CN103601806B

CN103601806B - Il-6结合分子

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Publication number: CN103601806B
Application number: CN201310193693.6A
Authority: CN
Inventors: C.布兰切托特; J.德哈德; T.德赖尔; N.A.德琼格; S.P.范德沃宁; N.G.H.翁奇内
Original assignee: Yagn -X Co Ltd
Current assignee: Yagenkes Co.,Ltd.; Yagenks Corp.
Priority date: 2012-05-23
Filing date: 2013-05-23
Publication date: 2019-01-18
Anticipated expiration: 2033-05-23
Also published as: US20150140011A1; RU2014152006A; JP6410712B2; BR112014029219B1; KR20150063311A; US11117959B2; CO7240362A2; AU2013264779B2; CA2871148A1; US11827701B2; WO2013175427A1; US10183995B2; AU2013264779A1; US20190233509A1; MX360163B; RU2676078C2; WO2013175276A1; BR112014029219A2; EP2852616A1; BR112014029219A8

Abstract

本发明提供了结合分子(例如抗体或其抗原结合片段)，其特异性结合于IL‑6(例如人类，小鼠或非人灵长类IL‑6)并抑制其生物活性。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段结合于IL‑6并抑制其对IL‑6受体的结合。此类抗体或抗原结合片段对于治疗IL‑6相关的疾病或病症(例如炎性疾病和癌症)特别有用。

Description

IL-6结合分子

相关申请

本申请要求2012年5月23日提交的美国临时申请系列号61/650,883、2012年10月30日提交的美国临时申请系列号61/720,102和2012年11月14日提交的PCT/IB2012/056424的优先权，均通过全文提述并入本文。

发明背景

白介素-6(IL-6)是主要的促炎症细胞因子。其导致免疫活性细胞和造血细胞的增殖和分化。人IL-6是由212个氨基酸组成的单一糖蛋白，其具有两个N-连接的糖基化位点，并具有约26kDa的分子量。IL-6的结构包含四个α-螺旋域，所述域具有四个半胱氨酸残基的基序，这对于IL-6的三级结构是必需的。IL-6信号传导由IL-6对于可溶性或表面结合的IL-6受体α链(IL-6Rα)的结合介导，所述结合使得该复合物能够与细胞表面跨膜gp130亚基相互作用，所述亚基介导胞内信号传导。

IL-6涉及炎性疾病的疾病发生，所述炎性疾病包括炎性自身免疫病如类风湿性关节炎(RA)，脊椎强直性关节病，系统性红斑狼疮(SLE)，炎性肠病(IBD)，和Castleman病。IL-6亦涉及癌症的疾病发生，所述癌包括前列腺癌，弥散性大细胞淋巴瘤，多发性骨髓瘤，和肾细胞癌。亦报道了IL-6在促进癌症相关的食欲缺乏(anorexia)，口腔黏膜炎和恶病质中的作用。

尽管本领域中已知来源于对非人动物的免疫接种的IL-6结合分子，但这些分子通常需要大量的抗体工程(例如CDR移植和人源化)以减少其免疫原性。而且，所得的人源化变体通常受对IL-6靶的不理想的结合亲和力困扰，并需要大量的抗体工程和亲和力成熟以试图恢复IL-6结合亲和力。其最终结果是大多数IL-6抗体呈现对IL-6靶的不理想的结合亲和力。

因此，考虑到IL-6在疾病发生中的重要性和已知的IL-6抗体的缺点，显然在本领域中有对于改善的(例如几乎未经工程改造的)IL-6药剂的需要，所述药剂可抑制IL-6的生物活性，并因此治疗与IL-6活性相关的疾病。

发明概述

本发明通过提供结合分子(例如抗体或其抗原结合片段)来改善现有技术，所述结合分子具有改善的结合概貌，即以高结合亲和力(例如皮摩尔结合亲和力)特异性结合于IL-6(例如人或非人灵长类IL-6)并强力地抑制其生物活性(例如结合于IL-6受体)。在某些示例性实施方案中，本发明的IL-6结合分子来源于经受用IL-6抗原的主动免疫接种的驼类物种(例如美洲驼)的常规抗体全集。例如，本发明的驼类来源的IL-6结合分子可包含成对的VH/VL域或其它备选框架，其中VH或VL域的一个或多个超变环(hypervariable loop)(例如H1，H2，H3，L1，L2和/或L3)来源于所述驼类物种。而且，在某些实施方案中，至少所述超变环之一采取规范折叠(或规范折叠的组合)，其与人类抗体的折叠相同或实质上相同。此类结合分子呈现高的人类同源性(序列和结构)并因此由于其低免疫原性而特别有用于治疗IL-6相关的疾病或病症(例如炎性疾病和癌症)。令人惊讶的是，本发明的IL-6抗体呈现高结合亲和力，可制造性(manufacturability)和热稳定性，而无需已知IL-6抗体通常所需的大量和耗时的抗体工程和亲和力成熟。

因此，在一个方面，本发明提供特异性结合于IL-6的结合分子，所述结合分子包含至少一个抗体CDR，其中所述CDR包含至少一个当所述结合分子结合于IL-6时埋在IL-6的F229空穴或F279空穴中的氨基酸残基。在某些实施方案中，所述结合分子包含VH域，所述VH域具有根据Kabat在98位的氨基酸，其当所述抗体或片段结合于IL-6时，埋在IL-6的F229空穴中。在一个具体实施方案中，在98位的氨基酸是色氨酸。在某些实施方案中，所述结合分子包含VL域，所述VL域具有根据Kabat在30位的氨基酸，其当所述抗体或片段结合于IL-6时，埋在IL-6的F229空穴中。在一个具体实施方案中，在30位的氨基酸是酪氨酸，在某些实施方案中，所述结合分子包含VH域，所述VH域具有根据Kabat在99位的氨基酸，其当所述抗体或片段结合于IL-6时，埋在IL-6的F279空穴中。在一个具体实施方案中，在99位的氨基酸是缬氨酸。

在某些实施方案中，所述结合分子包含VH域和VL域，所述VH域包含超变环H1，H2和H3，其中所述VH域多肽与VL域配对，所述VL域包含超变环L1，L2和L3，其中超变环H1-H3和L1-L3至少之一通过用IL-6抗原对羊驼属(Lama)物种进行免疫接种而从该羊驼属物种的常规抗体获得。在一个具体实施方案中，超变环H1，H2，L1，L2和L3的至少之一呈现预测的或实际的相应规范折叠结构，其与人抗体中出现的H1，H2，L1，L2或L3超变环的规范折叠结构相同或实质上相同。在一个具体实施方案中，超变环H1和H2的至少之一各呈现预测的或实际的规范折叠结构，其与相应的人类规范折叠结构相同或实质上相同。在一个具体实施方案中，超变环L1，L2和L3的至少之一各呈现预测的或实际的规范折叠结构，其与相应的人类规范折叠结构相同或实质上相同。在一个具体实施方案中，超变环H1和H2的至少之一形成预测的或实际的规范折叠结构的组合，其与已知出现于人类种系VH域的规范折叠结构的相应的组合相同或实质上相同。在一个具体实施方案中，超变环H1和H2的至少之一形成规范折叠结构的组合，其对应于选自下组的人类规范折叠结构的组合：1-1，1-2，1-3，1-4，1-6，2-1，3-1和3-5。在一个具体实施方案中，超变环L1和L2的至少之一形成预测的或实际的规范折叠结构的组合，其与已知出现于人类种系VL域的规范折叠结构的相应的组合相同或实质上相同。在一个具体实施方案中，超变环L1和L2的至少之一形成规范折叠结构的组合，其对应于选自下组的人类规范折叠结构的组合：11-7，13-7(A,B,C)，14-7(A,B)，12-11，14-11，12-12，2-1，3-1，4-1和6-1。

在某些实施方案中，所述结合分子包含VH域和VL域，其中所述结合分子的VH域和/或VL域与一个或多个对应人类VH或VL域在框架区FR1，FR2，FR3和FR4内具有90％或更高的序列同一性。在某些实施方案中，所述结合分子包含VH域和VL域，且为亲本结合分子的种系化变体，其中所述结合分子的VH域和VL域之一或两者与亲本非人类抗体的对应VH域和VL域相比，在框架区内包含总共1至10个氨基酸取代。在一个具体实施方案中，所述亲本结合分子是常规的驼类抗体。在某些实施方案中，所述结合分子是抗体或其抗原结合片段。

在某些实施方案中，所述结合分子包含VH域，所述VH域包含SEQ ID NO:500[X₁PDVVTGFHYDX₂]中列出的HCDR3氨基酸序列，或其序列变体，其中：

X₁是任何氨基酸，优选D或Y；

X₂是任何氨基酸，优选Y或N；和

其中所述序列变体在所述序列中包含一个，两个或三个氨基酸取代。在一个具体实施方案中，HCDR3氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:497-499。

在某些实施方案中，所述VH域进一步包含SEQ ID NO:507[VIX₁YX₂X₃DTYYSPSLX₄S]中列出的HCDR2氨基酸序列或其序列变体，其中：

X1是任何氨基酸，优选D，Y或N；

X2是任何氨基酸，优选D或E；

X3是任何氨基酸，优选A或G；

X4是任何氨基酸，优选E或K；和

其中所述序列变体在所述序列中包含一个，两个或三个氨基酸取代。在一个具体实施方案中，HCDR2氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:501-506。

在某些实施方案中，所述VH域进一步包含在SEQ ID NO:512[X₁X₂YYX₃WX₄]中列出的HCDR1氨基酸序列，或其序列变体，其中：

X1是任何氨基酸，优选T，S或P；

X2是任何氨基酸，优选R或S；

X3是任何氨基酸，优选A或V；

X4是任何氨基酸，优选S或T；和

其中所述序列变体在所述序列中包含一个，两个或三个氨基酸取代。在一个具体实施方案中，所述HCDR1氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:508-511。

在某些实施方案中，所述结合分子包含VH域，所述VH域包含SEQ ID NO:497，501和508中分别列出的HCDR3，HCDR2和HCDR1氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述结合分子进一步包含VL域，其中所述VL域包含SEQ IDNO:524[ASYX₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇]中列出的LCDR3氨基酸序列，或其序列变体，其中：

X1是任何氨基酸，优选R或K；

X2是任何氨基酸，优选N，H，R，S，D，T或Y；

X3是任何氨基酸，优选F，Y，T，S或R；

X4是任何氨基酸，优选N或I；

X5是任何氨基酸，优选N或D；

X6是任何氨基酸，优选V，N，G或A；

X7是任何氨基酸，优选V或I；和

其中所述序列变体包含所述序列的一个，两个或三个氨基酸取代。在一个具体实施方案中，所述LCDR3氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:513-523.

在某些实施方案中，所述VL域进一步包含SEQ ID NO:535[X₁VX₂X₃RX₄S]中列出的LCDR2氨基酸序列,或其序列变体，其中：

X1是任何氨基酸，优选R，K，D，A或E；

X2是任何氨基酸，优选S，N或T；

X3是任何氨基酸，优选T，K或Y；

X4是任何氨基酸，优选A，T或V；和

其中所述序列变体包含所述序列的一个，两个或三个氨基酸取代。在一个具体实施方案中，所述LCDR2氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:525-534。

在某些实施方案中，所述VL域进一步包含SEQ ID NO:542[AGX₁X₂X₃DX₄GX₅X₆X₇YVS]中列出的LCDR1氨基酸序列,或其序列变体，其中

X1是任何氨基酸，优选A或T；

X2是任何氨基酸，优选S或N；

X3是任何氨基酸，优选S，E或N；

X4是任何氨基酸，优选V或I；

X5是任何氨基酸，优选G，Y，T或F；

X6是任何氨基酸，优选G或Y；

X7是任何氨基酸，优选N，D或A；和

其中所述序列变体包含所述序列的一个，两个或三个氨基酸取代。在一个具体实施方案中，所述LCDR1氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:538-541。在某些实施方案中，所述结合分子包含VL域，所述VL域包含SEQ ID NO:513，525和536中分别列出的LCDR3，LCDR2和LCDR1氨基酸序列。在某些实施方案中，所述结合分子包含：VH域，其具有SEQ ID NO:497，501和508中分别列出的HCDR3，HCDR2和HCDR1氨基酸序列；和VL域，其具有SEQ ID NO:513，525和536中分别列出的LCDR3，LCDR2和LCDR1氨基酸序列。在某些实施方案中，所述结合分子包含VH域，其与SEQ ID NO:152中列出的氨基酸序列具有至少85％序列同一性。在某些实施方案中，所述结合分子包含VH域，其氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:127-232和569-571。在某些实施方案中，所述结合分子包含VH域，其氨基酸序列为SEQ ID NO:152。在某些实施方案中，所述结合分子包含VL域，其与SEQ ID NO:416中列出的氨基酸序列具有至少85％序列同一性。在某些实施方案中，所述结合分子包含VL域，其氨基酸序列选自下组：SEQID NO:391-496。在某些实施方案中，所述结合分子包含VL域，其氨基酸序列为SEQ ID NO:416。在某些实施方案中，所述结合分子包含：VH域，其具有SEQ ID NO:152中列出的氨基酸序列；和VL域，其具有SEQ ID NO:中416列出的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述结合分子包含所述H1和H2环，其形成规范折叠结构的组合，所述组合对应于见于人类1ACY抗体结构中的人类规范折叠结构的组合3-1。在某些实施方案中，所述结合分子包含所述L1和L2环，其形成规范折叠结构的组合，所述组合对应于见于人类3MUG抗体结构中的人类规范折叠结构的组合6λ-1。在某些实施方案中，所述结合分子包含所述L1，L2和L3环，其形成规范折叠结构的组合，所述组合对应于见于人类3MUG抗体结构中的人类规范折叠结构的组合6λ-1-5。

在某些实施方案中，所述结合分子包含VH域，所述VH域包含SEQ ID NO:544[RAGX₁GX₂G]中列出的HCDR3氨基酸序列,或其序列变体，其中：

X₁是任何氨基酸，优选W；

X₂是任何氨基酸，优选M，A，L，S或N；和

其中所述序列变体包含所述序列的一个，两个或三个氨基酸取代。在一个具体实施方案中，所述HCDR3氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:543，SEQ ID NO:566，SEQ ID NO:567和SEQ ID NO:568。

在某些实施方案中，所述VH域进一步包含SEQ ID NO:554[X₁ISX₂X₃GX₄SX₅X₆YX₇DSVKG]中列出的HCDR2氨基酸序列,或其序列变体，其中：

X1是任何氨基酸，优选A，P或R；

X2是任何氨基酸，优选A或S；

X3是任何氨基酸，优选S或G；

X4是任何氨基酸，优选G或V；

X5是任何氨基酸，优选A或T；

X6是任何氨基酸，优选Y，N或S；

X7是任何氨基酸，优选G，A或T；和

其中所述序列变体包含所述序列的一个，两个或三个氨基酸取代。在一个具体实施方案中，所述HCDR2氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:545-553。

在某些实施方案中，所述VH域进一步包含SEQ ID NO:562[X₁X₂X₃X₄X₅]中列出的HCDR1氨基酸序列,或其序列变体，其中：

X1是任何氨基酸，优选S或T；

X2是任何氨基酸，优选H或Y；

X3是任何氨基酸，优选A或R；

X4是任何氨基酸，优选M或L；

X5是任何氨基酸，优选S或Y；和

其中所述序列变体包含所述序列的一个，两个或三个氨基酸取代。在一个具体实施方案中，所述HCDR1氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:555-561。

在某些实施方案中，所述VH域包含HCDR3，其具有选自下组的氨基酸序列：SEQ IDNO:543，566，567和568，和包含分别在SEQ ID NO:545和555中列出的HCDR2和HCDR1氨基酸序列。在某些实施方案中，所述结合分子进一步包含VL域，其中所述VL域包含SEQ ID NO:563中列出的LCDR3氨基酸序列，或其序列变体，其中所述序列变体包含所述序列的一个，两个或三个氨基酸取代。在某些实施方案中，所述VL域进一步包含SEQ ID NO:564中列出的LCDR2氨基酸序列，或其序列变体，其中所述序列变体包含所述序列的一个，两个或三个氨基酸取代。在某些实施方案中，所述VL域进一步包含SEQ ID NO:565中列出的LCDR1氨基酸序列，或其序列变体，其中所述序列变体包含所述序列的一个，两个或三个氨基酸取代。在某些实施方案中，所述VL域包含分别在SEQ ID NO:563，564和565中列出的LCDR3，LCDR2和LCDR1氨基酸序列。在某些实施方案中，所述结合分子包含：VH域，其具有分别在SEQ ID NO:544，545和555中列出的HCDR3，HCDR2和HCDR1氨基酸序列；和VL域，其具有分别在SEQ IDNO:563，564和565中列出的LCDR3，LCDR2和LCDR1氨基酸序列。在某些实施方案中，所述结合分子包含VH域，其与SEQ ID NO:86中列出的氨基酸序列具有至少85％序列同一性。在某些实施方案中，所述结合分子包含VH域，其具有的氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:39-126和569-571。在某些实施方案中，所述结合分子包含VH域，其具有的氨基酸序列选自SEQ IDNO:86，SEQ ID NO:569，SEQ ID NO:570和SEQ ID NO:571。在某些实施方案中，所述结合分子包含VL域，其与SEQ ID NO:350中列出的氨基酸序列具有至少85％序列同一性。在某些实施方案中，所述结合分子包含VL域，其具有的氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:303-390。在某些实施方案中，所述结合分子包含VL域，其具有的氨基酸序列为SEQ ID NO:350。在某些实施方案中，所述结合分子包含：VH域，其具有SEQ ID NO:86，SEQ ID NO:569，SEQ ID NO:570或SEQ ID NO:571中列出的氨基酸序列；和VL域，其具有SEQ ID NO:350中列出的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述结合分子包含H1和H2环，其形成规范折叠结构的组合，所述组合对应于见于人类1DFB抗体结构中的人类规范折叠结构的组合1-3。在某些实施方案中，所述结合分子包含L1和L2环，其形成规范折叠结构的组合，所述组合对应于见于人类1MFA抗体结构中的人类规范折叠结构的组合7λ-1。在某些实施方案中，所述结合分子包含L1，L2和L3环，其形成规范折叠结构的组合，所述组合对应于见于人类3MUG抗体结构中的人类规范折叠结构的组合7λ-1-4。

在某些实施方案中，所述结合分子是Fab片段，其以低于2x10^-5s^-1的解离速率(off-rate)(通过表面等离子共振测量的k_off)结合于人类IL-6。在某些实施方案中，所述结合分子以亚皮摩尔结合亲和力结合于人类IL-6抗原。在某些实施方案中，所述结合分子以单数位飞摩尔的结合亲和力结合于人类IL-6抗原。在某些实施方案中，所述结合分子包含超变环，其从羊驼属的常规抗体无需后续亲和力成熟而获得。在某些实施方案中，所述结合分子以少于0.1pM的IC50抑制IL-6诱导的B9杂交瘤细胞的增殖。

在某些实施方案中，所述结合分子呈现大于65℃的熔解温度(Tm)。在某些实施方案中，所述结合分子是亲本驼类抗体的种系化变体，所述种系化变体与所述亲本驼类抗体相比具有更高的熔解温度。在某些实施方案中，所述结合分子在HEK293细胞中瞬时表达后以至少20mg/ml的水平表达。在某些实施方案中，所述结合分子表征为低于约10.0，例如低于约6.0的评分。在某些实施方案中，所述结合分子抑制IL-6对IL-6受体的结合。在某些实施方案中，所述结合分子抑制gp130对IL-6受体的结合。在某些实施方案中，所述结合分子特异性结合于人类和食蟹猴IL-6。在某些实施方案中，所述结合分子包含至少一个来自特异性结合于IL-6的驼类抗体的CDR。

在另一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含任何前述权利要求的结合分子，和一种或多种药学上可接受的载体。

