CN105126077A - 衣原体蛋白Pgp3在制备抑制银屑病样皮损药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种衣原体蛋白Pgp3在制备抑制银屑病样皮损药物中的应用，属于微生物与酶领域。本发明中的衣原体蛋白Pgp3与人类抗菌多肽LL-37结合从而达到抑制银屑病皮损发展的目的。本发明有效的解决了现有治疗银屑病药物副作用大、长期用药患者人身安全性和药物有效性无法保障以及治疗费用高等问题。本发明中的衣原体蛋白来源于沙眼衣原体，相对于化学药物来讲，副作用小，而且治疗效果明显，有望替代目前以外用激素为主的银屑病治疗药物。
Description
技术领域
本发明属于微生物与酶领域，具体是一种衣原体蛋白Pgp3在制备抑制银屑病样皮损药物中的应用。
背景技术
银屑病是一种反复发作的、以表皮增殖和炎症为特征，无传染性的红斑鳞屑性皮肤病，其病因与遗传、感染、变态反应、代谢障碍及自身免疫等有关。该病病程长，外观丑陋，后期可侵犯多种脏器，给患者身心带来极大伤害。
治疗银屑病的药物包括全身系统用药及局部外用药物。早期及病情较轻的银屑病主要依靠外用药物治疗，目前治疗银屑病的外用药物主要包括：
1.维生素D3类似物
该类药物导致了银屑病外用疗法的变革，它可以抑制各种皮肤炎症和表皮增殖，有利于增强细胞的正常角化，临床疗效较好，但是起效慢，平均6-8周后才有显著疗效，主要不良反应是局部皮肤刺激。另外该类药物价格较高，对于皮损面积较大的患者是一笔较昂贵的治疗费用。
2.焦油类制剂
常用的有2%-10%煤焦油、松馏油、糠馏油及黑豆馏油等，对皮脂腺分泌及表皮基底细胞有丝分裂和鳞屑的产生有抑制作用，故可治疗银屑病，但可致癌和致畸，目前已很少应用于临床。
3.蒽林制剂及皮质类固醇制剂
蒽林软膏外涂，刺激性较强；皮质类固醇制剂可抑制T细胞活化，达到治疗银屑病的目的，是目前临床上主要采用的外用治疗药物。该类药物虽然起效快，但副作用较大，且停药后易致反跳或转变成红皮病型或脓疱型银屑病。
中重度银屑病需要系统用药，该类药物主要包括抗肿瘤制剂、免疫抑制剂、免疫调节剂、维A酸类药物、抗生素及生物制剂等。这些药物多存在副作用大或者长期应用的安全性和有效性仍不明确等缺点。
发明内容
本发明就是为了解决现有药物在治疗银屑病中存在的问题，所提出的一种衣原体蛋白Pgp3在制备抑制银屑病样皮损药物中的应用。
本发明是按照以下技术方案实现的。
衣原体蛋白Pgp3在制备抑制银屑病样皮损药物中的应用。
所述衣原体蛋白Pgp3与人类抗菌多肽LL-37结合抑制银屑病皮损的发展。
本发明获得了如下的有益效果。
本发明有效的解决了现有治疗银屑病药物副作用大、长期用药患者人身安全性和药物有效性无法保障以及治疗费用高等问题。本发明中的衣原体蛋白来源于沙眼衣原体，相对于化学药物来讲，副作用小，而且治疗效果明显，有望替代目前以外用激素为主的银屑病治疗药物，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是本发明GST-Pgp3蛋白SDS-PAGE电泳检测图；
图2是本发明Pgp3蛋白SDS-PAGE电泳检测图；
图3是本发明Pgp3蛋白浓缩后SDS-PAGE电泳检测图；
图4是本发明GST-pulldown实验结果图；
图5是本发明Pgp3蛋白干预前后小鼠银屑病样皮损外表对比图；
图6是本发明Pgp3蛋白干预银屑病样小鼠实验对照组皮损组织HE染色图；
图7是本发明Pgp3蛋白干预银屑病样小鼠实验模型组皮损组织HE染色图；
图8是本发明Pgp3蛋白干预银屑病样小鼠实验外涂高浓度组皮损组织HE染色图；
图9是本发明Pgp3蛋白干预银屑病样小鼠实验外涂低浓度组皮损组织HE染色图；
图10是本发明Pgp3蛋白干预银屑病样小鼠实验外涂对照组皮损组织HE染色图；
图11是本发明Pgp3蛋白干预银屑病样小鼠实验注射高浓度组皮损组织HE染色图；
图12是本发明Pgp3蛋白干预银屑病样小鼠实验注射低浓度组皮损组织HE染色图；
图13是本发明Pgp3蛋白干预银屑病样小鼠实验注射对照组皮损组织HE染色图；
图14是本发明Pgp3蛋白干预前后小鼠皮肤红斑积分趋势图；
图15是本发明Pgp3蛋白干预前后小鼠皮损面积积分趋势图；
