的动物类型、其年龄和重量，减毒病毒的免疫原性和施用方式，待施用的有用剂量将改变。
本发明的三组分或二组分免疫原性疫苗可以单独或一起施用。另外，因为二组分疫苗作为佐剂是有用的，所以它可以施用以增强其他癌症治疗，例如化学治疗、放射治疗或其他类型的免疫治疗。
在一种治疗方法中，至少一种TLR配体与本发明的三组分免疫原性疫苗和/或二组分免疫原性疫苗一起共施用。共施用的TLR配体作为另外的佐剂施用。示例性TLR配体在本文中描述。任何TLR配体可以与免疫原性疫苗共施用。优选地，TLR2或TLR9配体例如CpG ODN与免疫原性疫苗共施用。当免疫原性疫苗含有TLR配体例如共价连接的TLR2配体作为共价连接的佐剂组分时，应当理解共施用的TLR配体例如共施用的TLR9配体可以不同于共价连接的TLR配体。
治疗方法可以涉及三组分疫苗、二组分疫苗和/或共施用的TLR配体的任何组合的施用，如按照待治疗的病况所需的或如按照卫生保健专家指示的。
将佐剂包含在药物组合物中是任选的。佐剂包括例如明矾、QS-21和TLR激动剂。TLR激动剂包括但不限于本文描述的任何TLR激动剂。优选的TLR激动剂包括TLR2激动剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂和TLR9激动剂。TLR9通过未甲基化的含CpG序列激活，所述序列包括在细菌DNA或合成寡核苷酸(ODN)中发现的那些。此类未甲基化的含CpG序列以高频率存在于细菌DNA中，但在哺乳动物DNA中是罕见的。因此，未甲基化的CpG序列使微生物DNA与哺乳动物DNA区分。参见例如，Janeway和Medzhitov，2002，Ann Rev Immunol；20:197；Barton和Medzhitov，2002，Curr Top Microbiol Immunol；270:81；Medzhitov，2001，Nat Rev Immunol；1:135；Heine和Lein，2003，Int Arch Allergy Immunol；130:180；Modlin，2002，Ann Allergy Asthma Immunol；88:543；和Dunne和O'Neill，2003，Sci. STKE2003:re3。
TLR9激动剂可以是微生物DNA的制剂，所述DNA包括但不限于大肠杆菌DNA、无内毒素大肠杆菌DNA、或来自大肠杆菌K12的无内毒素细菌DNA。TLR9激动剂可以是从细菌中分离的，例如与细菌来源分离的；合成的，例如通过用于多核苷酸的化学合成的标准方法产生的；通过标准重组方法产生，随后从细菌来源中分离的；或前述的组合。在许多实施方案中，TLR激动剂是纯化的，并且是例如至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%纯的或更高纯度的。
TLR9激动剂可以是含有未甲基化的CpG基序的合成寡核苷酸，在本文中也称为“CpG寡脱氧核苷酸”、“ CpGODN”或“ODN”(参见例如，Hemmi等人 "A Toll-like receptorrecognizes bacterial DNA," Nature 2000；408：740-745)。至少三个类型的免疫刺激性CpG-ODN已得到描述。A (或D)型ODN优先激活类浆细胞树突状细胞(pDC)，以产生IFN?，而B(或K)型ODN诱导B细胞的增殖以及IgM和IL-6的分泌。已生成合并称为A和B型两者的特征的另一个类型，并将其称为C型。本发明的TLR9激动剂可以包括已得到描述的至少三种类型的刺激性ODN (A型、B型和C型)中的任一种。
CpG-寡脱氧核苷酸TLR9激动剂包含CpG基序。CpG基序包含CpG二核苷酸的5'侧的两个碱基和3'侧的两个碱基。CpG-寡脱氧核苷酸可以通过用于多核苷酸的化学合成的标准方法产生。CpG-寡脱氧核苷酸可以例如在商业上购自Coley Pharmaceuticals(Wellesley，MA)、Axxora，LLC(San Diego，CA)或InVivogen,(San Diego，CA)。CpG-寡脱氧核苷酸TLR9激动剂可以包括广泛范围的DNA主链、修饰和取代。
在本发明的一些方面，TLR9激动剂是包含核苷酸序列5' CG 3'的核酸。在本发明的一些方面，TLR9激动剂是包含核苷酸序列5'-嘌呤-嘌呤-胞嘧啶-鸟嘌呤-嘧啶-嘧啶-3'的核酸。在本发明的其他方面，TLR9激动剂是包含核苷酸序列5'-嘌呤-TCG -嘧啶-嘧啶-3'的核酸。在本发明的一些方面，TLR9激动剂是包含核苷酸序列5'-(TGC)n-3'的核酸。在本发明的其他方面，TLR9激动剂是包含序列5'-TCGNN-3'的核酸，其中N是任何核苷酸。
在一些方面，TLR9激动剂可以具有长度约5-约200、约10-约100、约12-约50、约15-约25、约5-约15、约5-约10或约5-约7个核苷酸的序列。在一些方面，TLR9激动剂的长度可小于约15、小于约12、小于约10或小于约8个核苷酸。
TLR9激动剂包括但不限于美国专利号6,194,388；6,207,646；6,239,116；6,339,068；和6,406,705、6,426,334和6,476,000以及公开的美国专利申请US 2002/0086295、US2003/0212028和US 2004/0248837中描述的那些中的任一种。
在一些方面，TLR激动剂可以是更大的核苷酸构建体(例如质粒载体、病毒载体或其他此类构建体)的部分。广泛多样的质粒和病毒载体是本领域已知的，并且无需在此处详细阐述。大量此类载体已在多种出版物中描述。参见例如，Current Protocols inMolecular Biology,(F. M. Ausubel,等人，编辑，1987及更新版)。许多此类载体是商购可得的。
本发明的免疫原性疫苗可以与一种或多种另外的治疗剂一起施用。另外的治疗处理包括但不限于手术切除、放射治疗、化学治疗、激素治疗、抗肿瘤疫苗、基于抗体的治疗、全身照射、骨髓移植、外周血干细胞移植和化学治疗剂(在本文中也称为“抗肿瘤化学治疗剂”)的施用。抗肿瘤化学治疗剂包括但不限于环磷酰胺、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、多柔比星、长春新碱、异环磷酰胺、顺铂、吉西他滨、白消安(也称为1,4-丁二醇二甲烷磺酸酯或BU)、ara-C (也称为1-β-D-阿糖呋喃糖胞嘧啶或阿糖胞苷)、阿霉素、丝裂霉素、环磷酰胺、甲氨蝶呤及其组合。TLR激动剂的施用可以在另外的化学治疗剂施用前、过程中和/或后发生。另外的治疗剂包括例如一种或多种细胞因子、抗生素、抗微生物剂、抗病毒剂例如AZT、ddI或ddC，及其组合。使用的细胞因子包括但不限于IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-18、IL-19、IL-20、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、肿瘤坏死因子(TNF)、转化生长因子-β (TGF-β)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))(美国专利号5,478,556、5,837,231和5,861,159)、或Flt-3配体(Shurin等人，Cell Immunol. 1997；179:174-184)。抗肿瘤疫苗包括但不限于肽疫苗、全细胞疫苗、遗传修饰的全细胞疫苗、重组蛋白质疫苗或基于通过重组病毒载体对肿瘤相关抗原的表达的疫苗。另外的治疗剂可以是免疫调节剂，例如TLR4激动剂、TLR 8激动剂、TLR9激动剂、COX-2抑制剂、GM-CSF、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的抑制剂、化学治疗剂或其组合。
如指出的，药物组合物作为疫苗是有用的。疫苗可以是预防或保护性疫苗。同样地，疫苗可以是在疾病或病症例如癌症形成后施用的治疗疫苗。因此，本发明包含包括如本文描述的糖脂肽的疫苗，包括抗微生物(例如抗病毒或抗菌)和抗癌疫苗。
可以有效治疗或预防的癌症包括但不限于前列腺癌、膀胱癌、结肠癌、乳腺癌、黑素瘤、胰腺癌、肺癌、白血病、淋巴瘤、肉瘤、卵巢癌、卡波西肉瘤、霍奇金病(Hodgkin'sDisease)、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、小细胞肺癌、原发性脑瘤、胃癌、恶性胰腺胰岛素瘤(malignantpancreatic insulanoma)、恶性类癌、恶化前皮肤病损、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、成神经细胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、恶性血钙过多、宫颈癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌和上皮细胞起源的癌症。如本文使用的，“肿瘤”指在哺乳动物中发现的所有类型的癌症、赘生物或恶性肿瘤。
肿瘤的治疗功效可以通过本领域众所周知的多种参数中的任一种进行评估。这包括但不限于测定肿瘤大小的减少，测定肿瘤的生长、传播、侵袭力、血管化、血管生成和/或转移的抑制，测定任何转移病灶的生长、传播、侵袭力和/或血管化的抑制，和/或测定针对肿瘤抗原的增加的迟发型超敏反应。治疗功效也可以通过下述方式进行评估：测定受试者中复发的延迟或肿瘤进展的延迟，或测定受试者的存活率例如在治疗后一或五年时增加的存活率。如本文使用的，复发是在其明显停止后肿瘤或赘生物的恢复，例如白血病的恢复。
本发明的糖脂肽也可以用于被动免疫接种方法中。例如，糖脂肽可以施用于宿主动物，例如兔、小鼠、大鼠、鸡或山羊，以在宿主动物中生成抗体产生。用于在宿主动物中产生多克隆抗体的方案是众所周知的。包含在糖脂肽中的一种或多种T表位任选选择为与抗体在其中产生的宿主动物的相应T表位相同或相似。从动物中分离抗体，随后预防或治疗上施用于哺乳动物受试者，优选人受试者，以治疗或预防疾病或感染。针对本发明的糖脂肽的单克隆抗体可以从依照标准实验室方案制备的杂交瘤中分离；它们还可以使用重组技术例如噬菌体展示产生。此类抗体对于被动免疫接种也是有用的。任选地，抗糖脂肽单克隆抗体是人抗体或人源化抗体。包含在用于产生多克隆或单克隆抗体的糖脂肽中的一种或多种B表位根据预期治疗目的进行选择。本发明包含多克隆和单克隆抗糖脂肽抗体，以及其制备和使用方法。
相应地，还由本发明提供的是药物组合物，其包含本发明的单克隆或多克隆抗体以及药学可接受的载体。优选地，单克隆抗体是人源化抗体。人源化抗体更优选用于在人疾病或病症的治疗中使用，因为当引入人宿主内时，人源化抗体更不可能诱导免疫应答，特别是变应性应答。如指出的，药物组合物任选包含赋形剂或稀释剂，其作为载体是药学可接受的和与单克隆抗体相容，可以施用于任何受试者，包括人和驯养动物(例如猫和犬)。制备和使用此类药物组合物的方法也包括在本发明中。
致癌转化细胞的共同特征是寡糖例如Globo-H、LewisY和Tn抗原的过表达。任选地，包含本发明的单克隆或多克隆抗体以及药学可接受的载体的本发明药物组合物，可以用于靶向包含过表达此类寡糖的致癌转化细胞的肿瘤。例如，缀合至化学治疗分子的抗体可以用于将化学治疗分子递送至肿瘤。
本发明的另一种药物组合物可包含可影响蛋白质活性的化合物(例如抗体、配体、小分子或肽)以及药学可接受的载体。化合物对蛋白质的作用可包括但不限于激动、拮抗、抑制或增强蛋白质的正常生物过程。优选地，化合物是结合蛋白质上的表位的抗体，所述蛋白质包含O-糖基化位点。优选地，O-糖基化位点是O-GlcNAc位点。众多研究已显示这种异常糖基化可以促进转移，因此它与癌症患者的弱存活率强烈关联。因此，影响异常糖基化蛋白质的活性的能力可以使得能够预防异常活性。
治疗有效浓度和量可通过在已知体外和体内系统(包括但不限于本文描述的那些中的任一种)中测试化合物，凭经验对本文描述的每种应用进行测定，随后可以由其外推用于人或其他动物的剂量。治疗功效可以通过本领域众所周知的多种参数中的任一种进行评估。这包括但不限于肿瘤大小的减少，CD8+ T细胞活性的增加，和/或增加的存活时间。
如本文其他地方指出的，已惊讶地发现Toll样受体(TLR)配体共价连接至包含碳水化合物组分(含有B表位)和肽组分(含有T表位)的糖肽，增强糖肽通过靶细胞的摄取和内在化(参见实施例3)。因此鉴定的表征为脂质的TLR配体是用于在本发明的糖脂肽中使用的优选的脂质组分。本发明因此进一步提供了用于鉴定TLR配体优选脂质配体的方法，其包括使候选化合物与含有Toll样受体(TLR)的靶细胞接触，和测定候选化合物是否结合TLR(即，是否是TLR配体)。优选地，候选化合物通过TLR由靶细胞内在化。通过与TLR的结合和任选地通过内在化到靶细胞内鉴定的含脂质的TLR配体预期是免疫原性的，且非常适合于用作本发明的糖脂肽的脂质组分。本发明因此还包含糖脂肽，其包括使用本发明的方法鉴定的一种或多种含脂质的TLR配体作为脂质组分。
本发明还包括诊断试剂盒。由本发明提供的试剂盒可以含有本发明的抗体、优选单克隆抗体，和合适的缓冲液(例如Tris、磷酸盐、碳酸盐等)，从而致使试剂盒用户能够鉴定O-GlcNAc修饰。用户随后可以根据需要可检测地标记抗体。可替代地，由本发明提供的试剂盒可以含有在溶液中的抗体，优选在猝灭缓冲液中冷冻的或呈粉末形式(如通过冻干法)的抗体。可以缀合至可检测标记或未缀合的抗体与缓冲液一起包括在试剂盒中，所述缓冲液可以任选还包括稳定剂、杀生物剂、惰性蛋白质例如血清白蛋白等。一般地，这些材料将以基于活性抗体的量的小于5重量%存在，且通常以再次基于抗体浓度的至少约0.001重量%的总量存在。任选地，试剂盒可以包括惰性增量剂或赋形剂，以稀释活性成分，其中赋形剂可以以总组合物的约1重量%-99重量%存在。在优选实施方案中，由试剂盒提供的抗体是可检测标记的，使得结合的抗体是可检测的。可检测标记可以是放射性标记、酶促标记、荧光标记等。任选地，试剂盒可以含有本发明的未缀合的单克隆抗体，和进一步含有能够结合一级抗体的次级抗体。当能够结合一级抗体的次级抗体在测定中采用时，这通常存在于分开的小瓶中。次级抗体通常缀合至可检测标记和以与上文描述的抗体制剂类似的方式配制。试剂盒一般还包括包装和一组使用说明书。
如本文使用的，术语“受试者”包括但不限于人和非人脊椎动物。非人脊椎动物包括家畜动物、伴侣动物和实验室动物。非人受试者还包括非人灵长类动物以及啮齿类动物，例如但不限于大鼠或小鼠。非人受试者还包括但不限于鸡、马、牛、猪、山羊、犬、猫、豚鼠、仓鼠、貂和兔。如本文使用的，术语“受试者”、“个体”、“患者”和“宿主”可互换使用。在优选实施方案中，受试者是哺乳动物，特别是人。
如本文使用的，“在体外”是在细胞培养中，“在体内”是在受试者的体内。
如本文使用的，“处理”或“治疗”包括治疗和预防处理。治疗疾病或病况应意指干预此类疾病或病况，以便预防或减慢疾病或病况的发展、预防或减慢疾病或病况的进展、停止疾病或病况的进展、或消除疾病或病况。
如本文使用的，术语“药学可接受的载体”指一种或多种相容的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质，其适合于施用于人或其他脊椎动物。
如本文使用的，当用于描述化合物时，术语“分离的”应意指从化合物在自然界中出现于其中的天然环境中取出。在一个实施方案中，分离的意指从细胞的非核酸分子中取出。
当提供值的范围时，应当理解除非上下文另有明确说明，在该范围上限和下限之间的每个居中值至下限单位的十分之一，以及在该所述范围中的任何其他所述值或居中值均包含在本发明内。这些更小范围的上限和下限可以独立地包括在更小范围内，并且也包含在本发明内，受所述范围中的任何具体排除的限制管辖。当所述范围包括限制中的一个或两个时，排除那些所包括限制中的任一或两者的范围也包括在本发明中。
在一些实施方案中，“有效量”是导致至少一种病理学参数减少的量。因此，例如，与未接受治疗的个体中的参数的预期减少相比较，有效达到至少约10%、至少约15%、至少约20%或至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%或至少约95%减少的量。
实施例
本发明通过下述实施例举例说明。应当理解具体例子、材料、量和程序应依照如本文阐述的本发明的范围和精神广泛解释。
实施例1
针对基于完全合成的碳水化合物的抗癌疫苗：含有肿瘤相关Tn抗原的脂质化糖肽的合成和免疫学评价
在这个实施例中，通过聚合物支持和溶液相化学的组合制备了完全合成的候选癌症疫苗，其由肿瘤相关Tn抗原、肽T表位和脂肽Pam3Cys组成。糖脂肽掺入脂质体内给出能够在小鼠中引发T细胞依赖性抗体应答的制剂。
致癌转化细胞的共同特征是寡糖例如Globo-H、LewisY和Tn抗原的过表达(Lloyd，Am. J Clin. Pathol. 1987，87，129；Feizi等人，Trends in Biochem. Sci. 1985，10，24-29；Springer，J. Mol. Med. 1997，75，594-602；Hakomori，Acta Anat. 1998，161，79-90)。众多研究已显示这种异常糖基化可以促进转移(Sanders等人，Mol. Pathol. 1999，52，174-178)，因此它的表达与癌症患者的弱存活率强烈关联。
几个一流研究已利用肿瘤相关碳水化合物的差异表达用于开发癌症疫苗(Ragupathi，Cancer Immunol. 1996，43，152-157；Musselli等人，J Cancer Res. Clin.Oncol. 2001，127，R20-R26)。然而，碳水化合物不能激活辅助T淋巴细胞已使其作为疫苗的用途变复杂(Kuberan等人，Current Organic Chemistry 2000，4，653-677)。对于大多数免疫原(包括碳水化合物)，抗体产生依赖于两类淋巴细胞B细胞和辅助T细胞的协同相互作用(Jennings等人，Neoglycoconjugates，preparation and application，Academic，SanDiego，1994)。糖单独不能激活辅助T细胞，因此具有有限的免疫原性。低亲和力IgM抗体的形成和IgG抗体的不存在显现这种有限的免疫原性。
为了克服碳水化合物的T细胞独立性质，过去研究已集中于糖与外源载体蛋白质(例如匙孔血蓝蛋白(KLH)、去毒破伤风类毒素)的缀合。在这种方法中，载体蛋白质增强碳水化合物向免疫系统的呈递，并且提供可以激活T辅助细胞的T表位(12-15个氨基酸的肽片段)。
然而，碳水化合物与载体蛋白质的缀合具有几个问题。一般而言，缀合化学难以控制，导致产生具有可以影响免疫应答的再现性的在组成和结构方面的含糊性的缀合物(Anderson等人，J. Immunol. 1989，142，2464-2468)。此外，外源载体蛋白质可以引发强B细胞应答，其可以导致针对碳水化合物表位的抗体应答的抑制。当采用自身抗原例如肿瘤相关碳水化合物时，后者是更大的问题。此外，用于碳水化合物与蛋白质的缀合的接头可以是免疫原性的，导致表位抑制(Buskas等人，Chem. Eur. J. 2004，10，3517-3523)。并不令人惊讶地，用碳水化合物-蛋白质缀合物癌症疫苗的几个临床试验未能在所有患者中诱导足够强的辅助T细胞应答(Sabbatini等人，Int. J. Cancer 2000，87，79-85)。因此，需要开发可替代策略用于呈递肿瘤相关碳水化合物表位，其将导致更有效的向IgG抗体的类别转换(Keil等人，Angew. Chem. Int. Ed. 2001，40，366-369；Angew. Chem. 2001，113，379-382；Toyokuni等人，Bioorg. & Med. Chem. 1994，2，1119-1132；Lo-Man等人，Cancer Res.2004，64，4987-4994；Kagan等人，Cancer Immunol. Immunother. 2005，54，424-430；Reichel等人，Chem. Commun. 1997，21，2087-2088)。
此处，我们报道了结构上充分确定的完全合成的抗癌疫苗候选物(化合物9)的合成和免疫学评价，所述抗癌疫苗候选物构成集中和有效的T细胞依赖性免疫应答所需的最低限度结构特征。疫苗候选物由肿瘤相关Tn抗原、肽T表位YAFKYARHANVGRNAFELFL(YAF)(SEQ ID NO:2)和脂肽S-［(R)-2,3-二棕榈酰氧基-丙基］-N-棕榈酰-(R)-半胱氨酸(Pam3Cys)组成。充当B表位的Tn抗原在乳腺、结肠和前列腺的人上皮肿瘤细胞的表面上过表达。这种抗原不存在于正常细胞上，并且因此致使其成为用于免疫治疗的极佳靶。为了克服碳水化合物抗原的T细胞独立性质，掺入YAF肽。这个20氨基酸肽序列衍生自脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白质，且已鉴定为用于人T细胞的MHC II类限制位点(Wiertz等人，J. Exp.Med. 1992，176，79-88)。设想这种辅助T细胞表位会诱导T细胞依赖性免疫应答，导致针对Tn抗原的IgG抗体的产生。合并的B细胞和辅助T细胞表位缺乏提供用于树突状细胞(DC)成熟的合适“危险信号”的能力(Medzhitov等人，Science 2002，296，298-300)。因此，掺入衍生自大肠杆菌的主要脂蛋白的免疫活性N末端序列的脂肽Pam3Cys (Braun，Biochim.Biophys. Acta 1975，415，335-377)。这种脂肽已识别为有力的免疫佐剂(Weismuller等人，Physiol. Chem. 1983，364，593)，并且近期研究已显示它通过与Toll样受体-2(TLR-2)的相互作用发挥其活性(Aliprantis等人，Science 1999，285，736-73)。这种相互作用导致促炎细胞因子和趋化因子的产生，其进而刺激抗原呈递细胞(APC)，从而起始辅助T细胞发育和激活(Werling等人，Vet. Immunol. Immunopathol. 2003，91，1-12)。脂肽还促进抗原掺入脂质体内。脂质体作为疫苗设计中的载体已吸引关注(Kersten等人，Biochim.Biophys. Acta 1995，1241，117-138)，这是由于其低的固有免疫原性，从而避免不希望有的载体诱导的免疫应答。
靶化合物9的合成需要采用以下化学操作的高度会聚的合成策略，所述化学操作与碳水化合物、肽和脂质部分的存在相容。设想9可以由含间隔物的Tn抗原7、聚合物结合的肽1和S-［2,3-双(棕榈酰氧基)丙基］-N-Fmoc-Cys (Pam2FmocCys，2,(Metzger等人，Int.J. Peptide Protein Res. 1991，38，545-554))进行制备。使用与作为激活混合物(方案10)的高酸敏感的HMPB-MBHA树脂和2-(1H-苯并三唑-1-基)-氧基-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐/1-羟基苯并三唑(HBTU/HOBt)(Knorr等人，Tetrahedron Lett. 1989，30，1927-1930)组合的Fmoc保护氨基酸，通过自动化固相肽合成装配树脂结合的肽1。选择HMPB-MBHA树脂，因为它允许化合物从树脂中裂解，而无侧链保护基团的伴随去除。这个特征是重要的，因为天冬氨酸、谷氨酸和赖氨酸的侧链官能团否则会干扰Tn抗原衍生物7的掺入。接下来，在DMF和二氯甲烷的混合物中在DIPEA存在下，将Pam2FmocCys衍生物2使用PyBOP(Martinez等人，J. Med. Chem. 1988，28，1874-1879)和HOBt手工偶联至肽1的N末端胺，以给出树脂结合的脂肽3。3的Fmoc基团在标准条件下去除，所得到的化合物4的游离胺在PyBOP和HOBt的存在下与棕榈酸偶联，以给出完全保护和树脂结合的脂肽5。Pam2Cys部分的胺在与1偶联后棕榈酰化，以避免半胱氨酸部分的外消旋化。化合物5从树脂中的裂解用2%TFA的二氯甲烷溶液来达到，随后用5%吡啶的甲醇溶液立即中和。在通过LH-20尺寸排阻层析纯化后，采用DIC/HOAt/DIPEA (Carpino，J. Am. Chem. Soc 1993，115，4397-4398)作为偶联剂，使脂肽6的C末端羧酸与Tn衍生物7的胺偶联，以在通过Sephadex LH-20尺寸排阻层析纯化后，给出以79%得率的完全保护的脂质化糖肽8。通过MALDI-TOF的质谱法分析显示在m/z 5239.6和5263.0处的信号，分别对应于［M+H］+和［M+Na］+。最后，利用1,2-乙二硫醇(EDT)作为清除剂，将8的侧链保护基团通过用95% TFA的水溶液处理去除。发现三异丙基硅烷(TIS)的可替代使用导致未鉴定的副产物的形成。靶化合物9通过尺寸排阻层析以及随后的使用Synchropak C4柱的RP-HPLC纯化。9的MALDI质量分析显示在m/z 3760.3处的信号，对应于［M+Na］+。
方案10. a)PyBOP、HOBt、DIPEA、DMF/DCM (5/1，v/v)；b)哌啶/DMF(1/5，v/v)；c)CH3(CH2)14COOH、PyBOP、HOBt、DMF/DCM (1/5，v/v)；d) 2% TFA的DCM溶液；e) 7、DIC、HOAt、DIPEA、DMF/DCM (2/1，v/v)、79%；f) TFA/H2O/EDT (95/2.5/2.5，v/v/v)、79%。
