CN105510587A - 新霉素的免疫胶体金检测卡及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明新霉素的免疫胶体金检测卡及其制备方法,涉及β-肾上腺素受体激动剂检测技术领域。本发明的检测卡外壳中的试纸条，由PVC胶板、样品垫、胶体金结合垫、包被膜和吸水垫组成；胶体金膜为含新霉素单克隆抗体的玻璃纤维素膜，包被膜是硝酸纤维素膜，其上设有T线和C线，T线包被有新霉素蛋白质偶联物，C线包被有羊抗鼠IgG抗体。本发明有效用于快速检测新霉素，方便、快捷、结果准确。
Description
技术领域
本发明涉及动物源食品抗生素检测技术领域，特别是涉及新霉素的免疫胶体金检测卡及其制备方法。
背景技术
新霉素是一种广谱抗生素，常用于动物各种传染病的治疗，对于多种病原菌有较强的抑制作用，对革兰氏阳性和阴性菌皆有效。新霉素存在严重的副作用，具有肾毒性和内耳毒性，它对内耳的伤害，往往是不可逆转的，因此动物食品中的新霉素残留对人类的健康构成巨大威胁。检测动物源食品中新霉素的含量显得更直接、方便，且可实现宰前检测，为及时排除食品安全隐患，保障食品的质量安全，特开展本试验方法研究。
现有技术对于新霉素的检测主要是高效液相色谱-串联质谱法、高效液相色谱法等检测方法，但这些技术的缺陷明显：设备昂贵、操作复杂、难以推广。所以，建立一种简单、有效、适合基层使用的测定方法是极其必要的。本发明的目的是研制一种更适合企业进行现场检测且快捷简便、成本低廉的定性检测方法。
发明内容
针对以上情况，本发明的目的就是为了克服现有技术存在的缺陷而提供一种新霉素的免疫胶体金检测卡及其制备方法，可有效解决能快速、简便地检测出β-肾上腺素受体激动剂新霉素的问题。
本发明的新霉素胶体金检测卡，包括包被了单克隆抗体胶体金标记物的胶体金结合垫、包被了新霉素-BSA和羊抗鼠IgG的硝酸纤维素膜、样品垫、吸水垫、PVC胶板和塑料模具组成，在PVC胶板的一端依次粘附样品垫、结合垫，中间黏贴硝酸纤维素膜，另一端粘附吸水垫。
本发明的新霉素胶体金检测卡的制备方法，是由以下步骤实现：
(1)胶体金溶液制备：取1L三角烧瓶1个，加入超纯水495mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl4·3H2O)5mL，配制成500mL0.01%氯金酸水溶液，加热煮沸后在持续搅拌的情况下加入1%柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)溶液5-7mL，继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，维持5min后停止加热，补水至原体积，冷却至室温，2-8℃保存备用；
(2)抗体的预处理：将要标记的新霉素抗体在1000r/min,4℃条件下，离心20min，取上清，用0.01mol/LPBS稀释成1mg/mL；或者用0.01mol/LPBS稀释成1mg/ml，过0.22μm滤膜；
(3)胶体金标记物的制备：取步骤(1)中的胶体金溶液40mL，用0.25mol/LK2CO3调节胶体金溶液pH至8.5，电磁搅拌器250r/min搅拌，逐滴加入4mL含0.3mg抗体蛋白的蛋白溶液，反应10min；逐滴加入4mL10%BSA，继续搅拌反应10min；金标抗体溶液常温低速（1500r/min）离心10min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀；红色上清溶液4℃，12000r/min离心20min，弃上清，收集沉淀，将沉淀用金标抗体稀释液定容至1mL，制备成新霉素单克隆抗体胶体金标记物；
(4)胶体金膜的制备：将步骤(3)新霉素蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物用划膜仪以5μL/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上，室温自然晾干或者37℃烘干3h，制成含新霉素蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物的胶体金膜；
(5)包被膜制备：将羊抗鼠IgG抗体、新霉素蛋白质偶联物稀释成1mg/mL，用划膜仪依次以1μL/cm的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上，制备成包被膜，37℃包被2h后，室温自然晾干或者37℃烘干；
