CN101998990B - 流感病毒疫苗抗原制备方法的改进 - Google Patents

Abstract

公开了从裂解的流感病毒制备疫苗抗原的许多改进。裂解步骤之后可以是去污剂交换。裂解可在存在较高离子强度的缓冲液和/或存在磷酸盐缓冲液时进行。

Description

流感病毒疫苗抗原制备方法的改进

本申请要求美国临时申请61/069,868(2008/3/18提交)的优先权，其全部内容被纳入本文作为参考。

技术领域

本发明涉及流感疫苗制备领域。

背景技术

参考文献1的第17和18章描述了目前常规使用的流感疫苗。它们基于活病毒或灭活病毒，灭活疫苗可以基于完整病毒、′裂解′病毒或纯化的表面抗原(包括血凝素以及也是通常使用的神经氨酸酶)。

已知有许多不同的制备裂解抗原疫苗和表面抗原疫苗的方法。例如，各种裂解过程如参考文献2-8所述，而制备表面抗原疫苗的不同方法披露于参考文献9-14。

本发明的目的是提供制造裂解疫苗和表面抗原疫苗的改良方法。

发明内容

发明人曾经对现有的从裂解的流感病毒制备疫苗抗原的方法设计了许多改进。

去污剂使用时间的改进

在现有纯化方法中，流感病毒颗粒先接触第一去污剂(例如聚山梨酸酯，如聚山梨酸酯80)，然后用第二去污剂(例如CTAB)裂解。第一去污剂在病毒灭活之前使用，而第二去污剂在灭活之后加入。在上述方法中，第二去污剂随后除去，而第一去污剂仍旧保留，从而有助于抗原溶解。

相反，根据本发明的第一个方面，第一去污剂较晚使用，具体地说是在已经用第二去污剂裂解病毒颗粒之后。这种时间和顺序的变化使得抗原产量提高了20倍以上，尤其是对于H5亚型的甲型流感病毒。

因此，本发明提供了一种分裂流感病毒颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：(i)在不存在去污剂时获得包含流感病毒颗粒的组合物；(ii)在不存在去污剂时灭活所述流感病毒颗粒；(iii)用包含第一去污剂的试剂裂解灭活的病毒颗粒；和(iv)用第二去污剂交换第一去污剂。所述去污剂交换步骤可在裂解步骤之后的任何时刻进行，但在病毒颗粒捕获步骤之前进行较为理想，所述捕获步骤可通过以下方法进行，例如，亲和捕获、伪亲和捕获、层析或吸附(见下文)。因此，第二去污剂可在裂解之后但在病毒颗粒捕获之前加入。可在病毒颗粒捕获之后再加入额外量的第二去污剂，尤其是如果之前加入的第二去污剂的量小于1.5g/L时。

通过这种方法获得的分裂的病毒颗粒可用于制备流感疫苗。

本发明还提供了一种分裂流感病毒颗粒的方法，改进之处在于：在不存在去污剂时灭活流感病毒颗粒；用包含第一去污剂的试剂裂解灭活的病毒颗粒；以及在裂解后用第二去污剂交换第一去污剂。

在第一方面的其它实施方式中，所述第二去污剂是在灭活之后但在裂解之前加入的。因此，本发明提供了一种分裂流感病毒颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：(i)在不存在去污剂时获得包含流感病毒颗粒的组合物；(ii)在不存在去污剂时灭活所述流感病毒颗粒；(iii)加入第二去污剂但不裂解灭活的病毒颗粒；(iv)在存在第二去污剂时用包含第一去污剂的试剂裂解灭活的病毒颗粒；和(v)除去第一去污剂同时保留第二去污剂。

通过这种方法获得的分裂的病毒颗粒可用于制备流感疫苗。

本发明还提供了一种分裂流感病毒颗粒的方法，改进之处在于：在不存在去污剂时灭活所述流感病毒颗粒；在存在第二去污剂时用包含第一去污剂的试剂裂解灭活的病毒颗粒；以及在裂解之后除去第一去污剂同时保留第二去污剂。

在改进去污剂使用时间的还有其它实施方式中，去污剂是在病毒颗粒灭活之前、但在对病毒颗粒进行超滤/渗滤步骤之后加入的。因此，本发明提供了一种分裂流感病毒颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：(i)在不存在去污剂时获得包含流感病毒颗粒的组合物；(ii)对含有病毒颗粒的组合物进行超滤/渗滤；(iii)在滤过的含有病毒颗粒的组合物中加入去污剂但不裂解病毒颗粒；和(iv)灭活流感病毒颗粒。该方法还可包括步骤(v)：用去污剂裂解灭活的病毒颗粒。步骤(v)中使用的去污剂可以不同于步骤(iii)中使用的去污剂。可在步骤(v)之后加入额外量的与步骤(iii)中所用相同的去污剂，尤其是如果步骤(iii)中去污剂的加入量小于1.5g/L时。

在之前去污剂的加入量小于1.5g/L时再加入额外量的去污剂的实施方式中，额外的加入可在进一步超滤/渗滤步骤之前进行。

裂解过程的改进

流感疫苗的裂解过程涉及用增溶浓度的去污剂处理病毒颗粒。合适的去污剂包括聚山梨酸酯类(吐温类)[6]、曲通X-100[6，10，15]、溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)[9，16]和脱氧胆酸盐[2，17]。

在现有纯化过程中，在存在20mM Tris/HCl时接触去污剂而裂解流感病毒颗粒。相反，根据本发明的第二个方面，在存在具有较高离子强度缓冲液时使用去污剂。因此，本发明提供了一种分裂流感病毒颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：(i)获得包含流感病毒颗粒的组合物；(ii)通过接触用离子强度为100mM或更高的缓冲液剂配制的去污剂来裂解所述病毒颗粒。这种升高的离子强度使得抗原产量提高了20倍以上，尤其是对于H5亚型的甲型流感病毒。

通过这种方法获得的分裂的病毒颗粒可用于制备流感疫苗。

有用的缓冲液的离子强度至少为100mM，例如≥200mM、≥300mM、≥400mM、≥500mM、≥600mM、≥700mM、≥800mM，等等。可通过各种途径获得这种较高的离子强度，例如使用单价离子(如NaCl)、二价离子(如硫酸盐)、三价离子(如磷酸盐)，等等。使用三价离子是提高离子强度的便捷方法。一种适用的缓冲液，尤其是当用于基于CTAB的裂解过程时，是用50mM磷酸盐缓冲液，pH 7.5配制的200mM NaCl。在裂解过程中升高离子强度时需要小心，尤其对于细胞培养物中生长的病毒，以免造成在随后的处理步骤中需要保留的DNA大量溶解。

本发明还提供了一种分裂流感病毒颗粒的方法，改进之处在于：用离子强度为100mM或更高的缓冲液剂配制的去污剂来裂解病毒颗粒。

磷酸盐缓冲液

在现有纯化过程中，在用Tris缓冲液裂解之前、之间和之后保持流感病毒颗粒。相反，根据本发明的第三个方面，在用磷酸盐缓冲液裂解之前、之间和之后保持流感病毒颗粒。这种缓冲液变化使得抗原产量提高了20倍以上，尤其是对于H5亚型的甲型流感病毒。

因此，本发明提供了一种分裂流感病毒颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：(i)在存在磷酸盐缓冲液时获得包含流感病毒颗粒的组合物；(ii)在存在磷酸盐缓冲液时灭活所述流感病毒颗粒；和(iii)在存在磷酸盐缓冲液时裂解所述灭活的流感病毒颗粒。

通过这种方法获得的分裂的病毒颗粒可用于制备流感疫苗。有用的磷酸盐缓冲液的pH值在6.5和8.5之间，例如在7.0和8.0之间，或者约7.5。

本发明还提供了一种分裂流感病毒颗粒的方法，改进之处在于：灭活和随后的裂解病毒颗粒都在存在磷酸盐缓冲液时进行。

超滤膜

在现有纯化工艺中，半纯化的裂解后流感病毒表面抗原用聚苯醚砜(PES)膜超滤/渗滤进一步纯化。相反，根据本发明的第四个方面，超滤采用的是纤维素膜。这种膜的变化降低了疏水性和蛋白质保留，使得抗原产量提高了20倍以上，尤其是对于H5亚型的甲型流感病毒。

因此，本发明提供了一种从包含流感病毒表面糖蛋白的混合物中纯化所述糖蛋白的方法，包括用纤维素膜超滤所述混合物的步骤。通过这种方法获得的纯化糖蛋白可用于制备流感疫苗。

本发明还提供了一种通过超滤从包含流感病毒表面糖蛋白的混合物中纯化所述糖蛋白的方法，改进之处包括采用纤维素超滤膜。

可使用各种类型的纤维素膜。这些膜可基于纤维素本身、纤维素酯(例如二乙酸酯、三乙酸酯、硝酸酯，等等)或其混合物。例如，参考文献18披露了具有非纤维性聚合微孔基底的膜，膜层由纤维素和/或乙酸纤维素形成。所述膜层的厚度在1-20微米之间，并且可以延伸入微孔基底5-30微米。参考文献19披露了基于三乙酸纤维素的不对称超滤膜，该膜任选被至多达30％的二乙酸纤维素取代。参考文献20披露了形式为中空纤维的渗滤膜，其具有乙酸纤维素或乙酸纤维素衍生物构成的连续内腔。

