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CN102239409A - 用于及时护理分析仪的基于微流的实验室测试卡 - Google Patents

用于及时护理分析仪的基于微流的实验室测试卡 Download PDF

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CN102239409A
CN102239409A CN2009801485115A CN200980148511A CN102239409A CN 102239409 A CN102239409 A CN 102239409A CN 2009801485115 A CN2009801485115 A CN 2009801485115A CN 200980148511 A CN200980148511 A CN 200980148511A CN 102239409 A CN102239409 A CN 102239409A
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CN
China
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chamber
sample
salt bridge
channel
control electrode
Prior art date
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Pending
Application number
CN2009801485115A
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English (en)
Inventor
萨妮·帕克·金姆
申英植
刘长庚
罗里·凯利
贝琪·陈
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
NANOIVD Inc
Original Assignee
NANOIVD Inc
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Abstract

描述了基于微流的实验室测试卡。所述测试卡用于及时护理(POC)分析仪。所述测试卡被设计为接收样品并然后使用所述POC分析仪定量或计数所述样品中的特定物质。所述测试卡可以由多个层构成。在一个实施方案中，所述测试卡包括具有过滤表面的初级分离室、捕获通道和粒子检测器。所述测试卡还可以包括纳米线传感器。

Description

用于及时护理分析仪的基于微流的实验室测试卡
发明人：萨妮·帕克·金姆、申英植、刘长庚、罗里·凯利和贝琪·陈
相关申请的交叉引用
本申请要求2008年12月5日提交的题目为“INTEGRATEDSEMICONDUCTOR-NANOSENSOR ANALYSIS SYSTEM(集成半导体-纳米传感器分析系统)”的美国临时专利申请系列第61/120,253号的权益。
背景
在诸如血液、尿和其他体液的生物样品中的抗体、蛋白、肽、核酸、适体和某些细胞类型的细胞受体或物质的检测被用于诊断疾病、估计治疗功效和许多其他目的。在当前的诊断测定需要患者拜访医师或出行到实验室时，及时护理测定可由初级护理医师在他们的办公室进行、或由患者在其家中进行以及由保健工作者在远程地理场所进行或对卧床的患者在医院中进行。
微流技术已被应用于解决一些常规实验室技术缺点的尝试中。例如，微流技术需要明显较少量的试剂。然而，微流技术通常能够处理明显较少体积的生物样品，这可能会在待检测的特定细胞或物质的量是极为稀少或微小的量时限制灵敏度。
需要的是便宜并且不需大量劳动的用于检测生物样品中特定物质的系统和方法。
需要的是能够在及时护理时得到快速结果的用于检测生物样品中的特定物质的系统和方法。
需要的是极为灵敏的用于检测生物样品中特定物质的系统和方法。
附图简述
图1A-1B显示适合用于测试卡的及时护理(POC)分析仪的一个实施方案。
图2A-2B显示测试卡的一个实施方案的装配图和分解图。
图3A显示初级分离室的放大图。
图3B显示孔的放大图。
图4A-4B显示捕获通道238的一个实施方案的透视图和剖面图。
图5A-5B显示粒子检测器的一个实施方案的放大图。
图5C显示粒子检测器的另一个实施方案的放大图。
图6A-6B显示测试卡的另一个实施方案的装配图和分解图。
图7A-7B显示测试卡的另一个实施方案的装配图和分解图。
图8A-8B分别显示初级分离层的顶侧和底侧的放大图。
图9A显示纳米线传感器的一个实施方案的放大图。
图9B显示纳米线传感器的示意性响应。
图9C显示肽核酸(PNA)和巯基乙醇的混合的自装配单层(SAM)的示意性代表图。
优选实施方案详述
图1A-1B显示适合用于测试卡200的及时护理(POC)分析仪100的一个实施方案。POC分析仪100包括卡槽112、显示器114和控制器116。卡槽112被为构造为接收测试卡200。显示器114显示POC分析仪100的状态和测试结果。控制器116打开和关闭POC分析仪100、开始和停止测试并改变显示器114。
POC分析仪100包括用于对测试卡200施加压力的压力装置，例如注射器、蠕动泵或任何其他合适的泵。POC分析仪100还包括电接触件，其被构造为与测试卡200上的相应的电接触件匹配。
测试卡200被设计为接收样品，并然后使用POC分析仪100定量或计数样品中的特定物质。样品可以是全血、血浆、血清、细针抽吸物(fine needleaspirate)、骨髓样品、脊髓液、囊内液、关节液或滑液、子宫内膜抽吸样品、胃样品、眼内液、卵巢液、组织培养介质、尿或其他生物样品或非生物样品。
在一个实施方案中，测试卡200被构造为接收全血样品并提供样品中循环肿瘤细胞(CTC)数目的近似计数。在同一实施方案中或其他实施方案中，测试卡200可用于提供样品中缺少CD45、CD14、CD33、CD16、CD24、CD64或CD15细胞表面标志物中任一种的白细胞数目的近似计数。在同一实施方案或其他的实施方案中，测试卡200可用于提供具有如下的特异性表面标志物的细胞的近似计数：例如，癌细胞的表皮生长因子受体(EGFR)扩增、癌干细胞的CD133或抗原特异性的T细胞受体。
测试卡200可以由塑料、玻璃或任何其他合适的材料制备。测试卡200可以由一个或多个层构成。所述层可以使用环氧树脂、热粘合或任何其他合适的方法和/或材料被连接在一起。测试卡200可以具有大约70mm x 55mm x 5mm的尺度。测试卡200可以与缓冲液源(buffer supply)一起包装，并且可以具有电接触件，该电接触件被排列为有利于访问。
图2A-2B显示测试卡200的一个实施方案的装配图和分解图。测试卡200适于接收全血样品并提供CTC的近似计数。测试卡200由一叠层构成，包括顶层210、粒子检测层220、初级分离层230和废物收集层260。依据制造和成本的考虑，这些层的功能性可以被组合或分成更少的层或更多的层。
初级分离层230包括样品入口231。样品入口231能够接收大约0.01ml至10ml的大样品。样品入口231具有将阻塞机会最小化的尺寸。样品入口231可以具有大约0.5mm至10mm，并且优选大约5mm的直径。样品入口231可以穿过顶层210和粒子检测层220到达初级分离层230。
