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CN102498391B - 传感器及浓度测定方法 - Google Patents

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CN102498391B
CN102498391B CN201080034694.0A CN201080034694A CN102498391B CN 102498391 B CN102498391 B CN 102498391B CN 201080034694 A CN201080034694 A CN 201080034694A CN 102498391 B CN102498391 B CN 102498391B
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enzyme
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liquid sample
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Matsushita Electric Industrial Co Ltd
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Abstract

传感器(1)的试剂层(4)含有具有亲水性官能团的醌类化合物、菲醌和/或菲醌的衍生物作为介体。由于醌类化合物的氧化还原电位比现有的介体低，因此根据该传感器(1)，可减小干扰物质对检测结果造成的影响。

Description

传感器及浓度测定方法
技术领域
本发明涉及检测或定量液体试样中的目标物质的传感器及目标物质的浓度测定方法。
背景技术
以往，提出了检测生物试样中的目标物质的传感器。在作为传感器的一例的血糖传感器中，生物试样为血液，目标物质为葡萄糖。
血糖传感器中，提案特别多的是电化学式血糖传感器。电化学式血糖传感器包含酶和介体。该酶通过与血液中的葡萄糖进行特异性反应而使葡萄糖氧化。介体接受由氧化而产生的电子。接受了电子的介体例如在电极上被电化学氧化。由该氧化所得到的电流的大小，可简便地检测血液中的葡萄糖浓度、即血糖值。
以往，作为如上所述的电化学式血糖传感器中的介体，多使用铁氰化钾(例如专利文献1)。铁氰化钾在室温下在干燥状态下具有化学稳定性，价格也便宜。并且，铁氰化钾在血液等以水为溶剂的试样中的溶解性高。因此，在特定的传感器(血糖检测时使酶及介体主动溶解于血液中的传感器)中，铁氰化钾是特别优选的。
铁氰化钾所含的铁氰化物离子迅速地溶解到血液中，从与葡萄糖反应后的酶接受电子，成为亚铁氰化物离子。该离子在电极上被电化学氧化，由此产生与血糖值相应的电流。
但是，在包含铁氰化钾作为介体的血糖传感器中，存在因血液中的共存物质而产生测定误差的问题。测定误差如下产生。血液中，除了葡萄糖以外还共存有抗坏血酸(维生素C)等物质。抗坏血酸与亚铁氰化物离子一起在血糖传感器内的电极上被氧化。结果，基于血糖值而产生的电流与基于抗坏血酸而产生的电流叠加得到的电流值作为表示血糖值的电流被检测到。由此产生测定误差。
这种测定误差，是由于用于使亚铁氰化物离子氧化所需的电极的电位显著高于用于使抗坏血酸氧化的电位(为正值)而产生的。即，亚铁氰化物离子本身的氧化电位(约160mV、对Ag|AgCl)与抗坏血酸的氧化电位(约-140mV、对Ag|AgCl)相比非常高，因此产生较大的测定误差。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2001-305095号公报
专利文献2：日本特表2001-520367号公报
发明内容
鉴于上述背景技术中所述的测定误差的问题，本发明的目的在于，提供更不易受到干扰物质影响的传感器及浓度测定方法。
第一发明的传感器为一种检测或定量液体试样中所含的目标物质的传感器，其中，包含：PQQ依赖性或FAD依赖性酶、具有亲水性官能团的醌类化合物和至少一对电极。上述PQQ依赖性或FAD依赖性酶通过与上述液体试样接触而使上述目标物质脱氢或氧化。上述醌类化合物从酶接受电子。当上述一对电极间施加有电压时，上述一对电极中的一个从上述醌类化合物接受电子。
第二发明的传感器为一种检测或定量液体试样中所含的目标物质的传感器，其中，包含：具有亲水性官能团的醌类化合物、氧化酶和至少一对电极。上述氧化酶通过与上述液体试样接触而使上述目标物质氧化。上述醌类化合物从上述氧化酶接受电子。当上述一对电极间施加有电压时，上述一对电极中的一个从上述醌类化合物接受电子。
第三发明的传感器为一种检测或定量液体试样中所含的目标物质的传感器，其中，包含：具有亲水性官能团的醌类化合物、脱氢酶和至少一对电极。上述脱氢酶通过与上述液体试样接触而使上述目标物质脱氢。上述醌类化合物从上述脱氢酶接受电子。当上述一对电极间施加有电压时，上述一对电极中的一个从上述醌类化合物接受电子。
根据第一发明、第二发明及第三发明，传感器包含具有亲水性官能团的醌类化合物。与不具有亲水性官能团的醌类化合物相比，具有亲水性官能团的醌类化合物可以期待在水中具有优良的溶解性。由于醌类化合物在水中的溶解性优良，因此醌类化合物与液体试样中溶解的目标物质及酶分子碰撞的机会增加。其结果是，可以期待增大应答电流及缩短测定所需的时间。
并且，与不具有亲水性官能团的醌类化合物相比，具有亲水性官能团的醌类化合物可以期待具有较小的挥发性。
并且，由于传感器包含具有亲水性官能团的醌类化合物，因此与传感器包含不具有亲水性官能团的醌类化合物的情况相比，可以期待能够增加传感器所包含的醌类化合物的量。
第四发明的传感器为一种检测或定量液体试样中所含的目标物质的传感器，其中，包含：作为介体的菲醌和/或其衍生物、酶和至少一对电极。上述酶通过与液体试样接触而使上述目标物质脱氢或氧化。上述菲醌和/或其衍生物从上述酶接受电子。当上述一对电极间施加有电压时，上述一对电极中的一个从上述菲醌和/或其衍生物接受电子。
由于传感器包含菲醌或其衍生物作为介体，因此具有测定结果不易受到液体试样中的易氧化性的测定干扰物质的影响的倾向。因此，根据上述第四发明，可以期待实现可靠性更高的目标物质的检测。
第五发明的方法为一种测定液体试样中所含的目标物质的浓度的方法，其中，包括：
(a)使上述液体试样、PQQ依赖性或FAD依赖性酶以及具有亲水性官能团的醌类化合物接触；
(b)利用上述PQQ依赖性或FAD依赖性酶，使上述液体试样中所含的上述目标物质脱氢或氧化；
(c)利用上述醌类化合物，从上述PQQ依赖性或FAD依赖性酶接受电子；
(d)向与上述液体试样接触的一对电极施加电压；
(e)利用上述一对电极中的一个，使通过上述(c)步骤接受了电子的上述醌类化合物氧化；
(f)测定上述一对电极间流过的电流；及
(g)基于上述电流，计算上述目标物质的浓度。
第六发明的方法为一种测定液体试样中所含的目标物质的浓度的方法，其中，包括：
(a)使上述液体试样、具有亲水性官能团的醌类化合物以及以上述目标物质为底物向上述醌类化合物供给电子的氧化酶接触；
(b)检测通过上述(a)步骤而产生的电流；及
(c)基于上述(b)步骤的检测结果，计算上述目标物质的浓度。
第七发明的方法为一种测定液体试样中所含的目标物质的浓度的方法，其中，包括：
(a)使上述液体试样、具有亲水性官能团的醌类化合物以及以上述目标物质为底物向上述醌类化合物供给电子的脱氢酶接触；
(b)检测通过上述(a)步骤而产生的电流；及
(c)基于上述(b)步骤的检测结果，计算上述目标物质的浓度。
与不具有亲水性官能团的醌类化合物相比，具有亲水性官能团的醌类化合物可以期待在水中具有优良的溶解性。因此，具有亲水性官能团的醌类化合物与液体试样中溶解的目标物质及酶分子碰撞的机会增加。其结果是，根据第五～第七发明，可以期待增大电流及缩短测定所需的时间。
第八发明的方法为一种测定液体试样中所含的目标物质的浓度的方法，其中，包括：
(a)使上述液体试样、菲醌和/或其衍生物以及以上述目标物质为底物向上述菲醌和/或其衍生物供给电子的酶接触；
(b)检测通过上述(a)步骤而产生的电流；及
(c)基于通过上述(b)步骤而检测到的电流，计算上述目标物质的浓度。
由于使用菲醌和/或其衍生物，因此可以期待测定结果不易受到液体试样中的易氧化性的测定干扰物质的影响。