在第一层析步骤之前加入额外处理步骤

在现有纯化工艺中，为从细胞培养物发酵培养基组分中分离流感病毒颗粒，流感病毒颗粒是从树脂上的培养收获物中捕获的。已经观察到某些毒株不能完全结合于树脂。

根据本发明的第四个方面，在捕获步骤之前将病毒收获物进行超滤/渗滤到低电导率缓冲液中。根据流感病毒毒株不同，该初始步骤可使抗原产量提高至多达10倍，且对于不结合于捕获剂的病毒颗粒尤其有用。

因此，本发明提供了一种处理含有流感病毒颗粒的液体培养基的方法，包括超滤所述液体培养基的步骤以提供包含低电导率缓冲液的含病毒颗粒渗余物。然后进一步处理该渗余物，例如通过亲和捕获、吸附、层析等等。

本发明还提供了一种从含有流感病毒颗粒的液体培养基中分离流感病毒颗粒的方法，改进之处在于在分离之前对所述液体培养基进行渗滤以提供包含低电导率缓冲液的含病毒颗粒渗余物。

本发明还提供了一种从含有病毒颗粒的液体培养基中分离流感病毒颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：(i)渗滤该液体培养基以提供包含低电导率缓冲液的含病毒颗粒渗余物；和然后(ii)通过选自亲和捕获、伪亲和捕获、层析或吸附的方法从渗余物中捕获病毒颗粒。

通过这些方法获得的渗余物和病毒颗粒可用于制备流感疫苗。

渗滤利用透性膜滤器根据溶液和悬浮液组分的分子大小将它们分离。小组分可通过膜形成滤液，而较大的组分(如病毒颗粒)则无法通过而被保留。可利用渗滤来降低盐、溶剂或液体培养基中其它低分子量种类的浓度，并任选用来引入新的种类(例如用来交换缓冲液)。渗滤可以是连续或不连续的。连续渗滤包括以与滤液生成速度基本相同的速度在缓冲液或样品中加水来洗出最初的低分子量种类。如果将缓冲液用于渗滤，则样品中的新缓冲盐的浓度会以与被除去种类的浓度成反比的速度提高。采用连续渗滤，用所选缓冲液进行6当量样品体积洗涤后通常可除去超过100％可渗透溶质中的99.5％。不连续渗滤用大量的水或缓冲液稀释样品，然后浓缩回原始体积。本发明优选不连续渗滤。典型的培养基渗滤包括至少2(例如，3、4、5、6、7、8、9、10或更多)倍渗滤体积(即在渗滤开始时至少2x样品体积)。

渗滤可采用任何合适的膜(例如，PES、纤维素等，如上文所述)以任何合适方式(例如，中空、盒式、螺旋等等)进行。所述膜保留病毒颗粒的截断值为，例如，500kDa。

渗滤步骤可在超滤步骤之前进行，例如，以便浓缩液体培养基。浓度将通常浓缩至少2倍，例如，＞2倍、＞3倍、＞4倍、＞5倍、＞10倍，等等。超滤/浓缩和随后的渗滤可采用相同设备进行。渗滤之前进行浓缩能降低完成渗滤所需的液体体积，因此是有利的。

渗滤之后的渗余物含有低电导率缓冲液。合适的缓冲液包括磷酸盐缓冲液、Tris/HCl缓冲液、TES缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液，等等。渗余物的电导率通常小于20mS/cm，例如0.5-10mS/cm，或者是1.0-1.4mS/cm。可采用10mM磷酸盐缓冲液。

可采用亲和捕获、伪亲和捕获、层析或吸附从渗滤渗余物中捕获病毒颗粒。已知适用于流感病毒的合适技术。例如，已知可采用欧卫矛(Euonymuseuropaeus)凝集素[21]或用Cellufine Sulfate(CS)或硫酸化Sephadex柱进行亲和捕获或伪亲和捕获。可吸附于，例如，聚电解质[22]、硫酸钡[23]或磷酸钙[24]，等等。在使用捕获材料之前用渗余物中存在的低电导率缓冲液进行平衡是有益的。因此，例如，可用10mM磷酸盐缓冲液平衡捕获树脂。相同的缓冲液也可用来洗涤捕获材料，然后释放捕获的病毒颗粒。

流感病毒

本发明可用来从包括甲型、乙型和丙型流感病毒在内的任何合适的流感病毒中制备抗原。尤其可用于感染人类的甲型病毒株。

用于疫苗的流感病毒株随季节而变。在目前的大流行间期，疫苗一般包括两种A型流感毒株(H1N1和H3N2)和一种B型流感毒株，一般是三价疫苗。本发明可使用这种流行间病毒，但也可使用来自大流行毒株(即疫苗接受者和普通人群未曾免疫接触的毒株)的病毒，尤其是甲型流感病毒。因此，本发明可采用选自下组的任何甲型流感病毒血凝素亚型：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16。所述病毒可额外具有以下任何NA亚型：N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9。

本发明尤其适用大流行甲型流感病毒毒株，如H5N1毒株。大流行毒株的特征有：(a)与目前流通的人毒株中的血凝素相比，它含有新的血凝素，即数十年没有在人群中发现的血凝素(如H2)，或者从未在人群中发现的血凝素(如H5、H6或H9，通常只出现在鸟群体中)，从而疫苗受者和常规人群对该毒株的血凝素没有免疫力；(b)它能够在人群中水平传播；和(c)它能使人致病。大流行毒株H2、H5、H7或H9亚型毒株有，例如，H5N1、H5N3、H9N2、H2N2、H7N1和H7N7毒株。H5亚型的病毒可分成许多进化支，如进化支1或进化支2。已经鉴定出进化支2的6个亚进化支，其中亚进化支1、2和3具有不同的地理分布，并且由于它们可感染人类而尤其受到重视。

乙型流感病毒通常不显示不同的HA亚型，但乙型流感病毒确实可分成两种不同的谱系。这些谱系在20世纪80年代晚期出现，具有在抗原性上和/或遗传上明显相互不同的HA[25]。目前的乙型流感病毒毒株类似于B/Victoria/2/87或B/Yamagata/16/88。这些毒株在抗原上通常不同，但也可用氨基酸序列的差异来区别两种谱系，例如，B/Yamagata/16/88样毒株通常(但不是总是)具有氨基酸残基164缺失的HA蛋白，上述编号是根据‘Lee40’HA序列定的[26]。本发明可用于任一谱系的乙型流感病毒抗原。

流感病毒可被减毒。流感病毒可以是温度敏感型。流感病毒可以是冷适应性病毒。然而，当使用活病毒作为疫苗抗原时这三个特征更加典型。

流感病毒可以是对抗病毒治疗有抗性(例如对奥塞米韦[27]和/或扎那米韦有抗性)的毒株，包括抗性大流行毒株[28]。

可用于本发明的流感病毒可以是再分类毒株，并可通过逆向遗传学技术获得。逆向遗传学技术[如29-33]能够用质粒在体外制备含有所需基因组区段的流感病毒。该技术一般包括表达(a)例如，由polI启动子或噬菌体RNA聚合酶启动子编码所需病毒RNA分子的DNA分子，和(b)例如，由polII启动子编码病毒蛋白的DNA分子，以便在细胞中表达两种类型的DNA，导致组装成完整的感染性病毒颗粒。DNA优选提供所有病毒RNA和蛋白质，但也可能用辅助病毒提供一些RNA和蛋白质。

优选采用不同质粒产生各病毒RNA的基于质粒的方法[34-36]，这些方法也包括使用质粒来表达所有或一些病毒蛋白(例如，仅PB1、PB2、PA和NP蛋白)，在一些方法中最多使用12种质粒。为了降低所需的质粒数量，近期方法[37]将多个RNA聚合酶I转录盒(用于合成病毒RNA)合并到同一质粒(如编码1、2、3、4、5、6、7或所有8种流感A vRNA区段的序列)上，并且将多个蛋白编码区与RNA聚合酶II启动子合并到另一个质粒(如编码1、2、3、4、5、6、7或所有8种流感AmRNA转录物的序列)上。参考文献37方法的优选方面包括：(a)PB1、PB2和PA mRNA编码区在同一质粒上；和(b)所有8个vRNA编码区段在同一质粒上。一个质粒上包含NA和HA区段而另外六个区段位于另一质粒上也可能是有利的。

PolI启动子是种特异性的，因此可选择与发生反向遗传学的细胞类型相匹配的启动子，例如在犬细胞中优选使用犬polI启动子[38，39]。然而，作为使用polI启动子来编码病毒RNA区段的替换方式，可使用噬菌体聚合酶启动子[40]。例如，可方便地使用SP6、T3或T7聚合酶的启动子。由于polI启动子的物种特异性，噬菌体聚合酶启动子可能较适合许多细胞类型，但也必须用编码外源性聚合酶的质粒转染细胞。