在另一个方面，本发明提供了治疗IL-6相关疾病或病症的方法，其包括向需要该治疗的受试者施用有效量的本发明的药物组合物。

在另一个方面，本发明提供了分离的核酸，其编码本文中公开的结合分子。

在另一个方面，本发明提供了重组表达载体，其包含本发明的核酸分子。

在另一个方面，本发明提供了宿主细胞，其包含本发明的重组表达载体。

附图简述

图1描述了测量本发明的抗体的体外IL-6中和活性的细胞增殖测定的结果。

图2描述了测量本发明的抗体的体内效力的上皮卵巢癌小鼠肿瘤异种移植实验的结果。

图3A-B显示本发明的61H7抗体的驼类来源的超变环(L1-L3，H1和H2)采用预测的人类抗体的规范折叠和规范折叠组合。

图4A-B显示本发明的68F2抗体及其种系化变体(129D3)的驼类来源的超变环(L1-L3，H1和H2)采用预测的人类抗体的规范折叠和规范折叠组合。

图5描述了IL-6的空间填充模型，其分别与以下叠合(overlay)：(A)IL-受体的F229；(B)IL-6受体的F229和61H7VH的W98，(C)IL-6受体的F229和68F2VL的Y30；和(D)IL-6受体的F229，61H7VH的W98和68F2VH的V99，均按照Kabat编号。

图6描述了对于IL-6受体结合重要的IL-6上的两个表面结合空穴的空间填充模型，其与下述叠合：IL-6受体的残基F229和F279，以及68F2VL的残基Y30和68F2VH的V99，均根据Kabat编号(在该结构中为Y32和V104)。

图7A-B描述68F2及其种系化变体129D3的热稳定性，其在Biacore中用固定化的糖基化人类IL-6针对下述进行测量：(A)本发明的其它种系化变体IL-6抗体和(B)其它参照抗体。每个图的上部描述了熔解曲线，而下部列出了对于每个抗体的Tm值。

图8描述抗体克隆68F2，129D3(68F2的种系化变体)和103A1(61H7的变体)的血清稳定性。亦包括了参照抗体GL 18。

图9描述对于本发明的IL-6抗体，相对于参照抗体(以粗体显示)(包括完全的人类抗体阿达木单抗(adalimumab)(Humira))的低免疫原性(Epibase)评分。

图10A-B描述(A)68F2和(B)61H7的VH和VL的比对，描述与其相应的种系化变体129D3和111A7的框架区的高水平的序列同源性。亦显示了导入每个分子的框架改变的最小数目(总共为13)。

图11A-B显示(A)CNTO328和(B)VH_rabbit(ALD518)的VH和VK的比对，描述与其相应的种系化变体CNTO136和VH_human(ALD518)的框架区的高水平的序列同源性。亦显示了导入每个分子的框架改变的最小数目(总共为36和46)。

图12显示129D3IgG1抗体及其变体在食蟹猴中的药代动力学概貌。

图13描述测量本发明的抗体的体内效力的血清淀粉状蛋白A(SAA)小鼠模型实验的结果。

图14描述测量本发明的抗体的体内效力的小鼠银屑病异种移植物实验的结果。

图15描述在肾细胞癌小鼠肿瘤异种移植物模型中测量本发明的抗体的体内效力的实验中观察到的肿瘤生长数据。

图16描述在肾细胞癌小鼠肿瘤异种移植物模型中测量本发明的抗体的体内效力的实验中观察到的存活数据的Kaplan-Meier图。

图17描述在肾细胞癌小鼠肿瘤异种移植物模型中测量本发明的抗体的体内效力的实验中观察到的肿瘤生长数据，所有药剂以3mg/kg给药。

图18描述在肾细胞癌小鼠肿瘤异种移植物模型中测量本发明的抗体的体内效力的实验中观察到的存活数据的Kaplan-Meier图，所有药剂以3mg/kg给药。

发明详述

I.定义

为了使得本发明可更容易理解，首先定义了某些术语。

如用于本文中，术语“IL-6”指白介素-6。IL-6核苷酸和多肽序列在本领域中是公知的。例示性人类IL-6氨基酸序列列于GenBank保藏GI:10834984，而例示性的小鼠IL-6氨基酸序列列于GenBank保藏GI:13624311。

如用于本文中，术语“抗体”指免疫球蛋白分子，其包含四个多肽链，即通过二硫键相互连接的两个重(H)链和两个轻(L)链，以及其多聚物(例如IgM)。每条重链包含重链可变区(缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个域：CH1，CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个域(CL1)。VH和VL区可进一步细分为具有超变性的区，称为互补决定区(CDR)，散布于称为框架区(FR)的更保守的区中。

如用于本文中，术语抗体的“抗原结合片段”包括任何天然存在的，酶法可获得的，合成的，或遗传工程的多肽或糖蛋白，其特异性结合抗原以形成复合物。抗体的抗原结合片段可例如从完整抗体分子使用任何合适的标准技术如蛋白分解消化或重组遗传工程技术(涉及对编码抗体可变域和任选地恒定域的DNA的操作和表达)来衍生。抗原结合部分的非限定性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')₂片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模仿抗体的超变区的氨基酸残基组成的最小识别单元(例如，分离的互补决定区(CDR))。其它工程改造的分子，如二价抗体(diabody)，三价抗体(triabody)，四价抗体(tetrabody)和微抗体(minibody)，亦涵盖于表述“抗原结合部分”之内。

如用于本文中，术语“可变区”或“可变域”指下述事实：可变域VH和VL的某些部分在序列方面在抗体之间广泛不同，并用于每种特定抗体对其靶抗原的结合和特异性。然而，所述差异在抗体的可变域中并非平均分布。其聚集在每个VL域和VH域中称为“超变环”的三个区段，其形成抗原结合位点的一部分。V拉姆达轻链域的第一、第二和第三个超变环在本文中称作L1(λ)，L2(λ)和L3(λ)，并可定义为包含VL域中的残基24-33(L1(λ)，由9,10或11个氨基酸残基组成)，49-53(L2(λ)，由3个残基组成)和90-96(L3(λ)，由5个残基组成)(Morea等，Methods 20:267-279(2000))。V卡帕轻链域的第一，第二和第三个超变环在本文中称作L1(κ)，L2(κ)和L3(κ)，并可定义为包含VL域中的残基25-33(L1(κ)，由6，7，8，11，12或13个残基组成)，49-53(L2(κ)，由3个残基组成)和90-97(L3(κ)，由6个残基组成)(Morea等，Methods 20:267-279(2000))。VH域的第一，第二和第三个超变环在本文中称作H1，H2和H3并可定义为包含VH域中的残基25-33(H1，由7，8或9个残基组成)，52-56(H2，由3或4个残基组成)和91-105(H3，长度高度可变)(Morea等，Methods 20:267-279(2000))。

除非另行指明，术语L1，L2和L3分别指VL域的第一，第二和第三个超变环，并涵盖从V卡帕和V拉姆达同种型获得的超变环。术语H1，H2和H3分别指VH域的第一，第二和第三个超变环，并涵盖从任何已知的重链同种型(包括γ，ε，δ，α或μ)获得的超变环。

超变环L1，L2，L3，H1，H2和H3可各包含如下所定义的“互补决定区”或“CDR”的部分。术语“超变环”和“互补决定区”并不是严格同义的，因为超变环(HV)基于结构而定义，而互补决定区(CDR)基于序列变异性而定义(Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD.，1983)，且对HV和CDR的限制在一些VH和VL域中可为不同的。

VL和VH域的CDR通常可定义为包含下述氨基酸：轻链可变域的残基24-34(CDRL1)，50-56(CDRL2)和89-97(CDRL3)和重链可变域的残基31-35或31-35b(CDRH1)，50-65(CDRH2)和95-102(CDRH3)(Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5thEd.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。因此，HV可包含于相应的CDR中，且本文中提及VH和VL域的“超变环”可解释为亦涵盖对应的CDR，反之亦然，除非另行指明。

可变域的更高度保守的部分称作框架区(FR)，如下文所定义。天然重链和轻链的可变域各包含四个FR(分别为FR1，FR2，FR3和FR4)，其主要呈β-层叠构型，由三个超变环连接。每个链中的超变环通过FR紧密结合在一起，与来自其它链的超变环一起参与抗体的抗原结合位点的形成。对抗体的结构分析揭示了由互补决定区形成的结合位点的形状和序列之间的关系(Chothia等，J.Mol.Biol.227:799-817(1992)；Tramontano等，J.Mol.Biol，215:175-182(1990))。尽管其具有高度序列差异性，但六个环中的五个仅采用主链构象的一个小全集，这称为“规范结构”。这些构象首先由环的长度决定，其次由在环中和框架区中的某些位置上关键残基的存在决定，其通过填充(packing)，氢键键合，或呈现不常见的主链构象的能力而决定构象。

如用于本文中，术语“互补决定区”或“CDR”指见于重链和轻链多肽的可变区内的非连续性抗原结合位点。这些特定区由Kabat等，J.Biol.Chem.252，6609-6616(1977)和Kabat等，Sequences of protein of immunological interest.(1991)，和由Chothia等，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)和由MacCallum等，J.Mol.Biol.262:732-745(1996)描述，其中该定义包括相互比较时氨基酸残基的重叠或一部分。将涵盖如上述每一个引用的参考文献中定义的CDR的氨基酸残基列出以供比较。优选地，术语“CDR”是基于序列比较由Kabat定义的CDR。

表1：CDR定义

¹残基编号遵循Kabat等，见上的命名法

²残基编号遵循Chothia等，见上的命名法

³残基编号遵循MacCallum等，见上的命名法

如用于本文中，术语“框架区”或“FR区”包括为可变区一部分，但非CDR(例如，使用CDR的Kabat定义)一部分的氨基酸残基。因此，可变区框架长度为约100至120个氨基酸，但仅包括CDR之外的那些氨基酸。对于重链可变区的具体实例和对于如Kabat等定义的CDR，框架区1对应于涵盖氨基酸1-30的可变区的域；框架区2对应于涵盖氨基酸36-49的可变区的域；框架区3对应于涵盖氨基酸66-94的域，且框架区4对应于从氨基酸103至可变区末端的可变区的域。对于轻链的框架区类似地由每个轻链可变区CDR所分开。类似地，使用Chothia等或McCallum等对CDR的定义，框架区边界由如上所述的相应的CDR末端所分开。在优选实施方案中，CDR如Kabat所定义。

在天然存在的抗体中，存在于每个单体抗体上的六个CDR是短的，非连续的氨基酸序列，其当抗体在水性环境中呈现其三维构型时特异性地处于形成抗原结合位点的位置。剩余的重链和轻链可变域在氨基酸序列方面显示较少的分子间差异性，并称为框架区。框架区主要采用β-层叠构象，且CDR形成环，其连接所述β-层叠结构，并在一些情况下形成其一部分。因此，这些框架区起形成支架(scaffold)的作用，所述支架允许六个CDR通过链间的、非共价相互作用而布置在正确的取向。由布置的CDR形成的抗原结合位点定义了互补于免疫反应性抗原上表位的表面。该互补表面促进抗体对免疫反应性抗原表位的非共价性结合。CDR的位置可由本领域一般技术人员方便地鉴定。

如用于本文中，术语“F229空穴”指Boulanger等，2003，Science 27，2101-2104(以全文提述的方式并入本文)中列出的IL-6/IL-6受体复合物中由人类IL-6受体的苯丙氨酸229残基占据的人类IL-6的表面空穴。

如用于本文中，术语“F279空穴”指Boulanger等，2003，Science 27，2101-2104(以全文提述的方式并入本文)中列出的IL-6/IL-6受体复合物中由人类IL-6受体的苯丙氨酸279残基占据的人类IL-6的表面空穴。

如用于本文中，术语“驼类来源的”指抗体可变区氨基酸序列(例如框架或CDR序列)天然存在于驼类(例如美洲驼)的抗体分子中。驼类来源的抗体可从任何驼类物种获得，其包括但不限于美洲驼(llama)，单峰驼(dromedary)，羊驼(alpaca)，骆马(vicuna)，原驼(guanaco)或骆驼(camel)。在某些实施方案中，所述驼类(例如美洲驼)经IL-6(例如人类IL-6)主动免疫接种。在某些实施方案中，术语“驼类来源的”限于来源于驼类的常规抗体全集的抗体序列，并特别排除来源于驼类的仅重链抗体(VHH)全集的抗体序列。

如用于本文中，术语“常规抗体”指任何同种型，包括IgA，IgG，IgD，IgE或IgM的抗体。天然的或天然存在的“常规”驼类抗体通常为异四聚体糖蛋白，由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链构成。每个轻链通过一个共价性二硫键连接于重链，而二硫连接的数量在不同的免疫球蛋白同种型的重链间有所不同。每个重链和轻链亦具有规律间隔的链间二硫桥联。每条重链在一端(N-末端)具有可变域(VH)，继以多个恒定域。每条轻链在一端(N-末端)具有可变域(VL)并在其另一端具有恒定域(CL)；轻链的恒定域与重链的第一恒定域对齐，而轻链可变域与重链的可变域对齐。认为特定氨基酸残基形成轻链和重链可变域之间的界面。

如用于本文中，术语“特异性结合于”指抗体或其抗原结合片段以至少约1x10^-6(例如1x10^-6M，1x10^-7M，1x10^-8M，1x10^-9M，1x10^-10M，1x10^-11M，1x10^-12M，1x10^-13M，1x10^-14M，1x10^- ¹⁵M或更高)，优选1x10^-12M至1x10^-15M或更高的KD结合于IL-6，和/或以比非特异性抗原大至少两倍的亲和力结合于IL-6的能力。然而，应理解的是，抗体或其抗原结合片段能够特异性结合于两种或更多种序列上相关的抗原。例如，本文中公开的抗体或其抗原结合片段能特异性结合于人类和非人类(例如小鼠或非人灵长类)IL-6。

如用于本文中，术语“抗原”指由抗体可变区识别的结合位点或表位。

如用于本文中，术语“治疗”和“处理”指本文中所述的治疗性或预防性措施。“治疗”和“处理”的方法采用向受试者施用本发明的抗体或其抗原结合片段，所述受试者例如患有IL-6相关疾病或病症(例如炎症和癌症)或易患此种疾病或病症的受试者，以预防、治愈、延迟所述疾病或病症或复发的疾病或病症、减少其严重性，或减轻其一个或多个症状，或者延长受试者的存活至超过不存在此种治疗时预期的存活。

如本文中使用的，术语“IL-6相关的疾病或病症”包括与IL-6活性相关的疾病状态和/或症状。例示性IL-6相关的疾病或病症包括但不限于炎性疾病(例如炎性自身免疫性疾病如类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮)，癌症(例如前列腺癌，弥散性大细胞淋巴瘤，多发性骨髓瘤和肾细胞癌)，和癌症相关的病症(例如食欲缺乏和恶病质)。

如用于本文中，术语“有效量”指当施用于受试者时，足以实现如本文中所述IL-6相关疾病或病症的治疗、预后或诊断的抗体或其抗原结合片段的量。治疗有效量可取决于所治疗的受试者和疾病状况，受试者的体重和年龄，疾病状况的严重性，施用方式等而有所不同，其可由本领域一般技术人员方便地确定。用于施用的剂量的范围可为，例如约1ng至约10,000mg，约1ug至约5,000mg，约1mg至约1,000mg，约10mg至约100mg的根据本发明的抗体或其抗原结合片段。可调整剂量方案以提供最优的治疗反应。有效量亦为结合多肽的任何毒性或有害作用(即副作用)最小化和/或相比有益作用较不重要的量。

如用于本文中，术语“受试者”包括任何人类或非人动物。

如用于本文中，术语“表面等离子共振”指允许通过检测生物传感器基质内的蛋白浓度的改变来分析实时相互作用的光学现象，例如使用BIAcore^TM系统(Biacore LifeSciences division of GE Healthcare，Piscataway，NJ)。

如用于本文中，术语“K_D”指特定结合多肽/抗原相互作用的平衡解离常数。

如用于本文中，术语“解离速率”指对于特定结合相互作用的离解速率(K_off)。

II.IL-6结合分子

在一个方面，本发明提供了结合分子(抗体或其抗原结合片段)，其特异性结合于IL-6并抑制其活性。此类结合分子通常包含至少一个本文中表13-18中列出的CDR区的氨基酸序列。

对与人类IL-6受体复合的人类IL-6的晶体结构的分析显示所述IL-6受体的两个残基，F229和F279，对于IL-6/IL-6受体相互作用至关重要(参见例如Boulanger等，2003，Science 27，2101-2104，其通过全文提述并入本文)。在IL-6/IL-6受体复合物中，F229和F279埋于IL-6的表面的不同空穴中。在某些实施方案中，本发明的结合分子利用这些IL-6上的空穴实现高亲和力结合。在一个具体实施方案中，本发明的结合分子包含抗体CDR区，其中所述CDR区包含当所述结合分子结合于IL-6时埋于IL-6上的F229空穴或F279空穴中的氨基酸残基。

通常而言，本发明的结合分子抑制IL-6活性(例如通过拮抗IL-6对IL-6受体的结合)。在某些实施方案中，所述结合分子亦抑制gp130对IL-6受体的结合。然而，在其他实施方案中，所述结合分子可结合于IL-6，而不抑制gp130对IL-6受体的结合。

本发明的结合分子通常对IL-6具有高亲和力，并通常在体内和在体外对抑制IL-6活性是高度强力的。在某些实施方案中，本发明的结合分子以约1x10^-4s^-1(例如约9x10^-5，8x10^-5，7x10^-5，6x10^-5，5x10^-5，4x10^-5，3x10^-5，2x10^-5，和1x10^-5)的解离速率(通过表面等离子共振测量的k_off)结合于人类IL-6。在其他实施方案中，本发明的结合分子以少于0.1pM的IC50抑制IL-6诱导的B9杂交瘤细胞的增殖。在某些其他实施方案中，本发明的结合分子与结合于IL-6的预决抗体相竞争，其中此种预决的抗体含有VH序列和VL序列，其选自表13-18中列出的VH和VL氨基酸序列。在某些其他实施方案中，本发明的结合分子竞争排除至少30％，40％，50％，60％，70％，80％,或90％的预决的抗体对IL-6的结合。在某些其它实施方案中，本发明的结合分子与20A4，24D10，68F2，61H7，129D3或111A7对IL-6的结合相竞争，例如竞争排除至少50％，60％，70％，80％或90％的一种这些抗体对IL-6的结合。在某些其他实施方案中，本发明的结合分子与17F10，24C9，18C11，29B11，28A6或126A3对IL-6的结合相竞争，例如竞争排除至少50％，60％，70％，80％或90％的一种这些抗体对IL-6的结合。

通常而言，本发明的结合分子亦呈现高度热稳定性。在某些实施方案中，所述结合分子呈现大于55℃的熔解温度(Tm)(例如，至少56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75℃或更高)。在某些例示性实施方案中，本发明的Il-6结合分子为种系化变体，其呈现与其亲本、驼类来源的同类相当或更高的热稳定性。在某些例示性实施方案中，热稳定性根据合适的缓冲液(PBS)中以100μg/ml的浓度温育1小时来测量。在其它例示性实施方案中，所述IL-6结合分子的热稳定性呈现于全长IgG形式(例如包含IgG1或IgG4Fc区)。

本发明的结合分子亦表征为功能性抗体的高表达水平，及低水平的非功能性污染物，如高或低分子量聚集物。例如，本发明的IL-6结合分子可表征为至少20mg/L的产生水平(例如至少20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30mg/L或或更高)。在某些例示性实施方案中，所述IL-6结合分子为种系化变体，其呈现与其亲本、驼类的同类相当或更高的表达水平。在其他例示性实施方案中，表达水平使用本发明的IL-6结合分子的全长IgG形式测定，例如通过在HEK293细胞中的瞬时表达。

本发明的结合分子亦通常表征为低的预测免疫原性。例如，本发明的IL-6结合分子呈现少于15.0，少于约12.0或少于约10.0的评分(例如总DRB1评分)。在某些例示性实施方案中，所述结合分子呈现约9.0，约8.0，约7.0或约6.0的免疫原性评分。还在其他实施方案中，所述免疫原性评分低于的免疫原性评分，例如约6.0，约5.0或约4.0。

本发明的结合分子可结合于任何IL-6，包括但不限于人类和食蟹猴IL-6。优选地，结合分子可结合于人类和食蟹猴IL-6。

i)IL-6抗体或其抗原结合片段

在某些实施方案中，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，其特异性结合于IL-6(例如人类IL-6)，并拮抗IL-6对IL-6受体的结合。本发明的例示性Fab克隆的VH，VL和CDR序列列于表13-18。本发明的抗体可包含任何这些Fab克隆的框架和/或CDR氨基酸序列。

本发明的抗体可包含CDR区序列，其具有当所述抗体或片段结合于IL-6时埋于IL-6上的F229空穴中的氨基酸残基(例如，芳族氨基酸，如色氨酸或酪氨酸)。例示性抗体包含根据Kabat在98位具有色氨酸的VH域和/或在30位具有酪氨酸的VL域。此类抗体对于IL-6具有特别高的亲和力。

