CN102232118B - 用于核酸检测的新型荧光染料组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于分子生物学，特别是多重PCR中的荧光染料组合物。具体而言，本发明涉及用于扩增反应的染料组合物，其中使用至少4种不同染料，其中第一染料是5-FAM或6-FAM或其混合物，第二染料选自DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560或ATTO 532，第三染料选自ATTO550、DY-555或DY-556，第四染料选自ROX、DY-510XL或ATTO 565，并任选地，第五荧光染料选自DY-632或DY-520XL。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域。具体而言，本发明涉及例如扩增反应如聚合酶链反应(PCR)中的核酸检测。本发明可特别用于基因分型、定量PCR、实时PCR和多重PCR。本发明具体涉及PCR中使用的染料。
背景技术
荧光染料在分析化学、生物化学和分子生物学中有广泛的应用，如在DNA测序和核酸的检测和扩增中。荧光染料吸收特定波长光谱(“激发谱”)的光并在不同的特定波长光谱(“发射谱”)再发射能量。荧光染料通常用作分子标记与DNA和蛋白质探针或其它生物分子连接。
多重聚合酶链反应(多重PCR)是一种能够在单个反应管中平行扩增两种或两种以上产物的PCR技术。它广泛应用于基因分型应用和分子生物学的其它方面，例如研究、法医学或诊断应用，包括人的鉴定和亲子鉴定以及传染病的诊断或同种异体骨髓移植后的嵌合状态分析。利用cDNA作为起始模板或结合以mRNA为起始材料的逆转录，多重PCR还可用于定性和半定量的基因表达分析。例如，被分析的核酸可来自各种真核(人、动物或植物)与原核(细菌)或病毒来源。
例如，多重PCR被用来同时检测多个标记基因和/或它们的多态性，例如单核苷酸多态性(SNP)、短串联重复(STR)或缺失-插入多态性(DIP或Indel)。扩增产物及其基因分型的检测通常在DNA测序仪中电泳分离(如毛细管凝胶电泳)后通过多色荧光检测进行。在实时定量多重PCR中，可通过同时检测不同荧光染料来同时监测多个目标序列的扩增。
用于多色荧光检测的仪器通常设计并校准为针对非常特定的荧光染料的组合，即按照激发和检测光谱和滤光片组。
许多DNA序列分析仪采用毛细管电泳装置结合特殊的多波长荧光检测系统。此类仪器的基本设置见Karger等(1991)所述(Karger A，Harris JM，Gesteland RF.“采用毛细管电泳的DNA测序多波长荧光检测(Multiwavelength fluorescence detection for DNA sequencing using capillaryelectrophoresis)”.Nucleic Acids Res 18，4955-4962，1991)，并通过应用生物系统公司(Applied Biosystems)(美国加利福尼亚州福斯特城(Foster City，CA，USA))的ABI Prism系列遗传分析仪(310、3100、3130等)进入商业应用。这些仪器可用于DNA序列分析、遗传多态性(SNP、DIP、STR)的多重基因分型、mRNA表达分析，或更一般地用于扩增DNA片段的长度分析。后者还是法医学和亲子鉴定领域中多重PCR STR基因分型的当前标准。在该情况中，在多重扩增中使用的各引物对中的至少一个引物在其5′-OH端或内部碱基上标记有共价连接的荧光染料。这些仪器的光学检测单元使用可调至10mW的多线氩离子激光器，其可以在488nm(主波长)和514nm激发多个荧光团(Wenz H，Robertson JM，Menchen S，Oaks F，Demorest DM，Scheibler D，Rosenblum BB，Wike C，Gilbert DA，Efcavitch JW.“通过变性毛细管电泳进行高精度基因分型(High-precision genotyping by denaturing capillaryelectrophoresis)”.Genome Res 8，69-80页，1998)。记录525到680nm之间的荧光发射。分离出发射光以便通过摄谱仪(棱镜)进行多色荧光的同时检测并成像在冷却的CCD(电荷耦合器件(charge coupled device))相机上。在现有构造中，可通过约10nm重量的数字带通滤波器在CCD芯片上设定最多5个波长带。这些数字带通滤波器的相对位置由生产商针对有限数量的染料组合进行专有设定(见表1)。所述装置的这些设定也称为虚拟滤光片组。数字带通滤波器的确切位置和范围未见公开。新一代的多毛细管DNA测序仪如ABI Prism3130遗传分析仪另外还具有两个可变虚拟滤光片组，称为“any4dyes”或“any5dyes”，使客户能针对其它染料组合调整预设的数字带通滤波器。因此，所谓的条件限定数可有一定程度的改变。然而仍然没有关于这些数字带通滤波器的相对位置和波长范围的信息。
表1：用于ABI Prism遗传分析仪的已知荧光染料组合以及虚拟滤光片组。5，6-FAM：5-和6-羧基荧光素；6-FAM：6-羧基荧光素；JOE：6-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素；HEX：4，7，2′，4′，5′，7′-六氯-6-羧基荧光素；TET：4，7，2′，7′-四氯-6-羧基荧光素；TAMRA：6-羧基四甲基-罗丹明；VIC：2′-氯-7′-苯基-1，4-二氯-6-羧基荧光素；NED：2′-氯-5′-氟-7′，8′-苯-1，4-二氯-6-羧基荧光素；ROX：5-和6-羧基-X-罗丹明；PET和LIZ为未公开的应用生物系统公司(美国加利福尼亚州)的专有染料。
此外，必须针对为了同时检测4或5个不同色而选定的多色滤光片组进行光谱校准，以产生数学矩阵来校正染料重叠的荧光发射谱。这一计算所运用的数学算法尚未公开。
还需要着重注意的是，由单个氩离子激光器、摄谱仪、与CCD相机联用的虚拟滤光片组和光谱校准算法组成的用于同时检测不同荧光染料的ABIPrism遗传分析仪的光学设置与其它测序仪或实时PCR热循环仪所用的设置具有本质不同。后者具有来通过不同的滤光器组合和短时补偿(时间分辨)分析不同染料的多组激发和发射滤光器。此外，ABI Prism遗传分析仪的具体光学设置也限制了多荧光检测中不同染料的兼容性。