在其它技术中，可能使用polI和polII双启动子由一个模板同时编码病毒RNA和可表达的mRNA[41，42]。

因此，流感A病毒可包含来自A/PR/8/34病毒的一个或多个RNA区段(一般是来自A/PR/8/34的6个区段，HA和N区段来自疫苗毒株，即6:2再造毒株)。也可包含来自A/WSN/33病毒，或用于产生疫苗制剂的再造病毒的任何其它毒株的一个或多个RNA区段。甲型流感病毒包括不到6个(即0，1，2，3，4或5)个来自AA/6/60流感病毒(A/AnnArbor/6/60)的病毒区段。乙型流感病毒包括不到6个(即0，1，2，3，4或5)个来自AA/1/66流感病毒(B/AnnArbor/1/66)的病毒区段。本发明一般保护免受能够在人之间传播的毒株的感染，因此该毒株的基因组通常包含源自哺乳动物(如人)流感病毒的至少一个RNA区段。它可包含源自禽流感病毒的NS区段。

流感病毒生长和病毒颗粒纯化

可对含有流感病毒颗粒的原料进行本发明的方法。这些病毒颗粒可以是病毒在卵(例如，无特定病原体的卵)或在细胞培养物中生长的产物。目前培养流感病毒的标准方法采用含胚的鸡蛋，由鸡蛋内容物(尿囊液)纯化病毒。然而，更近一段时间以来，已经在动物细胞培养物上培养病毒，出于速度和患者变态反应的原因，优选这种培养方法。

用来生长流感病毒的细胞系通常是哺乳动物来源的。合适的哺乳动物细胞来源包括但不限于：仓鼠、牛、灵长动物(包括人和猴)和犬细胞，但不优选使用灵长动物细胞。可采用各种细胞类型，例如肾细胞、成纤维细胞、视网膜细胞、肺细胞等。合适的仓鼠细胞的例子是称为BHK21或HKCC的细胞系。合适的猴细胞是(例如)非洲绿猴细胞，例如肾细胞，如Vero细胞系[43-45]。合适的犬细胞是(例如)肾细胞，例如CLDK和MDCK细胞系。

因此，合适的细胞系包括但不限于：MDCK；CHO；CLDK；HKCC；293T；BHK；Vero；MRC-5；PER.C6[46]；FRhL2；WI-38；等等。合适的细胞系可由各种来源获得，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)[47]、Coriell细胞库[48]或欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)。例如，ATCC供应各种不同Vero细胞，目录号为CCL-81、CCL-81.2、CRL1586和CRL-1587，还供应MDCK细胞，目录号为CCL-34。PER.C6可获自ECACC，保藏号为96022940。

最优选的细胞系是具有哺乳动物类糖基化的细胞系。哺乳动物细胞系的一个较不优选的替代方式是，可以在禽细胞系上培养[例如参考文献49-51]，包括衍生自鸭(如鸭视网膜)或鸡的细胞系。禽细胞系的例子包括禽胚胎干细胞[49.52]和鸭视网膜细胞[50]。合适的禽胚胎干细胞包括衍生自鸡胚胎干细胞的Ebx细胞系、EB45、EB14和EB14-074[53]。也可利用鸡胚成纤维细胞(CEF)。然而，除了使用禽细胞，使用哺乳动物细胞意味着疫苗可不含禽DNA以及卵蛋白(如卵清蛋白和卵类黏蛋白)，从而降低变应原性。

用于培养流感病毒的最优选细胞系是衍生自Madin Darby狗肾的MDCK细胞系[54-57]。原始MDCK细胞系可购自ATCC(CCL-34)，但也可利用该细胞系的衍生细胞系。例如，参考文献54公开了适合悬浮培养的MDCK细胞系(‘MDCK 33016’，保藏号DSM ACC 2219)。类似地，参考文献58公开了在无血清培养基(‘B-702’，保藏号FERM BP-7449)中悬浮培养的MDCK衍生细胞系。参考文献59公开了非致瘤性MDCK细胞，包括‘MDCK-S’(ATCC PTA-6500)、‘MDCK-SF 101’(ATCC PTA-6501)、‘MDCK-SF 102’(ATCC PTA-6502)和‘MDCK-SF103’(PTA-6503)。参考文献60公开了非常易于感染的MDCK细胞系，包括‘MDCK.5F1’细胞(ATCC CRL12042)。可使用任何这些MDCK细胞系。

可以在贴壁或悬浮培养的细胞中培养病毒。也可采用微载体培养。因此，在一些实施方式中，细胞可能适合悬浮培养。

优选在无血清培养基和/或无蛋白培养基中培养细胞系。在本发明中，如果培养基中没有人或动物来源的血清的添加剂，则称为无血清培养基。生长在该培养物中的细胞通常本身就含有蛋白质，但无蛋白应理解为在不含蛋白质、生长因子、其它蛋白添加剂和非血清蛋白质的情况下发生细胞增殖的培养物，但可任选包含诸如胰蛋白酶和其它蛋白酶等可能是病毒生长所必需的蛋白质。

在病毒复制期间，支持流感病毒复制的细胞系优选低于37℃生长[61](例如，30-36℃，或约30℃，31℃，32℃，33℃，34℃，35℃，36℃)。

在培养细胞中增殖流感病毒的方法通常包括以下步骤：用待培养的菌株接种培养的细胞，将感染细胞培养所需时间以使病毒增殖，例如通过病毒效价或抗原表达来确定所需时间(如接种后24-168小时)，然后收获增殖的病毒。用1∶500-1∶1，优选1∶100-1∶5，更优选1∶50-1∶10的病毒(由PFU或TCID50测定)：细胞比接种培养的细胞。将病毒加入细胞悬液中，或施加于细胞单层，在25-40℃，优选28-37℃下，使病毒吸附于细胞至少60分钟，但通常小于300分钟，优选90-240分钟。可通过冻融或酶作用去除感染的细胞培养物(如单层)，以提高收获的细胞上清液的病毒含量。然后，可灭活或冷冻储存收获的液体。可以约0.0001-10、优选0.002-5、更优选0.001-2的感染复数(″m.o.i.″)感染培养的细胞。更优选地，以约0.01的m.o.i.感染细胞。可以在感染后30-60小时收获感染的细胞。优选在感染后34-48小时收获细胞。更优选在感染后38-40小时收获细胞。通常在细胞培养期间加入蛋白酶(一般是胰蛋白酶)，以使病毒释放，可以在培养的任何合适阶段加入蛋白酶，例如在接种前、接种时或接种后[61]。

在优选的实施方式中，尤其是采用MDCK细胞时，超过40群体倍增水平时细胞系不从主工作细胞库传代。

病毒接种物以及病毒培养物优选不含(即经测试且得到阴性污染结果)单纯疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒3、SARS冠状病毒、腺病毒、鼻病毒、呼肠孤病毒、多瘤病毒、双RNA病毒、环病毒和/或细小病毒[62]。特别优选不存在单纯疱疹病毒。

流感病毒在卵或细胞培养物中生长之后可获得含有病毒颗粒的液体。本发明可用来从这种液体制备抗原，且通常的第一个步骤是从所述液体中纯化(或浓缩)病毒颗粒。纯化可通过各种方法实现[63，64]。例如，可使用区带离心法[65]，例如采用线性蔗糖梯度溶液。密度梯度离心可使用差速区带离心或连续流转头[66]。也可采用沉淀法，例如使用聚乙二醇[67]。可采用亲和捕获或伪亲和捕获，如上文所述(本发明的第五方面)。在这种纯化方法之前，可对含有病毒颗粒的液体进行过滤(例如，以除去细胞碎片)和/或超滤(通常具有较大的分子量截断值，如≥300kDa≥、500kDa或更高)和/或渗滤(如本发明的第五个方面所述)。

病毒灭活

本发明的方法通常包括灭活病毒以去除其感染性的步骤。灭活病毒的化学方法包括用有效量的以下一种或多种物质处理：去污剂、甲醛(如福尔马林)、β-丙内酯、亚甲基蓝、补骨脂素、羧基富勒烯(C60)或其任意组合。本领域已知其它病毒灭活方法，例如二乙胺、乙酰氮丙啶、或γ辐照或UV照射。

用β-氮丙啶处理尤其有用，如参考文献68所述。在本发明的一些实施方式中，β-氮丙啶可存在于磷酸盐缓冲液中。

在灭活之前的步骤中，通常如上文所述浓缩病毒颗粒。

裂解

用去污剂(离子型或非离子型)和/或溶剂处理纯化的病毒颗粒产生亚病毒颗粒制品可获得裂解病毒颗粒。如上所述，裂解流感病毒的方法是本领域熟知的，包括“吐温-醚”法。裂解通常在完整的感染性或非感染性病毒颗粒上进行。这种破坏导致病毒蛋白的完全或部分溶解，改变病毒的完整性。BEGRIVAC^TM、FLUARIX^TM、FLUZONE^TM和FLUSHIELD^TM产品是裂解疫苗。

合适的裂解剂包括但不限于：乙醚、聚山梨酸酯80、脱氧胆酸盐、磷酸三丁酯、聚氧乙烯烷基醚、N，N-二烷基-葡糖酰胺、Hecameg、烷基苯氧基-聚乙氧基乙醇、季铵化合物、十二烷基肌氨酸钠、溴化十六烷基三甲基铵(如Cetavlon^TM)、磷酸三丁酯、十四烷基三甲铵盐、脂质转染试剂、利非他明(lipofectamine)和DOT-MA、辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如曲通表面活性剂，如曲通X-100或曲通N101)、壬基酚聚醚-9(NP9)Sympatens-NP/090、聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(吐温表面活性剂)、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯等。一种有用的裂解方法使用脱氧胆酸钠和甲醛的连续作用，最初病毒颗粒纯化过程中(例如在蔗糖密度梯度溶液中)发生裂解。