并且，提供以下的浓度测定方法。
第九发明的浓度测定方法为一种测定液体试样中所含的目标物质的浓度的方法，其中，包括：
(a)使上述液体试样、脱氢或氧化酶、以及菲醌和/或其衍生物接触；
(b)利用上述脱氢或氧化酶，使上述液体试样中所含的上述目标物质脱氢或氧化；
(c)利用上述菲醌和/或其衍生物，从上述脱氢或氧化酶接受电子；
(d)向通过上述(c)步骤接受了电子的上述菲醌和/或其衍生物照射光；
(e)测定从上述接受了电子的上述菲醌和/或其衍生物射出的光量；及
(f)基于上述光量，计算上述目标物质的浓度。
第十发明的浓度测定方法为一种测定液体试样中所含的目标物质的浓度的方法，其中，包括：
(a)使上述液体试样、脱氢或氧化酶以及作为第一介体的菲醌和/或其衍生物接触；
(b)利用上述脱氢或氧化酶，使上述液体试样中所含的上述目标物质脱氢或氧化；
(c)利用上述菲醌和/或其衍生物，从上述脱氢或氧化酶接受电子；
(d)利用第二介体，从通过上述(c)步骤接受了电子的上述菲醌和/或其衍生物接受电子；
(e)向通过上述(d)步骤接受了电子的上述第二介体照射光；
(f)测定从上述接受了电子的上述第二介体射出的光量；及
(g)基于上述射出的光量，计算上述目标物质的浓度。
第十一发明的浓度测定方法为一种测定以水为介质的液体试样中所含的目标物质的浓度的方法，其中，包括：
(a)在上述液体试样中溶解醌类化合物以及以上述目标物质为底物向上述醌类化合物供给电子的氧化酶；
(b)检测通过上述(a)步骤而得到的溶液中产生的电流；及
(c)基于上述(b)的检测结果，计算上述目标物质的浓度。
并且，提供以下的传感器。
第十二发明的传感器为一种检测或定量试样中所含的目标物质的传感器，其中，包含：PQQ依赖性或FAD依赖性脱氢酶、具有亲水性官能团的醌类化合物和至少第一及第二电极。上述醌类化合物与上述第一电极的至少一部分及第二电极的至少一部分的双方接触。上述PQQ依赖性或FAD依赖性脱氢酶通过与上述液体试样接触而使上述目标物质脱氢(氧化)。上述醌类化合物从上述酶接受电子。当上述第一及第二电极间施加有电压时，上述一对电极中的一个从上述醌类化合物接受电子。
根据上述第十二发明，由于试样、酶、醌类化合物以及第一及第二电极相接触，因此当第一及第二电极间施加有电压时，可以期待第一或第二电极中的一个成为作用电极、另一个成为对电极。
第十三发明的传感器为一种检测或定量试样中所含的目标物质的传感器，特别地包含酶、醌类化合物和至少一对电极。另外，以银/氯化银(饱和氯化钾)电极为基准电极而测定的上述醌类化合物的氧化还原电位，与0V相比为负值。
第十四发明的传感器为一种检测或定量试样中所含的目标物质的传感器，特别地包含酶、具有亲水性官能团的醌类化合物和至少一对电极。另外，以银/氯化银(饱和氯化钾)电极为基准电极而测定的上述醌类化合物的氧化还原电位，与0V相比为负值。
根据上述第十三及十四发明，由于以银/氯化银(饱和氯化钾)电极为基准电极而测定的上述醌类化合物的氧化还原电位与0V相比为负值，因此具有检测结果不易受到液体试样中的易氧化性的干扰物质的影响的倾向。因此，可以期待实现可靠性更高的目标物质的检测。
第十五发明的传感器为一种用于检测或定量液体试样中所含的目标物质的传感器，其中，包含：具有亲水性官能团的醌类化合物、酶分子内含有辅酶的酶或与辅酶结合的酶、和至少一对电极。上述酶通过与上述液体试样接触而使上述试样中所含的上述目标物质脱氢或氧化。上述醌类化合物从上述酶接受电子。当上述一对电极间施加有电压时，上述至少一对电极中的一个从上述醌类化合物接受电子。
发明效果
根据本发明，提供测定误差少的传感器及浓度测定方法，能够实现高精度的目标物质测定。
附图说明
图1是表示传感器的概略构成的分解立体图。
图2是表示测定系统的概略构成的立体图。
图3是表示测定系统的概略构成的框图。
图4是9，10-菲醌-2-磺酸钠盐的循环伏安图(实线)及铁氰化钾(虚线)的循环伏安图。
图5是表示葡萄糖浓度与使用9，10-菲醌-2-磺酸钠盐的传感器(实线)及使用铁氰化钾的传感器(虚线)的应答电流的关系的图表。
图6是表示葡萄糖浓度与使用9，10-菲醌-2-磺酸钠盐的传感器(实线)及使用铁氰化钾的传感器(虚线)的葡萄糖浓度测定的同时重现性的关系的图表。
图7是表示抗坏血酸浓度与使用9，10-菲醌-2-磺酸钠盐的传感器(实线)及使用铁氰化钾的传感器(虚线)的葡萄糖浓度测定结果自真值的背离度的关系的图表。
图8是表示对乙酰氨基酚浓度与使用9，10-菲醌-2-磺酸钠盐的传感器(实线)及使用铁氰化钾的传感器(虚线)的葡萄糖浓度测定结果自真值的背离度的关系的图表。
图9是表示葡萄糖浓度为80mg/dL时，血细胞比容水平与使用9，10-菲醌-2-磺酸钠盐的传感器(实线)及使用铁氰化钾的传感器(虚线)的葡萄糖浓度测定结果自真值的背离度的关系的图表。
图10是表示葡萄糖浓度为336mg/dL时，血细胞比容水平与使用9，10-菲醌-2-磺酸钠盐的传感器(实线)及使用铁氰化钾的传感器(虚线)的葡萄糖浓度测定结果自真值的背离度的关系的图表。
图11是菲醌衍生物的合成途径。
图12是9，10-菲醌-2-磺酸钠盐的循环伏安图。
图13是9，10-菲醌-2，7-二磺酸二钠盐的循环伏安图。
图14是化合物A的循环伏安图。
图15是化合物B的循环伏安图。
图16是化合物H’的循环伏安图。
图17是化合物I的循环伏安图。
图18是化合物I’的循环伏安图。
图19是化合物J的循环伏安图。
图20是表示形成试剂层的试剂液中的缓冲成分对传感器的应答性的改善的图表。
图21是表示试剂液的pH对减小溶解氧的影响的效果的图表。
图22是表示试剂液中的柠檬酸-3Na对传感器的应答性的改善的图表。
具体实施方式
[1]第一实施方式
<1-1.传感器>
《1-1-a.传感器的概略构成》
传感器1是包含醌类化合物、酶和电极的传感器的一例。传感器1能够检测和/或定量液体试样中的目标物质。
具体而言，传感器1包括：基板2、导电层3、试剂层4、隔片5、盖6。
《1-1-b.基板》
如图1所示，基板2为板状的构件。基板2具有绝缘性。作为构成基板2的材料，例如，可列举如下：
-聚对苯二甲酸乙二醇酯、乙烯基聚合物、聚酰亚胺、聚酯及聚苯乙烯类塑料(スチレニクス)等树脂；
-玻璃；以及
-陶瓷；等。
基板2的尺寸不限于具体数值。例如，基板2的宽度优选为4～20mm、更优选为5～10mm。另外，基板2的长度优选为20～40mm。另外，基板2的厚度优选为0.1～1mm。优选基板2的宽度、长度及厚度均在上述范围内。
《1-1-c.导电层》
如图1所示，导电层3以大致均匀的厚度形成在基板2上。导电层3包含3个电极31～33。有时将电极31称为作用电极、将电极32称为对电极、将电极33称为探测电极。需要说明的是，探测电极33可以省略。
电极31～33各自的一部分以面向毛细管51的方式配置。
电极31～33的另外一部分在传感器1的与导入口52相反的端部露出而未被隔片5及盖6覆盖。这些露出部分起到作为引线的作用。即，这些露出部分从测定器101接受电压的施加，或者将电流传到测定器101。
各电极可以通过如下方法形成：
-使用导电性材料的印刷等；或者
-将基板2用导电性材料覆盖后，利用激光烧蚀等形成非导电轨。
例如，可以在基板2上通过钯溅射形成导电层3，再通过激光烧蚀形成非导电轨。非导电轨具有优选0.01～0.5mm、更优选0.05mm～0.3mm的宽度。
需要说明的是，导电层3的构成材料只要是导电性材料(导电性物质)即可，没有特别限定。作为导电性材料的例子，可列举如下：
-以金属、金属混合物、合金、金属氧化物及金属化合物为代表的无机导电性物质等；
-烃类导电性聚合物及含有杂原子类的导电性聚合物等有机导电性物质；或
-这些物质的组合。
作为导电层3的构成材料，优选钯、金、铂、碳等，特别优选钯。
导电层3的厚度可根据其形成方法及构成材料而变更。例如，通过溅射形成导电层3时，导电层3的厚度优选为0.1～20nm、更优选为1～10nm。通过印刷形成导电层3时，导电层3的厚度优选为0.1～50μm、更优选为1～30μm。
《1-1-d.试剂层》
如图1所示，试剂层4以与电极31～33相接的方式配置。试剂层4与电极31及32一起作为传感器1的活性部发挥作用。活性部是指电化学的活性区域，是与液体试样中的特定物质反应而产生电信号的部分。具体而言，试剂层4包含酶和介体。
试剂层4只要以至少与电极31和32(第一电极和第二电极)的一部分接触的方式配置即可。另外，试剂层4也可以配置还与电极33接触。