此外或或者，本发明的抗体可包含CDR区序列，其当所述抗体或片段结合于IL-6时，具有埋于IL-6上的F279空穴中的氨基酸残基。例示性抗体包含根据Kabat在99位具有缬氨酸的VH域。

在某些实施方案中，本发明的抗IL-6抗体或片段包含VH，其包含来自表13-16中列出的VH的1个，2个或3个CDR氨基酸序列。

在某些实施方案中，本发明的抗IL-6抗体或片段包含VL，其包含来自表13-16中列出的VL的1个，2个或3个CDR氨基酸序列。

在某些实施方案中，本发明的抗IL-6抗体或片段包含：VH，其包含来自表13-18中列出的VH的1个，2个或3个CDR氨基酸序列；和VL，其包含来自表13-18中列出的VL的1个，2个或3个CDR氨基酸序列。在一个优选实施方案中，所有六个CDR来自相同的Fab克隆。

在某些实施方案中，本发明的抗IL-6抗体或片段包含表13-16中列出的VH。

在某些实施方案中，本发明的抗IL-6抗体或片段包含表13-16中列出的VL。

在某些实施方案中，本发明的抗IL-6抗体或片段包含表13-16中列出的VH和VL。

在某些实施方案中，本发明的抗IL-6抗体或片段包含来自表13-16中列出的单个Fab克隆的VH和VL。

在某些实施方案中，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其特异性结合于IL-6，所述抗体或片段包含表13-18中列出的CDR，VH和VL氨基酸序列的序列变体。

在某些实施方案中，所述序列变体包含VH和/或VL氨基酸序列，其与表13-16中列出的VH或VL区氨基酸序列具有约80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性。

在其他实施方案中，所述序列变体包含选自表13-18的VH，VL,或CDR氨基酸序列，其经导入一个或多个保守氨基酸取代而改变。保守氨基酸取代包括将一个类型的氨基酸用相同类型的氨基酸取代，在此类型通过共同的物理化学氨基酸侧链性质和自然界中发现的同源蛋白中的高取代频率来定义，所述频率如通过标准的Dayhoff频率交换矩阵或BLOSUM矩阵来确定。已归纳了六大类氨基酸侧链，其包括：类型I(Cys)；类型II(Ser，Thr，Pro，Ala，Gly)；类型III(Asn，Asp，Gln，Glu)；类型IV(His，Arg，Lys)；类型V(Ile，Leu，Val，Met)；和类型VI(Phe，Tyr，Trp)。例如，用Asp取代另一个类型III残基如Asn，Gln或Glu，是保守取代。因此，在IL-6抗体或其抗原结合片段中的预测的非必需的氨基酸残基优选用来自相同类型的另一个氨基酸残基替代。鉴定不消除抗原结合的氨基酸保守取代的方法在本领域中是公知的(参见例如Brummell等，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:412-417(1997))。

在其他实施方案中，所述序列变体包含选自表13-18的VH，VL或CDR氨基酸序列，其经改变以改善抗体产生和/或制造，例如将甲硫氨酸交换为丙氨酸，丝氨酸或亮氨酸。在某些其他实施方案中，所述序列变体包含选自表13-18的VH，VL或CDR氨基酸序列，其经改变以改善抗体产生，例如将谷氨酰胺交换为谷氨酸，或将天冬酰胺交换为丙氨酸或相关氨基酸。在例示性实施方案中，表16的VH氨基酸序列的CDR区以外的一个或多个谷氨酰胺已经变成谷氨酸，例如SEQ ID NO.152中第1、3、5或16位或其任意组合处的一个或多个谷氨酰胺已经变成谷氨酸以提高抗体产生或稳定性。在一个具体实施方案中，SEQ ID NO.152中第1位处的谷氨酰胺已经变成谷氨酸。

ii)具有高人类同源性的IL-6结合分子

在某些方面，本发明的IL-6结合分子为具有高人类同源性的抗体(或抗原结合片段)。抗体应认为具有“高人类同源性”，如果其VH域和VL域一同呈现与最紧密匹配的人种系VH和VL序列具有至少90％氨基酸序列同一性。具有高人类同源性的抗体可包括包含天然非人类抗体的VH和VL域的抗体，其与人类种系序列呈现充分高％序列同一性，包括例如包含驼类常规抗体的VH和VL域的抗体，以及此类抗体经工程改造的，特别是人源化的变体，以及亦包括“完全人类”抗体。

在一个实施方案中，所述具有高人类同源性的抗体的VH域可呈现与一个或多个人类VH域在框架区FR1，FR2，FR3和FR4中具有80％或更高的氨基酸序列同一性或序列同源性。在其他实施方案中，本发明的多肽的VH域和最紧密匹配的人类种系VH域序列之间的氨基酸序列同一性或序列同源性可为85％或更高，90％或更高，95％或更高，97％或更高，或高至99％或甚至100％。

在一个实施方案中，所述具有高人类同源性的抗体的VH域与最紧密匹配的人类VH序列相比，在框架区FR1，FR2，FR3和FR4中可含有少于10(例如10，9，8，7，6，5，4，3，2或1)个氨基酸序列取代。

在另一个实施方案中，所述具有高人类同源性的抗体的VL域可呈现与一个或多个人类VL域在框架区FR1，FR2，FR3和FR4中具有80％或更高的序列同一性或序列同源性。在其他实施方案中，本发明的多肽的VL域和最紧密匹配的人类种系VH域序列之间的氨基酸序列同一性或序列同源性可为85％或更高，90％或更高，95％或更高，97％或更高，或高至99％或甚至100％。

在一个实施方案中，所述具有高人类同源性的抗体的VL域与最紧密匹配的人类VL序列相比，在框架区FR1，FR2，FR3和FR4中可含有少于10(例如10，9，8，7，6，5，4，3，2或1)个氨基酸序列取代。

具有高人类同源性的抗体亦可包含超变环或CDR，其具有人类或类似人类的规范折叠，如下文中详细讨论。在一个实施方案中，具有高人类同源性的抗体的VH域或VL域中的至少一个超变环或CDR可从非人类抗体，例如来自骆驼科的物种的常规抗体的VH或VL域获得或衍生，但其呈现与在人类抗体中出现的规范折叠结构实质上相同的预测或实际的规范折叠结构。

应注意的是具有高人类同源性的抗体并不必需拥有人类或类似人类的规范折叠结构。例如，灵长类抗体与人类抗体具有高序列同源性，但通常并不拥有人类或类似人类的规范折叠结构。

在本领域中充分确立了，尽管由人类种系编码的VH域和VL域中存在的超变环的初级氨基酸序列根据定义为高度可变的，但所有超变环，除了VH域的CDR H3之外，均仅采用少数不同的结构构象，称为规范折叠(Chothia等，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Tramontano等Proteins 6:382-94(1989))，其取决于超变环的长度和所谓规范氨基酸残基的存在(Chothia等，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。在完整的VH或VL域中的超变环的实际规范结构可通过结构分析(例如X射线晶体学)来确定，但亦可根据特定结构特征性的关键氨基酸残基来预测规范结构(在下文中进一步讨论)。基本上，决定每种规范结构的残基的特定样式构成了“特征标识(signature)”，其使得能在未知结构的VH或VL域的超变环中识别出规范结构；因此规范结构可能仅基于初级氨基酸序列来预测。

对于具有高人类同源性的抗体中任何给定的VH或VL序列的超变环的预测的规范折叠结构可使用从www.bioinf.org.uk/abs/chothia.html，www.biochem.ucl.ac.uk/～martin/antibodies.html和www.bioc.unizh.ch/antibody/Sequences/Germlines/Vbase_hVk.html公众可获得的算法来进行分析。这些工具允许将问题VH或VL序列与已知规范结构的人类VH或VL域序列进行比对以及对所述问题序列的超变环做出规范结构的预测。

在VH域的情况下，如果满足至少第一和优选所有下述标准，H1和H2环可评价为具有与已知出现在人类抗体中的规范折叠结构“实质上相同的”规范折叠结构：

1.与最紧密匹配的人类规范结构类型具有相同的长度，通过残基数量决定。

2.与针对相应的人类H1和H2规范结构类型描述的关键氨基酸残基具有至少33％同一性，优选至少50％同一性。

(注意：就对前述分析的目的而言，将H1和H2环分别对待，并将每个均针对其最紧密匹配的人类规范结构类型相比较)

前述分析依赖于对感兴趣抗体的H1和H2环的规范结构的预测。若在感兴趣的抗体中H1和H2环的实际结构是已知的，例如基于X射线晶体学而已知，则在该感兴趣的抗体中的H1和H2环亦可评价为具有与已知出现在人类抗体中的规范折叠结构“实质上相同的”规范折叠结构，如果环的长度与最紧密匹配的人类规范结构类型的长度不同(通常相差±1或±2个氨基酸)，但在感兴趣的抗体中H1和H2环的实际结构匹配于人类规范折叠的结构。

在针对人VH域的第一和第二超变环(H1和H2)的人类规范结构类型中发现的关键氨基酸残基描述于Chothia等，J.Mol.Biol.227:799-817(1992)，其通过全文提述并入本文。具体而言，Chothia等的802页表3(其特别通过提述并入本文)列出了对于见于人类种系的H1规范结构，在关键位点的优选氨基酸残基，而803页表4(其亦特别通过提述并入本文)列出了对于见于人类种系的CDR H2规范结构，在关键位点的优选氨基酸残基。

在一个实施方案中，具有高人类同源性的抗体的VH域中的H1和H2均呈现预测的或实际的规范折叠结构，其与人类抗体中出现的规范折叠结构实质上相同。

具有高人类同源性的抗体可包含VH域，其中超变环H1和H2形成规范折叠结构的组合，其与已知在至少一种人类种系VH域中出现的规范结构的组合相同。已观察到仅某些在H1和H2的规范折叠结构的组合实际上出现于由人类种系编码的VH域。在一个实施方案中，在具有高人类同源性的抗体的VH域中的H1和H2可从非人类物种例如骆驼科物种的VH域获得，但其形成的预测的或实际的规范折叠结构的组合与已知出现于人类种系或体细胞突变的VH域中的规范折叠结构的组合相同。在非限定性实施方案中，具有高人类同源性的抗体的VH域中的H1和H2可从非人类物种例如骆驼科物种的VH域获得，且其形成下列规范折叠组合：1-1，1-2，1-3，1-6，1-4，2-1，3-1和3-5。

具有高人类同源性的抗体可含有VH域，其呈现与人类VH的高序列同一性/序列同源性，且含有与人类VH呈现结构同源性的超变环。

下述可为有利的：在具有高人类同源性的抗体的VH域中在H1和H2存在的规范折叠，及其组合，对于代表与具有高人类同源性的抗体的VH在总体初级氨基酸序列同一性方面最紧密匹配的人类VH种系序列而言是“正确的”。举例而言，若该最紧密的序列匹配是与人种系VH3域，则H1和H2形成的规范折叠的组合亦在人类VH3域中天然出现可为有利的。这在具有高人类同源性的抗体来源于非人类物种的情况下，例如含有来源于驼类常规抗体的VH和VL域的抗体，特别是含有人源化的驼类VH和VL域的抗体而言可为特别重要的。

因此，在一个实施方案中，具有高人类同源性的IL-6抗体的VH域可呈现与人类VH域在框架区FR1，FR2，FR3和FR4中具有80％或更高，85％或更高，90％或更高，95％或更高，97％或更高，或高至99％或甚至100％的序列同一性或序列同源性，且此外，在相同抗体中的H1和H2从非人类VH域获得(例如来源于骆驼科物种)，但形成的预测或实际的规范折叠结构的组合与已知天然出现于相同的人类VH域的规范折叠组合是相同的。

例如，在一个例示性实施方案中，本发明的IL-6抗体(例如61H7)的H1和H2环可包含如见于例如人类抗体结构1DFB的人类规范折叠结构组合1-2。在另一个例示性实施方案中，本发明的IL-6抗体(例如68F2或其种系化变体129D3)的H1和H2环可包含如见于例如人类抗体结构1ACY中的人类规范折叠结构组合3-1。

在其他实施方案中，具有高人类同源性的抗体的VL域中的L1和L2均从非人类物种的VL域(例如驼类来源的VL域)获得，且每个均呈现预测或实际的规范折叠结构，其与存在于人类抗体的规范折叠结构实质上相同。

类似于VH域，V拉姆达和V卡帕类型两者的VL域的超变环可采用有限数量的构象或规范结构，其部分地由长度决定，亦由在某些规范位置的关键氨基酸残基的存在决定。

在具有高人类同源性的感兴趣的抗体内，从非人物种，例如骆驼科物种的VL域获得的L1，L2和L3环可评价为具有与已知出现在人类抗体中的规范折叠结构“实质上相同的”规范折叠结构，如果满足至少第一和优选所有下述标准：

1.与最紧密匹配的人类结构类型具有相同的长度，通过氨基酸残基数量决定。

2.与针对来自V拉姆达或V卡帕全集的相应的人类L1或L2规范结构类型描述的关键氨基酸残基具有至少33％同一性，优选至少50％同一性。

(注意：就对前述分析的目的而言，将L1和L2环分别对待，并将每个均针对其最紧密匹配的人类规范结构类型相比较)。

前述分析依赖于对感兴趣抗体的VL域的L1，L2和L3环的规范结构的预测。若L1，L2和L3环的实际结构是已知的，例如基于X射线晶体学而已知，则来源于该感兴趣的抗体的L1，L2或L3环亦可评价为具有与已知出现在人类抗体中的规范折叠结构“实质上相同的”规范折叠结构，如果环的长度与最紧密匹配的人类规范结构类型的长度不同(通常相差±1或±2个氨基酸)，但骆驼科环的实际结构匹配于人类规范折叠。

见于对于人类V拉姆达和V卡帕域的CDR的人类规范结构类型的关键氨基酸残基描述于Morea等Methods，20:267-279(2000)和Martin等，J.Mol.Biol.，263:800-815(1996)。人类V卡帕域的结构全集亦描述于Tomlinson等EMBO J.14:4628-4638(1995)，而V拉姆达域的结构全集描述于Williams等J.Mol.Biol.，264:220-232(1996)。所有这些文献的内容通过提述并入本文。

具有高人类同源性的抗体的VL域中的L1和L2可形成预测或实际的规范折叠结构的组合，其与已知发生于人类种系VL域的规范折叠结构的组合相同。在非限定性实施方案中，具有高人类同源性的抗体(例如含有驼类来源的VL域或其人源化变体的抗体)的V拉姆达域中的L1和L2可形成下述规范折叠组合之一：11-7，13-7(A,B,C)，14-7(A,B)，12-11，14-11和12-12(如定义于Williams等J.Mol.Biol.264:220-32(1996)和如显示于http://www.bioc.uzh.ch/antibody/Sequences/Germlines/VBase_hVL.html)。在非限定性实施方案中，V卡帕域中的L1和L2可形成下述规范折叠组合之一：2-1，3-1，4-1和6-1(如定义于Tomlinson等EMBO J.14:4628-38(1995)和如显示于http://www.bioc.uzh.ch/antibody/Sequences/Germlines/VBase_hVK.html)。例如，在一个例示性实施方案中，本发明的IL-6抗体(例如61H7)的L1和L2环可包含如见于例如人类抗体结构1MFA中的人类规范折叠结构组合7λ-1。在另一个例示性实施方案中，本发明的IL-6抗体(例如68F2或其种系化变体129D3)的L1和L2环可包含如见于例如人类抗体结构3MUG中的人类规范折叠结构组合6λ-1。

在又一个实施方案中，具有高人类同源性的抗体的VL域中L1，L2和L3所有三者可呈现实质上的人类结构。优选具有高人类同源性的抗体的VL域呈现与人类VL的高序列同一性/序列同源性，亦优选VL域中的超变环呈现与人类VL的结构同源性。例如，在一个例示性实施方案中，本发明的IL-6抗体(例如61H7)的环L1-L3可包含如见于例如人类抗体结构1MFA中的人类规范折叠结构组合7λ-1-4。在另一个例示性实施方案中，本发明的IL-6抗体(例如68F2或其种系化变体129D3)的L1-L3环可包含如见于例如人类抗体结构3MUG中的人类规范折叠结构组合6λ-1-5。

在一个实施方案中，具有高人类同源性的IL-6抗体的VL域可呈现与人类VL域在框架区FR1，FR2，FR3和FR4中具有80％或更高，85％或更高，90％或更高，95％或更高，97％或更高,或高至99％或甚至100％的序列同一性，且此外超变环L1和超变环L2可形成预测的或实际的规范折叠结构的组合，其与已知天然出现于相同的人类VL域的规范折叠组合相同。

显然，涵盖将与人类VH呈现高序列同一性/序列同源性，且亦与人类VH的超变环具有结构同源性的VH域，和与人类VL呈现高序列同一性/序列同源性，且亦与人类VL的超变环具有结构同源性的VL域相组合，以提供含有与人类编码的VH/VL配对具有最大序列和结构同源性的VH/VL配对(例如驼类来源的VH/VL配对)的具有高人类同源性的抗体。

iii)非免疫球蛋白结合分子

在又一个方面，本发明提供了特异性结合于IL-6的非免疫球蛋白结合分子。如用于本文中，术语“非免疫球蛋白结合分子”为结合分子，其结合位点包含从除了免疫球蛋白的多肽来源的部分(例如支架或框架)，但其可经工程改造(例如通过添加CDR区序列)以将所需的结合特异性赋予所述结合分子。本发明的非免疫球蛋白结合分子通常包含移至于非免疫球蛋白多肽的一个或多个表13-18中列出的CDR区。

在某些实施方案中，非免疫球蛋白结合分子包含来源于免疫球蛋白超家族的成员的结合位点部分，所述成员并非免疫球蛋白(例如T细胞受体或细胞粘着蛋白(例如CTLA-4，N-CAM，telokin))。此类结合分子包含结合位点部分，其保持免疫球蛋白折叠的构象，并当经修饰包含一个或多个表13-18中列出的CDR区时，能够特异性结合于IL-6。在其他实施方案中，本发明的非免疫球蛋白结合分子包含结合位点，所述位点具有非基于免疫球蛋白折叠的蛋白拓扑(例如锚蛋白重复蛋白，四连接素(tetranectin)和纤连蛋白)，但虽然如此，当经修饰以包含一个或多个表13-18中列出的CDR区时，其能够特异性结合于靶(例如IL-6)。

在一个实施方案中，本发明的结合分子包含四连接素分子。四连接素是具有三价结构的血浆蛋白。所述四连接素三聚体的每个单体包含五个独特的氨基酸环，其可经替换或工程改造以包含抗体CDR序列(例如表13-18列出的CDR区)。制备四连接素结合多肽的方法描述于例如US20110086770，其通过全文提述并入本文。

在一个实施方案中，本发明的结合分子包含纤连蛋白分子。纤连蛋白结合分子(例如包含纤连蛋白类型I，II或III域的分子)展示CDR样环，其可经替换或工程改造以包含抗体CDR序列(例如表13-18列出的CDR区)。制备纤连蛋白结合多肽的方法描述于，例如WO 01/64942和美国专利号6,673,901，6,703,199，7,078,490,和7,119,171，其每个均通过全文提述并入本文。

在另一个实施方案中，本发明的结合分子包含来自亲和抗体(affibody)的结合位点。亲和抗体来源于葡萄球菌蛋白(A)(SPA)的免疫球蛋白结合域(参见例如Nord等，Nat.Biotechnol.，15:772-777(1997))。在本发明中采用的亲和抗体结合位点可通过对来源于SPA的域(例如域B)的SPA相关蛋白(例如蛋白Z)进行诱变，并就对IL-6具有结合亲和力的突变体SPA相关多肽进行选择来合成。其它用于制备亲和抗体结合位点的方法描述于美国专利号6,740,734和6,602,977以及WO 00/63243，其每一个均通过提述并入本文。

在另一个实施方案中，本发明的结合分子包含来自anticalin的结合位点。anticalin(亦称作lipocalin)是多样的β-桶(beta-barrel)蛋白家族的成员，该家族功能为在其桶/环区结合靶分子。可对lipocalin结合位点进行工程改造以结合IL-6，即随机化连接所述桶的链的环序列(参见例如Schlehuber等，Drug Discov.Today，10:23-33(2005)；Beste等，PNAS，96:1898-1903(1999))。在本发明的结合分子中采用的anticalin结合位点可首先从lipocalin家族的多肽来获得，将所述多肽在四个区段中进行突变，所述四个区段对应线性多肽序列中包括欧洲粉蝶(Pieris brassica)的胆色素(bilin)结合蛋白(BBP)的氨基酸位置28至45，58至69，86至99和114至129的序列位置。其它制备anticalin结合位点的方法描述于WO99/16873和WO 05/019254，其每一个均通过提述并入本文。

