CN102430116A

CN102430116A - 用于人凝血因子ⅷ制剂的干热处理方法及其稳定剂

Info

Publication number: CN102430116A
Application number: CN2011102402782A
Authority: CN
Inventors: 阎晨; 熊可强
Original assignee: Shanghai Xinxing Medicine Co ltd
Current assignee: Shanghai Xinxing Medicine Co ltd
Priority date: 2011-08-19
Filing date: 2011-08-19
Publication date: 2012-05-02

Abstract

本发明公开了一种用于人凝血因子VIII制剂的干热处理方法，在冻干步骤前，在所述的人凝血因子VIII溶液中加入所述稳定剂，其中所述稳定剂包括人血白蛋白、Ca²⁺可溶解盐、氨基酸、柠檬酸三钠和氯化钠，其中所述的人血白蛋白浓度百分比为0.5％-5％，Ca²⁺浓度为1mmol/L。本发明还公开了一种用于人凝血因子VIII制剂的干热处理稳定剂。本发明选择在80℃，72小时下干热处理，对脂包膜和非脂包膜病毒都有效，且干热处理往往是最后的步骤，成本较低，可操作性和可控制性较强。

Description

用于人凝血因子Ⅷ制剂的干热处理方法及其稳定剂

技术领域

本发明涉及医药技术领域，更具体的，本发明涉及一种可防止人凝血因子VIII制剂在80℃，72h干热灭活过程中，一种用于人凝血因子VIII制剂的干热处理方法和干热处理稳定剂。

背景技术

人凝血因子VIII(Human Coagulation Factor VIII)称“抗血友病球蛋白”，是体内内源性凝血系统的重要成分之一。因子VIII和因子IXa、磷脂和钙离子形成复合物，在因子X的激活过程中起辅因子作用。人凝血因子VIII制剂是防治甲型血友病人出血的特效血液制剂。由于血液制品的特殊性，容易携带艾滋病、甲肝、乙肝等病毒，如果病毒灭活不彻底，那么很容易造成病人的感染，因此病毒灭活是生产人凝血因子VIII的一个关键步骤。

目前报道现在巴氏灭活、S/D病毒灭活法、干热灭活法等多种病毒灭活方法都已应用于人凝血因子VIII因子浓制剂的生产过程中，如：德国Centeon Pharma GmbH公司的产品Humate-P即采用的巴氏灭活。在上述病毒灭活方法中，S/D病毒灭活方法反应条件相对比较温和，不会造成人凝血因子VIII的效价损失，但是其作用原理限制了它只能作为脂包膜病毒的灭活，仅用S/D法处理的凝血因子制品仍有传播甲肝、B19等非脂包膜病毒的可能。目前常用的巴氏灭活法在内的温度灭活法相对较为可靠，尤其是干热灭活比较稳定。

专利号为CN1181974公开一种低糖分，稳定的，不含白蛋的一种重组体凝血因子制剂。但此重组体凝血因子制剂不含有人血白蛋白的rFVIII(重组人凝血因子VIII)的稳定剂，此重组人凝血因子VIII不采用干热病毒灭活工艺。

但是，在干热灭活过程中发现在没有稳定剂的情况下，人凝血因子VIII效价损失十分严重，最多可能会造成50％的效价损失。这不仅造成了大量的经济损失，同时也增加了生产成本，因此改变人凝血因子VIII的配方，降低效价损失是十分必要的。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明目的在于克服或改善现有的问题，本发明提供了一种人凝血因子VIII制剂的干热处理的稳定剂。

为实现上述目的，本发明技术方案为：

一种用于人凝血因子VIII制剂的干热处理方法，其特征在于，在冻干步骤前，在所述的人凝血因子VIII溶液中加入所述稳定剂，其中所述稳定剂包括人血白蛋白、Ca²⁺可溶解盐、氨基酸、柠檬酸三钠和氯化钠，其中所述的人血白蛋白浓度百分比为0.5％-5％，Ca²⁺浓度为1mmol/L。

