CN102460115B - 流式粒子图像分析方法和装置 - Google Patents

Abstract

能够高精度并且高效地进行聚焦点调整，高精度地检查聚焦点位置的偏离、样本液的流动的厚度。在多个不同的焦点位置上，根据由均匀的物质构成的标准粒子的图像取得调焦用参数值。作为标准粒子图像的中心附近的浓度值与轮廓附近的浓度值的比或差、或者中心附近的浓度值来求出调焦用参数值。根据得到的调焦用参数值与焦点位置的关系，调整聚焦点位置。另外，根据调焦用参数值与焦点位置的关系，将参数值换算为焦点位置，根据焦点位置及其波动，检查聚焦点位置的偏离和样本液的厚度。

Description

流式粒子图像分析方法和装置

技术领域

本发明涉及一种对流动池中的粒子图像进行拍摄，对粒子的静止图像进行分析的流式粒子图像分析方法和装置。

背景技术

在现有的粒子图像分析中，为了在形态学上检查血液中的细胞、尿中的粒子，通过以下的方法进行检查，即由检查技师在玻璃载片上做成标本，直接进行显微镜观察。显微镜检查存在结果受到技师的熟练程度的影响，检查需要时间等问题，所以要求提高效率。

近年来，随着检查的自动化的发展，例如在专利文献1、2中，公开了以下的流式粒子图像分析装置，使试样通过特别形状的流动池，使试样中的粒子在宽阔的摄影区域中流动，点亮闪光灯，作为静止图像拍摄试样中的粒子的放大图像，从各静止图像中对粒子进行分类。流式粒子图像分析装置通过外侧的鞘液的流动将试样液体包围来流到特殊形状的流动池，由此形成扁平的流动。但是，由于鞘液没有流过预定量，在鞘液的流动中存在不均匀等理由，有时样本液体的流动的形状比设定值厚。如果样本液的流动变厚，则有时粒子位置从聚焦点位置偏离，无法得到正确的图像。

为了在流式粒子图像分析装置中维持粒子的分类精度，需要始终在聚焦点位置拍摄粒子的静止图像。为了始终得到焦点聚焦的图像，例如需要进行以下的处理。

(1)在装置启动时，正确地调整聚焦点位置。

(2)在(1)后，还定期地检查聚焦点位置和样本液的流动的厚度。

例如在专利文献3～5中记载了(1)的调焦方法。在专利文献3中，记载了以下的方法：在调焦时，一边使流动池或物镜移动，一边在多个不同的位置，得到由均匀的物质构成的相同大小的标准粒子(以下称为标准粒子)的静止图像，计算各位置处的标准粒子的平均面积值，进行流动池或物镜的位置调整，使该值成为最小。在专利文献4中，表示了使用了神经网络的调焦方法。在该方法中，预先使神经网络学习在多个焦点位置的标准粒子图像的特征量(浓度分散、浓度对比度、浓度微分等)，将结果载入装置中，根据结果进行调焦。在专利文献5中，表示了以下的方法：替代专利文献3的面积，使用标准粒子的R图像中的等级分散值。这表示了以下的方法，根据在明亮的状态和昏暗的状态的中间状态下能够看到在聚焦点位置的标准粒子的性质，进行流动池或物镜的位置调整，以使浓度分散(等级分散)成为最大值与最小值的大致中央值。

例如在专利文献5中记载了(2)的聚焦点位置的检查和检查样本液的流动的厚度的方法。在专利文献5中，公开了以下的方法，根据上述等级分散值和样本宽度(静止图像的横向)的关系图，利用等级分散值的分布，检查从聚焦点的偏离和样本液的流动的厚度。表示了在等级分散值从聚焦点位置的值偏离的情况下，判断为焦点没有聚焦，在等级分散值的波动(等级分散值的分散)大时，判断为样本液的流动变厚的方法。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开平5-296915号公报

专利文献2：日本特开昭63-94156号公报

专利文献3：日本特开2007-304059号公报

专利文献4：日本特开平9-311102号公报

专利文献5：日本特开2002-62251号公报

发明内容

发明要解决的问题

关于上述(1)的粒子图像的聚焦点调整，专利文献3的方法对调焦的参数使用了面积值。我们通过实验确认可知，如图1所示，在调焦中使用的标准粒子的颗粒直径小到1μm的情况下，聚焦点位置的面积最小，但颗粒直径越大，成为面积最小值的位置越是从聚焦点位置偏离。