在另一个实施方案中，本发明的结合分子包含来自富含半胱氨酸的多肽的结合位点。在本发明的实践中采用的富含半胱氨酸的域通常不形成α-螺旋，β-层叠或β-桶结构。通常，二硫键促使该域折叠为三维结构。通常，富含半胱氨酸的域具有至少两个二硫键，更通常至少三个二硫键。一种例示性富含半胱氨酸的多肽是A域蛋白。A域(有时称为“补体类型的重复”)含有约30-50或30-65个氨基酸。在一些实施方案中，该域包含约35-45个氨基酸，而在一些情况下约40个氨基酸。在所述30-50个氨基酸内，存在约6个半胱氨酸残基。在六个半胱氨酸中，二硫键通常在下述半胱氨酸之间形成：C1和C3，C2和C5，C4和C6。所述A域构成配体结合模块(moiety)。该域的半胱氨酸残基通过二硫键连接以形成紧凑的、稳定的、功能独立的模块。这些重复的簇构成配体结合域，且差动簇合(differential clustering)可针对配体结合赋予特异性。含有A域的例示性蛋白包括，例如补体成分(例如C6，C7，C8，C9和因子I)，丝氨酸蛋白酶(例如肠肽酶，matriptase和corin)，跨膜蛋白(例如ST7，LRP3，LRP5和LRP6)和内吞受体(endocytic receptor)(例如Sortilin相关受体，LDL受体，VLDLR，LRP1，LRP2和ApoER2)。制备具有所需结合特异性的A域蛋白的方法公开于例如WO 02/088171和WO04/044011，其每一个均通过提述并入本文。

在其他实施方案中，本发明的结合分子包含来自重复蛋白的结合位点。重复蛋白是含有连续拷贝的小(例如约20至约40个氨基酸残基)结构单元或重复的蛋白，所述结构单元或重复彼此堆积以形成连续的域。重复蛋白可通过调整所述蛋白中重复的数量来进行修饰以适应特定靶结合位点。例示性的重复蛋白包括设计的锚蛋白重复蛋白(即DARPin)(参见例如Binz等，Nat.Biotechnol.，22:575-582(2004))或富亮氨酸重复蛋白(即LRRP)(参见例如Pancer等，Nature，430:174-180(2004))。所有目前为止确定的锚蛋白重复单元的三级结构均具有由β-发卡继以两个反平行的α-螺旋并终以将该重复单元与下一个重复单元连接的环构成的特征。锚蛋白重复单元构建的域通过将所述重复单元堆积为延伸和弯曲的结构来形成。LRRP结合位点形成来自海七鳃鳗和其它无颌鱼类的获得性免疫系统一部分，并在其通过在淋巴细胞成熟过程中重组一套富亮氨酸重复基因而形成方面类似于抗体。制备DARpin或LRRP结合位点的方法描述于WO 02/20565和WO 06/083275，其每一个均通过提述并入本文。

在本发明的结合分子中可采用的其它非免疫球蛋白结合位点包括来源于Src同源域(例如SH2或SH3域)，PDZ域，β-内酰胺酶，高亲和力蛋白酶抑制剂，或小二硫键结合蛋白支架如蝎毒素的结合位点。制备来源于这些分子的结合位点的方法已在本领域中公开，参见例如Panni等，J.Biol.Chem.，277:21666-21674(2002)，Schneider等，Nat.Biotechnol.，17:170-175(1999)；Legendre等，Protein Sci.，11:1506-1518(2002)；Stoop等，Nat.Biotechnol.，21:1063-1068(2003)；和Vita等，PNAS，92:6404-6408(1995)。还有其它的结合位点可来源于选自下组的结合域：EGF样域，Kringle域，PAN域，Gla域，SRCR域，Kunitz/牛胰胰蛋白酶抑制剂域，Kazal类型丝氨酸蛋白酶抑制剂域，Trefoil(P类型)域，von Willebrand因子类型C域，过敏毒素样域，CUB域，甲状腺球蛋白类型I重复，LDL受体类型A域，Sushi域，Link域，血小板反应素(Thrombospondin)类型I域，免疫球蛋白样域，C-类型凝集素域，MAM域，von Willebrand因子类型A域，生长调节素B域，WAP-类型四二硫键核心(four disulfide core)域，F5/8类型C域，血液结合素(Hemopexin)域，层粘连蛋白类型EGF样域，C2域和此类其它本领域一般技术人员已知的域，以及其衍生物和/或变体。

非免疫球蛋白结合分子可通过从具有人工多样化的结合位点的结合分子的文库选择或分离靶结合变体来鉴定。多样化的文库可通过组入CDR序列的文库(例如，选自表13-18中列出的那些CDR序列)和/或完全随机的方法(例如易错PCR，外显子改组，或定向演化)和/或藉由本领域公认的设计策略来生成。例如，当结合位点与其关联的靶分子相互作用时通常涉及的氨基酸位置可通过在编码所述结合位点的核酸内相应的位置插入简并密码子，三核苷酸，随机肽，或整个环来随机化(参见例如美国公开号20040132028)。氨基酸位置的定位可通过调查与靶分子复合的结合位点的晶体结构来鉴定。对于CDR序列组入(例如，选自表13-18中列出的那些CDR序列)和/或随机化的候选位置包括结合位点的结合空穴，螺旋，平表面，和环。在某些实施方案中，对于多样化可能为候选的在结合位点中的氨基酸可通过其与免疫球蛋白折叠的同源性来鉴定。例如，在纤连蛋白的CDR样环内的残基可经随机化以生成纤连蛋白结合分子的文库(参见例如Koide等，J.Mol.Biol.，284:1141-1151(1998))。在组入CDR序列(例如，选自表2-6中列出的那些CDR序列)和/或随机化之后，然后可对经多样化的文库进行选择或筛选步骤以获得具有所需结合特征，例如特异性结合于IL-6，的结合分子。选择可通过本领域公认的方法如噬菌体展示，酵母展示，或核酸展示来实现。

iv.驼类来源的VH和VL域的种系化

由于下述因素，驼类常规抗体对于制备作为人类治疗剂有用的抗体提供了有利的起始点(讨论于US 12/497,239，其通过全文提述并入本文)：

1)驼类VH和VL域与其人类同类物之间的高％序列同源性；

2)驼类VH和VL域的CDR与其人类同类物之间的高度结构同源性(即人类样规范折叠结构和人类样规范折叠的组合)。

驼类(例如美洲驼)平台亦在可获得的IL-6抗体的功能多样性方面提供了显著的优势。

包含驼类VH和/或驼类VL域的IL-6抗体对人类治疗的有用性可仍进一步通过将天然驼类VH和VL域“种系化(germlining)”来改善，例如使其在人类宿主中具有较低免疫原性。种系化的总体目标是产生一种分子，其中当导入人类受试者时，VH和VL域呈现最小限的免疫原性，而保留由亲本VH和VL域形成的抗原结合位点的特异性和亲和力。

确定驼类VH(或VL)域和人类VH(或VL)域之间的同源性在该种系化过程中是关键步骤，无论对于选择待改变的驼类氨基酸残基(在给定VH或VL域中)还是对于选择合适的替代氨基酸侧链而言均如此。

已基于大量新颖驼类VH(和VL)域序列(通常为已知结合靶抗原的体细胞突变的VH(或VL)域)与人类种系VH(或VL)序列，人类VH(和VL)共同序列，以及对于羊驼(llamapacos)可获得的种系序列信息的比对而开发了一种将驼类常规抗体种系化的方法。

下述段落概述的原理可应用于(i)选择供在驼类来源的VH或VL域或其CDR中替代的“驼类”氨基酸序列，和(ii)选择在种系化任何给定驼类VH(或VL)域时用来取代的替代“人类”氨基酸序列。该方法可用于制备本文中表13-16中列出的VH和VL序列的种系化变体。

步骤1：选择人类(种系)家族和该家族的成员，其对于待种系化的成熟驼类序列显示最高同源性/同一性。用于对于任何给定驼类VH(或VL)域鉴定最紧密匹配的人类种系的一般步骤在下文中概述。

步骤2：选择用于种系化参照(germline against)的特定人类种系家族成员。优选地，这是具有最高同源性的种系，或来自相同家族的另一个种系家族成员。

步骤3：基于与选定的人类种系最接近的驼类种系的氨基酸利用表，鉴定视为对于种系化优选的位置。

步骤4：尝试改变驼类种系中偏离最接近的人类种系的氨基酸；相对于CDR残基，优选种系化FR残基。

a.优选偏离用于种系化参照的选定人类种系的位置，对其在驼类序列中发现的氨基酸并不匹配选定的种系，且并未见于相同亚型的其它种系(对于V以及对于J编码的FR氨基酸均如此)。

b.亦可在所述种系化过程中定位(address)偏离选定的人类种系家族成员，但用于相同家族的其它种系的位置。

c.亦可定位其它对于选定的人类种系的错配(例如，由于附加的体细胞突变)。

下述方法可用于对于给定的驼类VH(或VL)域确定最紧密匹配的人类种系：

在分析骆驼科和人类种系VH和VL之间的百分比序列同一性之前，可首先确定规范折叠，其允许鉴定对于H1和H2或L1和L2(和L3)具有相同的规范折叠的组合的人类种系区段的家族。接着，可选择与感兴趣的骆驼科可变区具有最高序列同源性程度的人类种系家族成员进行序列同源性的评分。超变环L1，L2，L3，H1和H2的Chothia规范类型的确定可用在网页www.bioinf.org.uk/abs/chothia.html.page上公众可获得的生物信息学工具来进行。该程序的输出显示在数据文件中的关键残基要求。在这些数据文件中，显示关键残基位置，以及在每个位置允许的氨基酸。将抗体的可变区的序列作为输入给出，并首先与共同抗体序列比对以指派(assign)Kabat编号方案。对规范折叠的分析使用由Martin和Thornton(Martin等，J.Mol.Biol.263:800-815(1996))开发的自动方法衍生的一组关键残基模板。单个框架区的边界可使用IMGT编号方案指派，所述方案改编自Chothia的编码方案(Lefranc等，NAR 27:209-212(1999)；imgt.cines.fr)。

在已知特定人类种系V区段的情况下(其对于H1和H2或L1和L2(和L3)使用相同的规范折叠组合)，可确定在序列同源性方面最佳匹配的家族成员。骆驼科VH和VL域框架氨基酸序列与由人类种系编码的相应序列之间的百分比序列同一性可使用生物信息学工具确定，但亦可使用所述序列手动的比对。人类免疫球蛋白序列可从数种蛋白质数据库鉴定，如VBase(vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)或Pluckthun/Honegger数据库(http://www.bioc.unizh.ch/antibody/Sequences/Germlines)。为了将人类序列与骆驼科VH或VL域的V区进行比较，可使用序列比对算法如通过网站如www.expasy.ch/tools/#align可获得的算法，但对于有限组的序列亦可进行手动比对。可选择具有相同的规范折叠组合并具有与每条链的框架区1，2和3最高同源性程度的家族的人类种系轻链和重链序列，并将其与感兴趣的骆驼科可变区相比较；同样将FR4针对人类种系JH和JK或JL区进行检查。

注意在总体百分比序列同源性的计算中，将FR1，FR2和FR3的残基使用来自具有相同规范折叠组合的人类种系家族的最紧密匹配的序列进行评价。仅对与最紧密匹配或具有相同规范折叠组合的相同家族的其它成员不同的残基进行评分(NB–排除任何引物编码的不同)。然而，就种系化的目的而言，可考虑对与其它人类种系家族的成员相同的框架区中的残基(其不具有相同的规范折叠组合)进行种系化，尽管这些残基根据上述的严格条件具有“负的”评分。该假定是基于对于种系化的“混合并匹配(mix and match)”方法，其中将FR1，FR2，FR3和FR4分别与其最紧密匹配的人类种系序列相比较，因此所述种系化的分子含有不同FR的组合，如Qu及其同事(Qu等，Clin.Cancer Res.5:3095-3100(1999))和Ono及其同事(Ono等，Mol.Immunol.36:387-395(1999))所实施。

IV.修饰的结合分子

在某些实施方案中，本发明的结合多肽可包含一种或多种修饰。本发明的结合多肽的修饰形式可使用任何本领域中已知的技术制备。

i)减少免疫原性风险

在某些实施方案中，使用本领域中公认的技术修饰本发明的结合分子(例如抗体或其抗原结合片段)以进一步减少其免疫原性风险。例如，抗体或其片段可根据上文所述的方法进行种系化。或者，可对本发明的结合分子进行嵌合化，人源化，和/或去免疫化(deimmunize)。

在一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段可为嵌合的。嵌合抗体是抗体不同部分来源于不同动物物种的抗体，如具有来自驼类(例如美洲驼)单克隆抗体的可变区和人类免疫球蛋白恒定区的抗体。产生嵌合抗体或其片段的方法在本领域中是已知的。参见例如Morrison，Science 229:1202(1985)；Oi等，BioTechniques 4:214(1986)；Gillies等，J.Immunol.Methods 125:191-202(1989)；美国专利号5,807,715；4,816,567；和4,816,397，其均通过全文提述并入本文。对于“嵌合抗体”的产生开发的技术(Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.81:851-855(1984)；Neuberger等，Nature 312:604-608(1984)；Takeda等，Nature 314:452-454(1985))可用于产生所述分子。例如，可将编码驼类抗IL-6抗体分子的结合特异性的遗传序列与来自具有合适生物活性的人类抗体分子的序列融合在一起。如用于本文中，嵌合抗体是其中不同部分来源于不同动物物种的分子，如具有来源于驼类(例如美洲驼)单克隆抗体的可变区和人类免疫球蛋白恒定区的那些，例如种系化或人源化抗体。

在另一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合部分是人源化的。人源化抗体具有包含来自非人类抗体的一种或多种互补决定区(CDR)的结合特异性和来自人类抗体分子的框架区。通常，将人类框架区中的框架残基用来自CDR供体抗体的相应残基取代，以改变，优选改善抗原结合。这些框架取代通过本领域中公知的方法鉴定，例如通过对CDR和框架残基的相互作用建模以鉴定对于抗原结合重要的框架残基，以及进行序列比较以鉴定在特定位置的不常见的框架残基(参见例如Queen等，美国专利号5,585,089；Riechmann等，Nature 332:323(1988)，其通过全文提述并入本文)。抗体可使用多种本领域中已知的技术人源化，所述技术包括CDR移植(EP 239,400；PCT公开WO 91/09967；美国专利号5,225,539；5,530,101；和5,585,089)，镶贴(veneering)或重铺(resurfacing)(EP 592,106；EP 519,596；Padlan，Molecular Immunology 28(4/5):489-498(1991)；Studnicka等，ProteinEngineering 7(6):805-814(1994)；Roguska.等，PNAS 91:969-973(1994))，以及链改组(美国专利号5,565,332).

在一些实施方案中，可使用去免疫化以进一步减少IL-6结合分子(例如抗体或其抗原结合部分)的免疫原性风险。如用于本文中，术语“去免疫化”包括改变多肽(例如抗体或其抗原结合部分)以修饰T细胞表位(参见例如WO9852976A1，WO0034317A2)。例如，可分析来自本发明的起始IL-6特异性抗体或其抗原结合部分的VH和VL序列，并可从每个V区生成人类T细胞表位“图谱(map)”，其显示表位相对于互补决定区(CDR)和序列内其它关键残基的位置。分析来自T细胞表位图谱的单个T细胞表位以鉴定具有低的改变最终抗体活性的风险的备选氨基酸取代。设计一系列备选VH和VL序列，其包含氨基酸取代的组合，然后将这些序列组入一系列IL-6特异性抗体或其片段以供用于本文中公开的诊断和治疗方法，然后测试其功能。通常，生成并测试12至24个变体抗体。然后将包含修饰的V和人类C区的完整重链和轻链基因克隆入表达载体，并将后续质粒导入细胞系以供产生全抗体。然后在合适的生物化学和生物学测定中比较抗体，并鉴定出最优的变体。

ii)效应物功能和Fc修饰

在某些实施方案中，本发明的结合分子可包含抗体恒定区(例如IgG恒定区，例如人类IgG恒定区，例如人类IgG1或IgG4恒定区)，其介导一种或多种效应物功能。例如，补体的C1成分对抗体恒定区的结合可活化补体系统。补体的活化对于细胞病原体的调理作用(opsonisation)和裂解是重要的。补体的活化亦刺激炎性反应，并亦可涉及自身免疫超敏感性。此外，抗体通过Fc区结合于多种细胞上的受体，其中抗体Fc区上的Fc受体结合位点结合于细胞上的Fc受体(FcR)。存在多种Fc受体，其对于不同类型的抗体具特异性，包括IgG(γ受体)，IgE(ε受体)，IgA(α受体)和IgM(μ受体)。抗体对细胞表面上的Fc受体的结合触发多种重要和多样的生物应答，包括抗体包被的颗粒的吞噬(engulfment)和破坏，免疫复合物的清除，杀伤细胞对抗体包被的靶细胞的裂解(称为细胞依存性细胞介导的细胞毒性或ADCC)，炎性介质的释放，胎盘转移和免疫球蛋白产生的控制。在优选实施方案中，本发明的结合分子(例如抗体或其抗原结合片段)结合于Fc-γ受体。在其它实施方案中，本发明的结合分子可包含恒定区，其缺乏一种或多种效应物功能(例如ADCC活性)和/或无法结合Fcγ受体。

本发明的某些实施方案包括抗IL-6抗体，其中在一种或多种恒定区域中的至少一个氨基酸经缺失，或另行改变从而提供所需的生物化学特征如当与具有大约相同的免疫原性的完全的、未改变的抗体相比减少或增强的效应物功能，非共价二聚化的能力，增加的在肿瘤病灶定位的能力，减少的血清半寿期，或增加的血清半衰期。例如，供用于本文中所述的诊断和治疗方法的某些抗体或其片段是域缺失抗体，其包含类似于免疫球蛋白重链的多肽链，但缺乏一种或多种重链域的至少一部分。例如，在某些抗体中，会缺失修饰抗体的恒定区的一整个域，例如，会缺失全部或部分CH2域。

在某些其它实施方案中，结合分子包含来源于不同抗体同种型的恒定区(例如来自人类IgG1，IgG2，IgG3或IgG4中两个或更多个的恒定区)。在其他实施方案中，结合分子包含嵌合铰链(即包含来源于不同抗体同种型的铰链域的铰链部分，例如来自IgG4分子的上部铰链域和IgG1中部铰链域的铰链)。在一个实施方案中，结合分子包含结合分子包含来自人类IgG4分子的Fc区或其部分和在分子的核心铰链区中的Ser228Pro突变(EU编号)。

在某些实施方案中，可使用本领域中已知的技术对Fc部分进行突变以增加或减少效应物功能。例如，恒定区域的缺失或失活(通过点突变或其它手段)可减少循环的修饰抗体的Fc受体结合，由此增加肿瘤定位。在其它情况下，其可为符合本发明的恒定区修饰调节(moderate)补体结合，并因此减少血清半寿期和缀合的细胞毒素的非特异性缔合。恒定区的还有其它的修饰可用于修饰二硫连接或寡糖模块，其由于增加的抗原特异性或灵活性而允许增强的定位。所述修饰所得的生理概貌，生物利用度和其它生物化学作用如肿瘤定位，生物分布和血清半衰期，可使用已知的免疫学技术而无需不必要的实验容易地进行测量和定量。

在某些实施方案中，用于本发明的抗体的Fc域是Fc变体。如用于本文中，术语“Fc变体”指相对于所述Fc域所来源的野生型Fc域具有至少一个氨基酸取代的Fc域。例如，其中所述Fc域来源于人类IgG1抗体，所述人类IgG1 Fc域的Fc变体相对于所述Fc域包含至少一个氨基酸取代。

Fc变体的氨基酸取代可位于Fc域内的任何位置(即EU常规氨基酸位置)。在一个实施方案中，Fc变体包含在位于铰链域或其部分的氨基酸位置的取代。在另一个实施方案中，Fc变体包含在位于CH2域或其部分的氨基酸位置的取代。在另一个实施方案中，Fc变体包含在位于CH3域或其部分的氨基酸位置的取代。在另一个实施方案中，Fc变体包含在位于CH4域或其部分的氨基酸位置的取代。