接下来，将化合物9掺入基于磷脂的脂质体内。因此，在含9、胆固醇、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的脂质薄膜的水合后，通过经由100 nm Nuclepore®聚碳酸酯膜挤出制备小型单层囊泡(SUV)。通过负染色的透射电子显微镜检查(TEM)证实脂质体是有均匀大小的，具有约100 nm的预期直径(参见Buskas等人，Angew. Chem. Int. Ed. 2005，44，5985-5988的图1)。通过用TFA水解随后为高pH阴离子交换层析的定量，就N-乙酰半乳糖胺含量分析脂质体制剂。测定了约30 μg/mL GalNAc的浓度，其对应于约10%的起始化合物9的掺入。
用含有0.6 μg碳水化合物的新鲜制备的脂质体，以每周一次的间隔皮下免疫接种五只雌性BALB/c小鼠的组。为了探究嵌入的脂肽Pam3Cys的佐剂性质，含抗原的脂质体连同或不连同有效的皂苷免疫佐剂QS-21 (Antigenics Inc.，Lexington，MA)一起施用。抗Tn抗体滴度通过用BSA-Tn缀合物包被微量滴定板进行测定，并且用标记有碱性磷酸酶的抗小鼠IgM或IgG抗体完成检测。如表1中可见的，将小鼠用脂质体制剂免疫接种，引发针对Tn抗原的IgM和IgG抗体(表1，条目1和2)。IgG抗体的存在指出9的辅助T表位肽已激活辅助T淋巴细胞。此外，对仅用脂质体免疫接种的小鼠(组1)产生IgG抗体的观察结果指出嵌入的佐剂Pam3Cys已触发用于DC成熟及其对辅助T细胞的后续激活的合适信号。然而，接受与QS-21组合的脂质体的小鼠(组2)引发更高滴度的抗Tn抗体。这种更强的免疫应答可能是由于从混合Th1/Th2到Th1应答的转变(Moore等人，Vaccine 1999，17，2517-2527)。
表1. 在用糖脂肽/脂质体制剂4次免疫接种后的ELISA抗Tn抗体滴度［a］。
［a］ ELISA板用BSA-BrAc-Tn缀合物包被。所有滴度是关于五只小鼠的组的平均值。通过回归分析测定滴度，标绘与吸光度比较的log10稀释度而测定滴度。滴度计算为给出比相对于1:100稀释的生理盐水小鼠血清的吸光度高为0.1或更高的最高稀释度。
本文呈现的结果首次提供了关于使用脂质化糖肽作为最低限度亚单位疫苗的原理证明(proof-of-principle)。预期可以作出几个改善。例如，已发现Tn抗原的聚簇呈递是粘蛋白的更合适模拟物，因此针对这个结构产生的抗体更佳地识别在癌细胞上表达的Tn抗原(Nakada等人，J. Biol. Chem. 1991，266，12402-12405；Nakada等人，Proc. Natl.Acad. Sci. USA 1993，90，2495-2499；Reddish等人，Glycoconj. J. 1997，14，549-560；Reis等人，Glycoconj. J. 1998，15，51-62)。在这个研究中采用的Tn表位已知是用于人的MHC II类限制性表位。因此，当采用鼠Th表位时，可以预期向IgG抗体的更有效的类别转换。另一方面，化合物9是用于在人中使用的更合适的疫苗候选物。近期报道指出Pam2Cys是比Pam3Cys更有效的免疫佐剂(Jackson等人，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 2004，101，15440-15445)。还已提出Pam2Cys佐剂具有改善的可溶性质(Zeng等人，J. Immunol. 2002，169，4905-4912)，其是化合物9的成问题的特征。解决这些问题的研究在进行中。
这个工作在Buskas等人，Angew. Chem. Int. Ed. 2005，44，5985-5988中报道。
支持信息
试剂和一般实验程序。氨基酸和树脂得自Applied Biosystems和NovaBiochem；DMF得自EM science；并且NMP得自Applied Biosystems。磷脂酰乙醇胺(PE)、胆固醇、磷脂酰胆碱(PC；蛋黄)和磷脂酰甘油(PG；蛋黄)购自Sigma-Aldrich和Fluka。所有其他化学制品购自Aldrich、Acros和Fluka，且无需进一步纯化而使用。采用的所有溶剂都具有试剂级别，且通过经过合适的干燥剂回流进行干燥。TLC使用Kieselgel 60 F254 (Merck)板执行，通过UV光(254 nm)和/或通过用8%硫酸的乙醇溶液炭化或通过茚三酮进行检测。柱层析在二氧化硅凝胶(Merck，筛目70-230)上执行。尺寸排阻柱层析在Sephadex LH-20上执行。将提取物在减压下在≤40℃(水浴)浓缩。配备自动采样器、UV检测器和流分收集器和具有1 mL/分钟流速的Synchropak C4柱100x4.6 mm RP的Agilent 1100系列HPLC系统用于分析和纯化。使用HP-MALDI仪器使用龙胆酸作为基质记录阳离子基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱。1H NMR和13C NMR谱在Varian Inova300分光计、Varian Inova500分光计和Varian Inova600分光计上记录，所述分光计都配备Sun工作站。在CDCl3中记录的1H谱参考在7.26 ppm处的残基CHCl3或TMS，并且13C谱参考CDCl3在77.0 ppm处的中心峰。使用标准1D实验以及gCOSY/DQCOSY、gHSQC和TOCSY 2D实验作出分配。
脂肽6。化合物1在HMPB-MBHA树脂(最大负荷，0.1 mmol)上合成。肽1的合成在配备UV检测器的ABI 433A肽合成仪上执，使用Fmoc保护的氨基酸和2-(1H-苯并三唑-1-基)-氧基-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)/1-羟基苯并三唑(HOBt)作为偶联剂进行。单个偶联步骤根据需要用条件性加帽进行。在肽1合成完成后，手工执行剩余步骤。将N-芴甲氧羰基-S-(2,3-双(棕榈酰氧基)-(2R-丙基)-(R)-半胱氨酸2 (120 mg，0.13 mmol)溶解于DMF (5 mL)中，并且加入PyBOP (0.13 mmol)、HOBt (0.13 mmol)和DIPEA (0.27 mmol)。在预混合2分钟后，加入DCM (1 mL)，并且将混合物加入树脂中。将偶联步骤执行两次。在偶联完成(如通过Kaiser测试测定的)后，使用20%哌啶的DMF (5 mL)溶液裂解N-Fmoc基团。使用PyBop (0.3 mmol)、HOBt (0.3 mmol)和DIPEA (0.6 mmol)的DMF溶液，如上所述使棕榈酸(77 mg，0.3 mmol)与游离胺偶联。将树脂用DMF和DCM充分洗涤，且在真空下干燥4小时。通过用2%三氟乙酸的DCM (2.5 mL)溶液处理2分钟，从树脂中释放完全保护的脂肽6。将混合物过滤到5%吡啶的甲醇溶液(5 mL)内。将该程序重复，并且将含有脂肽的流分合并浓缩至干燥。通过尺寸排阻层析(LH-20，DCM/MeOH，1:1)纯化粗产物，以给出作为白色固体的脂肽6(275 mg，0.057 mmol)：Rf = 0.57 (DCM/MeOH 9:1)；所选的NMR数据(CDCl3/CD3OD 1/1 v/v600MHz): 1H, δ 0.48-0.90 (m, 27 H, Pam CH3, Leu CH3, Val CH3), 0.96-1.61 (m,Leu CH2, Leu CH, Lys CH2, tBu CH3, Boc CH3, Ala CH3, Arg CH2), 1.18 (br s, 72H,Pam CH2), 1.95, 1.99 (s, 4x3H, Pbf CH3C), 2.36, 2.41, 2.44 (s, 6x3H, Pbf CH3),2.48 (s, 2x2H, Pbf CH2) 2.65-2.73 (m, 6H, S-CH 2-甘油基, His CH2, Cysβ), 3.47(m, 2H, Glyα), 3.57 (m, 2H, Glyα), 4.06 (m, 1H, S-甘油基-CH 2 bO), 4.32 (m, 1H,S-甘油基-CH 2 aO), 3.65-4.39 (m, 17H, Pheα, Alaα, Hisα, Lysα, Valα, Asnα, Gluα,Tyrα, Argα), 4.45 (m, 1H, Cysα), 5.06 (m, 1H, S-甘油基-CH), 6.72-7.39 (m, 70H,His CH, Tyr芳族的(aromat), Phe芳族的, Trt芳族的), 7.48-8.29 (m, NH)。对于C269H373N33O42S3计算的MALDI-MS ［M+Na］ m/z = 4860.22：实测值4860.31。
受保护的糖脂肽8。将脂肽6 (22 mg，4.6 μmol)、HOAt (6.3 mg，46 μmol)和DIC(7 μL，46 μmol)的DCM/DMF (2/1 v/v，1.5 mL)溶液在氩气氛下在环境温度搅拌15分钟。将化合物7 (8 mg，19 μmol)和DIPEA (14 μL，92 μmol)的DMF(1.5 mL)溶液加入脂肽的搅拌混合物中，并且将反应在室温保持18小时。将混合物用甲苯稀释且在减压下浓缩至干燥。通过尺寸排阻(LH-20，DCM/MeOH 1:1)纯化残余物给出作为白色固体的化合物8 (19 mg，79%)：所选的NMR数据(CDCl3/CD3OD 1/1 v/v 600MHz): 1H,δ 0.60-0.90 (m, 27 H, PamCH3, Leu CH3, Val CH3), 0.96-1.61 (m, Leu CH2, Leu CH, Lys CH2, tBu CH3, BocCH3, Ala CH3, Arg CH2), 1.18 (br s, 72H, Pam CH2), 1.94, 1.98, 1.99, 2.00 (s,6x3H, Pbf CH3C, HNAc CH3), 2.36, 2.41, 2.45 (s, 6x3H, Pbf CH3), 2.48 (s, 2x2H,Pbf CH2), 3.42-4.31 (m, Pheα, Ala, Lys, Val, Asp, Glu, Tyr, Arg, Gly, Leu,His, Asn CH2, Tyr CH2, Phe CH2, Arg CH2), 3.71 (H-3), 3.88 (H-4) 4.06 (S-甘油基-CH 2 βO), 4.20 (t, 1H, H-2), 4.32 (m, 1H, S-甘油基-CH 2 αO), 4.42 (m, 1H, Cysα),4.82 (d, 1H, H-1, J=3.68Hz), 5.06 (m, 1H, S-甘油基-CH), 6.72-7.39 (m, 70H,His CH, Tyr芳族的, Phe芳族的, Trt芳族的), 7.48-8.29 (m, NH)。对于C286H403N37O49S3计算的MALDI-MS ［M+Na］ m/z = 5262.67：实测值5262.99。
糖脂肽9。将在TFA/H2O/乙烷-1,2-二硫醇(95:2.5:2.5，3 mL)的脱保护混合物中的化合物8 (12 mg，2.3 μmol)在室温搅拌1小时。在减压下去除溶剂，然后首先通过短的尺寸排阻LH-20柱(DCM/MeOH 1:1)纯化粗制化合物，随后通过使用0-100%乙腈的水溶液(0.1%TFA)梯度的HPLC来纯化粗制化合物，以在冻干后给出作为白色固体的化合物9 (6.8 mg，79%)：所选NMR数据(CDCl3/CD3OD 600MHz): 1H, δ 0.74-0.96 (m, 27H, Pam CH3, LeuCH3, Val CH3), 1.11-2.35 (Leu CH2, Leu CH, sp CH2, Lys CH2, Glu CH2, Ala CH3,Val CH, Asp CH2), 1.29 (br S, 72H, Pam CH2), 2.43-3.87 (Alaα, Glyα, S-甘油基-OCH2, Cysβ, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6), 4.05-4.73 (m, Cysα, Pheα, Tyrα, Hisα, Leuα, Lysα, Aspα, Valα, Argα, Gluα, H-1), 5.12 (m, 1H, S-甘油基-CH), 6.64-6.71 (dd+dd, 2H, His CH, NH), 6.86-7.12 (dd+dd 2H, His CH, NH) 7.16-8.23 (m, Tyr芳族的, Phe芳族的, NH)。对于C186H297N37O41S计算的HR-MALDI-MS ［M+Na］ m/z = 3760.1911：实测值3760.3384。
Tn衍生物11。将化合物10溶解于DMF (10 mL)，并且加入二异丙基碳化二亚胺(DIC)(82 μL，0.53 mmol)和HOAt (216 mg，1.58 mmol)。在搅拌15分钟后，加入3-(N-(叔丁氧基羰基)-氨基)丙醇(111 mg，0.63 mmol)，并且将反应维持在环境温度15小时。将混合物在减压下浓缩至干燥，并且通过硅胶柱层析(0-5%MeOH的DCM溶液)和LH-20尺寸排阻层析(DCM/MeOH 1:1)纯化残余物，以给出化合物11 (363 mg，83%)。Rf = 0.63 (DCM/MeOH 9:1)； [α]D +4.4 (c 1.0 mg/mL，CH2Cl2)；NMR数据(CDCl3, 500MHz): 1H, δ 1.27 (d, 3H,CH3 Thr), 1.43 (s, 9H, tBu CH3), 1.46-1.61 (m, 2H, CH2), 1.99 (s, 3H, CH3 Ac),2.05 (s, 6H, CH3 Ac), 2.06 (s, 3H, CH3 Ac), 2.17 (s, 3H, CH3 Ac), 3.17-3.27(m, 3H, CH2, CH2a), 3.48-3.50 (m, 1H, CH2b), 4.07-4.28 (m, 6H, H-6, H-5, Thrα,Thrβ, CH Fmoc), 4.43-4.51 (m, 2H, CH2 Fmoc), 4.62 (dd, 1H, H-2), 4.89 (br t,1H, NH), 5.04-5.11 (m, 2H, H-1, H-3), 5.41 (d, 1H, H-4), 5.75 (br d, 1H, NHT), 6.81 (br d, 1H, NH GalNAc), 7.17-7.79 (m, 8H, 芳族的H); 13C (CDCl3,75MHz)δ17.19, 20.92, 20.99, 21.09, 23.30, 28.55, 30.69, 35.87, 36.92, 47.43, 47.77,58.57, 62.36, 67.47, 68.68, 77.46, 80.08, 99.88, 120.25, 125.34, 127.35,128.00, 128.76, 129.13, 141.55, 143.94, 144.01, 156.51, 157.52, 169.68,170.66, 170.94, 170.99。
对于C41H54N4O14计算的HR-MALDI-MS ［M+Na］ m/z = 849.3535：实测值849.3391。
Tn衍生物7。将化合物11 (194 mg，0.24 mmol)在含20%哌啶的DMF (5 mL)中的溶液在环境温度搅拌1小时。将混合物浓缩至干燥，并将残余物用吡啶/乙酸酐(3:1，5 mL)处理2小时。将反应混合物用甲苯稀释且浓缩至干燥。将残余物溶解于二氯甲烷中，并用1MHCl和饱和NaHCO3水溶液洗涤，用MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过尺寸排阻层析(LH-20，DCM/MeOH 1:1)纯化残余物提供化合物12 (167 mg，91%)：NMR数据(CDCl3, 300MHz): 1H, δ1.24 (d, 1H, Thr CH3), 1.42 (s, 9H, tBu CH3), 1.55-1.59 (m, 2H, NHCH2CH 2CH2NH),1.95, 2.02, 2.03, 2.12, 2.14 (s, 15H, CH3 Ac), 3.13-3.23 (m, 3H, CH2 + CH2a),3.36-3.41 (m, 1H, CH2b), 4.03-4.12 (m, 2H), 4.19-4.23 (m, 2H, Thrβ), 4.54-4.61(m, H-2, Thrα), 4.88 (m, 1H, NH), 4.96 (s, 1H, J=3.57 Hz, H-1), 5.07 (dd, 1H,H-3), 5.35 (d, 1H, H-4), 6.43 (br S, 1H, NH), 6.72 (br S, 1H, NH)。对C28H46N4O13计算的MALDI-MS ［M+Na］ m/z = 669.296：实测值669.323。通过与5%水合肼的甲醇(5 mL)溶液一起在室温搅拌35分钟，使化合物12脱保护。将反应混合物用甲苯稀释并浓缩。将残余物与甲苯一起共蒸发两次。通过硅胶柱层析(DCM/MeOH 5:1)的纯化获得13 (119 mg，89%)：NMR数据(CD3OD, 300MHz): 1H, δ 1.26 (d, 3H, Thr CH3), 1.43 (s, 9H, tBu CH3),1.57-1.63 (m, 2H, NHCH2CH 2CH2NH), 2.06, 2.10 (s, 2x3H NHAc), 2.12-3.09 (m, 2H,CH2), 3.15 (m, 2H, CH2), 3.31 (br s, 2H, H-6), 3.68-3.76 (m, 2H, H-3, H-5),3.88 (d, 1H, H-4), 4.22-4.26 (m, 2H, H-2, Thrβ), 4.46 (m, 1H, Thrα), 4.84 (d,1H, H-1), 6.60 (br m, 1H, NH), 7.50 (br d, 1H, NH)。对于C22H40N4O10计算的MALDI-MS ［M+Na］ m/z = 543.264：实测值543.301。将13的三氟乙酸(4 mL)溶液在氩气氛下在环境温度搅拌45分钟。随后将反应混合物用DCM稀释且浓缩至干燥。通过柱层析(Iatro珠，EtOAc/MeOH/H2O 2:2:1 → MeOH/H2O 1:1)纯化粗产物。在合并的流分浓缩后，将固体自H2O冻干，以给出化合物作为白色粉末的化合物7 (91 mg，0.21 mmol，95%)。Rf = 0.17(EtOAc/MeOH/H2O 6:3:1)； [α]D -37(c 1.0 mg/mL，H2O)；NMR数据(D2O, 300MHz): 1H, δ 1.15 (d,3H, J = 6.3 Hz, Thr CH3), 1.73-1.77 (m, 2H, CH2), 1.95 (s, 3H, NHAc), 2.04 (s,3H, NHAc), 2.82-2.87 (m, 2H, CH2), 3.11-3.15 (m, 1H, CH2a), 3.22-3.26 (m, 1H,CH2b), 3.65 (m, 2H, H-6), 3.76 (dd, 1H, J = 2.9, 11.2 Hz, H-3), 3.87 (d, 1H, J= 2.9 Hz, H-4), 3.92 (t, 1H, H-5), 3.99 (dd, 1H, J = 3.41, 11.2 Hz, H-2),4.28-4.30 (m, 1H, Thrβ), 4.32 (d, 1H, J = 2.4 Hz, Thrα) 4.78 (d, 1H, J = 3.56Hz, J = 3.9 Hz, H-1), 7.97 (br d, 1H, NH), 8.17 (br t, 1H, NH), 8.27 (br d,1H, NH); 13C (D2O, 75MHz), δ 18.17 Thr CH3), 21.93, 22.33 (2xNAc) 26.98 (CH2),36.55 (CH2), 37.22 (CH2), 49.98 (C-6), 58.30 (C-3), 61.46 (C-4), 67.76 (C-5),68.65 (C-2), 71.54 (C-Thrβ), 74.60 (C-Thrα), 98.60 (C-1), 172.09, 174.37,175.18 (3x C=O, NHAc)。对于C17H32N4O8计算的HR-MALDI-MS ［M+Na］ m/z = 443.2118：实测值443.2489。
脂质体制备。脂质体由PC、PG、胆固醇和糖脂肽9 (15 μmol，摩尔比65:25:50:10)制备。将脂质在氩气氛下溶解于DCM/MeOH (3/1，v/v)中。随后通过使干氮气流经过和随后的在高真空下进一步干燥一小时来去除溶剂。将所得到的脂质薄膜悬浮于含有145 mMNaCl的1 mL 10 mM Hepes缓冲液，pH 6.5中。将溶液在振荡器(250 rpm)上在Ar气氛下在41℃涡旋3小时。将脂质体悬液在50℃通过0.6 μm、0.2 μm和0.1 μm 聚碳酸酯膜(Whatman，Nuclepore®，Track-Etch Membrane)挤出十次，以获得SUV。
免疫接种。在第0、7、14和21天时用0.6 μg的含有碳水化合物的脂质体和在每个加强中的10 μg佐剂QS-21皮下免疫接种五只小鼠(雌性BALB/c，6周)的组。在第28天时使小鼠放血(腿静脉)，并且就抗体的存在情况测试血清。
ELISA。将96孔板用溶于含有75 mM氯化钠的0.2 M硼酸盐缓冲液(pH 8.5)中的Tn–BSA (2.5 μg mL-1)在4℃包被过夜(100 μL/孔)。将板用含有0.5% Tween 20%和0.02%叠氮化钠的0.01 M Tris缓冲液洗涤三次。通过使板与溶于含有0.14 M氯化钠的0.01 M磷酸盐缓冲液中的1% BSA一起在室温温育1小时达到封闭。接下来，将板洗涤，随后在室温与在磷酸缓冲盐水中的血清稀释物一起温育2小时。去除过量抗体，并且将板洗涤三次。将板与兔抗小鼠IgM和IgG Fcγ片段特异性碱性磷酸酶缀合的抗体(Jackson ImmunoResearchLaboratories Inc.，West Grove，PA)一起在室温温育2小时。随后，在将板洗涤后，加入酶底物(对硝基苯基磷酸酯)，并允许反应30分钟，然后通过加入3 M含水氢氧化钠猝灭酶促反应，然后在405和490 nm的双重波长读取吸光度。通过回归分析测定抗体滴度，其中针对吸光度标绘log10稀释度。滴度计算为给出1:120稀释的正常小鼠血清吸光度的两倍的最高稀释度。
实施例2
非共价连接的二表位脂质体制剂
在第一组实验中，将肿瘤相关碳水化合物B表位和通用T表位肽分开掺入预制成的脂质体内，以形成二表位构建体。另外，将脂肽Pam3Cys掺入脂质体内，预期它将充当嵌入佐剂，从而避免使用另外的外部佐剂例如QS-21的必要性。
自在其表面上携带两种不同硫醇反应官能团(functionality)马来酰亚胺和溴乙酰的脂质锚制备脂质体。还将Pam3Cys佐剂掺入预制成的脂质体内，并且包括马来酰亚胺官能团。方便地，马来酰亚胺和溴乙酰基团在其对硫氢基的反应性方面显示显著差异。马来酰亚胺在pH 6.5与硫氢基化合物快速反应，而溴乙酰需要略微更高的pH 8-9，以与硫醇化合物有效反应。
通过利用在反应性方面的这种差异，制备了携带癌症相关Ley四糖和通用T辅助肽QYIKANSKFIGITEL(QYI)(SEQ ID NO:1)的二表位脂质体构建体(方案11)。对于与硫醇反应性锚的缀合，寡糖和肽都用含硫醇接头官能化。与预制成的脂质体的两步连续缀合具有极大优点：它是使得容易制备携带多种不同碳水化合物B表位的脂质体的非常灵活的方法。如基于对共价偶联至囊泡的碳水化合物和肽的定量，缀合得率很高，对于寡糖为70-80%和对于肽为65-70%，并且结果是可高度再现的。
重要的是要注意到在这些第一种二表位脂质体构建体中，碳水化合物B表位和肽T表位自身不通过共价键连接在一起，而是通过它们与之缀合的其各自的脂质锚和通过疏水相互作用保持接近。在关于具有病原体相关肽B表位的疫苗候选物的文献中的几个报道已显示这种方法是成功的，导致IgM和特异性IgG抗体的良好滴度。这些研究也指出嵌入佐剂Pam3Cys足以诱导合适的免疫应答。
然而，在我们用肿瘤相关碳水化合物B表位Ley的研究中，在这个实施例中描述的使用非共价连接的二表位脂质体制剂对小鼠的免疫接种，仅导致极低滴度的IgM抗体。未检测到IgG抗Ley抗体。甚至更令人惊讶地，共施用脂质体疫苗候选物与有力的外部佐剂QS-21也不改善结果。另外，发现已用未包被的脂质体对照(即在表面上只携带马来酰亚胺和溴乙酰官能团的脂质体)免疫接种的小鼠，引发如通过ELISA检测到的高滴度IgG抗体。使用多种蛋白质缀合物的来自这组小鼠的抗血清的更详细ELISA研究揭示小鼠已响应于马来酰亚胺接头并引发针对马来酰亚胺接头的抗体。此外，针对抗接头抗体筛选来自用包被有Ley抗原和QYI肽的脂质体免疫接种的小鼠的抗血清，发现这些小鼠也已引发针对马来酰亚胺接头的IgG抗体。
方案11