图16是本发明Pgp3蛋白干预前后小鼠皮损厚度积分趋势图；
图17是本发明Pgp3蛋白干预前后小鼠皮损总积分趋势图。
具体实施方式
一．核苷酸序列及氨基酸序列
1.Pgp3蛋白由沙眼衣原体质粒pORF5编码,共795bp(GeneID:3205528）,其核苷酸序列如下：
ATGGGAAATTCTGGTTTTTATTTGTATAACACTGAAAACTGCGTCTTTGCTGATAATATCAAAGTTGGGCAAATGACAGAGCCGCTCAAGGACCAGCAAATAATCCTTGGGACAACATCAACACCTGTCGCAGCCAAAATGACAGCTTCTGATGGAATATCTTTAACAGTCTCCAATAATTCATCAACCAATGCTTCTATTACAATTGGTTTGGATGCGGAAAAAGCTTACCAGCTTATTCTAGAAAAGTTGGGAGATCAAATTCTTGATGGAATTGCTGATACTATTGTTGATAGTACAGTCCAAGATATTTTAGACAAAATCAAAACAGACCCTTCTCTAGGTTTGTTGAAAGCTTTTAACAACTTTCCAATCACTAATAAAATTCAATGCAACGGGTTATTCACTCCCAGTAACATTGAAACTTTATTAGGAGGAACTGAAATAGGAAAATTCACAGTCACACCCAAAAGCTCTGGGAGCATGTTCTTAGTCTCAGCAGATATTATTGCATCAAGAATGGAAGGCGGCGTTGTTCTAGCTTTGGTACGAGAAGGTGATTCTAAGCCCTGCGCGATTAGTTATGGATACTCATCAGGCATTCCTAATTTATGTAGTCTAAGAACCAGTATTACTAATACAGGATTGACTCCGACAACGTATTCATTACGTGTAGGCGGTTTAGAAAGCGGTGTGGTATGGGTTAATGCCCTTTCTAATGGCAATGATATTTTAGGAATAACAAATACTTCTAATGTATCTTTTTTAGAGGTAATACCTCAAACAAACGCTTAA
2.Pgp3蛋白的分子量为29kDa，其氨基酸序列如下：
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61sstnasitigldaekayqlileklgdqildgiadtivdstvqdildkiktdpslgllkaf
121nnfpitnkiqcnglftpsnietllggteigkftvtpkssgsmflvsadiiasrmeggvvl
181alvregdskpcaisygyssgipnlcslrtsitntgltpttyslrvgglesgvvwvnalsn
241gndilgitntsnvsflevipqtna
3.LL-37蛋白的氨基酸序列
1llgdffrkskekigkefkrivqrikdflrnlvprtes
4.PCR扩增Pgp3基因片段引物
引物CGCGGATCCATGGGAAATTCTGGTTTTTATTTG
引物TTTTCCTTTGCGGCCGCTTAAGCGTTTGTTTGAGGTATTA
二．Pgp3蛋白的制备
1.GST-Pgp3蛋白的表达和鉴定
1.1PCR扩增Pgp3基因片段
以沙眼衣原体D型株为模板，以上述引物和引物为引物，PCR扩增Pgp3基因。PCR反应条件：92℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸30s，末次循环72℃延伸15min，总反应体积50ul，琼脂糖凝胶电泳鉴定表达产物。
1.2重组质粒pGEX-6P-2-Pgp3的构建
将PCR产物与pGEX-6P-2分别用BamHI和NotI进行双酶切处理，T4连接酶于15℃连接4h，构建pGEX-6P-2-Pgp3重组质粒，并转化入DH5α菌（天根生化科技(北京)有限公司；CB101-02），用含Amp+选择培养基筛选出阳性菌落。通过1%琼脂糖电泳及基因测序对阳性菌中提取的质粒进行鉴定。
1.3重组质粒pGEX-6P-2-Pgp3的表达