(6)样品垫前处理：将样品垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，在空气湿度低于60%的条件下，室温自然晾干；
(7)检测卡的组装：PVC胶板自上而下依次粘贴样品垫、胶体金膜、包被膜和吸水棉，组装成试纸条，切割成一定宽度的长条，再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中。
所述步骤(5)中所包被的检测线T设在质控线C的下方；
所述步骤(6)中的样品垫处理液是由1g小牛血清蛋白(BSA)和0.8g氯化钠(NaCl)，用含有0.5%TRITON-100的0.01mol/LPBS定容至100mL；
本发明可有效用于测定β-肾上腺素受体激动剂新霉素，方法简单，方便、快捷，结果准确。
附图说明
图1为本发明新霉素的免疫胶体金检测卡的结构图：图中1.加样孔2.检测线3.质控线4.检测孔5.试纸条6.检测卡外壳。
图2为本发明新霉素的免疫胶体金检测卡内的试纸条的剖视结构图，图中7.样品垫8.胶体金结合垫9.PVC胶板10.硝酸纤维素膜11.吸水垫。
具体实施方式
实施例1
图1、图2所示的实施例：图中9为PVC胶板；7为样品垫；8为胶体金结合垫，该胶体金结合垫上包被了单克隆抗体胶体金标记物；10为包被膜，即硝酸纤维素膜，该硝酸纤维素膜上包被了新霉素-BSA和羊抗鼠IgG；11为吸水垫，由吸水材料如滤纸制成。
在PVC胶板9的一端上(样品端)粘附样品垫7、结合垫8，样品垫7和结合垫8为并排结构。
在PVC胶板9的中间粘附硝酸纤维素膜10。在硝酸纤维素膜10上设置有羊抗鼠IgG质控线3和新霉素-BSA检测线2。
在PVC胶板9的另一端粘附吸水垫11。硝酸纤维素膜10的一端与结合垫8略交叉，另一端与吸水垫11略交叉。该试纸条5可装入有塑料模具制成的检测卡外壳6中，制成检测卡，在检测卡外壳6的上盖上设有加样孔1和检测孔4，样品垫7正对加样孔1，硝酸纤维素膜10正对检测孔4。
实施例2
新霉素胶体金检测卡制备，是由以下步骤具体实现：
胶体金溶液制备：取1L三角烧瓶1个，加入超纯水495mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl4·3H2O)5mL，配制成500mL0.01%氯金酸水溶液，加热煮沸后在持续搅拌的情况下加入1%柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)溶液5-7mL，继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，维持5min后停止加热，补水至原体积，冷却至室温，2-8℃保存备用；
抗体的预处理：将要标记的新霉素抗体在1000r/min,4℃条件下，离心20min，取上清，用0.01mol/LPBS稀释成1mg/mL；或者用0.01mol/LPBS稀释成1mg/ml，过0.22μm滤膜；
胶体金标记物的制备：取步骤(1)中的胶体金溶液40mL，用0.25mol/LK2CO3调节胶体金溶液pH至8.5，电磁搅拌器250r/min搅拌，逐滴加入4mL含0.3mg抗体蛋白的蛋白溶液，反应10min；逐滴加入4mL10%BSA，继续搅拌反应10min；金标抗体溶液常温低速（1500r/min）离心10min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀；红色上清溶液4℃，12000r/min离心20min，弃上清，收集沉淀，将沉淀用金标抗体稀释液定容至1mL，制备成新霉素单克隆抗体胶体金标记物；
胶体金膜的制备：将步骤(3)新霉素蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物用划膜仪以5μL/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上，室温自然晾干或者37℃烘干3h，制成含新霉素蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物的胶体金膜；
包被膜制备：将羊抗鼠IgG抗体、新霉素蛋白质偶联物稀释成1mg/mL，用划膜仪依次以1μL/cm的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上，制备成包被膜，37℃包被2h后，室温自然晾干或者37℃烘干；
样品垫前处理：将样品垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，在空气湿度低于60%的条件下，室温自然晾干；