初级分离层230还包括与样品入口231流体连通的初级分离室235。初级分离层230可以还包括与初级分离室235流体连通的捕获通道238。图3A显示初级分离室235的放大图。初级分离室235包括过滤表面236。过滤表面236包括多个合适尺寸的孔237。对于检测全血中的CTC，孔237具有阻止CTC和较大的白细胞穿过，同时容许较小的白细胞、红细胞、血小板、血浆和其他血液组分穿过的尺寸，或者具有大约1μm至30μm，并且优选大约16μm的直径。对于诸如检测癌细胞抗原、核酸、抗体、免疫球蛋白、其他生物标志物和微生物的其他应用，孔237可以具有大约1μm的直径。过滤表面236可以具有大于50％的孔隙率。孔隙率是指过滤表面236由孔237构成的部分或百分比。图3B显示孔237的放大图。孔237可以按六边形、矩形或任何其他合适的形式排列。孔237可以是圆的、六边形的或任何其他合适的形状。孔237可以具有统一尺寸或不同尺寸。过滤表面236可以是大约6mm长×6mm宽，并且可以包括大约100,000个孔。
样品入口231位于过滤表面236上方。样品入口231引导全血样品从上述过滤表面236进入初级分离室235，并使样品以基本上垂直于过滤表面236的方向流动。这具有增加流速并降低测试时间的作用。
初级分离层230还包括与初级分离室235流体连通的缓冲液入口232。缓冲液入口232可以穿过顶层210和粒子检测层220到达初级分离层230。缓冲液入口232可以与POC分析仪100中的压力装置流体连通。缓冲液入口232引导缓冲液以基本上平行于过滤表面236的方向进入初级分离室235以产生横过过滤层236并流向捕获通道238的“清扫”作用。缓冲液入口232可以首先将缓冲液引入缓冲液槽233，该缓冲液槽233横过过滤表面236的基本上整个侧面延伸。缓冲液填充缓冲液槽233，并然后溢流到过滤表面236上。缓冲液槽233可以具有顶，该顶位于与过滤表面236大致相同的水平。可选择地，缓冲液入口232可以包括缓冲液扩散器，该缓冲液扩散器将缓冲液横过过滤表面236的基本上整个侧面铺散开。缓冲液入口232引导缓冲液横过过滤表面236并在缓冲液由缓冲液入口232流向捕获通道238时导致过滤表面236的清扫。
过滤表面236可以作为初级分离层230的一部分形成，或者可以被单独制造，然后连接至初级分离层230。过滤表面236可以通过注射模铸、微石板印刷术、诸如光成像、湿刻和干刻的微细加工技术、诸如辐射“拉开”的基于辐射的加工和激光烧蚀制造。“湿刻”一般是指通过与液体元件接触进行蚀刻。“干刻”一般是指通过与气体或等离子体接触进行蚀刻。对于激光烧蚀，每个脉冲的激光移除一小部分的聚合材料。同步加速器传递高度定向的X射线辐射，该高度定向的X射线辐射可用于解开或“拉开”诸如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)的丙烯酸材料的聚合物主链。使用这个概念，聚合物膜的暴露区域可以通过离子化辐射被“拉开”并随后通过溶剂浴洗印掉，所述聚合物膜的暴露区域通过具有界定期望图式的吸收和发射部分的X射线掩模界定。
对于计数CTC，灵敏度对应于样品体积，因为，每体积的CTC数目极小。测试卡200能够过滤具有多达10ml或更大体积的血液样品。这个样品尺寸可以比通常在微流装置中所出现的样品尺寸大10倍。因此，这种大的样品尺寸导致可能高10倍的灵敏度。
图4A-4B显示捕获通道238的一个实施方案的透视图和剖面图。捕获通道238包括用结合剂处理的壁，所述结合剂选择性地结合样品中被特异性靶向的组分。在一个实施方案中，捕获通道238具有用与白细胞结合的CD45抗体处理的壁。在其他实施方案中，捕获通道238具有用可以选择性地结合不想要的组分的抗体、适体、肽和/或小分子处理的壁。捕获通道238宽至足以使白细胞或其他血液组分239结合捕获通道238的壁时不会阻塞。捕获通道238可以具有大约20μm至1000μm，并且优选大约400μm的宽度。捕获通道238还长至足以增强白细胞或其他血液组分的捕获。捕获通道238可以具有大约0.1cm至10cm并且优选大约5cm的总路径长度。捕获通道238刻画了增强白细胞或其他血液组分的捕获的曲折路径。在显示的实施方案中，捕获通道238刻画了具有几个大约90度的转弯的螺旋样路径，这使得白细胞或其他血液组分与壁接触。这些转弯还在粒子从其流动的直径碰撞壁和与其他粒子碰撞时产生紊流，从而引起与壁接触的频率增加。捕获通道238可以具有正方形、矩形、三角形或任何其他合适的形状的横截面形状。
粒子检测器层220包括与捕获通道238流体连通的粒子检测器300。粒子检测器300能够定量粒子物质的量或计数样品中细胞的数目。粒子检测器300可以是基于琼脂的盐桥阻抗传感器、DADMAC盐桥阻抗传感器或任何其他合适的传感器。
图5A-5B显示粒子检测器300的一个实施方案的放大图。粒子检测器300是盐桥阻抗传感器，具体地是基于琼脂的盐桥阻抗传感器。粒子检测器300包括传感器入口301，该传感器入口301接收来自捕获通道238的样品并将其导向主流通道302。主流通道302可以具有大约0.05mm至0.5mm，并且优选大约0.1mm的宽度。粒子检测器300还可以包括缓冲液贮器303和在主流通道302的两侧引入缓冲液的缓冲液引入通道304和305。缓冲液引入通道304和305将样品流体动力学地集中在主流通道302的中心。这将样品中的细胞或粒子以基本上单线排列。可选择地，可使用单缓冲液引入通道将样品流体动力学地集中在主流通道302的一侧。
粒子检测器300还包括盐桥室311和312，盐桥室311和312容纳琼脂并经由连接通道313和314偶联至主流通道302。连接通道313和314可以具有大约0.001mm至0.05mm的宽度和大约0.01mm至0.2mm的长度并且，优选大约0.01mm宽且0.1mm长。电解液入口315和316容纳电解液并且与盐桥室311和312流体连通。电解液入口315和316与电极325和326偶联。电极325和326穿过顶层210并可以与POC分析仪100电偶联。电极325和326可以由Ag/AgCl或任何其他合适的材料制成。与主流通道302流体连通的收集室319在末端收集样品。
粒子检测器300可以包括有利于盐桥室311和312制造的琼脂入口317和318。盐桥室311和312可以通过用大约2-10％琼脂和1M KCl(重量/体积(weight by volume))的琼脂混合物填充琼脂入口317和318来制造。将这种琼脂混合物加热直至琼脂完全溶解。在琼脂混合物变澄清时，其可使用，并在可使用时立即将其引入琼脂入口317和318。可以通过毛细管力或正压将琼脂混合物引入琼脂入口317和318。琼脂混合物将首先填充琼脂入口317和318以及盐桥室311和312。连接通道313和314很窄并且高的流动阻力将阻止琼脂混合物流入主流通道302。连接通道313和314的尺寸由于所使用的小体积而容许琼脂或其他聚合物在通道中更一致地填充。这使得如果像在较大的连接通道的情况下那样在填充较多聚合物时具有差异性聚合的盐桥的可能性较小。这可以导致测试结果更高的再现性。一旦用琼脂混合物装填盐桥室311和312，便可以停止流动。可以将粒子检测器300储存在室温下直至琼脂混合物冷却并凝固。粒子检测器300可以在此时将1M KCl溶液引入电解液入口315和316后使用。基于琼脂的盐桥传感器的制造不需要光刻。基于琼脂的盐桥传感器的制造与大范围的材料相容，包括软材料，例如聚二甲基硅氧烷(PDMS)。基于琼脂的盐桥传感器的制造不需要作为光敏引发剂的UV和交联剂。
图5C显示粒子检测器300的另一个实施方案的放大图。粒子检测器300是盐桥阻抗传感器，具体地是二烯丙基二甲基氯化铵(DADMAC)盐桥阻抗传感器。粒子检测器300包括传感器入口301，该传感器入口301接收来自捕获通道238的样品并将其导向主流通道302。主流通道302可以具有大约0.05mm至0.5mm，并且优选大约0.1mm的宽度。粒子检测器300还可以包括缓冲液贮器303和在主流通道302的两侧引入缓冲液的缓冲液引入通道304和305。缓冲液引入通道304和305将样品流体动力学地集中在主流通道302的中心。这将样品中的细胞以基本上单线排列。可选择地，可使用单缓冲液引入通道将样品流体动力学地集中在主流通道302的一侧。