将pGEX-6P-2-Pgp3重组质粒转化入大肠埃希菌BL21（天根生化科技（北京）有限公司；CB105-01）中，加入SOC培养基摇匀培养后转入LB固体培养基，37℃培养过夜后挑取单克隆菌落加入液体LB培养基增量培养，加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达3h后4℃、12000rpm离心5min收集菌体，PBS缓冲液重悬沉淀，加溶菌酶、Triton-X100混匀裂解后冰上超声破碎菌体至悬液透明，离心后收集上清。
2.GST-Pgp3纯化
GST-Pgp3蛋白上清液中加入经PBS缓冲液（pH7.4）预洗的200ulGST磁珠(GSTbeads；美国GenScript生物科技有限公司；L00327），室温振荡lh后3000rpm、4℃离心5min并弃上清，用PBS缓冲液洗涤磁珠，上清液进行SDS-PAGE电泳检测。检测结果如图1所示，第三泳道为GST磁珠吸附、洗脱后得到的纯化的GST-Pgp3蛋白检测情况，可见在54kDa处形成一条单一的目的条带。
向GST磁珠吸附、洗脱后的GST-Pgp3蛋白溶液中加入200ulPBS缓冲液和10ulPP酶以切除GST标签，室温震荡2h后离心5分钟，离心收集Pgp3上清，并进行SDS-PAGE电泳检测。如图2所示，GST-Pgp3蛋白经PP蛋白酶切除GST标签后，SDS-PAGE电泳显示在28kDa处出现一条蛋白条带（第三泳道）。
3.Pgp3蛋白的浓缩
将纯化后的Pgp3蛋白加入10kDa超滤管（美国Millipore生物技术有限公司），加10mlPBS缓冲液，4℃，4000×g离心，每次20min，重复5次，收集浓缩后的Pgp3蛋白，SDS-PAGE电泳检测。如图3所示，10kDa超滤管浓缩后的Pgp3蛋白，SDS-PAGE电泳检测显示在28kDa处出现的蛋白条带明显增粗。
BCA蛋白定量分析试剂盒（赛默飞世尔科技(中国)有限公司）测定蛋白浓度为5536ug/ml，用PBS缓冲液将Pgp3蛋白分别稀释成100ug/ml及50ug/ml，分装，-80℃冻存备用。
三．GSTpulldown实验
将1mlGST-Pgp3蛋白上清液与20ul经PBS预洗的GST磁珠混合，室温振荡lh后3000rpm、4℃离心5min并弃上清，用PBS缓冲液洗涤磁珠3次后弃上清，将20ulGST-Pgp3磁珠（GST-Pgp3beads）与8ugLL-37蛋白（由Peptide2.0公司合成）在37℃共同孵育30min，离心，用PBS缓冲液洗涤3次，每次10min,加入SDS上样缓冲液，沸水浴煮5min冰上冷却5min，SDS-PAGE电泳分离蛋白，电泳完毕后，卸下凝胶，将转膜缓冲液浸泡好的硝酸纤维素膜轻轻贴附在胶的游离面上，4℃、80V电压转膜1小时。转膜结束后，1×TBST洗膜，封闭液封闭1个小时，加入抗LL-37的抗4℃孵育过夜，加入HRP标记的Ⅱ抗37℃孵育1h，发光底物作用5min后暗室曝光、洗片及记录分析。如图4所示，实验结果如下：
第一泳道加入LL-37蛋白进行反应，7kDa处出现单一蛋白条带，表明抗体特异性识别LL-37蛋白；
第二泳道加入GSTbeads进行反应，未出现蛋白条带，表明抗体不识别GST；
第三泳道加入GSTbeads与LL-37蛋白进行反应，未出现蛋白条带，表明GST不能与LL-37蛋白结合；
第四泳道加入GSTbeads与LL-37Sup.进行反应，在7kDa处出现单一蛋白条带，因GST不能与LL-37蛋白结合，LL-37蛋白游离于上清液中而被检测出；
第五泳道加入GST-Pgp3beads进行反应，未出现蛋白条带，表明抗体不识别Pgp3蛋白；
第六泳道加入GST-Pgp3beads与LL-37蛋白进行反应，在7kDa处出现一条条带，表明Pgp3蛋白能结合LL-37蛋白；在63kDa处出现另一条条带，表明GST-Pgp3蛋白能和LL-37蛋白结合并形成稳定复合物；
第七泳道加入GST-Pgp3beads与LL-37Sup.进行反应，7kDa处出现微弱条带，因Pgp3蛋白能与LL-37和CRAMP结合，所以上清液游离LL-37量很低。
四、银屑病样小鼠模型的构建及PASI评分