[酶]
试剂层4包含一种或多种酶。试剂层4中所含的酶优选为以目标物质为底物的酶，特别优选为与目标物质特异性反应的酶。酶根据目标物质的浓度、即与目标物质的反应量，向醌类化合物供给电子。
作为试剂层4中所含的酶，特别优选氧化还原酶。作为氧化还原酶，具体可列举以目标物质为底物的氧化酶及脱氢酶。作为这些氧化还原酶的例子，
-在目标物质为葡萄糖时，可列举优选葡萄糖氧化酶、葡萄糖脱氢酶；
-在目标物质为乳酸时，可优选列举乳酸氧化酶或乳酸脱氢酶；
-在目标物质为胆固醇时，可列举优选胆固醇酯酶或胆固醇氧化酶；
-在目标物质为醇时，可列举优选醇氧化酶；
-在目标物质为胆红素时，可列举优选胆红素氧化酶。
试剂层4可以含有与酶相符的辅酶。
关于酶的辅酶依赖性，没有特别限定。例如，试剂层4中所含的酶可以是对NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，nicotinamide adenine dinucleotide)、NADP(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，nicotinamide adenine dinucleotidephosphate)、PQQ(吡咯喹啉醌，Pyrroloquinoline quinone)或FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸，flavin adenine dinucleotide)等辅酶具有依赖性的酶。
酶的辅酶优选为FAD或PQQ。在这些辅酶所对应的酶中，辅酶与其酶蛋白结合、或者含有于酶中。因此，执行传感器的制作及测定时，无需在酶之外另外添加辅酶。结果，可简化传感器的构成、制造步骤及测定步骤。
在NAD和NADP依赖性酶的情况下，例如如专利文献2中所公开的那样，可以另外添加在不与酶蛋白结合的状态下发挥功能的辅酶NAD和NADP。在另外添加辅酶时，传感器的构成及制造或测定步骤比使用以FAD和PQQ为辅酶的酶时复杂。但是，本申请发明中也可以使用NAD和NADP依赖性酶。
例如，酶可以是FAD依赖性氧化酶、NAD依赖性、PQQ依赖性或FAD依赖性脱氢酶等。氧化酶及脱氢酶的具体例如上所述。
试剂层4中的酶不限于这些酶，可以根据目标物质适当选择。
试剂层4中的酶含量设定为能够进行目标物质的检测的程度，每1次测定或每1个传感器优选设定为0.2～20U(单位)，更优选设定为0.5～10U左右。
[介体]
试剂层4含有一种以上的介体。介体也可换称为电子受体或电子传递物质。介体能够可逆地变为氧化体和还原体。是直接或与其他介体协作而介导物质间的电子移动的物质。
对试剂层4含有使底物氧化的酶时介体的作用进行说明。酶通过使底物氧化，接受来自底物的电子并将电子提供给辅酶。其结果是，辅酶由氧化体变为还原体。作为氧化体的介体从变为还原体的辅酶接受电子，使辅酶恢复为氧化体。结果，介体自身变为还原体。变为还原体的介体将电子提供给电极31或32，其自身变为氧化体。这样，介体介导了酶与电极间的电子移动。
上述辅酶可通过与酶蛋白(酶分子)结合而保持于酶蛋白上。另外，辅酶可以以与酶蛋白分离的状态存在。
作为介体，优选醌类化合物。醌类化合物是指含有醌的化合物。醌类化合物中包括醌及醌衍生物。作为醌衍生物，可列举在醌上附加有各种官能团(可换称为取代基)的化合物。
作为醌类化合物中的醌，可列举(a)苯醌、(b)萘醌、(c)蒽醌、(d)菲醌及(e)菲绕啉醌等。作为菲醌，特别是可具体列举9，10-菲醌。各醌的结构式的具体例，如下所示。
[化1]
Figure BDA0000134085870000121
另外，作为醌衍生物上的附加官能团(取代基)的一例，可列举亲水性官能团。作为亲水性官能团，可列举磺酸基(磺基、-SO3H)、羧酸基(羧基、-COOH)、磷酸基(-PO4H2)等。需要说明的是，磺酸基、羧酸基及磷酸基中也包括它们的盐(钠盐、钾盐、钙盐等)。
一种醌衍生物可具有两个以上的亲水性官能团。另外，一种醌衍生物可具有两种以上的官能团。
醌衍生物可具有含有苯环的取代基。上述亲水性官能团(包括盐)可附加在取代基中的苯环上。换言之，亲水性官能团可通过苯环与醌结合。
例如，上述醌(a)～(e)上可附加有下述取代基中的至少1个。
[化2]
取代基中，可在一个苯环上附加有两个以上的官能团，也可在一个苯环上附加有两种以上的官能团。
此外，在上述亲水性官能团与苯环之间，可有其他原子介于其间。例如，图11所示的化合物I’通过化合物I与氨基乙磺酸的缩合反应而得到。化合物I’中的取代基具有：磺酸基、苯环以及磺酸基与苯环之间的氨基羧基(-CONH-)。
无论是具有苯环的取代基还是不具有苯环的取代基，其在醌上的附加位置均没有特别限定。例如，就9，10-菲醌而言，优选选择1、2、3、4及7位中的至少一个位置。
具体而言，传感器1可具有选自由9，10-菲醌-2-磺酸、9，10-菲醌-1-磺酸、9，10-菲醌-3-磺酸、9，10-菲醌-4-磺酸、9，10-菲醌-2，7-二磺酸、9，10-菲醌-2-羧酸和9，10-菲醌-2-磷酸组成的组中的至少一种化合物作为醌衍生物。
试剂层4中的醌类化合物的含量，可设定为能够发挥作为介体的功能的程度的量，每1次测定或每1个传感器优选设定为1～500nmol、更优选设定为10～200nmol左右。
每1次测定或每1个传感器的酶量如上所述。因此，每1U酶的介体的量优选为0.05～2500nmol、更优选为1～400nmol。特别是醌类化合物(更具体而言为菲醌)的量优选为该范围。
需要说明的是，作为醌类化合物的制造方法，可适当使用现有的方法。
以往，醌在医药、农药、工业的领域中使用。醌例如可由芳香烃制造。具体而言，蒽醌可通过蒽的氧化容易地制造。
另外，具有亲水性官能团的醌类化合物的制造方法，可以包括在醌中引入亲水性官能团的步骤。例如，作为在醌中附加磺酸基作为亲水性官能团的方法，有使醌与发烟硫酸反应的方法等。
传感器1可具有两种以上的醌类化合物，也可具有醌类化合物以外的电子传递物质。
需要说明的是，在本实施方式中醌类化合物包含于试剂层4中，但醌类化合物也可包含于电极中。具有亲水性官能团的醌类化合物与作为该醌类化合物的主要素的醌相比有更高的水溶性。
另外，具有亲水性官能团的醌类化合物的挥发性，与作为该醌类化合物的主要素的醌相比有更低的倾向。因此，在醌类化合物附加有亲水性官能团的情况下，醌类化合物通过包含于试剂层4中，可作为介体发挥作用。
[具有亲水性官能团的醌类化合物的优点]
具有亲水性官能团的醌类化合物，适合以水为介质的试样(例如血液)中的目标物质的测定。
介体为具有亲水性官能团的醌类化合物时，介体分子与酶分子在试样中碰撞的机会增加。其结果是，反应速度增大，来自于目标物质的电流量增大，同时测定所需的时间也可缩短。
另外，介体为具有亲水性官能团的醌类化合物时，不需要配合用于将介体固定在作用电极中或作用电极上的填充剂成分或粘结剂成分。即，在介体溶解于试样中而发挥作用的情况下，如前所述，通过在电极上滴加介体溶液并使其干燥，可简单地在电极上配置介体。
介体优选以与构成传感器的电极当中第一电极的至少一部分和第二电极的至少一部分一起相接的方式配置。第一电极和第二电极相当于作用电极和对电极。通过如此配置介体，各电极的电位稳定，因此测定的精度提高。由于通过在第一和第二电极间施加电压来进行电化学反应从而实施测定，因此介体与两电极的一部分相接时，在作为对电极起作用的一侧的电极上通过介体的还原反应对电极提供稳定的介体的还原电位。另一方面，作为作用电极起作用的一侧的电极的电位，是在上述介体的还原电位上施加上述施加电压，因而电位稳定。
考虑传感器的长期稳定性等时，优选在电极中包含未附加有亲水性官能团的醌。即，优选利用醌与导电性材料的混合物形成电极。已知有：通过配合填充剂成分、粘结剂成分将介体分子固定在作用电极中或作用电极上的方法。
[介体的氧化还原电位的优选范围及其优点]
干扰物质是指妨碍传感器1对目标物质的准确检测的物质，有时也称为干涉物质。作为干扰物质，可列举抗坏血酸、尿酸及对乙酰氨基酚等。测定的对象为非生物试样(血液及尿等生物试样以外的试样)时，干扰物质是指该非生物试样中所含的易氧化性物质。
如前面在背景技术中所述，干扰物质的氧化所需的电位比介体的氧化所需的电位低时，干扰物质会对传感器的测定结果造成影响。其结果是，测定结果产生误差。例如，试样为血液时，使介体氧化所需的电极的电位显著高于使血液中所含的抗坏血酸等氧化所需的电极的电位(为正值)，由此带来误差。