专利文献4的方法对调焦使用了神经网络。为了使用神经网络，需要预先通过从所有位置的标准粒子图像得到的特征量进行学习。另外，因为需要通过考虑了每日的差异、装置之间的差异的标准粒子图像得到的特征量进行学习，所以数据取得需要时间。另外，神经网络的学习也需要时间。

专利文献5的方法对调焦的参数使用了等级分散值。等级分散值与焦点位置的关系如图2那样，不是单调减少，所以例如在调焦开始时刻的状态位于图中的箭头A的情况下，难以判断使流动池或物镜向哪个方向移动才好。

关于上述(2)的聚焦点位置的检查和检查样本液的流动的厚度的方法，专利文献5的方法使用了等级分散值。根据本方法，在判定样本液的流动的厚度的情况下，例如如图3所示，在样本的厚度是d1的情况下，等级分散值分布在Δ1的范围内。但是，在聚焦点位置偏离，流到与d1相同的宽度d2的位置时，分布的波动成为与Δ1不同的Δ2。因此，可知难以通过使用等级分散值来正确了解流动的厚度。

根据以上说明，在本发明中，其目的在于提供一种高精度、高效率地调整聚焦点位置，并且在调整聚焦点位置后，高精度地进行聚焦点位置的偏离检查和样本液的流动的厚度检查的方法和装置。

解决课题的手段

为了解决上述课题，本发明的流式粒子图像分析方法包括：使包含由均匀的物质构成的球状的标准粒子的样本液在流动池中流动，通过包含物镜的拍摄部对标准粒子进行拍摄，取得静止图像的步骤；根据静止图像，作为粒子图像特征参数值，计算粒子图像的中心附近的浓度值与轮廓附近的浓度值的比、或者粒子图像的中心附近的浓度值与轮廓附近的浓度值的差、或者粒子图像的中心附近的浓度值的步骤；以及根据该参数值，进行拍摄部的调焦的步骤。通过该结构，能够使用各种颗粒直径的标准粒子进行调焦，另外能够掌握装置启动时(调焦开始时)的状态，能够高效地进行调焦。

并且，本发明的流式粒子图像分析方法包括：使包含由均匀的物质构成的球状的标准粒子的样本液在流动池中流动，在拍摄部对标准粒子进行拍摄，取得静止图像的步骤；从静止图像中抽出表示拍摄部的焦点位置的粒子图像特征参数值的步骤；将上述参数值换算为焦点位置的步骤；以及根据换算后的焦点位置的波动，取得样本液的厚度信息的步骤。作为粒子图像特征参数值，可以使用粒子图像的中心附近的浓度值与轮廓附近的浓度值的比、或者粒子图像的中心附近的浓度值与轮廓附近的浓度值的差、或者粒子图像的中心附近的浓度值。根据该结构，能够根据焦点位置的值和波动检查聚焦点位置的偏离、检查样本液的流动的厚度。

另外，本发明的流式粒子图像分析装置包括：通过鞘液包住样本液使样本液流动的流动池；对流动池进行照射的脉冲光源；具有物镜的拍摄部；使流动池和物镜之间的距离可变的驱动单元；使包含由均匀的物质构成的球状的标准粒子的样本液在流动池中流动，在拍摄部中对标准粒子进行拍摄，取得静止图像的单元；根据静止图像，作为粒子图像特征参数值，计算粒子图像的中心附近的浓度值与轮廓附近的浓度值的比、或者粒子图像的中心附近的浓度值与轮廓附近的浓度值的差、或者粒子图像的中心附近的浓度值的单元。还具有根据该参数值，通过驱动单元使流动池与物镜之间的距离可变，来进行拍摄部的调焦的单元。或者，具有将参数值换算为拍摄部的焦点位置的单元；以及根据换算后的焦点位置，得到聚焦点位置的信息的单元。或者，还可以具有将参数值换算为焦点位置的单元；以及根据换算后的焦点位置的波动，得到样本液的厚度信息的单元。

发明效果

根据本发明的聚焦点调整方法，能够高精度并且高效地使用各种颗粒直径的标准粒子进行聚焦点调整。另外，根据使用了本发明的参数的检查方法，能够高精度地检查聚焦点位置和样本液的流动的厚度。