4.1实验动物制备
饲养SPF级、体重为18-20g、6-8周龄的BALB/c雌性小鼠。刮除背毛约2cm×3cm大小，单笼饲养，1d后按组别处理。
4.2实验分组及干预
32只小鼠随机分成8组，每组4只，分别为：空白对照组，模型组，外涂高浓度组，外涂低浓度组，外涂对照组，注射高浓度组，注射低浓度组，注射对照组。详细干预方法见表1。
注：①.小鼠第1d去毛，第2天开始用Pgp3处理，共处理7天；
②.IMQ造模：每日早上定时定量将42mg咪喹莫特均匀外涂在小鼠背部；
③.外涂组：每日傍晚定时定量将Pgp3混合物均匀外涂；
④.注射组：每日傍晚定时定量九格法将Pgp3混合物多点皮下注射，每格1针共9针。
如图5所示，第8天可见，与空白对照组相比较，模型组小鼠皮肤可见明显红斑和鳞屑，厚度显著增加，肉眼观察类似银屑病样皮损改变。外涂高、低浓度组、注射高、低浓度组小鼠皮损较模型组有不同程度改善，红斑变浅，鳞屑减少，皮肤较前光滑，表皮增厚减轻，而外涂及注射对照组相比模型组未见明显差异，红斑颜色仍较深，广泛鳞屑，皮肤增厚依旧明显。
4.3实验动物取材
各组小鼠于处理第8d经脱颈处死取材，按九格法剪取对应区域皮损组织，10%甲醛溶液固定后制备石蜡切片，HE染色。
如图6-13所示，HE染色可见（HE×200），与空白对照组相比，模型组角质层明显增厚，主要为角化过度、角化不全，棘层变厚，表皮突延伸，下端增宽，部分融合，真皮层炎性细胞浸润等银屑病样病理变化。Pgp3蛋白干预后，外涂高、低浓度组，注射高、低浓度组小鼠皮肤表皮层较模型组平整，厚度较干预前降低，角化不全减轻。而外涂对照组及注射对照组与模型组小鼠皮损组织学表现类似，表皮较厚，明显角化不全及明显炎性细胞浸润。
4.4各组小鼠银屑病样皮损面积和疾病严重程度（PASI）评分
每日定时观察记录皮损改变情况，依据PASI评分标准，给予小鼠皮损处红斑、鳞屑及浸润增厚程度0～4等不同积分，标准为：0：无；1：轻度；2：中度；3：重度；4：极重度，三者总和得出总积分。各组小鼠积分取平均值后绘制积分趋势图。
如图14-17所示，PASI评分趋势图显示，除空白对照组外，涂抹咪喹莫特乳膏后各组小鼠评分曲线呈明显上升走势。Pgp3蛋白干预各组PASI评分与模型组比较，曲线呈现不同程度下降，第8天时各项PASI评分指标均低于模型组。外涂及注射对照组曲线也位于模型组之下，但下降程度明显不如Pgp3干预组。
4.5统计学处理
实验数据以均数±标准差(±S)表示。使用SPSS19.0软件对数据进行分析，多组间比较采用方差分析(OneWayANOVA)，检验水准α=0.05，P＜0.05表示差异有统计学意义。
由表2所知，模型组表皮层明显增厚，接近空白对照组表皮厚度10倍，外涂及注射高浓度组表皮增厚程度较低，与模型组比较有统计学差异（P＜0.05），外涂及注射低浓度组虽然皮肤厚度亦较模型组明显降低，但无统计学差异（P＞0.05）；而外涂及注射对照组表皮增厚程度仍旧明显。
本发明中Pgp3蛋白之所以具有治疗银屑病的用途，原因如下：
最新的研究显示人类抗菌肽LL-37过度表达在银屑病的发生与发展中起重要作用，并且在LL-37过度表达的动物模型中显示与银屑病相似的组织病理学特点。抗菌肽LL-37与银屑病发病的关系如下：
1.与自身DNA结合，参与浆细胞样树突状细胞活化
浆细胞样树突状细胞（plasmacytoiddendriticcells，pDC）起源于淋巴样祖细胞，分布在外周血和淋巴组织中，能高度特异性识别病毒与某些微生物感染。pDC在正常外周组织中不分布，但在发生炎症的皮肤、黏膜和肿瘤部位数量明显增加。pDCs特异性表达Toll样受体（TLR）7、TLR9，在其内体内识别病毒/微生物核酸，其中TLR9可特异性识别CpGDN（细菌DNA中非甲基化的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤基序），通过MyD88-TRAF6-MAPK-NF-κB信号转导途径，快速产生强大的型干扰素（IFNs）反应。异常产生的IFN是病理性自身免疫现象的主要原因，主要是诱导了外周髓性树突状细胞的不断成熟，进而活化自身反应性T细胞。