如表1所列，只有几组荧光染料可用于DNA寡核苷酸的标记和通过应用生物系统公司的DNA自动测序设备进行的同时检测。由于所使用的单个氩激光器在488nm的激发最强，这些染料在蓝色道到红色道之间的相对灵敏度显著降低。此外，各颜色的相对灵敏度和适当的分析分离受到光谱重叠的影响。这些染料中有很多(如VIC、HEX、NED、PET、LIZ)是应用生物系统公司专有的，这一事实造成了进一步的限制。用VIC、NED和PET染料标记的定制PCR引物只能通过该公司的合成实验室获得，而LIZ只能作为应用生物系统公司的市售产品和带标记DNA长度标准一起得到。此外，PET和LIZ的化学结构是未知的。因此，出于技术和经济方面的原因，需要新的颜色组合物。
发明内容
本发明特别致力于用于DNA序列分析仪的染料组合物，该分析仪使用与特殊的多波长荧光检测系统联用的毛细管电泳装置。如上所述，这些仪器可用于DNA序列分析、遗传多态性(SNP、DIP、STR)的多重基因分型、mRNA表达分析，或更一般地用于扩增DNA片段的长度分析等。
本发明涉及用于检测荧光标记核酸的荧光染料的替代组合。出乎意料地，本发明的发明人发现这些组合物与现有技术的组合物相比具有优异的性能，例如在灵敏度方面。本发明的荧光染料组合物克服了已知组合物的许多局限和缺点。染料的相对灵敏度提高，光谱重叠减少。如本发明的发明人在所附实施例中所示，本发明的染料组合物的积极效果不能从各单个染料的光谱性质检测得到。
具体而言，本发明涉及对样品中至少4种用共价连接染料标记的核酸进行同时检测的方法，包括检测所述荧光染料激发后的荧光发射的步骤，其中一种选自5-FAM或6-FAM或其混合物的荧光染料与第一核酸共价连接，一种选自DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560或ATTO 532的荧光染料与第二核酸共价连接，一种选自ATTO 550或DY-556的荧光染料与第三核酸共价连接，和一种选自ROX、DY-510XL或ATTO 565的荧光染料与第四核酸共价连接，以及任选地，一种选自DY-632或DY-520XL的荧光染料与第五核酸共价连接。
本发明还涉及用于多重PCR的试剂盒和组合物，包含：
(i)与选自5-FAM或6-FAM或其混合物的荧光染料共价连接的第一核酸；
(ii)与选自DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560或ATTO 532的荧光染料共价连接的第二核酸；
(iii)与选自ATTO 550、DY-555或DY-556的荧光染料共价连接的第三核酸；
(iv)与选自ROX、DY-510XL或ATTO 565的荧光染料共价连接的第四核酸。
本发明的范围还包括至少4种荧光染料的组合物在多重聚合酶链反应中的应用，其中各染料与和侧接待扩增基因座的序列基本互补的寡核苷酸引物或和待扩增基因座上的序列基本互补的寡核苷酸探针共价连接，其中
(i)第一染料是5-FAM或6-FAM或其混合物，
(ii)第二染料选自DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560或ATTO532，
(iii)第三染料选自ATTO 550或DY-556，
(iv)第四染料选自ROX、DY-510XL或ATTO 565，以及选自DY-632或DY-520XL，
(v)任选地，第五染料选自DY-632或DY-520XL。
发明详述
本发明涉及用于检测荧光标记核酸的荧光染料的特定组合物。
具体而言，本发明涉及对样品中至少4种用共价连接染料标记的核酸进行同时检测的方法，包括检测所述荧光染料激发后的荧光发射的步骤，其中一种选自5-FAM或6-FAM或其混合物的荧光染料与第一核酸共价连接，一种选自DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560或ATTO 532的荧光染料与第二核酸共价连接，一种选自ATTO 550、DY-555或DY-556的荧光染料与第三核酸共价连接，和一种选自ROX、DY-510XL或ATTO 565的荧光染料与第四核酸共价连接，以及任选地，一种选自DY-632或DY-520XL的荧光染料与第五核酸共价连接。
本发明的一个方面涉及同时检测扩增反应的扩增产物的方法，包括以下步骤：
(i)采用和侧接基因座的序列基本互补的引物或引物对扩增核酸模板上的三个或三个以上基因座；和
(ii)通过荧光检测荧光标记的扩增产物或通过荧光检测与所述扩增产物的所述基因座上的序列互补的荧光标记寡核苷酸探针来检测所述扩增产物，
其中荧光染料与所述扩增产物和/或所述寡核苷酸探针和/或所述引物和/或所述引物对中至少一个引物共价连接，并任选地与大小标记共价连接，且其中使用至少4种不同染料，其中第一染料是5-FAM或6-FAM或其混合物，第二染料选自DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560或ATTO 532，第三染料选自ATTO 550、DY-555或DY-556，第四染料选自ROX、DY-510XL或ATTO 565，且任选地，第五荧光染料选自DY-632或DY-520XL。
本发明还涉及同时检测核酸扩增反应的扩增产物的方法，包括以下步骤：
(i)用与侧接待扩增序列的引物或引物对扩增三个或三个以上核酸序列；和
(ii)直接检测或利用与所述扩增产物互补的荧光标记寡核苷酸探针间接检测荧光标记的扩增产物，
(iii)任选地，检测荧光标记的大小标记，
其中，各待测序列有不同的荧光染料与所述扩增产物和/或所述寡核苷酸探针和/或所述引物和/或所述引物对中至少一个引物共价连接，并任选地与大小标记共价连接，
且其中使用至少4种不同染料，其中第一染料是5-FAM或6-FAM或其混合物，第二染料选自DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560或ATTO 532，第三染料选自ATTO 550、DY-555或DY-556，第四染料选自ROX、DY-510XL或ATTO 565，且任选地，第五荧光染料选自DY-632或DY-520XL。
在本发明所述方法的一种具体实施方式中，第一染料是5-FAM或6-FAM或其混合物，第二染料选自DY-530或ATTO 532，第三染料选自ATTO 550、DY-555或DY-556，第四染料选自DY-510XL或ATTO 565，且任选地，第五荧光染料选自DY-632或DY-520XL。
如上所述，本发明涉及至少4种不同荧光染料的组合物。在上述方法的背景下，这意味着在使用本发明的一种染料荧光标记的大小标记时，那么根据所用的4种、5种或更多种不同染料的组合物，可扩增并检测至少3种核酸序列(即基因座)。若不使用荧光标记的大小标记，那么可扩增并检测至少4种序列。
在上述方法中，为各待扩增(和检测)序列指定组合物中的一种特定染料，能检测和区分各具体扩增产物。
本文中的“同时检测”是指可检测同一溶液中的多种染料，优选在同一时间进行。因此，可利用例如多个检测器或滤光器。
