CN104569420B - 适配体修饰的纳米银探针及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种不同适配体分子同时修饰的纳米银探针以及可与之配套使用的快速显色试剂。纳米银探针以直径为10～30nm的纳米银球为内核，银球外表面键合有不同物质的适配体链和寡核苷酸链。本发明还公开了包含上述探针的试剂盒在同时可视化检测人免疫球蛋白E和血小板衍生生长因子中的应用。本发明的纳米银探针与显色剂联用可同时检测多种待测目标物，且可提高可视化检测的灵敏度，特异性好。此种纳米银探针的合成及修饰方法成熟，显色剂检测性能优良、稳定。两者配合使用可实现样本的多靶标检测，且可提高灵敏度，简化检测过程。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种不同适配体修饰的纳米银探针及其试剂盒可同时多靶标检测的应用。
背景技术
食物过敏反应是现代社会中常见的一大类疾病，其发生的原因是进食或接触各种食物中的变应原引起的，这些反应中大都是由免疫球蛋白E引起的I型超敏反应。对血清样本中IgE的检测，可以帮助进行医疗诊断。血小板衍生生长因子(platelet-derived growthfactor，PDGF)是一种强效的丝裂原和重要的促肿瘤血管生成生长因子，可由多种血细胞、组织细胞和一些肿瘤细胞产生。目前对肿瘤细胞中PDGF表达与检测的研究已成为生物医学研究领域的热点之一。适配体是具有三维空间结构能特异性识别目标分子的DNA或RNA分子，合成容易，易于修饰且稳定。纳米银具有优良的表面催化特性，当金属粒子和还原剂分子吸附到其表面时，纳米银催化氧化还原反应并在其表面产生一层金属膜。基于此原理，我们合成了适配体修饰的纳米银探针，通过其催化金属沉积实现高灵敏，特异性可视化分析检测。我们利用适配体功能化的纳米银可以实现对人IgE和PDGF-BB的特异性识别，同时定量可视化检测其含量。
发明内容
本发明要解决的技术问题，是提供包含上述纳米银材料及显色液的试剂盒，并用于人IgE和PDGF-BB的同时定量可视化检测。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种不同适配体分子修饰的纳米银探针，其特征在于，它以直径为10～30nm的纳米银球为内核，银球外表面键合有不同适配体链和寡核苷酸链；
其中，所述的适配体链分别为IgE适配体和PDGF-BB适配体：
其中，所述的IgE适配体链为：
5’SH-(CH2)6-AAAAAGGGGCACGTTTATCCGTCCCTCCTAGTGGCGTGCCCC-3’
其中，所述的PDGF-BB适配体链为：
5’-SH-(CH2)6-AAAAAACAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG-3’；
其中，所述的寡核苷酸链为：
5’-SH-(CH2)6-AAAAA AAAAA AAAAA-3’。
上述不同适配体修饰的纳米银探针的制备方法，包括如下步骤：
(1)在冰浴条件下，将2-20mmol/L硝酸银溶液逐滴加入至3-30mmol/L硼氢化钠溶液中，硝酸银与硼氢化钠的反应摩尔比为1：3，不断搅拌至反应完全，然后补加硼氢化钠溶液，补加的硼氢化钠的摩尔量为上述参与反应的硼氢化钠的摩尔量的7％，继续搅拌至室温，得到纳米银溶液；
(2)将不同的适配体链和寡核苷酸链按摩尔比(1～9):(1～9):(1～99)加入步骤(1)得到的纳米银溶液中，静置10～24小时，适配体链和寡核苷酸链的总摩尔量与纳米银摩尔量之比为(100-1000):1；
(3)向步骤(2)得到的混合体系中加入1×PBS缓冲溶液，使得混合体系中的PBS缓冲溶液的浓度为0.1×PBS，静置3～10小时；
(4)向步骤(3)得到的混合体系中加入1～5mol/L氯化钠溶液，静置2～4小时，重复加入氯化钠溶液与静置的步骤1～4次，使得氯化钠的终浓度为0.1～0.3mol/L；
(5)将步骤(4)得到的混合体系静置24～72小时；