正常情况下，pDCs不与自身DNA起反应。病毒等微生物的核酸含有大量能与之结合并激活TLR9的CpGDNA序列，但是哺乳动物自身DNA大部分都是甲基化的，极少含有CpGDNA序列。而近来的研究显示自身DNA有潜在激活TLR9的活性，之所以没有激活的原因是自身DNA不能进入含有TLR9的内体中，但相关机制仍不明了。
银屑病患者皮肤中存在pDCs浸润，pDCs的活化被认为是炎症或免疫应答的“上游”，继之触发自身免疫性T细胞活化，导致皮肤炎症性皮损形成。皮肤受到损伤或刺激时可加剧银屑病，提示在皮肤损害、自身DNA释放及局部pDCs活化之间存在潜在的联系。
最新的研究显示，内源性抗菌肽LL-37在银屑病皮损中过度表达是银屑病皮损中pDCs活化的关键因素。该过程涉及3个独立的步骤。首先，LL-37通过静电作用结合自身DNA使其发生构型改变，形成聚合的致密结构；其次，LL-37促使其与自身DNA复合物进入pDC的早期内体中，因此绕过了位于细胞内TLR9识别病毒/微生物DNA而不识别自身DNA的安全机制；最后，LL-37将其与DNA的复合物留在早期内体中，并可能在此过程中对其进行修饰，从而特异性地维持TLR9介导的IFNs产生。LL-37打破了对自身DNA的先天性耐受，使其通过与病毒核酸相似的途径，快速强力地诱导IFNs产生，进一步激活先天及获得性免疫反应。有研究认为细胞凋亡过程中自身DNA释放到胞外，这些DNA与LL-37共同激活免疫系统，造成组织损害。还有研究认为损伤皮肤中上皮细胞通过调节LL-37的表达能够活化并维持免疫反应，增强其抗感染作用并促进伤口愈合。以往认为银屑病皮损处的感染发生率低，与LL-37的高表达相关联。事实上，LL-37是银屑病皮损中促使IFNs反应的主要诱发因素，第一次将抗菌防御系统与银屑病的发病机制联系起来。皮肤受到损伤时上皮细胞LL-37表达失调（过度表达）引起pDCs在银屑病皮损中不断地活化、积聚，诱导IFNs异常产生，导致髓性树突状细胞成熟，促发局部T细胞介导的病理性自身免疫性反应，导致银屑病发生。
2.促进上皮细胞增生及血管形成
目前LL-37已被公认是一种上皮细胞生长因子。Tokumaru等报告LL-37可诱导上皮细胞生长因子受体转录活化，并促使KC迁移。促进血管形成是LL-37的另一功能。Koczulla等报告在组织模型及兔的动物模型中，LL-37可导致新生血管形成，并且这种血管形成是由内皮细胞formylpeptidereceptor-like(FPRL)-1受体所介导。KC过度增生，真皮乳头毛细血管扩张、迂曲和新生血管形成是银屑病的组织病理学特点。因此LL-37促进上皮细胞增生及血管形成的作用可能与银屑病组织病理学特点的形成有关。
3.对炎性细胞的趋化作用
中性粒细胞、淋巴细胞及组织细胞等炎性细胞浸润是银屑病的另一大组织病理学特点。Chertov等报告LL37对中性粒细胞、单核细胞及T淋巴细胞等有明显的趋化作用。另外，LL-37可上调巨噬细胞内趋化性细胞因子IL-8的表达，而受IL-8刺激的中性粒细胞又能释放LL-37，进一步趋化更多的炎性细胞聚集。LL-37的这些作用是导致银屑病皮损中炎性细胞浸润以及中性粒细胞微脓肿形成的重要因素之一。
Pgp3蛋白是由沙眼衣原体编码的一个约28KDa的分泌性蛋白，经过本发明研究发现Pgp3蛋白可以结合LL-37，从而抑制银屑病皮损的发展，而且外用和注射Pgp3蛋白均可以达到相同的效果。本发明治疗效果明显，毒副作用小，有望替代目前以外用激素为主的银屑病治疗药物，具有重要的科研和临床价值。
SEQUENCELISTING
<110>侯淑萍
<120>衣原体蛋白Pgp3在制备抑制银屑病样皮损药物中的应用
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SEQUENCELISTING
<110>侯淑萍
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Claims (2)
1.一种衣原体蛋白Pgp3在制备抑制银屑病样皮损药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的衣原体蛋白Pgp3在制备抑制银屑病样皮损药物中的应用，其特征在于：所述衣原体蛋白Pgp3与人类抗菌多肽LL-37结合抑制银屑病皮损的发展。