本发明中的“基因座”是待扩增和/或检测的核酸序列的一部分，所述核酸为例如，染色体、mRNA、质粒、粘粒、DNA或RNA(任何来源的，例如，细菌、病毒、真核、原核、来自植物、真菌或动物，例如人源的)等。
本文中的“扩增产物”是扩增反应，例如聚合酶链反应的核酸或寡核苷酸产物。例如，它们由扩增所用的引物所定义。
本文中的“引物”是指包含与待扩增或转录的核酸(“模板”)互补的序列的寡核苷酸。在复制过程中，聚合酶使核苷酸与和模板上相应核苷酸互补的引物的3′-OH端连接。
本文中的“寡核苷酸”是指一段核酸，例如RNA或DNA，其包含的序列具有两个或两个以上核苷酸，例如2-250个核苷酸，更优选2-200个，更优选2-100个，更优选2-30个，更优选2-25个，更优选2-20个，更优选5-25个，最优选10-25个核苷酸。
在本方法的第一方面中，在扩增过程中，检测可采用例如荧光标记的寡核苷酸探针进行。或者，可使用荧光标记的引物。又或者，可使用结合入扩增产物的荧光标记的核苷酸。在该情况中，优选每个待扩增或检测的基因座都在单独的反应管中进行扩增。随后，可将扩增产物统一进行检测。
因此，在一些情况中检测可在扩增过程中进行，例如在聚合酶链反应的各循环后或循环中和/或在扩增反应完成后。
在本方法的第一方面的一种实施方式中，本方法还另外包括在检测所述扩增产物之前根据大小或分子量分离扩增产物的步骤。根据大小或分子量的分离可例如利用电泳例如凝胶电泳或色谱技术进行。
扩增反应优选选自下组：聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、基于转录的扩增体系(TAS)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、滚环扩增(RCA)、转录介导的扩增(TMA)、自主序列复制(3SR)、Qβ扩增和(热稳定性)解旋酶依赖性扩增((t)HAD)。更优选扩增反应是PCR。最优选扩增反应是多重PCR，即在单个管中扩增一种以上目标核酸序列。可同时扩增例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个基因座(目标核酸序列)。
如上所述，可例如在同一反应管中同时扩增或例如在不同的反应管中分别扩增核酸序列(即基因座)，。本发明的方法优选同时扩增所述基因座。
在同时检测扩增反应扩增产物的方法的一种具体实施方式中，扩增反应是实时多重聚合酶链反应，所述方法包括以下步骤：
(i)利用侧接所述待扩增序列的引物对同时扩增至少4种核酸序列；
(ii)对各待扩增序列采用至少一种寡核苷酸探针检测所述扩增产物，其中所述寡核苷酸探针与所述扩增产物上的序列基本互补，
其中，荧光染料与各寡核苷酸探针共价连接，其中第一染料是5-FAM或6-FAM或其混合物，第二染料选自DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560或ATTO 532，第三染料选自ATTO 550、DY-555或DY-556，第四染料选自ROX、DY-510XL或ATTO 565，且任选地，第五荧光染料选自DY-632或DY-520XL。
在本发明的方法一种优选实施方式中，第三染料是ATTO 550或DY-556。在另一种优选实施方式中，第三染料是ATTO 550或DY-555。在另一种优选实施方式中，第三染料是ATTO 550。
在本方法的一种优选实施方式中，第二染料是DY-530，第三染料是ATTO 550，第四染料选自ROX或DY-510XL。更优选地，第四染料是DY-510XL。
当使用选自DY-632或DY-520XL的第五染料时，第三染料优选ATTO550，第四染料优选选自DY-510XL或ATTO 565。
在本发明的一些具体实施方式中，至少一种染料与寡核苷酸大小标记共价连接。换言之，在一种优选实施方式中，至少一种核酸是寡核苷酸大小标记。优选地，所述第四核酸为寡核苷酸大小标记。寡核苷酸大小标记是一种大小限定的寡核苷酸或大小限定的寡核苷酸的混合物。在混合物的情况中，所有相同大小的寡核苷酸可与相同的荧光染料连接，或所有寡核苷酸可与相同的荧光染料连接。
本发明还涉及包含以下组分的组合物：
(i)与选自5-FAM或6-FAM或其混合物的荧光染料共价连接的第一核酸；
(ii)与选自DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560或ATTO 532的荧光染料共价连接的第二核酸；
(iii)与选自ATTO 550、DY-555或DY-556的荧光染料共价连接的第三核酸；和
(iv)与选自ROX、DY-510XL或ATTO 565的荧光染料共价连接的第四核酸。
在一种具体实施方式中，所述组合物还包含：
(v)与选自DY-632或DY-520XL的荧光染料共价连接的第五核酸。
优选地，第三染料是ATTO 550，第四染料选自DY-510XL或ATTO 565。
在所述组合物的一种实施方式中，组合物中各核酸是相同等位基因梯的成员。换言之，本发明在一个方面涉及包含上述标记核酸的组合物的等位基因梯。
本发明的组合物可用作大小标记。在该情况中，各不同核酸具有限定的已知长度。因此，在所述组合物的一种优选实施方式中，至少一种核酸是寡核苷酸大小标记。优选地，所述第四核酸为寡核苷酸大小标记。
在本发明组合物的一种具体实施方式中，第一染料是5-FAM或6-FAM或其混合物，第二染料选自DY-530、CAL Fluor Orange 560或ATTO 532，第三染料选自ATTO 550、DY-555或DY-556，第四染料选自DY-510XL或ATTO 565，且任选地，第五荧光染料选自DY-632或DY-520XL。在本发明组合物的另一个具体实施方式中，第一染料是5-FAM或6-FAM或其混合物，第二染料选自DY-530或ATTO 532，第三染料选自ATTO 550、DY-555或DY-556，第四染料选自DY-510XL或ATTO 565，且任选地，第五荧光染料选自DY-632或DY-520XL。
本发明还涉及用于多重PCR的试剂盒，其包含适于共价连接到用于多重PCR的核苷酸、引物、大小标记或寡核苷酸探针的至少4种不同的荧光染料，其中第一染料是5-FAM或6-FAM或其混合物，第二染料选自DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560或ATTO 532，第三染料选自ATTO 550、DY-555或DY-556，第四染料选自ROX、DY-510XL或ATTO 565，且任选地，第五荧光染料选自DY-632或DY-520XL。
本发明在另一方面涉及用于多重PCR的试剂盒，其包含：
(i)与选自5-FAM或6-FAM或其混合物的荧光染料共价连接的至少一种第一核酸；