附图说明

图1是表示颗粒直径和在各颗粒直径下表示面积最小值的位置与聚焦点位置的差的分布图。

图2是表示等级分散值与各焦点位置的关系的一个例子的图。

图3是表示等级分散值与各焦点位置的分布的一个例子的图。

图4是说明流式粒子图像分析装置的结构例子的图。

图5是说明流式粒子图像分析装置的图像输入装置的结构例子的图。

图6是说明流式粒子图像分析装置的聚焦点调整时的图像处理方法的图。

图7是说明在代表性的焦点位置的标准粒子图像例子和通过了标准粒子的中心的x方向的浓度曲线的示意图例的图。

图8是说明求出调焦用参数(中心浓度比)的详细步骤的图。

图9是说明调焦用参数的图。

图10是说明求出调焦用参数(中心浓度差)的详细步骤的图。

图11是说明求出调焦用参数(中心浓度)的详细步骤的图。

图12是表示调焦用参数与各焦点位置的关系的一个例子的图。

图13是说明调焦方法的详细步骤的图。

图14是说明使用了近似式的调焦方法的详细步骤的图。

图15是说明检查聚焦点位置的偏离和样本液的流动的厚度的方法的详细步骤的图。

图16是表示聚焦点偏离时的焦点位置直方图的一个例子的图。

图17是表示样本液的流动的厚度变厚时的焦点位置直方图的一个例子的图。

图18是说明本发明的流式粒子图像分析装置的结构例子的图。

具体实施方式

下面，说明本发明的实施方式。

图4是说明应用本发明的流式粒子图像分析装置的结构例子的图。在测量装置本体401中，通过染色液添加装置402向试样添加染色液，一定时间后，通过图像输入装置403拍摄试样中的粒子的放大静止图像。把拍摄到的图像转送到图像处理装置406，通过图像模式识别进行试样中的粒子的分类，对1个检体中包含的试样中的粒子的种类及其出现频度进行计数。作为图像处理装置406，例如使用具备显示器404、键盘405的通用的个人计算机。计数的结果通过显示器404报告给操作者。将通过图像输入装置403拍摄的图像、图像处理装置406的测量结果、各对象区域的分类结果和在图像模式识别过程中得到的图像特征量等数据保存在图像处理装置406内的存储装置中。另外，图像处理装置406还兼有预览功能。在预览功能中，操作者能够显示任意的图像，执行自动分类的修正、基于目视的细分类。

图5是构成测量装置本体401的图像输入装置403的结构图。在图像输入装置403中，使用流动池501，在物镜503与脉冲灯502之间，作成宽度广厚度薄的扁平的试样505的流动。试样505以被外侧的鞘液流包围横穿光轴的方式流动。向通过流动池501形成的试样505的流动瞬间照射脉冲灯502的光，通过物镜503放大后的试样505中的粒子图像作为静止图像被照相机504拍摄。作为照相机504，例如可以使用CCD彩色照相机、CMOS彩色照相机等。把得到的图像转送到图像处理装置406。

通过焦点机构506，物镜503能够移动。通过焦点机构506的电动机509的旋转，稍微移动进给螺钉508，由此，与臂507联动的物镜503沿前后方向在光轴上移动。通过调整流动池501与物镜503之间的距离(焦点位置)，能够进行聚焦点调整。另外，通过焦点机构506可动的不限于物镜503，也可以是流动池501。

在进行聚焦点调整时，作为试样505，使用包含很多由均匀的物质构成的同一尺寸的球状的标准粒子的样本液。作为标准粒子，例如使用聚乙烯、聚苯乙烯等市场销售的透明球状粒子。通过焦点机构506使物镜503移动来改变拍摄系统的焦点位置，在设置在流动池的流动中的多个不同的焦点位置上，拍摄多张标准粒子的静止图像。把得到的图像转送到图像处理装置406。

图6是说明聚焦点调整时的图像处理装置406中的图像处理方法的详细的图。

照相机504拍摄的标准粒子图像作为数字数据被转送到图像处理装置406。

在着色修正处理步骤S601中，除去由于光学系统的特性造成的图像上的浓度不均。

在平滑化处理步骤S602中，进行噪声除去。作为手段，例如可以使用移动平均法、介质滤波处理等已知的技术。另外，也可以不进行平滑化处理。

在区域分割处理步骤S603中，将拍摄了标准粒子的图像分割为背景区域和对象区域，作成将背景区域设为0，将对象区域设为1的2值图像。

在区域分割修正处理步骤S604中，进行对象区域的填坑、背景区域的噪声除去等2值图像的修正、整形。作为手段，例如可以使用包含加粗处理、减细处理等滤波处理在内的已知技术。