优选的裂解剂是离子型(例如，阳离子型)去污剂，如溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)。

裂解可在存在缓冲液，如磷酸盐缓冲液时进行。缓冲液宜具有微酸性pH，如在7.1和9.0之间，在7.2和8.0之间，或者约7.5。

裂解通常是水溶液中发生，如缓冲的水溶液。如上所述，溶液的离子强度为100mM或更高，例如≥200mM、≥300mM、≥400mM、≥500mM、≥600mM、≥700mM、≥800mM，等等。

去污剂交换

裂解步骤之后通常通过吸附除去裂解去污剂。例如，参考文献14报道了在CTAB/吐温裂解步骤之后加入安伯莱特XAD-4(一种交联的大网络芳香聚合物)以除去去污剂。然后通过过滤除去该聚合物。

一些情况下，需要将去污剂保留在最终的药物制剂中以溶解某些活性成分。在此例中，从病毒颗粒制备流感抗原的以前方法在离子型裂解去污剂(如CTAB)之前或与之同时加入了非离子型去污剂(如聚山梨酸酯)。然后彻底除去离子型去污剂(例如通过安伯莱特吸附)，但出于溶解目的保留了非离子型去污剂。也可采用非离子型去污剂来溶解抗原，从而，在除去离子型去污剂期间不吸附它们，例如，确保安伯莱特吸附除去CTAB但不除去血凝素。

这种方法的一个问题是，很难达到非离子型去污剂的所需终浓度，因为在裂解之后保留在溶液中的非离子型去污剂的量取决于裂解步骤之前存在的蛋白质、脂质等的量：加入物质的水平越低则非离子型去污剂的残余浓度越高，反之亦然。

为避免该问题，在本发明的一些实施方式中，在裂解步骤之前不使病毒颗粒接触去污剂。裂解时使病毒颗粒接触所需浓度的第一去污剂(例如离子型去污剂，如CTAB)。然后除去第一去污剂，但替换成第二去污剂(例如非离子型去污剂，如聚山梨酸酯80)，即将第一去污剂换成第二去污剂。该步骤可包括：在除去第一去污剂的同时加入第二去污剂；加入第二去污剂，随后除去第一去污剂；或者除去第一去污剂随后加入第二去污剂。交换之后存在的第二去污剂的量可能低于、高于或等于交换之前存在的第一去污剂的量。但重要的是，该步骤之后残余的第二去污剂的浓度是可控且可确定的(例如，相对于流感抗原的量)，而过早加入第二去污剂可导致除去裂解去污剂之后剩余的量可变。

裂解之后不一定要立即发生去污剂交换。例如，在裂解之后但在去污剂交换之前可能需要进一步纯化抗原，例如可以从裂解病毒颗粒中纯化表面抗原(见下文)再进行交换。

对裂解病毒颗粒的进一步处理

本发明提供了流感病毒裂解工艺的各种改进，因此可用来制造裂解病毒疫苗。然而，除此之外，可进一步处理按照本发明制备的裂解病毒颗粒以提供，例如，纯化的流感病毒表面抗原(血凝素以及通常还包括神经氨酸酶)。如上所述，制备该类疫苗的方法是本领域熟知的，FLUVIRIN^TM、AGRIPPAL^TM和INFLUVAC^TM产品都是此类疫苗。例如，可采用超离心裂解病毒颗粒来制备纯化的表面抗原。类似地，可对裂解病毒颗粒进行区带梯度离心(见参考文献9的实施例1)。

因此，本发明的分裂流感病毒颗粒的方法可作为制备裂解病毒疫苗或制备纯化表面抗原疫苗的总过程的一部分。在该过程中，将通过以本发明所述方法分裂流感病毒颗粒的方法从病毒获得含有血凝素的抗原制品。然后用所述含有血凝素的抗原制品来制备疫苗，也如本文所述。

HA是现有灭活流感疫苗中的主要免疫原，参考一般通过SRID试验测定的HA水平使疫苗标准化。现有疫苗一般含有约15μg HA/毒株，但(例如)儿童使用时，或者在大流行情况下，或当使用佐剂时也可采用较低剂量。采用了分数剂量如1/2(即7.5μg HA/毒株)、1/4和1/8，以及较高剂量(如3x或9x剂量[69，70])。因此，疫苗可包含0.1-150μg HA/流感毒株，优选0.1-50μg，例如0.1-20μg、0.1-15μg、0.1-10μg、0.1-7.5μg、0.5-5μg等。具体剂量包括例如，约45、约30、约15、约10、约7.5、约5、约3.8、约1.9、约1.5μg等/毒株。用于儿童时理想剂量是1.5μg/毒株。

疫苗可包含一种或多种(如1、2、3、4或更多种)流感病毒毒株，包括甲型流感病毒和/或乙型流感病毒的抗原。疫苗包含一种以上流感毒株时，一般单独培养不同毒株，收获病毒后将它们混合在一起，然后制备抗原。对于含有一种以上流感毒株抗原的疫苗而言，本发明的方法可在制备单价原料抗原期间使用，然后混合多个单价原料而制成多价疫苗。因此，本发明方法可包括混合一种以上流感毒株的抗原(含有血凝素的抗原制品)的步骤。

本发明所用HA可以是天然HA，如病毒中发现的天然HA，或者可以是经修饰的HA。例如，已知修饰HA以去除导致病毒在禽类动物中具有高度致病性的决定簇(如HA1和HA2之间切割位点周围的超碱性区域(hyper-basicregion))，因为这些决定簇可导致病毒不能在鸡蛋中生长。

疫苗可包含基质蛋白以便受益于定位在该抗原内的额外的T细胞表位。因此，包含血细胞凝集素和神经氨酸酶的疫苗还可包含M1和/或M2基质蛋白。有用的基质片段披露于参考文献71。也可存在核蛋白。

佐剂

本发明疫苗组合物可包含佐剂，佐剂的作用是增强在接受组合物的患者中引起的免疫应答(体液免疫和/或细胞免疫)。可用于本发明的疫苗佐剂包括但不限于：

·包含钙盐和铝盐(或其混合物)的含矿物质组合物。钙盐包括磷酸钙(如参考文献72公开的“CAP”颗粒)。铝盐包括氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等，所述盐取任何合适形式(如凝胶、晶体、无定形等)。优选吸附于这些盐。也可将含有矿物质的组合物制成金属盐的颗粒[73]。可使称为氢氧化铝和磷酸铝的佐剂。这些名称是常规名称，仅为方便使用，因为它们都不是所代表的实际化合物的准确描述[例如参见参考文献157的第9章]。本发明可采用通常用作佐剂的任何″氢氧化物″或″磷酸盐″佐剂。称为″氢氧化铝″的佐剂一般是羟基氧化铝盐(通常至少部分为晶体)。称为″磷酸铝″的佐剂一般是羟基磷酸铝，也常常含有少量硫酸盐(即羟基磷酸硫酸铝)。可通过沉淀获得这些佐剂，沉淀期间的反应条件和浓度影响磷酸根取代该盐中羟基的程度。本发明可使用氢氧化铝和磷酸铝的混合物。在这种情况下，磷酸铝比氢氧化铝多，例如重量比为至少2∶1，例如≥5∶1、≥6∶1、≥7∶1、≥8∶1、≥9∶1等。给予患者的组合物中Al⁺⁺⁺的浓度优选小于10mg/ml，例如≤5mg/ml、≤4mg/ml、≤3mg/ml、≤2mg/ml、≤1mg/ml等。优选范围是0.3-1mg/ml。最大值优选为0.85毫克/剂量。-皂苷[参考文献157的第22章]是在许多种类植物的树皮、叶、茎干、根甚至花中发现的甾醇糖苷和三萜糖苷的异质群体。已广泛研究了作为佐剂的来自皂树(Quillaiasaponaria)Molina树皮的皂苷。皂苷也可购自丽花菝葜(Smilax ornata)(墨西哥菝葜)、满天星(Gypsophilla paniculata)(婚纱花)和肥皂草(Saponaria officianalis)(皂根)。皂苷佐剂制剂包括纯化的制剂，例如QS21，以及脂质制剂，例如ISCOM。QS21以商标Stimulon^TM出售。已采用HPLC和RP-HPLC纯化皂苷组合物。已鉴定了用这些技术纯化的特定组分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。皂苷优选QS21。制备QS21的方法参见参考文献144。74.皂苷制剂也可包含甾醇，如胆固醇[75]。

·皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒[参考文献157的第23章]。ISCOM一般还含有磷脂，例如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷可用在ISCOM中。ISCOM优选包含QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。参考文献75-77中进一步描述了ISCOM。任选地，ISCOM可不含其它去污剂[78]。开发基于皂苷的佐剂的综述可参见参考文献79和80。

·细菌ADP-核糖基化毒素(如大肠杆菌(E.coli)不耐热肠毒素″LT″、霍乱毒素″CT″或百日咳毒素″PT″)，尤其是其脱毒衍生物，如称为LT-K63和LT-R72[81]或CT-E29H[82]的突变毒素。参考文献83中描述了将脱毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐剂，参考文献84中描述了将其用作胃肠道外佐剂。