检测卡的组装：PVC胶板自上而下依次粘贴样品垫、胶体金膜、包被膜和吸水棉，组装成试纸条，切割成一定宽度长条，再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中。
实施例3
新霉素最低检出限量试验
准确称量0.500g新霉素抗原溶于超纯水并定容至100mL，标为A1溶液，取A1溶液1mL于容量瓶加超纯水并定容至1000mL，形成A2溶液，取A2溶液1mL于容量瓶加超纯水并定容至1000mL，形成A3溶液，则A3溶液的浓度为5ng/mL(5ppb)。取A3溶液1mL于4支试管中，并分别标号1~4，往试管中分别加入往9mL、4mL、1mL、0mL超纯水，配成新霉素抗原溶液浓度分别是：0.5ng/mL、1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL；另取一支空试管，加入5mL超纯水，标为5号试管。取上述1~5号试管中液体作为样品滴加到新霉素检测卡上，加样后5min观察结果，检测线2和质控线3的显色结果见表1。
表1新霉素最低检出限量试验
经多次检验，新霉素的检出率达99%，最低检出限量为5ng/mL。
Claims (2)
1.新霉素胶体金检测卡，其特征在于按照下述步骤制备得到：
(1)胶体金溶液制备：取1L三角烧瓶1个，加入超纯水495mL，而后加入1%氯金酸HAuCl4·3H2O)5mL，配制成500mL0.01%氯金酸水溶液，加热煮沸后在持续搅拌的情况下加入1%柠檬酸三钠Na3C6H5O7·2H2O溶液5-7mL，继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，维持5min后停止加热，补水至原体积，冷却至室温，2-8℃保存备用；
(2)抗体的预处理：将要标记的新霉素抗体在1000r/min，4℃条件下，离心20min，取上清，用0.01mol/LPBS稀释成1mg/mL；或者用0.01mol/LPBS稀释成1mg/ml，过0.22μm滤膜；
(3)胶体金标记物的制备：取步骤(1)中的胶体金溶液40mL，用0.25mol/LK2CO3调节胶体金溶液pH至8.5，电磁搅拌器250r/min搅拌，逐滴加入4mL含0.3mg抗体蛋白的蛋白溶液，反应10min；逐滴加入4mL10%BSA，继续搅拌反应10min；金标抗体溶液常温1500r/min离心10min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀；红色上清溶液4℃，12000r/min离心20min，弃上清，收集沉淀，将沉淀用金标抗体稀释液定容至1mL，制备成新霉素单克隆抗体胶体金标记物；
(4)胶体金膜的制备：将步骤(3)新霉素蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物用划膜仪以5μL/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上，室温自然晾干或者37℃烘干3h，制成含新霉素蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物的胶体金膜；
(5)包被膜制备：将羊抗鼠IgG抗体、新霉素蛋白质偶联物稀释成1mg/mL，用划膜仪依次以1μL/cm的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上，制备成包被膜，37℃包被2h后，室温自然晾干或者37℃烘干；
(6)样品垫前处理：将样品垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，在空气湿度低于60%的条件下，室温自然晾干；
(7)检测卡的组装：PVC胶板自上而下依次粘贴样品垫、胶体金膜、包被膜和吸水棉，组装成试纸条，切割成一定宽度的长条，再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中。
2.根据权利要求1所述的新霉素胶体金检测卡，其特征在于所述步骤(5)中所包被的检测线T设在质控线C的下方；
所述步骤(6)中的样品垫处理液是由1g小牛血清蛋白(BSA)和0.8g氯化钠(NaCl)，用含有0.5%TRITON-100的0.01mol/LPBS定容至100mL。
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