在标记处理步骤S605中，对2值图像的每个连接成分进行标记处理，附加用于唯一确定图像中的多个对象的编号。

在特征量计算处理步骤S606中，针对附加了编号的各个对象区域，计算面积、后述的调焦用参数等特征量。

在步骤S607中，判断得到的对象区域是否是单一的标准粒子。在满足m≤(对象区域的面积)≤M的情况下，看作是单一的标准粒子，作为调焦用图像前进到下一步骤。在不满足的情况下，看作是多个连接标准粒子图像、或者标准粒子以外的成分而废弃。在此，m、M预先通过试验而求出最优值。

另外，也可以通过硬件进行图6所示的处理的全部或一部分。

图7是在代表性的焦点位置的标准粒子的图像例子和通过了标准粒子的中心的x方向的浓度曲线的示意图。图7(a)表示包含图5的物镜503和照相机504的拍摄系统的焦点位置远离标准粒子时的情况，图7(b)表示拍摄系统的焦点位置与标准粒子一致，焦点与标准粒子相符时的情况，图7(c)表示拍摄系统的焦点位置位于标准粒子前侧的情况。

拍摄系统的焦点位置位于远离标准粒子一侧时的标准粒子图像701如图7(a)所示那样，标准粒子的中心部分比背景区域亮。关于此时的浓度曲线704，粒子中心附近的浓度值最大，粒子的轮廓部分的浓度值最小，但在背景部分中，表示出比轮廓部分大但比粒子中心小的浓度值。相反，拍摄系统的焦点位置位于标准粒子前侧时的标准粒子图像703如图7(c)所示那样，中心部分没有注目的特征。此时的浓度曲线706如图示那样，整个粒子部分表示出小的浓度值，在粒子中心附近的浓度值和轮廓部分的浓度值中看不到变化。另一方面，在聚焦点位置的标准粒子图像702如图7(b)所示，粒子的中心部分具有亮的背景和暗的轮廓部分的中间的亮度。这时的浓度曲线705在中心附近的浓度值中可以看出特征。即，通过了标准粒子的中心的浓度曲线705在粒子中心部分取得中等程度的浓度值，在粒子轮廓部分显示出更小的浓度值，在背景区域中显示出比粒子中心部分的浓度值大的浓度值。

图8是表示求出在特征量计算处理步骤S602中计算的调焦用参数(中心浓度比)的详细步骤的图。另外，图9表示根据标准粒子的图像求出的通过标准粒子的中心的典型的浓度曲线。

在图8的步骤S801中，求出图9所示的浓度值Pd。浓度值Pd相当于各图像中的背景等级。在各图像中作成了浓度直方图时，作为具有最频值的浓度值来求出背景等级。

在步骤S802中，求出图9所示的浓度值bla。浓度值bla是表示标准粒子的对象区域的轮廓附近的浓度值，表示在对象区域中浓度值最小(暗)的值。作为整个对象区域中的最小浓度值，求出浓度值bla。

在步骤S803中，求出图9所示的浓度值cen。浓度值cen是对象区域的中心附近的浓度值，表示在对象区域中心部分浓度值最大(亮)的值。作为包含对象区域的中心像素的1或多个像素的最大浓度值来求出浓度值cen。另外，关于中心部分的像素数，根据使用的标准粒子的颗粒直径通过实验求出最优的像素数。另外，浓度值cen并不限于最大浓度值，也可以使用包含中心像素的1个或多个像素的平均浓度值。

在步骤S804中，根据浓度值pd、cen、bla，求出图9所示的值a(各图像中的背景等级与对象区域的轮廓附近的浓度值的差)和值b(各图像中的背景等级与对象区域的中心附近的浓度值的差)。具体地说，根据下式(1)、(2)计算出各值。

a＝Pd-bla    ……(1)

b＝Pd-cen    ……(2)

在步骤S805中，根据值a和b，根据下式(3)计算出调焦用参数(中心浓度比)。

调焦用参数＝b/a    ……(3)

调焦用参数可以使用上述中心浓度比以外的值。在此，作为中心浓度比以外的调焦用参数的例子，说明中心浓度差和中心浓度值。

图10是表示使用中心浓度差作为在特征量计算处理步骤S606中计算出的调焦用参数时的详细步骤的图。

在步骤S1001中，求出对象区域的轮廓附近的浓度值bla。求出的方法可以使用图8的步骤S802所示的方法。

在步骤S1002中，求出对象区域的中心附近的浓度值cen。求出的方法可以使用图8的步骤S803所示的方法。

在步骤S1003中，根据在步骤S1001中求出的浓度值bla和在步骤S1002中求出的浓度值cen，根据下式(4)计算调焦用参数(中心浓度差)。

调焦用参数＝cen-bla    ……(4)