本发明的另一方面，所述的人血白蛋白浓度百分比为0.5％-2％。

本发明的另一方面，所述的氨基酸为甘氨酸、赖氨酸或其盐。

本发明的另一方面，在冻干步骤前，在所述的人凝血因子VIII溶液中，加入所述的稳定剂含有0.1-10％的甘氨酸。

本发明的另一方面，在冻干步骤前，在所述的人凝血因子VIII溶液中，加入所述的氯化钠含量为0.01mmol/L-0.1mmol/L。

本发明的另一方面，所述方法为80℃，72小时条件下干热灭活。

本发明的另一实施方式，所述的稳定剂包括人血白蛋白、Ca²⁺可溶解盐、氨基酸、柠檬酸三钠和氯化钠，其中所述的人血白蛋白浓度百分比为0.5％-5％，Ca²⁺浓度为1mmol/L。

本发明的另一方面，所述的氨基酸为甘氨酸、赖氨酸或其盐类，所述的稳定剂含有0.1-10％的甘氨酸。

本发明的另一实施方式，一种干热处理稳定剂在人凝血因子VIII制剂中的应用。

人凝血因子VIII是一种用健康人血浆为原料的血液制品，需采用干热病毒灭活工艺灭活可能存在的病毒。

本发明的有益效果为：

本发明提供的稳定剂使制剂在80℃，72小时干热处理的过程中，人凝血因子VIII的损失减少，活性回收率可提高5％-50％。在人凝血因子VIII制剂中加入以上所述稳定剂，既能达到病毒灭活的效果，又能减少凝血因子VIII的活性损失。

本发明选择在80℃72小时下干热处理，对脂包膜和非脂包膜病毒都有效，且干热处理往往是最后的步骤，成本较低，可操作性和可控制性较强。

具体实施方式

下面结合实例对本发明稳定剂对人凝血因子VIII制剂在80℃，72小时干热灭活过程中的保护作用做详细的说明。

实施例1：加入稳定剂后病毒灭活验证

(1)人凝血因子VIII的制备

0-4℃下离心血浆得到冷沉淀，溶解冷沉淀，经过酸沉淀及澄清过滤，加入S/D溶液至tween80终浓度1％，TNBP 0.3％，24-26℃下保温6小时，然后经过柱层析得到含有人凝血因子VIII的蛋白溶液，所得洗脱液用含有0.01-0.1MNaCl，0.01M柠檬酸三钠，0.1％-0.349％赖氨酸盐酸盐，0.1％-10％甘氨酸的透析液进行超滤脱盐透析，得到人凝血因子VIII的浓缩液。

(2)加入稳定剂，制备人凝血因子VIII冻干剂

在浓缩液中加入20％人血白蛋白至溶液中浓度为2％，加CaCl₂至Ca²⁺浓度至1mmol/L。除菌，分装，冻干后经过80℃/72小时病毒干热灭活即为成品。冷冻干燥前。

(3)病毒灭活

分别取三批人凝血因子VIII进行病毒灭活实验，三批人凝血因子VIII病毒灭活实验结果如下：

表1人凝血因子VIII80℃72小时病毒灭活结果

由表1可以看出，经过80℃72小时病毒灭活后，加入稳定剂的人凝血因子VIII制剂完全符合《中国药典》的要求，说明加入稳定剂后的干热病毒灭活处理是有效的。

实施例2：人凝血因子VIII稳定剂对80℃72小时干热灭活中制剂的影响

在制备人凝血因子VIII浓缩液时，透析液分别用0.9％甘氨酸以及所制作的稳定剂作为透析液进行浓缩透析，观察稳定剂对冻干和干热灭活中的人凝血因子VIII制剂的保护作用，冻干后和干热灭活后效价回收率如下：

表2人凝血因子VIII稳定剂保护实验结果

由表2可以看出，在不加入稳定剂，只含有赋形剂0.9％甘氨酸的情况下，效价损失高达40％-50％，在加入稳定剂后，效价损失率高于90％。

实施例3：透析液中人血白蛋白及Ca²⁺对人凝血因子VIII的保护作用。

1.按常规方法制备人凝血因子VIII，除CaCl₂和人血白蛋白外，按标准加入稳定剂，制备人凝血因子VIII制剂浓缩液。

2.观察复溶后样品澄清度及人凝血因子VIII的活性回收率

将上述方法制备的浓缩液，按下表加入稳定剂的人凝血因子VIII进行冻干，80℃72小时实验，观察后的溶液的澄清度，并检测效价，观察保护剂对病毒灭活中的人凝血因子VIII的影响。结果见表3。