(ii)与选自DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560或ATTO 532的荧光染料共价连接的至少一种第二核酸；
(iii)与选自ATTO 550、DY-555或DY-556的荧光染料共价连接的至少一种第三核酸；和
(iv)与选自ROX、DY-510XL或ATTO 565的荧光染料共价连接的至少一种第四核酸。
在本发明试剂盒的具体实施方式中，所述第一、第二、第三和/或第四核酸可以是探针。这些核酸中的一种或多种还可以是大小标记。
具体而言，本发明的试剂盒是用于多重PCR的试剂盒，其包含：
(i)至少三种不同的引物对，其中荧光染料与各引物对的至少一种引物共价连接；和
(ii)任选地包含寡核苷酸大小标记，其中荧光染料与所述大小标记共价连接；
其中使用至少4种不同染料，其中第一染料是5-FAM或6-FAM或其混合物，第二染料选自DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560或ATTO 532，第三染料选自ATTO 550、DY-555或DY-556，第四染料选自ROX、DY-510XL或ATTO 565，且任选地，第五荧光染料选自DY-632或DY-520XL。
在一种优选实施方式中，所述试剂盒包含至少5种不同的荧光染料，其中第三染料是ATTO 550，第四染料选自由DY-510XL或ATTO 565。
在本发明试剂盒的一种具体实施方式中，第一染料是5-FAM或6-FAM或其混合物，第二染料选自DY-530、CAL Fluor Orange 560或ATTO 532，第三染料选自ATTO 550、DY-555或DY-556，第四染料选自DY-510XL或ATTO 565，且任选地，第五荧光染料选自DY-632或DY-520XL。在本发明试剂盒的又一种具体实施方式中，第一染料是5-FAM或6-FAM或其混合物，第二染料选自DY-530或ATTO 532，第三染料选自ATTO 550、DY-555或DY-556，第四染料选自DY-510XL或ATTO 565，且任选地，第五荧光染料选自DY-632或DY-520XL。
本发明的范围还包括至少4种荧光染料的组合物在多重聚合酶链反应中的应用，其中各染料与和侧接待扩增基因座的序列基本互补的寡核苷酸引物或和待扩增基因座上的序列基本互补的寡核苷酸探针共价连接，其中
(i)第一染料是5-FAM或6-FAM或其混合物，
(ii)第二染料选自DY-530、HEX、CAL Fluor Orange 560或ATTO532，
(iii)第三染料选自ATTO 550、DY-555或DY-556，
(iv)第四染料选自ROX、DY-510XL或ATTO 565，以及选自DY-632或DY-520XL，
(v)任选地，第五染料选自DY-632或DY-520XL。
在本发明所述应用的一种实施方式中，第三染料是ATTO 550或DY-556。在所述应用的一种实施方式中，第三染料是ATTO 550。
在本发明所述应用的另一种实施方式中，第三染料是ATTO 550，第四染料选自由DY-510XL或ATTO 565。
在本发明所述应用的另一种实施方式中，第二染料是DY-530，第三染料是ATTO 550，第四染料选自ROX或DY-510XL。
当使用选自DY-632或DY-520XL的第五染料时，优选第二染料是DY-530，第三染料是ATTO 550，第四染料是DY-510XL。
在至少4种荧光染料的组合物的应用的一种具体实施方式中，第一染料是5-FAM或6-FAM或其混合物，第二染料选自DY-530、CAL Fluor Orange560或ATTO 532，第三染料选自ATTO 550、DY-555或DY-556，第四染料选自DY-510XL或ATTO 565，且任选地，第五荧光染料选自DY-632或DY-520XL。在至少4种荧光染料的组合物的应用的另一种具体实施方式中，第一染料是5-FAM或6-FAM或其混合物，第二染料选自DY-530或ATTO532，第三染料选自ATTO 550、DY-555或DY-556，第四染料选自DY-510XL或ATTO 565，且任选地，第五荧光染料选自DY-632或DY-520XL。
在本发明所述应用的一些实施方式中，一种染料与寡核苷酸大小标记共价连接。
本发明的方法、试剂盒和组合物还可用于法医学和亲子鉴定。
美国专利第6,316,610号和EP 1 155 027 B1公开了5-FAM(5-羧基荧光素)和6-FAM(6-羧基荧光素)、HEX(6-羧基-2′，4，4′，5′，7，7′-六氯荧光素)、VIC(2′-氯-7′苯-1，4-二氯-6-羧基荧光素)、NED(2′-氯-5′-氟-7′，8′-苯并-1，4-二氯-6-羧基荧光素)和ROX(5-羧基-X-罗丹明)的结构(参见US 6,316,610B2和EP 1 155 027 B1的图3-5)。DY-530、DY-556、DY-510XL、DY-632和DY-520XL的结构分别见附图1A-E所示。ATTO 565的结构见附图2所示。CAL Fluor 560 Orange、CAL Fluor Red 590、CAL Fluor Red 610和CALFluor Red 635的亚磷酰胺结构分别见附图3A-D所示。DY-555的结构见图5所示。DY-530、DY-556、DY-510XL、DY-632和DY-520XL是德国耶拿的戴欧米克斯公司(Dyomics GmbH，Jena，Germany)的产品。ATTO 532、ATTO550和ATTO 565是德国锡根的ATTO-TEC公司(ATTO-TEC GMBH，Siegen，Germany)的产品。VIC、NED、PET和LIZ是美国加利福尼亚州福斯特城的应用生物系统公司的产品。CAL Fluor 560 Orange、CAL Fluor Red 590、CALFluor Red 610和CAL Fluor Red 635是美国加利福尼亚州诺瓦托的生物探索技术公司(Biosearch Technologies Inc.，Novato，CA，USA)的产品。
本发明中染料与核苷酸、引物、探针和/或标记的连接可通过技术人员已知的标准偶联反应，例如通过N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯或亚磷酰胺偶联实现。
本发明所述荧光染料的具体组合物可用于应用生物系统公司((美国加利福尼亚州福斯特城)的ABI Prism系列遗传分析仪(310、3100、3130等)的自动DNA测序装置。还可用于使用相同的光学配置进行多波长检测的其它电泳设备。此外，可使用常规的实时PCR设备，例如应用生物系统公司(的ABI Prism序列检测系统(SDS)系列、司查塔基公司(Stratagene)(美国加利福尼亚州拉霍亚(La Jolla，CA，USA))的Mx系列或艾本德公司(Eppendorf)(德国汉堡)的Mastercyclerep realplex。