(6)将步骤(5)得到的溶液经离心去除上清，取沉淀加入1×PBS缓冲溶液重悬，重复离心与重悬的步骤2～4次，1×PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的0.1～5倍；最后离心得到的沉淀用1×PBSM缓冲溶液重悬即得备用探针。
制备得到的不同适配体修饰的纳米银探针可用于制备同时检测人IgE和PDGF-BB的试剂盒。
其中，该试剂盒包含如下试剂：制备有抗人IgE抗体和抗PDGF-BB抗体的芯片、含有人IgE和PDGF-BB蛋白的标准溶液、修饰有人IgE和PDGF-BB适配体的纳米银探针、洗涤液、显色液。
其中，洗涤液为PBST，即1×PBS溶液中加入0.05％的吐温-20；
其中，显色液为10mmol/L氯金酸和2mmol/L氢醌等体积混合；
其中，上述的同时检测人IgE和PDGF-BB的试剂盒，其操作方法包括如下步骤：
(1)在不同的芯片孔中加入不同浓度的人IgE和PDGF-BB的标准溶液和待测样品各30μL，在37℃条件下反应1小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3～4次，拍干；
(2)每孔加入修饰有人IgE和PDGF-BB适配体的纳米银探针30μL，在37℃条件下反应1小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3～4次，拍干；
(3)每孔加入30μL显色剂溶液，避光反应1～8min，去离子水冲洗3～4遍，拍干；
(4)用芯片分析仪扫描，并用芯片分析软件对图像进行处理，不同浓度的人IgE和PDGF-BB标准溶液对应不同的灰度值，得到两条标准曲线，由标准曲线计算得到样品中人IgE和PDGF-BB的浓度。
有益效果：本发明的纳米银探针联合显色剂的方法能大大提高显色检测的灵敏度，且用于可视化检测的芯片分析仪成本低，具有普适性和实用性高等优点。纳米银探针的合成及修饰方法成熟，可修饰不同的检测探针，可实现同时多靶标检测。制备的显色剂显色性能好，为蛋白质的可视化定量分析提供了一种高灵敏度的方法。
本发明利用不同适配体分子对蛋白质的特异性识别作用实现对人IgE和PDGF-BB的同时高灵敏特异性检测，对人IgE的定量范围为5ng mL-1to 500ng mL-1，PDGF-BB的定量范围为1.56ng/mL-100ng/mL,且特异性好，人免疫球蛋白IgG、人血清蛋白HSA、血清serum等没有干扰。本发明试剂盒中所采用的显色剂，与商品化的银增强试剂比较，所需显色时间短，在检测低浓度的蛋白质含量时具有明显的优势。
附图说明
图1纳米银探针的紫外-可见吸收光谱图。
其种1-纳米银(AgNPs，2.6nmol/L)，2-适配体修饰的纳米银探针(Ag-apt)，3-离心后适配体修饰的纳米银探针(Ag-apt,1.03nmol/L)
图2检测人IgE浓度的信号相关性曲线及扫描图。
图3检测PDGF-BB浓度的信号相关性曲线及扫描图。
图4显色后芯片表面的扫描电子显微镜图
图5检测PDGF-BB的特异性曲线。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：纳米银探针的制备。
(1)在冰浴的条件下，将2mmol/L的硝酸银以一定的速度滴加至3mmol/L的硼氢化钠溶液中(两者反应摩尔比为1:3)，不断搅拌至反应完全，反应完成后补加7％摩尔量的硼氢化钠溶液并加热得到黄色溶液，纳米银的浓度为2.6nM。
(2)将人IgE、PDGF-BB适配体链和寡核苷酸链按摩尔比3:3:1加入步骤(1)得到的纳米银溶液中，静置18小时。适配体链和寡核苷酸链的总摩尔量与纳米银摩尔量之比为288。
所述的IgE适配体链为：
5’SH-(CH2)6-AAAAAGGGGCACGTTTATCCGTCCCTCCTAGTGGCGTGCCCC-3’
所述的PDGF-BB适配体链为：
5’-SH-(CH2)6-AAAAAACAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG-3’；
所述的寡核苷酸链为：