粒子检测器300还包括容纳DADMA并与主流通路302流体连通的盐桥室321和322。电解液入口315和316容纳电解液并且与盐桥室311和312流体连通。电解液入口315和316与电极325和326偶联。电极325和326穿过顶层216并可以与POC分析仪100电偶联。电极325和326可以由Ag/AgCl或任何其他合适的材料制成。与主流通道302流体连通的收集室319在末端收集样品。
粒子检测器300可以用标准的软石板印刷工艺制造。基于SU-8或硅的铸模通过用聚二甲基硅氧烷(PDMS)的光刻制造。粒子检测器300通过用光敏引发剂和单体的预聚物混合物填充盐桥室321和322并将其暴漏于UV而制造。预聚物混合物由下列物质构成：65％二烯丙基二甲基氯化铵水溶液、2％2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(光引发剂)和2％N，N′-亚甲基双丙烯酰胺(交联剂)。聚合后，用缓冲液(1M KCl)将剩余的预聚物混合物洗掉。对于电测量，将KCl溶液装填到与盐桥室321和322连接的电解液入口315和316中并且在这种情况下通过在电极325和326之间施加直流偏压使KCl溶液中的阴离子Cl-离子穿过盐桥室321和322流动。这驱动了在盐桥室321和322之间的电流并且在细胞穿过盐桥室321和322之间的主流通道302产生电极325与326之间的阻抗改变时监测盐桥室321和322之间的阻抗。激励信号可能具有大约0.01V至10V交流或直流的电压并且在使用交流时，具有50Hz至10kHz的频率。
图6A-6B显示测试卡200的另一个实施方案的装配图和分解图。测试卡200包括顶层210、组合层225、废物层260。组合层225将粒子检测层220和初级分离层230中存在的元件组合为组合层225。组合层225包括初级分离室235、捕获通道238和粒子检测器300。样品入口231容许样品被引入初级分离室235。缓冲液入口232容许缓冲液被引入初级分离室235以及主流通道302。
实施例1：循环肿瘤细胞(CTC)
测试卡200可用于检测全血中的循环肿瘤细胞(CTC)。用抗凝剂收集包含血浆、血小板、红细胞、白细胞和CTC的全血样品并将其插入样品入口231。然后将测试卡200插入POC分析仪100。样品到达初级分离室235并通过样品入口231被基本上垂直于过滤表面236引入。血浆、血小板、红细胞和较小的白细胞穿过孔237进入废物室260。孔237可以具有大约14-18μm，并且优选大约16μm的直径。较大的白细胞和CTC太大而不能穿过孔237，并且保留在初级分离室235中。POC分析仪100可以施加大约0-50psi的压力至样品入口231 1-3分钟以促进过滤过程。
缓冲液被以基本上平行于过滤表面236的方向引入初级分离室235。可以关闭样品入口231以阻止缓冲液逆流。缓冲液由缓冲液入口232基本上与过滤表面236平行地进入以产生横过过滤表面236流向捕获通道238的“清扫”作用。缓冲液入口232在初级分离室235的进入点的高度被降低，而横过长度被加宽以引起缓冲液的铺散以便在缓冲液由缓冲液入口232流出并且缓冲液流向捕获通道238时引起过滤表面236的完全清扫。可以使用具有约275-299毫渗摩尔/千克的重量克分子渗透浓度的磷酸盐缓冲盐水或其他pH缓冲液以维持正常的细胞功能和体积。这具有将过滤表面236上的白细胞和CTC“清扫”或疏通到捕获通道238中的作用，尤其是可能部分“粘”在或留在孔237中的白细胞和CTC。同样，POC分析仪100能够施加压力至缓冲液入口232中以促进清扫过程。
缓冲液携带未过滤的残余白细胞和CTC穿过捕获通道238。捕获通道238的曲折路径增加了白细胞与捕获通道238的壁接触并结合至所述壁的可能，所述壁被CD45抗体或与白细胞特异性地结合的其他捕获剂处理过。CTC不与所述壁结合并且穿过捕获通道238。
缓冲液将CTC运载至粒子检测器300。CTC进入并穿过传感器入口301并进入主流通道302。来自缓冲液贮器303的额外的缓冲液穿过缓冲液引入通道304和305被引入主流通道302，以将CTC流体动力学地集中在主流通道302的中心。被流体动力学地集中的CTC在连接通道313和314之间通过并且被计数。可以施加大约5mV至500mV的电压至电极325和326并通过POC分析仪100测量阻抗。
CTC收集在收集室319中，如果期望的话，可以在此处将CTC移出测试卡以供进一步分析。
实施例2：移植组织分型
测试卡200可用于组织分型，其中在移植前测试预期供体和受体的组织的相容性。可以对胚胎进行组织分型以确保移植的胚胎可以是患病同胞的脐带血干细胞供体。
这种应用使用具有直径为大约5μm的孔237的过滤表面236。少量来自样品的白细胞停留在初级分离室235中并穿过捕获通道238移动，捕获通道238具有用已知的抗-HLA(人白细胞抗原)抗体特异性处理的壁。如果抗体识别主要组织相容性复合体(MHC)上的表位，则白细胞结合捕获通道238的壁并不被粒子检测器300计数。这容许基于捕获通道238中存在的已知抗体的特异性间接地鉴定细胞的MHC。
实施例3：疾病相关的人白细胞抗原(HLA)分型
测试卡200可用于检测HLA A、B、C，它们可能在与某些人疾病状态的关系中有用。
这种应用使用具有直径为大约5μm的孔237的过滤表面236。样品中的白细胞停留在初级分离室235中并穿过捕获通道238移动，捕获通道238具有用特异性抗-HLA(人白细胞抗原)抗体处理的壁。如果抗体识别白细胞上的HLA抗原，则白细胞结合捕获通道238的壁并不被粒子检测器300计数。这容许基于捕获通道238中存在的已知抗体的特异性间接地鉴定细胞的HLA。
实施例4：获得性造血干细胞疾患
测试卡200可用于鉴定阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)、获得性造血干细胞疾患，这些疾病中血细胞丢失了某些细胞表面标志物，从而引起机体的红细胞(RBC)的一些或全部被称为溶血的过程破坏。测试卡200可用于检测缺乏表面标志物CD45、CD14、CD33、CD16、CD24、CD64和CD15的组合的血细胞。
这种应用使用具有直径为大约5μm的孔237的过滤表面236。捕获通道238具有用CD45、CD14和/或CD33抗体处理的壁。被PNH影响的白细胞不结合壁并穿过捕获通道238被粒子检测器300计数。
图7A-7B显示测试卡200的另一个实施方案的装配图和分解图。测试卡200包括顶层210、初级分离层230、次级分离层240、纳米线传感器层250和废物收集层260。
图8A-8B显示次级分离层240的放大图。次级分离层240包括通过孔237与初级分离室235流体连通的次级分离室245。次级分离室245收集血浆、红细胞、血小板和小于孔237的尺寸的其他血液组分。次级分离室245具有内壁241和外壁242。内壁241具有大约400μm宽的开放间隙，该间隙容许粒子从次级分离室245移出并进入次级分离室245的内壁241和外壁242之间的通道248。通道248可被捕获剂处理过以特异性地结合在次级分离室245中收集的粒子。样品穿过通道249流动，通道249可沿次级分离层240的顶部和底部延长，然后到达纳米线传感器350。
纳米线传感器层250包括纳米线传感器350。纳米线传感器350能够定量血浆或其他样品中特定物质的量。
图9A显示纳米线传感器350的一个实施方案的放大图。纳米线传感器350是硅纳米线场效应晶体管(FET)。纳米线传感器350包括基底352。纳米线传感器350还包括源极353和漏极354，它们都设置在基底352上。源极353和漏极354可以被绝缘层覆盖。纳米线传感器350还包括与源极354和漏极354偶联的纳米线355。纳米线355是半导体性的并且可以由Si、Ge、InAs、ZnO、SiGe或任何其他合适的材料制成。纳米线355可以具有大约1nm至500nm，并且优选大约20nm的厚度。纳米线355可以被掺杂至大约1016/cm3至1020/cm3，并且优选大约1018/cm3。纳米线传感器350还包括设置在基底352上的控制电极356。