荧光染料6-FAM、VIC、NED、PET或ROX与LIZ是应用生物系统公司一度最推荐的分别用于多波长检测试验中蓝、绿、黄、红和橙色道的染料。本发明所述荧光染料的具体组合物已与本领域已知组合物进行了比较，如所附实施例3所示具有如下技术优势。本发明染料组合物的优势特别是其相对灵敏度方面见实施例3的表4所示。与本领域已知的染料组合物相比，获得了更好的灵敏度，具体而言，ATTO 532、DY-530和CAL Fluor Orange 560与使用VIC的组合物相比灵敏度更好。比较而言，ATTO 550所得结果比NED好，DY-510XL比PET好。因此，发现新的染料组合物显著改善了绿、黄和红色标记的PCR扩增子的灵敏度。这为设计灵敏的多重PCR提供了更多的灵活度，特别是在法医学领域(例如污点检测)和临床应用(例如癌症和产前诊断)中。新的绿、黄和红色染料还可与已知的兼容染料联用，例如，组合物6-FAM、VIC、ATTO 550和ROX或6-FAM、VIC、ATTO 550、PET和DY-632(数据未显示)。可采用其它组合物。
此外，鉴定出染料DY-632和DY-520XL可替代LIZ用于新的内部长度标准的合成。实施例2和4显示就DY-632而言此类标准在60-380bp范围内(增幅20bp)的可行性。
如实施例1和3所示，无法通过观察荧光染料的光谱数据(例如，最大吸收和发射、消光系数)来确定它们对多重核酸检测的染料组合物的适用性。荧光染料的具体组合物的选择不能仅从各染料的光谱性质推断得到。
如上所述，ABI Prism遗传分析仪具有独特的设置。所述设备的光学规格尚未完全公开(例如，虚拟滤光片组中数字带通滤波器的确切位置、校正染料重叠荧光发射光谱的算法)。在DNA序列自动装置的检测单元中在电泳条件下进行记录之前，荧光染料的光谱数据都不存在，特别是来自应用生物系统公司的染料。因此，无法根据标准化公开染料光学性质(最大激发和发射、量子产率等)或其它设备(例如实时热循环仪)的推荐选择和ABI Prism遗传分析仪兼容的染料组合物，而是必须在适当的运行(缓冲液、pH)和检测条件(虚拟滤光片组、光谱校准)进行评估(见实施例1)。此外，必须确保共价标记的PCR扩增子在毛细管电泳中产生具有精确大小分辨率的单个片段峰。对于只能以非对映异构体混合物形式得到的荧光染料来说，有时并非如此。对于这一事实，按厂商所述为三种非对映异构体的混合物的染料ATTO 550令人感兴趣并出乎意料地在50-400碱基范围内产生明显的单个扩增子的峰。最后，所有染料在所有应用条件(例如，寡核苷酸合成、寡核苷酸纯化、PCR和毛细管电泳)下必须具有化学和物理稳定性。必须凭经验评估各种无法测知性因素。为此，详细描述了新的基于PCR的染料组合物的评估试验(实施例3)。
附图简述
图1：来自戴欧米克斯公司(德国耶拿)的荧光染料的结构。(A)DY-530游离羧酸，(B)DY-556NHS酯、一钠盐，(C)DY-632游离酸、二钠盐，(D)DY-510XL游离羧酸，(E)DY-520XL羧酸。在(A)、(C)、(D)和(E)的情况中，游离羧基用于寡核苷酸5′端的NHS偶联。
图2：来自ATTO-TEC公司(德国锡根)的荧光染料的结构。(A)ATTO 565(高氯酸盐)NHS酯，(B)ATTO 550，一种非对映异构体的游离酸。游离羧基用于寡核苷酸5′端的NHS偶联。
图3：来自生物探索技术公司(美国加利福尼亚州诺瓦托)的荧光染料的结构。(A)CAL Fluor Orange 560，(B)CAL Fluor Red 590，(C)CAL FluorRed 610，(D)CAL Fluor Red 635。iPr：异丙基，CE：β-氰基乙基。
图4：通过多重PCR扩增和具有重叠片段范围的4种短串联重复(STR)的基因分型进行人DNA序型分析。所示电泳图显示碱基对[bp]表示的片段大小上6-FAM、DY-530、ATTO 550、DY-510-XL和DY-632染料的相对荧光单位(RFU)。如实施例4所述，从500pg基因组DNA开始进行多重PCR和基因分型。利用内部DY-632标记的大小标准品计算片段大小(底部的电泳图)。在各电泳图的底部空白处标注了STR基因座的名称及其片段范围。
图5：荧光染料DY-555(戴欧米克斯公司(德国耶拿))的结构。DY-555的NHS酯，氯化盐的结构。
实施例
实施例1：记录溶于电泳缓冲液中的荧光染料标记的寡核苷酸的光谱数据
荧光染料的光谱特性受到溶剂系统、缓冲液组成和pH值的显著影响。通常，未偶联荧光染料的公开光谱数据由染料生产商在水或有机溶剂如甲醇、乙醇、二甲基甲酰胺或二甲基亚砜中记录。很少得到在限定的PCR缓冲液中测得的数据，且此前没有用DNA序列自动装置的检测单元在电泳条件下记录的数据，特别是本发明关注的那些来自应用生物系统公司(美国加利福尼亚州福斯特城)的染料。此外，已知荧光染料的光谱特性在与寡核苷酸偶联后会改变。
在服务性实验室(例如，比利时瑟兰的友基公司(Eurogentec SA，Seraing，Belgium)；美国加利福尼亚州福斯特城的应用生物系统公司)，通过标准的亚磷酰胺化学法合成寡核苷酸引物。荧光染料通过N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯偶联(Giusti WG，Adriano T.“5′-荧光染料标记的寡核苷酸的合成和表征(Synthesisand characterization of 5′-fluorescent-dye-labeled oligonucleotides)”.PCR MethodsAppl 2：223-227，1993)或标准的亚磷酰胺化学法(Theisen P，McCollum C，AndrusA.“寡核苷酸的荧光染料亚磷酰胺标记(Fluorescent dye phosphoramidite labellingof oligonucleotides)”.Nucleic Acids Symp Ser 27，pp.99-100，1992)与寡核苷酸的5′端共价连接。所有引物在服务性实验室通过离子对反相高效液相色谱或聚丙烯酰胺凝胶电泳按照标准方法纯化，溶于TE-缓冲液(10mM Tris/HCl，室温调至pH 8.0，1mM EDTA)至100μM浓度，4℃避光保存直至进一步使用。