使介体氧化所需的电极的电位，依赖于介体自身的氧化还原电位。因此，从减轻干扰物质的影响的观点考虑，优选介体的氧化还原电位为更负的值。即使与干扰物质的氧化电位向比为正值，通过使用氧化还原电位尽可能接近该氧化电位的介体，也可减轻干扰物质的影响。为了进一步减小影响，优选使用具有比干扰物质的氧化电位更负的氧化还原电位的介体。
另外，在酶使目标物质氧化的情况下，优选介体的氧化还原电位与辅酶的氧化还原电位相比为正值。由此，介体可容易地从辅酶接受电子。
另外，在酶使目标物质还原的情况下，优选介体的氧化还原电位与辅酶的氧化还原电位相比为负值。由此，介体可容易地向辅酶供给电子。由此可见，通过还原反应来检测目标物质时，辅酶、介体、干扰物质(易还原性物质)的电位的关系，成为与通过氧化来检测目标物质时相反的关系。以下，对通过氧化来检测目标物质的情况进行说明。
辅酶的具体的氧化还原电位如下所示。作为辅酶的FAD和PQQ在与酶蛋白结合的状态下与酶蛋白协作而典型地发挥作用。这些辅酶的氧化还原电位分别为约-300mV和约-200mV。另外，NAD不与酶蛋白结合而发挥作用。NAD的氧化还原电位为约-520mV。
此外，一般而言，介体的氧化还原电位相对于辅酶的氧化还原电位越是正值，则介体的电子接受能力有越大的倾向。即，介体的氧化还原电位与辅酶的氧化还原电位之差越大，则能级的差越大。由此，介体的电子接受速度越大。因此，从传感器的测定高灵敏化及快速化的观点考虑，优选介体的氧化还原电位在正侧为高值。
如上所述，为了实现误差小且灵敏度好的传感器及测定方法，通过干扰物质的氧化还原电位限制介体的氧化还原电位的正侧，通过与电子接受能力相关的辅酶的氧化还原电位限制介体的氧化还原电位的负侧。该范围有时被限制得非常窄。
例如，在专利文献2中，公开了包含NAD依赖性酶、并且包含含有氮原子的杂环化合物菲绕啉醌作为介体的传感器。菲绕啉醌的氧化还原电位为约0mV，NAD的氧化还原电位为约-520mV，即，该文献的传感器中，在介体与辅酶之间存在约520mV的电位差。需要说明的是，抗坏血酸的氧化电位为约-140mV，因此介体为菲绕啉醌时，由于上述理由，无法完全避免干扰物质的影响。
如上所述，包含PQQ依赖性或FAD依赖性酶的传感器，具有可以以较低的制造成本进行制造的优点。但是，由于PQQ和FAD的氧化还原电位比NAD高，因此开发可应用于PQQ依赖性和FAD依赖性酶的电位低的介体并不容易。目前，为了减小干扰物质的影响且为了抑制制造成本，期待也可应用于PQQ依赖性和FAD依赖性酶的氧化还原电位低的介体。
但是，在辅酶为FAD或PQQ时，由于它们的电位更靠近正侧，因此上述范围特别狭窄。
作为本发明的介体的例子的9，10-菲醌、9，10-菲醌-2-磺酸、1，2-萘醌-4-磺酸、2，5-二甲基-1，4-苯醌的氧化还原电位，依次为-180mV、-140mV、-16mV、-5mV。这些氧化还原电位与0mV相比为负值，与NAD的电位相比为正值，并且与FAD及PQQ的电位相比为正值。特别是9，10-菲醌、9，10-菲醌-2-磺酸的氧化还原电位，与抗坏血酸的氧化电位(约-140mV)相比为负值。即，这些介体可应用于包含PQQ依赖性或FAD依赖性酶的传感器。另外，这些介体也可减小干扰物质对检测结果造成的影响。
但是，从辅酶接受电子的能力并不仅仅取决于电位的关系。醌类化合物的电子接受能力例如还受到醌类化合物的电荷与酶的活性部位附近的电荷的关系及醌类化合物的分子大小与酶的活性部位空间的大小的关系等的影响。
酶为FAD依赖性酶或PQQ依赖性酶时，介体优选为9，10-菲醌(包括其衍生物)。9，10-菲醌不像蒽醌那样芳香环横向连接成一列，而是具有紧密的分子大小。因此，推测9，10-菲醌容易侵入酶的活性部位空间。另外，9，10-菲醌还不具有电荷，因此预测其也不易受到酶的活性部位的电荷的影响。
[其他组成]
试剂层4可含有酶和介体以外的其他成分。作为这样的成分，可以使用可提高酶或介体的保存性、或者可提高酶与目标物质的反应性的各种物质。作为这样的成分，例如可列举缓冲剂。
[试剂层的形成方法]
试剂层4可通过各种方法形成可能。作为形成方法，可列举例如印刷法、涂布法等。
以下说明形成方法的一例。将包含酶、介体及根据需要使用的其他成分的水溶液，用微量注射器等以一定量滴加到电极31及32上后，在适当的环境中静置使其干燥，由此可以形成试剂层4。需要说明的是，根据需要可以在电极33上也滴加水溶液。
水溶液的滴加量不限于特定的数值，优选为0.5～5μL、更优选为1～2μL。
试剂层4的形状不限于具体的形状。该形状可为矩形或圆形等。试剂层4的面积(在基板2的平面方向上的面积)根据器件的特性及尺寸来决定。该面积可优选为1～25mm2、更优选为2～10mm2。
要涂布的水溶液所含的酶和介体以及其他成分的含量，根据所需的器件的特性、尺寸进行选择。
《1-1-e.隔片》
如图1所示，隔片5是用于在盖6与导电层3之间设置空隙的构件。
具体而言，隔片5为板状的构件，除了电极31～33的引线部分及后述的毛细管51部分以外，覆盖导电层3的整体。隔片5具备使电极31～33的与引线部分相反的端部露出的矩形的切槽。通过隔片5具备该切槽而形成由隔片5、导电层3及盖6围成的毛细管51。这样，隔片5提供毛细管51的侧壁，并且可规定毛细管51的长度、宽度、高度等。
毛细管51的容量优选设定为0.1～1.0μL(微升)左右。隔片5的厚度优选为0.1～0.2mm，隔片所具备的切槽的长度优选为1～5mm，隔片所具备的宽度优选为0.5～2mm。需要说明的是，它们的尺寸可适当选择以使毛细管51达到所期望的容量。例如，使用具备长度为3.4mm、宽度为1.2mm的切槽的厚度0.145mm的隔片5时，可提供长度为3.4mm、宽度为1.2mm、高度为0.145mm、容量为0.6μL的毛细管51。
毛细管51通过毛细管现象从作为其开口部的导入口52抽吸液体试样并保持于电极31～33上。
《1-1-f.盖》
如图1所示，盖6为覆盖整个隔片5的板状的构件。盖6具备从表面贯通至背面的孔。该孔作为从毛细管51通向外部的通气口61起作用。通气口61是用于在液体试样被抽吸到毛细管51中时、将毛细管51内的空气排出到毛细管外的排气孔。通过这样排出空气，可容易地将液体试样抽吸到毛细管51内。通气口61优选设置在远离导入口52的位置，即，从导入口52观察时设置于毛细管51的深处。通过这样配置导入口52，可使液体试样快速地从导入口52移动至毛细管51的深处。
<1-2.测定系统>
上述的传感器1在图2所示的测定系统100中使用。测定系统100具备传感器1及测定器101。
如图2及图3所示，测定器101包括：显示部102、安装部103、切换电路107、基准电压源108、电流/电压转换电路109、A/D转换电路110、运算部111。测定器101还包括传感器1的各电极所对应的连接器。图3中绘出了连接器104～106。
显示部102显示测定器101的状态、测定结果、操作内容等。显示部102具体通过液晶显示面板来实现。
如图2所示，传感器1以可装卸的方式插入安装部103中。
如图3所示，通过将传感器1安装到安装部103中，使连接器104～106分别与传感器1的电极31～33连接。
切换电路107将连接器104～106与基准电压源108连接，或者连接到电流/电压转换电路109。
基准电压源108经由连接器104～106向电极31～33施加电压。
电流/电压转换电路109经由连接器104～106接收来自传感器1的电流，转换为电压并输出到A/D转换电路110中。
A/D转换电路110将来自电流/电压转换电路109的输出值(模拟值)转换为脉冲(数字值)。
运算部111包括：CPU(中央处理器，Central Processing Unit)以及ROM(只读存储器，Read Only Memory)、RAM(随机存取存储器，RandomAccess Memory)等记录介质。运算部111进行目标物质的浓度计算，或者控制测定器101内的各部的操作。
对运算部111的浓度计算功能进行说明。运算部111的存储介质中，存储有用于确定试样中的目标物质的浓度的换算表、用于确定该浓度的修正量的修正量表等。运算部111基于来自A/D转换电路110的脉冲，参照换算表而计算目标物质的临时浓度。运算部111进而使用修正量表中的修正量确定目标物质的最终浓度。这样计算出的浓度显示于显示部102。