由于其在接近中性pH的高反应性，马来酰亚胺接头在缀合化学中广泛用于达到在免疫接种研究中进一步使用的糖-和肽-蛋白质缀合物。存在商购可得的蛋白质缀合试剂盒(Pierce Endogen Inc.)，其利用马来酰亚胺接头用于抗原缀合物和检测缀合物两者。我们的数据显示使用这些试剂盒可以导致假阳性结果，尤其当与低免疫原性的抗原一起工作时(参见T. Buskas，Y. Li和G-J. Boons，Chem. Eur. J.,10:3517-3523，2004)。
为了测试高度免疫原性的马来酰亚胺接头是否抑制针对Ley四糖的免疫应答，我们仅使用溴乙酰接头制备非共价二表位脂质体。在这个实验中，含硫醇的Ley四糖和通用的T辅助细胞肽在分开反应中缀合至含有溴乙酰接头的脂质。缀合的脂质随后混合在一起，以形成脂质囊泡。将这种新脂质体制剂连同或不连同外部佐剂QS-21一起施用于小鼠，仅产生低滴度的抗Ley抗体。因此，针对Ley四糖的有效免疫应答的缺乏不仅仅是由于免疫原性的马来酰亚胺接头。
因为已知肿瘤相关Ley四糖仅是弱免疫原性的，所以我们制备了另一种二表位脂质体构建体，其中更多免疫原性的Tn(簇)抗原用作靶B表位。然而，用这种抗原同样获得阴性结果。再次，小鼠的免疫接种仅导致极低滴度的抗Tn(c) IgM抗体。与作为外部佐剂的QS-21一起共施用完全没有增强免疫应答。
根据这些结果，我们得出结论：当具有低免疫原性的肿瘤相关碳水化合物抗原用作B表位时，已对一系列肽抗原证明成功的非共价连接的二表位脂质体方法失败了。因此，我们推论肿瘤相关碳水化合物B表位和辅助T表位需要差异呈递给免疫系统，以诱发T细胞依赖性免疫应答。
实施例3
共价连接的二表位脂质体制剂
我们推测为了达到碳水化合物B表位和肽T表位的更佳呈递，可能它们需要共价连接在一起。为了测试这个想法，我们合成了构建体1 (方案12)，其是含有集中和有效的T细胞依赖性免疫应答所需的结构特征的结构上充分确定的抗癌疫苗候选物。该疫苗候选物由肿瘤相关Tn抗原、肽T表位YAFKYARHANVGRNAFELFL(YAF)(SEQ ID NO:2)(脑膜炎奈瑟氏球菌)和脂肽Pam3Cys组成。由于在合成中使用原始辅助T表位肽QYI的困难，在这个研究中使用展示更佳可溶性质的不同通用T表位(YAF)。
通过固相和溶液相合成的组合以高度会聚方式合成化合物1。
方案12
随后将构建体掺入基于磷脂的脂质体内。化合物1具有在一系列溶剂中的低溶解度的缺点，其可能是在脂质体内的掺入仅是10%的主要原因。
用该构建体以每周一次间隔免疫接种小鼠。为了探究嵌入的脂肽Pam3Cys的佐剂性质，将含抗原脂质体连同(组2)或不连同(组1)佐剂QS-21一起施用。
如表1 (实施例1)中可见的，将小鼠用脂质体制剂免疫接种，引发针对Tn抗原的IgM和IgG抗体(表1，条目1和2)。IgG抗体的存在指出1的辅助T表位肽已激活辅助T淋巴细胞。此外，对在不存在外部佐剂QS-21的情况下用脂质体免疫接种的小鼠(组1)产生IgG抗体的观察结果指出嵌入的佐剂Pam3Cys已触发用于DC成熟及其对辅助T细胞的后续激活的合适信号。然而，接受与QS-21组合的脂质体的小鼠(组2)引发更高滴度的抗Tn抗体。这种更强的免疫应答可能是由于从混合Th1/Th2到Th1倾斜应答的转变。
该结果首次提供了关于使用脂质化糖肽作为最低限度的自足亚单位疫苗的原理证明，所述脂质化糖肽含有碳水化合物B表位、辅助T细胞表位和脂肽佐剂。还得出结论：为了诱发针对肿瘤相关碳水化合物抗原的T细胞依赖性免疫应答，碳水化合物B表位和肽T表位以非共价方式在含佐剂脂质体的表面上一起呈递是不够的；相反，实体优选共价连接在一起。最后，观察到当三种组分(碳水化合物B表位、辅助T细胞表位和脂肽)共价连接以形成脂质化糖肽时，不需要外部佐剂(QS-21)。
可替代的糖脂肽组分
可以对化合物1作出几个改进。例如，已发现针对Tn抗原引发的抗体弱识别癌细胞。然而，聚簇(Nakada等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993，90，2495-2499；Reddish等人，1997，14，549-560；Zhang等人，Cancer Res. 1995，55，3364-3368；Adluri等人，CancerImmunol. Immunother 1995，41，185-192)或将Tn抗原作为MUC-1糖肽的部分呈递引发具有改善的结合特征的抗体(Snijdewint等人，Int. J. Cancer 2001，93，97-106)。在化合物1中采用的T表位是用于人的MHC II类限制性表位。因此，当采用鼠T表位时，可以预期向IgG抗体的更有效的类别转换。此外，已发现脂肽Pam2Cys或Pam3CysSK4是比Pam3Cys更有效的免疫佐剂(Spohn等人，Vaccine 2004，22，2494-2499)。然而，未知Pam2Cys或Pam3CysSK4连接至T和B表位是否会影响其功效和效力。因此，基于这些考虑，设计了化合物2和3 (方案12)，其含有MUC-1糖肽作为B表位，含有衍生自脊髓灰质炎病毒的充分证明的鼠辅助T细胞表位KLFAVWKITYKDT(KLF)(SEQ ID NO:3)(Leclerc等人，J. Virol. 1991，65，711-718)作为T表位以及分别含有脂肽Pam2Cys或Pam3CysSK4。
如对化合物1所述，将糖脂肽2和3掺入基于磷脂的脂质体内。令人惊讶地，困扰化合物1的溶解度问题对于化合物2和3不是问题。将雌性BALB/c小鼠用脂质体制剂连同或不连同外部佐剂QS-21一起以每周一次间隔免疫接种四次(Kensil等人，J. Immunol. 1991，146，431-437)。通过用缀合至BSA的CTSAPDT(αGalNAc)RPAP包被微量滴定板测定抗Muc1抗体滴度，并且用由碱性磷酸酶标记的抗小鼠IgG抗体完成检测。结果概括于表2和3中。
表2. 在用糖脂肽/脂质体制剂4次免疫接种后的ELISA抗MUC-1抗体滴度*。
* ELISA板用BSA-BrAc-MUC-1缀合物包被。抗MUC1抗体滴度作为五只小鼠的组的平均值呈现。滴度定义为获得相对于空白小鼠血清的本底而言光密度为0.1或更大的最高稀释度。
表3. 在用糖脂肽/脂质体制剂4次免疫接种后的ELISA抗MUC-1抗体滴度*。
* ELISA板用BSA-BrAc-MUC-1缀合物包被。抗MUC1抗体滴度作为五只小鼠的组的平均值呈现。滴度定义为获得相对于空白小鼠血清的本底而言光密度为0.1或更大的最高稀释度。
如表2中可见，用化合物2和3的脂质体制剂免疫接种的小鼠引发高滴度的抗MUC-1IgG抗体。令人惊讶地，用基于Pam3CysSK4的疫苗免疫接种的小鼠引发比用Pam2Cys衍生物免疫接种的小鼠更高滴度的抗体。这些结果与已比较Pam2Cys和Pam3CysSK4的佐剂性(adjuvancy)的报道相矛盾。IgG抗体的亚分型(IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3)指出朝向Th2免疫应答的偏向(条目1和3，表3)。佐剂QS-21的共施用不导致IgG抗体的显著增加，然而，在这些情况下，观察到混合Th1/Th2应答(条目2和4，表3)。
为了确保小鼠血清能够识别在癌细胞上存在的天然MUC-1糖肽，检查血清与表达MUC-1的MCF-7人乳腺癌细胞系的结合。因此，将细胞用1:50稀释的血清处理30分钟，这之后加入由FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体。通过流式细胞术分析测定阳性细胞百分比和平均荧光。如(图2)中可见的，抗血清与MUC-1阳性肿瘤细胞强烈反应，而对于得自首次用于实验的小鼠的血清未观察到结合。此外，当采用不表达MUC-1糖肽的SK-MEL 28细胞时，未观察到结合。这些结果证实由3诱导的抗MUC-1抗体识别在人癌细胞上的天然抗原。进一步的ELISA研究显示针对T表位的滴度极低，显示未出现显著的表位抑制。
三组分疫苗的脂肽部分是起始产生必需的细胞因子和趋化因子(危险信号)所必需的(Bevan，Nat. Rev. Immunol. 2004，4，595-602；Eisen等人，Curr. Drug Targets2004，5，89-105；Akira等人，Nat. Immunol. 2001，2，675-680；Pasare等人，Immunity2004，21，733-741；Dabbagh等人，Curr. Opin. Infect. Dis. 2003，16，199-204；Beutler，Mol. Immunol. 2004，40，845-859)。近期研究的结果指出脂肽通过与单核吞噬细胞表面上的Toll样受体2相互作用而起始先天性免疫应答。在激活后，TLR-2的细胞内结构域募集衔接蛋白质MyD88，导致激酶级联的激活，导致许多细胞因子和趋化因子的产生。另一方面，脂多糖通过与Toll样受体4 (TLR4)/MD2相互作用而诱导细胞应答，这导致衔接蛋白质MyD88和TRIF的募集，导致产生更复杂模式的细胞因子。TNF-α分泌是MyD88依赖性途径激活的原型量度，而IFN-β的分泌通常用作TRIF依赖性细胞激活的指示物(Akira等人，Nat.Immunol. 2001，2，675-680；Beutler，Mol. Immunol. 2004，40，845-859)。
为了检查含有T表位和B表位的糖肽与TLR配体的连接是否影响细胞因子产生，测定了通过化合物1、2和3诱导的TNF-α和IFN-β分泌的功效(EC50)和效力(最大应答性)，将结果与Pam2CysSK4、Pam3CysSK4和LPS的那些相比较。因此，使RAW NO-小鼠巨噬细胞暴露于广泛范围浓度的化合物1、2和3、Pam2CysSK4、Pam3CysSK4和大肠杆菌055:B5 LPS。在5小时后，收获上清液，使用商业或内部开发的捕获ELISA测定分别针对小鼠TNF-α和IFN-β检查该上清液。
表4. 大肠杆菌LPS和合成化合物对于通过小鼠巨噬细胞(RAW γNO(-)细胞)的TNF-α产生的浓度-应答曲线的EC50和Emax值。
* EC50和Emax的值报道为根据Prism(GraphPad Software，Inc)的最佳拟合值。使用Prism中的非线性最小二乘法曲线拟合分析浓度-应答数据。
如图3和表4中可见，糖脂肽3和Pam3CysSK4以相似功效和效力诱导TNF-α的分泌，表明B表位和T表位的连接对细胞因子和趋化因子应答没有作用。令人惊讶地，B表位和T表位与Pam2CysSK4的连接导致效力的显著减少，因此在这种情况下B表位和T表位的连接导致活性的减少。含有Pam3Cys部分的化合物1比化合物2和3显著活性更低，这可能解释了化合物1的弱抗原性。化合物1、2和3不诱导IFN-β的产生。令人惊讶地，与化合物1、2、3和Pam3CysSK4相比较，大肠杆菌055:B5展示对于TNF-α诱导大得多的效力和功效。此外，它能够刺激细胞产生IFN-β。大肠杆菌LPS太活跃，导致先天性免疫系统的过度激活，导致脓毒性休克的症状。
推测除了起始细胞因子和趋化因子的产生外，脂肽还可以以TLR2依赖性方式促进通过抗原呈递细胞的选择性靶向和摄取。为了测试这个假设，将含有荧光标记的化合物4施用于RAW NO-小鼠巨噬细胞，并且在30分钟后收获细胞，裂解并测量荧光。为了考虑到可能的细胞表面结合而无内在化，细胞也在裂解前受胰蛋白酶作用，随后检查荧光。如图4中可见，显著数量的4是内在化的，而少量附着至细胞表面。为了测定摄取是否由TLR2介导，使用天然HEK297细胞和用TLR2或TLR4/MD2转染的HEK297细胞重复摄取研究。重要的是，仅当细胞用TLR2转染时，观察到显著摄取，表明摄取由这种受体介导。这些研究显示TLR2促进抗原的摄取，这是抗原加工和免疫应答中的重要步骤。
实施例4
脂质组分的共价连接
为了确定TLR配体与疫苗候选物的共价连接的重要性，设计并合成了仅含有B表位和T表位的化合物5 (方案13)。在PAM3CysSK4的存在下，将小鼠用这种化合物以每周一次间隔免疫接种四次。有趣的是，糖肽5和佐剂Pam3CysSK4的混合物未引发IgG抗体或引发极低滴度的IgG抗体，证实Pam3CysSK4与B表位和T表位的共价连接对于强免疫应答是关键的。
方案13
实施例5
脂质组分
为了测定用Toll样受体的配体脂质化的重要性，设计并合成了化合物6 (方案14)。这种化合物由连接至非免疫原性脂质化氨基酸的B表位和T表位组成。将小鼠用化合物6的脂质体制剂免疫接种，这类似于对于化合物1和2采用的程序。含有化合物6的脂质体诱导显著低于由化合物3引发的那些的滴度，证实三组分疫苗的TLR配体对于最佳免疫应答是重要的。
方案14
结论
三组分的基于碳水化合物的疫苗具有相对于传统缀合物疫苗的许多独特优点。例如，最低限度亚单位疫苗不具有碳水化合物-蛋白质缀合物特有的表位抑制的缺点。除了提供危险信号外，脂肽Pam3CysSK4还促进抗原掺入脂质体内。脂质体制剂是有吸引力的，因为它将抗原有效呈递给免疫系统。疫苗的独特特征是Pam3CysSK4促进通过抗原呈递细胞、T辅助细胞和B淋巴细胞的选择性靶向和摄取，所述细胞表达Toll loll样受体(实施例3)。最后，完全合成的化合物具有以下优点：它可以得到完全表征，这促进其以可再现方式产生。
实施例6
通过靶向Toll样受体增加合成肿瘤相关碳水化合物抗原的抗原性
在这个实施例中，已设计、化学合成和免疫学评价许多完全合成的疫苗候选物，以建立克服肿瘤相关碳水化合物和糖肽的弱免疫原性的策略和详细研究TLR参与对于抗原应答的重要性。TLR2激动剂、非种系选择性肽T辅助细胞表位和肿瘤相关糖肽的共价连接给出在小鼠中引发特别高滴度的IgG抗体的化合物，所述IgG抗体识别表达肿瘤相关碳水化合物的癌细胞。
寡糖例如Globo-H、LewisY和Tn抗原的过表达是致癌转化细胞的共同特征(Springer，Mol. Med. 1997，75，594-602；Hakomori，Acta Anat. 1998，161，79-90；Dube，Nat. Rev. Drug Discov. 2005，4，477-488)。众多研究已显示这种异常糖基化可以促进转移(Sanders，J. Clin. Pathol. Mol. Pathol. 1999，52，174-178)，因此这些化合物的表达与癌症患者的弱存活率强烈关联。广泛和扩大量的临床前和临床研究证实针对碳水化合物相关肿瘤抗原的天然获得抗体、被动给予抗体或主动诱导的抗体能够消除癌症患者中的循环肿瘤细胞和微小转移(Livingston，Cancer Immunol. 1997，45，10-19；Ragupathi，Cancer Immunol. 1996，43，152-157；von Mensdorff-Pouilly，Int. J. Cancer 2000，86，702-712；Finn，Nat. Rev. Immunol. 2003，3，630-641)。由缀合至外源载体蛋白质(例如KLH和BSA)的肿瘤相关碳水化合物(Globo-H、LewisY和Tn)组成的传统癌症疫苗候选物未能在大多数患者中引发足够高滴度的IgG抗体。看起来针对肿瘤相关碳水化合物的IgG抗体的诱导比引发针对病毒和细菌碳水化合物的相似抗体困难得多。这个观察结果并不令人惊讶，因为肿瘤相关糖是自身抗原，因而被免疫系统耐受。生长中的肿瘤的抗原脱落(shedding)加固这种耐受性。此外，外源载体蛋白质例如KLH可以引发强B细胞应答，这可以导致针对碳水化合物表位的抗体应答的抑制。当采用自身抗原例如肿瘤相关碳水化合物时，后者是更大的问题。此外，用于碳水化合物与蛋白质的缀合的接头可以是免疫原性的，导致表位抑制(Buskas，Chem. Eur. J. 2004，10，3517-3524；Ni，Bioconjug. Chem. 2006，17，493-500)。明确的是，基于碳水化合物的癌症疫苗的成功开发需要用于向免疫系统更有效呈递肿瘤相关碳水化合物表位，导致向IgG抗体的更有效类别转换的新策略(Reichel，J.Chem. Commun. 1997，21，2087-2088；Alexander，J. Immunol. 2000，164，1625-1633；Kudryashov，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2001，98，3264-3269；Lo-Man，J. Immunol.2001，166，2849-2854；Jiang，Curr. Med. Chem. 2003，10，1423-1439；Jackson，Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004，101，15440-5；Lo-Man，Cancer Res. 2004，64，4987-4994；Buskas，Angew. Chem. Int. Ed. 2005，44，5985-5988(实施例1)；Dziadek，Angew.Chem. Int. Ed. 2005，44，7630-7635；Krikorian，Bioconjug. Chem. 2005，16，812-819；Pan，J. Med. Chem. 2005，48，875-883)。
在先天性和适应性免疫应答的合作的知识中的进展(Pasare，Semin. Immunol.2004，16，23-26；Pashine，Nat. Med. 2005，11，S63-S68；Akira，Nat. Rev. Immunol.2004，4，499-511；O'Neill，Curr Opin Immunol 2006，18，3-9；Lee，Semin Immunol 2007，19，48-55；Ghiringhelli，Curr Opin Immunol 2007，19，224-31)提供用于疾病例如癌症的疫苗设计的新途径，对于所述疾病，传统疫苗方法已失败。先天性免疫系统快速响应高度保守化合物的家族，该高度保守化合物是病原体的主要部分并被宿主察觉为危险信号。这些分子模式的识别由高度保守的受体例如Toll样受体(TLR)的套组介导，该受体的激活导致急性炎症应答，例如针对侵入病原体的直接局部攻击和不同组细胞因子的产生。除了抗微生物性质外，细胞因子和趋化因子也激活并调节免疫系统的适应性组分(Lin，J ClinInvest 2007，117，1175-83)。在这方面，细胞因子刺激许多共刺激蛋白质的表达，用于在T辅助细胞与B细胞和抗原呈递细胞(APC)之间的最佳相互作用。此外，一些细胞因子和趋化因子负责克服由调节性T细胞介导的抑制。其他细胞因子对于将效应T细胞应答导向T辅助细胞-1 (Th-1)或T辅助细胞-2 (Th-2)表型是重要的(Dabbagh，Curr. Opin. Infect.Dis. 2003，16，199-204)。
近来，我们描述了由肿瘤相关MUC-1糖肽B表位、非种系选择性辅助T细胞表位和TLR2配体组成的完全合成的三组分疫苗候选物(化合物21，图5)(Buskas，Angew. Chem.Int. Ed. 2005，44，5985-5988(实施例1)；Ingale，Nat. Chem. Biol. 2007，3，663-667；Ingale，J. Org. Lett. 2006，8，5785-5788；Bundle，Nat. Chem. Biol. 2007，3，604-606)。三组分疫苗的优越抗原性质归因于作为抗原性且可能诱导免疫抑制的任何不必要特征的不存在。然而，它含有用于引发有关IgG免疫应答所需的所有介质。此外，TLR2激动剂Pam3CysSK4与B表位和T表位的连接确保细胞因子在其中疫苗与免疫细胞相互作用的位点产生。这导致高局部浓度的细胞因子，促进有关免疫细胞的成熟。除了提供危险信号外，脂肽Pam3CysSK4还促进抗原掺入脂质体内，促进通过抗原呈递细胞和B淋巴细胞的选择性靶向和摄取。
为了建立完全合成的三组分癌症疫苗的最佳体系结构和详细研究TLR参与对于抗原应答的重要性，我们已化学合成并免疫学评价了许多完全合成的疫苗候选物。已发现由免疫沉默脂肽、非种系选择性肽T辅助细胞表位和MUC-1糖肽组成的化合物22的脂质体制剂比由TLR2配体(Pam3CysSK4)修饰的化合物21显著抗原性更低。然而，具有分别为TLR2和TLR4激动剂的Pam3CysSK4 (23)或单磷酰脂质A (24)的化合物22的脂质体制剂引发可与化合物21相比的滴度。然而，由22和23或24的混合物引发的抗血清具有受损的识别癌细胞的能力。令人惊讶地，由连接至脂质化氨基酸的MUC-1糖肽B表位和连接至Pam3CysSK4的辅助T表位组成的化合物25和26的混合物不产生针对MUC-1糖肽的抗体。总之，该结果证实TLR参与不是必需的，但极大增强针对肿瘤相关糖肽MUC-1的抗原应答。TLR激动剂与B表位和辅助T表位的共价连接对于用于改善的癌细胞识别的抗体成熟是重要的。
结果和讨论。
化学合成。
含有衍生自MUC-1的肿瘤相关糖肽(Berzofsky，Nat. Rev. Immunol. 2001，1，209-219；Baldus，Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 2004，41，189-231；Apostolopoulos，Curr. Opin. Mol. Ther. 1999，1，98-103；Hang，Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005，13，5021-5034)作为B表位、衍生自脊髓灰质炎病毒的充分证明的鼠MHC II类限制性辅助T细胞表位KLFAVWKITYKDT (SEQ ID NO:3)(Leclerc，J. Virol. 1991，65，711-718)和脂肽Pam3CysSK4(TLR2激动剂)(Spohn，Vaccine 2004，22，2494-2499)的化合物21 (图5)，先前显示在小鼠中引发特别高滴度的IgG抗体(Ingale，Nat. Chem. Biol. 2007，3，663-667)。化合物22具有与21相似的体系结构，然而，TLR2配体已替换为脂质化氨基酸(Toth，Tetrahedron Lett. 1993，34，3925-3928)。脂质化氨基酸不诱导细胞因子的产生，然而，它们致使化合物能够掺入脂质体内。因此，糖脂肽22理想地适合于确定TLR参与对于针对肿瘤相关糖肽的抗原应答的重要性。为了测定TLR配体的共价连接的重要性，采用化合物22和分别为TLR2和TRL4激动剂的Pam3CysSK4 (23)或单磷酰脂质A (24)的脂质体制剂(Spohn，Vaccine 2004，22，2494-2499；Chow，J. Biol. Chem. 1999，274，10689-10692)。最后，由连接至脂质化氨基酸的MUC-1糖肽B表位和连接至Pam3CysSK4的辅助T表位组成的化合物25和26用于确定B表位和辅助T表位的共价连接的重要性。化合物21如先前描述地制备(Ingale，Nat. Chem. Biol. 2007，3，663-667；Ingale，Org. Lett. 2006，8，5785-5788)。使用Rink酰胺树脂、Fmoc保护的氨基酸、Fmoc-Thr-(AcO3-α-D-GalNAc)(Cato，J. Carbohydr. Chem.2005，24，503-516)和Fmoc保护的脂质化氨基酸(Gibbons，Liebigs Ann. Chem. 1990，1175-1183；Koppitz，Helv. Chim. Acta 1997，80，1280-1300)，通过SPPS合成化合物22。使用2-(1H-苯并三唑-1-基)-氧基-1,1,3,3-四甲基六氟磷酸盐(HBTU)/N-羟基苯并三唑(HOBt)(Knorr，Tetrahedron Lett. 1989，30，1927-1930)作为激活试剂引入标准氨基酸，糖基化氨基酸用O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)/1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)装入，脂质化氨基酸由苯并三唑-1-基-氧基-三吡咯烷子基磷六氟磷酸盐(PyBOP)/HOBt装入。在糖脂肽装配完成后，使用标准条件去除N末端Fmoc保护基团，所得到的胺用乙酸酐和二异丙基乙胺(DIPEA)的N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液通过乙酰化加帽。接下来，糖部分的乙酰酯用60%肼的MeOH溶液裂解，用试剂B (TFA、H2O、苯酚、三乙基硅烷，88/5/5/2，v/v/v/v)处理导致侧链保护基团的去除和糖肽从固相支持体中释放。
在通过用冰冷的二乙醚沉淀和随后的在C-4半制备型柱上的HPLC纯化粗产物后，获得纯化合物22。类似方案用于合成化合物25。衍生物26通过SPPS在Rink酰胺树脂上合成，并且在肽装配后，所得到的产物用N-芴甲氧羰基-R-(2,3-双(棕榈酰氧基)-(2R-丙基)-(R)-半胱氨酸(Fmoc-Pam2Cys-OH)手工偶联(Metzger，Int. J. Pept. Protein Res.1991，38，545-554)。用20%哌啶的DMF溶液去除产物的N-Fmoc基团，并且使用PyBOB、HOBt和DIPEA的DMF溶液，使所得到的胺与棕榈酸偶联。将脂肽用试剂B处理，以将其从树脂中裂解和去除侧链保护基团。通过用冰冷的二乙醚沉淀和随后的在C-4半制备型柱上的HPLC纯化粗产物。