分别将寡核苷酸稀释20倍和2000倍以便进行紫外/可见光(UV/Vis)光谱和荧光测定，测定在ABI Prism遗传分析仪的毛细管电泳凝胶缓冲液中进行，其由100mM N-[三-(羟甲基)-甲基-3-氨基]-丙磺酸(TAPS)/NaOH(pH 8.0，室温下调节)，8M尿素和5％2-吡咯烷酮组成(Rosenblum BB，Oaks F，MenchenS，Johnson B.“改善的毛细管电泳中单链DNA的筛分精确度(Improvedsingle-strand DNA sizing accuracy in capillary electrophoresis.)”Nucleic Acids Res，25，pp.3925-3929，1997)。用SPECORDS 100 Bio UV/VIS-分光光度计(德国耶拿的耶拿艾纳立提克公司(Analytik Jena AG，Jena，Germany))记录200nm到700nm之间的吸收光谱。用SPEXFluorolog-3荧光分光光度计(美国纽约州爱迪生的荷瑞巴JY公司(HORIBA Jobin Yvon Inc，Edison，NY，USA))分析荧光光谱。使用与ABI Prism遗传分析仪氩激光器的主发射波长对应的488nm的激发波长，并记录520nm到700nm之间的发射光谱。
表2：不同荧光染料在其最大发射时的最大发射和相对信号高度。染料标记的寡核苷酸(引物WB 94，DNA序列5′-[染料]-AGATTGTACTGAGAGTG-3′)以相同浓度溶于ABI Prism遗传分析仪的毛细管电泳凝胶缓冲液中。使用488nm的激发波长。将测得的最大激发和发射与文献数据比较。记录最大发射的信号高度(RFU，相对荧光单位)。将6-FAM的信号高度设为100％以便计算相对信号高度。
表2总结了连接在引物WB 94的5′端(DNA序列5′-[染料]-AGATTGTACTGAGAGTG-3′)的染料的测定结果。可观察到公开的和测定的最大激发的染料特异性差异最多达21nm(DY-520XL)，最大发射的差异最多达10nm(DY-556)。所述结果不能从公开数据预测得到。
实施例2：用于ABI Prism310遗传分析仪和Prism3130遗传分析仪光谱校准的色矩阵标准(matrix standard)设定
在对标记DNA片段大小进行任何分析之前，必须为各染料组合物和应用生物系统公司的各DNA序列分析仪生成荧光标记的光谱校准。光谱校准为选定的多色滤光片组(同时检测4或5种不同颜色)产生数学矩阵来校正染料荧光发射谱的重叠。ABI Prism310遗传分析仪的矩阵标准组由针对每个颜色的至少5种标记PCR扩增子片段的混合物组成，这些扩增子应在毛细管电泳中清晰地分离并应产生约为1000-3000相对荧光单位(RFU)的信号高度。因此，该类型设备分别需要4或5种不同的标记片段混合物。相反，ABI Prism3130或3130XL遗传分析仪的矩阵标准由限定的颜色组合物(4色或5色)中所有颜色的一种不同标记的PCR扩增子片段的混合物组成，这些扩增子应可毛细管电泳中清晰地分离并产生约为1000-3000RFU的信号高度。
矩阵标准组通过PCR制得。所有试剂和其它消耗品均为PCR质量级，特别是不含DNA、DNA-和RNA-依赖性核酸酶。PCR引物的合成和纯化如实施例1所述。质粒pUC19(1μg)(Yanisch-Perron C，Vieira J，Messing J.“改进的M13噬菌体克隆载体和宿主菌株：M13mp18和pUC19载体的核苷酸序列(ImprovedM13 phage cloning vectors and host strains：nucleotide sequences of the M13mp18and pUC19 vectors)”.Gene，33，pp.103-119，1985)用DNA限制性内切核酸酶Aat II(美国马萨诸塞州伊普斯维奇的新英格兰生物实验室(New England Biolabs，Ipswich，MA，USA)；根据生产商的说明书使用)线性化，纯化(德国希尔登的凯杰公司的QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAquick PCR purification kit，Qiagen，Hilden Germany)；根据生产商说明书使用)，并用UV-VIS光谱法在260nm下定量(Sambrook J，Fritsche EF，Maniatis T.《分子克隆：实验室手册》(MolecularCloning：A Laboratory Manual)，第2版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press)，1989)。PCR引物(见表3)设计为以20bp的增量产生60bp到300bp的扩增子。称为Alpha 3的PCR引物在其5′端标记有相应的荧光染料，并在单一PCR中分别与引物WB 80到WB300中的一种联用。
表3：用于矩阵和长度标准的PCR引物。引物Alpha 3在其5′端标记有各荧光染料。
该酶反应的总体积为25μL，包含50mM Tris/HCl(室温调至pH 8.8)、20mM NH4SO4、0.2mM dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP的等摩尔混合物)、1.5mM MgCl2、1.5单位JumpStartTM Taq DNA聚合酶(德国特克恩的西格玛奥德里奇化学品公司(Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，Germany))、200μg/mL牛血清白蛋白(德国曼海姆的罗氏诊断公司(RocheDiagnostics GmbH、Mannheim、Germany))、0.01％吐温20、200nM引物、和1.0pg线性化质粒DNA。采用ABI 9600(美国加利福尼亚州福斯特城的应用生物系统公司)热循环仪。循环条件由以下组成：95℃初始热激活240秒；然后94℃变性30秒、60℃引物退火120秒、72℃引物延伸75秒，共30个循环。所有温度变化的速度设定为1℃/秒。然后，68℃下进行3600秒的最后延伸步骤，以通过Taq DNA聚合酶的固有末端转移酶活性，最大程度增加在模板3′端独立添加一种核苷酸(优选A)。如上所述纯化并定量分析PCR产物。用TE缓冲液(1mM Tris/HCl，室温调至pH 8.0；0.1mM EDTA)稀释PCR产物。