另外，运算部111除了浓度计算功能以外，还具有切换电路107的切换控制、基准电压源108的电压控制、浓度测定或修正量选择时的时间的测定(计时功能)、向显示部102的显示数据输出及与外部设备的通信功能等。
运算部111的各种功能通过CPU读取并执行收纳于未图示的ROM等中的程序来实现。
<1-3.测定系统的使用>
以下，对利用测定系统100进行的浓度测定进行说明。
当传感器1插入安装部103中时，连接器104～106分别与电极31～33连接。并且，安装部103内的开关(未图示)被传感器1按下。通过开关的按下，运算部111判断安装了传感器1，将测定器101设定为试样待机状态。试样待机状态是指在运算部111的控制下，基准电压源108经由连接器104和106开始向作用电极31和探测电极33之间施加电压，且电流/电压转换电路109开始了电流测定后，而液体试样尚未供于测定的状态。
当使用者将液体试样附着到传感器1的导入口52时，液体试样通过毛细管现象从导入口52被吸入毛细管51中。
作为液体试样，例如可使用血液、汗液、尿液等生物体来源的液体试样或环境来源的液体试样、食品来源的液体试样等。例如，将传感器1作为血糖值传感器使用时，使用者刺破自身的手指、手掌或手腕等，挤出少量的血液，将该血液作为液体试样，供于传感器1的测定。
当液体试样到达作用电极31和探测电极33时，运算部111经由电流/电压转换电路109而接收的电流值会发生变化。根据该变化，运算部111判断液体试样被抽吸到传感器1中。这样探测到液体试样的抽吸时，开始进行测定。
在传感器1内，试剂层4中的酶和介体等成分溶解于液体试样中。这样，在传感器1的电极31和32上，液体试样、酶及介体相互接触。
通过运算部111的控制，切换电路107将连接器104和连接器105连接到基准电压源108及电流/电压转换电路109。这样，在作用电极31与对电极32之间施加有电压，作用电极31与对电极32之间产生的电流被传输到电流/电压转换电路109。
流入电流/电压转换电路109的电流被转换为电压。然后，该电压被A/D转换电路110进一步转换为脉冲。运算部111从该脉冲计算特定成分的浓度。由运算部111计算出的值显示于显示部202。此时，有时也一起显示提供给使用者的其他信息。
测定结束后，使用者可以将传感器1从安装部103取下。
需要说明的是，基准电压源108要向两个电极31和32之间提供足以引起目标电化学反应的电压。该电压主要根据所利用的化学反应及电极进行设定。
由以上的说明可知，通过使用测定系统100，执行下述浓度测定方法，其中，所述浓度测定方法包括：
(a)使液体试样、介体以及酶相接触；
(b)检测通过上述(a)步骤产生的电流；和
(c)基于上述(b)步骤的检测结果，测定目标物质的浓度。
另外，在将以水为介质的液体试样作为对象时，在测定系统100中，执行下述浓度测定方法，其中，所述浓度测定方法包括：
(i)使醌类化合物以及以上述目标物质为底物向上述醌类化合物供给电子的氧化酶溶解于上述液体试样；
(ii)检测在通过上述(i)步骤而得到的溶液中产生的电流；和
(iii)基于上述(ii)步骤的检测结果，测定上述目标物质的浓度。
<1-4.总结>
由以上的说明可知，传感器1为一种检测或定量液体试样中所含的目标物质的传感器，其中，包含：醌类化合物、向醌类化合物供给电子的酶和从醌类化合物接受电子的电极。目标物质可成为酶的底物。传感器1的构成也可表现为：包含以目标物质为底物的酶、电极和在酶与电极之间进行电子传递的醌类化合物。
本实施方式还可表现为以下方式。
(1)一种传感器，用于检测或定量液体试样中所含的目标物质，其中，包含：
PQQ依赖性或FAD依赖性酶、
具有亲水性官能团的醌类化合物、和
至少一对电极，
上述PQQ依赖性或FAD依赖性酶，通过与上述液体试样接触而使上述目标物质脱氢或氧化，
上述醌类化合物从上述PQQ依赖性或FAD依赖性酶接受电子，
当上述一对电极间施加有电压时，上述一对电极中的一个从上述醌类化合物接受电子。
需要说明的是，设有两对以上的电极时，只要向这些电极中的至少一对电极施加电压即可。以下也是同样。
(2)如上述(1)所述的传感器，其中，上述PQQ依赖性或FAD依赖性酶为脱氢酶。
(3)如上述(1)所述的传感器，其中，上述FAD依赖性酶为葡萄糖脱氢酶。
(4)一种传感器，用于检测或定量液体试样中所含的目标物质，其中，包含：
具有亲水性官能团的醌类化合物、
氧化酶、和
至少一对电极，
上述氧化酶通过与上述液体试样接触而使上述目标物质氧化，
上述醌类化合物从上述氧化酶接受电子，
当上述一对电极间施加有电压时，上述一对电极中的一个从上述醌类化合物接受电子。
(5)如上述(4)所述的传感器，其中，上述氧化酶为FAD依赖性酶。
(6)一种传感器，用于检测或定量液体试样中所含的目标物质，其中，包含：
具有亲水性官能团的醌类化合物、
脱氢酶、和
至少一对电极，
上述脱氢酶通过与上述液体试样接触而使上述目标物质脱氢，
上述醌类化合物从上述脱氢酶接受电子，
当上述一对电极间施加有电压时，上述一对电极中的一个从上述醌类化合物接受电子。
(7)如上述(1)～(6)中任一项所述的传感器，其中，
上述醌类化合物具有醌和取代基，
上述取代基具有苯环和附加于上述苯环上的上述亲水性官能团。
(8)如上述(1)～(7)中任一项所述的传感器，其中，上述醌类化合物具有选自由磺酸基、羧酸基及磷酸基组成的组中的至少一种官能团作为上述亲水性官能团。
(9)如上述(8)所述的传感器，其中，
上述磺酸基为选自由1-磺酸、2-磺酸、3-磺酸、4-磺酸及2，7-二磺酸组成的组中的至少一种官能团，
上述羧酸基为2-羧酸，
上述磷酸基为2-磷酸。
(10)一种传感器，用于检测或定量液体试样中所含的目标物质，其中，包含：
作为介体的菲醌和/或其衍生物、
酶、和
至少一对电极，
上述酶通过与上述液体试样接触而使上述目标物质脱氢或氧化，
上述菲醌和/或其衍生物从上述酶接受电子，
当上述一对电极间施加有电压时，上述一对电极中的一个从上述接受了电子的菲醌和/或其衍生物接受电子。
(11)如上述(9)所述的传感器，其中，
上述菲醌为9，10-菲醌，上述菲醌衍生物为9，10-菲醌的衍生物。
(12)如上述(10)或(11)所述的传感器，其中，
上述菲醌衍生物具有亲水性官能团。
(13)如上述(12)所述的传感器，其中，
上述菲醌衍生物具有选自由磺酸基、羧酸基及磷酸基组成的组中的至少一种官能团作为上述亲水性官能团。
(14)如上述(10)～(13)中任一项所述的传感器，其中，包含选自由9，10-菲醌-2-磺酸、9，10-菲醌-1-磺酸、9，10-菲醌-3-磺酸、9，10-菲醌-4-磺酸、9，10-菲醌-2，7-二磺酸、9，10-菲醌-2-羧酸及9，10-菲醌-2-磷酸组成的组中的至少一种化合物作为上述菲醌衍生物。
(15)如上述(10)～(14)中任一项所述的传感器，其中，
上述酶为氧化还原酶。
(16)如上述(15)所述的传感器，其中，
上述氧化还原酶为氧化酶。
(17)如上述(16)所述的传感器，其中，
上述氧化还原酶为FAD依赖性氧化酶。
(18)如上述(15)所述的传感器，其中，
上述氧化还原酶为脱氢酶。
(19)如上述(18)所述的传感器，其中，
包含选自由NAD依赖性脱氢酶、PQQ依赖性脱氢酶及FAD依赖性脱氢酶组成的组中的至少一种酶作为上述氧化还原酶。
(20)如上述(19)所述的传感器，其中，
上述氧化还原酶为FAD依赖性葡萄糖脱氢酶。
(21)如上述(15)所述的传感器，其中，
上述氧化还原酶为PQQ依赖性或FAD依赖性酶。
(22)如上述(10)～(21)中任一项所述的传感器，其中，
上述传感器中所含的上述菲醌及其衍生物的量，每1U上述酶为0.05～2500nmol。
(23)如上述(9)～(21)中任一项所述的传感器，其中，
上述生物传感器中所含的上述菲醌及其衍生物的量，每1U上述酶为1～400nmol。
(24)一种测定液体试样中所含的目标物质的浓度的方法，其中，包括：
(a)使上述液体试样、PQQ依赖性或FAD依赖性酶以及具有亲水性官能团的醌类化合物接触；
(b)利用上述PQQ依赖性或FAD依赖性酶，使上述液体试样中所含的上述目标物质脱氢或氧化；
(c)利用上述醌类化合物，从上述PQQ依赖性或FAD依赖性酶接受电子；
(d)向与上述液体试样接触的一对电极施加电压；
(e)利用上述一对电极中的一个，使通过上述(c)步骤接受了电子的上述醌类化合物氧化；