纳米线传感器350还包括控制电极356。控制电极356可以位于距纳米线355大约0.01mm至1mm，并且优选大约0.1mm。在一个实施方案中，控制电极356由Au制成，但还可以由Ag、Cu、Zn、Cd、Fe、Ni、Co或任何其他合适的材料制成。在一个实施方案中，控制电极356用对靶分子特异性的肽核酸(PNA)官能化，所述肽核酸经由例如，胺、羧酸、醛或硫醇键与控制电极356相连。靶分子可以是例如，含有预选的核苷酸序列的核酸分子。PNA可以包括间隔单元，例如，氨基酸连接体或例如8-氨基-3，6-二氧杂辛酸的单体或多体或在PNA与控制电极356连接之后为PNA提供柔性的任何其他合适的间隔体。信号改变可以通过测量FET的门控响应来检测。对控制电极356施加的电压VCE提供FET的门控输入。当靶分子与控制电极356结合时，控制电极356与纳米线355之间的电容改变，并且相同的VCE的门控响应将不同。控制电极356可能很大，例如，5μm x 5μm至500μm x 500μm，优选约50μm x 50μm(长×宽)，以增加与控制电极356结合的靶分子的数目，从而增强检测灵敏度。控制电极356可以是任何合适的厚度，例如，约10nm至约200nm。控制电极356的增加的尺寸和控制电极356而不是纳米线355的官能化，促进纳米线传感器350的灵敏度和特异性增加。
纳米线355和控制电极356彼此是流体连通的。在一个实施方案中，纳米线355和控制电极356被放置于微流通道357内。可选择地，纳米线355和控制电极356可以被放置在样品室中，该样品室中样品是静止的或搅拌的。控制电极356可以为与微流通道357基本上相同的宽度或任何其他合适的尺寸或宽度。
控制电极356可以被大量癌抗原的任一种官能化。控制电极356可以被与蛋白53(p53)核酸(肿瘤抑制)或人表皮生长因子受体2、HER2/neu核酸或其他分子互补的肽核酸(PNA)官能化。控制电极可以被下列癌抗原的抗体官能化：CA27.29、癌胚抗原(CEA)、CA15-3、前列腺特异性抗原(PSA)或其他抗原。
控制电极356可以被官能化以检测大量蛋白生物标志物的任一种。控制电极356可以被下列抗体官能化：心脏病和卒中风险因子C反应性蛋白(CRP)的抗体；诊断充血性心力衰竭(CHF)的B型利钠肽(BNP)的抗体；测试急性心肌梗塞和骨骼肌损伤的肌酸酐激酶的抗体；测试营养状况或肝功能的转铁蛋白的抗体；筛选具有心脏病和卒中风险的患者的高半胱氨酸的抗体；小的血液分子例如用于糖尿病测试的葡萄糖的抗体；或检测急性感染存在的乙肝表面抗原(HBsAG)的抗体。
控制电极356可以被大量检测免疫球蛋白的抗体和检测某些类型的癌、疾病、感染和免疫状况的抗体官能化。控制电极356可以被对诊断骨髓瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症并评价单克隆丙种球蛋白病和淀粉样变的特异性免疫球蛋白(gA、IgG和IgM)的抗体官能化。控制电极356可以被下列物质官能化：用作临床恢复和随后对乙肝病毒免疫性(subsequentimmunity)指示剂的抗-乙肝的抗体；检测与系统性红斑狼疮(SLE)相关的抗体的抗双链DNA(抗-dsDNA)的抗体；或诊断特应性皮炎、湿疹、寄生虫感染、变应性支气管肺曲菌病和免疫缺陷的变应原特异性免疫球蛋白E(IgE)的抗体。
控制电极356可以被检测多种感染性疾病的大量互补性肽核酸(PNA)的任一种官能化。控制电极356可以被与下列核酸互补的PNA官能化：HSV核酸、丙肝核酸、HIV-1核酸、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)性肺炎(PCP)核酸、细菌核酸、嗜肺性军团病菌(Ligionella pneumophilia)核酸或B型链球菌核酸。
尽管上述实施例描述了使用全血作为样品，诸如尿的其他样品也可用于测试卡200。例如，控制电机356可以被白蛋白的抗体官能化以检测作为糖尿病早期标记的尿中的白蛋白。
测试卡200被设计为与其他纳米级装置相比具有增强的检测灵敏度。测试卡200包括按照尺寸以及按照电荷分离样品中的组分的微流装置和基于分子的生物化学特性和物理特性检测靶生物分子的纳米线传感器350。还描述了检测样品中一种或多种生物分子的存在或不存在的方法和基于受治疗者的样品中生物分子的存在而诊断受治疗者的疾病状况的方法。本文所述的方法被设计为提供改善的灵敏度以检测皮摩尔和飞摩尔量的核酸以及检测样品中的生物分子。
测试卡200包括微流装置和纳米线传感器350。微流装置包括基于至少尺寸、结构和电荷的一种或多种分离样品中的分子的尺寸排阻结构。纳米线传感器350包括基底352和具有预定的电流-电压特征并且适于用作生物传感器的门控的纳米线场效应电晶体(NW-FET)。纳米线传感器350还包括具有入口的微流通道357。纳米线传感器350包括源极353、漏极354、与源极353和漏极354连接并被设置在源极353和漏极354之间的纳米线355、以及控制电极356，控制电极356被对形成具有预定电流-电压特征的FET的靶分子特异性的结合位点官能化。NW-FET设置在基底352上并且在基底352与微流通道357之间。靶分子与控制电极356上的结合位点之间发生的结合事件引起NW-FET的电流-电压特征的可检测的改变。在优选的实施方案中，纳米线355是基于硅的纳米线，但是还可以是Ge、InAs、ZnO和SiGe或任何其他半导体材料。控制电极356可以是例如，金属控制电极，如Au、Ag、Cu、Zn、Cd、Fe、Ni、Co或任何其他合适的元素或化合物。优选地，控制电极356是Au。结合位点可以是例如，肽核酸(PNA)、抗体、适体、肽或经由例如，胺、羧酸、醛或硫醇键与控制电极356相连的对靶分子特异性的其他剂(参见，例如，图9c)。靶分子可以是例如，含有预选的核苷酸序列的核酸分子。PNA可以包括间隔单元，例如，氨基酸连接体或例如8-氨基-3，6-二氧杂辛酸的单体或多体或在PNA与控制电极连接之后为PNA提供柔性的任何其他合适的间隔体。信号改变可以通过测量NW-FET的门控响应来检测。对控制电极356施加的电压VCE提供NW-FET的门控输入。当靶分子与控制电极356结合时，控制电极与纳米线355之间的电容改变，并且对于相同的VCE的门控响应将不同。控制电极356可能很大，例如，5μm x 5μm至500μm x 500μm，优选约50μm x 50μm(长×宽)，以增加靶分子与控制电极356的结合，从而增强检测灵敏度。控制电极356可以是任何合适的厚度，例如，约10μm至约200μm。控制电极356的增加的尺寸和控制电极356而不是纳米线355的官能化，促进纳米线传感器355的灵敏度和特异性增加。
本发明的另一实施方案是检测样品中、尤其是生物样品中靶核酸分子的存在或不存在的方法，通过将样品施用于纳米线传感器350，并检测纳米线传感器350的信号改变，其中信号改变是通过样品中的靶分子与纳米线传感器350中控制电极356上的结合位点的结合诱导的。样品可以是生物样品，例如，血液或血浆样品。靶分子优选是含有预选序列的DNA分子，所述预选序列例如是肿瘤存在的特征的肿瘤源DNA序列。肿瘤源DNA可以是标志物或潜在标志物，该标志物或潜在标志物充当肿瘤存在及其进展的诊断指示剂和预后指示剂以及对治疗响应的预测性指示剂。DNA可以是例如，突变K-ras并且肿瘤可以是胰脏癌，尤其是胰腺癌。
该方法还可以用于建立生物样品中靶DNA浓度与癌状况之间的关联。该方法还可以用作靶DNA所来源的肿瘤的早期检测的筛选方法或测定肿瘤进展的筛选方法。例如，该方法可用于通过下列测定来检测非癌性胰脏损伤至癌性胰脏损伤的改变：在受治疗者的样品中测定具有胰脏损伤的受治疗者的样品的额外的突变K-ras存在；或测定受治疗者的样品中在临床上显著的突变K-ras DNA水平之上的升高水平的突变K-ras DNA的存在。受治疗者样品中额外的突变K-ras DNA的存在或突变K-ras DNA的升高是胰脏损伤是癌或将变为癌的指示。此外，该方法可用于预测对治疗的响应或选择最适于用特定治疗来治疗的患者。例如，如在2008年的美国临床肿瘤学会和欧洲肿瘤内科学会(American Society of Clinical Oncology andEuropean Society of Medical Oncology)上所提出的，转移性结肠直肠癌中K-ras突变的存在一般与对抗表皮生长因子受体(EGFR)激酶的抗体如西妥昔单抗(Erbitux，Imclone，Inc.)和帕尼单抗(Vectibix，Amgen Inc.)的弱响应有关。