本发明的结合分子可采用任何本领域公认的Fc变体，其已知赋予效应物功能和/或FcR结合的改善(例如减少或增强)。所述Fc变体可包括，例如任何一个公开于国际PCT公开WO88/07089A1，WO96/14339A1，WO98/05787A1，WO98/23289A1，WO99/51642A1，WO99/58572A1，WO00/09560A2，WO00/32767A1，WO00/42072A2，WO02/44215A2，WO02/060919A2，WO03/074569A2，WO04/016750A2，WO04/029207A2，WO04/035752A2，WO04/063351A2，WO04/074455A2，WO04/099249A2，WO05/040217A2，WO05/070963A1，WO05/077981A2，WO05/092925A2，WO05/123780A2，WO06/019447A1，WO06/047350A2,和WO06/085967A2或美国专利号5,648,260；5,739,277；5,834,250；5,869,046；6,096,871；6,121,022；6,194,551；6,242,195；6,277,375；6,528,624；6,538,124；6,737,056；6,821,505；6,998,253；和7,083,784(其每一个均通过提述并入本文)的氨基酸取代。在一个例示性实施方案中，本发明的结合多肽可包含Fc变体，所述变体在EU位置268包含氨基酸取代(例如H268D或H268E)。在另一个例示性实施方案中，本发明的结合多肽可包含在EU位置239(例如S239D或S239E)和/或EU位置332(例如I332D或I332Q)的氨基酸取代。

在某些实施方案中，本发明的结合多肽可包含Fc变体，所述变体包含改变抗体的抗原非依存性效应物功能，特别是结合多肽的循环半寿期的氨基酸取代。此类结合分子当与缺乏这些取代的结合分子比较时，呈现增加或减少的对FcRn的结合，因此分别具有增加或减少的血清中的半寿期。具有改善的对FcRn的亲和力的Fc变体预期具有较长的血清半寿期，且此类分子在当需要施用的抗体半寿期较长(例如治疗慢性疾病或病症)的处理哺乳动物的方法中具有有用的用途。相反，具有减少的FcRn结合亲和力的Fc变体预期具有较短的半寿期，且此类分子可用于在例如当缩短的循环时间有利(例如用于体内诊断成像，或在起始抗体当在循环中存在较长时间时具有毒性副作用)时施用于哺乳动物。具有减少的FcRn结合亲和力的Fc变体亦不太可能跨越胎盘，并因此亦可用于在怀孕妇女中治疗疾病或病症。此外，其它可需要减少的FcRn结合亲和力的应用包括其中需要定位至脑，肾和/或肝的应用。在一个例示性实施方案中，本发明的改变的结合分子(例如抗体或其抗原结合片段)呈现来自脉管系统跨越肾小球上皮的转运的减少。在另一个实施方案中，本发明的改变的结合分子(例如抗体或其抗原结合片段)呈现来自脑跨越血脑屏障(BBB)进入脉管空间的转运的减少。在一个实施方案中，具有改变的FcRn结合的抗体包含Fc域，其在Fc域的“FcRn结合环”内具有一个或多个氨基酸取代。所述FcRn结合环包含氨基酸残基280-299(根据EU编号)。改变FcRn结合活性的例示性氨基酸取代公开于国际PCT公开号WO05/047327，其通过提述并入本文。在某些例示性实施方案中，本发明的结合分子(例如抗体或其抗原结合片段)包含Fc域，其具有一个或多个下述取代：V284E，H285E，N286D，K290E和S304D(EU编号)。还在另一个例示性实施方案中，本发明的结合分子包含具有双重突变H433K/N434F的人类Fc域(参见例如美国专利号8,163,881)。在一个具体实施方案中，本发明的结合分子包含一个或多个选自表16的可变区和具有双重突变H433K/N434F的人Fc域。在另一个具体实施方案中，本发明的结合分子包含一个或多个来自表17的CDR序列和具有双重突变H433K/N434F的人Fc域。还在另一个具体实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO.152的VH域和具有双重突变H433K/N434F的人Fc域。还在另一个具体实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ IDNO.152的VH域和具有双重突变H433K/N434F的人Fc域，所述VH域中一个或多个位置(例如第1、3、5或16位或其任意组合)处的谷氨酰胺已经变成谷氨酸。还在另一个具体实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO.152的VH域和具有双重突变H433K/N434F的人Fc域，所述VH域中第1位处的谷氨酰胺已经变成谷氨酸。

在其他实施方案中，供用于本文中所述的诊断和治疗方法的结合分子具有恒定区，例如IgG1或IgG4重链恒定区，其经改变以减少或消除糖基化。例如，本发明的结合分子(例如抗体或其抗原结合片段)亦可包含Fc变体，其包含改变所述抗体Fc的糖基化的氨基酸取代。例如，所述Fc变体可具有减少的糖基化(例如N-或O-连接的糖基化)。在例示性实施方案中，所述Fc变体包含正常见于氨基酸位置297(EU编号)的N-连接的聚糖的糖基化的减少。在另一个实施方案中，所述抗体在糖基化基序例如N-连接的糖基化基序(例如含有氨基酸序列NXT或NXS的N-连接的糖基化基序)附近或之内具有氨基酸取代。在一个具体实施方案中，所述抗体包含在氨基酸位置228或299(EU编号)具有氨基酸取代的Fc变体。在更具体的实施方案中，所述抗体包含IgG1或IgG4恒定区，其包含S228P和T299A突变(EU编号)。

赋予减少或改变的糖基化的例示性氨基酸取代公开于国际PCT公开号WO05/018572，其通过提述并入本文。在优选实施方案中，本发明的抗体或其片段经修饰以消除糖基化。此类抗体或其片段可称作“脱糖基(agly)”抗体或其片段(例如“脱糖基”抗体)。尽管不拘于理论，但认为“脱糖基”抗体或其片段在体内可具有改善的安全性和稳定性概貌。脱糖基抗体可为任何同种型或其亚类型，例如IgG1，IgG2，IgG3或IgG4。在某些实施方案中，脱糖基抗体或其片段包含脱糖基化的IgG4抗体Fc区，其缺乏Fc效应物功能，由此消除对表达IL-6的正常生命器官的Fc介导的毒性的潜力。还在其它实施方案中，本发明的抗体或其片段包含改变的聚糖。例如，所述抗体可在Fc区的Asn297的N-聚糖上具有减少数目的岩藻糖残基，即为脱岩藻糖化的。脱岩藻糖作用增加了对NK细胞的FcRgII结合，并强力增加ADCC。已显示包含抗IL-6scFv和抗CD3scFv的二价抗体诱导ADCC对IL-6表达细胞的杀伤。相应地，在一个实施方案中，使用脱岩藻糖化的抗IL-6抗体以靶向和杀伤IL-6表达细胞。在另一个实施方案中，所述抗体可在Fc区的Asn297的N-聚糖上具有改变数目的唾液酸残基。可使用许多本领域中公认的方法制备“脱糖基”抗体或具有改变的聚糖的抗体。例如，可使用具有修饰的糖基化途径(例如糖基转移酶缺失)的遗传工程改造的宿主细胞(例如修饰的酵母，例如毕赤酵母(Picchia)，或CHO细胞)产生此类抗体。

iii)共价附着

可修饰本发明的结合分子，例如通过将分子共价附于所述结合分子从而使得共价附着并不阻止所述结合多肽特异性结合其关联表位。例如(但并不限于此)，本发明的抗体或其片段可通过糖基化，乙酰化，PEG化，磷酸化，酰胺化，藉由已知的保护/封闭基团衍生化，蛋白分解切割，连接于细胞配体或其它蛋白等来进行修饰。任何多种化学修饰可通过已知技术进行，其包括但不限于特异性化学切割，乙酰化，甲酰化等。此外，衍生物可含有一个或多个非规范氨基酸。

本发明的结合多肽(例如抗体或其片段)可进一步在N或C末端重组融合于异源多肽，或化学缀合(包括共价和非共价缀合)于多肽或其它组合物。例如，抗IL-6抗体可重组融合或缀合于在检测测定中作为标记有用的分子，和效应物分子如异源多肽，药物，放射性核素或毒素。参见例如PCT公开WO 92/08495；WO 91/14438；WO 89/12624；美国专利号5,314,995；和EP 396,387。

可使用本领域中已知方法将结合分子融合于异源多肽以增加体内半寿期或用于免疫测定。例如，在一个实施方案中，可将PEG缀合于本发明的结合分子以增加其体内半寿期。Leong，S.R.等，Cytokine 16:106(2001)；Adv.in Drug Deliv.Rev.54:531(2002)；或Weir等，Biochem.Soc.Transactions 30:512(2002)。

而且，本发明的结合分子可融合于标志物序列，如肽，以协助其纯化或检测。在优选实施方案中，所述标志物氨基酸序列为六组氨酸肽，如在pQE载体(QIAGEN，Inc.，9259Eton Avenue，Chatsworth，Calif.，91311)中提供的标记，等等，其中许多在商业上是可获得的。例如，如描述于Gentz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:821-824(1989)，六组氨酸允许融合蛋白的方便纯化。其它可用于纯化的肽标记包括但不限于“HA”标记(其对应于来源于流感血凝素蛋白的表位)(Wilson等，Cell 37:767(1984))和“Flag”标记。

本发明的结合分子可以以非缀合形式使用，或可缀合于多种分子至少之一，例如改善所述分子的治疗性质，促进靶检测，或对患者进行成像或治疗。进行纯化时，本发明的结合分子可在纯化之前或之后进行标记或缀合。具体地，本发明的结合分子可缀合于治疗剂，前药，肽，蛋白质，酶，病毒，脂质，生物反应修饰剂(biological response modifier)，药剂，或PEG。

本发明进一步涵盖缀合于诊断或治疗剂的本发明的结合分子。所述结合分子可在诊断上用于例如监视免疫细胞紊乱(例如CLL)的形成或进展，作为例如确定给定治疗和/或预防方案的效力的临床测试方法的一部分。可通过将所述结合分子偶联于可检测物质来协助检测。可检测物质的实例包括多种酶，辅基(prosthetic group)，荧光物质，发光物质，生物发光物质，放射性物质，用于数种正电子发射层描记术的正电子发射金属，和非放射性顺磁性金属离子。对于可缀合于根据本发明用作诊断物的抗体的金属离子，参见例如美国专利号4,741,900。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉亲合素/生物素和亲合素/生物素；合适的荧光物质的实例包括伞形酮，荧光素，异硫氰酸荧光素，罗丹明，二氯三嗪基胺荧光素，丹酰氯或藻红蛋白；发光物质的实例包括鲁米诺(luminal)；生物发光物质的实例包括萤光素酶，萤光素和水母发光蛋白(phycoerythrin)；而合适的放射性物质的实例包括125I，131I，111In或99Tc。

供用于本文中公开的诊断和治疗方法的结合分子可缀合于细胞毒素(如放射性同位素，细胞毒性药物，或毒素)、治疗剂，细胞抑制剂，生物毒素，前药，肽，蛋白质，酶，病毒，脂质，生物反应修饰剂，药剂，免疫活性配体(例如淋巴因子或其它抗体，其中所得分子结合于瘤形成细胞和效应细胞如T细胞二者)，或PEG。

在另一个实施方案中，供用于本文中公开的诊断和治疗方法的抗IL-6抗体可缀合于减少肿瘤细胞生长的分子。在其他实施方案中，公开的组合物可包含抗体，或其片段，其偶联于药物或前药。本发明的仍旧其它实施方案包括缀合于特异性生物毒素或其细胞毒性片段如蓖麻毒蛋白，白树毒蛋白，假单胞菌外毒素或白喉毒素的抗体或其片段的用途。使用何种缀合的或未缀合的抗体的选择会取决于癌症的类型和阶段，辅助治疗的使用(例如化疗或外部辐射)和患者状况。应理解的是，本领域技术人员根据本文中的教导可方便地进行此种选择。

应理解的是，在之前研究中，已成功地使用以同位素标记的抗肿瘤抗体在动物模型中和在一些情况下在人类中破坏肿瘤细胞。例示性放射性同位素包括90Y，125I，131I，123I，111In，105Rh，153Sm，67Cu，67Ga，166Ho，177Lu，186Re和188Re。所述放射性核素通过产生离子化辐射起作用，所述辐射在核DNA中造成多个链断裂，导致细胞死亡。用于产生治疗性缀合物的同位素通常产生高能α-或β-粒子，其具有较短的路径长度。此类放射性核素杀伤接近其的细胞，例如缀合物附着或进入的瘤形成细胞。其对于非定位细胞具有很小或不起作用。放射性核素基本上不具免疫原性。

V.结合分子的表达

在如上所述操纵分离的遗传物质以提供本发明的结合分子之后，通常将该基因插入表达载体以供导入宿主细胞，其可用于产生所需量的要求保护的抗体或其片段。

就本说明书和权利要求书而言，术语“载体”或“表达载体”在本文中用于意指依照本发明用作供导入细胞和在细胞中表达所需基因的媒介的载体。如本领域技术人员所知，此类载体可容易地选自下组：质粒，噬菌体，病毒和逆转录病毒。一般地，与本发明相容的载体会包含选择标志物，合适的限制性位点以协助所需基因的克隆，和进入真核或原核细胞和/或在其中复制的能力。

就本发明而言，可采用多种表达载体系统。例如，一种类型的载体利用来源于动物病毒如牛乳头状瘤病毒，多瘤病毒，腺病毒，牛痘病毒，杆状病毒，逆转录病毒(RSV，MMTV或MOMLV)或SV40病毒的DNA元件。其它的涉及使用具有内部核糖体结合位点的多顺反子系统。此外，将DNA整合入其染色体的细胞可通过导入一种或多种允许选择转染的宿主细胞的标志物来进行选择。所述标志物可给予营养缺陷型宿主原养型，给予杀生物剂(例如抗生素)抗性或对重金属如铜的抗性。可选择标志物基因可直接连接于待表达的DNA序列，或通过共转化导入相同细胞。对于mRNA的最佳合成亦可需要其它元件。这些元件可包括信号序列，剪接信号，以及转录启动子，增强子，和终止信号。在特别优选的实施方案中，将克隆的可变区基因与如上所讨论的合成的重链和轻链恒定区基因(优选人类的)一同插入表达载体。

在其它优选实施方案中，本发明的结合分子或其片段可使用多顺反子构建体表达。在此类表达系统中，可从单个多顺反子构建体产生多个感兴趣的基因产物如抗体的重链和轻链。这些系统有利地使用内部核糖体进入位点(IRES)以在真核宿主细胞中提供相对高水平的本发明的多肽。相容的IRES序列公开于美国专利号6,193,980，其通过提述并入本文。本领域技术人员会知道此类表达系统可用于有效地产生本申请中公开的完整范围的多肽。

更一般地，一旦制备了编码抗体或其片段的载体或DNA序列，即可将表达载体导入合适的宿主细胞。即，可转化所述宿主细胞。将质粒导入宿主细胞可通过多种本领域技术人员公知的技术来实现。这包括但不限于转染(包括电泳和电穿孔)，原生质体融合，磷酸钙沉淀，与包膜的DNA的细胞融合，微注射，和用完整病毒感染。参见Ridgway，A.A.G."MammalianExpression Vectors"Chapter 24.2，pp.470-472Vectors，Rodriguez和Denhardt，Eds.(Butterworths，Boston，Mass.1988)。更优选地，将质粒导入宿主是通过电穿孔。将转化的细胞在适于轻链和重链的产生的条件下生长，并就重链和/或轻链蛋白合成进行测定。例示性测定技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)，放射免疫测定(RIA)，或荧光激活的细胞分选分析(FACS)，免疫组织化学等。

如用于本文中，术语“转化”应以广泛含意使用，指将DNA导入受体宿主细胞，其改变基因型并后续地导致所述受体细胞中的变化。

依此类推，“宿主细胞”指经使用重组DNA技术构建并编码至少一种外源基因的载体转化的细胞。在从重组宿主分离多肽的过程的描述中，术语“细胞”和“细胞培养物”可互换使用以表示抗体的来源，除非明显另行指明。换言之，从“细胞”回收多肽可意指从沉淀的全细胞，或从含有培养基和悬浮细胞的细胞培养物。

在一个实施方案中，用于抗体表达的宿主细胞系是哺乳动物来源的。本领域技术人员可确定最适于待在其中表达所需基因产物的具体宿主细胞系。例示性宿主细胞系包括但不限于DG44和DUXB11(中国仓鼠卵巢系，DHFR-)，HELA(人宫颈癌瘤)，CVI(猴肾系)，COS(具有SV40T抗原的CVI的衍生物)，R1610(中国仓鼠成纤维细胞)，BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)，HAK(仓鼠肾系)，SP2/O(小鼠骨髓瘤)，BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)，RAJI(人类淋巴细胞)，293(人肾)。在一个实施方案中，所述细胞系提供了由其表达的抗体的改变的糖基化，例如脱岩藻糖化(例如PER.C6.RTM.(Crucell)或FUT8-敲除CHO细胞系(Potelligent.RTM.Cells)(Biowa，Princeton，N.J.))。在一个实施方案中，可使用NS0细胞。特别优选CHO细胞。宿主细胞系通常可从商业服务，American Tissue CultureCollection或发表的文献获得。

体外产生允许放大规模以提供大量的所需多肽。在组织培养条件下用于哺乳动物细胞培养的技术在本领域中是已知的，且包括匀质的悬浮培养，例如在气升式反应器或连续搅拌反应器中，或固定化或捕获的(entrapped)细胞培养，例如在中空纤维，微囊中，在琼脂糖微珠或陶瓷筒(ceramic cartridge)上。若必需和/或期望，可通过定制的层析方法来纯化多肽溶液，例如凝胶过滤，离子交换层析，在DEAE纤维素上的层析，和/或(免疫)亲和层析。

编码本发明的结合分子或其片段的基因亦可在非哺乳动物细胞如细菌或真菌或植物细胞中表达。在此方面，应理解的是亦可转化多种单细胞非哺乳动物微生物如细菌；即那些能够在培养或发酵中生长的。易受转化的细菌包括肠杆菌科的成员如大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门氏菌属(Salmonella)；芽孢杆菌科(Bacillaceae)如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌属(Pneumococcus)；链球菌属(Streptococcus)；和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)的菌株。应进一步理解的是，当在细菌中表达时，多肽可成为包涵体的一部分。所述多肽必需经分离，纯化，然后组装为功能性分子。

除了原核生物外，亦可使用真核微生物。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，即常见的面包师用酵母(baker’s yeast)在真核微生物中是最常用的，尽管通常亦可使用多种其它菌株。对于在酵母属(Saccharomyces)中的表达，通常使用例如质粒YRp7(Stinchcomb等，Nature，282:39(1979)；Kingsman等，Gene，7:141(1979)；Tschemper等，Gene，10:157(1980))。该质粒已经含有TRP1基因，其对于缺乏在色氨酸中生长的酵母的突变株，例如ATCC编号44076或PEP4-1(Jones，Genetics，85:12(1977))提供了选择标志物。然后，trpl缺乏的存在，作为酵母宿主细胞基因组的特征，对于通过在色氨酸缺乏下生长检测转化提供了有效的环境。

VI.结合分子的药物制剂和给药方法

在另一个方面，本发明提供了包含结合分子(例如抗体或其抗原结合片段)的药物组合物。

用于制备本发明的结合分子和将其施用于受试者的方法对于本领域技术人员是公知的或可方便地确定的。本发明的抗体或其片段的给药途径可为口服，肠胃外，吸入或局部。术语肠胃外用于本文中包括静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、直肠或阴道给药。静脉内、动脉内、皮下和肌肉内形式的肠胃外给药通常是优选的。尽管所有这些形式的给药显然均认为包括在本发明的范围内，但用于给药的例示形式应为供注射的溶液，特别是供静脉内或动脉内注射或点滴的溶液。通常，合适的供注射的药物组合物可包含缓冲液(例如乙酸、磷酸或柠檬酸缓冲液)，表面活性剂(例如聚山梨酯)，任选的稳定剂(例如人白蛋白)等。在与本文中的教导相容的其它方法中，可将所述多肽直接递送至有害的(adverse)细胞群体的位置，由此增加患病组织对治疗剂的暴露。例如，本发明的结合分子的高热稳定性和溶解性质使其对于局部给药，例如通过皮下(Sub-Q)注射是理想的药剂。此外，本发明的抗体的极端高的亲和力和效力允许使用较低的有效剂量，由此简化了皮下注射。相应地，所述结合分子特别适于炎性相关病症(例如类风湿性关节炎)，癌症或相关症状(例如食欲缺乏或恶病质)的治疗或预防，对这些病症，结合分子的定位递送可为理想的。