·生物粘附剂和粘膜粘附剂，如酯化透明质酸微球[85]或壳聚糖及其衍生物[86]。

·由可生物降解和无毒材料(例如聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚正酯、聚酐、聚己酸内酯等)，优选丙交酯-乙交酯共聚物形成的微粒(即直径约100nm-150μm，更优选约200nm-30μm，最优选约500nm-10μm的颗粒)，任选处理以具有带负电表面(如用SDS处理)或带正电表面(例如用阳离子去污剂如CTAB处理)。

·脂质体(参考文献157第13和14章)。适合用作佐剂的脂质体制剂的例子见参考文献87-89所述。

·胞壁酰肽，例如N-乙酰胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(去甲MDP)、N-乙酰葡萄糖胺酰-N-乙酰胞壁酰-L-Al-D-异谷氨酰-L-Ala-二棕榈酰丙酰胺(″DTP-DPP″或″Theramide^TM″)和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。

·聚氧(polyoxidonium)聚合物[90，91]或其它N-氧化的聚乙烯-哌嗪衍生物。

·甲基肌苷5′-单磷酸酯(″MIMP″)[92]。

·多聚羟化吡咯双烷类化合物[93]，如下式化合物：

式中，R选自：氢，直链或支链、未取代或取代、饱和或不饱和的酰基、烷基(如环烷基)、烯基、炔基和芳基，或其药学上可接受的盐或衍生物。例子包括但不限于：木麻黄(casuarine)、木麻黄-6-α-D-吡喃葡萄糖、3-表-木麻黄、7-表-木麻黄、3，7-二表-木麻黄等。·CD1d配体，如α-糖基神经酰胺[113-120](例如α-半乳糖苷神经酰胺)、含有植物鞘氨醇的α-糖基神经酰胺、OCH、KRN7000[(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖苷吡喃糖基)-2-(N-二十六烷基氨基)-1，3，4-十八烷三醇]、CRONY-101、3″-O-磺基-半乳糖苷神经酰胺，等等。

·γ菊粉[102]或其衍生物，如algammulin。

·水包油乳液。多种这类乳液是已知的，它们一般包含至少一种油和至少一种表面活性剂，油与表面活性剂是可生物降解(可代谢)和生物相容性的。进一步的细节如下。

·免疫刺激性寡核苷酸，例如含有CpG基序的寡核苷酸(含有通过磷酸键连接于鸟嘌呤残基的未甲基化胞嘧啶残基的二核苷酸序列)、或CpI基序(含有连接于肌苷的胞嘧啶的二核苷酸序列)，或双链RNA、或含有回文序列的寡核苷酸、或含有聚(dG)序列的寡核苷酸。免疫刺激性寡核苷酸可包含核苷酸修饰/类似物，如硫代磷酸酯修饰，可以是双链或(除RNA外)单链。参考文献103、104和105公开了可能的类似取代，例如用2’-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。参考文献106-111中进一步讨论了CpG寡核苷酸的佐剂作用。CpG序列可能导向TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[112]。CpG序列可特异性诱导Th1免疫应答，例如CpG-A ODN(寡脱氧核糖核苷酸)，或更特异地诱导B细胞应答，例如CpG-B ODN。参考文献113-115中讨论了CpG-A和CpG-B ODN。CpG优选是CpG-A ODN。优选构建CpG寡核苷酸时使其5’端可为受体所识别。任选将两个CpG寡核苷酸序列的3’端相连接形成“免疫聚体”。参见例如，参考文献112和116-118。有用的CpG佐剂是CpG7909，也称为ProMune^TM(科雷制药集团公司(Coley Pharmaceutical Group，Inc.))。另一种是CpG 1826。或者或此外，为了使用CpG序列，可使用TpG序列[119]，这些寡核苷酸可不含非甲基化CpG基序。免疫刺激性寡核苷酸可能富含嘧啶。例如，它可能含有一个以上连续的胸腺嘧啶核苷酸(例如，参考文献119所公开的TTTT)，和/或它的核苷酸组成中可能含有＞25％胸腺嘧啶(例如＞35％、＞40％、＞50％、＞60％、＞80％等)。例如，它可能含有一个以上连续的胞嘧啶核苷酸(例如，参考文献119所公开的CCCC)，和/或它的核苷酸组成中可能含有＞25％胞嘧啶(例如＞35％、＞40％、＞50％、＞60％、＞80％等)。这些寡核苷酸可以不含未甲基化的CpG基序。免疫刺激性寡核苷酸一般含有至少20个核苷酸。它们可含有少于100个核苷酸。

基于免疫刺激性寡核苷酸的特别有用的佐剂被称为IC-31^TM[120]。因此，本发明佐剂可包含(i)和(ii)的混合物：(i)包含至少一个(优选多个)CpI基序的寡核苷酸(例如15-40个核苷酸)，和(ii)聚阳离子聚合物，如包含至少一个(优选多个)Lys-Arg-Lys三肽序列的寡肽(如5-20个氨基酸)。寡核苷酸可以是含有26-聚体序列5′-(IC)₁₃-3′(SEQ ID NO：__)的脱氧核苷酸。聚阳离子聚合物可以是含有11-聚体氨基酸序列KLKLLLLLKLK(SEQ ID NO：__)的肽。

·3-O-脱酰化单磷酰脂质A(′3dMPL′，也称为′MPL^TM′)[121-124]。在水性条件下，3dMPL可形成不同大小，如直径＜150nm或＞500nm的胶束聚集体或颗粒。其中一种或两种可用于本发明，可通过常规实验选择更好的颗粒。本发明优选使用小颗粒(如小到足以产生澄清的3dMPL水悬液)，因为它们活性高[125]。优选颗粒的平均直径小于220nm，更优选小于200nm，小于150nm，或小于120nm，它们的直径甚至可以小于100nm。然而在大多数情况下，平均直径不小于50nm。

·咪唑并喹啉化合物，如咪喹莫特(″R-837″)[126，127]、瑞喹莫德(″R-848″)[128]和其类似物；及其盐(如盐酸盐)。有关免疫刺激性咪唑喹啉的其它细节可参见参考文献129-133。

·缩氨基硫脲化合物，如参考文献134所述的化合物。参考文献134中也描述了配制、制备和筛选活性化合物的方法。缩氨基硫脲在刺激人外周血单核的细胞产生细胞因子，例如TNF-α中特别有效。

色胺酮化合物，如参考文献135所述的化合物。参考文献135中也描述了配制、制备和筛选活性化合物的方法。缩氨基硫脲在刺激人外周血单核的细胞产生细胞因子，例如TNF-α中特别有效。

·核苷类似物，如(a)埃索他宾(Isatorabine)(ANA-245；7-硫杂-8-氧代鸟苷)及其前药：

(b)ANA975；(c)ANA-025-1；(d)ANA380；(e)参考文献136-138所公开的化合物。含有连接于含磷酸无环主链的脂质的化合物，如TLR4拮抗剂E5564[139，140]：

·取代的脲或式I、II或III的化合物，或其盐：

如参考文献141所述，例如‘ER803058’、‘ER803732’、‘ER804053’、ER804058’、‘ER804059’、‘ER804442’、‘ER804680’、‘ER804764’、ER803022或‘ER804057’，如：

·大肠杆菌(Escherichia coli)如OM174的脂质A的衍生物(如参考文献142和143所述)。

·Loxoribine(7-烯丙基-8-氧代鸟苷)[144]。

·参考文献145所述化合物，包括：酰基哌嗪化合物、吲哚二酮化合物、四氢异喹啉(THIQ)化合物、苯并环二酮化合物、氨基氮杂乙烯基化合物、氨基苯并咪唑喹啉酮(ABIQ)化合物[146，147]、水合酞酰胺(hydrapthalamide)化合物、苯并苯基酮化合物、异唑化合物、固醇化合物、喹唑啉酮(quinazilinone)化合物、吡咯化合物[148]、蒽醌化合物、喹喔啉化合物、三嗪化合物、吡唑嘧啶化合物和吲哚化合物[149]。

·氨烷基氨基葡糖苷磷酸衍生物，如RC529[150，151]。

·磷腈，如参考文献152和153中所述的聚[二(羧基苯氧基)磷腈](poly[di(carboxylatophenoxy)phosphazene](″PCPP″)。

参考文献157和158中更详细地讨论了这些和其它佐剂活性物质。

组合物可包含两种或多种所述佐剂。单独的佐剂可以优选诱导Th1应答或Th2应答，而佐剂的有用组合可同时包含Th2佐剂(例如，水包油乳液或铝盐)和Th1佐剂(例如，3dMPL、皂苷、或免疫刺激性寡核苷酸)。例如，组合物中宜包含：铝盐和免疫刺激性寡核苷酸；铝盐和式I、II或III的化合物；水包油乳液和式I、II或III的化合物；水包油乳液和免疫刺激性寡核苷酸；铝盐和α-糖基神经酰胺；水包油乳液和α-糖基神经酰胺；水包油乳液和3dMPL；水包油乳液和皂苷；等等。3dMPL和水包油乳液的混合物非常有用。

用于本发明的优选佐剂是水包油乳液，发现它特别适用于含佐剂的流感病毒疫苗。多种这类乳液是已知的，它们一般包含至少一种油和至少一种表面活性剂，油与表面活性剂是可生物降解(可代谢)和生物相容性的。乳剂中的油滴直径通常小于5μm，理想情况下具有亚微米直径，通过微流化床实现这种小尺寸以提供稳定乳剂。优选小于220nm的液滴，因为它们可进行过滤除菌。