本发明的另一实施方案是用于检测从组织样品中分离的基因组DNA中的预选DNA序列。基因组DNA样品与纳米线传感器350中的控制电极356接触，其中控制电极356被对预选DNA特异性的结合位点官能化，并且检测电导率或电流的改变。预选DNA序列可以是：例如，对病毒特异性的DNA序列，所述病毒如乙肝病毒、人免疫缺陷病毒、人乳头瘤病毒或巨细胞病毒。
场效应电晶体(FET)是三电极装置，其包括门极、源极和漏极。FET在Paul Horowitz和Winfield Hill的The Art of Electronics(电子学)，第二版，Cambridge University Press，1989，第113-174页中较详细地描述，其整体内容通过引用并入本文。这种载流子的可用性是通过将电压施加到被称为门极的第三“控制电极”来控制的。通道中的电导是通过将电压施加到门极来控制的，电压施加到门极产生了跨通道的电场。
传感装置包括(a)纳米线355，其与源极353和漏极354连接并且被设置在源极353和漏极354之间；(b)门极或控制电极356；以及(c)微流通道357，其任选具有流体入口和出口。源极353、漏极354、纳米线355和控制电极356形成纳米线传感器350。纳米线355和控制电极356物理分离并且控制电极356在微流通道357的流中。纳米线传感器350和微流通道357设置在支撑基底352上。纳米线传感器350位于基底352和微流通道357之间。控制电极356被对预选靶分子特异性的结合位点官能化。与控制电极356上的结合位点结合的靶分子在门处提供电压，该电压产生了改变纳米线355的载流子分布的电场。纳米线355中这种载流子分布的改变影响了电流穿过纳米线355的流动，这可以通过检测器检测，例如，利用电压计的I-V扫描。
由于测量是在溶液相中进行的，通过用绝缘材料涂覆源极353和漏极354来防止源极353与漏极354暴露于微流通道357中的样品。多种绝缘材料是可用的，例如氮化硅、氧化硅以及任何其他合适的材料。氮化硅或氧化硅可以通过等离子体增强化学气相沉积(PECVD)被沉积在源极353和漏极354上以提供绝缘。使用PECVD进行薄层沉积氮化硅或氧化硅的条件可以被进一步优化。
纳米线传感器350还可以包括用于测量控制电极356的电容或其他特性改变的装置。纳米线传感器350用简单电子器件操作，优选由与纳米线355连接的光刻所界定的微米尺寸的源极353和其他电子组件，如电源、放大器和电压计。为了最小化穿过微流通道357中含电解液的样品的寄生电流，用诸如氮化硅或二氧化硅的绝缘材料使源极353和漏极354绝缘。控制电极356在微流通道357的流中。由于微流通道357的小尺寸，将仅获得小体积的样品(通常小于1毫升)。样品溶液通过重力或穿过微流通道357的抽吸而以固定的流速穿过微流通道357流动。可以通过注射泵、蠕动泵或任何其他合适的装置将样品抽吸穿过微流通道357。还可以使用压缩的空气或氮气调压器使样品穿过微流通道357流动。样品还可以大约1至100μl/分钟的速率被抽吸穿过微流通道357。
如本文所用，术语“纳米线”如整体并入本文的美国专利第7,385,267号所描述的，该专利将纳米线定义为细长的纳米级半导体，沿其长度上的任一点具有至少一个横截尺寸，并且在某些实施方案中，具有小于500nm的两个正交横截尺寸，优选小于200nm，更优选小于150nm，甚至更优选小于100nm，甚至更优选小于70nm，仍然更优选小于50nm，甚至更优选小于20nm，仍然更优选小于10nm并且甚至小于5nm。在其他实施方案中，横截尺寸可以小于2nm或1nm。在一组实施方案中，纳米线具有介于0.5nm至200nm的至少一个横截尺寸。当纳米线具有芯和外部区域时，上述尺寸关于芯的那些尺寸。细长半导体的截面可以具有任意形状，包括但不限于：环形、方形、矩形、椭圆形和管形。包括规则形状和不规则形状。可以制成本发明的纳米线的材料的实例的非限制性列表可显示如下。纳米管是一类可用于本发明的纳米线，并且在一个实施方案中，本发明的装置包括与纳米管相当等级的线。如本文所用，“纳米管”是具有挖空的芯的纳米线，并且包括本领域的普通技术人员已知的那些纳米管。“非纳米管纳米线”是不为纳米管的任何纳米线。在本发明的一组实施方案中，具有未修饰的表面(不包括在纳米管所放置的环境中纳米管中非固有的辅助反应实体)的非纳米管纳米线用于本文所描述的可使用纳米线或纳米管的发明的任何排列中。“线”一般是指具有至少半导体或金属的电导性的任何材料。例如，术语“导电”或“导体”或“电导体”在用于指“导电性”线或纳米线时是指所述线使电荷通过其本身的能力。优选的导电材料具有低于约10-3，更优选低于约10-4，并且最优选低于约10-6或10-7Ωm的电阻率。
除非另外指明，否则纳米线355可包括碳纳米管、纳米棒、纳米线、有机和无机导电聚合物和半导体聚合物以及类似物。可能不是分子线，但具有各种小的纳米纤维级尺寸的其他导电或半导体元件也可在一些情况下使用，例如，无机结构，如基于主族和金属原子的线样硅(wire-likesilicon)、含过渡金属的线、砷化镓、氮化镓、磷化铟、锗、硒化镉结构或任何其他合适的组分。可以在不需过度实验的情况下以本文所述的涉及纳米线的技术类似的方式使大量这些和其他的纳米线按对电子装置有用的图案在表面上生长和/或施加到表面上。纳米线355应能够形成为具有至少1μm，优选至少3μm，更优选至少5μm，并且更优选甚至至少长10或20μm的长度，并且优选地具有小于约100nm，更优选小于约75nm，并且更优选小于约50nm，并且更优选小于约25nm的厚度(高和宽)。纳米线355应具有至少约2∶1，优选大于约10∶1，并且更优选大于约1000∶1的长宽比(长度比厚度)。
优选地，纳米线355是硅纳米线(SiNW)，优选硅非纳米管(实心)纳米线。然而，可以使用任何合适的材料。
制造纳米线355的多种方法是本领域内可用的，参见，例如，美国专利第7,301,199号和美国专利第7,410,904号，它们通过整体引用并入本文。可以使用诸如“自下而上”法的方法，该方法是通过气-液-固相(VLS)技术以整体材料生长纳米线。这种方法产生了高品质的纳米线，但是难以制备在长度和直径方面均一的纳米线。而且，它难以将纳米线放置在预期位置并将其与包括电极在内的纳米线传感器350的其他组件对齐，这导致装置与装置之间的一致性差(Gao等人Anal Chem 2007；79：3291-7)。可以使用的其他方法是基于电子束石板印刷(E-bean lithography)和湿/干刻的“自上而下”技术。后面的这类方法是优选的，因为它们提供了对纳米线的尺寸和位置的更多可控性，这使得高通量和自动化生产成为可能。
在多种实施方案中，可以采用任何数目的不同方法来制造控制电极356，包括下列的实例和组合：印刷、石板印刷、化学气相沉积(CVD)、蚀刻、激光烧蚀、弧光放电和/或电化学方法。控制电极356可以具有下列尺寸：5μm x 5μm至500μm x 500μm尺寸，优选约50μm x 50μm(长×宽)或任何其他合适的尺寸。控制电极356可以是任何合适的厚度，例如，约10μm至约200μm。