用于肠胃外给药的制备物包括无菌水或非水溶液，悬液和乳液。非水溶剂的实例是丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄榄油，和可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水，醇/水溶液，乳液或悬液，包括盐水和缓冲的介质。在本主题发明中，药学上可接受的载体包括但不限于0.01-0.1M和优选0.05M磷酸缓冲液或0.8％盐水。其它常见的肠胃外媒介包括磷酸钠溶液，Ringer右旋糖，右旋糖和氯化钠，乳酸化的Ringer，或不挥发性油。静脉内媒介包括液体和营养补充物，电解质补充物，如基于Ringer右旋糖的那些，等等。亦可存在防腐剂和其它添加剂，如例如抗微生物剂，抗氧化剂，螯合剂，和惰性气体等等。更具体地，适于注射用的药物组合物包括无菌的水溶液(当水溶性时)或分散体和无菌的粉末(供临时制备无菌的可注射溶液或分散体)。在此类情况下，所述组合物必须是无菌的，且应为达到容易的可注射性程度的液体。其在生产和储藏条件下应为稳定的，且优选避免微生物如细菌和真菌的污染作用而保藏。所述载体可为溶剂或分散介质，其含有例如水，乙醇，多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，及其合适的混合物。合适的流动性可通过例如使用包衣如卵磷脂，通过维持所需的粒径(在分散体的情况下)和通过使用表面活性剂来维持。微生物作用的防止可通过多种抗细菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯(paraben)，氯丁醇，苯酚，抗坏血酸，硫柳汞等来实现。在许多情况下，优选在组合物中包括等张剂，例如糖，多元醇如甘露醇、山梨醇，或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中包括延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸铝和明胶来实现。

在任何情况下，无菌的可注射溶液可通过将活性化合物(例如抗体本身或与其它活性剂组合)以所需量组入含有本文中列举的成分之一或组合(视需要)的合适溶剂中，接着进行过滤灭菌来制备。一般地，分散体通过将所述活性化合物组入无菌媒介来制备，所述媒介含有基础分散介质和所需的来自上列的那些的其它成分。在用于供制备无菌的可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其自其之前无菌过滤的溶液产生具有活性成分加上任何其它所需成分的粉末。对供注射的制备物在无菌条件下根据本领域已知方法进行加工，填充入容器如安瓿，袋，瓶，注射器或小瓶中，并进行密封。进一步，可将所述制备物以试剂盒的形式包装并出售，如描述于共同待决的美国系列号No.09/259,337和美国系列号No.09/259,338(每一个均通过提述并入本文)中的那些。此种制品优选带有标签或包装插页表明相关的组合物可用于治疗罹患或易患自身免疫或瘤形成疾病的受试者。

本发明的结合分子可配制为广泛范围的浓度以供药物用途。例如，所述结合分子可配制为5mg/ml至50mg/ml(例如5，10，20，50mg/ml)的浓度。或者，本发明的结合分子可改为更高浓度的制剂以供局部(例如皮下)给药。例如，可将所述结合分子配制为50mg/ml至200mg/ml的浓度，例如约50，约75，约100，约150，约175或约200mg/ml。

对于上文所述条件下的治疗，本发明的结合分子的有效量，取决于多种不同因素而变化，所述因素包括给药手段，靶位点，患者的生理状态，患者是人类或动物，其它施用的药物，和处理是预防性或是治疗性的。通常，患者是人类，但亦可处理包括转基因哺乳动物的非人哺乳动物。处理剂量可使用本领域技术人员已知的常规方法滴定以优化安全性和效力。

对于用本发明的抗体的被动免疫接种，剂量的范围可为例如约0.0001至100mg/kg，和更常见为0.01至5mg/kg(例如0.02mg/kg，0.25mg/kg，0.5mg/kg，0.75mg/kg，1mg/kg，2mg/kg等)的宿主体重。例如，剂量可为1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1至10mg/kg范围内，优选至少1mg/kg。在上述范围中的中间剂量亦旨在处于本发明的范围内。

可对受试者每日，隔日，每周，或根据由经验分析确定的任何其它日程施用此类剂量。例示性的治疗需要在持续的例如至少六个月的期间内以多个剂量进行给药。其它例示性治疗方案需要每两周一次或每月一次或每3至6个月一次的给药。例示的剂量日程包括在每日1-10mg/kg或15mg/kg，隔日30mg/kg，或每周60mg/kg。在一些方法中，将两种或更多种具有不同结合特异性的单克隆抗体同时施用，在此情况下施用的每种抗体的剂量可落在指示的范围之内。

可多次施用本发明的结合分子。单次给药之间的间隔可为例如每日，每周，每月或每年。间隔亦可为非定期的，如根据测量患者中多肽或靶分子的血液水平来指示。在一些方法中，调整剂量以实现一定的血浆抗体或毒素浓度，例如1-1000μg/ml或25-300μg/ml。或者，可将抗体或其片段作为持续释放制剂来施用，在此情况下需要较不频繁的施用。剂量和频率取决于患者中抗体的半寿期而变化。一般地，种系化或人源化抗体显示最长的半寿期，接着是嵌合抗体和非人类抗体。在一个实施方案中，本发明的抗体或其片段可以以非缀合形式施用。在另一个实施方案中，本发明的抗体可以以缀合形式施用多次。仍在另一个实施方案中，本发明的抗体或其片段可以以非缀合形式，然后以缀合形式施用，或反之。

给药的剂量和频率可取决于处理是预防性或治疗性而变化。在预防性用途中，将含有本发明抗体或其混合物的组合物施用于尚未处于疾病状态的患者以增强该患者的抵抗力。此种量定义为“预防有效量”。在此用途中，准确量同样取决于患者的健康和一般免疫状态，但一般范围为0.1至25mg每剂，特别是0.5至2.5mg每剂。将相对较低的剂量以相对不频繁的间隔在一长段时间内施用。一些患者余生中继续接受处理。

在治疗性用途中，有时需要以相对较短的间隔进行相对较高的剂量(例如约1至400mg/kg抗体每剂，5至25mg的剂量更常用于放射性免疫缀合物，而更高剂量用于细胞毒素-药物缀合分子)直至减少或终止疾病的进行，并优选直至患者显示疾病症状的部分或完全缓解。在此之后，可对所述患者进行预防性方案。

在一个实施方案中，可将受试者用编码本发明的多肽的核酸分子(例如在载体中)处理。编码多肽的核酸的剂量的范围为约10ng至1g，100ng至100mg，1μg至10mg，或30-300μgDNA每位患者。对于感染性病毒载体的剂量在10至100个或更多个病毒颗粒每剂变动。

治疗剂可通过肠胃外，表面，静脉内，口服，皮下，动脉内，颅内，腹膜内，鼻内或肌肉内手段施用以供预防和/或治疗处理。对于本发明的抗体的施用，优选肌肉内注射或静脉内输注。在一些方法中，将治疗性抗体或其片段直接注入颅内。在一些方法中，将抗体或其片段作为持续释放的组合物或装置如Medipad^TM装置施用。

本发明的药剂可任选地与其它对于处理需要处理(例如预防性或治疗性)的病症或病状为有效的其它药剂组合施用。优选的其它药剂为本领域公认并对于具体病症标准情况下施用的那些。

有效的单次处理剂量(即治疗有效量)的⁹⁰Y标记的本发明的抗体的范围为约5至约75mCi，更优选约10至约40mCi。有效的单次处理非骨髓消融(ablative)剂量的¹³¹I标记的抗体的范围为约5至约70mCi，更优选约5至约40mCi。有效的单次处理消融剂量(即可需要自体骨髓移植)的¹³¹I标记的抗体的范围为约30至约600mCi，更优选约50至少于约500mCi。

尽管已用¹³¹I和⁹⁰Y获得了大量临床经验，但在本领域中亦已知其它放射性标记，并已用其进行类似的目的。亦使用其它放射性同位素进行成像。例如，与本发明的范围相容的其它放射性同位素包括但不限于¹²³I，¹²⁵I，³²P，⁵⁷Co，⁶⁴Cu，⁶⁷Cu，⁷⁷Br，⁸¹Rb，⁸¹Kr，⁸⁷Sr，¹¹³In，¹²⁷Cs，¹²⁹Cs，¹³²I，¹⁹⁷Hg，²⁰³Pb，²⁰⁶Bi，¹⁷⁷Lu，¹⁸⁶Re，²¹²Pb，²¹²Bi，⁴⁷Sc，¹⁰⁵Rh，¹⁰⁹Pd，¹⁵³Sm，¹⁸⁸Re，¹⁹⁹Au，²²⁵Ac，²¹¹At，²¹³Bi。在此方面，α，γ和β发射物均与本发明相容。此外，考虑到本公开，认为本领域技术人员可容易地确定何种放射性核素与选定的治疗程序相容而无需不必要的实验。为此目的，其它已用于临床诊断的放射性核素包括¹²⁵I，¹²³I，⁹⁹Tc，⁴³K，⁵²Fe，⁶⁷Ga，⁶⁸Ga以及¹¹¹In。抗体亦经多种放射性核素标记以供在靶向的免疫疗法中的潜在用途(Peirersz等Immunol.Cell Biol.65:111-125(1987))。这些放射性核素包括¹⁸⁸Re和¹⁸⁶Re以及在较低程度上，¹⁹⁹Au和⁶⁷Cu。美国专利号5,460,785提供了关于此类放射性同位素的其它数据，并通过提述并入本文。

如前所讨论，本发明的结合分子可以以药学上有效量施用以供在体内治疗哺乳动物病症。为此，应理解的是公开的抗体或其片段经配制以协助给药并促进活性剂的稳定性。优选地，依照本发明的药物组合物包含药学上可接受的、非毒性、无菌的载体如生理盐水、非毒性缓冲液、防腐剂等。就本申请而言，缀合或非缀合于治疗剂的本发明的抗体的药学上有效量，应意指足以实现对靶的有效结合并实现益处，例如缓解疾病或病症的症状，或检测物质或细胞的量。在肿瘤细胞的情况下，所述多肽优选能够与瘤形成或免疫反应性细胞上选定的免疫反应性抗原相互作用，并提供这些细胞死亡的增加。当然，本发明的药物组合物可以以单次或多次剂量施用以提供所述多肽的药学上的有效量。

与本公开的范围一致，可依照前述处理方法将本发明的结合分子以足以产生治疗或预防作用的量施用于人类或其它动物。可将本发明的多肽以常规剂量形式施用于此种人类或其它动物，所述剂量形式根据已知的技术通过将本发明的抗体与常规的药学上可接受的载体或稀释剂组合来制备。本领域技术人员公认所述药学上可接受的载体或稀释剂的形式和特性由其将组合的活性成分的量，给药途径，和其它公知的变量决定。本领域技术人员会进一步理解包含一种或多种根据本发明的多肽的混合物可证明是特别有效的。

VII.治疗IL-6相关的疾病或病症的方法

本发明的结合分子可用于拮抗IL-6活性。相应地，在另一个方面，本发明提供了治疗IL-6相关的疾病或病症的方法，即将包含一种或多种本发明的结合分子的药物组合物施用于有此需要的受试者。

适合于治疗的IL-6相关的疾病或病症包括但不限于炎性疾病和癌症。

本领域技术人员应能够通过常规实验，确定就处理IL-6相关疾病或病症的目的而言，何为抗体(或其它治疗剂)的有效的、非毒性的量。例如，多肽的治疗上活性量可根据如受试者的疾病阶段(例如阶段I对阶段IV)，年龄，性别，医学并发症(例如免疫抑制病状或疾病)和重量，以及抗体在所述受试者中引发所需反应的能力的因素变化。可调整剂量方案以提供最佳的治疗反应。例如，可将数个分开的剂量每日施用，或可如治疗情况的急迫性所示成比例减少剂量。然而，一般地，预期有效剂量的范围为约0.05至100毫克每千克体重每日，和更优选约0.5至10毫克每千克体重每日。

VIII.示例

实施例1：IL-6特异性拮抗性Fab的生成和选择

将美洲驼(llama)用人类IL-6(在从MACS Miltenyi Biotec购买的大肠杆菌(目录号130-093-934)中产生或在从Humanzyme购买的人胚肾细胞(目录号HZ-1044)中产生)免疫接种。对美洲驼的免疫接种和外周血淋巴细胞(PBL)的收获，以及后续的RNA的提取和抗体片段的扩增，如De Haard及其同事(De Haard H等，JBC.274:18218-30，1999)所述进行。在最后一次免疫接种之后，收集血液，并从使用Ficoll-Paque梯度制备的PBL和ChomczynskiP等(Anal.Biochem.162:156-159，1987)描述的方法提取总RNA。然后将提取的RNA用于随机cDNA合成和重链和轻链V区(Vλ和Vκ)的PCR扩增以如De Haard H等(Biol.Chem.274，1999)所述构建含有Fab的噬菌粒文库。

表达Fab的噬菌体根据标准实验方案产生，并进一步对固定化的人IL-6进行选择，所述IL-6经生物素化并由中性亲合素捕获，或者直接包被于maxisorp平板。IL-6结合噬菌体用胰蛋白酶的总或竞争性洗脱根据标准噬菌体展示实验方案进行。

接着IL-6特异性Fab就与IL-6中和抗体，B-E8和IL-6受体的交叉竞争使用基于ELISA的竞争测定来进行筛选。使用该测定鉴定的例示性拮抗性IL-6特异性Fab的VH和VL氨基酸序列列于下表13。

能够与B-E8抗体交叉竞争的IL-6特异性Fab的结合动力学使用表面等离子共振(Biacore)评估。特别地，将生物素化的(原核)IL-6捕获于链霉亲合素biacore传感器芯片(CM5-SA)上，并将不同浓度的纯化的Fab在3分钟内注射，接着用缓冲液进行5分钟洗涤。从洗涤阶段，确定了解离速率(kd)，而从注射阶段，使用浓度和解离速率作为参数计算结合速率(on-rate)(ka)。拮抗性Fab的测得的解离速率和结合速率和计算的亲和力示于表2。Fab24C9和24D10具有在10^-5s^-1范围的解离速率，和分别为660和270pM的亲和力。拮抗性纯化的Fab(表3)和Fab表达细菌的周质级分(表4)的结合动力学亦通过表面等离子共振(Biacore)使用CM5芯片上直接包被的细菌和真核产生的人IL-6进行评价。测试的Fab具有6x10^-4至2x10^-5s^-1的解离速率。

表2：选定的纯化的拮抗性Fab克隆的结合动力学

表3：选定的纯化的拮抗性Fab克隆的结合动力学

表4：含Fab的周质级分的结合动力学

实施例2：用于改善的亲和力的VH/VL改组。

使用VL链改组以改善Fab 17F10，18C7，18C9，18C11，20A4，29B11，16D2和28A6的亲和力。在此方法中，将这些克隆的重链(如VHCH1片段)重新导入初级噬菌粒轻链文库(参见实施例1)。进行亲和力选择以选择对于IL-6具有改善的亲和力的链改组Fab。链改组Fab的结合动力学通过表面等离子共振(Biacore)使用细菌和真核产生的人IL-6，以及食蟹猴IL-6进行评价(表5-7)。通过VL链改组方法选择的例示性IL-6特异性Fab的VH和VL氨基酸序列列于下表14。

亦使用VH链改组以改善Fab 24D10的亲和力。在此方法中，将24D10的轻链重新导入初级噬菌粒重链文库(参见实施例1)并使用解离速率测定进行选择。在该类型的选择中，允许噬菌体结合于基质上的抗原1.5至2小时。在第2轮，在用PBS-Tween洗涤15次之后，在过量可溶性IL-6存在下再进行一次洗涤。其原理为具有较差解离速率并因此更快地解离的噬菌体抗体被过量的可溶性靶捕获，并在洗涤中被去除。该方法避免了此种噬菌体重新结合于包被的靶。再次洗涤步骤的时间随进行的轮次数而增加，并将温度亦增加至37℃以选择更稳定的Fab变体。链改组Fab和基准抗体BE8和GL18的结合动力学通过表面等离子共振(Biacore)使用细菌和真核产生的人类IL-6进行评价(表8和9)。通过该VH链改组方法选择的例示性IL-6-特异性Fab的VH和VL氨基酸序列列于下表14。

表5：纯化的17F10，18C11，18C7和20A4链改组Fab的结合动力学

表6：含有29B11链改组Fab的周质级分的结合动力学

表7：含有28A6链改组Fab的周质级分的结合动力学

表8：含24D10链改组Fab的周质级分的结合动力学

表9：纯化的24D10链改组Fab的结合动力学

实施例3：与IL-6复合的Fab 61H7的晶体结构

i)IL-6/Fab 61H7复合物的表征

尺寸排阻层析在Alliance 2695 HPLC系统(Waters)上使用Silica Gel KW803柱(Shodex)进行，其用50 mM Tris-HCl pH 7.5，150 mM NaCl以0.5ml/min的流速洗脱。检测使用三重角度光散射检测仪(triple-angle light scattering detector)(Mini-DAWN^TMTREOS，Wyatt technology，Sanata Barbara，USA)进行。分子量确定通过ASTRA V软件(Wyatt technology)进行。

ii)结晶

对IL-6/Fab 61H7复合物进行的起始结晶筛选用商业性试剂盒Structure screen1和2，Proplex screen和Stura Footprint screen(Molecular Dimensions Ltd)进行。液滴使用Cartesian MicroSys SQ机器人在Greiner 96孔板上设定为1:1(v:v)比例的蛋白质(8.45 mg/ml)对母液，总体积为200 nl。复合物的衍射品质的结晶通过在27.14％PEG MME2K，0.1M Na Hepes pH 7.14中优化之后，在277K通过静止滴(sitting-drop)蒸汽扩散获得。晶体属于C2空间群，具有下述晶胞维度：和和β＝97°。其在每一个不对称单元中含有一个ILF/Fab复合物，具有的Vm值，其对应于48％的溶剂含量。

iii)对IL-6:61H7复合物的结构的分析

对61H7 mAb的CDR环预测的规范结构对于H1和H2分别是1和3。而对于L1，L2,和L3分别是7，1,和4(www.bioinf.org.uk/abs/chothia.html)。61H7 VH(来源于针对HIV-1蛋白gp41的患者来源的抗体)与Protein Data Bank(PDB)登录号1dfb的覆盖显示H1和H2采用预期的规范折叠(参见图3A)。61H7 VL与Protein Data Bank(PDB)登录号1mfa的覆盖说明所有三条轻链CDR采用预期的构象(参见图3B)。相应地，结构分析确认61H7的VH(VH3家族成员)属于规范H1-H2结构的人类1-3组合，而61H7的VL(VL8家族成员)属于人类规范结构的人类7λ1-4组合。

之前对IL-6进行了结晶，并将其归类为由环和附加的微小螺旋连接的四螺旋束(Somers等，1997，EMBO Journal 16，989-997，其通过全文提述并入本文)。将apo IL-6(pdb1ALU)与来自IL-6:61H7复合物的IL-6的叠加显示两种模型之间的良好符合(rms)。这确证61H7 Fab识别并结合IL-6的天然构象。

IL-6与其受体和信号传导受体gp130复合的晶体结构显示六聚体复合物(Boulanger等，2003，Science 27，2101-2104，其通过全文提述并入本文)。IL-6与IL-6R通过位点I形成非信号传导复合物。位点II是由IL-6和IL-6R的二元复合物形成的复合表位。位点III与gp130的相互作用形成信号传导复合物。

将IL-6:IL-6R结构(pdb 1P9M)与IL-6:61H7结构叠加显示两种IL-6结构之间的良好符合(rms )。两个环在构象方面有所不同。覆盖残基Asn48-Asn61的第一环是较长的环，其在apo IL-6和IL-6:61H7复合物中不形成结构。该环在IL-6:IL-6R结构中由IL-6R的结合稳定化。在构象方面不同的第二环是所谓BC环。

晶体不对称单元含有单个1:1复合物。IL-6:61H7复合物的总体架构显示VH(60％)和VL(40％)两者均对于较大的相互作用面积有所贡献。根据晶体结构，确定了对于与IL-6的相互作用重要的残基。在61H7Fab和细胞因子之间形成的氢键和盐桥列于表10。相互作用限于轻链的CDR1和CDR3和重链的CDR1，CDR2和CDR3。