(f)测定上述一对电极间流过的电流；及
(g)基于上述电流，计算上述目标物质的浓度。
(25)一种测定液体试样中所含的目标物质的浓度的方法，其中，包括：
(a)使上述液体试样、具有亲水性官能团的醌类化合物以及以上述目标物质为底物向上述醌类化合物供给电子的氧化酶接触；
(b)检测通过上述(a)步骤而产生的电流；及
(c)基于上述(b)步骤的检测结果，计算上述目标物质的浓度。
(26)一种测定液体试样中所含的目标物质的浓度的方法，其中，包括：
(a)使上述液体试样、具有亲水性官能团的醌类化合物以及以上述目标物质为底物向上述醌类化合物供给电子的脱氢酶接触；
(b)检测通过上述(a)步骤而产生的电流；及
(c)基于上述(b)步骤的检测结果，计算上述目标物质的浓度。
(27)一种测定液体试样中所含的目标物质的浓度的方法，其中，包括：
(a)使上述液体试样、菲醌和/或其衍生物以及以上述目标物质为底物向上述菲醌和/或其衍生物供给电子的酶接触；
(b)检测通过上述(a)步骤而产生的电流；及
(c)基于通过上述(b)步骤而检测到的电流，计算上述目标物质的浓度。
(28)一种传感器，用于检测或定量试样中所含的目标物质，其中，包含：
PQQ依赖性或FAD依赖性脱氢酶、
具有亲水性官能团的醌类化合物、和
至少第一及第二电极，
上述醌类化合物与上述第一电极的至少一部分及第二电极的至少一部分的双方接触，
上述PQQ依赖性或FAD依赖性脱氢酶通过与上述液体试样接触而使上述目标物质脱氢，
上述醌类化合物从上述PQQ依赖性或FAD依赖性酶接受电子，
当上述第一及第二电极间施加有电压时，上述一对电极中的一个从上述醌类化合物接受电子。
(29)一种传感器，用于检测或定量试样中所含的目标物质，其中，包含：
酶、
醌类化合物、和
至少一对电极，
以银/氯化银(饱和氯化钾)电极为基准电极而测定的上述醌类化合物的氧化还原电位，与0V相比为负值，
上述酶通过与上述液体试样接触而使上述目标物质脱氢或氧化，
上述醌类化合物从上述酶接受电子，
当上述一对电极间施加有电压时，上述至少一对电极中的一个从上述醌类化合物接受电子。
(30))一种传感器，用于检测或定量试样中所含的目标物质，其中，包含：
酶、
具有亲水性官能团的醌类化合物、和
至少一对电极，
以银/氯化银(饱和氯化钾)电极为基准电极而测定的上述醌类化合物的氧化还原电位，与0V相比为负值，
上述酶通过与上述液体试样接触而使上述试样中所含的上述目标物质脱氢或氧化，
上述醌类化合物从上述酶接受电子，
当上述一对电极间施加有电压时，上述至少一对电极中的一个从上述醌类化合物接受电子。
(31)一种传感器，用于检测或定量液体试样中所含的目标物质，其中，包含：
具有亲水性官能团的醌类化合物、
酶分子内含有辅酶的酶或者与辅酶结合的酶、和
至少一对电极，
上述酶通过与上述液体试样接触而使上述目标物质脱氢或氧化，
上述醌类化合物从上述酶接受电子，
当上述一对电极间施加有电压时，上述至少一对电极中的一个从上述醌类化合物接受电子。
(32)如上述(30)所述的传感器，其中，
上述酶为脱氢酶。
(33)一种测定以水为介质的液体试样中所含的目标物质的浓度的方法，其中，包括：
(a)使醌类化合物以及以上述目标物质为底物向上述醌类化合物供给电子的氧化酶溶解于上述液体试样中；
(b)检测通过上述(a)步骤得到的溶液中产生的电流；及
(c)基于上述(b)步骤的检测结果，计算上述目标物质的浓度。
[2]第二实施方式
本实施方式的方法，为一种测定液体试样中所含的目标物质的浓度的方法，其中，包括：
(a)使上述液体试样、脱氢或氧化酶以及菲醌和/或其衍生物接触；
(b)利用上述脱氢或氧化酶，使上述液体试样中所含的上述目标物质脱氢或氧化；
(c)利用上述菲醌和/或其衍生物，从上述脱氢或氧化酶接受电子；
(d)向通过上述(c)步骤接受了电子的上述菲醌和/或其衍生物照射光；
(e)测定从上述接受了电子的上述菲醌和/或其衍生物射出的光量；及
(f)基于上述光量，计算上述目标物质的浓度。
需要说明的是，在对象为以水为介质的液体试样时，上述(a)步骤可包括：使菲醌和/或其衍生物以及以上述目标物质为底物向菲醌和/或其衍生物供给电子的氧化酶溶解于上述液体试样中。
关于“菲醌的衍生物”，已在第一实施方式中进行了说明。
另外，PQQ依赖性脱氢酶及FAD依赖性脱氢酶也已在第一实施方式中进行了说明。
上述(e)步骤的光量的测定例如如下执行。在含有酶及菲醌和/或其衍生物的透光性比色皿中添加液体试样。作为比色皿，例如可使用玻璃或聚苯乙烯制的市售的光学测定用比色皿。使用市售的分光光度仪，向比色皿照射光，检测透过的光。作为所照射的光的波长及所检测的光的波长，优选选择伴随菲醌和/或其衍生物的氧化及还原显示较大的吸光度变化的波长。由此，可以利用光来检测目标物质的氧化所伴随的、菲醌或其衍生物的氧化体的减少或还原体的增加。在此，对使用菲醌和/或其衍生物的例子进行了说明，但可以使用作为从酶接受电子的化合物、通过还原而光学特性发生变化的醌类化合物。
另外，上述(f)步骤例如通过下述来执行：运算装置使用由目标物质浓度已知的标准溶液得到的标准曲线，计算目标物质的浓度。
[3]第三实施方式
本实施方式的浓度测定方法，除了使用第一介体及第二介体以外，具有与第二实施方式的方法同样的构成。
即，本实施方式的浓度测定方法，为一种测定液体试样中所含的目标物质的浓度的方法，其中，包括：
(a)使上述液体试样、脱氢或氧化酶以及作为第一介体的菲醌和/或其衍生物接触；
(b)利用上述脱氢或氧化酶，使上述液体试样中所含的上述目标物质脱氢或氧化；
(c)利用上述菲醌和/或其衍生物，从上述脱氢或氧化酶接受电子；
(d)利用第二介体，从通过上述(c)步骤接受了电子的上述菲醌和/或其衍生物接受电子；
(e)向通过上述(d)步骤接受了电子的上述第二介体照射光；
(f)测定从接受了上述电子的上述第二介体射出的光量；及
(g)基于上述射出的光量，计算上述目标物质的浓度。
需要说明的是，与第二实施方式同样，当本实施方式的方法的对象为以水为介质的液体试样时，上述(a)步骤可包括：使醌类化合物以及以上述目标物质为底物向上述醌类化合物供给电子的氧化酶溶解于上述液体试样中。
作为第二介体，可以使用从菲醌和/或其衍生物接受电子、通过还原而光学特性发生变化的物质。
实施例
<1.介体的溶解度>
以下，以9，10-菲醌(上述式(d))及9，10-菲醌-2-磺酸钠盐(下述式(i))作为醌类化合物的一例，说明与铁氰化钾比较溶解度的结果。
[化3]
Figure BDA0000134085870000291
用发烟硫酸将市售的9，10-菲醌加以磺酰化后，进行异构体的分离，进而将其钠盐化，得到作为目标化合物的9，10-菲醌-2-磺酸钠盐。反应式如下所示。
[化4]
Figure BDA0000134085870000292
称量铁氰化钾、9，10-菲醌及9，10-菲醌-2-磺酸钠盐，向其中添加水。通过目视确认来评价25℃时在水中的溶解度。结果如表1所示。
[表1]
  介体   在水中的溶解度
  铁氰化钾   100mM以上
  9，10-菲醌   小于1mM
  9，10-菲醌-2-磺酸钠盐   80mM以上
如表1所示，9，10-菲醌-2-磺酸钠盐在将以水为溶剂的液体试样作为对象的传感器中显示出适合作为介体的溶解度。
<2.氧化还原电位>
将铁氰化钾及9，10-菲醌-2-磺酸钠盐以1mM溶解于100mM磷酸钠缓冲液(pH7)中，由此制备铁氰化钾水溶液及9，10-菲醌-2-磺酸钠水溶液。
使用这些水溶液，利用循环伏安法对铁氰化钾及9，10-菲醌-2-磺酸钠盐进行氧化还原电位的测定。具体而言，所用的电极如下所示：
-作用电极：玻璃碳电极、
-对电极：铂线、
-参比电极：银/氯化银(饱和氯化钾)电极(以下记作Ag|AgCl)。
另外，测定使用稳压器。各种电极和稳压器使用电化学中一般使用的电极和稳压器。这些设备例如可从BAS公司等获得。
循环伏安法中，使施加在作用电极上的电位相对于时间以线形进行扫描。扫描速度设定为0.1V/秒。首先，在作用电极上施加第一电位，使电极电位向负侧扫描直至与该电位相比为负值的第二电位。然后，进行使电极电位从第二电位向正侧折返至第一电位的扫描。
关于第一电位及第二电位，在铁氰化钾的情况下分别为0.7V及-0.3V，在9，10-菲醌-2-磺酸钠盐的情况下分别为0.2V及-0.5V。
以下所述的电位为相对于Ag|AgCl的电位。