用“官能剂”涂覆控制电极356的过程在本文中可称为“官能化”并且被涂覆的控制电极被称为“官能化的”。官能剂可以例如结合感兴趣的特定化学物质和/或生物物质，例如，硫醇基团；核酸，如二脱氧核糖核酸或“DNA”；肽核酸或“PNA”；和核糖核酸或“RNA；适体；激素；碳水化合物；蛋白；抗体；抗原；分子受体和/或细胞表面结合位点，这提供了少量生物化学实例。在本发明中，与控制电极356结合以形成结合位点的官能剂对样品中的靶分子是特异的或互补的。例如，第一电沉积的金官能剂可以是硫醇封端的PNA官能剂或结合硫醇封端的PNA官能剂，该PNA官能剂继而可以结合所测定的样品中互补的DNA靶分子。控制电极356可以结合约0.1μm至约100μm，优选约1μm至约10μm PNA。
SiNW和非金属控制电极356可以用p型或n型掺杂剂掺杂。控制电极356的表面可以用捕获剂，含有与诸如K-ras突变ssDNA的预选DNA序列互补的序列的PNA修饰。
纳米线355或控制电极356或纳米线355和控制电极356二者可以被掺杂。可以使用两种不同的方法来掺杂纳米线355和/或控制电极356以进一步优化：基于旋涂掺杂剂的掺杂和离子注入。对于旋涂掺杂剂方法，将衬底用p型或n型旋涂掺杂剂溶液旋转涂覆，随后是高温扩散工艺。最终的掺杂水平可以由热工艺的温度和时间决定。对于离子注入，在加速器中由多种气体源产生高能量离子，如硼、磷或砷，并且将所述高能量离子导向衬底上。将离子注射到衬底的近表面区域内。已报道了两种方法都能得到良好的结果(Gao等人Anal Chem 2007；79：3291-7和Wang等人，NanoLett 2006；6(6)：1096-1100)。可以基于四点探针测量选择最优的掺杂水平(参见，例如，Robert F.Pierret，′Semiconductor Device Fundamentals(半导体装置基础)，′Addison Wesley，第3章，第85-89页和第3.1.4节以及Sato等人Journal of Surface Analysis 11(2)58-61(2004)，二者均通过引用整体并入本文)。可以使用约1018个孔或供体原子/cm3的掺杂水平作为优化的起点。可以按需要增加或降低掺杂水平。
合成的肽核酸寡聚物(PNA)可以由多种来源商购获得。在本发明中，PNA可以与控制电极356结合以形成结合位点。PNA是对样品中的靶分子中的预选核苷酸序列特异性的/互补的，所述预选核苷酸序列例如DNA或RNA，优选ssDNA。优选地，用于本发明的PNA具有特异性结合样品中的靶DNA的合适的长度和序列，例如约5至约75，优选约20至约50个核苷酸，并且与靶DNA中的预选序列80％、85％、90％、95％、99％或100％互补。优选地，PNA的序列与预选序列100％互补。PNA可以包括为下列序列的互补序列或它们的任一个的序列：SEQ ID NO：2、3、4、5或6。优选地，靶DNA与连接至控制电极356的PNA在适于检测靶DNA的预选序列与连接至控制电极356的PNA之间的单碱基对错配的条件下杂交。优选地，所述条件是低盐杂交条件，例如，10mM Tris HCI，pH 8.0或等同条件。
可以使用不止一个纳米线传感器350，各传感器被设计为检测样品中不同的靶分子。传感装置还可以包含不止一个NW-FET，它们的每一个被设计为检测不同的靶分子。例如，如本文所述传感装置可以包括多个NW-FET，每一个包括被靶分子的结合位点官能化的控制电极356，所述靶分子含有序列SEQ ID NO：2-6之一。
术语“样品”如通过引用整体并入本文的美国专利第7,385,267号所述的，并且是指任何细胞、细胞培养基、组织或来自生物来源的液体(“生物样品”)、或可以根据本发明评价的任何其他的生物的或非生物的介质，例如，血浆、血清或水。样品包括但不限于：取自生物体(例如，人、非人的哺乳动物、无脊椎动物、植物、真菌、藻类、细菌、病毒等)的生物样品、取自被设计为用于人消耗的食物的样品、包括被设计为用于动物消耗的食品如牲畜饲料的样品、器官捐赠样品、用于血供的样品、来自供水的样品、或类似样品。样品的一个实例是取自人或动物以确定特定核酸序列存在或不存在的样品。
优选的样品是血液、血浆或血清样品，优选来自患有或怀疑患有肿瘤如胰腺瘤的受治疗者的血液、血浆或血清样品。样品可以是被匀浆化并置于溶液中的组织样品。
纳米线传感器350可以如下制造：
将PNA固定在电极上：固定可以由X射线光电子谱(XPS)来表征。XPS是评价薄膜的化学特性以及结构特性的非原位(ex-situ)方法。还可以在HS-ssPNA固定之后测定表面上的定量分析。监测HS-ssPNA单层和含有封阻剂(巯基乙醇)的混合的自组装PNA单层的表面覆盖的改变。傅里叶变换红外(FTIR)光谱提供关于分子印迹和取向的额外信息。基于这两个方法，可以在PNA取向以及覆盖方面测定表面状态。
绝缘层的形成：由于测量将在溶液相中进行，金属电极要避免暴露于液体中。氮化硅和氧化硅是用于此目的的最常见的材料。优化用例如PEVCD进行的薄层沉积。使用双层剥离(lift-off)方法来形成图案化的绝缘层。下层被螺旋涂覆，随后施加光刻胶。在相同的暴露和显影条件下，下层比光刻胶更容易且更快地显影。形成了在金属沉积步骤期间充当掩模的悬浮光刻剂图案以在金属沉积之后提供环绕衬底上新形成的金属图案的间隙。在各向异性地形成薄层之后进行剥离的PECVD工艺之后，用氮化硅或氧化硅覆盖金属电极图案。
掺杂工艺：至少两种不同的掺杂方法是合适的：旋涂掺杂剂方法和离子注入。掺杂之后，估计的掺杂水平通过四点探针测量来计算。测量层的薄层电阻ρs。四个探针以线性方式排列。将固定的电流供给外侧两个探针，而由内侧两个探针测量维持固定电流的电压。由电流和电压值之间的关系，计算薄片电阻(sheet resistance)。掺杂水平由电阻率与掺杂剂密度曲线来计算。掺杂水平的初始目标是1018/cm3。基于来自背景门控测量的NW-FET的门控性能来调节目标掺杂水平。
纳米线FET装置：可以使用电子束石板印刷和多种蚀刻技术来产生纳米线制件。在纳米线制造之后，通过用扫描电子显微镜(SEM)成像来将其表征。然后通过例如电子束石板印刷、光刻和剥离方法来界定金属电极。同样，用例如SEM监测图案的尺寸和品质。用I-V测量和回门控(back-gating)测量来测试装置的电子性能。掺杂水平可以基于门控性能而改变。
绝缘层：金属电极的全部覆盖可以由例如SEM成像来证实。电分离也可以由例如液体中的I-V测量来检查。
实施例5：靶分子
有4个显著的K-ras点突变(下面的#1-4)与胰脏癌相关。另一点突变(下面的#5)在胰脏癌中以极低频率出现。靶寡核苷酸含有K-ras核酸序列的至少约20-50个核苷酸并且含有四个突变(#1-4)中的至少一个。含有K-ras核酸序列的至少约20-50个核苷酸并且含有#5突变的靶寡核苷酸充当阴性对照以增加对胰脏癌检测的特异性。
还合成了下列突变#1-5中的每一个的互补的并且含有约20-50个核苷酸的PNA。所有合成的寡核苷酸可以购自商业来源。
K-RAS编码序列(1-60，野生型)：
ATG ACT GAA TAT AAA CTT GTG GTA GTT GGA GCT GGT
GGC GTA GGC AAG AGT GCC TTG ACG
K-RAS编码序列(1-60，#1-5突变)
Figure BPA00001382645800211
#1：ATG ACT GAA TAT AAA CTT GTG GTA GTT GGA GCT CGTGGC GTA GGC AAG AGT GCC TTG ACG
#2：ATG ACT GAA TAT AAA CTT GTG GTA GTT GGA GCT GATGGC GTA GGC AAG AGT GCC TTG ACG
#3：ATG ACT GAA TAT AAA CTT GTG GTA GTT GGA GCT GTTGGC GTA GGC AAG AGT GCC TTG ACG
#4：ATG ACT GAA TAT AAA CTT GTG GTA GTT GGA GCT TGTGGC GTA GGC AAG AGT GCC TTG ACG
#5：ATG ACT GAA TAT AAA CTT GTG GTA GTT GGA GCT GGTGAC GTA GGC AAG AGT GCC TTG ACG