免疫接种和免疫学。
通过卵磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰甘油(PG)、胆固醇(Chol)和化合物21或22 (摩尔比：65/25/50/10)的薄膜在含有NaCl (145 mM)的HEPES缓冲液(10 mM，pH 6.5)中的水合，随后为通过经由100 nm Nuclepore®聚碳酸酯膜挤出，将化合物21和22掺入基于磷脂的小型单层囊泡(SUV)内。将五只雌性BALB/c小鼠的组用含有3 μg糖的脂质体以每周一次间隔皮下免疫接种四次。此外，在HEPES缓冲液中制备具有糖肽22与23或24的混合物的相似脂质体(摩尔比：PC/PG/Chol/22/23或24，65/25/5/5/5)，在血清收获前以每周一次间隔施用四次。最后，采用标准程序，将小鼠用化合物25和26的脂质体制剂(摩尔比：PC/PG/Chol/25/26，65/25/5/5/5)免疫接种。
通过用缀合至BSA的MUC-1衍生的糖肽TSAPDT(α-D-GalNAc)RPAP包被微量滴定板来测定抗血清的抗MUC-1抗体滴度，并且用由碱性磷酸酶标记的抗小鼠IgM或IgG抗体完成检测。用21免疫接种的小鼠引发特别高滴度的抗MUC-1 IgG抗体(表5)。IgG抗体的亚分型(IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3)指出朝向Th2免疫应答的偏向。此外，观察到的高IgG3滴度是抗碳水化合物应答的典型。用含有脂质化氨基酸代替TLR2配体的糖脂肽22免疫接种导致显著更低滴度的IgG抗体，证实TLR参与对于最佳抗原应答是非常重要的。然而，具有Pam3CysSK4 (23)或单磷酰脂质A (24)的化合物22的脂质体制剂引发与21相似的IgG (总)滴度。在22与23的混合物的情况下，如通过高IgG1和低IgG2a,b滴度证明的，免疫应答朝向Th2应答偏向。另一方面，单磷酰脂质A的使用导致显著的IgG1和IG2a,b应答，因此这种制剂引发混合Th1/Th2应答。最后，含有化合物25和26的脂质体不诱导可测量滴度的抗MUC-1抗体，表明对于抗原应答，B表位和T表位需要共价连接。
表5. 在用多种制剂4次免疫接种后的ELISA抗MUC1和抗T表位抗体滴度a。
a抗MUC1和抗T表位抗体滴度作为关于五只小鼠的组的中值呈现。对于抗MUC1抗体滴度，将ELISA板用BSA-MI-MUC1缀合物包被，或对于抗T表位抗体滴度，将ELISA板用中性抗生物素蛋白-生物素-T表位包被。通过线性回归分析，标绘与吸光度比较的稀释度而测定滴度。滴度定义为获得相对于正常对照小鼠血清光密度为0.1或更大的最高稀释度。
b 采用脂质体制剂。
总IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM的个别抗MUC1滴度和总IgG的抗T表位在表8中报道。
接下来，研究针对辅助T表位的可能抗原应答。因此，将链霉抗生物素蛋白包被的微量滴定板用由生物素修饰的辅助T表位处理。在加入血清的系列稀释液后，用由碱性磷酸酶标记的抗小鼠IgM或IgG抗体完成检测。有趣的是，化合物21引发低的针对辅助T表位的抗体，而22与23或24的混合物未引发针对辅助T表位的抗体。
分别通过与单核吞噬细胞表面上的TLR2或TLR4相互作用，Pam3CysSK4或单磷酰脂质A用于起始细胞因子产生(Kawai，Semin. Immunol. 2007，19，24-32)。在用Pam3CysSK4激活后，TLR2的细胞内结构域募集衔接蛋白质MyD88，导致激酶级联的激活，从而导致许多细胞因子和趋化因子的产生。另一方面，脂多糖(LPS)和脂质A通过与TLR4/MD2复合物相互作用而诱导细胞应答，这导致衔接蛋白质MyD88和TRIF的募集，从而导致更复杂模式的细胞因子的诱导。TNF-α分泌是MyD88依赖性途径激活的原型量度，而IFN-β的分泌通常用作TRIF依赖性细胞激活的指示物。
为了检查细胞因子产生，使小鼠巨噬细胞(RAW γNO(-)细胞)暴露于广泛范围浓度的化合物21-24、大肠杆菌055:B5 LPS和原型大肠杆菌二磷酰脂质A (Zhang，J. Am.Chem. Soc. 2007，129，5200-5216)。在5.5小时后，收获上清液，使用商业或内部开发的捕获ELISA分别针对小鼠TNF-α和IFN-β检查该上清液(图6)。通过使用PRISM软件使剂量应答曲线拟合至逻辑斯谛方程，测定效力(EC50，产生50%活性的浓度)和功效(最大生产水平)。糖脂肽21和Pam3CysSK4 (23)以相似功效和效力诱导TNF-α分泌，表明B表位和T表位的连接对细胞因子应答没有作用。如预期的，化合物无一诱导IFN-β的产生。此外，化合物22不诱导TNF-α和IFN-β分泌，表明它的脂质部分是免疫沉默的。化合物24刺激细胞产生TNF-α和INF-β，但它的效力比大肠杆菌055:B5 LPS的小得多。与化合物21和23相比较，它展示大得多的TNF-α生产功效。化合物21和23的功效减少可能是有利性质，因为LPS可以过度激活先天性免疫系统，导致脓毒性休克的症状。
接下来，确定小鼠抗血清识别存在于癌细胞上的天然MUC-1抗原的能力。因此，将血清样品的系列稀释液加入表达MUC-1的MCF-7人乳腺癌细胞(Horwitz，Steroids 1975，26，785-95)，并且使用FITC标记的抗小鼠IgG抗体建立识别。如图7中可见，得自用三组分疫苗1免疫接种的抗血清展示极佳的MUC-1肿瘤细胞识别，而当采用不表达MUC-1抗原的SK-MEL 28细胞时，未观察到结合(图9)。
尽管得自用脂质化T-B表位(22)和Pam3CysSK4 (23)的混合物免疫接种的小鼠的血清引发与21相等的高IgG抗体滴度(表5)，但观察到少得多的MCF-7细胞识别。这个结果指出佐剂PamsCysSK4 (23)与B-T表位的共价连接对于正确的抗体成熟是重要的，正确的抗体成熟导致改善的癌细胞识别。用化合物22和单磷酰脂质A(24)的混合物免疫接种导致可变结果，两只小鼠展示极佳的MCF-7细胞识别，三只小鼠展示中等的MCF-7细胞识别。
讨论
旨在开发基于碳水化合物的癌症疫苗的大多数努力已集中于使用通过人工接头连接至载体蛋白质的化学合成的肿瘤相关碳水化合物(Springer，Mol. Med. 1997，75，594-602；Dube，Nat. Rev. Drug Discov. 2005，4，477-488；Ouerfelli，Expert Rev. Vaccines2005，4，677-685；Slovin，Immunol. Cell Biol. 2005，83，418-428)。已确定使用KLH作为载体蛋白质与有力佐剂QS-21组合给出最佳结果。然而，这种方法的缺点是KLH是极大和麻烦的蛋白质，其可以引发高滴度的抗KLH抗体(Cappello，Cancer Immunol Immunother1999，48，483-492)，导致肿瘤相关碳水化合物表位的免疫抑制。此外，缀合化学常常难以控制，因为它导致产生具有可以影响免疫应答的再现性的在组成和结构方面的含糊性的缀合物。此外，接头部分可以引发强B细胞应答(Buskas，Chem. Eur. J. 2004，10，3517-3524；Ni，Bioconjug. Chem. 2006，17，493-500)。并不令人惊讶地，用碳水化合物-蛋白质缀合物的临床前和临床研究已导致混合优点的结果。例如，在佐剂QS-21的存在下，用缀合至KLH的Tn抗原的三聚体簇(Tn(c)-KLH)免疫接种小鼠引发中等滴度的IgG抗体(Kuduk，J. Am.Chem. Soc. 1998，120，12474-12485)。在复发的前列腺癌患者的临床试验中检查疫苗候选物给出低的中值IgG和IgM抗体滴度(Slovin，J. Clin. Oncol. 2003，21，4292-4298)。
本文报道的研究显示其中MUC-1相关糖肽B表位、非种系选择性鼠MHC II类限制性辅助T细胞表位和TLR2激动剂(21)共价连接的三组分疫苗，可以引发强IgG抗体应答。尽管TLR2配体与T-B糖肽表位的共价连接不是高IgG抗体滴度所需的，但发现它对于最佳癌细胞识别是非常重要的。在这方面，含有化合物21或化合物22和TLR2激动剂23的混合物的脂质体引发相似的高抗MUC-1 IgG抗体滴度。然而，得自用21免疫接种的抗血清在比得自用22和23的混合物免疫接种的抗血清低得多的血清稀释度下识别表达MUC-1的癌细胞。看起来用三组分疫苗21免疫接种导致更有效的抗体成熟，从而导致改善的癌细胞识别。
还观察到针对辅助T表位的抗原应答方面的差异。因此，21引发针对辅助T表位的低滴度的IgG抗体，而22与23的混合物不诱导针对候选疫苗的这个部分的抗原应答。因此，TLR2配体的共价连接使得化合物21更多抗原性，导致针对辅助T表位的低抗体应答。
观察到化合物22与23或24的混合物诱导相似高滴度的总IgG抗体。然而，当采用TLR2激动剂Pam3CysSK4 (23)时，观察到朝向Th2应答(IgG1)的偏向，而当使用TLR4激动剂单磷酰脂质A (24)时，获得混合Th1/Th2应答(IgG2a,b)。辅助T细胞的极化方面的差异可能是由于不同模式的细胞因子被TLR2或TLR4诱导。在这方面，先前观察到Pam3Cys诱导比大肠杆菌LPS更低水平的Th1诱导性细胞因子Il-12(p70)，和高得多水平的Th2诱导性IL-10(Dillon，B. J Immunol 2004，172，4733-43)。差异可能是由于TLR4募集衔接蛋白质MyD88和Trif的能力，而TLR2仅可募集MyD88。该结果表明免疫系统可以通过佐剂的适当选择以特定方向定制，这是有意义的，因为不同IgG同种型执行不同效应子功能。
本文描述的结果还显示与由TLR2配体修饰的化合物21相比较，含有免疫沉默脂肽的化合物22单独引发低得多的IgG滴度。特别地，化合物22引发IgG2抗体的能力是受损的。采用在TLR信号转导方面缺陷的小鼠的近期研究对这些先天性免疫受体对于适应性免疫应答的重要性产生怀疑(Blander，Nature 2006，440，808-812；Gavin，Science 2006，314，1936-1938；Meyer-Bahlburg，J Exp Med 2007，204，3095-101；Pulendran，N Engl J Med2007，356，1776-8)。在这方面，用MyD88缺陷型小鼠的研究显示IgM和IgG1在很大程度上但并非完全依赖TLR信号转导，而IgG2同种型是完全TLR依赖性的(Blander，Nature 2006，440，808-812)。与此处报道的结果一致的这些观察结果归因于B细胞成熟需要TLR信号转导。然而，另一个研究发现当在几种佐剂的存在或不存在下，用三硝基苯酚-血蓝蛋白(TNP-Hy)或TNP-KLH免疫接种时，MyD88-/-/Triflps/lps双重敲除小鼠引发与野生型小鼠相似滴度的抗体(Gavin，Science 2006，314，1936-1938)。得出结论：可能需要从佐剂中排除TLR激动剂。已注意到佐剂的重要性可能依赖于免疫原的抗原性(Meyer-Bahlburg，J Exp Med2007，204，3095-101；Pulendran，N Engl J Med 2007，356，1776-8)。在这方面，TNP的蛋白质缀合物是高度抗原性的并且可能不需要佐剂用于最佳应答。然而，自身抗原例如肿瘤相关碳水化合物具有低固有抗原性，并且此处报道的结果明确显示当共施用TLR配体时，获得强得多的抗体应答。此外，此处证实候选疫苗的体系结构对于最佳抗原应答是非常重要的，特别地TLR配体与T-B表位的共价连接导致改善的癌细胞识别。
化合物25和26的混合物不能引发抗MUC-1糖肽抗体指出T表位与B表位的共价连接是引发抗原应答所需的。在这方面，B细胞通过辅助T细胞的激活需要与通过抗原呈递细胞的辅助T细胞激活相似类型的细胞间相互作用。因此，含蛋白质或肽的抗原需要被B细胞内在化以转运至内体小泡，在此蛋白酶将消化蛋白质，一些所得到的肽片段将与II类MHC蛋白质复合。II类MHC-肽复合物随后转运至B淋巴细胞的细胞表面，以介导与辅助T细胞的相互作用，导致从低亲和力IgM到高亲和力IgG抗体产生的类别转换。与抗原呈递细胞不同，B细胞具有弱吞噬性质，并且仅可内在化结合B细胞受体的分子。因此，预期辅助T表位的内在化通过与B表位(MUC-1糖肽)的共价连接得到促进，因此两种表位的共价连接将导致更强的抗原应答。
总之，已证实完全合成的癌症疫苗的抗原性质可以通过结构-活性关系研究最佳化。在这方面，已确定其中肿瘤相关MUC-1糖肽B表位、非种系选择性辅助T细胞表位和TLR2配体共价连接的三组分疫苗，可以引发特别高的IgG抗体应答，其具有识别癌细胞的能力。辅助T表位共价连接至B表位是非常重要的，可能是因为辅助T表位通过B细胞的内在化需要B表位的存在。还已显示TLR激动剂的掺入对于针对肿瘤相关糖肽抗原的强抗原应答是重要的。在这方面，由TLR2配体诱导的细胞因子对于免疫细胞成熟是重要的，免疫细胞成熟导致强抗体应答。令人惊讶的发现是当TLR2表位共价连接至糖肽T-B表位时，观察到改善的癌细胞识别。此处呈现的结果提供三组分疫苗的最佳构成的重要信息，并且将指导基于碳水化合物的癌症疫苗的成功开发。
实验
肽合成：肽通过建立的方案在配备UV检测器的ABI 433A肽合成仪(AppliedBiosystems)上使用N α -Fmoc保护的氨基酸和2-(1H-苯并三唑-1-基)-氧基-1,1,3,3-四甲基六氟磷酸盐(HBTU)/N-羟基苯并三唑(HOBt)(Knorr，Tetrahedron Lett. 1989，30，1927-1930)作为激活试剂而合成。单个偶联步骤用条件性加帽执行。使用下述受保护的氨基酸：N α -Fmoc-Arg(Pbf)-OH、N α -Fmoc-Asp(O t Bu)-OH、N α -Fmoc-Asp-Thr(ψMe,Mepro)-OH、N α -Fmoc-Ile-Thr(ψMe,Mepro)-OH、N α -Fmoc-Lys(Boc)-OH、N α -Fmoc-Ser( t Bu)-OH、N α -Fmoc-Thr( t Bu)-OH和N α-Fmoc-Tyr( t Bu)-OH。使用O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)/1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)作为偶联剂，手工执行糖基化氨基酸N α-Fmoc-Thr-(AcO3-α-D-GalNAc) 1S (Cato，J. Carbohydr. Chem. 2005，24，503-516)的偶联。使用苯并三唑-1-基-氧基-三吡咯烷子基-磷六氟磷酸盐(PyBOP)/HOBt作为偶联剂(参见支持信息)，执行N α -Fmoc-亲脂氨基酸(N α -Fmoc-D,L-十四烷酸) 2S (Gibbons，Liebigs Ann. Chem. 1990，1175-1183；Koppitz，Helv. Chim. Acta 1997，80，1280-1300)和N α -Fmoc-S-(2,3-双(棕榈酰氧基)-(2R-丙基)-(R)-半胱氨酸3S (Metzger，Int. J.Pept. Protein Res. 1991，38，545-554；Roth，Bioconj. Chem. 2004，15，541-553)(其由(R)-缩水甘油制备)的偶联。通过标准Kaiser测试监控手工偶联的进展(Kaiser，Anal.Biochem. 1970，34，595)。
脂质体制备：将卵磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰甘油(PG)、胆固醇(Chol)和化合物21或22 (15 mmol，摩尔比65:25:50:10)或PC/PG/Chol/22/23或24 (15 mmol，摩尔比60:25:50:10:5)或PC/PG/Chol/25/26 (15 mmol，摩尔比65:25:50:5:5)溶解于三氟乙醇和MeOH (1:1，v/v，5 mL)的混合物中。将溶剂在真空中去除，以给出薄脂质薄膜，其通过在氩气氛下在41℃在含有NaCl (145 mM)的HEPES缓冲液(10 mM，pH 6.5) (1 mL)中振荡3小时水合。将囊泡悬液超声处理1分钟，随后在50℃相继通过1.0、0.4、0.2和0.1 μm聚碳酸酯膜(Whatman，Nuclepore® Track-Etch Membrane)挤出，以获得SUV。通过在100℃在密封管中加热SUV(50 μL)和含水TFA (2 M，200 μL)的混合物4小时测定GalNAc含量。随后将溶液在真空中浓缩，并且通过高pH阴离子交换层析，使用脉冲安培检测器(HPAEC-PAD；Methrome)和CarboPac柱PA-10和PA-20 (Dionex)进行分析。
剂量和免疫接种时间表：将五只小鼠的组(雌性BALB/c，年龄8-10周；JacksonLaboratories)以每周一次间隔免疫接种四次。每次加强在脂质体制剂中包含3 µg糖。血清样品在免疫接种(预先放血)前和最后一次免疫接种后的一周获得。最后一次放血通过心脏放血完成。
血清学测定：如先前描述的(Buskas，Chem. Eur. J. 2004，10，3517-3524)，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测定抗MUC-1 IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM抗体滴度。简言之，将ELISA板(Thermo Electron Corp.)用通过马来酰亚胺接头缀合至BSA的MUC-1糖肽缀合物(BSA-MI-MUC-1)包被。允许血清的系列稀释液结合固定的MUC-1。通过加入磷酸酯缀合的抗小鼠IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.)、IgG1 (Zymed)、IgG2a(Zymed)、IgG2b (Zymed)、IgG3 (BD Biosciences Pharmingen)或IgM (JacksonImmunoResearch Laboratories Inc.)抗体完成检测。在加入对硝基苯基磷酸酯(Sigma)后，使用微板读数器(BMG Labtech)在405 nm处测量吸光度，其中波长校正设在490 nm处。如下测定针对T (脊髓灰质炎)表位的抗体滴度。使Reacti-bind NeutrAvidin包被和预封闭的板(Pierce)与生物素标记的T表位(10 µg/mL)一起温育2小时。接下来，允许血清的系列稀释液结合固定的T表位。如上所述完成检测。抗体滴度定义为获得相对于正常对照小鼠血清光密度为0.1或更大的最高稀释度。
细胞培养：衍生自RAW 264.7小鼠单核细胞/巨噬细胞细胞系的RAW 264.7 γNO(-)细胞得自ATCC。将细胞维持在具有L-谷氨酰胺(2 mM)的RPMI 1640培养基中，所述RPMI1640培养基调整为含有碳酸氢钠(1.5 g L-1)、葡萄糖(4.5 g L-1)、HEPES (10 mM)和丙酮酸钠(1.0 mM)，且补充有青霉素(100 u mL-1)/ 链霉素(100 µg mL-1；Mediatech)和FBS(10%；Hyclone)。得自ATCC的人乳腺腺癌细胞(MCF7)(Horwitz，Steroids 1975，26，785-95)在具有L-谷氨酰胺(2 mM)和Earle’s BSS的伊格尔最低基础培养基(Eagle’s minimumessential medium)中培养，所述伊格尔最低基础培养基经修改为含有碳酸氢钠(1.5 g L-1)、非必需氨基酸(0.1 mM)和丙酮酸钠(1 mM)，且补充有牛胰岛素(0.01 mg mL-1；Sigma)和FBS(10%)。人皮肤恶性黑素瘤细胞(SK-MEL-28)得自ATCC，且在具有L-谷氨酰胺(2 mM)和Earle’s BSS的伊格尔最低基础培养基中生长，所述伊格尔最低基础培养基调整为含有碳酸氢钠(1.5 g L-1)、非必需氨基酸(0.1 mM)和丙酮酸钠(1 mM)，且补充有FBS (10%)。所有细胞在37℃下维持在潮湿5% CO2大气中。
TNF-α和IFN-β测定。在暴露测定当天，将RAW 264.7 γNO(-)细胞以2 x 105个细胞/孔铺板于96孔板(Nunc)中，在多粘菌素B的存在或不存在下，与不同刺激物一起温育5.5小时。将培养上清液收集并冷冻(-80℃)贮存，直至测定细胞因子产生。使用来自R&DSystems的TNF-α DuoSet ELISA Development试剂盒测定TNF-α浓度。如下测定IFN-β的浓度。将ELISA MaxiSorp板用针对小鼠IFN-β的兔多克隆抗体(PBL BiomedicalLaboratories)包被。允许在标准品和样品中的IFN-β结合固定化抗体。随后加入大鼠抗小鼠IFN-β抗体(USBiological)，产生抗体-抗原-抗体“夹心”。接下来，加入辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗大鼠IgG (H+L)抗体(Pierce)和HRP的生色底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB；Pierce)。在反应停止后，在450 nm处测量吸光度，其中波长校正设至540 nm。使用Prism(GraphPad Software，Inc.)中的非线性最小二乘法曲线拟合分析浓度-应答数据。用下述四参数逻辑斯谛方程拟合这些数据：Y = Emax /(1 +(EC50/X)Hill斜率)，其中Y是细胞因子应答，X是刺激物的浓度，Emax是最大应答，并且EC50是产生50%刺激的刺激物浓度。Hill斜率设为1，以能够比较不同诱导物的EC50值。所有细胞因子值作为一式三份测量的平均值± SD呈现，其中每次试验重复三次。
针对LPS污染评价材料：为了确保细胞因子产生中的任何增加不由含有多种刺激物的溶液的LPS污染引起，亲合结合LPS的脂质A区域，从而阻止LPS诱导的细胞因子产生(Tsubery，Biochemistry 2000，39，11837-44)。在与大肠杆菌O55:B5 LPS一起温育5.5小时前与多粘菌素B (30 µg mL-1；Bedford Laboratories)一起预温育30分钟的细胞上清液中的TNF-α和IFN-β浓度显示完全抑制，而与多粘菌素B一起预温育对与合成化合物21和23一起温育的细胞的TNF-α合成没有作用。因此，后一种制剂的LPS污染是无关紧要的。
通过荧光测量的细胞识别分析：使免疫接种前和后的血清的系列稀释液与MCF7和SK-MEL-28单细胞悬液一起在冰上温育30分钟。接下来，将细胞洗涤并与缀合至异硫氰酸荧光素(FITC；Sigma)的山羊抗小鼠IgG γ-链特异性抗体一起在冰上温育20分钟。在三次洗涤和细胞裂解后，使用微板读数器(BMG Labtech)，就荧光强度(485 ex / 520 em)分析细胞裂解产物。数据点一式三份地收集并代表三次独立实验。
实施例7
化合物的合成
一般方法：Fmoc-L-氨基酸衍生物和树脂购自NovaBioChem和Applied Biosystems；肽合成级别N，N-二甲基甲酰胺(DMF)购自EM Science；N-甲基吡咯烷酮(NMP)购自AppliedBiosystems。卵磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰甘油(PG)、胆固醇(Chol)和单磷酰脂质A (MPL-A)得自Avanti Polar Lipids。EZ-Link® NHS-生物素试剂(琥珀酰亚胺基-6-(生物素酰胺)己酸酯)得自Pierce。所有其他化学试剂购自Aldrich、Acros、Alfa Aesar和FisherScientific，且无需进一步纯化而使用。采用的所有溶剂都是试剂级的。使用以1 mL/分钟流速的Agilent Zorbax EclipseTM C8分析柱(5 μm，4.6 x 150 mm)、以3 mL/分钟流速的Agilent Zorbax EclipseTM C8半制备型柱(5 μm，10 x 250 mm)、或以2mL/分钟流速的Phenomenex JupiterTM C4半制备型柱(5 μm，10 x 250 mm)，在配备自动注射器、流分收集器和UV检测器(在214 nm处检测)的Agilent 1100系列系统上执行反相高效液相层析(RP-HPLC)。所有运行都使用经过40分钟的0-100%溶剂B的线性梯度(溶剂A = 5%乙腈，0.1%三氟乙酸(TFA)的水溶液，溶剂B = 5%水，0.1%TFA的乙腈溶液)执行。在ABI 4700蛋白质组学分析仪上记录基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF)质谱。