表10：61H7:IL-6复合物中的氢键和盐桥

IL-6:61H7复合物和IL-6:IL-6R复合物的叠加显示在61H7 Fab和IL-6R之间存在位阻。导致与IL-6R发生空间碰撞的主要是VL。IL-6R和61H7的表位会非常靠近彼此。为了验证在两个表位之间存在重叠，对距IL-6R在以内的残基和距61H7 Fab在以内的残基进行作图，并搜索两个表位之间的重叠。两个表位之间的重叠非常小，并主要由VH互补位形成。重叠集中在由61H7的HCDR3环和IL-6R分子二者占据的空穴周围。IL-6R在IL-6上的该结合位点称作位点I(Boulanger等，2003，Science 27，2101-2104，其通过全文提述并入本文)。该空穴形成位点I由IL-6R的Phe 229的疏水侧链所占据。该氨基酸被Boulanger等称为热点残基，因为诱变研究显示其在受体和细胞因子之间的相互作用中的关键作用。将该残基突变为缬氨酸或丝氨酸完全消除了IL-6R对IL-6的结合(Kalai等，1997，Blood，1319-1333，其均通过全文提述并入本文)。在Fab 61H7的重链CDR3环的中心中的Trp98占据同一空穴，表明其因此撞击IL-6中的关键表位以阻断其与IL-6R的相互作用(显示于图5)。Trp98可能是Fab61H7对IL-6的超高亲和力的关键残基。

实施例4：与IL-6复合的Fab 68F2和129D3的晶体结构

i)IL-6:68F2晶体的生成、数据收集和结构确定

将8mg Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(d-PBS)pH 7.2中的68F2mAb(4mg/ml)在Zeba TMDesalt Spin Column(Pierce Fab Preparation Kit Thermo Scientific)上缓冲液交换至含有20mM半胱氨酸-HCl的消化缓冲液。将样品用固定化的木瓜蛋白酶(Pierce ThermoScientific)温育，并在37℃消化6小时。将Fc片段使用在d-PBS中平衡的CaptureSelect人类Fc亲和基质(BAC BV Unilever)与Fab片段分离。将Fab片段从流过物回收，并将Fc片段使用0.1M甘氨酸pH 2.0洗脱。蛋白浓度通过UV分光光度法根据在280nm的吸光度来确定。回收了4.6mg(>50％)的纯化的Fab 68F2，并在Amicon-Ultra(截取值10kDa)上浓缩至1.53mg/ml。

将2.5mg的rh IL-6(Immunotools)用Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(d-PBS)pH 7.2中的2.6mg的Fab 68F2在4摄氏度温育1小时，然后在Amicon-Ultra(截取值10kDa)上浓缩至1ml。然后将IL-6:68F2复合物与过量的游离IL-6在d-PBS中的Superdex75柱上通过凝胶过滤层析分开，并在Amicon-Ultra浓缩器(截取值10kDa)上最终浓缩至8.1mg/ml。在SDS-PAGE上评估复合物的纯化。

尺寸排阻层析在Alliance 2695HPLC系统(Waters)上使用Silica Gel KW803柱(Shodex)进行，用50mM Tris-HCl pH 7.5，150mM NaCl以0.5ml/min的流速洗脱。检测使用三重角度光散射检测仪(Mini-DAWN^TM TREOS，Wyatt technology，Santa Barbara，USA)进行。分子量确定通过ASTRA V软件(Wyatt technology)进行。对IL-6:68F2复合物进行的起始结晶筛选用商业性试剂盒Structure screen 1和2，Proplex screen和Stura Footprintscreen(Molecular Dimensions Ltd)进行。液滴使用Cartesian MicroSys SQ机器人在Greiner 96孔板上设定为1:1(v:v)比例的蛋白质(8.1mg/ml)对母液，总体积为200nl。复合物的衍射品质的结晶通过置于25％PEG 4K，0.15M(NH₄)₂SO₄，0.1M MES pH 5.5中9个月之后在277K进行静止滴(sitting-drop)蒸汽扩散获得。

将供数据收集的结晶转移至含7.5％乙二醇的母液中，并在液氮中闪冻。衍射数据在标准低温条件下在ESRF同步加速器(Grenoble，France)使用ADSC Quantum 4检测器在束线(beamline)ID14-4上收集，并使用XDS处理和用XSCALE衡量(scale)。与Fab 68F2复合的IL-6的晶体结构使用MOLREP通过Fab 129D3和IL-6结构的分子替代(molecularreplacement)根据单波长正常衍射实验(single-wavelength native diffractionexperiment)来确定(表4)。精化用BUSTER进行。类似地产生IL-6:129D3晶体。

iii)IL-6:68F2和IL-6:129D3复合物结构的分析

IL-6:68F2复合物的晶体结构具有的分辨率。将该模型精化至26.7％的R因子和29.6％的R_free因子，并具有合理的立体化学(意指超过95％的残基采用允许的构象)。IL-6:129D3复合物的晶体结构具有的分辨率。将该模型精化至28.5％的R因子和31.3％的R_free因子，并具有合理的立体化学。

进行了对晶体化的68F2和129D3 Fab(r.m.s.d.)，VH域(r.m.s.d. )和VL域(r.m.s.d.0.4)的重叠。这些叠加显示在亲本68F2和种系化的129D3 Fab结构之间并无显著差异。

对于68F2mAb及其种系化变体129D3的CDR环预测的规范结构对于H1和H2分别为3和1，而对于L1，L2和L3分别为6λ，1和5。重链的规范折叠通过在www.bioinf.org.uk/abs/chothia.html的服务器预测，轻链的规范折叠通过手动确定。用于轻链规范折叠的比较的参照Fab(PG16)通过检索Antibody Structure Summary Page(www.bioinf.org.uk/abs/sacs/antibody_structure_summary_page.html)而人工地发现。68F2和129D3VL与PG16的VL(Protein Data Bank(PDB)登录号3MUG)的重叠说明所有三个CDR采用预测的构象(参见图4A)。68F2/129D3VH与参照PDB登录号1ACY的重叠显示H1和H2采用预测的规范折叠(参加图4B)。相应地，结构分析确证68F2/129D3的VL(VL2家族成员)属于规范L1-L3结构的人类6λ-1-5组合，而68F2/129D3的VH(VH4家族成员)属于人类规范H1-H2结构的3-1组合。

晶体不对称单元含有单个1:1复合物。IL-6:68F2复合物的总体架构显示VH(50％)和VL(50％)同等地对较大的相互作用面积作出贡献。该相互作用面积略大于61H7与IL-6的相互作用面积类似于61H7:IL-6复合物，仅L2环不直接涉及与IL-6的相互作用。

重链和轻链之间的界面对于68F2对应于而对于129D3结构对应于该界面面积与对于61H7和27B3抗体测得的面积相当。所有界面面积用EMBL网上服务程序PISA计算。

根据晶体结构，确定了对于与IL-6的相互作用重要的残基。在68F2 Fab和细胞因子之间形成的氢键和盐桥列于表11。相互作用限于轻链的CDR1和CDR3和重链的CDR1，CDR2和CDR3。

20A4克隆的VL改组导致68F2克隆具有与亲本20A4相比10x更佳的亲和力。两种抗体主要在其L1和L2 CDR存在差异。轻链CDR2环并不贡献于与IL-6的结合，因此，亲和力的改善归结于L1环中的突变。三个与IL-6发生重要相互作用的残基中的两个在20A4克隆中不保守：Asn26，其与IL-6的Ser76形成氢键，在20A4中是Ser；而Thr31，其与IL-6形成两个氢键，在20A4亲本L1中是Gly。当改变这两个残基时添加三个新的氢键可能解释了在VL改组之后观察到的部分亲和力上升。更重要地，在L1中的改变可能导致稳定化Y30(Kabat编号)和/或使其正确位于F229空穴中，允许额外的高效力。

表11：68F2:IL-6复合物中的氢键和盐桥

IL-6:68F2复合物和IL-6:IL-6R复合物的重叠显示在68F2 Fab和IL-6R之间存在位阻，如对于61H7:IL-6复合物所观察到的。然而，与61H7:IL-6复合物相对，主要是68F2的VH导致与68F2:IL-6复合物中IL-6R的空间碰撞。68F2 Fab准确地与IL-6在相同于IL-6R的位点相互作用。此外，68F2并不与gp130结合位点重叠，并因此特异性地仅与IL-6R竞争。

IL-6:IL-6R和IL-6:68F2复合物的重叠表明IL-6R和68F2的表位彼此非常接近。在IL-6上对属于两个表位的残基进行定位，并确定其重叠。68F2表位与IL-6R的重叠几乎是完全的。IL-6R在IL-6上的结合位点称为位点I(Boulanger等，2003，Science 27，2101-2104)。空穴形成位点I由IL-6R的Phe 229的疏水侧链占据。该氨基酸由Boulanger等称为热点残基，因为诱变研究显示其在受体和细胞因子之间的相互作用中的关键作用。该残基突变为缬氨酸或丝氨酸完全地消除了IL-6R对IL-6的结合(Kalai等，1997，Blood，1319-1333)。对在IL-6:68F2结构中描述为位点I的空穴的检查揭示其由Fab 68F2的轻链的CDR1环占据。具体而言，轻链的CDR1中的Tyr32(Kabat编号中的位置30)在结合该位点中起至关重要的作用(图5C)。

在IL-6和IL-6R之间的相互作用中的另一个关键残基是IL-6R的Phe279。该残基代表总结合界面的20％(相对于对于Phe 229的28％使其成为第二重要的相互作用。像Phe229，Phe279亦结合于在IL-6的表面上形成的空穴中。该空穴亦由68F2残基占据，更特别地，由重链的CDR3环的Val104(Kabat编号中的位置99)占据(图6)。

之前对IL-6进行了结晶，并将其归类为由环和附加的微小螺旋连接的四螺旋束(Somers等，1997，EMBO Journal 16，989-997)。已经解析了IL-6与其受体和信号传导受体gp130复合的晶体结构(Boulanger等，2003，Science 27，2101-2104)。IL-6与IL-6R通过位点I形成非信号传导复合物。位点II是由IL-6和IL-6R的二元复合物形成的复合表位。位点III与gp130的相互作用形成信号传导复合物。

IL-6:61H7复合物的结构与IL-6:68F2结构的比较显示尽管两种mAb与IL-6R竞争对IL-6的位点I的结合，两种抗体在两个不同的表位结合IL-6。68F2结合在桶形状的IL-6的侧面，并排他地竞争IL-6R结合，而61H7更多地在桶形状的IL-6的基部相互作用，与IL-6R和gp130竞争。有趣的是，在IL-6上的独特的重叠表位是由IL-6R的热点残基Phe229填充的空穴(图5)。这表明对该空穴的结合对于对68F2和61H7观察到的高效力是关键的。

实施例5：在61H7的HCDR3中的W98的结构功能分析

本文中公开的极端高度强力的抗体的显著特征是其占据IL-6上IL-6R的F229结合处空穴(本文中称作F229空穴)的能力。对于61H7(及其种系化变体例如111A7)，F229空穴由HCDR3的色氨酸98残基(W98)占据。为了评价W98对61H7结合IL-6的功能重要性，生成了111A7的突变体，其中VH位置98在M100A或M100L的背景下突变为所有可能的氨基酸。含有突变体Fab的细菌的周质级分的结合动力学使用表面等离子共振(Biocore)测试，并确定了对于每个突变体的解离速率。突变分析的结果列于表12。数据显然显示在位置98的色氨酸(W)是实现最佳解离速率的最佳可能氨基酸。W98的突变总是有害于111A7对IL-6的结合。

表12：具有在位置98和100的VH突变的61H7 Fab的解离速率

实施例6：Fab克隆61H7和68F2的VH和VL的种系化

将克隆68F2和61H7的VH和VL序列针对人种系VH和VL序列进行比对以鉴定最紧密相关的种系序列。种系化过程如WO 2010/001251中和由Baca等(J.Biol.Chem.(1997)272:10678-10684)和Tsurushita等(J.Immunol.Methods(2004)295:9-19)所述进行。使用文库/噬菌体展示方法，其中并入了对于人类和美洲驼残基二者而言的偏离的FR残基。

本发明的驼类来源的IL-6抗体在序列和结构方面显著地类似人类样的。其结果，仅最小数量的序列改变(通过种系化)并入了最终的种系化变体。例如，在亲本68F2抗体的VH和VL框架区中的87(VH)和79(VL)个氨基酸中，仅导入了6个(VH)和7个(VL)氨基酸变化(总共13个氨基酸变化)，得到在其相应的VH和VL框架中具有93.1％和91.1％同一性的最终种系化先驱(lead)(129D3)(参见图10A的比对)。类似地，在亲本61H7抗体的VH和VL框架区中的87(VH)和79(VL)个氨基酸中，仅导入了8个(VH)和5个(VL)氨基酸变化(总共13个氨基酸变化)，得到在其相应的VH和VL框架中具有90.8和93.7％同一性的最终种系化先驱(111A7)(参见图10B的比对)。

与之相对，本领域公认的IL-6抗体需要大量的工程改造(CDR移植)和序列改变(回复突变)以生成适于治疗用途的变体。例如，参照小鼠IL-6抗体CNTO-328需要14个(VH)和22个(VL)氨基酸改变(总共36个)以生成人源化变体CNTO136，其在VH和VL框架中仅具有84％和72.5％同源性(对于比对，参见图11A)。另一种参照兔IL-6抗体，ALD518，需要总共46个框架改变(在VH中为26个，而在VL中为20个)以生成最终的人源化变体，其与亲本抗体仅具有70.5％和74％序列同源性。因此，IL-6抗体显然仅需要最小限的工程改造，并得到在序列上更加接近人类的分子。

此外，待改变的FR残基的小数量使其能够将CDR残基中的变化并入种系化过程。此类CDR突变可用于去除导入生产变异性(糖基化位点，氧化，异构化等)的氨基酸或将CDR残基向见于抗体的不同变体中的氨基酸改变进行种系化。

使用噬菌体展示(应用严格选择条件)以选择其它功能性Fab。对单个克隆就解离速率进行筛选，并对最佳命中进行测序以确定人类序列同一性。例示性种系化IL-6特异性Fab的VH和VL氨基酸序列列于下表15和16。

将来自所有鉴定的VH和VL域的CDR区(其为129D3和111A7的变体Fab)进行比较，并确定CDR氨基酸共同序列。129D3和111A7的CDR变体和衍生的CDR共同序列列于下表17和18。

实施例7：体外效力测定

克隆129D3，68F2，61H7，133A9，133H2，133E5和132E7的体外效力使用基于细胞的中和生物测定使用B9细胞系确定，基本上如Helle等1988，Eur.J.Immunol 18；1535-1540所述。B9细胞来源于鼠类B细胞杂交瘤细胞系B13.29，其需要IL-6以供存活和增殖，并响应非常低浓度的人类IL-6。测定使用10pg/ml(或0.5pM)人类IL-6和纯化的129D3，B-E8，CAT6001，CNTO136，61H7，UCB124.g1的浓度系列来进行。将B9细胞在不含IL-6的培养基中以平底板中5000个细胞/200微升在IL-6存在，抗体存在或不存在的情况下接种。增殖在64-72h通过[3H]胸腺嘧啶脉冲进行测量。结果(示于图1和表23)说明所有克隆具有高效力，其中在该测定中129D3具有少于0.1pM的IC50。有趣的是，如图1中所示，克隆129D3的IC50优于基准CNTO136，CAT6001，UCB124，和B-E8抗体。

克隆133E5，133A9，133H2，111B1，104C1，129D3，68F2，61H7的体外效力亦使用基于细胞的中和生物测定使用7TD1细胞系确定，基本上如Van Snick等PNAS；83，:9679(1986)(其通过全文提述并入本文)中所述。7TD1细胞是由小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0-Ag14与来自在融合之前三日用大肠杆菌脂多糖免疫接种的C57BL/6小鼠的脾细胞的融合形成的鼠类杂交瘤细胞系。7TD1细胞系的生长依存于IL-6，且IL-6的移除导致凋亡所致的细胞死亡。测定使用75pg/ml人类IL-6和纯化的133E5，133A9，133H2，111B1，104C1，129D3，68F2，61H7，B-E8，GL18LB，CNTO136和hu1U的浓缩系列进行。

简言之，将7TD1细胞(7.10E3)在RPMI1640培养基+10％FCS中温育2-4h，然后在微滴定板中添加IL-6(75pg/ml终浓度)(200ul终体积)。将细胞在37℃温育3日，然后用PBS洗涤，并添加60ul的底物溶液(对硝基苯基-N-乙酰基-β-D-葡糖胺(Sigma N-9376)；在0.05M柠檬酸钠pH 5中的7.5mM底物；0.25体积％triton X-100)进行4h。酶促反应用90ul的终止溶液(100mM甘氨酸+10mM EDTA pH 10.4)中止，并测量在405nm的OD。结果(显示表24)说明所有克隆在该测定中具有高效力，其中IC50少于1pM。

实施例8：上皮卵巢癌小鼠异种移植物测定

克隆129D3的体内效力使用小鼠异种移植物模型来确定。将IGROV-1上皮细胞(5x10⁶)在皮下注入裸鼠。在3日之后，对小鼠以4或20mg/kg的剂量两周一次施用129D3或CNT0328。每组有5只小鼠，并在对照组中有10只小鼠。每周确定在每个研究组中小鼠的百分比存活，并将结果作为存活曲线作图。结果(示于图2)说明129D3呈现优于基准CNT0328 IL-6抗体的体内效力。

实施例9：免疫原性分析

将本发明的IL-6抗体的VH和VL区就潜在的免疫原性序列的存在进行评价(例如推定的HLA类型II限制的表位，亦称作TH-表位)，并与多种商业上可获得的参照抗体使用分析(profiling)方法对于免疫原性评分进行比较。

在同种异型水平对于18DRB1，6DRB3/4/5，13DQ和5DP，即总共42种HLA类型II受体进行分析。鉴定出了DRB1，DRB3/4/5的强和中等结合物，以及DQ和DP表位的强结合物。对于强和中等亲和力的DRB1结合物，分别进行表位计数。结合于相同组的多种同种异型的肽计为一次。表示最劣情况免疫原性风险的大约评分如下所述计算：评分＝∑(表位计数x同种异型频率)。

换言之，将影响特定HLA同种异型的表位数乘以受影响的同种异型的等位基因频率。对于给定序列，对于乘积就用于该研究、存在于白人群体2％或更多中的所有DRB1同种异型进行加和。

对于本发明的IL-6抗体和代表性参照抗体的DRB1评分提供于图9。总DRB1评分是对于每个抗体的VH和VL评分的复合，而低评分表明该抗体的低免疫原性。相应地，图9说明本发明的IL-6抗体与基准IL-6抗体以及其它商业上可获得的抗体(例如Humira和Remicade)相比具有相同或较低的免疫原性。

实施例10：可制造性

将68F2的种系化型式的VH和VL分别在pUPE重链和轻链表达载体中重新克隆以供瞬时表达全长IgG1抗体。在HEK293E细胞中的瞬时表达之后，将IgG1抗体用蛋白A纯化，并通过测量OD280来定量。下表19总结种系化衍生物的产生水平，以及68F2亲本抗体的水平。亦对每种抗体在基于7TD1的增殖测定中测量效力(以pM计)。

发现变体126A3，127F1，129D3和129F1(均在严格条件下选自种系化的文库)，与野生型68F2具有类似的效力(即0.5至0.7pM)。而且，所有种系化的变体表达良好，即24至28μg/ml。例外是给予9μg/ml的产量的种系化变体129F2。

实施例11：稳定性分析

为了检查全长人类IgG1形式的68F2的种系化和亲本型式的热稳定性，将抗体样品以100μg/ml的浓度(PBS中)在4，50，55，60，65，70和75℃温育1小时。在此之后，将样品在15分钟的期间缓慢冷却至25℃，并维持在该温度2小时，在此之后将其在4℃储藏过夜。在离心去除(变性的抗体的)沉淀之后，使用Biacore(在PBS中1/10稀释和在HBSEP中1/10)测量溶液中剩余的功能性抗体的浓度。在注射在IL-6固定化的芯片上之后获得的解离曲线的斜率是功能性抗体的浓度的量度。