取1μL纯化PCR产物的等份试样，与12.5μL HiDiTM甲酰胺(应用生物系统公司)混合。95℃使样品变性3分钟，冷却至10℃，电泳前室温保存。用ABI Prism 313或3130遗传分析仪(应用生物系统公司)通过毛细管电泳分离PCR片段。电动力法(10秒，ABI Prism 310或3130遗传分析仪分别为15,000V或3,000V)注入样品。电泳运行条件如下：60℃以15.000V处理单根毛细管(ABI Prism 310遗传分析仪)或含4根毛细管(ABIPrism 3130遗传分析仪)(内径50μm，长度约40cm)的毛细管阵列25分钟，毛细管中填充有POP-4[4％聚-(N，N-二甲基丙烯酰胺)、8M尿素、5％2-吡咯烷酮、100mM(羟甲基)-甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)/NaOH，室温调至pH8.0；应用生物系统公司]。在ABI Prism 310遗传分析仪的情况中，分别使用滤光片组D或G5同时检测4或5种染料。在ABI Prism 3130遗传分析仪的情况中，分别使用滤光片组“any4dyes”或“any5dyes”同时检测4或5种颜色。采用Genmapper软件(美国加利福尼亚州福斯特城的应用生物系统公司)计算峰高。随后，制备并混合适当稀释的PCR产物以获得峰高约1000-3000RFU的矩阵标准。然后用DNA测序自动装置的数据采集软件中适当的光谱校准软件模块记录矩阵文件并保存以供后续分析。
用于ABI Prism 310遗传分析仪的用ROX、DY-632和DY-520XL标记的多片段矩阵标准也可用作内部长度标准(见实施例4)。在一些实施方式中，向矩阵标准中添加其它分别使用与PCR引物Alpha 3联用的PCR引物WB 320、WB 340、WB 360和WB 380(见表1)的染料标记PCR扩增子以扩展长度标准的范围。
实施例3：评估用于ABI Prism遗传分析仪的新型荧光染料组合物。
ABI Prism遗传分析仪系列用于DNA测序或DNA片段大小分析中标记单链DNA的高精度分离，并经验证。该设备不适于绝对定量。因为在进行批次间精确性实验时，经常观察到12％或更高的峰高均值的相对标准偏差(68％置信度)。每次运行时，毛细管都用新的缓冲聚合物溶液填充。此外，设备之间存在的灵敏度差异值得关注。由于这些变化，详细描述了用于评估新型荧光染料组合物的带有内部归一化的试验。为此设计了能标记扩增子两条链的PCR。
引物的合成和纯化如实施例1所述。将如实施例2所述线性化并纯化的质粒pUC19作为模板DNA。利用引物WB 94(DNA序列5′-[染料]-AGATTGTACTGAGAGTG-3′)用感兴趣的染料标记PCR扩增子的一条DNA链的5′端。扩增子的另一DNA链包含引物Alpha 3FAM(DNA序列5′-[6-FAM]-TTTTTT-[HEG]-AGCCTGAATGGCGAATGG)，具有6-FAM作为通用归一化染料标准。此外，Alpha 3FAM在其模板特异性序列的5′端含有通过内部六聚乙二醇部分桥接的5个胸苷残基作为Taq DNA聚合酶的终止子(Newton CR，Holland D，Heptinstall LE，Hodgson I，Edge MD，MarkhamAF，McLean MJ.“采用结合新亚磷酰胺中间体的引物生产具有5′单链尾的PCR产物(The production of PCR products with 5′single-stranded tails usingprimers that incorporate novel phosphoramidite intermediates)”.Nucleic AcidsRes，21，1155-1162页，1993)。因此，含有Alpha 3FAM的DNA链显著大于具有感兴趣的荧光染料的DNA链，且两条链可以通过毛细管电泳清晰地分离。PCR、PCR纯化和毛细管电泳如实施例2所述进行。
毛细管电泳后采用软件GeneScan Analysis和GeneMapper利用相应的矩阵文件(见实施例2)分析样品。用感兴趣染料标记的DNA链的峰面积通过互补DNA链的6-FAM信号归一化，而6-FAM信号设为100％。选择的染料组合物的结果总结在表4中。
实施例4：ABI Prism遗传分析仪中利用新的5色组合物检测具有重叠片段大小范围的4个STR基因座的多重PCR
详细描述了用于具有重叠片段大小范围的4个STR基因座的基因分型的多重PCR，以便测试一种新型荧光染料组合物的可用性。
基本的分子遗传学实验按照Sambrook等(1989)(Sambrook J，FritscheEF，Maniatis T.《分子克隆：实验室手册》(Molecular cloning.A laboratorymanual).第2版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor LaboratoryPress)，1989)所述进行。人类检测样品是全血或痰液，后者按照生产商说明书用无菌口颊拭子(德国文森/陆赫的NP公司(Nerbe Plus GmbH，Winsen/Luhe，Germany))收集。按照生产商说明书采用NucleoSpin组织试剂盒(德国多让的M&N公司(Macherey和Nagel，Dueren，Germany))提取DNA。用记录核苷酸碱基260nm吸光度的UV/VIS光谱(Sambrook等，1989)，或采用QuantifylerTM人DNA定量试剂盒(美国加利福尼亚州福斯特城的应用生物系统公司)和ABI Prism 7000 SDS实时热循环仪(美国加利福尼亚州福斯特城的应用生物系统公司)进行定量实时PCR(qPCR)来进行DNA定量分析。
选用人STR基因座vWA(GenBank登录号M25858)、D12S391(GenBank登录号G08921)、D18S51(GenBank登录号L18333)和D19S433(GenBank登录号G08036)。利用NCBI(美国马里兰州贝塞斯达的国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA))的智人(Homo sapiens)DNA数据库RefSeq Build 35设计引物。PCR引物设计使用Primer3软件(Rozen S，Skaletsky HJ.“在互联网上供普通用户和生物学家程序员使用的Primer3(Primer3 on the www for general users and for biologist programmers)”.刊于：Krawetz S和Misener S(编)的《生物信息学方法和步骤：分子生物学方法(Bioinformatics Methods and Protocols：Methods in Molecular Biology)》.新泽西州托托瓦的休玛纳出版社(Humana Press，Totowa，NJ)，365-386页，2000)完成。用Blastn软件根据人基因组序列核查引物的特异性(局部比对搜索基本工具核苷酸(Basic Local Alignment Search Tool nucleotides)；Altschul SF，Gish W，Miller W，Myers EW，Lipman DJ.“局部比对搜索基本工具(Basic local alignment search tool)”.J Mol Biol，第215卷，403-410页，1990)。用自身二聚体(Autodimer)软件控制多重PCR引物对的相容性(Vallone PM，Butler JM.“自身二聚体：引物二聚体和发夹结构的筛选工具(AutoDimer：a screening tool for primer-dimer and hairpin structures)”Biotechniques，第37卷，226-231页，2004)。引物的合成和纯化如实施例1所述。