5’-SH-(CH2)6-AAAAA AAAAA AAAAA-3’。
其5’端由巯基修饰，且连接碱基A；
(3)向步骤(2)得到的混合体系中加入1×PBS(137mM NaCl,2.7mM KCl,10mM,Na2HPO4·12H2O,2mM KH2PO4)溶液，使PBS的浓度为0.1×，静置6小时。
(4)向步骤(3)得到的混合体系中加入2mol/L氯化钠溶液，每隔3小时加一次氯化钠，静置，使氯化钠的终浓度为0.2mol/L。
(5)将步骤(4)得到的混合体系静置48小时。
(6)将步骤(5)得到的溶液经离心去除上清，沉淀加入1×PBS溶液重悬，重复离心与重悬的步骤3次，PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的1倍；最后离心得到的沉淀经1×PBSM重悬即得适配体修饰的纳米银探针。图1为纳米银探针的紫外-可见吸收光谱图。
实施例2：纳米银探针的制备。
(1)在冰浴的条件下，将20mmol/L的硝酸银以一定的速度滴加至30mmol/L的硼氢化钠溶液中(两者反应摩尔比为1:3)，不断搅拌至反应完全，反应完成后补加7％摩尔量的硼氢化钠溶液并加热得到黄色溶液，纳米银的浓度为2.6nmol/L。
(2)将人IgE、PDGF-BB适配体链和寡核苷酸链按摩尔比1:1:1加入步骤(1)得到的纳米银溶液中，静置10小时。适配体链和寡核苷酸链的总摩尔量与纳米银摩尔量之比为100。
所述的IgE适配体链为：
5’SH-(CH2)6-AAAAAGGGGCACGTTTATCCGTCCCTCCTAGTGGCGTGCCCC-3’
所述的PDGF-BB适配体链为：
5’-SH-(CH2)6-AAAAAACAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG-3’；
所述的寡核苷酸链为：
5’-SH-(CH2)6-AAAAA AAAAA AAAAA-3’。
其5’端由巯基修饰，且连接碱基A；
(3)向步骤(2)得到的混合体系中加入1×PBS(137mM NaCl,2.7mM KCl,10mM,Na2HPO4·12H2O,2mM KH2PO4)溶液，使PBS的浓度为0.1M，静置3小时。
(4)向步骤(3)得到的混合体系中加入1mol/L氯化钠溶液，静置2小时，重复加入氯化钠溶液与静置的步骤1次，使氯化钠的终浓度为0.1mol/L。
(5)将步骤(4)得到的混合体系静置24小时。
(6)将步骤(5)得到的溶液经离心去除上清，沉淀加入1×PBS溶液重悬，重复离心与重悬的步骤2次，PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的0.1倍；最后离心得到的沉淀经1×PBSM重悬即得适配体修饰的纳米银探针。
实施例3：纳米银探针的制备。
(1)在冰浴的条件下，将10mmol/L的硝酸银以一定的速度滴加至20mmol/L的硼氢化钠溶液中(两者反应摩尔比为1:3)，不断搅拌至反应完全，反应完成后补加7％摩尔量的硼氢化钠溶液并加热得到黄色溶液，纳米银的浓度为2.6nmol/L。
(2)将人IgE、PDGF-BB适配体链和寡核苷酸链按摩尔比9:9:99加入步骤(1)得到的纳米银溶液中，静置24小时。适配体链和寡核苷酸链的总摩尔量与纳米银摩尔量之比为1000。
所述的IgE适配体链为：
5’SH-(CH2)6-AAAAAGGGGCACGTTTATCCGTCCCTCCTAGTGGCGTGCCCC-3’
所述的PDGF-BB适配体链为：
5’-SH-(CH2)6-AAAAAACAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG-3’；
所述的寡核苷酸链为：
5’-SH-(CH2)6-AAAAA AAAAA AAAAA-3’。
其5’端由巯基修饰，且连接碱基A；
(3)向步骤(2)得到的混合体系中加入1×PBS(137mM NaCl,2.7mM KCl,10mM,Na2HPO4.·12H2O,2mM KH2PO4)溶液，使PBS的浓度为0.1×，静置10小时。