乳剂可包含诸如动物(如鱼)或植物来源的油。植物油的来源包括坚果、种籽和谷物。坚果油中最常见的是花生油、大豆油、可可油和橄榄油。也可使用获自(例如)霍霍巴豆的霍霍巴油。种籽油包括红花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻油等。在谷物油中，最常见的是玉米油，但也可采用其它谷类如小麦、燕麦、裸麦、稻、画眉草(teff)、黑小麦(triticale)等的油。可从坚果和种籽油开始，通过水解、分离和酯化合适物质制备甘油和1，2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯(不是种籽油中天然产生的)。来自哺乳动物乳汁的脂肪和油是可代谢的，因此可用于实施本发明。由动物来源获得纯油的过程中必需的分离、纯化、皂化和其它步骤是本领域众所周知的。大多数鱼类含有容易回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和鲸油如鲸蜡代表了可用于本发明的几种鱼油的例子。通过生化途径用5-碳异戊二烯单位合成许多支链油，它们总称为萜类。鲨鱼肝油含有称为鲨烯的支链不饱和类萜，2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯，本文特别优选此类萜。鲨烯的饱和类似物鲨烷也是优选的油。鱼油，包括鲨烯和鲨烷易于从商业来源购得，或可通过本领域已知方法获得。其它优选油是生育酚(见下)。可采用油的混合物。

可通过′HLB′(亲水/亲脂平衡)对表面活性剂分类。本发明优选的表面活性剂的HLB为至少10，优选至少15，更优选至少16。可用于本发明的表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80；以商品名DOWF AX出售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，如直链EP/PO嵌段共聚物；重复的乙氧基(氧-1，2-乙二基)数量不同的辛苯聚醇，特别感兴趣的是辛苯聚醇9(曲通(Triton)X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；壬酚乙醇酯，如Tergitol^TM NP系列；衍生自十二烷醇、十六烷醇、十八烷醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为苄泽表面活性剂)，如三乙二醇单月桂基醚(苄泽30)；以及去水山梨糖醇酯(通常称为司盘)，如去水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和去水山梨糖醇单月桂酸酯。优选非离子型表面活性剂。包含在乳液中的优选表面活性剂是吐温80(聚氧乙烯失水山梨糖醇酯)、司盘85(失水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-100。

可使用表面活性剂的混合物，如吐温80/司盘85混合物。也适合采用聚氧乙烯去水山梨糖醇酯如聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯(吐温80)和辛苯聚糖如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton X-100)的混合物。另一种有用的混合物包含聚乙二醇单月桂醚9和聚氧乙烯去水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。

表面活性剂的含量(重量％)优选为：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(如吐温80)0.01-1％，特别是约0.1％；辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如曲通X-100或曲通系列的其它去污剂)0.001-0.1％，特别是0.005-0.02％；聚氧乙烯醚(如月桂醇聚醚9)0.1-20％，优选0.1-10％，特别是0.1-1％或约0.5％。

优选乳液佐剂的平均液滴大小为＜1μm，例如≤750nm、≤500nm、≤400nm、≤300nm、≤250nm、≤220nm、≤200nm或更小。可通过诸如微流化等技术方便地获得这种液滴大小。

本发明所用的具体水包油乳液佐剂包括但不限于：

·鲨烯、吐温80和司盘85的亚微米乳液。该乳液的体积组成可以是约5％鲨烯、约0.5％聚山梨酯80和约0.5％司盘85。以重量计，这些比例变为4.3％鲨烯、0.5％聚山梨酯80和0.48％司盘85。这种佐剂称为‘MF59’[154-156]，参考文献157的第10章和参考文献158的第12章更详细地描述了该佐剂。MF59乳液宜包含柠檬酸根离子，如10mM柠檬酸钠缓冲液。

·鲨烯、生育酚和聚山梨酯80(吐温80)的乳液。该乳液可包含磷酸盐缓冲盐水。它也可含有司盘85(如1％)和/或卵磷脂。这些乳液可含有2-10％鲨烯、2-10％生育酚和0.3-3％吐温80，鲨烯∶生育酚的重量比优选＜1，因为这能使乳液更稳定。角鲨烯和吐温80的体积比可以约为5∶2，或者重量比约为11∶5。可通过下述方法制备一种这样的乳液：将吐温80溶解于PBS得到2％溶液，然后将90ml该溶液与5g DL-α-生育酚和5ml鲨烯的混合物混合，然后使该混合物微流体化。得到的乳液可含有(如)平均直径为100-250nm，优选约180nm的亚微米油滴。该乳液也可含有3-脱-O-酰化单磷酰脂质A(‘3d-MPL’)。此种类型的另一种有用乳液可包含(每个人用剂量)0.5-10mg鲨烯、0.5-11mg生育酚和0.1-4mg聚山梨酯80[159]。

·鲨烯、生育酚和曲通去污剂(如曲通X-100)的乳液。该乳液也可包含3d-MPL(见下)。该乳液可含有磷酸盐缓冲液。

·含有聚山梨酯(如聚山梨酯80)、Triton去污剂(如Triton X-100)和生育酚(如α-生育酚琥珀酸酯)的乳液。该乳液可包含这三种组分，其质量比约为75∶11∶10(如750μg/ml聚山梨酯80、110μg/ml曲通X-100和100μg/mlα-生育酚琥珀酸酯)，这些浓度应包括抗原中这些组分的贡献。该乳液还可包含鲨烯。该乳液也可包含3d-MPL(见下)。水相可含有磷酸盐缓冲液。

·鲨烯、聚山梨酯80和泊洛沙姆401(″普流罗尼克^TM L121″)的乳液。可以用磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4配制该乳液。该乳液是一种有用的胞壁酰二肽递送载体，已与用″SAF-I″佐剂(0.05-1％Thr-MDP、5％鲨烯、2.5％Pluronic L121和0.2％聚山梨酸酯80)配的苏氨酰基-MDP一起使用[160]。也可不与Thr-MDP一起使用，例如用″AF″佐剂(5％鲨烯、1.25％Pluronic L121和0.2％聚山梨酸酯80)[161]。优选微流体化。

·含有鲨烯、水性溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子型表面活性剂(如聚氧乙烯(12)十六十八醚)和疏水性非离子型表面活性剂(如去水山梨糖醇酯或二缩甘露醇酯，如去水山梨糖醇单油酸酯或‘司盘80’)的乳液。该乳剂优选为热可逆的和/或其中至少90％油滴(以体积计)小于200nm[162]。该乳剂也可含有以下一种或多种物质：糖醇；低温保护剂(例如，糖，如十二烷基麦芽苷和/或蔗糖)；和/或烷基聚糖苷(alkylpolyglycoside)。该乳液可包含TLR4激动剂[163]。这类乳液可以被冻干。

·角鲨烯、泊洛沙姆-105和Abil-Care的乳液[164]。含佐剂疫苗中这些组分的终浓度(重量)是5％鲨烯、4％泊洛沙姆-105(普流罗尼克多元醇)和2％Abil-Care 85(双-PEG/PPG-16/16PEG/PPG16/16二甲硅油；辛酸/癸酸甘油三酯)。

·含有0.5-50％油、0.1-10％磷脂和0.05-5％非离子型表面活性剂的乳液。如参考文献165述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。优选亚微米液滴尺寸。

·不可代谢油(如轻质矿物油)和至少一种表面活性剂(如卵磷脂、吐温80或司盘80)的亚微米水包油乳液。可包含添加剂，例如QuilA皂苷、胆固醇、皂苷-亲脂体偶联物(如通过葡糖醛酸的羧基将脂族胺加到脱酰基皂苷上而产生的GPI-0100，参见参考文献166)、二甲基二-十八烷基溴化铵和/或N，N-二-十八烷基-N，N-双(2-羟乙基)丙二胺。

·皂苷(如QuilA或QS21)和固醇(如胆固醇)结合成螺旋胶束的乳液[167]。

·含有矿物油、非离子型亲脂乙氧基化脂肪醇和非离子型亲水表面活性剂(如乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[168]。

·包含矿物油、非离子亲水性乙氧基化脂肪醇和非离子亲脂性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[168]。

在一些实施方式中，可在递送时即时将乳液与抗原混合，因此佐剂和抗原可单独地保存在包装或分销的疫苗中，以便在使用时配制成最终制剂。在其它实施方式中，在生产过程中将乳液与抗原混合，因此组合物以含佐剂液体形式包装，如FLUAD^TM产品。抗原通常是水性形式，以便最终通过混合两种液体制备疫苗。混合的两种液体的体积比可变(例如5∶1-1∶5)，但通常约为1∶1。上述对具体乳液的说明给出组分浓度时，这些浓度通常是非稀释组合物，因此与抗原溶液混合后浓度降低。