图11是表示使用中心浓度值作为在特征量计算处理步骤S606中计算出的调焦用参时的详细步骤的图。

在步骤S1101中，求出各图像中的背景等级。求出的方法可以使用图8的步骤S801所示的方法。

在步骤S1102中，求出对象区域的中心附近的浓度值cen。求出的方法可以使用图8的步骤S803所示的方法。

在步骤S1103中，根据在步骤S1101中求出的浓度值Pd和在步骤S1102中求出的浓度值cen，根据下式(5)计算出调焦用参数(中心浓度值)。

调焦用参数＝Pd-cen    ……(5)

另外，中心浓度值并不限于(Pd-cen)，也可以使用cen的值本身。

另外，对于针对调焦用参数使用中心浓度比、中心浓度差、中心浓度值中的哪一个，可以根据安装在装置中的光学系统的特性选择最适于调焦的参数。

图12表示例如在图5所示的标准粒子试样505中使用颗粒直径10μm的标准粒子，根据使物镜503每次1μm地移动30点的情况下在设置在流动池中的各焦点位置拍摄到的图像计算出的调焦用参数(中心浓度比)值的例子。符号1201是在各焦点位置对根据得到的大约100张标准粒子图像计算出的调焦用参数的平均值进行描绘得到的。另外，所使用的标准粒子的颗粒直径可以与在流式粒子图像分析装置中成为对象的成分相配合，选择最适合的大小。另外，对于物镜的移动幅度，根据所使用的标准粒子的颗粒直径，预先通过实验确定最适合的幅度。在计算调焦用参数时，可以根据标准粒子的颜色特性和照相机的分光特性，选择使用灵敏度最高的颜色浓度值。关于在各焦点位置的标准粒子图像的收集张数，根据调焦用参数的波动、照相机的特性，预先通过实验求出最适合的张数。

如图12所示那样，焦点位置与调焦用参数的关系是广范围并且单调增加，聚焦点位置1202位于调焦用参数的最大值和最小值的大致中央的位置。例如在图12的例子时，在聚焦点位置的调焦用参数值(中心浓度比)为0.28。另外，关于聚焦点位置，根据所使用的标准粒子的颗粒直径和光学系统的特性，预先通过实验求出最适合的位置。在此，说明了使用中心浓度比作为调焦用参数的情况，但在使用中心浓度值、中心浓度值作为调焦用参数的情况下也一样，可以决定聚焦点位置的调焦用参数值。

图13是表示本发明的聚焦点调整方法的详细步骤的一个例子的图。

在步骤S1301中，使物镜移动到预先确定的初始位置。这可以在装置启动时自动地移动。

在步骤S1302中，计算在初始位置的调焦用参数平均值。

在步骤S1303中，使物镜例如移动1μm。预先通过实验设定移动幅度和移动方向。另外，使计数值n加1。

在步骤S1304中，计算移动后的位置的调焦用参数平均值。

在步骤S1305中，判断物镜的移动次数(n)是否达到了预先通过实验确定的次数。在满足n＝N的情况下，物镜移动了规定的次数，前进到步骤S1306。在不满足的情况下，返回到步骤S1303，直到满足步骤S1305为止，重复进行物镜的移动、各焦点位置的调焦用参数的平均值的计算。另外，对于N，根据标准粒子的颗粒直径、调焦用参数，预先求出最适合的次数。

在步骤S1306中，使物镜移动到在求出的各焦点位置的调焦用参数成为最接近P的值的焦点位置。P是预先通过实验确定的值，例如在图12的例子的情况下，是0.28。

另外，在步骤S1301中，也可以不将预先确定的初始位置作为初始位置，而是将装置启动时的位置作为初始位置。在该情况下，关于步骤S1303中的物镜的移动，根据在步骤S1302中求出的调焦用参数值位于预先求出的关系图例如图12的哪个边，来判断物镜的移动方向。

图14表示使用了近似式的聚焦点调整方法的详细步骤的一个例子。

在步骤S1401中，使物镜移动到预先确定的初始位置。也可以在装置启动时自动地移动。

在步骤S1402中，计算初始位置的调焦用参数平均值。

在步骤S1403中，使物镜例如移动3μm。预先通过实验设定移动幅度和移动方向。另外，使计数值n加1。

在步骤S1404中，计算移动后的位置的调焦用参数平均值。

在步骤S1405中，判断物镜的移动次数(n)是否达到了预先通过实验确定的次数。在满足n＝N的情况下，物镜移动了规定的次数，前进到步骤S1406。在不满足的情况下，返回到步骤S1403，直到满足步骤S1405为止，重复进行物镜的移动、各焦点位置的调焦用参数的平均值的计算。另外，对于N，根据标准粒子的颗粒直径、调焦用参数，预先求出最适合的次数。