(4)向步骤(3)得到的混合体系中加入5mol/L氯化钠溶液，静置4小时，重复加入氯化钠溶液与静置的步骤4次，使氯化钠的终浓度为0.3mol/L。
(5)将步骤(4)得到的混合体系静置72小时。
(6)将步骤(5)得到的溶液经离心去除上清，沉淀加入1×PBS溶液重悬，重复离心与重悬的步骤4次，PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的5倍；最后离心得到的沉淀经1×PBSM重悬即得适配体修饰的纳米银探针。
实施例4：用于同时检测人IgE和PDGF-BB的试剂盒。
适配体修饰的纳米银探针按实施例1～3的方法合成；
PBS(购自上海生工生物工程有限公司)及Tween-20(购自天津科美有限公司)用于配制洗涤液；
牛血清白蛋白购自北京博奥森生物技术有限公司；
抗人IgE抗体和抗PDGF-BB抗体购自Abcam,USA；
人IgE和PDGF-BB蛋白购自于R&D Systems,Minneapolis,USA；
氯金酸购自于(上海试剂一厂)；
氢醌购自于(南京试剂有限公司)；
制备有人IgE和PDGF-BB的芯片购自于(南京祥中生物科技有限公司)。
所有溶液均用高纯水配制。
实施例5：检测人IgE和PDGF-BB含量的方法。
利用实施例4的试剂盒检测人IgE和PDGF-BB含量的具体方法，依次顺序包括如下步骤：
(1)在不同的芯片孔中加入不同浓度的人IgE和PDGF-BB的标准溶液和待测样品各30μL，在37℃条件下反应1小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3～4次，拍干；
(2)每孔加入修饰有人IgE和PDGF-BB适配体的纳米银探针30μL，在37℃条件下反应1小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3～4次，拍干；
(3)每孔加入30μL显色剂溶液，避光反应5min，去离子水冲洗3～4遍，拍干；
(4)用芯片分析仪扫描，并用芯片分析软件对图像进行处理，不同浓度的人IgE和PDGF-BB标准溶液对应不同的灰度值，得到两条标准曲线，由标准曲线计算得到样品中人IgE和PDGF-BB的浓度。结果见图2和图3分别为IgE和PDGF-BB的线性关系图，图4为显色后的扫描电子显微镜图。
实施例6：人IgE和PDGF-BB的特异性。
试验方法：
(1)在不同的孔中分别加入50ng/mL IgE、50ng/mL PDGF-BB、10％serum、50μg/mL人血清白蛋白(HSA)、50μg/mL人免疫球蛋白IgG、1mg/mLBSA各30μL，在37℃条件下反应1小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3次，拍干；
(2)每孔加入不同适配体修饰的纳米银探针30μL，在37℃条件下反应1小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3次，拍干；
(3)每孔加入30μL显色剂，避光反应5min，去离子水冲洗3次，拍干；
(4)用芯片分析仪扫描，并用芯片分析软件对图像进行处理，得到人IgE和PDGF-BB特异性的数据，结果见图5。
本发明将纳米银探针应用于人IgE和PDGF-BB的分析检测中，当人IgE的浓度在5ng/mL-500ng/mL和PDGF-BB的浓度在1.56ng/mL-100ng/mL，信号强度与浓度具有很好的相关性，相关系数分别为0.9813和0.9861。纳米银探针与我们自制的显色剂联合使用能显著增强显色信号。在同等的条件下，我们将商品化的银增强试剂与纳米银探针联用，其线性范围分别为20ng/mL-500ng/mL和12.50ng/mL-100ng/mL，表明本发明中试剂盒所用显色剂在低浓度区域有显著的优势，线性范围更宽，检测限降低。而且此显色体系具有很好的特异性，能特异性识别人IgE和PDGF-BB，不受复杂体系(如人血清)中其它因素的干扰。
Claims (7)