糖脂肽22的合成：如在实验中的肽合成下所述的，合成22在Rink酰胺树脂(28，0.1mmol)上执行。前四个氨基酸Arg-Pro-Ala-Pro使用标准方案在肽合成仪上偶联，以获得29。在合成完成后，执行1S (0.2 mmol，134 mg)的手工偶联。将N α-Fmoc-Thr-(AcO3-α-D-GalNAc) 1S (Cato，J. Carbohydr. Chem. 2005，24，503-516)溶解于NMP (5 mL)中，将O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU；0.2 mmol，76 mg)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt；0.2 mmol，27 mg)和二异丙基乙胺(DIPEA；0.4 mmol，70 μL)加入溶液中，然后将所得到的混合物加入树脂中。通过标准Kaiser测试监控偶联反应。在12小时后，将树脂用NMP (6 mL)和二氯甲烷(DCM；6 mL)洗涤，然后再经历相同偶联条件，以确保完全偶联。随后在肽合成仪上延长糖肽30。在合成完成后，将树脂用NMP (6 mL)、DCM (6mL)和甲醇(MeOH；6 mL)充分洗涤，并真空干燥。随后将树脂在DCM (5 mL)中溶胀1小时，并且手工执行偶联的剩余部分。接下来，将溶解于NMP(5 mL)、苯并三唑-1-基-氧基-三吡咯烷子基-磷六氟磷酸盐(PyBOP；0.3 mmol，156 mg)、HOBt(0.3 mmol，40 mg)和DIPEA(0.4mmol，67 μL)中的N α -Fmoc-亲脂氨基酸(N α -Fmoc-D,L-十四烷酸) 2S (Gibbons，LiebigsAnn. Chem. 1990，1175-1183；Koppitz，Helv. Chim. Acta 1997，80，1280-1300)(0.3mmol，139 mg)预混合2分钟，随后加入树脂中。通过Kaiser测试监控偶联反应，然后在静置8小时后完成。使用哌啶(20%)的DMF(6 mL)溶液裂解N α -Fmoc基团。将溶解于NMP(5 mL)、PyBOP(0.3 mmol，156 mg)、HOBt(0.3 mmol，40 mg)和DIPEA(0.4 mmol，67 μL)中的N α -Fmoc-Gly-OH(0.3 mmol，90 mg)预混合2分钟，随后加入树脂中。通过Kaiser测试监控偶联反应，然后在静置4小时后完成。使用哌啶(20%)的DMF(6 mL)溶液裂解N α -Fmoc基团。使用PyBOP(0.3 mmol，156 mg)、HOBt(0.3 mmol，40 mg)和DIPEA(0.4 mmol，67 μL)的NMP(5 mL)溶液，如上所述执行2S (0.3 mmol，139 mg)的再一个偶联循环。最后，使用哌啶(20%)的DMF(6 mL)溶液裂解N α -Fmoc基团，并且通过用Ac2O(10%)和DIPEA(5%)的NMP(5mL)溶液处理树脂10分钟，使所得到的游离氨基乙酰化。将树脂用NMP(5 mL x 2)、DCM(5 mL x 2)和MeOH(5mL x 2)充分洗涤，并且在真空中干燥。将树脂在DCM(5 mL)中溶胀1小时，用肼(60%)的MeOH4,5(10 mL)溶液处理2小时，用NMP(5 mL x 2)、DCM(5 mL x 2)和MeOH(5 mL x 2)充分洗涤，然后在真空中干燥。将树脂在DCM(5 mL)中溶胀1小时，随后用试剂B(TFA(88%)、水(5%)、苯酚(5%)和TIS(2%)，10 mL)处理2小时。将树脂过滤，用纯净TFA(2 mL)洗涤，随后将滤液在真空中浓缩至其原始体积的约1/3。使用二乙醚(0℃，40 mL)沉淀糖脂肽，通过以3,000 rpm离心15分钟回收。使用经过40分钟的0-95%溶剂B的A溶液的线性梯度，在半制备型C-4柱上通过RP-HPLC纯化粗制糖脂肽，并且将合适流分冻干以提供22 (图10)(57 mg，16%). C165H267N37O44，MALDI-ToF MS：观察到的，[M+] 3473.4900Da；计算的，[M+]3473.1070Da。
方案15。试剂和条件：a)使用Fmoc化学的SPPS，在DIPEA的NMP溶液的存在下与HBTU/HOBt偶联；b) 1S、HATU/HOAt、DIPEA、NMP，过夜；c) i. 在DIPEA的NMP溶液的存在下，2S与PyBOP/HOBt的手工偶联；ii. 20%哌啶的DMF溶液；iii. 在DIPEA的NMP溶液的存在下，1S与PyBOP/HOBt的手工偶联；iv. 20%哌啶的DMF溶液；v. 在DIPEA的NMP溶液的存在下，2S与PyBOP/HOBt的手工偶联；vi. 20%哌啶的DMF溶液；vii. 10%Ac2O，5%DIPEA的NMP溶液达10分钟；(d) 60%肼的MeOH溶液，2小时；e)试剂B，TFA(88%)、苯酚(5%)、水(5%)、TIS(2%)，2小时。
脂肽23的合成：如在实验中的肽合成下所述的，23的合成在Rink酰胺树脂(28，0.1mmol)上执行。在前五个氨基酸的偶联后，手工偶联分子的脂质部分。将N α -Fmoc-S-(2,3-双(棕榈酰氧基)-(2R-丙基)-(R)-半胱氨酸，3S (Metzger，Int. J. Pept. Protein Res.1991，38，545-554；Roth，Bioconj. Chem. 2004，15，541-553)(0.3 mmol，267 mg)溶解于DMF(5 mL)中，将PyBOP(0.3 mmol，156 mg)、HOBt(0.3 mmol，40 mg)和DIPEA(0.4 mmol，67μL)加入溶液中。在2分钟后，将反应混合物加入树脂中。通过Kaiser测试监控偶联反应，然后在静置12小时后完成。接下来，使用哌啶(20%)的DMF(6 mL)溶液裂解N α -Fmoc基团，以获得36。使用PyBOP(0.3 mmol，156 mg)、HOBt(0.3 mmol，40 mg)和DIPEA(0.4 mmol，67 μL)的DMF溶液，如上所述使棕榈酸(0.3 mmol，77 mg)与36的游离胺偶联。将树脂用DMF(5 mL x2)、DCM(5 mL x 2)和MeOH(5 mL x 2)充分洗涤，然后在真空中干燥。将树脂在DCM(5 mL)中溶胀1小时，随后用TFA(95%)、水(2.5%)和TIS(2.5%)(10 mL)在室温处理2小时。将树脂过滤，用纯净TFA(2 mL)洗涤。随后将滤液在真空中浓缩至其原始体积的约1/3。使用二乙醚(0℃，30 mL)沉淀脂肽，通过以3000 rpm离心15分钟回收。使用经过40分钟时期的0-95%溶剂B的溶剂A溶液的线性梯度，在半制备型C-4柱上通过RP-HPLC纯化粗制脂肽，并且将合适流分冻干以提供23 (图11)(40 mg，26%)。C81H156N11O12S，MALDI-ToF MS：观察到的[M+Na],1531.2240Da；计算的[M+Na]，1531.1734Da。
方案16。试剂和条件：a)使用Fmoc化学的SPPS，在DIPEA的NMP溶液的存在下与HBTU/HOBt偶联；b)在DIPEA的DMF溶液的存在下，通过PyBOP/HOBt激活的3S手工偶联；c)哌啶(20%)的DMF溶液；d)在DIPEA的DMF溶液的存在下，通过PyBOP/HOBt激活的棕榈酸偶联；e)TFA(95%)、水(2.5%)、TIS(2.5%)，2小时。
糖脂肽 25的合成：如在实验中的肽合成下所述的，合成25在Rink酰胺树脂(28，0.1 mmol)上执行。前四个氨基酸Arg-Pro-Ala-Pro使用标准方案在肽合成仪上偶联，以获得29。在合成完成后，使用1S (0.2 mmol，134 mg)执行手工偶联。将1S溶解于NMP(5 mL)中，加入HATU(0.2 mmol，76 mg)、HOAt(0.2 mmol，27 mg)和DIPEA(0.4 mmol，70 μL)，然后将所得到的混合物加入树脂中。通过标准Kaiser测试监控偶联反应。在12小时后，将树脂用NMP(6 mL)和DCM(6 mL)洗涤，然后再经历相同偶联条件，以确保完全偶联。随后在肽合成仪上延长糖肽30。在合成完成后，将树脂用NMP(6 mL)、DCM(6 mL)和MeOH(6 mL)充分洗涤，然后在真空中干燥。随后将树脂在DCM(5 mL)中溶胀1小时，并且手工完成肽序列的剩余部分。将2S (0.3 mmol，139 mg)溶解于NMP(5 mL)，将PyBOP(0.3 mmol，156 mg)、HOBt(0.3 mmol，40mg)和DIPEA(0.4 mmol，67 μL)加入溶液中。在2分钟后，将混合物加入树脂中。通过标准Kaiser测试监控偶联反应，并且在静置8小时后完成。接下来，使用哌啶(20%)的DMF(6 mL)溶液裂解N α -Fmoc基团。将N α -Fmoc-L-甘氨酸(0.3 mmol，90 mg)溶解于NMP(5 mL)，并且在将反应混合物加入树脂中之前，与PyBOP(0.3 mmol，156 mg)、HOBt(0.3 mmol，40 mg)和DIPEA(0.4 mmol，67 μL)预混合2分钟。通过Kaiser测试监控偶联反应，并且在静置4小时后完成。使用哌啶(20%)的DMF(6 mL)溶液裂解N α -Fmoc基团。使用PyBOP(0.3 mmol，156 mg)、HOBt(0.3 mmol，40 mg)和DIPEA(0.4 mmol，67 μL)的NMP(5 mL)溶液，如上所述执行2S (0.3mmol，139 mg)的再一个偶联循环。最后，使用哌啶(20%)的DMF(6 mL)溶液裂解N α -Fmoc基团，并且使用Ac2O(10%)和DIPEA(5%)的NMP(5 mL)溶液，使所得到的游离氨基乙酰化10分钟。将树脂用NMP(5 mL x 2)、DCM(5 mL x 2)和MeOH(5 mL x 2)充分洗涤，并且在真空中干燥。将树脂在DCM(5 mL)中溶胀1小时，用肼(60%)的MeOH(10 mL)溶液处理2小时，用NMP(5mL x 2)、DCM(5 mL x 2)和MeOH(5 mL x 2)充分洗涤，并且在真空中干燥。将树脂在DCM(5mL)中溶胀1小时，这之后将它用试剂B(TFA(88%)、水(5%)、苯酚(5%)和TIS(2%)，10 mL)处理2小时。将树脂过滤，用纯净TFA(2 mL)洗涤，随后将滤液在真空中浓缩至其原始体积的约1/3。使用二乙醚(0℃；40 mL)沉淀糖脂肽，并且通过以3,000 rpm离心15分钟回收。使用经过40分钟的0-95%溶剂B的A溶液的线性梯度，在半制备型C-4柱上通过RP-HPLC纯化粗制糖脂肽，将合适流分冻干以提供5 (图12)(35 mg，19%)。C84H145N19O25，MALDI-ToF MS：观察到的，[M+] 1821.1991Da；计算的，[M+] 1821.1624Da。
方案17。试剂和条件：a)使用Fmoc化学的SPPS，在DIPEA的NMP溶液的存在下与HBTU/HOBt偶联；b) 1S、HATU/HOAt、DIPEA、NMP，过夜；c) i. 在DIPEA的NMP溶液的存在下，2S与PyBOP/HOBt的手工偶联；ii. 20%哌啶的DMF溶液；iii. 在DIPEA的NMP溶液的存在下，N α -Fmoc-Gly-OH与PyBOP/HOBt的手工偶联；iv. 20%哌啶的DMF溶液；v. 在DIPEA的NMP溶液的存在下，2S与PyBOP/HOBt的手工偶联；vi. 20%哌啶的DMF溶液；vii. 10% Ac2O，5% DIPEA的NMP溶液达10分钟；(d) 60%肼的MeOH溶液，2小时；e)试剂B，TFA(88%)、苯酚(5%)、水(5%)、TIS(2%)，2小时。
脂肽26的合成：26的合成在Rink酰胺树脂(28，0.1 mmol)上执行。在通过使用标准SPPS装配肽后，手工偶联分子的脂质部分。将3S (0.3 mmol，267 mg)溶解于DMF(5 mL)中，将PyBOP(0.3 mmol，156 mg)、HOBt(0.3 mmol，40 mg)和DIPEA(0.4 mmol，67 μL)加入溶液中。在3S激活2分钟后，将反应混合物加入树脂中。通过Kaiser测试监控偶联反应，并且在静置12小时后完成。使用哌啶(20%)的DMF(6 mL)溶液裂解N-Fmoc基团，以获得43。使用PyBOP(0.3 mmol，156 mg)、HOBt(0.3 mmol，40 mg)和DIPEA(0.4 mmol，67 μL)的DMF溶液，如上所述使棕榈酸(77 mg，0.3 mmol)与43的游离胺偶联。将树脂用DMF(5 mL x 2)、DCM(5 mL x2)和MeOH(5 mL x 2)充分洗涤，然后在真空中干燥。将树脂在DCM(5 mL)中溶胀1小时，用试剂B(TFA(88%)、水(5%)、苯酚(5%)和TIS(2%)，10 mL)处理2小时，过滤，并用纯净TFA(2 mL)洗涤。随后将滤液在真空中浓缩至其原始体积的约1/3，使用二乙醚(0℃，30 mL)沉淀脂肽，然后通过以3000 rpm离心15分钟回收。使用经过40分钟的0-95%溶剂B的A溶液的线性梯度，在半制备型C-4柱上通过RP-HPLC纯化粗制脂肽，并且将合适流分冻干以提供26 (图13)(57mg，18%)。C162H278N29O31S，MALDI-ToF MS：观察到的，[M+] 3160.9423Da；计算的，[M+]3160.1814Da。
方案18。试剂和条件：a)使用Fmoc化学的SPPS，在DIPEA的NMP溶液的存在下与HBTU/HOBt偶联；b)在DIPEA的DMF溶液的存在下，3S、PyBOP、HOBt的手工偶联；c) 20%哌啶的DMF溶液；d)在DIPEA的DMF溶液的存在下，棕榈酸、PyBOP、HOBt的手工偶联；e)试剂B，TFA(88%)、苯酚(5%)、水(5%)、TIS(2%)，2小时。
生物素-T表位肽27的合成：如一般方法中所述的，27的合成在Rink酰胺树脂(28，0.1 mmol)上执行。在合成完成后，将树脂用DMF(5 mL x 2)、DCM(5 mL x 2)和MeOH(5 mL x2)充分洗涤，随后在真空中干燥。将树脂在DCM(5 mL)中溶胀1小时。接下来，将EZ-Link®NHS-生物素试剂(琥珀酰亚胺基-6-(生物素酰胺)己酸酯)(0.2 mmol，90 mg)和DIPEA(0.2mmol，36 μL)在DMF(5 mL)中的混合物加入树脂中。通过标准Kaiser测试监控偶联，并且偶联在8小时内完成。将树脂用DMF(5 mL x 2)、DCM(5 mL x 2)和MeOH(5 mL x 2)充分洗涤，然后在真空中干燥。将树脂在DCM(5 mL)中膨胀1小时，用试剂B(TFA(88%)、水(5%)、苯酚(5%)和TIS(2%)，15 mL)在室温处理2小时。将树脂过滤，用纯净TFA(2 mL)洗涤。将滤液在真空中浓缩至其原始体积的约1/3。使用二乙醚(0℃，30 mL)沉淀该肽，并且通过以3,000 rpm离心15分钟回收。使用经过40分钟时期的0-95%溶剂B的溶剂A溶液的线性梯度，在半制备型C-8柱上通过RP-HPLC纯化粗制肽，并且将合适流分冻干以提供27 (图14)(60%，基于树脂装载能力)。C95H147N21O21S，MALDI-ToF MS：观察到的[M+]，1951.2966Da；计算的[M+]，1951.3768Da。
方案19。试剂和条件：a)使用Fmoc化学的SPPS，在DIPEA的NMP溶液的存在下，与HBTU/HOBt偶联；b)在DIPEA的DMF溶液的存在下，琥珀酰亚胺基-6-(生物素酰胺)己酸酯的手工偶联；c)试剂B，TFA(88%)、苯酚(5%)、水(5%)、TIS(2%)，2小时。
实施例8
完全合成的多组分癌症疫苗引发多模式免疫应答(multi-model immune response)
这个实施例证实共价连接至Toll样受体(TLR)激动剂的糖基化MUC1衍生的糖肽可以引发有效的体液和细胞免疫应答，并且在逆转耐受和生成治疗应答中是有效的。许多对照化合物的检查证实三组分疫苗的疗效是由于通过佐剂引发的非特异性抗肿瘤应答，和通过MUC1衍生的糖肽引发的特异性体液和细胞免疫应答。已发现MUC1肽的糖基化对于诱导最佳应答是关键的，此外，辅助T表位和B表位共价连接至TLR配体是必需的。
结果
抗原设计和肿瘤攻击研究。在充分建立的乳腺癌小鼠模型(Akporiaye等人，2007，Vaccine；25:6965-6974)中检查化合物1、2、3、4和5的混合物和单独的5的脂质体制剂的功效(图16)。多组分疫苗候选物1含有衍生自MUC1的肿瘤相关糖肽(Baldus等人，2004，Crit. Rev Clin Lab Sci；41:189-231；和Springer，1997，J Mol Med；75:594-602)、衍生自脊髓灰质炎病毒的充分证明的鼠MHC II类限制性辅助T细胞表位KLFAVWKITYKDT(SEQ ID NO:1)(Leclerc等人，1991，J Virol；65:711-718)和作为Toll样受体-2 (TLR2)的有效激动剂的脂肽Pam3CysSK4 (Spohn等人，2004，Vaccine；22:2494-2499)。先前，MUC1衍生的糖肽SAPDT(α-GalNAc)RPAP被鉴定为MUC1的串联重复的抗原性优势结构域(Baldus等人，2004，Crit. Rev Clin Lab Sci；41:189-231；和Springer，1997，J Mol Med；75:594-602)。此外，这个表位还可以以与MHC I类(Kb)的复合物呈现，导致细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的激活(Apostolopoulos等人，2003，Proc Natl Acad Sci USA；100:15029-15034)。
如这个实施例中所示，1的MHC II类限制性辅助T细胞表位诱导从IgM到IgG抗体生产的类别转换(图20)，并促进外源糖肽在MHC 1类上的呈递。最后，1的Pam3CysSK4部分通过引发有关细胞因子和趋化因子充当嵌入佐剂(Spohn等人，2004，Vaccine；22:2494-2499)。为了测定1的碳水化合物部分的重要性，检查构建体2，其具有与1相似的结构，只是MUC1肽的苏氨酸不是糖基化的。化合物3缺乏1和2的MUC1糖肽表位，并被检查以解释由于通过佐剂的免疫激活的可能疗效。最后，检查糖肽4和佐剂Pam3CysSK4 5的混合物，以确定佐剂与MUC1糖肽和辅助T表位的共价连接的重要性。
多组分疫苗1通过脂质体介导的天然化学连接(Ingale等人，2006，Org Lett；8:5785-5788)进行制备。化合物2、3、4通过SPPS方案，使用Rink酰胺树脂、Fmoc保护的氨基酸Fmoc-Thr-(AcO3-α-D-GalNAc)合成。通过合成化合物、卵磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油和胆固醇的薄膜在含有NaCl(145 mM)的HEPES缓冲液(10 mM，pH 6.5)中的水合和随后的经由100 nmNuclepore®聚碳酸酯膜的挤出，将所得到的化合物掺入基于磷脂的小型单层囊泡(SUV)内。用化合物1、2、3、4和5的混合物和单独的5的脂质体制剂，将表达人MUC1的MUC1.Tg小鼠(C57BL/6；H-2b)的组以每两周一次的间隔免疫接种三次。在35天后，将小鼠用MMT乳房肿瘤细胞(对MUC1和Tn呈阳性)攻击，随后为一周后的再一次加强。在最后一次免疫接种后两周，将小鼠处死，并且通过肿瘤重量测定疫苗的功效。此外，通过MUC1特异性抗体的滴度和抗血清裂解荷有MUC1的肿瘤细胞的能力，来评估体液免疫应答的强健性。此外，通过测定产生IFN-γ的CD8+ T细胞的数目和这些细胞裂解肿瘤细胞的能力，来评价细胞免疫应答。
与空脂质体或用不含有MUC1糖肽表位的化合物3处理相比较，用多组分疫苗候选物1免疫接种导致肿瘤负荷的显著减少(图17)。有趣的是，与空脂质体的应用相比较，用化合物3免疫接种导致略微更小的肿瘤，表明由于非特异性佐剂效应所致的抗肿瘤性质。与对照免疫接种相比较，糖基化多组分疫苗候选物2以及化合物4和5的混合物未显示出抗癌性质的显著改善。在这些情况下，观察到在肿瘤重量方面的大分散，而用化合物1免疫接种导致在所有小鼠中肿瘤重量的实质减少。
体液免疫。通过用缀合至溴乙酰修饰的BSA的CTSAPDT(α-D-GalNAc)RPAP包被微量滴定板测定抗MUC1抗体滴度。化合物1已引发强IgG抗体应答，并且抗体的亚分型指出混合Th1/Th2应答(表6)。用1免疫接种但未用MMT肿瘤细胞攻击的小鼠引发相似滴度的抗体，指出癌细胞的免疫抑制可能得到逆转。抑制ELISA显示多克隆血清对于糖基化MUC1表位具有略微更高的亲和力(表7)。此外，测量到针对辅助T表位的低滴度抗体，指出候选疫苗不具有免疫抑制的缺点。尽管化合物2不含有碳水化合物部分，但所得到的抗血清可以识别CTSAPDT(α-D-GalNAc)RPAP表位。然而，在这种情况下，未检测到IgG3抗体。有趣的是，化合物4和5的混合物已引发低滴度的抗体，突出显示Pam3CysSK4与糖肽表位的共价连接对于强抗原应答的重要性。如预期的，不含有MUC1衍生表位的对照(3和5)不引发抗MUC1抗体应答。
通过用51Cr标记两个MUC1表达癌细胞类型和随后的抗血清和细胞毒性效应细胞(NK细胞)的添加和释放的51Cr的测量，来检查抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。如图18A和18B中可见，与对照化合物3相比较，通过用1免疫接种获得的抗血清能够显著增加癌细胞裂解。重要的是，与化合物1相比较，通过化合物2引发的抗体在细胞裂解中明显更不有效，突出显示糖基化对于有关抗原应答的重要性。如预期的，衍生自4和5的混合物和缺乏MUC1糖肽的对照衍生物的抗血清不诱导显著细胞裂解。
表6. 在用多种制剂4次免疫接种后的ELISA抗MUC1和抗T表位抗体滴度[a]。
[a]抗MUC1和抗T表位抗体滴度作为四到十三只小鼠的组的中值呈现。对于抗MUC1抗体滴度，将ELISA板用BSA-MI-MUC1(Tn)缀合物包被，或对于抗T表位抗体滴度，将ELISA板用中性抗生物素蛋白-生物素-T表位包被。通过线性回归分析测定滴度，其中与吸光度相比较对稀释度作图。滴度定义为获得相对于正常对照小鼠血清而言光密度为0.1或更大的最高稀释度。[b]采用脂质体制剂。在第3次和第4次免疫接种之间诱导MTT肿瘤。[c] EL = 空脂质体。[d]未诱导肿瘤。
表7. 通过ELISA[a]的MUC1(Tn)和MUC1 (未糖基化的)与BSA-MI-MUC1(Tn)缀合物的抗体结合的竞争性抑制IC50值。
[a] 将ELISA板用BSA-MI-MUC1(Tn)缀合物包被。将稀释以在不存在抑制剂的情况下在ELISA中获得约1的OD的在用1或2免疫接种后7只小鼠的组的血清样品，首先与MUC1(Tn)或未糖基化的MUC1 (0-500 µM终浓度)混合，随后应用于包被的微量滴定板。将光密度值对于用单独的血清(0 µM抑制剂，100%)获得的光密度值标准化。用下述逻辑斯谛方程拟合抑制数据：Y = 底部 +(顶部 – 底部)/(1 + 10(X – Log IC50))，其中Y是标准化的光密度，X是抑制剂浓度的对数，并且IC50是使应答减少一半的抑制剂浓度。IC50值报道为最佳拟合值和95%置信区间。
细胞免疫。为了评估疫苗候选物激活细胞毒性T淋巴细胞的能力，通过磁性细胞分选从用多种化合物免疫接种的小鼠的淋巴结中分离CD8+ T细胞，并且在ELLISPOT板上与用免疫接种肽脉冲的被照射DC一起温育。与对照相比较，疫苗候选物1和2显示出强CD8+应答(图19A，1和2与3比较)。有趣的是，糖肽4和佐剂5 (Pam3CysSK4)的混合物诱导更少数目的CD8+的激活，指出MUC1和辅助T表位与佐剂的共价连接对于CTL的最佳激活是重要的。
通过51Cr释放测定检查分离的CD8+细胞在无体外刺激的情况下的裂解活性，其中DC用MUC1衍生的糖肽SAPDT(Tn)RPAP (SEQ ID NO:26)或在免疫接种2的情况下用肽SAPDTRPAP (SEQ ID NO:20)脉冲。如图19B中可见，与对照相比较，通过化合物1和2激活的CTL显示出显著更大的细胞毒性。此外，用4和5的混合物免疫接种的小鼠显示出减少的裂解活性，进一步证实多种表位的共价连接的重要性。
为了详细研究CD8+细胞的表位需求，将五只MUC1.tg的组用化合物1和2的脂质体制剂免疫接种，随后收获并合并CD8+细胞，将其通过分别用糖肽SAPDT(Tn)RPAP (6) (SEQID NO:26)和肽SAPDTRPAP (7) (SEQ ID NO:20)脉冲的DC在体外刺激1天，随后通过与IL-2和IL-7一起培养而允许扩繁14天。在用MUC1衍生的糖肽6-9脉冲树突状细胞后，确定产生IFN-γ的CD8+细胞的百分比。化合物1已激活可通过糖基化和非糖基化结构激活的不同范围的CTL，而通过用2免疫接种获得的那些仅显示与无糖基化肽7的应答性。此外，得自用1免疫接种的CD8+细胞可以裂解用糖基化和无糖基化结构脉冲的DC (图20)。
这些结果指出通过用1免疫接种激活的CTL识别更广范围的结构(包括糖基化和无糖基化MUC1衍生的肽)，而由化合物2获得的CTL对无糖基化肽显示出强烈的优先。