在步骤S1406中，根据直到步骤S1405为止得到的多个不同的位置的焦点位置和调焦用参数值，计算近似式。例如可以使用sigmoid函数等公知的函数，求出近似式。

在步骤S1407中，使用在步骤S1406中求出的近似式，预测表示调焦用参数值P的聚焦点位置，移动物镜。P是预先通过实验确定的值，例如在图12的例子的情况下，是0.28。

另外，在图13和图14的例子中，通过使物镜移动，使拍摄系统的焦点位置在流动池中移动。但是，在将拍摄系统的焦点位置设定为流动池中的不同的多个位置时，也可以代替物镜的移动而使流动池移动。

图15是表示在将拍摄系统的焦点位置暂时调整为聚焦点位置后，检查聚焦点位置的偏离和样本液的流动的厚度的方法的详细步骤的图。由于图5所示的包围样本液的鞘液没有流过预定量，在鞘液的流动中存在不均等理由，有时样本的流动形状变得比设定值厚，因此希望定期地检查聚焦点的位置、样本液的流动的厚度。例如根据检测体个数、时间间隔等来确定检查间隔。

作为步骤，如上所述作为试样使标准粒子流动，在步骤S1501中，不使物镜移动而在当前的位置，根据1或多张图像，计算各标准粒子的调焦用参数。所使用的标准粒子的颗粒直径和调焦用参数的计算方法与聚焦点调整一样。

在步骤S1502中，将调焦用参数换算为焦点位置。换算使用在图14所示的步骤S1406中求出的近似式。另外，近似式也可以使用预先通过实验求出的近似式。

在步骤S1503中，作成求出的焦点位置的直方图。

在步骤S1504中，判断聚焦点位置是否没有偏离，样本液的流动的厚度是否正常。直方图的表示最频值的焦点位置＝D，在D是将拍摄系统的焦点位置调整到聚焦点位置时的焦点位置，并且满足K1≤焦点位置的波动≤K2的情况下，判断为聚焦点位置与样本液的流动的厚度正常，结束检查。在不满足的情况下，在步骤S1505中进行警告。在警告中，可以具体地显示聚焦点的偏离、样本液的流动的厚度不正常，也可以通过警告器进行通知。

关于焦点位置的波动，例如可以使用(a)直方图的表示最频值的半值的上侧的位置与下侧的位置的差(幅度)、(b)假设直方图依照正态分布，使用平均值±(x×∑)(x例如是1等预先确定的常数)的位置的上侧与下侧的位置的差(幅度)等。另外，可以预先使用样本液的流动的厚度正常时的直方图，通过实验求出K1和K2，也可以根据聚焦点调整后的聚焦点位置的直方图求出K1和K2。

图16例如表示样本液的流动的厚度正常，但聚焦点位置偏离时的直方图例子。符号1601表示聚焦点位置和样本液的流动的厚度正常时的直方图。符号1602表示某装置状态下的直方图。根据图可知，符号1602为表示最频值的焦点位置从符号1601时的D偏离。另外，根据该偏离显示在+侧，可以判断出聚焦点位置偏离到+侧。关于样本液的流动的厚度，例如表示直方图的半值的焦点位置的上侧与下侧的差是与正常的符号1601时大致相同的程度，因此可以判断样本液的流动的厚度正常。

图17例如表示聚焦点位置正常，但样本液的流动的厚度变厚时的直方图例子。符号1701表示聚焦点位置和样本液的流动的厚度正常时的直方图。符号1702表示某装置状态下的直方图。符号1702的表示直方图的最频值的焦点位置与符号1701一样是D，因此可以判断聚焦点位置正常。关于样本液的流动的厚度，例如表示直方图的半值的焦点位置的上侧与下侧的差与符号1701相比，符号1702一方变大，因此可以判断样本液的流动的厚度变厚。

根据使用了本发明的调焦用参数的聚焦点调整方法，能够使用各种大小的标准粒子进行聚焦点调整。另外，如果使用本发明的调焦用参数，则参数与焦点位置的关系为广范围并且单调增加(或减少)，因此，能够容易地预测装置启动时的焦点状态，能够有效地进行调焦。并且，通过根据焦点位置与调焦用参数的关系，求出近似函数，能够容易地预测聚焦点位置，因此能够有效地进行调焦。