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|---|---|---|---|
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510634943.4A CN105126077A (zh) | 2015-09-30 | 2015-09-30 | 衣原体蛋白Pgp3在制备抑制银屑病样皮损药物中的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| CN105126077A true CN105126077A (zh) | 2015-12-09 |
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Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
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| Country | Link |
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| CN (1) | CN105126077A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114177294A (zh) * | 2021-12-14 | 2022-03-15 | 天津医科大学总医院 | 衣原体蛋白Pgp3在制备抑制输卵管炎症药物中的应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995028487A2 (en) * | 1994-04-19 | 1995-10-26 | Biocine S.P.A. | Recombinant pgp3, methods of preparation and use in diagnosis and therapy |
| WO2013007985A1 (en) * | 2011-07-08 | 2013-01-17 | Imperial Innovations Limited | Method |
-
2015
- 2015-09-30 CN CN201510634943.4A patent/CN105126077A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995028487A2 (en) * | 1994-04-19 | 1995-10-26 | Biocine S.P.A. | Recombinant pgp3, methods of preparation and use in diagnosis and therapy |
| WO2013007985A1 (en) * | 2011-07-08 | 2013-01-17 | Imperial Innovations Limited | Method |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| SHUPING HOU, ET AL.: "Chlamydial Plasmid-Encoded Virulence Factor Pgp3 Neutralizes the Antichlamydial Activity of Human Cathelicidin LL-37", 《INFECTION AND IMMUNITY》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114177294A (zh) * | 2021-12-14 | 2022-03-15 | 天津医科大学总医院 | 衣原体蛋白Pgp3在制备抑制输卵管炎症药物中的应用 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |