CN103910811A - 一种低电内渗琼脂糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种低电内渗琼脂糖的制备方法，包括如下步骤：A称取琼脂粉加入pH4.4磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液，琼脂粉的添加量为20～100g·L-1；B搅拌；C趁热抽滤，收集滤液；D用蒸馏水反复洗涤至滤液呈中性；E烘干、粉碎得初级琼脂糖；F称取1重量份初级琼脂糖，加入150-250重量份蒸馏水，加热溶解；G加入3-7重量份经过预处理的DEAE-纤维素树脂；H趁热抽滤，留滤渣；I用85℃以上高温蒸馏水洗涤滤渣，收集滤液；J将滤液烘干，粉碎得低电内渗琼脂糖。本发明所使用的原料，制备方法都简单，获得的琼脂糖电内渗值低，可以低于0.1以下。
Description
技术领域
本发明涉及生化领域，具体涉及一种低电内渗琼脂糖的制备方法。
背景技术
电内渗是琼脂糖的重要质量标准之一,它在一定程度上反映了琼脂糖凝胶带负电荷的量。电内渗对电泳,尤其是对等电聚焦电泳的影响很大。用琼脂糖作电泳介质时,琼脂糖中含有的硫酸基、丙酮基等带负电荷的基团使琼脂糖凝胶带负电荷。电泳时,在电场力的作用下,凝胶本身虽然不向正极移动,但凝胶中的水在水合氢离子的作用下向阴极移动,样品中的中性分子随着水也向阴极移动。电内渗使电泳过程变得复杂起来,更重要的是电内渗产生静水压头,使一端电极有水渗出,另一端电极的水越来越少,破坏了凝胶结构,打破了电泳场的均一性。低电内渗琼脂糖被广泛用作各种电泳和分子筛色谱的稳定介质，其价格远高于初级琼脂糖。
电内渗是琼脂糖的重要质量标准之一,其数值越低越有利。现有技术中利用琼脂（琼胶）制备琼脂糖的方法有聚乙二醇沉淀法、DEAE-纤维素树脂法、乙酰化法等，但这些方法所制备的琼脂糖其电内渗值偏高。例如，直接采用DEAE-纤维素树脂法从江蓠琼脂中制备琼脂糖，其电内渗值都在0.2以上。另有文献报道采用DEAE-纤维素树脂法从石花菜琼脂中制备的琼脂糖其电内渗值为0.12，但此数值仍然较高；其次只用DEAE-纤维素树脂法不适用于其他红藻来源的琼脂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种低电内渗琼脂糖的制备方法，其可从琼脂中分离制备出更低电内渗琼脂糖，从而提升琼脂的价值。
本发明提供的技术方案如下：
一种低电内渗琼脂糖的制备方法，所述低电内渗琼脂糖，其电内渗值至少低于0.1，包括如下步骤：
A称取琼脂粉加入pH4.4磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液，琼脂粉的添加量为20-100g·L-1；
B在40℃-80℃下，缓慢匀速搅拌6小时以上；
C趁热抽滤，收集滤液；
D用蒸馏水反复洗涤至滤液呈中性，再用超纯水洗涤1-3次;
E烘干、粉碎得初级琼脂糖；
F称取1重量份初级琼脂糖，加入150-250重量份蒸馏水，加热溶解；
G DEAE-纤维素树脂先进行如下的预处理：依次用5-15%NaCl浸泡15-25小时，5-15%HCl浸泡3-7小时，3-5%NaOH浸泡2-6小时；将3-7重量份经过预处理的DEAE-纤维素树脂加入步骤F所得溶液，在65℃-80℃下先缓慢匀速搅拌1-3.5小时，再静置10分钟-100分钟；
H趁热抽滤，留滤渣；
I用85℃以上高温蒸馏水洗涤滤渣，收集滤液；
J将滤液烘干，粉碎得低电内渗琼脂糖。
所述低电内渗琼脂糖，其电内渗值低于0.08。更好地，所述低电内渗琼脂糖，其电内渗值为0.08-0.065。
其中，步骤G中，静置时需要保温，
其中，步骤J将滤液烘干之前，滤液可以先浓缩，再烘干。
较佳地，前述低电内渗琼脂糖的制备方法包括如下步骤：
A称取琼脂粉加入pH4.4磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液，琼脂粉的添加量为20g·L-1；
B在70℃下，缓慢匀速搅拌12小时；
C趁热抽滤，收集滤液；
D用蒸馏水反复洗涤至滤液呈中性，再用超纯水洗涤2次;
E烘干、粉碎得初级琼脂糖；
F称取1重量份初级琼脂糖，加入200重量份蒸馏水，加热溶解；
G加入5重量份经过预处理的DEAE-纤维素树脂，在70℃下先缓慢匀速搅拌2小时，再静置30分钟；预处理程序为：依次用10%NaCl浸泡20h，10%HCl浸泡4h，4%NaOH浸泡4h；
H趁热抽滤，留滤渣；
I用85℃以上高温蒸馏水洗涤滤渣，收集滤液；
J将滤液烘干，粉碎得低电内渗琼脂糖。
本发明所使用的原料，制备方法都简单，经过本发明方法，获得的琼脂糖电内渗值低，可以达到0.08以下，大大提升了琼脂的价值。本发明方法适合工业化生产，并且适用于各种红藻来源的琼脂。
具体实施方式
实施例一
1、从琼脂中分离制备初级琼脂糖
称取4g琼脂粉（石花菜琼脂）加入200mL pH4.4磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液中。
（磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液，pH4.4磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液配制方法：
A----配制0.2mol/L磷酸氢二钠溶液:称取十二水合磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O--分子量358.14）71.63g，用蒸馏水溶解，定容至1L。
B----配制0.1mol/L柠檬酸溶液：称取一水合柠檬酸（分子量210.14）42.03g，用蒸馏水溶解，定容至2L。
C----分别量取0.2mol/L磷酸氢二钠溶液882ml、0.1mol/L柠檬酸溶液1118ml，混合，可得pH4.4磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液），在70℃恒温下以每分钟15转的转速搅拌12小时。趁热抽滤，收集滤液。用蒸馏水反复洗涤至滤液呈中性，再用超纯水洗涤两次。置于60℃电热恒温鼓风干燥箱烘干，称重，粉碎得3.09g初级琼脂糖，得率为77.25%。经测定，其电内渗值为0.22。
2、从琼脂中分离制备低电内渗级琼脂糖
称取2.0g磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液法制备的初级琼脂糖，加入200ml蒸馏水，加热溶解，加入5g经过预处理的DEAE-纤维素树脂（依次用10%NaCl浸泡20h，10%HCl浸泡4h，4%NaOH浸泡4h），在70℃下以转速15r/min匀速搅拌2h。静置保温0.5h后趁热抽滤，用100ml90℃蒸馏水洗涤滤饼。滤液回收，50℃旋转蒸发浓缩至浓稠状，置于60℃鼓风干燥箱烘干，称重，粉碎得低电内渗琼脂糖1.51g，得率为75.50%，经测定其电内渗值为0.065。
其中电内渗值的测定方法为碱性巴比妥法，具体测定过程为：取0.3g琼脂糖样品加20ml pH8.6巴比妥缓冲液，加热配成1.5%琼脂糖胶液，趁热倒入胶板上，立即放上梳子，防渗漏，20min后取下挡板和梳子，将胶板和架放入电泳槽，加pH8.6巴比妥缓冲液，液面没过胶板不超过1cm，取葡聚糖和血清蛋白配成的溶液5ul，上样，室温下恒压75V，电泳1.5h，取出琼脂糖胶板，脱色剂浸泡15min，洗去溴百里酚蓝，染色剂浸泡20min染色，然后再用脱色剂浸泡，中间更换2次脱色剂，测量正极蓝斑到上样位置的距离OA，负极白斑到上样处距离OD，则电内渗=OD／(OA+OD)*100%。
实施例二
1、从琼脂中分离制备初级琼脂糖
称取12g琼脂粉（江蓠琼脂）加入200mL pH4.4磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液中，在50℃恒温下以每分钟20转的转速搅拌18小时。趁热抽滤，收集滤液。用蒸馏水反复洗涤至滤液呈中性，再用超纯水洗涤两次。置于50℃电热恒温鼓风干燥箱烘干，称重，粉碎得9.23g初级琼脂糖，得率为76.9%。经测定，其电内渗值为0.20。
2、从琼脂中分离制备低电内渗级琼脂糖
称取6.0g磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液法制备的初级琼脂糖，加入600ml蒸馏水，加热溶解，加入5g经过预处理的DEAE-纤维素树脂（依次用10%NaCl浸泡20h，10%HCl浸泡4h，4%NaOH浸泡4h），在70-75℃下以转速10-20r/min匀速搅拌2-2.5h。静置保温0.5-1h后趁热抽滤，用300ml95℃蒸馏水洗涤滤饼。滤液回收，55℃旋转蒸发浓缩至浓稠状，置于50℃鼓风干燥箱烘干，称重，粉碎得低电内渗琼脂糖4.5g，得率为75.0%，经测定其电内渗值为0.08。
实施例三
1、从琼脂中分离制备初级琼脂糖
称取20g琼脂粉（江蓠琼脂）加入200mL pH4.4磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液中，在40℃恒温下以每分钟15转的转速搅拌24小时。趁热抽滤，收集滤液。用蒸馏水反复洗涤至滤液呈中性，再用超纯水洗涤两次。置于55℃电热恒温鼓风干燥箱烘干，称重，粉碎得15.45g初级琼脂糖，得率为77.25%。经测定，其电内渗值为0.21。
2、从琼脂中分离制备低电内渗级琼脂糖
称取10g磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液法制备的初级琼脂糖，加入1000ml蒸馏水，加热溶解，加入25g经过预处理的DEAE-纤维素树脂（依次用10%NaCl浸泡20h，10%HCl浸泡4h，4%NaOH浸泡4h），在75℃下以转速20r/min匀速搅拌2.5h。静置保温1h后趁热抽滤，用450ml98℃蒸馏水洗涤滤饼。滤液回收，60℃旋转蒸发浓缩至浓稠状，置于55℃鼓风干燥箱烘干，称重，粉碎得低电内渗琼脂糖7.5g，得率为75.0%，经测定其电内渗值为0.068。
Claims (6)
1.一种低电内渗琼脂糖的制备方法，所述低电内渗琼脂糖，其电内渗值低于0.1，包括如下步骤：
A称取琼脂粉加入pH4.4磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液，琼脂粉的添加量为20-100g·L-1；
B在40℃-80℃下，缓慢匀速搅拌6小时以上；
C趁热抽滤，收集滤液；
D用蒸馏水反复洗涤至滤液呈中性，再用超纯水洗涤1-3次；
E烘干、粉碎得初级琼脂糖；
F称取1重量份初级琼脂糖，加入150-250重量份蒸馏水，加热溶解；
G DEAE-纤维素树脂先进行如下的预处理：依次用5-15%NaCl浸泡15-25小时，5-15%HCl浸泡3-7小时，3-5%NaOH浸泡2-6小时；将3-7重量份经过预处理的DEAE-纤维素树脂加入步骤F所得溶液，在65℃-80℃下先缓慢匀速搅拌1-3.5小时，再静置10分钟-100分钟；
H趁热抽滤，留滤渣；
I用85℃以上高温蒸馏水洗涤滤渣，收集滤液；
J将滤液烘干，粉碎得低电内渗琼脂糖。
2.如权利要求1所述的一种低电内渗琼脂糖的制备方法，其特征在于：所述低电内渗琼脂糖，其电内渗值低于0.08。
3.如权利要求1所述的一种低电内渗琼脂糖的制备方法，其特征在于：所述低电内渗琼脂糖，其电内渗值为0.08-0.065。
4.如权利要求1所述的一种低电内渗琼脂糖的制备方法，其特征在于：步骤G中，静置时需要保温。
5.如权利要求1所述的一种低电内渗琼脂糖的制备方法，其特征在于：步骤J将滤液烘干之前，滤液可以先浓缩，再烘干。
6.如权利要求1所述的一种低电内渗琼脂糖的制备方法，包括如下步骤：
A称取琼脂粉加入pH4.4磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液，琼脂粉的添加量为20g·L-1；
B在70℃下，缓慢匀速搅拌12小时；
C趁热抽滤，收集滤液；
D用蒸馏水反复洗涤至滤液呈中性，再用超纯水洗涤2次;
E烘干、粉碎得初级琼脂糖；
F称取1重量份初级琼脂糖，加入200重量份蒸馏水，加热溶解；
G加入5重量份经过预处理的DEAE-纤维素树脂，在70℃下先缓慢匀速搅拌2小时，再静置30分钟；预处理程序为：依次用10%NaCl浸泡20h，10%HCl浸泡4h，4%NaOH浸泡4h；
H趁热抽滤，留滤渣；
I用85℃以上高温蒸馏水洗涤滤渣，收集滤液；
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