细胞因子诱导。需要三组分疫苗的脂肽部分通过与单核吞噬细胞表面上的TLR2相互作用，以起始必需的细胞因子和趋化因子的产生(Akira等人，2001，Nat Immunol；2:675-680；Finlay和Hancock，2004，Nat Rev Microbiol；2:497-504；van Amersfoort等人，2003，Clin Microbiol Rev；16:379-414；和Spohn等人，2004，Vaccine；22:2494-2499)。在激活后，TLR2的细胞内结构域募集衔接蛋白质MyD88，导致激酶级联的激活，从而导致许多细胞因子和趋化因子的产生。另一方面，脂多糖通过与TLR4/MD2/CD14复合物相互作用而诱导细胞应答，这导致衔接蛋白质MyD88和TRIF的募集，从而导致更复杂模式的细胞因子诱导。TNF-γ分泌是MyD88依赖性途径激活的原型量度，而IFN-γ的分泌通常用作TRIF依赖性细胞激活的指示物(Akira等人，2001，Nat Immunol；2:675-680；和van Amersfoort等人，2003，Clin Microbiol Rev；16:379-414)。
为了检查通过多组分疫苗1的细胞因子产生的模式和确定糖基化是否影响应答性，检查通过化合物1、2和5诱导的TNF-α、IFN-β、Rantes、IL-6、IL-1、IL-10、IP-10、IL-12p70和IL-12/23p40分泌的功效(EC50)和效力(最大应答性)。因此，使通过确定的方法获得的原代树突状细胞暴露于广泛范围浓度的化合物1、2、5和大肠杆菌055:B5 LPS，使用捕获ELISA就多种小鼠细胞因子检查上清液。糖脂肽1、脂肽2和Pam3CysSK4 (5)以相似功效和效力诱导TNF-α、Rantes、IL-6、IL-1和IL-12/23p40分泌，指出B和T表位的连接和糖基化对细胞因子应答没有作用。参见图22、表8和表9。如预期的，两种化合物都不诱导IFN-β的产生。有趣的是，与化合物1、2和5相比较，大肠杆菌055:B5 LPS展示对于TNF-α诱导大得多的效力和功效。此外，它能够刺激细胞产生IFN-β、IL-10、IP10和IL-12p70。1、2和5的效力和功效减少是有利性质，因为已知LPS可以过度激活先天性免疫系统，导致脓毒性休克的症状。
为了确保细胞因子产生以TLR2依赖性方式起始，使化合物1和5暴露于HEK 293T细胞，其用鼠TLR2稳定转染，且用含有报道基因pELAM-Luc的质粒(NF-B依赖性萤火虫萤光素酶报道载体)和含有对照基因pRL-TK的质粒(海肾(Renilla)萤光素酶对照报道载体)瞬时转染。在4小时温育时间后，使用商业双重萤光素酶测定测量活性，发现化合物1和5能够以TLR2依赖性方式激活NF- B。
表8. 在原代树突状细胞温育24小时后获得的装载有化合物1、2或3和大肠杆菌LPS的脂质体制剂的剂量应答曲线的细胞因子坪值[a](pg/mL)。
[a]按照皮克细胞因子/μg总蛋白质使用非线性最小二乘法曲线拟合，通过Prism报告为最佳拟合值±标准误差的坪值。
[b] nd表示未检测到。
表9. 在原代树突状细胞中装载有化合物1、2或3和大肠杆菌LPS的脂质体制剂的细胞因子log EC50值[a](nM)。
[a]使用非线性最小二乘法曲线拟合，通过Prism报告为最佳拟合值±标准误差的Log EC50值。
[b] nd表示在用于精确EC50测定的水平上未检测到。
讨论
正在显现成功癌症疫苗开发需要立刻影响免疫系统的几个方面的多模式治疗的证据。尽管已在一些癌症患者中观察到针对MUC1的细胞和体液免疫应答，但设计可以引发这两种应答的癌症疫苗候选物是困难的。这个实施例证实由衍生自MUC1的糖肽、非种系选择性肽辅助T表位和TLR2激动剂组成的多组分疫苗可以引发IgG抗体，其可以裂解表达MUC1的癌细胞并刺激细胞毒性T淋巴细胞，从而在乳腺癌的小鼠模型中逆转耐受并生成治疗应答。
对照化合物的仔细分析揭示由多组分疫苗介导的肿瘤负荷的减少通过针对MUC1的特异性免疫和通过由嵌入TLR2激动剂介导的非特异性佐剂效应引起。正在显现TLR由肿瘤细胞广泛表达并且其激活可以导致致肿瘤性的抑制或促进的证据。此外，在TLR激活后产生的细胞因子和趋化因子可以刺激许多共刺激蛋白质的表达，用于在T辅助细胞与B细胞和抗原呈递细胞之间的最佳相互作用。近期研究指出TLR1/2激动剂具有在体外和体内减少Foxp3+调节性T细胞(Tregs)的抑制功能和增强肿瘤特异性CTL的细胞毒性的独特能力，并且潜在地具有比其他TLR激动剂更有利的抗肿瘤效应。
这个实施例也证实TLR2激动剂与糖脂肽表位的共价连接对于引发抗体和最佳CTL功能是关键的。用TLR2激动剂进行的脂质化使得有可能在脂质体制剂中配制多组分疫苗，这可能增强其循环时间。此外，脂质体制剂以多价方式呈递糖肽表位，从而提供用于B细胞表位的有效聚簇的机会，这是起始B细胞信号转导和抗体产生所必需的。如先前实施例中所示，TLR2激动剂Pam3CysSK4的共价连接促进通过表达TLR2的免疫细胞例如B细胞和抗原呈递细胞(APC)的选择性内在化。抗原的摄取和加工和T表位作为与MHC I或II类的复合物在APC细胞表面上的后续呈递，对于引发IgG抗体是关键的。在过去十年，众多研究已显示抗原选择性靶向APC将导致改善的免疫应答。例如，氧化甘露聚糖、热休克蛋白、细菌毒素和靶向树突状细胞的细胞表面受体的抗体已连接至抗原，以增加通过树突状细胞的摄取。尽管这些摄取策略是有吸引力的，但它们具有这样的缺点：靶向装置是抗原性的，这可能导致肿瘤相关碳水化合物的免疫抑制。Pam3CysSK4对于促进通过APC的摄取的吸引力在于其低固有免疫性。因此，三组分疫苗将促进摄取，而不具有免疫抑制的缺点。
最后，本实施例证实MUC1表位的糖基化对于肿瘤负荷的最佳减少是关键的。机制研究为这些观察结果提供基本原理，发现与使用缺乏Tn抗原的化合物2相比较，用化合物1免疫接种导致略微更高滴度的抗体，其是明显更有裂解性的。通过用光散射测量补充的NMR的构象研究已指出MUC1的去糖基化导致更少延伸和更加球状的结构。使用MUC1相关O-糖肽的相似研究已显示碳水化合物部分发挥构象效应，这可以提供免疫应答中的差异的基本原理。此外，糖基化1的使用导致CTL的有效激活，该CTL能够识别糖基化和未糖基化的结构，其中前面一种是优选的。另一方面，用非糖基化化合物2免疫接种导致主要识别非糖基化结构的CTL。已知在MUC1串联重复上的短O联聚糖例如Tn和STn在MHC II类途径中的DC加工过程中保持完整，因此有可能引发糖肽选择性CTL应答。此外，存在与相应非糖基化肽相比较，MUC1糖肽可以更强烈地结合MHC I类小鼠等位基因H2Kb的证据。此外，癌的进展不仅与具有截短糖例如Tn抗原的MUC1修饰相关，而且这些结构还以高得多的密度存在，因此有效免疫治疗需要引发针对此类结构的应答。
实验部分
用于自动化固相肽合成(SPPS)的一般方法：使用Nα-Fmoc保护的氨基酸和2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)/1-羟基苯并三唑(HOBt)作为激活试剂，通过建立的方案在配备UV检测器的Applied Biosystems，ABI 433A肽合成仪上合成肽。单个偶联步骤用条件性加帽执行。
用于天然化学连接的脂质体制备的一般方法：制备含有2 mM三(2-羧乙基)膦(TCEP)和0.3% EDTA的pH 7.8 200 mM磷酸钠缓冲液。将缓冲液脱气1小时。将含半胱氨酸肽(1当量)、硫酯(2当量)和十二烷基磷酸胆碱(dodecylposphocholine)(13当量)溶解于1:1CHCl3:三氟乙醇中，去除溶剂。随后将脂质/肽薄膜在恒温箱中在41℃水合4小时。将混合物超声处理，将肽/脂质悬液在50℃通过1.0 μm聚碳酸酯膜(Whatman，Nucleopore，Track-Etch Membrane)挤出，以获得均匀囊泡。
糖基化三组分疫苗候选物1的合成：将肽硫酯X (1.1 mg，0.674 μmol)、肽X (1.0mg，0.337 μmol)和十二烷基磷酸胆碱(1.5 mg，4.38 μmol)溶解于1:1 CHCl3：三氟乙醇的混合物(5 mL)中。将溶剂在减压下去除，以给出脂质/肽薄膜。使用含有2 mM TCEP和0.3%EDTA的200 mM磷酸钠缓冲液，将脂质/肽薄膜在41℃水合4小时。将混合物超声处理，将肽/脂质悬液在50℃通过1.0 μm聚碳酸酯膜(Whatman，Nucleopore，Track-Etch Membrane)挤出，以获得均匀囊泡。向囊泡悬液中加入2-巯基乙磺酸钠(1 mM)，以起始反应(1.5 mM最终肽浓度)。在20分钟后，使用经过40分钟时期的0-100% B的A溶液梯度，通过在分析型C-4反相柱上的RP-HPLC纯化反应混合物。合适流分的冻干提供1 (1.2 mg，80%)。C217H367N45O53S2HR MALDI-ToF MS：观察到的；计算的4515.685 [M+]。
用于免疫接种的脂质体制备的一般方法：通过合成化合物、卵磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油和胆固醇的薄膜在含有NaCl (145 mM)的HEPES缓冲液(10 mM，pH 7.4)中的水合和随后的经由0.1 µm Nucleopore®聚碳酸酯膜的挤出，将每种糖脂肽掺入基于磷脂的小型单层囊泡(SUV)内。
免疫接种：用三组分疫苗构建体(25 μg，含有3 μg碳水化合物)的脂质体制剂和缺乏肿瘤相关MUC1表位的各自对照，将表达人MUC1的8到12周龄MUC1.Tg小鼠(C57BL/6；H-2b)以每两周一次的间隔在尾的底部皮内免疫接种三次。在35天后，将小鼠用表达MUC1和Tn的MMT乳房肿瘤细胞(1×106个细胞)攻击。在第42天时，在肿瘤细胞注射后一周，给予再一次免疫接种。在第49天时，在最后一次免疫接种后一周，将小鼠处死，并且测定疫苗的功效。
肿瘤触诊：在第三次免疫接种后7天，用在100 µL PBS中的1×106个癌细胞在左胁中皮下注射MUC1.Tg小鼠。通过测径器测量可触知肿瘤，并且根据下式计算肿瘤重量：克=[(长度)X(宽度)2]/ 2，其中长度和宽度以厘米测量。在终点时，将肿瘤手术切除并测量肿瘤重量。
51铬(Cr)释放测定：使用以100:1比的作为效应细胞的无任何体外刺激的来自TDLN的CD8+ T细胞和作为靶细胞的用各自肽脉冲的51Cr标记的DC，通过标准51Cr释放方法持续6小时而测定细胞裂解活性。在与效应物一起温育前，将靶细胞用100 µCi 51Cr (AmershamBiosciences)/106个靶细胞载装2小时。使用Topcount Microscintillation Counter(Packard Biosciences)测定放射性51Cr释放，并且计算特异性裂解：(实验cpms – 自发cpms/完全cpms – 自发cpms)x 100。自发裂解是总裂解的<15%。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的测定：将肿瘤细胞(Yac-MUC1或C57mg.MUC1)用100 µCi 51Cr在37℃标记2小时，洗涤并与5 µg/mL的对照抗体(小鼠IgG)或得自疫苗接种小鼠的血清(25个稀释度中的1个)一起在37℃温育30分钟。具有高表达的CD16受体的NK细胞(KY-1克隆，来自Dr. Wayne M. Yokoyama，Washington University，St.Louis的慷慨赠品)用作效应物。在测定前这些细胞用IL-2 (200单位/mL)刺激24小时。以50:1的效应物:靶细胞比，将效应细胞与抗体标记的肿瘤细胞一起接种于96孔培养板(Costar高结合板)中4小时。通过Top Count测定在上清液中的51Cr释放。将51Cr的自发释放和最大释放测定，并低于20%。测定特异性释放的百分比：(释放-自发释放/最大释放-自发释放)x100。
IFN-γ ELISPOT测定：在处死时，从处理的MUC1.Tg小鼠中分离来自TDLN的MAC分选的CD4+和CD8+ T细胞，并且在IFN-γ ELISPOT测定中用作应答者。通过ZellNetConsulting，Inc.(Fort Lee，NJ)，使用计算机辅助的视频图像分析测定斑点数目。来自用Concavalin A刺激的C57BL/6小鼠的脾细胞用作阳性对照。
血清学测定：如先前描述的(Buskas等人，2004，Chemistry，10(14):3517-24)，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测定抗MUC-1 IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM抗体滴度。简言之，将ELISA板(Thermo Electron Corp.)用通过马来酰亚胺接头缀合至BSA的MUC-1糖肽缀合物(BSA-MI-MUC-1)包被。允许血清的系列稀释液结合固定的MUC-1。通过加入磷酸酯缀合的抗小鼠IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.)、IgG1 (Zymed)、IgG2a(Zymed)、IgG2b (Zymed)、IgG3 (BD Biosciences Pharmingen)、或IgM (JacksonImmunoResearch Laboratories Inc.)抗体完成检测。在加入对硝基苯基磷酸酯(Sigma)后，使用微板读数器(BMG Labtech)在405 nm处测量吸光度，其中波长校正设在490 nm处。如下测定针对T (脊髓灰质炎)表位的抗体滴度。使Reacti-bind NeutrAvidin包被和预封闭的板(Pierce)与生物素标记的T表位(10 µg/mL；100 μL/孔)一起温育2小时。接下来，允许血清的系列稀释液结合固定的T表位。如上所述完成检测。抗体滴度定义为获得相对于正常对照小鼠血清光密度为0.1或更大的最高稀释度。
抑制ELISA：为了探究相应糖肽、肽和糖对MAb与MUC(Tn)的结合的竞争性抑制，将血清样品以这样的方式在稀释缓冲液中稀释，所述方式使得在没有抑制剂的情况下，预期的最终光密度值是约1。对于每个孔，将60 µL稀释的血清样品在未包被的微量滴定板中与60 µL稀释缓冲液、以0-500 µM的终浓度溶于稀释缓冲液中的糖肽6 (MUC(Tn))、肽7 (未糖基化的MUC1)或Tn-单体混合。在室温温育30分钟后，将100 µl混合物转移至由BSA-MI-MUC1(Tn)包被的板。对于总IgG使用碱性磷酸酶缀合的检测抗体，如上所述将微量滴定板温育并显色。将光密度值针对用单独的单克隆抗体(0 µM抑制剂，100%)获得的光密度值标准化。
树突状细胞(DC)制备：如先前描述的(Inaba等人，1992，J Exp Med；176(6):1693-702和Mukherjee，2003，J Immunother；26:47-62)，由小鼠骨髓培养物制备DC。
细胞因子测定：在暴露测定当天时，将成熟DC作为4×106个细胞/孔以1.8 mL在24孔组织培养板中铺板。随后将细胞与不同刺激物(200 μL，10X)一起在2 mL/孔的最终体积中温育24小时。刺激物以广泛的浓度范围(对于脂质体中的1、5或6，对应于0.1 ng/mL-100µg/mL PAM3CysSK4的终浓度，和对于大肠杆菌LPS，对应于0.001 ng/mL-10 µg/mL的终浓度)给予。收集上清液。对于ATP对IL-1β分泌的作用的评价，将DC在相同体积的含有ATP (5 mM；Sigma)的培养基中再温育30分钟，这之后收获上清液。将所有收集的培养上清液冷冻(负80℃)贮存。
细胞因子ELISA在96孔MaxiSorp板(Nalge Nunc International)中执行。根据制造商的说明书，将细胞因子DuoSet ELISA Development试剂盒(R&D Systems)用于小鼠TNF-α、RANTES、IL-6、IL-1β、IL-10、IP-10、IL-12 p70和IL-12/23 p40的细胞因子定量。使用微板读数器(BMG Labtech)，在450 nm处测量吸光度，其中波长校正设至540 nm。如下测定在培养上清液中的小鼠IFN-β浓度。将板用针对小鼠IFN-β的兔多克隆抗体(PBLBiomedical Laboratories)包被。允许在标准品(PBL Biomedical Laboratories)和样品中的IFN-β结合固定化抗体。随后加入大鼠抗小鼠IFN-β抗体(USBiological)。接下来，加入HRP缀合的山羊抗大鼠IgG (H+L)抗体(Pierce)和HRP的生色底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(Pierce)。在反应停止后，在450 nm处测量吸光度，其中波长校正设至540 nm。细胞因子值表示为pg细胞因子/mL。在Prism (GraphPad Software，Inc.)中使用非线性最小二乘法曲线拟合分析浓度-应答数据。用下述四参数逻辑斯谛方程拟合这些数据：Y = Emax /(1 +(EC50/X)Hill斜率)，其中Y是细胞因子应答，X是刺激物的浓度，Emax是最大应答(坪值)，并且EC50是产生50%刺激的刺激物浓度。Hill斜率设为1，以能够比较不同诱导物的EC50值。
统计分析：使用单向方差分析(ANOVA)与Bonferroni多重比较检验执行多重比较。当P <0.05时，差异视为显著的。对于在两个组之间的比较，使用双尾斯氏t检验与95%置信区间分析数据。P-值 <0.05视为统计上显著的。
实施例9
第二种TLR激动剂的添加
这个实施例测定第二种TLR激动剂CpG的添加对免疫接种的有效性的作用。遵循实施例8中更详细地描述的程序，将表达人MUC1的老年MUC1.Tg小鼠(C57BL/6；H-2b)用下述物质的制剂免疫接种：化合物2 (Pam3CysSK4-T辅助细胞表位(脊髓灰质炎)- MUC1(未糖基化的))；化合物1 (Pam3CysSK4-T辅助细胞表位(脊髓灰质炎)- MUC1(Tn))；化合物1加上CpG(CpG 寡脱氧核苷酸(CpG ODN)))；化合物5 (Pam3CysSK4)加上化合物4 (T辅助细胞表位(脊髓灰质炎)- MUC1(Tn))；化合物5；化合物3 (Pam3CysSK4-T辅助细胞表位(脊髓灰质炎))；化合物3加上CpG；EL (空脂质体)加上CpG；或EL。化合物1、2、3、4和5的结构显示于图16中。使用标准免疫接种时间表，将化合物与TLR9激动剂CpG一起共施用。如图23-25中所示，TLR9配体CpG的组合的施用进一步改善三组分疫苗1的抗肿瘤性质。具体地，第二种激动剂的添加导致肿瘤重量的显著的进一步减少(图23)，并诱导更有效的免疫应答(图24和25)。
实施例10
在具有MMT肿瘤的MUC1.Tg小鼠中，三组分MUC1糖肽疫苗诱导体液和细胞免疫应答两者
用于癌症的有效免疫治疗取决于针对肿瘤抗原的细胞和体液免疫应答两者。在乳腺癌上以增加水平表达的MUC1也显示出改变的糖基化，其促成新抗原的形成。衍生自肿瘤相关MUC1的MHC I和II类结合肽的鉴定已促进基于MUC1的癌症疫苗的开发。当随着用佐剂进行的乳化给予时，来自MUC1串联重复的MHC I类结合表位导致强细胞应答，而无抗体应答。有可能的是，使用个体对于其可能更不耐受的更加代表如癌症所见到的新形式MUC1的糖肽，获得更佳的免疫原性，以及疫苗组分的直接连接会导致比将其作为混合物递送更佳的免疫应答。这个实施例显示由TLR2激动剂、辅助表位和T细胞表位(其也是衍生自MUC1的B细胞表位)组成的三组分疫苗，可以破坏耐受且引发体液和细胞免疫应答两者。与仅用佐剂和空脂质体处理的小鼠相比较，用MUC1糖肽疫苗免疫接种导致肿瘤负荷的显著减少。三组分疫苗激活MUC1糖肽特异性细胞毒性CD8+ T细胞，并且引发强滴度的介导通过ADCC裂解有关肿瘤细胞的IgG抗体。
用三组分疫苗化合物1 (Pam3CysSK4-T辅助细胞-MUC1)和LAA-T辅助细胞-MUC1(其含有免疫沉默脂质)和作为对照的化合物2 ((Pam3CysSK4-T辅助细胞)和LAA-T辅助细胞(这两者都缺乏肿瘤相关MUC1表位)的脂质体制剂，将表达人MUC1的MUC1.Tg小鼠(C57BL/6；H-2b)以每两周一次的间隔免疫接种三次。化合物的结构显示于图26中。在35天后，将小鼠用表达MUC1和Tn的MMT乳房肿瘤细胞攻击。免疫接种时间表显示于图27中。在最后一次免疫接种后三周，将小鼠处死，并且通过肿瘤负荷、细胞介导的免疫应答和抗体介导的免疫应答测定疫苗的功效。与LAA-T辅助细胞-MUC1(缺乏TLR2激动剂的化合物)和各自的对照化合物2(TLR2激动剂–T辅助细胞表位)和空脂质体相比较，用三组分糖基化疫苗化合物1免疫接种导致肿瘤质量的显著减少(参见图28)。三组分糖基化疫苗化合物1引发强滴度的介导通过ADCC裂解有关肿瘤细胞的IgG抗体(参见图30和31)。如通过铬释放测定所测定的，来自免疫接种的荷有MMT肿瘤的小鼠的经分选CD8+ T细胞的裂解潜力显示：与各自的对照化合物2((Pam3CysSK4-T辅助细胞)和EL以及缺乏TLR2配体的LAA-T辅助细胞-MUC1化合物相比较，用三组分糖基化疫苗免疫接种显示显著更大的裂解(参见图29)。这是引发细胞和体液应答两者的首个疫苗制剂。
实施例11
利用人MUC1 T辅助细胞序列的合成三组分构建体
对于I-Ab、H2-Kb和H2-Db结合表位的预测，主要查询Rankpe (Harvard，MA)位置特异性计分矩阵(Position Specific Scoring Matrices, PSSM)程序。逆向查询第二种程序SYPEITHI (Institute for Cell Biology，Heidelberg，德国)，以交叉验证H2-Kb和H2-Db结合表位。图32展示关于人MUC1衍生肽与小鼠I-Ab 15聚体以及H2-Db和H2-Kb 9聚体的结合的分析。许多鼓舞人心的预测是明显的。虚线显示了显示关于与I-Ab结合的RANKPEP得分的15聚体。指定了显示关于与H2-D b(dddd)或H2-Kb (kkkk)的结合或与两种(bbbb)的非种系选择性结合的RANKPEP得分的9聚体。
针对对CD4和CD8细胞的干扰素γ产生的诱导，测试通过这种分析鉴定的化合物。将小鼠用图33A中所述的肽免疫接种，并且通过细胞分选获得表达低水平CD62L的淋巴结衍生的T细胞，并且在用免疫接种肽脉冲的DC的存在下培养14天。在暴露用y轴上所列出的肽脉冲的DC后，就CD4+IFNγ+和CD8+IFNγ+ T细胞的存在情况通过细胞内细胞因子分析所得到的细胞(图33B)。用糖基化21聚体(肽C)免疫接种引发针对它自己以及非糖基化15聚体(肽A)和21聚体(肽B)的强特异性CD4+和CD8+应答。
已产生了利用图34中所示的人MUC1 T辅助细胞序列的多种合成构建体。遵循实施例8-10中更详细地描述的程序，将表达人MUC1的MUC1.Tg小鼠(C57BL/6；H-2 b)用图33和34中所示的构建体免疫接种。遵循实施例8-10中更详细地描述的程序，测定构建体在减少肿瘤重量、引发IgG抗体、介导通过ADCC裂解肿瘤细胞、引发CD8+细胞毒性活性和产生IFN-γ及其他细胞因子方面的有效性。
实施例12
通过使用完全合成的三组分免疫原产生的针对碳水化合物和糖肽的单克隆抗体
糖缀合物是在自然界中在功能和结构上最多样的分子，并且目前充分确定蛋白质和脂质结合的糖在影响真核生物学和疾病的许多分子过程中起基本作用。此类过程的例子包括受精、胚胎发生、神经元发育、激素活性、细胞增殖及其组构成特定组织。细胞-表面碳水化合物中的显著变化随着肿瘤进展出现，这看起来与转移密切相关。此外，碳水化合物能够诱导保护性抗体应答，这种免疫反应是生物在感染过程中存活的主要贡献者。
糖不能激活辅助T淋巴细胞已使其作为疫苗的开发变复杂。对于大多数免疫原(包括碳水化合物)，抗体产生依赖于两类淋巴细胞B细胞和辅助T细胞的协同相互作用(Jennings，Neoglyconjugates：Preparation and Applications 325-371(AcademicPress，Inc.，1994)；Kuberan，Curr. Org. Chem. 2000，4，653-677)。糖单独不能激活辅助T细胞，因此具有有限的免疫原性，如通过低亲和力IgM抗体和IgG抗体的不存在所体现的。为了克服碳水化合物的T细胞独立性质，过去研究已集中于糖与外源载体蛋白质(例如匙孔血蓝蛋白(KLH)、去毒破伤风类毒素)的缀合(Jennings，Neoglyconjugates：Preparation andApplications 325-371(Academic Press，Inc.，1994)；Kuberan，Curr. Org. Chem. 2000，4，653-677；Jones，An. Acad. Bras. Cienc. 2005，77，293-324)。在这种方法中，载体蛋白质增强碳水化合物向免疫系统的呈递，并提供可以激活T辅助细胞的T表位(12-15个氨基酸的肽片段)。因此，完成从低亲和力IgM到高亲和力IgG抗体的类别转换。这种方法已成功地应用于开发缀合物疫苗，以预防流感嗜血菌感染。
