CN103743711B - 利用环糊精与荧光共振能量转移技术检测食品中赤霉素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用环糊精与荧光共振能量转移技术检测食品中赤霉素的方法。利用环糊精的包含作用，使能量转移体系的受体丁基罗丹明B的荧光强度增强，从而建立了一种测定食品中赤霉素含量的方法。赤霉素的浓度在40~760？纳克/毫升范围内与荧光猝灭量呈良好的线性关系，方法检出限为8.9纳克/毫升。本发明克服了已有技术在检测时存在灵敏度低、应用范围窄等缺点，提高了灵敏度和选择性，对于食品中低浓度赤霉素的检测更加方便快速。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用环糊精的包含作用与荧光共振能量转移技术快速检测食品中痕量赤霉素的方法。
背景技术
赤霉素是广泛存在的一类植物激素，主要用于促进农产品的生长。赤霉素的种类共有100余种之多，其中以赤霉素GA3最普遍。有研究发现，赤霉素在人体内残留后代谢不完全，从而引发疾病，欧美等国家已对赤霉素GA3的残留量制定了相关标准。目前国内外检测赤霉素的方法主要有高效液相色谱法，免疫分析法，电化学法等。以上方法虽灵敏度较高，但反应条件苛刻，仪器昂贵，且操作时间长。因此，寻求具有快速，准确，选择性较高的检测食品中赤霉素的方法具有重要意义。而荧光共振能量转移法作为一种新型荧光检测技术，相比于其他荧光方法，具有更高的灵敏度和选择性，同时利用环糊精特殊的疏水筒状结构，将能量转移体系的给体与受体紧密包含于分子空腔内，有效地增强能量转移的效率。本方法利用其独特的检测特性，从而建立快速、灵敏、准确的检测赤霉素的新方法。目前国内外应用荧光共振能量转移法在赤霉素的检测上尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种方法简单，灵敏度高，选择性好，方便快速的对食品中痕量赤霉素进行检测的方法。
本发明思路：以核黄素作为荧光能量转移的给体，丁基罗丹明B作为受体，构成性能稳定的能量转移体系，核黄素将能量传递给丁基罗丹明B，使其成为荧光强度更高的超灵敏荧光探针。而环糊精可以有效地增敏受体丁基罗丹明B的荧光强度，并能够提高荧光共振能量转移的效率，加入赤霉素后，使丁基罗丹明B的荧光强度猝灭，且其猝灭值与赤霉素的浓度在40~760微克/升范围内呈良好的线性关系。从而建立检测赤霉素的环糊精包含能量转移法。
本发明具体机理：由于环糊精具有特殊的疏水性空腔，并呈筒状结构，从而可以有效地包含能量转移体系的给体和受体，拉近二者的分子间距，提高能量转移的效率。逐渐向体系中加入赤霉素后，受体丁基罗丹明B带有正电荷，与带有负电的赤霉素通过静电作用相结合，使荧光有规律的猝灭。
具体步骤为：
1、检测方法：
在10支10毫升比色管中都分别加入100微升1.0×10-5摩尔/升的核黄素溶液、120微升1.0×10-4摩尔/升的丁基罗丹明B溶液、1毫升1.0×10-3摩尔/升的β-环糊精溶液和20微升0.1克/升的聚乙烯醇溶液，再在这10支10毫升比色管中分别加入40~760纳克/毫升的赤霉素溶液，分别用pH＝6.6摩尔浓度为0.2摩尔/升的磷酸氢二钠-摩尔浓度为0.1摩尔/升的柠檬酸缓冲溶液定容至刻度，反应3分钟后用RF-5301PC荧光光度计进行荧光强度检测，激发波长为360纳米，激发和发射狭缝宽度均为5纳米。
2、工作曲线的绘制：
在10支10毫升比色管中都分别加入100微升1.0×10-5摩尔/升的核黄素溶液、120微升1.0×10-4摩尔/升的丁基罗丹明B溶液、1毫升1.0×10-3摩尔/升的β-环糊精溶液、20微升0.1克/升的聚乙烯醇溶液，再在这10支10毫升比色管中分别加入40~760微克/升的赤霉素溶液，分别用pH＝6.6摩尔浓度为0.2摩尔/升的磷酸氢二钠-摩尔浓度为0.1摩尔/升的柠檬酸缓冲溶液定容至刻度，充分摇匀后放置反应3分钟，进行共振光强度检测；赤霉素的浓度c在40~760纳克/毫升范围内与荧光猝灭量（ΔIF）呈良好的线性关系，其线性回归方程为：ΔIF=0.2503c+0.7416，线性相关系数r=0.9997。
本发明克服了已有技术在检测时存在反应时间长、操作繁琐、选择性差、仪器昂贵的缺点，更好地提高了灵敏度和选择性，对于食品中低浓度赤霉素的检测更加准确方便快速。
附图说明