结果图示于图4。对于铁氰化钾，氧化电流显示峰值时的电位为280mV、还原电流显示峰值时的电位为170mV。相对于此，对于9，10-菲醌-2-磺酸钠盐，氧化电流显示峰值时的电位为-120mV、还原电流显示峰值时的电位为-180mV。
以氧化电流显示峰值时的电位值(Eox)与还原电流显示峰值时的电位值(Ered)的平均值[(Ered+Eox)/2]计算氧化还原电位时，9，10-菲醌-2-磺酸钠盐的氧化还原电位为-150mV，铁氰化钾的氧化还原电位为225mV。这样，以Ag|AgCl为基准电极测定的、9，10-菲醌-2-磺酸钠盐的氧化还原电位为负值。
可知9，10-菲醌-2-磺酸钠盐具有与玻璃碳电极可逆且迅速的氧化还原反应性，同时具有比铁氰化钾低400mV左右的氧化还原电位。与电极的可逆且迅速的氧化还原反应性，是作为需要在短时间内进行测定的传感器中所使用的介体而言优选的特性。
另外，通过使用具有更低的氧化还原电位的物质作为介体，可以减小液体试样中的易氧化性的测定干扰物质、例如血液中的抗坏血酸或对乙酰氨基酚等的影响，结果可提供能够进行准确测定的传感器。
<3.葡萄糖应答性>
对于第一实施方式的传感器1，制作各部具有以下构成的传感器。更详细地如下所述。
首先，在长度为30mm、宽度为7mm、厚度为0.2mm的含有聚对苯二甲酸乙二醇酯为主要成分的基板2上，通过钯溅射形成厚度为8nm的导电层3。然后，通过激光烧蚀，形成宽度为0.1mm的非导电轨，由此形成电极31～33。以下述方式进行设计：电极31作为作用电极起作用，电极32作为对电极起作用，电极33作为探测电极起作用。然后，使用微量注射器，将含有酶和介体的水溶液涂布为直径2.2mm的圆形，由此形成试剂层4。形成试剂层4后，在形成有电极的基板上依次粘贴具有长度为3.4mm、宽度为1.2mm的切槽的隔片5(厚度0.145mm)和盖6，由此制作具有容量为0.6μL的腔室的传感器1。
[实施例1]
传感器构成
电极：钯
试剂层：
试剂层通过在形成有电极的基板上滴加以下组成的水溶液(试剂溶液)1.2μL并进行干燥来形成。
-酶：FAD依赖性葡萄糖脱氢酶3.5MU/L(升)
-介体：9，10-菲醌-2-磺酸钠盐0.6重量％(20mM)
[比较例1]
传感器构成
电极：钯
试剂层：
试剂层通过在形成有电极的基板上滴加以下组成的水溶液(1.4μL)并进行干燥来形成。
酶：FAD依赖性葡萄糖脱氢酶1.4MU/L(升)
介体：铁氰化钾1.7重量％(52mM)
对于实施例1及比较例2的传感器，以各种葡萄糖浓度(已知)的血液作为液体试样，利用测定系统100进行葡萄糖浓度测定。
结果如图5所示。包含9，10-菲醌-2-磺酸钠盐的传感器，显示出与包含铁氰化钾的传感器同等或更高的葡萄糖应答性。
<4.重现性>
使用上述<3.>部分中所述的传感器，考察葡萄糖浓度测定结果的重现性。以各种葡萄糖浓度(已知)的血液作为液体试样，计算使用6～10个传感器同时测定时的平均值及标准差，用标准差除以平均值，由此评价同时重现性。
以葡萄糖浓度为横轴、以同时重现性(标准差除以测定值的平均值所得的值)为纵轴作图的结果示于图6。包含9，10-菲醌-2-磺酸钠盐的传感器，显示出与包含铁氰化钾的传感器同等或更好的重现性。
<5.干扰物质的影响>
使用上述<3.>部分中所述的传感器，考察干扰物质的影响。
以添加有各种浓度的干扰物质的血液作为液体试样(葡萄糖浓度80mg/dL)，使用传感器测定葡萄糖浓度。对于6～10次测定结果的平均值，求出其自真值的背离度(％)。图7是使用抗坏血酸作为干扰物质时的结果，图8是使用对乙酰氨基酚作为干扰物质时的结果。
如图7及图8所示，包含9，10-菲醌-2-磺酸钠盐的传感器与包含铁氰化钾的传感器相比，干扰物质的影响减小。认为这是由于，用作介体的9，10-菲醌-2-磺酸钠盐具有比铁氰化钾更低的氧化还原电位。
另外，图9及图10表示0％～70％的各血细胞比容水平下葡萄糖浓度的测定值自真值的背离度。图9中，葡萄糖浓度为80mg/dL，图10中，葡萄糖浓度为336mg/dL。
如图9及图10所示，包含9，10-菲醌-2-磺酸钠盐的传感器与包含铁氰化钾的传感器相比，可减小血细胞比容的影响。
<6.其他介体>
如图11所示，以9，10-菲醌为起始物质，合成了化合物A、B、H’、I、I’及J。图11中的p-TsOH表示对甲苯磺酸。
化合物A、B、H’、I、I’、J以及9，10-菲醌-2，7-二磺酸二钠盐在水中的溶解度示于表2。
[表2]
  介体   在水中的溶解度
  9，10-菲醌-2，7-二磺酸二钠盐   200mM以上
  化合物A   1mM
  化合物B   1mM
  化合物H’   20mM
  化合物I   5mM
  化合物I’   20mM
  化合物J   50mM
化合物H’、I、I’、J以及9，10-菲醌-2，7-二磺酸二钠盐具有亲水性官能团，如表2所示，对水显示出高溶解度。
具有亲水性官能团的化合物、即9，10-菲醌-2，7-二磺酸二钠盐、化合物H’、I，I’、J，显示特别高的溶解度。
另外，通过与图4同样的操作，进行化合物A、B、H’、I、I’、J以及9，10-菲醌-2，7-二磺酸二钠盐的循环伏安法。循环伏安图示于图13～图19。为进行比较，将图4中的9，10-菲醌-2-磺酸钠盐的循环伏安图示于图12中。表3中示出各化合物的还原电流显示峰值时的电位值(Ered)、氧化电流显示峰值时的电位值(Eox)及氧化还原电位(E0’)。
[表3]
Figure BDA0000134085870000341
如表3所示，以Ag|AgCl作为基准电极而测定的这些化合物的氧化还原电位为负值。
<7.缓冲液的效果>
作为用于形成试剂层的试剂溶液的溶剂，使用N-(2-乙酰胺)-2-氨基乙磺酸(ACES)缓冲液(pH7.0)。其他条件(例如试剂溶液中的酶和介体的种类以及浓度等)与实施例1同样。对于缓冲成分ACES的浓度为0mM时、10mM时、20mM时、30mM时的各情况，分别测定相对于葡萄糖浓度的应答电流值。结果示于图20。
如图20所示，由于ACES的存在，传感器对葡萄糖浓度的应答性提高。另外，ACES浓度高的得到良好的应答性。
本发明人确认：即使使用磷酸缓冲液代替ACES缓冲液，传感器对葡萄糖浓度的应答性也提高。
<8.试剂溶液的pH>
分别使用pH6.4、pH7.0及pH7.5的磷酸缓冲液作为溶剂，制备3种试剂液。使用这些试剂液形成试剂层，由此制作了3种传感器。其他条件与实施例1同样。
使用这些传感器，测定血液中的葡萄糖浓度。如图21所示，血液中溶解的氧对葡萄糖浓度的测定结果产生影响。但是，通过使用pH7.0的缓冲液，与使用pH7.5的缓冲液相比，可减小氧的影响。另外，使用pH6.4的缓冲液时，其影响进一步减小。
<9.添加剂>
使用pH6.4的磷酸缓冲液作为溶剂来制备试剂液，使用该试剂液形成试剂层。比较在试剂液中添加10mM的柠檬酸-3Na时与未添加时传感器对葡萄糖浓度的应答电流。需要说明的是，除了使用pH6.4的磷酸缓冲液作为溶剂及添加柠檬酸-3Na以外，其他条件与实施例1相同。
如图22所示，通过添加柠檬酸-3Na，对葡萄糖浓度的应答电流的直线性提高。
另外，在使用氯化钙(CaCl2)代替柠檬酸-3Na的情况下，也确认到同样的效果。
符号的说明
1传感器
2基板
3导电层
31作用电极
32对电极
33探测电极
4试剂层
5隔片
51毛细管
52导入口
6盖
61通气口

Claims (32)

1.一种传感器，用于检测或定量液体试样中所含的目标物质，其中，包含：
PQQ依赖性或FAD依赖性酶、
具有亲水性官能团的醌类化合物、和
至少一对电极，
所述PQQ依赖性或FAD依赖性酶通过与所述液体试样接触而使所述目标物质脱氢或氧化，
所述醌类化合物具有醌和取代基，从所述PQQ依赖性或FAD依赖性酶接受电子，
所述取代基具有苯环和附加于所述苯环上的所述亲水性官能团，
当所述一对电极间施加有电压时，所述一对电极中的一个从所述醌类化合物接受电子。
2.如权利要求1所述的传感器，其中，
所述PQQ依赖性或FAD依赖性酶为脱氢酶。
3.如权利要求1所述的传感器，其中，
所述FAD依赖性酶为葡萄糖脱氢酶。
4.一种传感器，用于检测或定量液体试样中所含的目标物质，其中，包含：
具有亲水性官能团的醌类化合物、
氧化酶、和
至少一对电极，
所述氧化酶通过与所述液体试样接触而使所述目标物质氧化，
所述醌类化合物具有醌和取代基，从所述氧化酶接受电子，
所述取代基具有苯环和附加于所述苯环上的所述亲水性官能团，