组合物中的抗原和乳液通常是混合的，但一开始它们可以采取供临时混合的单独组分的试剂盒形式存在。当给予对象时组合物将通常采取水性形式。

将抗原与佐剂混合之后，血凝素抗原通常保留在水溶液中，但其本身可分布于油/水界面附近。通常，血凝素很少(如果有)会进入该乳液的油相。

当组合物包含生育酚时，可使用α、β、γ、δ、ε或ξ生育酚中任何一种，但优选α-生育酚。生育酚可取不同形式，例如不同的盐和/或异构体。盐包括有机盐，例如琥珀酸盐、乙酸盐、烟酸盐等。可同时采用D-α-生育酚和DL-α-生育酚。用于老年患者(如年龄大于60岁或更大的患者)的疫苗中宜包含生育酚，因为据报道维生素E在此患者群体中对免疫应答有正面作用[169]。它们也具有抗氧化特性，这种特性有助于稳定该乳液[170]。优选的α-生育酚是DL-α-生育酚，这种生育酚的优选盐是琥珀酸盐。发现琥珀酸盐在体内能与TNF相关配体协作。此外，已知α-生育酚琥珀酸酯与流感疫苗相容，并且是有用的替代含汞化合物的防腐剂[5]。

药物组合物

给予患者的本发明组合物优选为药学上可接受的组合物。除抗原外，它们可包含其它组分，例如它们一般包含一种或多种药物载体和/或赋形剂。对这类组分的充分讨论参见参考文献171。

该组合物可含有防腐剂，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。然而，疫苗优选应基本不含(即小于5μg/ml)含汞物质，如不含硫柳汞[172，173]。更加优选不含汞的疫苗，并可包含α-生育酚琥珀酸酯来代替汞化合物[5]。最优选不含防腐剂的疫苗。

为了控制张度，优选包含生理性盐如钠盐。优选氯化钠(NaCl)，其浓度可以是1-20mg/ml。可以存在的其它盐，包括氯化钾、磷酸二氢钾、二水合磷酸氢二钠、氯化镁、氯化钙等。组合物的渗透压通常为200mOsm/kg-400mOsm/kg，优选为240-360mOsm/kg，更优选为290-310mOsm/kg。虽然以前报道过渗透压对疫苗接种引起的疼痛无影响[174]，但优选将渗透压保持在此范围内。

组合物可含有一种或多种缓冲剂。缓冲剂一般包括：磷酸盐缓冲剂；Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂(特别是与氢氧化铝佐剂联用时)；或柠檬酸缓冲剂。包含的缓冲剂的浓度一般是5-20mM。

组合物的pH通常为5.0-8.1，更一般为6.0-8.0，例如6.5-7.5，或者7.0-7.8。因此，本发明方法可包括在包装前调整散装疫苗pH的步骤。该组合物优选无菌。该组合物优选无热原，如每剂量含有＜lEU(内毒素单位，标准量度)，优选每剂量＜0.1EU。该组合物优选不含谷蛋白。

该组合物可含有一次免疫的物质，或者可含有多次免疫的物质(即多剂量药盒)。多剂量配置优选含有防腐剂。作为多剂量组合物中包含防腐剂的替代方案(或除此之外)，该组合物可包含在装有用于取出物质的无菌接头的容器中。

根据本发明，流感疫苗的给药剂量体积一般为约0.5ml，但可将一半剂量(即约0.25ml)给予儿童。组合物和药盒优选储存于2-8℃。不应冷冻。理想地，应避光保存。

如果用细胞系培养病毒，标准实践是最大程度减少最终疫苗中残留的细胞系DNA的含量，以尽可能降低这些DNA的致癌活性。因此，按照本发明制备的疫苗组合物优选含有小于10ng(优选小于1ng，更优选小于100pg)残留的宿主细胞DNA/剂量，但可能存在痕量宿主细胞DNA。

优选疫苗中每15μg血凝素含＜10ng(例如，＜1ng，＜100pg)宿主细胞DNA，相当于每0.25ml体积含＜10ng(例如，＜1ng，＜100pg)宿主细胞DNA的疫苗。更优选每50μg血凝素中宿主细胞DNA含量＜10ng(如＜1ng、＜100pg)的疫苗，以及每0.5ml体积中宿主细胞DNA含量＜10ng(如＜1ng、＜100pg)的疫苗。

任何残留宿主细胞DNA的平均长度优选小于500bp，例如小于400bp、小于300bp、小于200bp、小于100bp等。

在疫苗制备过程中可采用标准纯化方法，如层析法等去除污染的DNA。可通过核酸酶处理，例如DNA酶处理来改进对残留宿主细胞DNA的清除效果。参考文献175和14公开了一种减少宿主细胞DNA污染的方便方法，该方法包括两步处理，第一步是在病毒生长期间使用DNA酶(如Benzonase)处理，然后是在病毒颗粒破裂期间使用阳离子去污剂(如CTAB)进行处理。也可用β-丙内酯处理除去[68]。

现在，残留宿主细胞DNA的测定是生物制品的常规管理要求，它在技术人员的普通能力范围内。用于测定DNA的实验一般是已验证的实验[176，177]。可通过数学和可以量化的条件来描述验证实验的性能特征，并鉴定可能的误差来源。通常测试该实验的某些特征，如精确性、准确性、特异性。一旦校正(例如用已知标准量的宿主细胞DNA校正)并检测了某个实验，则可按常规进行定量DNA测定。可采用三种主要的DNA定量技术：杂交方法，如Southern印迹或狭线印迹[178]；免疫测定方法，如Threshold^TM系统[179]；和定量PCR[180]。本领域技术人员熟悉这些方法，但各方法的准确特征，例如杂交探针的选择、引物的选择和/或用于扩增的引物等可能取决于所研究的宿主细胞。来自分子设备公司(Molecular Devices)的Threshold^TM系统是皮克水平总DNA的定量实验，已用于监测生物药品中污染DNA的水平[179]。典型实验包括生物素化ssDNA结合蛋白、脲酶偶联的抗ssDNA抗体和DNA之间以非序列特异性方式形成反应复合物。购自生产商的总DNA测定试剂盒(Total DNAAssay Kit)中包含所有实验组分。多个商业生产商均提供用以检测残留宿主细胞DNA的定量PCR实验，例如AppTec^TM实验室服务公司(AppTec^TM Laboratory Services)、BioReliance^TM公司奥西科技公司(Althea Technologies)等。对测定人病毒疫苗的宿主细胞DNA污染的化学发光杂交实验和总DNA Threshold^TM系统的比较参见参考文献181。

本发明的药盒

递送时，特别是使用佐剂时，可以临时制备疫苗。因此，本发明提供了包含各种易混组分的药盒。该药盒可将佐剂和抗原单独保存，直到使用。使用水包油乳液佐剂时可使用这种配置。

在药盒中，这些组分在物理上相互分离，这种分离可通过多种方式实现。例如，这两种组分可以装在两个不同的容器，如药瓶中。可通过(例如)取出一个药瓶的内容物并将其加入另一个药瓶，或者分别取出两个药瓶的内容物并在第三个容器中将它们混合在一起，来混合两个药瓶的内容物。

在优选的配置中，药盒的一种组分在注射器中，另一种组分在容器如药瓶中。可使用该注射器(例如装有针头的注射器)将其内容物注入第二个容器中混合，然后将该混合物抽回注射器中。然后，一般通过新的无菌针头将该注射器中的混合成分给予患者。将一种组分包装到注射器中无需用其它注射器对患者给药。

在另一优选配置中，这两种药盒组分在同一注射器，例如双室注射器(如参考文献182-189等所述)中分开保存。当注射器致动时(例如给予患者时)，将这两室中的内容物混合。这种配置在使用时无需单独的混合步骤。

该药盒组分通常是水性形式。在一些配置中，一组分(一般是抗原组分而非佐剂组分)是干燥形式(例如冻干形式)，而另一组分是水性形式。可将这两种组分混合，以再次激活干燥组分，得到给予患者的水性组合物。冻干组分一般装在药瓶中，而非注射器中。干燥组分可包含稳定剂，例如乳糖、蔗糖或甘露醇，及其混合物，如乳糖/蔗糖混合物、蔗糖/甘露醇混合物等。一种可能的配置将水性佐剂组分装在预填装注射器中，将冻干的抗原组分装在药瓶中。

组合物或药盒组分的包装

适用于本发明组合物(或药盒组分)的容器包括药瓶、注射器(如一次性注射器)、鼻喷雾等。这些容器应无菌。

组合物/组分装在药瓶中时，药瓶优选由玻璃或塑料制成。在将组合物加入药瓶之前，优选对其进行灭菌。为了避免胶乳敏感型患者的问题，优选用无胶乳的塞子密封药瓶，优选所有包装材料中不含胶乳。药瓶可包括单一剂量的疫苗，或者可以包括一个以上剂量(′多剂量′药瓶)，如10个剂量。优选的药瓶由无色玻璃制成。

药瓶可以有适合的帽(如Luer锁)，以便将预填装注射器插入该帽，可以将注射器的内容物推入药瓶(如在其中重建冻干物质)，可以将药瓶的内容物吸回注射器中。从药瓶中拔出注射器后，可连上针头，将该组合物给予患者。该帽优选位于封口或盖子内侧，以便在封口或盖子打开后才能接触到该帽。药瓶，特别是多剂量药瓶装有瓶帽，以便无菌地取出其内含物。