图1为本发明实施例在1.0×10-7摩尔/升的丁基罗丹明B，1.2×10-4摩尔/升的核黄素，1.0×10-4摩尔/升的β-环糊精，2.0×10-4克/升的聚乙烯醇和pH＝6.6的磷酸氢二钠（0.2摩尔/升）-柠檬酸（0.1摩尔/升）缓冲溶液中，不同浓度的赤霉素对丁基罗丹明B的荧光猝灭光谱图。其中a到j分别为40、120、200、280、360、440、520、600、680、760纳克/毫升的赤霉素对丁基罗丹明B的荧光猝灭光谱图。
图2为本发明实施例赤霉素含量与β-环糊精包含的能量转移体系中丁基罗丹明B的荧光猝灭量的关系图。
具体实施方式
实施例:
1、检测方法：
在10支10毫升比色管中都分别加入100微升1.0×10-5摩尔/升的核黄素溶液、120微升1.0×10-4摩尔/升的丁基罗丹明B溶液、1毫升1.0×10-3摩尔/升的β-环糊精溶液和20微升0.1克/升的聚乙烯醇溶液，再在这10支10毫升比色管中分别加入40、120、200、280、360、440、520、600、680、760纳克/毫升的赤霉素溶液，分别用pH＝6.6的磷酸氢二钠（0.2摩尔/升）-柠檬酸（0.1摩尔/升）缓冲溶液定容至刻度，反应3分钟后用RF-5301PC荧光光度计进行荧光强度检测，激发波长为360纳米，激发和发射狭缝宽度均为5nm。
2、工作曲线的绘制：
在10支10毫升比色管中都分别加入100微升1.0×10-5摩尔/升的核黄素溶液、120微升1.0×10-4摩尔/升的丁基罗丹明B溶液、1毫升1.0×10-3摩尔/升的β-环糊精溶液和20微升0.1克/升的聚乙烯醇溶液，再在这10支10毫升比色管中分别加入40、120、200、280、360、440、520、600、680、760纳克/毫升的赤霉素溶液，分别用pH＝6.6的磷酸氢二钠（0.2摩尔/升）-柠檬酸（0.1摩尔/升）缓冲溶液定容至刻度，充分摇匀后放置反应3分钟，进行共振光强度检测；赤霉素的浓度c在40~760纳克/毫升范围内与荧光猝灭量（ΔIF）呈良好的线性关系，其线性回归方程为：ΔIF=0.2503c+0.7416，线性相关系数r=0.9997。
3、食品中赤霉素含量的检测：
取市售牛奶样品适量，离心分离15分钟，将离心下层液用50毫摩/升的磷酸盐缓冲液稀释1000倍作为待测溶液。
取适量的待测液按实验方法操作对样品进行测定，同时进行标准加入回收试验，结果如表1所示，其标准偏差RSD≤2.4%(n=6)，加标回收率在98.3%~103.2%，说明方法具有较高的准确度和较好的精密度。
表1：样品测定和加标回收试验数据
| 样品 | 测定值(n=6) ng/mL | RSD(n=6)% | 加标量 ng/mL | 测得总量 ng/mL | 回收率% |
| 牛奶1 | 9.92 | 2.40 | 20.00 | 29.58 | 98.30 |
| 牛奶2 | 12.61 | 1.82 | 40.00 | 52.31 | 99.26 |
| 牛奶3 | 16.92 | 1.74 | 60.00 | 78.84 | 103.20 |
Claims (1)
1.一种利用环糊精与荧光共振能量转移技术检测食品中赤霉素的方法，其特征在于具体步骤如下：
1、检测方法：
在10支10毫升比色管中都分别加入100微升1.0×10-5摩尔/升的核黄素溶液、120微升1.0×10-4摩尔/升的丁基罗丹明B溶液、1毫升1.0×10-3摩尔/升的β-环糊精溶液和20微升0.1克/升的聚乙烯醇溶液，再在这10支10毫升比色管中分别加入40~760纳克/毫升的赤霉素溶液，分别用pH＝6.6摩尔浓度为0.2摩尔/升的磷酸氢二钠-摩尔浓度为0.1摩尔/升的柠檬酸缓冲溶液定容至刻度，反应3分钟后用RF-5301PC荧光光度计进行荧光强度检测，激发波长为360纳米，激发和发射狭缝宽度均为5纳米；
2、工作曲线的绘制：
在10支10毫升比色管中都分别加入100微升1.0×10-5摩尔/升的核黄素溶液、120微升1.0×10-4摩尔/升的丁基罗丹明B溶液、1毫升1.0×10-3摩尔/升的β-环糊精溶液、20微升0.1克/升的聚乙烯醇溶液，再在这10支10毫升比色管中分别加入40~760纳克/毫升的赤霉素溶液，分别用pH＝6.6摩尔浓度为0.2摩尔/升的磷酸氢二钠-摩尔浓度为0.1摩尔/升的柠檬酸缓冲溶液定容至刻度，充分摇匀后放置反应3分钟，进行荧光强度检测；赤霉素的浓度c在40~760纳克/毫升范围内与荧光猝灭量（ΔIF）呈良好的线性关系，其线性回归方程为：ΔIF=0.2503c+0.7416，线性相关系数r=0.9997。
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