如示于图7A，野生型68F2及其种系化衍生物的熔解曲线和熔解温度显然未受种系化影响。非常出乎意料，熔解温度甚至显示改善。例如，129D3具有70℃左右的Tm，其比亲本68F2抗体高3℃。亦将种系变体129D3和亲本68F2的熔解曲线一同与参照抗体GL18和CNTO136相比较(参见图7B)。SIMPLE抗体68F2和特别是其种系化变体129D3的有利的热稳定性(70℃的Tm)当与CNTO136的65℃的Tm和GL18抗体的61℃的Tm相比是令人震撼的。令人惊讶的是，施于两种参照抗体的大量抗体工程改造(例如人源化)和体外亲和力成熟强烈地影响其稳定性，而体内生成的SIMPLE抗体和种系化的最小限工程改造导致极其优良的热稳定性。

将68F2及其种系变体(129D3)(和来源于SIMPLE^TM抗体先驱(lead)61H7的种系化变体103A1)的全长人IgG1型式的血清稳定性与参照抗体的那些进行比较。在人类血清中在37℃温育之后，在第1，2，4，8，12，16，24，32和56周测量抗体的功能性浓度，并与预先等分的标样进行比较。如图8中描述，本发明的抗体的血清稳定性与参照抗体相比较为有利。

实施例12：CMC优化

对于CMC品质的抗体制造，不推荐几种残基或基序。其中包括抗体CDR环中甲硫氨酸的存在。甲硫氨酸可受氧化，导致抗体经化学改变的变体，其具有改变的性质如亲和力，效力，和稳定性。相应地，将111A7(及其61H7的种系化变体)的CDR3中存在的甲硫氨酸突变为丙氨酸(111A7MA)，亮氨酸(111A7ML)或丝氨酸(111A7MS)。所得的CMC-优化的序列提供于下表20。如示于表21，甲硫氨酸残基的突变对结合于IL-6具有可忽略的作用。

实施例13：克隆129D3及其Fc突变体在食蟹猴中的药代动力学(PK)研究

进行了作为多种IgG1分子格式的抗体克隆129D3的药代动力学分析。分析了下述抗体：野生型IgG1 129D3(129D3-WT)，在Fc区具有突变M252Y/S254T/T256E的IgG1 129D3(129D3-YTE)，和在Fc区具有突变H433K和N434F的IgG1 129D3(129D3-HN)。

对食蟹猴(对于每个测试的抗体为3只)静脉内注射单次5mg/kg剂量的129D3-WT，129D3-YTE，或129D3-HN。在不同时点取样品，并通过ELISA测试mAb的血浆浓度。特别地，将微滴定板(Maxisorb Nunc)用1ug/ml PBS中的IL-6(Immunotools)在4℃包被过夜。将平板用PBS-Tween洗涤2次，并用300μl PBS-1％酪蛋白封闭2小时。在用PBS-Tween洗涤2次之后，施加样品。所有稀释用1％汇集的空白血浆进行(这是来自三只未经免疫的食蟹猴的汇集，参见4.2章)。允许样品在RT结合2小时。然后将平板用PBS-Tween洗涤5次并将山羊生物素化的抗人IgG重链和轻链猴吸附的多克隆抗体以1000倍稀释施加(Bethyl，目录号：A80-319B)并允许在RT结合1小时。在将平板用PBS-Tween洗涤5次之后，将HRP缀合的链霉亲合素(Jackson Immunoresearch 016-030-084)以300,000倍稀释施加，并允许在RT结合1小时。然后将平板用PBS-Tween洗涤5次，并添加TMB(calbiochem CL07)-s(HS)TMB减弱剂(weakener)(SDT，#sTMB-W)的1:1混合物。允许着色进行10分钟，然后用0.5M H₂SO₄终止，之后在450nm测量吸光度。将样品分析四次，并将129D3-WT(来自与注射入动物相同的批次)用于标准曲线。

对于无隔室分析(non-compartmental analysis)的相关PK参数示于下表22。对于不同129D3IgG1抗体的药代动力学分析图示于图12(显示的结果为该组猴的平均结果)。该数据明显显示129D3-YTE和129D3-HN与亲本129D3-WT抗体相比具有更长的平均保留时间(MRT)。而且，129D3-YTE和129D3-HN与129D3-WT相比具有更慢的消除速率，并因此具有实质上延长的半寿期。

有趣的是，尽管两种抗体均含有野生型IgG1Fc区，但129D3-WT的半寿期与US201200344212中所述的MedImmune抗IL-6IgG1抗体(GL18)的半寿期相比显著更长。特别地，129D3-WT具有约15.6日的半寿期，与之相比，抗体GL18具有约8.5日的半寿期。因此，本发明的抗体的延长的半寿期显示为由于其相应的Fab区的性质所致。

实施例14：血清淀粉样蛋白A(SAA)小鼠模型

克隆68F2和61H7的体内效力进一步通过测量这些抗体阻断响应注射的IL-6的血清淀粉样蛋白A(SAA)诱导的能力来进行调查。进行该测定的一般方法列于WO2006/119115A2，其通过全文提述并入本文。特别地，用68F2，61H7，基准抗体GL18，或CNTO136，或盐溶液(对照)注射Balb/c小鼠静脉内。在施用抗体之后四小时，用0.1ug的IL-6注射小鼠。在进一步16小时之后，从小鼠取血，并通过ELISA确定血清淀粉样蛋白A的浓度。实验组，剂量和结果列于本文中的表26。剂量反应亦在图13中图示。结果显示抗体克隆68F2和61H7具有至少等于高效基准对照GL18和CNTO136的体内效力。

实施例15：人源化小鼠银屑病异种移植物模型

使用小鼠异种移植物模型以评价克隆68F2对诱导的银屑病病变形成的预防性效力。特别地，对BNX小鼠移植来自银屑病患者非涉及的(non-involved)皮肤的5mm直径完整厚度皮肤活检样品(biopsy)(每只小鼠1片)。在3周之后，用0.5x10⁶活化的PBMC注射移植物。对小鼠用克隆68F2，抗TNF抗体(Remicade)，或二丙酸倍他米松(阳性对照)的处理在将活化的细胞注入移植物之前一日起始。处理组和方案的细节示于表25。

处理效力通过上皮皱褶厚度(通过光学显微镜测量)来确定。组之间的显著性使用差异分析(ANOVA)继以事后最小方差(post-hoc Least Square Difference(LSD))检验进行分析以确立处理组之间的统计学上的显著差异。p<0.05的值表示组之间的显著差异。

这些实验的结果列于本文中的图14。对照组(组2)的上皮皱褶厚度为156μm±4(平均值±s.e.m.)。用倍他米松的处理(组1，n＝3)显著地使上皮皱褶厚度减少至83μm±13(p<0.05)(图12和13)。Remicade处理组(组3)的平均上皮皱褶厚度为125μm±12，而对于68F2处理组(组4)为125μm±12。这些数据显示在人源化小鼠银屑病模型中克隆68F2与抗TNF抗体Remicade同样有效。

实施例16：肾细胞癌小鼠异种移植物模型

在肾细胞癌小鼠异种移植物模型中调查克隆68F2的体内效力。进行该测定的一般方法列于WO2008/144763，其通过全文提述并入本文。简言之，将RXF393细胞(2x10⁶)在裸鼠的两个侧面皮下注入。允许肿瘤生长至50至300mm³的体积，然后进行抗体施用。90％的经注射的小鼠发生肿瘤。将40只小鼠分为5个组，每组8只小鼠。每个组接受腹膜内注射PBS(对照)或特别剂量的克隆68F2(1，3，10，或30mg/kg)。肿瘤大小和存活每周监视两次。

在本文中图15中列出的存活数据显示68F2相对于对照有效地延迟小鼠的死亡。特别地，对于PBS组，观察到的中位存活时间为15.5日，对于1mg/kg，3mg/kg和30mg/kg 68F2组为21日，而对于10mg/kg 68F2组为27.5日。在本文中图18中列出的存活数据显示剂量为3mg/kg的129D3和111A7相对于对照有效地延迟小鼠的死亡。在本文中图16中列出的肿瘤生长速率数据显示克隆68F2有效地以剂量依存性方式抑制肿瘤的生长，其中在10mg/kg剂量作用饱和。在本文中图17中列出的肿瘤生长速率数据显示克隆129D3和111A7SDMA>A当剂量为3mg/kg时有效地抑制肿瘤生长。

其它表格：

表13。例示性抗IL-6中和Fab的VH和VL氨基酸序列。

表14。由VH或VL改组生成的例示性抗IL-6中和Fab的VH和VL氨基酸序列

表15。Fab克隆61H7的例示性种系化变体的VH和VL氨基酸序列。

表16。Fab克隆68F2的例示性种系化变体的VH和VL氨基酸序列

表17。Fab129D3 CDR氨基酸序列的序列变体及其CDR共同序列

表18。Fab 111A7 CDR氨基酸序列的序列变体及其CDR共同序列

表19。种系化68F2变体的产生水平和效力(pM)

表20。Fab 111A7的CMC优化序列变体

表21。Fab 111A7的CMC优化的序列变体的IL-6结合动力学

表22。在单一静脉内施用入食蟹猴之后抗IL-6mAb的无隔室PK分析

抗体	MRT[日]	Cl[ml/日]	k[日-1]	T1/2[日]
					129D3-WT	22.4	6.96	0.0468	15.6
129D3-YTE	34.6	4.54	0.0303	24.0
					129D3-HN	35.9	3.34	0.0281	24.9

MRT＝平均停留时间；k＝平均排除速率常数；t1/2＝排除半寿期；Cl＝排除清除

表23.使用B9细胞的体外IL-6中和测定

表24。使用7TD1细胞的体外IL-6中和测定

表25。在银屑病异种移植物模型中采用的组和处理方案

组	处理	组大小	给药途径	处理频率
					1	二丙酸倍他米松	3	表面	一日2次，三周
2	PBS	4	i.p.	200μl，一周2次，3周
					3	Remicade(10mg/kg)	7	i.p.	200μl，一周2次，3周
4	68F2(10mg/kg)	5	i.p.	200μl，一周2次，3周

表26。在SAA小鼠模型中的体内IL-6中和

Claims

1.一种抗体或其抗原结合片段，其特异性结合于IL-6，所述抗体或其抗原结合片段包含至少一种抗体CDR，其中所述CDR包含至少一个氨基酸残基，当所述抗体或其抗原结合片段结合于IL-6时，所述氨基酸残基埋于IL-6上的F229空穴或F279空穴中，且其中所述抗体或其抗原结合片段包含：

(a)包含由SEQ ID NO：497所示的HCDR3氨基酸序列、由SEQ ID NO：501所示的HCDR2氨基酸序列和由SEQ ID NO：508所示的HCDR1氨基酸序列的VH域和包含由SEQ ID NO：513所示的LCDR3氨基酸序列、由SEQ ID NO：525所示的LCDR2氨基酸序列和由SEQ ID NO：536所示的LCDR1氨基酸序列的VL域；

(b)包含由SEQ ID NO：497所示的HCDR3氨基酸序列、由SEQ ID NO：501所示的HCDR2氨基酸序列和由SEQ ID NO：509所示的HCDR1氨基酸序列的VH域和包含由SEQ ID NO：513所示的LCDR3氨基酸序列、由SEQ ID NO：525所示的LCDR2氨基酸序列和由SEQ ID NO：536所示的LCDR1氨基酸序列的VL域；

(c)包含由SEQ ID NO：497所示的HCDR3氨基酸序列、由SEQ ID NO：504所示的HCDR2氨基酸序列和由SEQ ID NO：509所示的HCDR1氨基酸序列的VH域和包含由SEQ ID NO：513所示的LCDR3氨基酸序列、由SEQ ID NO：525所示的LCDR2氨基酸序列和由SEQ ID NO：536所示的LCDR1氨基酸序列的VL域；

(d)包含由SEQ ID NO：543所示的HCDR3氨基酸序列、由SEQ ID NO：545所示的HCDR2氨基酸序列和由SEQ ID NO：555所示的HCDR1氨基酸序列的VH域和包含由SEQ ID NO：563所示的LCDR3氨基酸序列、由SEQ ID NO：564所示的LCDR2氨基酸序列和由SEQ ID NO：565所示的LCDR1氨基酸序列的VL域，其中SEQ ID NO：543中的甲硫氨酸用或不用任何其它氨基酸替换；

(e)包含由SEQ ID NO：543所示的HCDR3氨基酸序列、由SEQ ID NO：545所示的HCDR2氨基酸序列和由SEQ ID NO：559所示的HCDR1氨基酸序列的VH域和包含由SEQ ID NO：563所示的LCDR3氨基酸序列、由SEQ ID NO：564所示的LCDR2氨基酸序列和由SEQ ID NO：565所示的LCDR1氨基酸序列的VL域；或

(f)包含由SEQ ID NO：543所示的HCDR3氨基酸序列、由SEQ ID NO：546所示的HCDR2氨基酸序列和由SEQ ID NO：557所示的HCDR1氨基酸序列的VH域和包含由SEQ ID NO：563所示的LCDR3氨基酸序列、由SEQ ID NO：564所示的LCDR2氨基酸序列和由SEQ ID NO：565所示的LCDR1氨基酸序列的VL域。

2.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：

(a)包含由SEQ ID NO：566所示的HCDR3氨基酸序列、由SEQ ID NO：545所示的HCDR2氨基酸序列和由SEQ ID NO：555所示的HCDR1氨基酸序列的VH域和包含由SEQ ID NO：563所示的LCDR3氨基酸序列、由SEQ ID NO：564所示的LCDR2氨基酸序列和由SEQ ID NO：565所示的LCDR1氨基酸序列的VL域；

(b)包含由SEQ ID NO：567所示的HCDR3氨基酸序列、由SEQ ID NO：545所示的HCDR2氨基酸序列和由SEQ ID NO：555所示的HCDR1氨基酸序列的VH域和包含由SEQ ID NO：563所示的LCDR3氨基酸序列、由SEQ ID NO：564所示的LCDR2氨基酸序列和由SEQ ID NO：565所示的LCDR1氨基酸序列的VL域；或

(c)包含由SEQ ID NO：568所示的HCDR3氨基酸序列、由SEQ ID NO：545所示的HCDR2氨基酸序列和由SEQ ID NO：555所示的HCDR1氨基酸序列的VH域和包含由SEQ ID NO：563所示的LCDR3氨基酸序列、由SEQ ID NO：564所示的LCDR2氨基酸序列和由SEQ ID NO：565所示的LCDR1氨基酸序列的VL域。

3.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：

(1)由SEQ ID NO：8所示的VH域和由SEQ ID NO：273所示的VL域；

(2)由SEQ ID NO：139所示的VH域和由SEQ ID NO：403所示的VL域；

(3)由SEQ ID NO：152所示的VH域和由SEQ ID NO：416所示的VL域；

(4)由SEQ ID NO：155所示的VH域和由SEQ ID NO：419所示的VL域；

(5)由SEQ ID NO：159所示的VH域和由SEQ ID NO：423所示的VL域；

(6)由SEQ ID NO：176所示的VH域和由SEQ ID NO：440所示的VL域；

(7)由SEQ ID NO：203所示的VH域和由SEQ ID NO：467所示的VL域；

(8)由SEQ ID NO：214所示的VH域和由SEQ ID NO：478所示的VL域；

(9)由SEQ ID NO：223所示的VH域和由SEQ ID NO：487所示的VL域；

(10)由SEQ ID NO：227所示的VH域和由SEQ ID NO：491所示的VL域；

(11)由SEQ ID NO：230所示的VH域和由SEQ ID NO：494所示的VL域；

(12)由SEQ ID NO：232所示的VH域和由SEQ ID NO：496所示的VL域；

(13)由SEQ ID NO：37所示的VH域和由SEQ ID NO：244所示的VL域；

(14)由SEQ ID NO：48所示的VH域和由SEQ ID NO：312所示的VL域；

(15)由SEQ ID NO：86所示的VH域和由SEQ ID NO：350所示的VL域；

(16)由SEQ ID NO：87所示的VH域和由SEQ ID NO：351所示的VL域；

(17)由SEQ ID NO：569所示的VH域和由SEQ ID NO：350所示的VL域；

(18)由SEQ ID NO：570所示的VH域和由SEQ ID NO：350所示的VL域；或

(19)由SEQ ID NO：571所示的VH域和由SEQ ID NO：350所示的VL域。

4.前述任一项权利要求的抗体或其抗原结合片段，其包含VH域和VL域，所述VH域包含超变环H1，H2和H3，其中所述VH域多肽与VL域配对，所述VL域包含超变环L1，L2和L3，其中超变环H1-H3和L1-L3至少之一是从通过用IL-6抗原主动免疫接种羊驼属(Lama)物种得到的羊驼属物种常规抗体获得的。

5.权利要求4的抗体或其抗原结合片段，其中：

a)超变环H1，H2，L1，L2和L3至少之一呈现预测或实际的规范折叠结构，其与人抗体中出现的H1，H2，L1，L2或L3超变环的相应规范折叠结构相同；

b)超变环H1和H2各呈现预测的或实际的规范折叠结构，其与相应的人类规范折叠结构相同；

c)超变环L1，L2和L3各呈现预测的或实际的规范折叠结构，其与相应的人类规范折叠结构相同；

d)超变环H1和H2形成预测的或实际的规范折叠结构的组合，其与已知出现于人类种系VH域的规范折叠结构的相应的组合相同；

e)超变环H1和H2形成规范折叠结构的组合，其对应于选自下组的人类规范折叠结构的组合：1-1，1-2，1-3，1-4，1-6，2-1，3-1和3-5；

f)超变环L1和L2形成预测的或实际的规范折叠结构的组合，其与已知出现于人类种系VL域的规范折叠结构的相应的组合相同；

g)超变环L1和L2形成规范折叠结构的组合，其对应于选自下组的人类规范折叠结构的组合：11-7，13-7(A,B,C)，14-7(A,B)，12-11，14-11，12-12，2-1，3-1，4-1和6-1；

h)超变环H1和H2形成规范折叠结构的组合，其对应于如见于人类1ACY抗体结构中的人类规范折叠结构的3-1组合；

i)超变环L1和L2形成规范折叠结构的组合，其对应于如见于人类3MUG抗体结构中的人类规范折叠结构的6λ-1组合；和/或

j)超变环L1，L2和L3形成规范折叠结构的组合，其对应于如见于人类3MUG抗体结构中的人类规范折叠结构的6λ-1-5组合。

6.权利要求1-3任一项的抗体或其抗原结合片段，其

a)抑制IL-6对IL-6受体的结合；

b)抑制gp130对IL-6受体的结合；

c)特异性结合于人类和食蟹猴(cynomolgus monkey)IL-6；

d)包含至少一个来自特异性结合于IL-6的驼类(camelid)抗体的CDR；

e)特征为具有少于10.0的评分；

f)在HEK293细胞中通过瞬时表达以至少20mg/ml表达；

g)呈现大于65℃的熔解温度(melting temperature,Tm)；

h)以少于0.1pM的IC50抑制IL-6诱导的B9杂交瘤细胞的增殖；

i)以少于2x10^-5s^-1的通过表面等离子共振测得的解离速率(k_off)结合于人类IL-6；

j)是亲本驼类抗体的种系化变体，所述种系化变体与亲本驼类抗体相比具有更高的熔解温度；

k)包含至少一个来自羊驼属常规抗体而无后续亲和力成熟的CDR；

l)当以天然的IgG1Fc格式静脉内施用于食蟹猴时，具有至少9日的血清半衰期；或

m)是亲本抗体或其抗原结合片段的种系化变体，其中所述抗体或其抗原结合片段包含VH和VL域，且其中所述抗体或其抗原结合片段的VH和VL域之一或两者与亲本非人类抗体的相应VH和VL域相比，在框架区中包含总共1至10个氨基酸取代；和/或包含VH和VL域，其中所述抗体或其抗原结合片段的VH和VL域之一或两者在框架区FR1，FR2，FR3和FR4中与一个或多个相应的人类VH或VL域具有90％或更高的序列同一性。

7.权利要求6的抗体或其抗原结合片段，当以天然的IgG1Fc格式静脉内施用于食蟹猴时，具有至少15日的血清半衰期。

8.权利要求1-3任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含VH域，其中至少一个谷氨酰胺变成谷氨酸。

9.权利要求1-3任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含人Fc域，所述Fc域具有双重突变H433K/N434F。

10.一种药物组合物，其包含前述任一项权利要求的抗体或其抗原结合片段和一种或多种药学上可接受的载体。

11.权利要求1-9任一项的抗体或其抗原结合片段制造用于治疗IL-6相关的疾病或病症的药物的用途。

12.一种分离的核酸，其编码权利要求1-9任一项的抗体或其抗原结合片段。

13.一种重组表达载体，其包含权利要求12的核酸。

14.一种宿主细胞，其包含权利要求13的重组表达载体。