肽核酸(PNA)固定策略：
已显示PNA可以单碱基灵敏度检测DNA(Wang等人，J.Amer ChemSoc 1996；118(33)：7667-7670)并且因此金表面上的单链PNA分子的有序自组装单层(SAM)展示对互补ssDNA的特异性识别(Briones等人，PhysicalReview Letters 2004；93(20)：208103)。PNA由于其与DNA的高结合亲和力而在本文中被用作结合位点。使用基于硫醇的固定将PNA固定于控制电极356的表面上以形成单层，基本上如通过引用整体并入本文的Briones等人，Phys.Rev.Lett.93，208103(2004)所述。形成单层的条件基于PNA浓度、间隔体长度和用于在PNA固定之后封阻控制电极表面的硫醇溶液来优化，例如：
将PNA浓度被优化以形成合理填充的单层，例如，约0.1μm至约10μm：过高的PNA浓度可以完全覆盖金表面但由于位阻效应而降低结合功效。
间隔体作用：在纳米表面上结合的特征与本体溶液中结合的特征极为不同。PNA和多聚物中包含了降低结合的壁效应并赋予PNA更高柔性的8-氨基-3，6，-二氧杂辛酸间隔体，例如，8-氨基-3，6，-二氧杂辛酸的二聚物和三聚物被用于确定用于结合测定的间隔体的优化长度。
封阻性硫醇溶液作用：为在硫醇-PNA固定之后封阻控制电极的金表面以便成功地进行后续DNA杂交，使用巯基乙醇溶液作为封阻剂。图9C显示了PNA和巯基乙醇的混合SAM的示意性代表图。
微流装置的设计和过程
起始样品和样品处理：
将样品加入微流装置并通过大约1μm尺寸的孔237将血浆与血细胞和血小板分离并使血浆进入次级分离室245。
使样品流入或泵入通道248中，通道248具有与通道248的壁结合的硅或玻璃。将足够的饱和促溶剂(例如，NaI和氯化胍试剂)与样品混合并在容许DNA与玻璃表面结合的温度下使样品与通道248接触足够的时间，在25度下大约5分钟；结合条件和时间可以进一步优化。DNA在促溶性盐的存在下被吸附到玻璃或二氧化硅表面是首次由Vogelstein和Gillespie(Vogelstein等人，Proc Natl Acad Sci USA 1979；76(2)：615-619)在他们对通过玻璃粉末由琼脂糖纯化DNA片段的工作中描述的。
用50％乙醇和50％缓冲液(20mM Tris-HCI，pH 7.2；0.2M NaCI；2mMEDTA)混合物洗涤结合有DNA的微流通道以移除NaI。然后用去离子水或低盐洗脱缓冲液将DNA从硅或玻璃表面洗脱。将携带靶DNA至传感装置的洗脱缓冲液的盐和pHT调节至例如10mM Tris HCI，pH 8.0以适于靶DNA与结合至控制电极的PNA杂交。盐和pH被调节的携带洗脱的DNA的杂交溶液穿过微流通道357流至或被泵至纳米线传感器350，在此处所述杂交溶液与被对预选靶分子特异性的肽核酸分子官能化的控制电极356接触，并且靶DNA分子与PNA杂交。
基于硅纳米线的传感器设计/开发
本发明的传感装置的纳米线355和与靶分子结合的控制电极356是物理上分离的。纳米线传感器350的一个实施方案的示意图显示在图9A中。如所图示的，纳米线传感器350由两个组件运行：纳米线355，其设置在源极353和漏极354之间；以及控制电极356。靶分子在适当的杂交条件下与结合至控制电极356的表面的PNA杂交。SiNW-FET通过改变的门控响应来检测控制电极356与纳米线355之间的电容改变。将电压VCE施加至控制电极356，由迁移的离子形成了纳米线355上的离子双层。这种现象充当门控电压并诱导纳米线355中的电荷密度改变。当DNA靶分子结合控制电极356的结合位点时，控制电极356和纳米线355之间的电容改变并且对于相同VCE的来自纳米线355的门控响应也改变。该改变是通过测量通过纳米线355的导电性检测的，例如，通过用电压计监测电流。
图9B显示纳米线传感器350电导对控制电极电压的示意性响应。基于电导线性区域线性外推至零设置域电压；Vth。当靶分子(ssDNA)结合至控制电极356的表面时，控制电极356与纳米线355表面之间的电容改变。这种电容改变改变了纳米线355的域电压，该域电压是纳米线传感器350的输出信号。
差异检测方案
为检测K-ras基因中的点突变，测定了血液样品的含单碱基突变的DNA。
收集由许多生物组分构成的人血液样品并将其与抗凝剂(例如，EDTA、柠檬酸盐、肝素)混合。优选EDTA抗凝的血液。收集抗凝的血液样品并使其穿过微流装置的尺寸排阻结构，通过使DNA与微流通道结合将样品中的DNA与非DNA分子分离，然后如上所述洗脱结合的DNA。在其中样品中的靶DNA与PNA杂交的条件下将含有洗脱的DNA的样品施加至两个纳米线传感器350：结合有对靶核酸分子特异性的PNA的第一纳米线传感器350(样品纳米线传感器350)；不含有靶核酸分子的结合的PNA的第二纳米线传感器350(对照纳米线传感器350)。通过取两个纳米线传感器350的纳米级的差异响应(样品纳米线传感器350的信号减去对照纳米线传感器350的信号)来消除以类似方式影响两个传感装置的除血液样品中的靶DNA以外的信号。
一个纳米线传感器中的差异检测和两个NW-FET：
制备包括至少以下2组的SiNW-FET和控制电极356的可弃型一次性测试筒装置：一组由第一SiNW-FET和被捕获PNA官能化的第一控制电极356；并且第二组是第二SiNW FET和没有捕获PNA的第二控制电极356。额外的组是额外的SiNW-FET和被不同的捕获PNA官能化的控制电极356。SiNW-FET在两组中是相同的(关于I-V特征和门控响应具有类似的性能)。该装置包括共享同一入口的至少两个微流通道。每个通道含有一个SiNW-FET。洗脱的DNA样品流入微流通道并且用检测装置检测位于各通道中的来自SiNW-FET的信号并进行比较。
本发明的其他方面对于熟练技术人员将是清楚的并且不需要在本文中重复。所采用的术语和表达用作说明术语并且不具有限制性，并且使用这些术语和表达时不旨在排除所显示和描述的特征的任何等同形式或其部分，应认识到多种改动是可能在本发明的范围内的。

Claims (48)

1.一种用于分离样品中的组分的装置，所述装置包括：
初级分离室，其具有界定了多个孔的过滤表面；
样品入口，其与所述初级分离室流体连通，所述样品入口被构造成将样品以基本上垂直于所述过滤表面的方向引入所述初级分离室；
其中所述过滤表面容许小于所述孔的组分穿过，并且其中所述过滤表面将大于所述孔的组分保留在所述初级分离室中；
捕获通道，其与所述初级分离室流体连通，所述捕获通道具有被捕获剂处理的壁，所述捕获剂用于选择性地结合较大组分中的被特异性靶向的至少一种；以及
缓冲液入口，其与所述初级分离室流体连通，所述缓冲液入口被构造成将缓冲液以基本上平行于所述过滤表面的方向引入所述初级分离室以将所述较大组分清扫入所述捕获通道；
其中所述捕获通道的壁在所述较大组分穿过所述捕获通道时选择性结合所述较大组分中的至少一种。
2.如权利要求1所述的装置，其中所述过滤表面能够接收大约0.01ml至10ml的样品。
3.如权利要求1所述的装置，其中所述过滤表面具有大约1mm x 1mm至100mm x 100mm的尺寸。
4.如权利要求1所述的装置，其中所述过滤表面具有至少50％的孔隙率。
5.如权利要求1所述的装置，其中所述样品是全血。
6.如权利要求5所述的装置，其中所述孔具有大约1μm的直径。
7.如权利要求6所述的装置，其中较小的组分包括血浆。
8.如权利要求5所述的装置，其中所述孔具有大约5μm的直径。
9.如权利要求8所述的装置，其中所述较大组分包括白细胞。
10.如权利要求5所述的装置，其中所述孔具有大约16μm的直径。
11.如权利要求10所述的装置，其中所述较大组分包括较大的白细胞和循环肿瘤细胞(CTC)。
12.如权利要求1所述的装置，其中所述样品入口具有大约0.5mm至10mm的直径。