如果使用本发明的调焦用参数，则能够将参数换算为焦点位置，因此能够正确地掌握装置的聚焦点位置。另外，在聚焦点位置偏离的情况下，能够正确地掌握向哪个方向偏离。并且，如果利用使用本发明的调焦用参数的样本液的流动的厚度检查方法，则能够将参数换算为焦点位置，因此能够高精度地检查样本液的流动的厚度。

实施例2

图18是说明本发明的流式粒子图像分析装置的聚焦点调整、以及进行聚焦点位置和样本液的流动的厚度检查的装置的结构例子的图。

在进行聚焦点调整的情况下，将在多个焦点位置通过照相机等图像输入单元1802拍摄到的标准粒子图像转送到存储器1801。

标准粒子图像被转送到图像处理单元1803，进行区域分割和特征量(面积、调焦用参数等)的计算。区域分割方法、特征量计算方法可以使用实施例1所示的方法。区域分割后的对象区域图像和特征量被转送到存储器1801。

针对每个焦点位置，把根据作为特征量之一的面积判断为单一的标准粒子的区域的调焦用参数转送到调焦用参数平均值计算单元1804，计算平均值。把计算出的各焦点位置的调焦用参数平均值转送到存储器1801。作为调焦用参数，可以使用实施例1中说明了的中心浓度比、中心浓度差、中心浓度值等。

把在各焦点位置计算出的调焦用参数的平均值转送到聚焦点判断单元1805，判断哪个焦点位置是聚焦点。判断方法可以使用实施例1所示的方法。把判断出的聚焦点位置转送到存储器1801。

把各焦点位置的调焦用参数的平均值转送到近似式计算单元1806，计算调焦用参数与焦点位置的关系的近似式。计算出的近似式被转送到存储器1801。近似式的求取方法可以使用实施例1所示的方法。

在聚焦点调整完成的状态下，检查聚焦点位置的偏离和样本液的流动的厚度时，把照相机等图像输入单元1802拍摄到的标准粒子图像转送到存储器1801。

把标准粒子图像转送到图像处理单元1803，计算区域分割和特征量(面积、调焦用参数等)。区域分割方法、特征量计算方法可以使用实施例1所示的方法。区域分割后的对象区域图像和特征量被转送到存储器1801。

根据作为特征量之一的面积判断为单一的标准粒子的区域的调焦用参数被转送到向焦点位置的换算单元1807。换算方法可以使用实施例1所示的方法。换算后的焦点位置被转送到存储器1801。

换算后的焦点位置被转送到聚焦点判断单元1805、样本液的流动的厚度判断单元1808，判断聚焦点位置是否正常、样本液的流动的厚度是否正常。判断方法可以使用实施例1所示的方法。判断结果被转送到存储器1801。

根据本发明的装置结构，能够高精度、高效率地使用各种颗粒直径的标准粒子进行聚焦点调整。另外，能够高精度地检查聚焦点的偏离和样本液的流动的厚度。

符号说明

401：测定装置本体；402：染色液添加装置；403：图像输入装置；404：显示器；405：键盘；406：图像处理装置；501：流动池；502：脉冲灯；503：物镜；504：照相机；505：试样；506：焦点机构；507：臂；508：进给螺钉；509：电动机。

Claims (10)

1.一种流式粒子图像分析方法，其对拍摄被鞘液包围而流动的样本液所得到的粒子图像进行分析，使包含由均匀的物质构成的球状的标准粒子的样本液在流动池中流动，通过包含物镜的拍摄部对上述标准粒子进行拍摄，取得静止图像，所述流式粒子图像分析方法的特征在于，

具有：

根据上述静止图像，作为粒子图像特征参数值，计算粒子图像的中心附近的浓度值与轮廓附近的浓度值的比、或者粒子图像的中心附近的浓度值与轮廓附近的浓度值的差的步骤；以及

根据上述参数值，进行上述拍摄部的调焦的步骤。

2.根据权利要求1所述的流式粒子图像分析方法，其特征在于，

还具有：

通过使上述物镜或上述流动池移动，在设定在上述流动池中的多个不同的焦点位置取得多个静止图像的步骤；以及

对于上述多个不同的焦点位置中的每个焦点位置，根据在该焦点位置取得的静止图像，计算平均参数值的步骤，

根据上述平均参数值进行上述调焦。

3.根据权利要求2所述的流式粒子图像分析方法，其特征在于，

通过函数对上述多个焦点位置与上述平均参数值的关系进行近似，使用该函数进行上述调焦。

4.一种流式粒子图像分析方法，其对拍摄被鞘液包围而流动的样本液所得到的粒子图像进行分析，使包含由均匀的物质构成的球状的标准粒子的样本液在流动池中流动，在拍摄部对上述标准粒子进行拍摄，取得静止图像，所述流式粒子图像分析方法的特征在于，