表3：人凝血因子VIII不同配方最终溶解液的研究结果

从表3可以看出，以含人白和氯化钙成份的溶解液二次病毒灭活前后复溶效果较好(外观好，效价稳定)。其中以2％人血白蛋白，1mmol/L氯化钙配方得到的人凝血因子VIII制剂外观和效价最为理想。

实施例4：NaCl对凝血因子VIII制剂的保护实验

按常规方法，得到含有高浓度NaCl溶液的洗脱液。将透析液中的NaCl浓度分别设定为0，25mmol/L，50mmol/L，100mmol/L NaCl，分别浓缩透析至透析液NaCl浓度。除菌，分装，冻干，经过80℃72小时干热病毒灭活。根据质检规程复溶，测定效价，观察外观，结果见表4。

表4不同浓度NaCl对人凝血因子VIII干热灭活的影响

由上表可以看出，在不加入氯化钠时，干热的损失达到25％-30％，随着氯化钠浓度的不断增加，虽然对外观有一定的影响，但并不会造成产品不符合制检规程，同时效价的损失逐步的减少。由于制检规程限定Na⁺浓度不超过160mmol/L，因此NaCl的终浓度为100mmol/L。

实施例5：甘氨酸浓度对凝血因子VIII的保护实验

按常规方法，得到含有高浓度NaCl溶液的洗脱液。将透析液中的甘氨酸浓度分别设定为0.3％，0.6％，0.9％，1.2％，1.5％，2％。分别浓缩透析至透析液浓度。除菌，分装，冻干，经过80℃72小时干热病毒灭活。根据质检规程复溶，测定效价，观察外观，结果见表5。

表5不同浓度甘氨酸对人凝血因子VIII干热灭活的影响

甘氨酸作为一种赋形剂，其浓度对人凝血因子VIII的外观有一定的影响。分别进行了各种浓度的实验。通过表5可以发现，甘氨酸的加入可以改善人凝血因子VIII的外观，但对效价并没有明显的保护作用，因此采用了缓冲体系中的0.9％甘氨酸作为透析液的浓度。

综上所述，本发明为人凝血因子VIII的干热处理提供了有效的稳定剂。

至此已结合实施例对本发明进行了描述。熟悉本领域的人员应当理解，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，可以容易地对所述实施例作出各种其它修改。因此，附属权利要求的范围并不限于上述说明，而是要广义地解释权利要求。

Claims

1.一种用于人凝血因子VIII制剂的干热处理方法，其特征在于：在冻干步骤前，在所述的人凝血因子VIII溶液中加入所述稳定剂，其中所述稳定剂包括人血白蛋白、Ca²⁺可溶解盐、氨基酸、柠檬酸三钠和氯化钠，其中所述的人血白蛋白浓度百分比为0.5％-5％，Ca²⁺浓度为1mmol/L。

2.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于：所述的人血白蛋白浓度百分比为0.5％-2％。

3.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于：所述的氨基酸为甘氨酸、赖氨酸或其盐类。

4.根据权利要求3中所述的方法，其特征在于：在冻干步骤前，在所述的人凝血因子VIII溶液中，加入所述的稳定剂含有0.1-10％的甘氨酸。

5.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于：在冻干步骤前，在所述的人凝血因子VIII溶液中，加入所述的氯化钠含量为0.01mmol/L-0.1mmol/L。

6.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于：所述方法是在80℃，72小时条件下干热灭活。

7.一种用于人凝血因子VIII制剂的干热处理稳定剂，其特征在于：所述的稳定剂包括人血白蛋白、Ca²⁺可溶解盐、氨基酸、柠檬酸三钠和氯化钠，其中所述的人血白蛋白浓度百分比为0.5％-5％，Ca²⁺浓度为1mmol/L。

8.根据权利要求7中所述的稳定剂，其特征在于：所述的人血白蛋白浓度百分比为0.5％-2％。

9.根据权利要求7中所述的稳定剂，其特征在于：所述的氨基酸为甘氨酸、赖氨酸或其盐类，所述的稳定剂含有0.1-10％的甘氨酸。

10.根据权利要求7-9中任一所述的干热处理稳定剂在人凝血因子VIII制剂中的应用。