1.一种不同适配体分子修饰的纳米银探针，其特征在于，它以直径为10～30nm的纳米银球为内核，银球外表面键合有不同适配体链和寡核苷酸链；
其中，所述的适配体链分别为IgE适配体和PDGF-BB适配体：
其中，所述的IgE适配体链为：
5’SH-(CH2)6-AAAAAGGGGCACGTTTATCCGTCCCTCCTAGTGGCGTGCCCC-3’；
其中，所述的PDGF-BB适配体链为：
5’-SH-(CH2)6-AAAAAACAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG-3’；
其中，所述的寡核苷酸链为：
5’-SH-(CH2)6-AAAAAAAAAAAAAAA-3’。
2.权利要求1所述的适配体修饰的纳米银探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)在冰浴条件下，将2-20mmol/L硝酸银溶液逐滴加入至3-30mmol/L硼氢化钠溶液中，硝酸银与硼氢化钠的反应摩尔比为1：3，不断搅拌至反应完全，然后补加硼氢化钠溶液，补加的硼氢化钠的摩尔量为上述参与反应的硼氢化钠的摩尔量的7％，继续搅拌至室温，得到纳米银溶液；
(2)将不同的适配体链和寡核苷酸链按摩尔比(1～9):(1～9):(1～99)加入步骤(1)得到的纳米银溶液中，静置10～24小时，适配体链和寡核苷酸链的总摩尔量与纳米银摩尔量之比为(100-1000):1；
(3)向步骤(2)得到的混合体系中加入1×PBS缓冲溶液，使得混合体系中的PBS缓冲溶液的浓度为0.1×PBS，静置3～10小时；
(4)向步骤(3)得到的混合体系中加入1～5mol/L氯化钠溶液，静置2～4小时，重复加入氯化钠溶液与静置的步骤1～4次，使得氯化钠的终浓度为0.1～0.3mol/L；
(5)将步骤(4)得到的混合体系静置24～72小时；
(6)将步骤(5)得到的溶液经离心去除上清，取沉淀加入1×PBS缓冲溶液重悬，重复离心与重悬的步骤2～4次，1×PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的0.1～5倍；最后离心得到的沉淀用1×PBSM缓冲溶液重悬即得备用探针。
3.权利要求1所述的不同适配体修饰的纳米银探针在同时检测人IgE和PDGF-BB中的应用。
4.一种用于同时检测人IgE和PDGF-BB的试剂盒，其特征在于，包含如下试剂： 制备有抗人IgE抗体和抗PDGF-BB抗体的芯片、含有人IgE和PDGF-BB蛋白的标准溶液、权利要求1所述的纳米银探针、洗涤液、显色液。
5.根据权利要求4用于同时检测人IgE和PDGF-BB的试剂盒，其特征在于，所述的洗涤液为PBST，即1×PBS溶液中加入0.05％的吐温-20。
6.根据权利要求4用于同时检测人IgE和PDGF-BB的试剂盒，其特征在于，所述的显色液为10mmol/L氯金酸和2mmol/L氢醌等体积混合。
7.根据权利要求4用于同时检测人IgE和PDGF-BB的试剂盒，其特征在于，所述的同时检测人IgE和PDGF-BB的试剂盒，其操作方法包括如下步骤：
(1)在不同的芯片孔中加入不同浓度的人IgE和PDGF-BB的标准溶液和待测样品各30μL，在37℃条件下反应1小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3～4次，拍干；
(2)每孔加入修饰有人IgE和PDGF-BB适配体的纳米银探针30μL，在37℃条件下反应1小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3～4次，拍干；
(3)每孔加入30μL显色剂溶液，避光反应1～8min，去离子水冲洗3～4遍，拍干；
(4)用芯片分析仪扫描，并用芯片分析软件对图像进行处理，不同浓度的人IgE和PDGF-BB标准溶液对应不同的灰度值，得到两条标准曲线，由标准曲线计算得到样品中人IgE和PDGF-BB的浓度。
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