具有：

根据上述静止图像，作为粒子图像特征参数值，计算粒子图像的中心附近的浓度值与轮廓附近的浓度值的比、或者粒子图像的中心附近的浓度值与轮廓附近的浓度值的差的步骤；

将上述参数值换算为上述拍摄部的焦点位置的步骤；以及

根据上述焦点位置，取得聚焦点位置的信息的步骤。

5.根据权利要求4所述的流式粒子图像分析方法，其特征在于，

根据对上述焦点位置与上述参数值的关系进行近似的函数，取得上述焦点位置信息。

6.一种流式粒子图像分析方法，其对拍摄被鞘液包围而流动的样本液所得到的粒子图像进行分析，使包含由均匀的物质构成的球状的标准粒子的样本液在流动池中流动，在拍摄部对上述标准粒子进行拍摄，取得静止图像，所述流式粒子图像分析方法的特征在于，

具有：

从上述静止图像中抽出表示上述拍摄部的焦点位置的粒子图像特征参数值的步骤；

将上述参数值换算为焦点位置的步骤；以及

根据上述换算后的焦点位置的波动，取得样本液的厚度信息的步骤，

作为上述粒子图像特征参数值，使用粒子图像的中心附近的浓度值与轮廓附近的浓度值的比、或者粒子图像的中心附近的浓度值与轮廓附近的浓度值的差。

7.根据权利要求6所述的流式粒子图像分析方法，其特征在于，

通过函数对上述焦点位置与上述参数值的关系进行近似，根据上述函数将上述参数值换算为上述焦点位置。

8.一种流式粒子图像分析装置，具有：

通过鞘液包住样本液使样本液流动的流动池；

对上述流动池进行照射的脉冲光源；

具有物镜的拍摄部；

使上述流动池和上述物镜之间的距离可变的驱动单元；

使包含由均匀的物质构成的球状的标准粒子的样本液在上述流动池中流动，在拍摄部中对上述标准粒子进行拍摄，取得静止图像的单元，所述流式粒子图像分析装置的特征在于，具有：

根据上述静止图像，作为粒子图像特征参数值，计算粒子图像的中心附近的浓度值与轮廓附近的浓度值的比、或者粒子图像的中心附近的浓度值与轮廓附近的浓度值的差的单元；

根据上述参数值，通过上述驱动单元使上述流动池与上述物镜之间的距离可变，来进行上述拍摄部的调焦的单元。

9.一种流式粒子图像分析装置，具有：

通过鞘液包住样本液使样本液流动的流动池；

对上述流动池进行照射的脉冲光源；

具有物镜的拍摄部；

使上述流动池和上述物镜之间的距离可变的驱动单元；

使包含由均匀的物质构成的球状的标准粒子的样本液在上述流动池中流动，在拍摄部中对上述标准粒子进行拍摄，取得静止图像的单元，所述流式粒子图像分析装置的特征在于，具有：

根据上述静止图像，作为粒子图像特征参数值计算粒子图像的中心附近的浓度值与轮廓附近的浓度值的比、或者粒子图像的中心附近的浓度值与轮廓附近的浓度值的差的单元；

将上述参数值换算为上述拍摄部的焦点位置的单元；以及

根据上述焦点位置取得聚焦点位置的信息的单元。

10.一种流式粒子图像分析装置，具有：

通过鞘液包住样本液使样本液流动的流动池；

对上述流动池进行照射的脉冲光源；

具有物镜的拍摄部；

使上述流动池和上述物镜之间的距离可变的驱动单元；

使包含由均匀的物质构成的球状的标准粒子的样本液在上述流动池中流动，在拍摄部中对上述标准粒子进行拍摄，取得静止图像的单元，所述流式粒子图像分析装置的特征在于，具有：

从上述静止图像中抽出表示上述拍摄部的焦点位置的粒子图像特征参数值的单元；

将上述参数值换算为焦点位置的单元；以及

根据上述焦点位置的波动，取得样本液的厚度信息的单元，

作为上述粒子图像特征参数值，使用粒子图像的中心附近的浓度值与轮廓附近的浓度值的比、或者粒子图像的中心附近的浓度值与轮廓附近的浓度值的差。