由更苛求的碳水化合物抗原例如肿瘤相关碳水化合物和糖肽组成的碳水化合物-蛋白质缀合物候选疫苗未能引发高滴度的IgG抗体。这些结果并不令人惊讶，因为肿瘤相关糖具有低抗原性，因为它们是自身抗原，因而被免疫系统耐受。通过生长中的肿瘤的抗原脱落加固这种耐受性。此外，外源载体蛋白质例如KLH和BSA和将糖连接至载体蛋白质的接头可以引发强B细胞应答，这可以导致针对碳水化合物表位的抗体应答的抑制(Buskas，Chem.Eur. J. 2004，10，3517-3524；Ni，Bioconjug. Chem. 2006，17，493-500)。明确的是，基于碳水化合物的癌症疫苗的成功开发需要用于向免疫系统更有效呈递肿瘤相关碳水化合物表位，导致更有效的向IgG抗体的类别转换的新策略(Reichel，Chem. Commun. 1997，21，2087-2088；Alexander，J. Immunol. 2000，164，1625-1633；Kudryashov，Proc. Natl.Acad. Sci. U.S.A. 2001，98，3264-3269；Lo-Man，J. Immunol. 2001，166，2849-2854；Jiang，Curr. Med. Chem. 2003，10，1423-1439；Jackson，Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 2004，101，15440-5；Lo-Man，Cancer Res. 2004，64，4987-4994；Buskas，Angew.Chem. Int. Ed. 2005，44，5985-5988(实施例I)；Dziadek，Angew. Chem. Int. Ed. 2005，44，7624-7630；Krikorian，Bioconjug. Chem. 2005，16，812-819；Pan，J. Med. Chem.2005，48，875-883)。
如先前实施例中所示，由TLR2激动剂、非种系选择性肽T辅助细胞表位和肿瘤相关糖肽组成的三组分疫苗，可以在小鼠中引发特别高滴度的IgG抗体，其可以识别表达肿瘤相关碳水化合物的癌细胞(参见化合物21，图5，实施例6和化合物51，图15)(Ingale，Nat.Chem. Biol. 2007，3，663-667)。疫苗候选物的优良性质归因于细胞因子的局部产生、共刺激蛋白质的上调、通过巨噬细胞和树突状细胞的摄取增强和表位抑制的避免。
本发明的三组分免疫原技术可用于生成针对弱抗原性碳水化合物和糖肽的单克隆抗体(MAb)。我们起初已集中于针对β-N-乙酰葡糖胺(β-O-GlcNAc)修饰肽的MAb (Wells，Science 2001，291，2376-2378；Whelan，Methods Enzymol. 2006，415，113-133；Zachara，Biochim. Biophys. Acta，2006，1761，599-617；Dias和Hart，Mol. Biosyst. 2007，3，766-772；Hart，Nature 2007，446，1017-1022；Lefebvre，Exp. Rev. Proteomics 2005，2，265-275)。后生动物中的众多核和细胞质蛋白质是在Ser和Thr残基上通过单糖β-O-GlcNAc修饰的。响应细胞外刺激的在O-GlcNAc水平上的快速和动态变化暗示O-GlcNAc在信号转导途径中的关键作用。O-GlcNAc水平的调节对细胞功能具有显著作用，这部分地通过在O-GlcNAc和O-磷酸酯之间的复杂相互影响介导。近来，O-GlcNAc已牵涉II型糖尿病的病因学、应激反应途径的调节和蛋白酶体的调节。这个令人兴奋的研究领域中的进展被试剂例如合适MAbs的缺乏严重阻碍。在这方面，仅一种具有相对广泛特异性的差性能IgM MAb (Comer，Anal.Biochem. 2001，293，169-177)是商购可得的(Covance Research Products Inc)。
我们已设计并合成化合物52 (图15)，其含有衍生自酪蛋白激酶II (CKII)的β-GlcNAc修饰的糖肽(Kreppel，J. Biol. Chem. 1999，274，32015-32022)作为B表位、衍生自脊髓灰质炎病毒的充分证明的鼠MHC II类限制性辅助T细胞表位KLFAVWKITYKDT (SEQ IDNO:3)、和嵌入佐剂Pam3CysSK4。此外，制备了具有人工的硫连接的GlcNAc部分的化合物53，预期其具有更佳的代谢稳定性。通过合成化合物、卵磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油和胆固醇的薄膜在含有NaCl (145 mM)的HEPES缓冲液(10 mM，pH 6.5)中的水合和随后的经由100 nmNucleopore®聚碳酸酯膜的挤出，将化合物52和53掺入基于磷脂的小型单层囊泡(SUV)内。用含有3 μg糖的脂质体，将五只雌性BALB/c小鼠的组以每周一次间隔腹膜内免疫接种四次。
通过用缀合至马来酰亚胺(MI)修饰的BSA的CGSTPVS(β-O-GlcNAc)SANM包被微量滴定板，测定抗糖肽抗体滴度，然后用由碱性磷酸酶标记的抗小鼠IgG抗体实现检测。如表10中可见，化合物52和53引发极佳滴度的抗MUC1 IgG抗体。此外，在O联和S联糖衍生物之间未观察到滴度的显著差异。
表10. 在用两种不同制剂的4次免疫接种后的ELISA抗GSTPVS(β-O-GlcNAc)SANM(68)滴度a
a抗GSTPVS(β-O-GlcNAc)SANM (68)抗体滴度作为五只小鼠的组的平均值呈现。将ELISA板用BSA-MI-GSTPVS(β-O-GlcNAc)SANM(BSA-MI-66)缀合物包被，并且通过线性回归分析，标绘与吸光度比较的稀释度来测定滴度。滴度定义为获得相对于正常对照小鼠血清光密度为0.1或更大的最高稀释度。
b 采用脂质体制剂。
c O-GlcNAc 52；Pam3CysSK4G-C-KLFAVWKITYKDT-G-GSTPVS(β-O-GluNAc)SANM。
d S-GlcNAc 53；Pam3CysSK4G-C-KLFAVWKITYKDT-G-GSTPVS(β-S-GluNAc)SANM。
对于IgM滴度，在52与53之间观察到统计上显著的差异(P = 0.0327)。
关于总IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM的个别滴度在图36中报道。
接下来，收获用O联糖脂肽52免疫接种的两只小鼠的脾脏，标准杂交瘤培养技术给出七个IgG1、七个IgG2a、两个IgG2b和十四个IgG3产生杂交瘤细胞系。使用ELISA和抑制ELISA研究所得到的MAb的配体特异性。所有MAb都识别连接至BSA的CGSTPVS(β-O-GlcNAc)SANM，而仅少数识别缀合至BSA的肽CGSTPVSSANM (SEQ ID NO:12)。此外，十九种MAb与BSA-MI-CGSTPVS(β-O-GlcNAc)SANM的相互作用可被糖肽GSTPVS(β-O-GlcNAc)SANM抑制。
如WO 2010/002478(“Glycopeptide and Uses Thereof”)中更详细地描述的，杂交瘤细胞系1F5.D6、9D1.E4和18B10.C7于2008年7月1日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 University Blvd.，Manassas，VA，20110-2209，USA，并且分别指定ATCC保藏号PTA-9339、PTA-9340和PTA-9341。然而，应当理解本文的书面说明书视为足以致使本领域技术人员能够完全实践本发明。此外，保藏实施方案预期作为本发明的一个方面的单个举例说明，并且不应解释为以任何方式限制权利要求的范围。
遵循相似程序，可以制备对于本文描述的任何MUC1构建体具有特异性的多克隆和单克隆抗体。
实施例13
使用新的合成免疫原生成O-GlcNAc特异性单克隆抗体
使完全合成的三组分免疫原与杂交瘤技术组合导致具有广谱结合靶的O-GlcNAc特异性IgG MAb的生成。大规模鸟枪蛋白质组学导致鉴定254种哺乳动物O-GlcNAc修饰的蛋白质，包括大量新糖蛋白。该数据暗示O-GlcNAc在转录/翻译调节、信号转导、遍在蛋白途径、细胞内囊泡的顺行运输和翻译后修饰中的作用。
核和细胞质蛋白质的丝氨酸和苏氨酸通过单个β-N-乙酰基-D-葡糖胺部分(β-GlcNAc)的O糖基化是遍在的翻译后修饰，其是高度动态的并通过循环酶O联GlcNAc转移酶(OGT)和O-GlcNAcase(OGA)的作用响应细胞刺激而波动。这类糖基化已牵涉许多细胞过程，这通常经由与可在相同氨基酸残基上出现的磷酸化的相互影响而进行。重要的是，O-GlcNAc水平的改变已与流行的人疾病(包括II型糖尿病和阿尔茨海默氏病)的病因学关连(Hart等人，2007 Nature 446，1017-1022)。
与对于其可获得广泛范围的泛特异性和位点特异性磷酸-抗体的磷酸化不同，O-GlcNAc修饰的研究被缺乏用于其检测、定量和位点定位的有效工具阻碍。特别地，仅两种泛-O-GlcNAc特异性抗体已得到描述：IgM泛-O-GlcNAc抗体(CTD 110.6；Comer等人，2001Anal. Biochem. 293，169-177)、和针对O-GlcNAc修饰的核孔组分产生的IgG抗体(RL-2；Snow等人，1987 J. Cell Biol. 104，1143-1156)，该IgG抗体显示与O-GlcNAc修饰的蛋白质的受限交叉反应性。事实上，多个研究已显示O-GlcNAc修饰的糖缀合物不引发有关IgG同种型抗体，因此引发O-GlcNAc特异性IgG抗体的挑战是相当大的。我们推论O-GlcNAc特异性抗体可以通过采用三组分免疫原(化合物52，图 35)引发，所述三组分免疫原由在这个研究中衍生自酪氨酸激酶II (CKII) α亚基的含O-GlcNAc肽(Kreppel和Hart，1999 J. Biol.Chem. 274，32015-32022)、充分证明的鼠MHC II类限制性辅助T细胞表位和作为嵌入佐剂的Toll样受体-2 (TLR2)激动剂组成。此类化合物预期避免由典型缀合物疫苗的载体蛋白质或接头区引起的免疫抑制；然而，它含有引发强烈和相关IgG免疫应答所需的所有介质(Ingale等人，2007 Nat. Chem. Biol. 3，663-667)。此外，制备了具有人工的硫连接的GlcNAc部分的化合物53，与其O联配对物相比较，所述部分具有改善的代谢稳定性，从而提供引发O-GlcNAc特异性抗体的另外机会。
通过脂质体介导的C末端脂肽硫酯63分别与糖肽64和65的天然化学连接(Ingale等人，2006 Org. Lett. 8，5785-5788)，容易地获得化合物52和53 (图35)。起始硫酯63在磺酰胺“保险栓(safety-catch)”接头上装配，接着通过用碘乙腈烷基化而释放和用苄硫醇处理，以给出使用标准条件脱保护的化合物。分别采用Rink酰胺树脂、Fmoc保护的氨基酸和Fmoc-Ser-(AcO3-α-D-GluNAc)或Fmoc-Ser-(1-硫代-AcO3-α-D-GluNAc)制备化合物64和65。在装配完成后，通过用60%肼的MeOH溶液处理来裂解乙酰酯，并且通过用试剂K处理从树脂中裂解所得到的化合物，然后通过反相HPLC纯化。将化合物52和53掺入基于磷脂的小型单层囊泡(SUV)内，接着通过100 nm Nuclepore®聚碳酸酯膜挤出。将五只雌性BALB/c小鼠的组用含有3 μg糖的脂质体以两周一次的间隔腹膜内免疫接种四次。通过用缀合至马来酰亚胺(MI)修饰的BSA的CGSTPVS(β-O-GlcNAc)SANM (66)包被微量滴定板，测定抗糖肽抗体滴度，并且用由碱性磷酸酶标记的抗小鼠IgG抗体完成检测。化合物52和53引发极佳滴度的IgG抗体(表10；图36)。此外，在O联和S联糖衍生物之间未观察到IgG滴度的显著差异，因此进一步的关注集中于用52免疫接种的小鼠。
收获用52免疫接种的两只小鼠的脾脏，标准杂交瘤培养技术给出七个IgG1、七个IgG2a、两个IgG2b和十四个IgG3产生杂交瘤细胞系。通过ELISA研究所得到的MAb的配体特异性。所有MAb都识别连接至BSA的CGSTPVS(β-O-GlcNAc)SANM (BSA-MI-66)，而仅少数识别缀合至BSA的肽CGSTPVSSANM (SEQ ID NO:12) (BSA-MI-67)。此外，二十种MAb的相互作用可被糖肽GSTPVS(β-O-GlcNAc)SANM (68)抑制，但不能被肽GSTPVSSANM (SEQ ID NO：13)(69)或 -O-GlcNAc-Ser (70)抑制，这证实糖肽特异性。
将三种杂交瘤(18B10.C7(3)、9D1.E4(10)、1F5.D6(14))以一升规模培养，通过饱和硫酸铵沉淀和随后的蛋白G柱层析纯化所得到的抗体，以在每种情况下获得约10 mg的IgG。抑制ELISA证实MAb需要碳水化合物和肽(糖肽)用于结合。
总之，三组分免疫原方法已成功地用于生成泛GlcNAc特异性MAb的实验对象组，其提供用于探究这类蛋白质糖基化的生物学牵涉的有力新工具。新近鉴定的O-GlcNAc修饰的蛋白质打开了探究这类翻译后修饰对于多种生物过程的重要性的新途径。预期三组分免疫接种技术在用于生成针对其他形式的蛋白质糖基化的MAb方面具有广泛应用。
方法
用于合成的试剂和一般程序。Fmoc-L-氨基酸衍生物和树脂购自NovaBioChem和Applied Biosystems，肽合成级别的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)购自EM Science，N-甲基吡咯烷酮(NMP)购自Applied Biosystems。卵磷脂酰胆碱(PC)、卵磷脂酰甘油(PG)、胆固醇(Chol)、单磷酰脂质A (MPL-A)和十二烷基磷酸胆碱(DPC)得自Avanti Polar Lipids。所有其他化学试剂购自Aldrich、Acros、Alfa Aesar和Fisher，且无需进一步纯化而使用。采用的所有溶剂都具有试剂级别。使用以1 ml分钟-1流速的Agilent ZorbaxEclipseTM C8分析柱(5 μm，4.6 x 150 mm)、以3 ml分钟-1流速的Agilent Zorbax EclipseTM C8半制备型柱(5 μm，10 x 250 mm)、或以2 ml分钟-1流速的Phenomenex JupiterTM C4半制备型柱(5 μm，10 x 250 mm)，在配备自动注射器、流分收集器和UV检测器(在214 nm处检测)的Agilent1100系列系统上执行反相高效液相层析(RP-HPLC)。所有运行都使用经过40分钟的0-100%溶剂B的线性梯度(溶剂A = 5%乙腈，0.1%三氟乙酸(TFA)的水溶液，溶剂B = 5%水，0.1%TFA的乙腈溶液)执行。在ABI 4700蛋白质组学分析仪上记录基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF)质谱。
用于固相肽合成(SPPS)的一般方法：使用N α-Fmoc保护的氨基酸和2-(1H-苯并三唑-1-基)-氧基-1,1,3,3-四乙基六氟磷酸盐(HBTU)/1-羟基苯并三唑(HOBt；Knorr等人，1989 Tetrahedron Lett. 30，1927-1930)作为激活试剂，通过建立的方案在配备UV检测器的ABI 433A肽合成仪(Applied Biosystems)上合成肽。单个偶联步骤用条件性加帽执行。使用下述受保护的氨基酸：N o-Fmoc-Arg(Pbf)-OH、N α-Fmoc-Asp(O t Bu)-OH、N α-Fmoc-Asp-Thr(ΨMe,Mepro)-OH、N α-Fmoc-Ile-Thr(ΨMe,Mepro)-OH、N α-Fmoc-Lys(Boc)-OH、N α-Fmoc-Ser( t Bu)-OH、N α-Fmoc-Thr( t Bu)-OH、N α-Fmoc-Tyr( t Bu)-OH。使用O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)/1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)作为偶联剂，手工执行糖基化氨基酸N α-FmocSer-(AcO3-α-D-O-GlcNAc)OH、N α-FmocSer-(AcO3-α-D-S-GlcNAc)OH的偶联。使用苯并三唑-1-基-氧基-三吡咯烷子基-磷六氟磷酸盐(PyBOP)/HOBt作为偶联剂，执行N α-Fmoc-S-(2,3-双(棕榈酰氧基)-(2R-丙基)-(R)-半胱氨酸(Metzger等人，1991 Int. J. Pept. Protein Res. 38，545-554；Roth等人，2004Bioconjugate Chem. 15，541-553)(其由(R)-缩水甘油制备)的偶联。通过标准Kaiser测试监控手工偶联的进展(Kaiser等人，1970 Anal. Biochem. 34，595)。
脂肽63的合成：如在用于肽合成的一般方法部分中所述的，63的合成在H-Gly-氨磺酰丁酰Novasyn TG树脂上执行。在前五个氨基酸的偶联后，手工执行剩余步骤。将N-α-Fmoc-S-(2,3-双(棕榈酰氧基)-(2R-丙基)-(R)-半胱氨酸(267 mg，0.3 mmol)溶解于DMF(5mL)中，将PyBOP(156.12 mg，0.3 mmol)、HOBt(40 mg，0.3 mmol)和DIPEA(67 μl，0.4 mmol)预混合2分钟，然后加入树脂中。通过Kaiser测试监控偶联反应，并且在静置12小时后完成。在偶联完成后，使用20%哌啶的DMF(6 mL)溶液裂解N-Fmoc基团，并且使用PyBOP(156.12mg，0.3 mmol)、HOBt(40 mg，0.3 mmol)和DIPEA(67 μl，0.4 mmol)的DMF溶液，使棕榈酸(77mg，0.3 mmol)与如上所述的游离胺偶联。将树脂用DMF(10 ml)、DCM(10 ml)和MeOH(10 ml)充分洗涤，随后在真空中干燥。将树脂在DCM(5 mL)中溶胀1小时，并且用DIPEA(0.5 ml，3mmol)、碘乙腈(0.36 ml，5 mmol)的NMP(6 ml)溶液处理。重要的是要注意到，在加入树脂之前，通过碱性矾土的塞来过滤碘乙腈。将树脂避光搅动24小时，过滤并用NMP(5 ml x 4)、DCM(5 ml x 4)和THF(5 ml x 4)洗涤。将激活的N-酰基磺酰胺树脂在DCM(5 ml)中溶胀1小时，排干并转移至50 ml圆底烧瓶。向含树脂的烧瓶中加入THF(4 ml)、苄硫醇(0.64 ml，5mmol)和苯硫酚钠(sodium thiophenate)(27 mg，0.2 mmol)。在搅动24小时后，将树脂过滤，并用己烷(5 ml x 2)洗涤。将合并的滤液和洗涤液收集并在真空中浓缩至其原始体积的约1/3。随后通过加入甲基叔丁基醚(0℃；60 mL)沉淀粗制产物，通过以3000 rpm离心15分钟回收，并且在乙醚倾析后，将肽沉淀物溶解于混合物DCM和MeOH(1.5 ml/1.5 ml)中。通过将其经过LH-20尺寸排阻柱，去除肽沉淀物中存在的硫醇杂质。收集含产物的流分并去除溶剂，以给出完全受保护的肽硫酯。将受保护的肽用试剂B(TFA 88%，苯酚5%，H2O 5%，TIS2%；5 ml)在室温处理4小时。随后将TFA溶液逐滴加入含有冰冷的甲基叔丁基醚(40 ml)的螺旋帽离心管中，并且将所得到的悬液在4℃静置过夜，这之后通过以3000 rpm(20分钟)离心收集沉淀物，并且在乙醚倾析后，将肽沉淀物重悬浮于冰冷的甲基叔丁基醚(40 ml)中，将洗涤过程重复两次。使用经过40分钟的0-100%溶剂B的A溶液的线性梯度，在半制备型C-4反相柱上通过HPLC纯化粗制肽，并且将合适流分冻干以提供63 (110 mg，65%)。C90H165N11O13S2，MALDI-ToF MS：观察到的，[M+Na] 1695.2335Da；计算的，[M+Na]1695.4714Da(图39)。
糖脂肽64的合成：如在一般程序中所述的，在Rink酰胺树脂(0.1 mmol)上执行SPPS。前四个氨基酸Ser-Ala-Asn-Met使用标准方案在肽合成仪上偶联。在合成完成后，使用Nα-FmocSer-(AcO3-α-D-O-GlcNAc)OH(0.2 mmol，131 mg)与O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU；0.2 mmol，76 mg)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt；0.2 mmol，27 mg)和二异丙基乙胺(DIPEA；0.4 mmol，70 μl)的NMP(5 ml)溶液，执行手工偶联12小时。通过标准Kaiser测试监控偶联反应。随后将树脂用NMP(6 ml)和二氯甲烷(DCM；6 ml)洗涤，然后再经历相同偶联条件，以确保偶联完成。随后在肽合成仪上延长糖肽，这之后将树脂用NMP(6 ml)、DCM(6 ml)和MeOH(6 ml)充分洗涤，在真空中干燥。将树脂在DCM(5 ml)中溶胀1小时，随后用肼(60%)的MeOH(10 ml)溶液处理2小时，用NMP(5 ml x2)、DCM(5 ml x 2)和MeOH(5 ml x 2)充分洗涤，在真空中干燥。将树脂在DCM(5 ml)中溶胀1小时，这之后将它用试剂K(TFA(81.5%)、苯酚(5%)、茴香硫醚(5%)、水(5%)、EDT(2.5%)、TIS(1%))(30 ml)在室温处理2小时。将树脂过滤，用纯净TFA(2 ml)洗涤。随后将滤液在真空中浓缩至其原始体积的约1/3。使用二乙醚(0℃)(30 ml)沉淀肽，并且通过以3000 rpm离心15分钟回收。使用经过40分钟时期的0-100%溶剂B的溶剂A溶液的线性梯度，在半制备型C-8柱上通过RP-HPLC纯化粗制肽，将合适流分冻干以提供64 (118 mg，40%)。C129H204N32O40S2，MALDI-ToF MS：观察到的[M+]，2907.5916Da；计算的[M+]，2905.4354 Da(图40)。
糖脂肽65的合成：如在一般程序中所述的，在Rink酰胺树脂(0.1 mmol)上执行SPPS。前四个氨基酸Ser-Ala-Asn-Met使用标准方案在肽合成仪上偶联。在合成完成后，使用Nα-FmocSer-(AcO3-α-D-S-GlcNAc)OH(0.2 mmol，134 mg)与O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU；0.2 mmol，76 mg)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt；0.2 mmol，27 mg)和二异丙基乙胺(DIPEA；0.4 mmol，70 μl)的NMP(5 ml)溶液，执行手工偶联12小时。通过标准Kaiser测试监控偶联反应。随后将树脂用NMP(6 ml)和二氯甲烷(DCM；6 ml)洗涤，然后再经历相同偶联条件，以确保完全偶联。随后在肽合成仪上延长所得到的糖肽。在合成完成后，将树脂用NMP(6 ml)、DCM(6 ml)和MeOH(6 ml)充分洗涤，在真空中干燥。将树脂在DCM(5 ml)中溶胀1小时，随后用肼(60%)的MeOH(10 ml)溶液处理2小时，用NMP(5 ml x 2)、DCM(5 ml x 2)和MeOH(5 ml x 2)充分洗涤，在真空中干燥。将树脂在DCM(5 ml)中膨胀1小时，这之后将它用TFA(81.5%)、苯酚(5%)、茴香硫醚(5%)、水(5%)、EDT(2.5%)、TIS(1%)(30 ml)在室温处理2小时。将树脂过滤，并用纯净TFA(2 ml)洗涤。随后将滤液在真空中浓缩至其原始体积的约1/3。使用二乙醚(30 ml ，0℃)沉淀肽，通过以3000rpm离心15分钟回收。使用经过40分钟时期的0-100%溶剂B的溶剂A溶液的线性梯度，在半制备型C-8柱上通过RP-HPLC纯化粗制肽，将合适流分冻干以提供65 (95 mg，34%)。C129H204N32O39S3，MALDI-ToF MS：观察到的[M+]，2923.6716Da；计算的[M+]，2923.3861Da(图41)。
糖脂肽52的合成：将脂肽硫酯63 (4.3 mg，2.5 μmol)、糖肽64 (5.0 mg，1.7 μmol)和十二烷基磷酸胆碱(6.0 mg，17.0 μmol)溶解于三氟乙醇和CHCl3 (2.5 ml/2.5 ml)的混合物中。将溶剂在减压下去除，以给出脂质/肽薄膜，在三(羧乙基)膦(2% w/v，40.0 μg)和EDTA(0.1% w/v，20.0 μg)的存在下，使用200 mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5，3 ml)，将所述脂质/肽薄膜在37℃水合4小时。将混合物超声波处理1分钟。向囊泡悬液中加入2-巯基乙磺酸钠(2%w/v，40.0 μg)，以起始连接反应。在恒温箱中在37℃执行反应，并且通过MALDI-ToF定期监控反应进展，MALDI-ToF显示糖肽64在2小时内消失。随后将反应用溶于连接缓冲液(2 ml)中的2-巯基乙醇(20%)稀释，使用经过40分钟的0-100%溶剂B的A溶液线性梯度，通过半制备型C-4反相柱纯化粗制肽，合适流分的冻干提供52 (4.3 mg，57%)。C212H360N43O53S3 ，MALDI-ToF MS：观察到的，4461.9177Da，计算的，4455.578Da(图37)。