PCR的设定如实施例2所述，其中改变如下：PCR中使用的寡核苷酸引物及其终浓度如表5所示，每个反应中使用500pg人基因组DNA作为模板DNA。
表5：用于ABI Prism遗传分析仪的新型荧光染料组合物的评估。Nd：未测定。
取1μL纯化PCR产物的等份试样，与12.0μL HiDiTM甲酰胺(应用生物系统公司)和0.5μL DY-632标记的长度标准混合。长度标准如实施例2所述合成并用TE缓冲液稀释，以便产生约700-1000RFU/0.5μL的信号高度。样品变性和毛细管电泳如实施例3所述，利用ABI Prism310遗传分析仪和虚拟滤光片组G5完成。通过GeneMapper软件分析数据。应用滤光片组G5的染料组合物6-FAM、DY-530、ATTO 550、DY-510XL和DY-632的预运行染料矩阵文件。显示所有4个STR基因座均为杂合的基因组DNA结果的电泳图见图4所示。如图所示，5种染料可清晰地分离，没有光谱重叠。扩增子产生片段尖峰，且通过自制长度内部长度标准调取的大小是精确和可重现的。
在所附的说明性实施例中使用了下列示例性PCR引物：
表6：实施例中所用PCR引物及其各自SEQ ID NO的列表
| 序列 | 引物 | 序列 | 引物 |
| SEQ ID NO：1 | PCR引物WB60 | SEQ ID NO：15 | PCR引物WB320 |
| SEQ ID NO：2 | PCR引物WB80 | SEQ ID NO：16 | PCR引物WB340 |
| SEQ ID NO：3 | PCR引物WB94 | SEQ ID NO：17 | PCR引物WB360 |
| SEQ ID NO：4 | PCR引物WB100 | SEQ ID NO：18 | PCR引物WB380 |
| SEQ ID NO：5 | PCR引物WB120 | SEQ ID NO：19 | PCR引物Alpha3 |
| SEQ ID NO：6 | PCR引物WB140 | SEQ ID NO：20 | PCR引物vWA-F |
| SEQ ID NO：7 | PCR引物WB160 | SEQ ID NO：21 | PCR引物vWA-R |
| SEQ ID NO：8 | PCR引物WB180 | SEQ ID NO：22 | PCR引物D12S391-F |
| SEQ ID NO：9 | PCR引物WB200 | SEQ ID NO：23 | PCR引物D12S391-R |
| SEQ ID NO：10 | PCR引物WB220 | SEQ ID NO：24 | PCR引物D18S51-F |
| SEQ ID NO：11 | PCR引物WB240 | SEQ ID NO：25 | PCR引物D18S51-R |
| SEQ ID NO：12 | PCR引物WB260 | SEQ ID NO：26 | PCR引物D19S433-F |
| SEQ ID NO：13 | PCR引物WB280 | SEQ ID NO：27 | PCR引物D19S433-R |
| SEQ ID NO：14 | PCR引物WB300 |
Claims (11)
1.一种同时检测样品中的4种或5种核酸的方法，所述方法包括在扩增反应中检测荧光染料在激发后的荧光发射的步骤，其特征在于，所述扩增反应是实时多重聚合酶链反应，且所述方法包括以下步骤：
(i)利用侧接待扩增序列的引物对同时扩增4种或5种待扩增的核酸序列；
(ii)对各待扩增的核酸序列采用至少一种寡核苷酸探针检测扩增产物，其中所述寡核苷酸探针与所述扩增产物上的序列互补，
其中，对于待检测的每种核酸，有一种荧光染料共价连接于其寡核苷酸探针或共价连接于其引物对中的至少一个引物，且采用4种或5种不同染料，其中第一染料是6-FAM，第二染料是DY-530，第三染料是ATTO 550，第四染料是DY-510XL，且在使用5种不同染料时，第五荧光染料是DY-632。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，至少一种核酸是寡核苷酸大小标记。
3.一种组合物，其包含：
(i)与荧光染料6-FAM共价连接的第一核酸；
(ii)与荧光染料DY-530共价连接的第二核酸；
(iii)与荧光染料ATTO 550共价连接的第三核酸；和
(iv)与荧光染料DY-510XL共价连接的第四核酸。
4.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，其还包含：
(v)与荧光染料DY-632共价连接的第五核酸。
5.如权利要求3或4所述的组合物，其特征在于，至少一种核酸是寡核苷酸大小标记。
6.如权利要求3或4所述的组合物，其特征在于，各核酸是相同的等位基因梯的成员。
7.一种用于多重PCR的试剂盒，其包含：
(i)与荧光染料6-FAM共价连接的一种第一核酸；
(ii)与的荧光染料DY-530共价连接的一种第二核酸；
(iii)与荧光染料ATTO 550共价连接的一种第三核酸；和
(iv)与荧光染料DY-510XL共价连接的一种第四核酸。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述第一、第二、第三和/或第四核酸是探针或引物。
9.如权利要求7所述用于多重PCR的试剂盒，其特征在于，其包含：
(i)至少3种不同的引物对，其中荧光染料与各引物对的至少一种引物共价连接；和
(ii)寡核苷酸大小标记，其中荧光染料与所述大小标记共价连接。
10.如权利要求7-9中任一项所述的试剂盒，其特征在于，其包含5种不同的荧光染料，其中第五染料是DY-632。
11.4种或5种荧光染料的组合物在多重聚合酶链反应中的应用，其中各染料与和侧接待扩增基因座的序列互补的寡核苷酸引物或和待扩增基因座上的序列互补的寡核苷酸探针共价连接，其中
(i)第一染料是6-FAM，
(ii)第二染料是DY-530，
(iii)第三染料是ATTO 550，
(iv)第四染料是DY-510XL或ATTO 565，以及
(v)对于5种荧光染料的组合物，第五染料是DY-632。
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