13.如权利要求1所述的装置，其中所述捕获通道具有曲折路径。
14.如权利要求1所述的装置，其中所述捕获通道具有大约20μm至1000μm的宽度。
15.如权利要求1所述的装置，其中所述捕获通道具有大约0.1cm至10cm的长度。
16.如权利要求1所述的装置，其中所述捕获通道造成了多个成角度的转弯。
17.如权利要求1所述的装置，其中所述捕获剂是抗体、肽、小分子或适体。
18.如权利要求1所述的装置，其中所述缓冲液入口包括缓冲液槽，所述缓冲液槽横跨所述过滤表面的基本上整个侧面延伸，其中所述缓冲液入口被构造成将缓冲液引入所述缓冲液槽并且缓冲液槽被构造成容许缓冲液溢流到所述过滤表面上。
19.如权利要求18所述的装置，其中所述缓冲液槽具有位于与所述过滤表面基本上同一水平的顶。
20.如权利要求1所述的装置，其中所述缓冲液入口包括缓冲液扩散器，所述缓冲液扩散器被构造成将缓冲液横跨所述过滤表面的基本上整个侧面铺散开。
21.一种用于分离样品中的组分的方法，所述方法包括：
提供初级分离室，所述初级分离室具有界定了多个孔的过滤表面；
将样品以基本上垂直于所述过滤表面的方向引入所述初级分离室，所述过滤表面容许小于所述孔的组分穿过，所述过滤表面将大于所述孔的组分保留在所述初级分离室中；
提供与所述初级分离室流体连通的捕获通道，所述捕获通道具有被捕获剂处理的壁，所述捕获剂用于选择性地结合较大组分中的至少一种；以及
将缓冲液以基本上平行于所述过滤表面的方向引入以将所述较大组分清扫入所述捕获通道，所述捕获通道的壁在所述较大组分穿过所述捕获通道时选择性结合所述较大组分中的至少一种。
22.一种用于分离样品中的组分的装置，所述装置包括：
初级分离室，其具有界定了多个孔的过滤表面；
样品入口，其与所述初级分离室流体连通，所述样品入口被构造成将样品以基本上垂直于所述过滤表面的方向引入所述初级分离室；
其中所述过滤表面容许小于所述孔的组分穿过，并且其中所述过滤表面将大于所述孔的组分保留在所述初级分离室中；以及
缓冲液入口，其与所述初级分离室流体连通，所述缓冲液入口被构造成将缓冲液以基本上平行于所述过滤表面的方向引入所述初级分离室以将较大组分清扫离开所述过滤表面。
23.如权利要求22所述的装置，还包括：
捕获通道，其与所述初级分离室流体连通，所述捕获通道被构造为接收来自所述过滤表面的所述较大组分，所述捕获通道具有被捕获剂处理的壁，所述捕获剂用于选择性地结合所述较大组分中的至少一种，所述捕获通道的壁在所述较大组分穿过所述捕获通道时选择性结合所述较大组分中的至少一种。
24.一种用于定量样品中的特定物质的量的装置，所述装置包括：
基底；
源极，其与所述基底偶联；
漏极，其与所述基底偶联，所述漏极具有低于所述源极的电势；
半导体纳米线，其与所述源极和所述漏极偶联；以及
控制电极，其与所述基底偶联，其中所述控制电极的表面的至少一部分用选择性地结合所述物质的捕获剂处理；
其中流经所述纳米线的电流的量对应于施加到所述控制电极的电压，并且受结合到所述控制电极的所述物质的量影响。
25.如权利要求24所述的装置，其中所述纳米线具有约1nm至0.99μm的宽度。
26.如权利要求24所述的装置，其中所述纳米线被掺杂至大约1016至1020个孔或供体原子/cm3的水平。
27.如权利要求24所述的装置，其中所述控制电极具有大约5μm×5μm至约500μm×500μm的长和宽。
28.如权利要求24所述的装置，其中所述控制电极具有大约10nm至200nm的厚度。
29.如权利要求24所述的装置，其中所述捕获剂是会与生物分子结合的肽核酸(PNA)、抗体、适体或小肽。
30.如权利要求24所述的装置，其中所述控制电极上的所述捕获剂形成具有大约0.1nm至100nm的厚度的层。
31.一种用于定量样品中的特定物质的量的装置，所述装置包括：
测试室，其被构造为容纳所述样品；
源极；
漏极，所述漏极具有低于所述源极的电势；
半导体纳米线，其至少部分地位于所述测试室中，所述半导体纳米线与所述源极和所述漏极偶联；
检测器，其用于测量流经所述纳米线的电流的量；以及
控制电极，其至少部分地位于所述测试室中，其中所述控制电极的表面的至少一部分用选择性地结合所述物质的捕获剂处理；
其中流经所述纳米线的电流的量对应于施加到所述控制电极的电压，并且受结合到所述控制电极的所述物质的量影响。
32.如权利要求31所述的装置，其中所述纳米线具有约1nm至0.99μm的宽度。
33.如权利要求31所述的装置，其中所述纳米线被掺杂至大约1016至1020个孔或供体原子/cm3的水平。
34.如权利要求31所述的装置，其中所述控制电极具有大约5μm×5μm至约500μm×500μm的长和宽。
35.如权利要求31所述的装置，其中所述控制电极具有大约10nm至200nm的厚度。
36.如权利要求31所述的装置，其中所述捕获剂是会与生物分子结合的肽核酸(PNA)、抗体、适体或小肽。
37.如权利要求31所述的装置，其中所述控制电极上的所述捕获剂形成具有大约0.1nm至100nm的厚度的层。
38.一种用于检测样品中的粒子的装置，所述装置包括：
主流通道；
缓冲液引入通道，其与所述主流通道流体连通，所述缓冲液引入通道能够将缓冲液引入所述主流通道以将所述样品中的所述粒子流体动力学地集中在所述主流通道内；
第一盐桥室和第二盐桥室，其分别与所述主流通道的第一相对侧面和第二相对侧面流体连通，所述第一盐桥室和第二盐桥室至少部分地被琼脂填充；
第一电解液室和第二电解液室，其分别与所述第一盐桥室和所述第二盐桥室流体连通，所述第一电解液室和所述第二电解液室至少部分地被电解液填充；
第一电极和第二电极，其分别设置在所述第一电解液室和所述第二电解液室中，所述第一电极和所述第二电极能够分别施加激励信号至所述第一电解液室和所述第二电解液室以及所述第一盐桥室和所述第二盐桥室；
阻抗分析仪，其与所述第一电极和所述第二电极偶联，用于测量所述第一盐桥室和所述第二盐桥室之间的阻抗；并且
其中穿过所述主流通道并在所述第一盐桥室和所述第二盐桥室之间流动的粒子将在施加激励信号时引起所述第一盐桥室和所述第二盐桥室之间阻抗的可检测改变。
39.如权利要求38所述的装置，其中所述第一盐桥室和所述第二盐桥室分别通过第一连接通道和第二连接通道与所述主流通道的所述第一相对侧面和第二相对侧面流体连通。
40.如权利要求38所述的装置，其中所述第一连接通道和所述第二连接通道具有大约0.001mm至0.05mm的宽度。
41.如权利要求38所述的装置，其中所述第一连接通道和所述第二连接通道具有大约0.01mm至0.2mm的长度。
42.如权利要求38所述的装置，还包括：
第一琼脂入口和第二琼脂入口，其分别与所述第一盐桥室和所述第二盐桥室偶联，所述第一琼脂入口和所述第二琼脂入口被构造为有利于用琼脂填充所述第一盐桥室和所述第二盐桥室。
43.如权利要求38所述的装置，其中所述主流通道具有大约0.05mm至0.5mm的宽度。
44.如权利要求38所述的装置，其中所述琼脂是大约2-10％琼脂和1MKCl重量/体积的混合物。
45.如权利要求38所述的装置，其中所述激励信号具有大约0.01V至10V的电压和大约50Hz至10kHz的频率。
46.一种用于计数样品中粒子数目的方法，所述方法包括：
将所述粒子流体动力学地集中在主流通道中；
施加激励信号至分别与所述主流通道的第一相对侧面和第二相对侧面流体连通的第一盐桥室和第二盐桥室，所述第一盐桥室和所述第二盐桥室被琼脂填充；
使所述粒子通过所述第一盐桥室和所述第二盐桥室之间；以及
通过检测在所述粒子通过所述第一盐桥室和所述第二盐桥室之间时所述第一盐桥室和所述第二盐桥室之间阻抗的改变来计数粒子的数目。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述粒子被集中在所述主流通道的中心。
48.如权利要求46所述的方法，其中所述粒子被集中在所述主流通道的一侧。
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