糖脂肽53的合成：将脂肽硫酯63 (2.5 mg，1.5 μmol)、糖肽65 (3.0 mg，1.0 μmol)和十二烷基磷酸胆碱(3.5 mg，10 μmol)溶解于三氟乙醇和CHCl3 (2.5 ml/2.5 ml)的混合物中。将溶剂在减压下去除，以给出脂质/肽薄膜，在三(羧乙基)膦(2%w/v，40.0 μg)和EDTA (0.1%w/v，20.0 μg)的存在下，使用200 mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5，2 ml)，将所述脂质/肽薄膜在37℃水合4小时。将混合物超声波处理1分钟。向囊泡悬液中加入2-巯基乙磺酸钠(2%w/v，40.0 μg)，以起始连接反应。在恒温箱中在37℃执行反应，并且通过MALDI-ToF定期监控反应进展，MALDI-ToF显示糖肽在2小时内消失。随后将反应用溶于连接缓冲液(2ml)中的2-巯基乙醇(20%)稀释。使用经过40分钟的0-100%溶剂B的A溶液线性梯度，通过半制备型C-4反相柱纯化粗制肽，合适流分的冻干提供53 (2.8 mg，64%)。C212H360N43O52S4 ，MALDI-ToF MS：观察到的，4469.9112Da，计算的，4471.6437Da(图38)。
化合物66-70如标准程序部分中所述地在Rink酰胺树脂(0.1 mmol)上进行制备。糖肽66 (78 mg，61 %)；C48H82N14O21S2，MALDI-ToF MS：观察到的[M+Na]，1277.4746Da；计算的[M+Na]，1277.5220 Da (图43)。肽67 (89 mg，83%)；C40H69N13O16S2，MALDI-ToF MS：观察到的[M+Na]，1074.4789 Da；计算的[M+Na]，1074.4427 Da (图44)。糖肽68 (57 mg，48%)；C45H77N13O20S，MALDI-ToF MS：观察到的[M+Na]，1174.4740Da；计算的[M+Na]，1174.5129 Da(图45)。肽69 (76 mg，78%)。C37H64N12O15S，MALDI-ToF MS：观察到的[M+Na]，969.8162Da；计算的[M+Na]，970.8657 Da (图46)。糖基化氨基酸70 (12 mg，33%)，C14H25N3O8，MALDI-ToFMS：观察到的[M+Na]，386.2749 Da；计算的[M+Na] 386.3636 Da(图46)。
用于缀合至BSA-MI的一般程序：按照Pierce Endogen Inc指导执行缀合。简言之，将纯化的(糖)肽66或67 (对于BSA上的可用MI基团的2.5当量过量)溶解于缀合缓冲液(含有EDTA和叠氮化钠的磷酸钠，pH 7.2；100 μl)中，并加入马来酰亚胺激活的BSA (2.4 mg)在缀合缓冲液(200 μl)中的溶液中。将混合物在室温温育2小时，随后通过D-Salt™右旋糖酐脱盐柱(Pierce Endogen，Inc.)纯化，平衡并用含有0.15 M氯化钠的磷酸钠缓冲液(pH7.4)洗脱。使用BCA蛋白质测定鉴定含有缀合物的流分。通过经由HPAEC/PAD的定量单糖分析测定碳水化合物含量。
用于制备脂质体的一般程序。将卵PC、卵PG、胆固醇、MPL-A和化合物52或53 (15 μmol，摩尔比60:25:50:5:10)溶解于三氟乙醇和MeOH (1:1，v/v，5 ml)的混合物中。将溶剂在真空中去除，以产生薄脂质薄膜，其通过在氩气氛下在41℃悬浮于含有NaCl (145 mM；1ml)的HEPES缓冲液(10 mM，pH 6.5)中3小时而水合。将囊泡悬液超声处理1分钟，随后在50℃相继通过1.0、0.6、0.4、0.2和0.1 μm聚碳酸酯膜(Whatman，Nuclepore Track-EtchMembrane)挤出，以获得SUV。通过在100℃在密封管中加热SUV (50 μL)和含水TFA (2 M，200 μL)的混合物4小时，来测定脂质体的含糖量。随后将溶液在真空中浓缩，并且使用脉冲安培检测器(HPAEC-PAD；Methrome)和CarboPac柱PA-10和PA-20(Dionex)，通过高pH阴离子交换层析进行分析。
剂量和免疫接种时间表：将五只小鼠 (雌性BALB/c，年龄8-10周，来自JacksonLaboratories)的组以两周间隔免疫接种四次。每次加强在脂质体制剂中包括3 µg糖。血清样品在免疫接种(预先放血)前和最后一次免疫接种后1周获得。最后一次放血通过心脏放血完成。
杂交瘤培养和抗体产生：收获用52免疫接种的两只小鼠的脾脏，标准杂交瘤培养技术给出30个产生IgG的杂交瘤细胞系。三种杂交瘤(18B10.C7(3)、9D1.E4(10)、1F5.D6(14))以一升规模培养，并且通过饱和硫酸铵沉淀和随后的蛋白G柱层析纯化所得到的抗体，以在每种情况下获得约10 mg的IgG。
用于生物实验的试剂：蛋白酶抑制剂混合物得自Roche(Indianapolis，IN)。PUGNAc O-(2-乙酰胺-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖亚基(glucopyranosylidene))氨基N-苯基氨基甲酸酯自Toronto Research Chemicals，Inc(Ontario，加拿大)定购。小鼠IgM抗O-GlcNAc(CTD110.6；Comer等人，2001 Anal. Biochem. 293，169-177)和兔多克隆抗OGT(AL28)抗体先前在Dr. Gerald W. Hart的实验室(Johns Hopkins University School ofMedicine，Baltimore，MD)生成。兔多克隆抗OGA抗体是来自Dr. Sidney W. Whiteheart(University of Kentucky College of Medicine)的友情赠予。兔多克隆抗CKII α抗体(用于免疫印迹的NB100-377和用于免疫沉淀的NB100-378)购自Novus Biologicals(Littleton，CO)。针对α-微管蛋白的小鼠单克隆抗体和抗小鼠IgM(μ链)-琼脂糖得自Sigma(St. Louis，Missouri)。正常兔IgG琼脂糖、正常兔IgG琼脂糖和蛋白A/G PLUS琼脂糖自Santa Cruz Biotechnology，Inc.(Santa Cruz，CA)定购。
血清学测定：如先前描述的(Buskas和Boons，2004 Chem. Eur. J. 10，3517-3524；Ingale等人，2007 Nat. Chem. Biol. 3，663-66)，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测定抗GSTPVS(β-O-GlcNAc)SANM (68) IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM抗体滴度。简言之，以在包被缓冲液(含有75 mM氯化钠的0.2 M硼酸盐缓冲液，pH 8.5)中2.5 μg ml-1的浓度，将Immulon II-HB平底96孔微量滴定板(Thermo Electron Corp.)用100 μl/孔的通过马来酰亚胺接头缀合至BSA的糖肽缀合物(BSA-MI-GSTPVS(β-O-GlcNAc) SANM；BSA-MI-66)在4℃包被过夜。允许血清或含MAb的细胞上清液的系列稀释液在室温结合固定的GSTPVS(β-O-GlcNAc)SANM共2小时。通过加入碱性磷酸酶缀合的抗小鼠IgG (JacksonImmunoResearch Laboratories Inc.)、IgG1 (Zymed)、IgG2a (Zymed)、IgG2b (Zymed)、IgG3 (BD Biosciences Pharmingen)、或IgM (Jacksons ImmunoResearch Laboratories)抗体完成检测。在加入对硝基苯基磷酸酯(Sigma)后，使用微板读数器(BMG Labtech)在405nm处测量吸光度，其中波长校正设在490 nm处。抗体滴度定义为获得相对于光密度为0.1或更大的最高稀释度。
为了探究相应糖肽、肽和糖对MAb与GSTPVS(β-O-GlcNAc)SANM (68)的结合的竞争性抑制，将MAb以这样的方式在稀释缓冲液中稀释，所述方式使得如果在抑制剂的情况下，预期的最终OD值是约1。对于每个孔，将60 µl稀释的MAb在未包被的微量滴定板中与60 µl稀释缓冲液、以0-500 µM的终浓度溶于稀释缓冲液中的糖肽68 (GSTPVS(β-O-GlcNAc)SANM)、肽69 (GSTPVSSANM；SEQ ID NO：11)或糖70 (β-O-GlcNAc-Ser)混合。在室温温育30分钟后，将100 µl混合物转移至由BSA-MICGSTPVS(β-O-GlcNAc)SANM (BSA-MI-66)包被的板。如上所述使用合适的碱性磷酸酶缀合的检测抗体，将微量滴定板温育并显色。
质粒构建：将人OGT和OGA cDNA以两步方式PCR扩增，以在5'末端引入attB1位点和HA表位以及在3'末端引入attB2位点，以促进入口(Gateway)克隆策略(Invitrogen，Carlsbad，CA)。引物包括(1)用于第一PCR以将HA表位掺入起始密码子后的ogt内的有义引物：5’-CCCCATGTATCCATATGACGTCCCAGACTATGCCGCGTCTTCCGTGGGCAACGT-3’ (SEQ ID NO：13)；(2)使用HA-ogt PCR产物作为模板的含有attB1位点的有义引物：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGGATGATGTATCCATATGACGTCCCAGACTATGCCGCGTCTTCCG-3’(SEQ ID NO：14)；(3)用于两个ogt PCR的具有3’ attB2位点的反义引物：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCTATGCTGACTCAGTGACTTCAACGGGCTTAATCATGTGG-3’(SEQ ID NO：15)；(4)用于第一PCR以将HA表位掺入起始密码子后的oga内的有义引物：5’-CCCCATGTATCCATATGACGTCCCAGACTATGCCGTGCAGAAGGAGAGTCAAGC-3’ (SEQ ID NO：16)；(5)使用HA-oga PCR产物作为模板的含有attB1位点的有义引物：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGGATGATGTATCCATATGACGTCCCAGACTATGCCGTGCAGAAGG-3’(SEQ ID NO：17)；(6)用于两个oga PCR的具有3’ attB2位点的反义引物：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCACAGGCTCCGACCAAGTAT-3’ (SEQ ID NO：18)。随后根据制造商的说明书，对纯化的DNA片段实施入口克隆，获得最终表达构建体pDEST26/HA-OGT和pDEST26/HA-OGA。
细胞培养、转染和处理：HEK 293T细胞得自ATCC (Manassas，VA)，并维持在由5%CO2加湿的37℃恒温箱中的补充有10%胎牛血清(GIBCO/Invitrogen，Carlsbad，CA)的达尔伯克(Dulbecco’s)改良伊格尔培养基(4.5 g l-1葡萄糖，Cellgro/Mediatech，Inc.，Herndon，VA)中。根据制造商的说明书，用8 μg DNA和Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen Carlsbad，CA)/10 cm细胞板执行转染。在不存在DNA的情况下执行模拟转染。转染后48小时收获细胞。对于免疫沉淀实验，用冰冷的PBS洗涤板的细胞，并且作为沉淀物(pellet)贮存于-80℃直至使用。对于免疫印迹实验，将细胞用冰冷的PBS洗涤两次，并且刮到裂解缓冲液(10 mM Tris-HCl，pH 7.5、150 mM NaCl、1% Igepal CA-630、0.1% SDS、4 mMEDTA、1 mM DTT、0.1 mM PUGNAc、蛋白酶抑制剂混合物)中，将裂解产物在4℃在microfuge中以16,000 g澄清25分钟。用Bradford蛋白质测定伴随标准程序(Bio-Rad，Hercules，CA)和在样品缓冲液中煮沸5分钟，定量蛋白质浓度。对于质谱法实验，将293T细胞的2 X 15 cm板用50 μM PUGNAc处理24小时，将细胞形成沉淀并如上贮存。
免疫沉淀和蛋白质印迹：为了制备用于CKII免疫沉淀的核胞质(nucleocytosolic)级分，将具有模拟或OGT转染的HEK293T细胞沉淀物重悬浮于4体积的低渗缓冲液(5 mM Tris-HCl，pH 7.5，蛋白酶抑制剂混合物)中，并且转移到2 ml匀浆器内。在冰上温育10分钟后，对细胞悬液实施杜恩斯匀浆化，随后为在冰上的另外5分钟温育。随后将一体积的高渗缓冲液(0.1 M Tris-HCl，pH 7.5，2 M NaCl、5 mM EDTA、5 mM DTT、蛋白酶抑制剂混合物)加入裂解产物中。将裂解产物在冰上温育5分钟，随后为另一轮杜恩斯匀浆化。将所得到的裂解产物转移至含有PUGNAc(终浓度10 μM)的microfuge管，并且在4℃以18,000g离心25分钟。使用Bradford蛋白质测定(Bio-Rad，Hercules，CA)测定蛋白质浓度。在IP前，裂解产物用1% Igepal CA-630和0.1% SDS补充，并且用正常兔或小鼠IgG AC和蛋白A/G PLUS琼脂糖的混合物在4℃预澄清30分钟。在澄清后，在目的抗体的存在下，将预澄清的上清液在4℃温育4。在加入蛋白A/G PLUS琼脂糖后，将样品在4℃温育另外2小时，并且用IP洗涤缓冲液(10 mM Tris-HCl，pH 7.5、150 mM NaCl、1% Igepal CA-630、0.1% SDS)广泛洗涤。最后，将SDSPAGE样品缓冲液加入IP复合物内，并且煮沸3分钟。将上清液通过10%或4-15% Tris-HCl预制小凝胶(Bio-Rad，Hercules，CA)分辨，并且转移至Immobilon-P转移膜(Millipore，Bedford，MA)。将膜用3% BSA (O-GlcNAc印迹)或5%乳(蛋白质印迹)的TBST(具有0.1% Tween 20的TBS)溶液封闭，然后用每种抗体(对于O-GlcNAc印迹为1:1000稀释度，对于CKII、OGT和OGA印迹为1:8000稀释度，和对于α-微管蛋白印迹为1:10,000稀释度)在4℃探测过夜，随后为在室温与缀合至HRP的次级抗体一起温育2小时。如下使用SuperSignal化学发光底物(Thermo Scientific，Rockford，IL)执行HRP活性的最终检测：MAb 18B10.C7(3)、9D1.E4(10)和1F5.D6(14)使用Femto；CKII、OGT、OGA和微管蛋白使用PICO。使薄膜暴露于CL-XPosure胶片(Thermo Scientific，Rockford，IL)。在薄膜上显现图像后，将印迹用0.1 M甘氨酸(pH 2.5)在室温剥离1小时，用ddH2O洗涤和如上所述针对上样对照(CKII或α-微管蛋白)再探测。
MAb与琼脂糖的缀合和用于LC-MS/MS分析的样品制备：根据制造商的说明书，经由二琥珀酰亚胺基底物(DSS，Thermo Scientific，Rockford，IL)，将MAb 18B10.C7(3)、9D1.E4(10)和1F5.D6(14)或CTD110.6共价缀合至蛋白A/G PULS琼脂糖或抗小鼠IgM琼脂糖。如上以更大规模制备PUGNAc处理的HEK293T核胞质级分，将其与抗体缀合的琼脂糖一起温育，并如上洗涤。为了从琼脂糖中洗脱蛋白质，加入0.1 M甘氨酸(pH 2.5)，并且将洗脱物立即用1 M Tris-HCl(pH 8.0)中和。随后将样品如先前所述地还原并烷基化，并且在37℃实施LysC消化过夜。在消化后，如先前描述地加工样品(Lim等人，2008 J. Proteome Res.7，1251-1263)。
质谱法：将样品用19.5 μl 0.1%甲酸(在水中)和0.5 μl 80%乙腈/0.1%甲酸(在水中)重悬浮，并且用0.2 μm滤器(Nanosep，PALL)过滤。随后将样品脱机上样到nanosprayC18柱上，使用Finnigan LTQ/XL质谱仪(ThermoFisher，San Jose，CA)，如先前描述(Lim等人，2008 J. Proteome Res. 7，1251-1263)用160分钟线性梯度分离。对每种样品实施具有不同设置的3次运行：(1) ETD (电子转移解离)模式，其中收集全MS谱，随后为在最强峰的ETD (激活的补充激活(enabled supplemental activation))后的6 MS/MS谱。动态排除对于30秒持续时间设为1。(2) CID-NL (碰撞诱导的解离-假中性丢失)模式，其中收集全MS谱，随后为在最强峰的CID后的8 MS/MS谱。在遇到假中性丢失事件(GlcNAc的丢失，203.08)后，基于MS/MS谱产生MS8谱。动态排除具有与ETD方法相同的设置。(3) DDNL-ETD (在CID下的数据依赖性中性丢失MS8，随后为在每一次中性丢失事件后的ETD激活)，其中用CID (35%标准化碰撞能量)收集来自每次完全MS扫描的最高的5个峰的MS/MS谱，并且监控203.08的中性丢失，在这个过程中产生MS8谱。使用由补充激活激活的ETD执行具有中性丢失的重复扫描事件。动态排除也与上述相同地设置。
数据分析和验证：使用TurboSequest算法(Bioworks 3.3，Thermo Finnigan)，针对从Swiss-Prot人蛋白质组数据库中提取的人(智人(Homo sapiens)，32876个条目，2007年8月13日发表)正向和反向数据库搜索MS谱。用15种离子的阈值和1e3的TIC对谱生成DTA文件。对于氧化甲硫氨酸(methione)、烷基化半胱氨酸和O-GlcNAc修饰的丝氨酸/苏氨酸，分别考虑15.99、57.02和203.08 Da的动态质量增加。将搜索正向和反向数据库获得的每种样品的所得OUT文件进一步用ProtoeIQ (Bioinquire)剖析，并用1% FDR (使用的度量：F-值)和处于5的ProFDR的起始肽覆盖过滤。
统计分析：通过双尾、不成对斯氏t检验测定在组之间的统计显著性。当P <0.05时，差异视为显著的。
本文引用的所有专利、专利申请和出版物的完全公开内容和可电子获得的材料(包括例如在例如GenBank和RefSeq中的核苷酸序列提交，和在例如SwissProt、PIR、PRF、PDB中的氨基酸序列提交，和来自GenBank和RefSeq中的注释编码区的翻译)均通过引用并入。前述说明书和实施例仅为了明确理解而给出。不应由其理解为不必要的限制。本发明并不限于所示和所述的确切细节，因为对本领域技术人员显而易见的变动将包括在由权利要求限定的本发明内。

Claims (37)

1.糖脂肽在制备用于在受试者中生成抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的药物中的用途，所述糖脂肽包含：
包含B细胞表位的至少一种糖基化MUC1糖肽组分；
包含MHC II类限制性辅助T细胞表位的至少一种肽组分；和
至少一种脂质组分。
2.权利要求1的用途，其中所述ADCC是天然杀伤(NK)细胞介导的。
3.权利要求1或2的用途，其中所述ADCC裂解肿瘤细胞。
4.权利要求3的用途，其中所述肿瘤细胞是乳腺癌细胞。
5.权利要求1的用途，其中所述ADCC裂解表达MUC1肽序列的细胞。
6.一种糖脂肽，其包含：
包含B细胞表位的至少一种糖基化MUC1糖肽组分；
包含MUC1衍生的MHC II类限制性辅助T细胞表位的至少一种肽组分；和
至少一种脂质组分。
7.权利要求6的糖脂肽，其中所述包含B细胞表位的糖基化MUC1糖肽组分包含在一个或多个丝氨酸和/或苏氨酸残基上的糖基化。
8.权利要求7的糖脂肽，其中所述包含B细胞表位的糖基化MUC1糖肽组分包含用选自下述的糖残基进行的糖基化：GAlNAc、GlcNAc、Gal、NANA、NGNA、岩藻糖、甘露糖和葡萄糖。
9.权利要求6-8中任一项的糖脂肽，其中所述包含B细胞表位的糖基化MUC1糖肽组分是I类MHC限制性表位。
10.权利要求6的糖脂肽，其中所述包含B细胞表位的糖基化MUC1糖肽组分和/或所述包含MHC II类限制性辅助T细胞表位的肽组分包含人MUC1肽序列。
11.权利要求6的糖脂肽，其中所述包含B细胞表位的糖脂肽和/或所述包含MHC II类限制性辅助T细胞表位的肽组分包含MUC1蛋白质序列的约5-30个氨基酸，所述MUC1蛋白质序列包含MUC1蛋白质的胞外区，且包含糖基化的一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基。
12.权利要求6的糖脂肽，其中所述包含B细胞表位的糖基化MUC1糖肽组分包含与SAPDTRPAP (SEQ ID NO:20)、TSAPDTRPAP (SEQ ID NO:21)、SAPDTRPL (SEQ ID NO:22)或TSAPDTRPL (SEQ ID NO:23)具有至少约50%序列同一性的氨基酸序列。
13.权利要求6的糖脂肽，其中所述包含B细胞表位的糖基化MUC1糖肽组分包含SAPDTRPAP (SEQ ID NO:20)、TSAPDTRPAP (SEQ ID NO:21)、SAPDTRPL (SEQ ID NO:22)或TSAPDTRPL (SEQ ID NO:23)。
14.权利要求12或13的糖脂肽，其中所述包含B细胞表位的糖基化MUC1糖肽组分包含在一个或多个丝氨酸和/或苏氨酸残基上的糖基化。
15.权利要求6-14中任一项的糖脂肽，其中所述脂质组分包含一条或多条脂质链、一个或多个半胱氨酸残基和一个或多个赖氨酸残基。
16.权利要求6-15中任一项的糖脂肽，其中所述脂质组分包含Toll样受体(TLR)配体。
17.权利要求16的糖脂肽，其中所述Toll样受体(TLR)配体包含TLR2配体。
18.权利要求17的糖脂肽，其中所述TLR2配体包含Pam3CysSK4。
19.权利要求6-15之一的糖脂肽，其中所述脂质组分包含脂质佐剂。
20.权利要求19的糖脂肽，其中所述脂质佐剂包含脂质化氨基酸(LAA)。
21.权利要求6的糖脂肽，其中所述MUC1衍生的B细胞肽表位和所述MUC1衍生的MHC II类限制性辅助T细胞肽表位包含邻接氨基酸序列。
22.权利要求21的糖脂肽，其中所述邻接氨基酸序列包含与氨基酸序列APGSTAPPAHGVTSA (SEQ ID NO:26)、APGSTAPPAHGVTSAPDTRPL (SEQ ID NO:27)、APGSTAPPAHGVTSAPDTRPL (SEQ ID NO:28)或APGSTAPPAHGVTSAPDTRPL (SEQ ID NO:29)具有至少50%序列同一性的序列。
23.权利要求21的糖脂肽，其中所述邻接氨基酸序列包含氨基酸序列APGSTAPPAHGVTSA(SEQ ID NO:26)、APGSTAPPAHGVTSAPDTRPL (SEQ ID NO:27)、APGSTAPPAHGVTSAPDTRPL(SEQ ID NO:28)或APGSTAPPAHGVTSAPDTRPL (SEQ ID NO:29)。
24.权利要求22或23的糖脂肽，其中所述邻接氨基酸序列是在一个或多个苏氨酸和/或丝氨酸残基上糖基化的。
25.权利要求6-24中任一项的糖脂肽，其进一步包含共价连接的免疫调节剂。
26.权利要求25的糖脂肽，其中所述免疫调节剂选自TLR9激动剂、COX-2抑制剂、GM-CSF、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的抑制剂、化学治疗剂及其组合。
27.一种药物组合物，其包含：
根据权利要求6-26中任一项的糖脂肽；和
药学可接受的载体。
28.一种组合物，其包含含有根据权利要求6-26中任一项的糖脂肽的脂质体。
29.权利要求28的组合物，其中所述糖脂肽的脂质组分促进脂质体形成。
30.权利要求27或28的组合物，其进一步包含免疫调节剂。
31.权利要求30的组合物，其中所述免疫调节剂包含TLR激动剂。
32.权利要求31的组合物，其中所述TLR激动剂包含TLR9激动剂。
33.权利要求32的组合物，其中所述TLR9激动剂包含CpG。
34.权利要求30的组合物，其中所述免疫调节剂选自TLR9激动剂、COX-2抑制剂、GM-CSF、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的抑制剂、化学治疗剂及其组合。
35.一种免疫原性疫苗，其包含根据权利要求6-26中任一项的糖肽或权利要求27-34中任一项的组合物。
36.权利要求6-26中任一项的糖脂肽或权利要求27-35中任一项的组合物用于制造治疗或预防感染、疾病或病症的药物的用途。
37.一种试剂盒，其包含：
权利要求6-26中任一项的糖脂肽；
包装；和
使用说明书。
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