当所述一对电极间施加有电压时，所述一对电极中的一个从所述醌类化合物接受电子。
5.如权利要求4所述的传感器，其中，
所述氧化酶为FAD依赖性酶。
6.一种传感器，用于检测或定量液体试样中所含的目标物质，其中，包含：
具有亲水性官能团的醌类化合物、
脱氢酶、和
至少一对电极，
所述脱氢酶通过与所述液体试样接触而使所述目标物质脱氢，
所述醌类化合物具有醌和取代基，从所述脱氢酶接受电子，
所述取代基具有苯环和附加于所述苯环上的所述亲水性官能团，
当所述一对电极间施加有电压时，所述一对电极中的一个从所述醌类化合物接受电子。
7.如权利要求1～6中任一项所述的传感器，其中，
所述醌类化合物具有选自磺酸基、羧酸基及磷酸基中的至少一种官能团作为所述亲水性官能团。
8.如权利要求7所述的传感器，其中，
所述磺酸基为选自由1-磺酸、2-磺酸、3-磺酸、4-磺酸及2，7-二磺酸组成的组中的至少一种官能团，
所述羧酸基为2-羧酸，
所述磷酸基为2-磷酸。
9.一种传感器，用于检测或定量液体试样中所含的目标物质，其中，包含：
作为介体的、具有亲水性官能团的菲醌衍生物、
酶、和
至少一对电极，
所述酶通过与所述液体试样接触而使所述目标物质脱氢或氧化，
所述菲醌衍生物从所述酶接受电子，
当所述一对电极间施加有电压时，所述一对电极中的一个从所述菲醌衍生物接受电子。
10.如权利要求9所述的传感器，其中，
所述菲醌衍生物为9，10-菲醌的衍生物。
11.如权利要求9所述的传感器，其中，
所述菲醌衍生物具有选自由磺酸基、羧酸基及磷酸基组成的组中的至少一种官能团作为所述亲水性官能团。
12.如权利要求9、10或11所述的传感器，其中，
包含选自由9，10-菲醌-2-磺酸、9，10-菲醌-1-磺酸、9，10-菲醌-3-磺酸、9，10-菲醌-4-磺酸、9，10-菲醌-2，7-二磺酸、9，10-菲醌-2-羧酸、及9，10-菲醌-2-磷酸组成的组中的至少一种化合物作为所述菲醌衍生物。
13.如权利要求9、10或11所述的传感器，其中，
所述酶为氧化还原酶。
14.如权利要求13所述的传感器，其中，
所述氧化还原酶为氧化酶。
15.如权利要求14所述的传感器，其中，
所述氧化还原酶为FAD依赖性氧化酶。
16.如权利要求13所述的传感器，其中，
所述氧化还原酶为脱氢酶。
17.如权利要求16所述的传感器，其中，
包含选自由NAD依赖性脱氢酶、PQQ依赖性脱氢酶及FAD依赖性脱氢酶组成的组中的至少一种酶作为所述氧化还原酶。
18.如权利要求17所述的传感器，其中，
所述氧化还原酶为FAD依赖性葡萄糖脱氢酶。
19.如权利要求13所述的传感器，其中，
所述氧化还原酶为PQQ依赖性或FAD依赖性酶。
20.如权利要求9、10、11中任一项所述的传感器，其中，
所述传感器中所含的所述菲醌衍生物的量，每1U所述酶为0.05～2500nmol。
21.如权利要求9、10、11中任一项所述的传感器，其中，
所述传感器中所含的所述菲醌衍生物的量，每1U所述酶为1～400nmol。
22.一种测定液体试样中所含的目标物质的浓度的方法，其中，包括：
(a)使所述液体试样、PQQ依赖性或FAD依赖性酶以及具有亲水性官能团的醌类化合物接触；
(b)利用所述PQQ依赖性或FAD依赖性酶，使所述液体试样中所含的所述目标物质脱氢或氧化；
(c)利用所述醌类化合物，从所述PQQ依赖性或FAD依赖性酶接受电子；
(d)向与所述液体试样接触的一对电极施加电压；
(e)利用所述一对电极中的一个，使通过所述(c)步骤接受了电子的所述醌类化合物氧化；
(f)测定所述一对电极间流过的电流；及
(g)基于所述电流，计算所述目标物质的浓度，
其中所述醌类化合物具有醌和取代基，
所述取代基具有苯环和附加于所述苯环上的所述亲水性官能团。
23.一种测定液体试样中所含的目标物质的浓度的方法，其中，包括：
(a)使所述液体试样、具有亲水性官能团的醌类化合物以及以所述目标物质为底物向所述醌类化合物供给电子的氧化酶接触；
(b)检测通过所述(a)步骤而产生的电流；及
(c)基于所述(b)步骤的检测结果，计算所述目标物质的浓度，
其中所述醌类化合物具有醌和取代基，所述取代基具有苯环和附加于所述苯环上的所述亲水性官能团。
24.一种测定液体试样中所含的目标物质的浓度的方法，其中，包括：
(a)使所述液体试样、具有亲水性官能团的醌类化合物以及以所述目标物质为底物向所述醌类化合物供给电子的脱氢酶接触；
(b)检测通过所述(a)步骤而产生的电流；及
(c)基于所述(b)的检测结果，计算所述目标物质的浓度，
其中所述醌类化合物具有醌和取代基，所述取代基具有苯环和附加于所述苯环上的所述亲水性官能团。
25.一种测定液体试样中所含的目标物质的浓度的方法，其中，包括：
(a)使所述液体试样、具有亲水性官能团的菲醌衍生物以及以所述目标物质为底物向所述菲醌衍生物供给电子的酶接触；
(b)检测通过所述(a)步骤而产生的电流；及
(c)基于通过所述(b)步骤而检测到的电流，计算所述目标物质的浓度。
26.一种测定液体试样中所含的目标物质的浓度的方法，其中，包括：
(a)使所述液体试样、脱氢或氧化酶以及具有亲水性官能团的菲醌衍生物接触；
(b)利用所述脱氢或氧化酶，使所述目标物质脱氢或氧化；
(c)利用所述菲醌衍生物，从所述脱氢或氧化酶接受电子；
(d)向通过所述(c)步骤接受了电子的所述菲醌衍生物照射光；
(e)测定从接受了所述电子的所述菲醌衍生物射出的光量；及
(f)基于所述光量，计算所述目标物质的浓度。
27.一种测定液体试样中所含的目标物质的浓度的方法，其中，包括：
(a)使所述液体试样、脱氢或氧化酶以及作为第一介体的菲醌和／或菲醌衍生物接触；
(b)利用所述脱氢或所述氧化酶，使所述目标物质脱氢或氧化；
(c)利用所述菲醌和／或菲醌衍生物，从所述脱氢或所述氧化酶接受电子；
(d)利用第二介体，从通过所述(c)步骤接受了电子的所述菲醌和／或菲醌衍生物接受电子；
(e)向通过所述(d)步骤接受了电子的所述第二介体照射光；
(f)测定从接受了所述电子的所述第二介体射出的光量；及
(g)基于所述射出的光量，计算所述目标物质的浓度。
28.一种传感器，用于检测或定量液体试样中所含的目标物质，其中，包含：
PQQ依赖性或FAD依赖性脱氢酶、
具有亲水性官能团的醌类化合物、和
至少第一及第二电极，
所述醌类化合物与所述第一电极的至少一部分及第二电极的至少一部分双方接触，
所述PQQ依赖性或FAD依赖性脱氢酶通过与所述液体试样接触而使所述目标物质脱氢，
所述醌类化合物具有醌和取代基，从所述PQQ依赖性或FAD依赖性脱氢酶接受电子，
所述取代基具有苯环和附加于所述苯环上的所述亲水性官能团，
当所述第一及第二电极间施加有电压时，所述一对电极中的一个从所述醌类化合物接受电子。
29.一种传感器，用于检测或定量液体试样中所含的目标物质，其中，包含：
酶、
具有亲水性官能团的醌类化合物、和
至少一对电极，
以银／氯化银电极为基准电极而测定的所述醌类化合物的氧化还原电位，与0V相比为负值，
所述酶通过与所述液体试样接触而使所述目标物质脱氢或氧化，
所述醌类化合物具有醌和取代基，从所述酶接受电子，
所述取代基具有苯环和附加于所述苯环上的所述亲水性官能团，
当所述一对电极间施加有电压时，所述一对电极中的一个从所述醌类化合物接受电子。
30.一种传感器，用于检测或定量液体试样中所含的目标物质，其中，包含：
具有亲水性官能团的醌类化合物、
酶分子内含有辅酶的酶或者与辅酶结合的酶、和
至少一对电极，
所述酶通过与所述液体试样接触而使所述目标物质脱氢或氧化，
所述醌类化合物具有醌和取代基，从所述酶接受电子，
所述取代基具有苯环和附加于所述苯环上的所述亲水性官能团，
当所述一对电极间施加有电压时，所述一对电极中的一个从所述醌类化合物接受电子。
31.如权利要求29所述的传感器，其中，
所述酶为脱氢酶。
32.一种测定以水为介质的液体试样中所含的目标物质的浓度的方法，其中，包括：
(a)使具有亲水性官能团的醌类化合物以及以所述目标物质为底物向所述醌类化合物供给电子的氧化酶溶解于所述液体试样中；
(b)检测通过所述(a)步骤得到的溶液中产生的电流；及
(c)基于所述(b)的检测结果，计算所述目标物质的浓度，
其中所述醌类化合物具有醌和取代基，所述取代基具有苯环和附加于所述苯环上的所述亲水性官能团。
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