某组分包装到注射器中时，该注射器可连有针头。如果未连接针头，可随注射器提供单独的针头以便组装和使用。这种针头可装在护罩中。优选安全性针头。一般是1-英寸23-号、1-英寸25-号和5/8-英寸25-号针头。可提供有剥离标签的注射器，该标签上可打印上内含物的批号、流感季节和过期日期，以帮助记录保存。注射器的活塞优选带有抑止装置，以防止活塞在吸出时偶然脱出。注射器可以有胶乳橡胶帽和/或活塞。一次性注射器含有单一剂量的疫苗。注射器通常带有顶帽，以在连接针头前密封顶端，顶帽优选由丁基橡胶制成。如果注射器和针头分开包装，那么针头优选装有丁基橡胶护罩。有用的注射器是以商品名″Tip-Lok″^TM销售的注射器。

容器可标注有半剂量体积，以利于递送给儿童。例如，含有0.5ml剂量的注射器可标有0.25ml体积的标记。

采用玻璃容器(如注射器或药瓶)时，优选采用由硼硅酸盐玻璃，而非钠钙玻璃制成的容器。

可将药盒或组合物与单页宣传品包装在一起(在同一个盒子中)，所述单页宣传品包括疫苗的详细情况如给药说明书、疫苗内所含抗原的详情等。说明书也可包含警告，(例如)准备好肾上腺素溶液以应对疫苗接种后发生过敏反应的情况等。

治疗方法和疫苗的给药

本发明的疫苗适合给予人类患者，本发明提供了在患者中产生免疫应答的方法，包括将本发明组合物给予患者的步骤。

本发明也提供用作药物的本发明药盒或组合物。本发明还提供了上文所述的医学用途。

这些方法和应用通常用来产生抗体应答，优选保护性抗体应答。评价接种流感病毒疫苗后抗体应答、中和能力和保护水平的方法是本领域众所周知的。人类研究表明，对人流感病毒血凝素的抗体效价与保护作用相关联(约30-40的血清样品血凝反应-抑制效价对同源病毒感染产生约50％保护作用)[190]。一般通过血凝反应抑制、微量中和、单径向免疫扩散和/或单径向溶血(SRH)来测定抗体应答。本领域熟知这些测定技术。

可以各种方式给予本发明组合物。最优选的免疫途径是肌肉内注射(如注射到上肢或下肢)，但其它可用的途径包括皮下注射、鼻内[191-193]、口服[194]、皮内[195，196]、经皮、透皮[197]等。

可利用本发明的疫苗治疗儿童和成年人。目前，推荐将流感疫苗用于年龄＞6个月的儿童和成年人免疫。因此，患者可以小于1岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。接受该疫苗的优选患者是老年人(例如≥50岁、≥60岁，优选≥65岁)、年轻人(如≤5岁)、住院患者、健康护理工作人员、军队服务人员和军人、妊娠妇女、慢性疾病患者、免疫缺陷患者、在接受该疫苗前7天接受过抗病毒化合物(如奥塞米韦或扎那米韦化合物；见下)的患者、对鸡蛋过敏的人和出国旅行者。然而该疫苗不只适用于这些人群，可以在更广泛的人群中使用。就大流行毒株而言，优选给予所有年龄的人。

对于各流感毒株的成人功效，优选的本发明组合物将满足1、2或3条CPMP标准，但它们也可给予儿童。这些标准是：(1)≥70％血清保护；(2)≥40％血清转化或显著增加；和/或(3)GMT增加≥2.5倍。在老年人(＞60岁)中，这些标准是：(1)≥60％血清保护；(2)≥30％血清转化；和/或(3)GMT增加≥2倍。这些标准基于至少50位患者的开放标记研究。

可以通过单剂量方案或多剂量方案进行治疗。因此，在任何具体流感季中(例如，在给定的12个月内，通常在秋季或冬季)，患者可以接受本发明组合物的单次剂量或一次以上剂量(例如，两次剂量)。单次剂量可引发针对甲型流感病毒H3N2亚型的有效免疫应答，然而可能需要两次剂量以额外提供针对甲型流感病毒H1N亚型和针对乙型流感病毒的有效免疫应答。在多剂量方案中，可通过相同或不同的途径如胃肠道外初免、粘膜加强，粘膜初免、胃肠道外加强等给予多个剂量。通常通过相同途径给予。一般以至少1周(例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约12周、约16周等)的间隔给予多个剂量。隔开25-30天(例如，28天)给予两次剂量特别有效。

可将本发明产生的疫苗与其它疫苗基本上同时(在健康护理专业人员或疫苗接种中心的同一用药咨询或访问期间)给予患者，例如与麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、MMR疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、偶联的B型流感嗜血杆菌疫苗、脊髓灰质炎病毒灭活疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、脑膜炎球菌偶联疫苗(如四价A-C-W135-Y疫苗)、肺炎球菌偶联疫苗等基本上同时给药。

相似地，可将本发明疫苗与抗病毒化合物，具体是对流感病毒有活性的抗病毒化合物(如奥塞米韦和/或扎那米韦)基本上同时给予患者(在对健康护理专业人员的同一次用药咨询或访问期间)。这些抗病毒化合物包括神经氨酸酶抑制剂，如(3R，4R，5S)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-羧酸或5-(乙酰基氨基)-4-[(氨基亚氨基甲基)-氨基]-2，6-脱水-3，4，5-三脱氧-D-甘油-D-半乳糖壬-2-烯酮酸，包括它们的酯(如乙酯)和盐(如磷酸盐)。优选的抗病毒化合物是(3R，4R，5S)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-羧酸的乙酯和磷酸盐(1∶1)，也称为磷酸奥塞米韦(TAMIFLU^TM)。

本发明组合方面

如上所述，本发明对现有的从裂解的流感病毒制备疫苗抗原的方法设计了许多改进。除了单独使用，这些改进可组合使用。通过包括这种组合的方法获得的裂解病毒颗粒可用于制备流感疫苗。

因此，例如，本发明提供了一种制备分裂的流感病毒颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：(i)在不存在去污剂而优选存在磷酸盐缓冲液时获得包含流感病毒颗粒的组合物；(ii)在不存在去污剂而优选存在磷酸盐缓冲液时灭活流感病毒颗粒；(iii)用包含以离子强度为100mM或更高的缓冲液剂(优选磷酸盐缓冲液)配制的第一去污剂的试剂裂解灭活的病毒颗粒；和(iv)用第二去污剂交换第一去污剂。

去污剂交换后获得的材料可被进一步纯化，包括采用纤维素超滤膜超滤(根据第四方面)。

类似地，本发明提供了一种制备分裂的流感病毒颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：(i)获得含有流感病毒颗粒的液体培养基；(ii)任选浓缩该培养基；(iiii)渗滤该液体培养基以提供包含低电导率缓冲液的含病毒颗粒渗余物；(iv)通过选自亲和捕获、伪亲和捕获、层析或吸附的方法从渗余物中捕获病毒颗粒；(v)在不存在去污剂而优选存在磷酸盐缓冲液时灭活流感病毒颗粒；(vi)用包含以离子强度为100mM或更高的缓冲液(优选磷酸盐缓冲液)配制的第一去污剂的试剂裂解灭活的病毒颗粒；和(vii)用第二去污剂交换第一去污剂。如上所述，所述材料可被进一步纯化。

概述

术语“含有”包括“包含”以及“由...组成”，例如“含有”X的组合物可仅由X组成或可包含其它物质，例如X+Y。术语″基本上″不排除″完全″，如″基本上不含″Y的组合物可能完全不含Y。必要时，可从本发明定义中删去术语″基本上″。

与数值x相关的术语“约”表示，例如x±10％。

除非另有说明，包括混合两种或更多种组分的步骤的方法不要求任何特定的混合顺序。因此，可以任何顺序混合这些组分。有三种组分时，两种组分可以相互混合，然后将混合的组分再与第三种组分混合等。

将动物(特别是牛)材料用于培养细胞时，它们应获自未患传染性海绵状脑病(TSE)，特别是未患牛海绵状脑病(BSE)的来源。总之，优选在完全不含动物来源物质的情况下培养细胞。

当某化合物作为组合物的一部分给予人体时，该化合物可被合适的前药所替换。

当使用细胞底物进行病毒再造或逆向遗传学方法时，优选批准用于人类疫苗生产的细胞底物，例如欧洲药典总纲5.2.3所述的细胞底物。

附图简要说明

图1和2都显示了抗原纯化过程中5个阶段的SDS-PAGE分析。5条泳道从左到右显示了以下阶段存在的蛋白质：(i)β-丙内酯灭活之后；(ii)CTAB裂解之后；(iii)通过吸附除去CTAB之后15小时；(iv)完全吸附之后；和(v)吸附后无菌过滤之后。

具体实施方式

甲型流感病毒H5N1毒株成功生长于MDCK细胞。从该毒株制备纯化的表面糖蛋白的最初尝试使用之前成功用于H1N1毒株的方法，但该方法的表现很差。超过95％的病毒HA在基于CTAB的裂解步骤后丢失，而用来除去CTAB的步骤同时除去了超过75％的HA。此外，最终HA的抗原性受到损害，其中大部分无法被SRID检测。因此对H1N1方法进行了改进。

未对病毒生长和收获进行改动。然而，在收获之后采用超滤将病毒颗粒浓缩5倍(中空纤维PES膜，截断值为500kDa)，然后将浓缩的病毒颗粒悬浮液渗滤到10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0±0.1)中。用CS树脂(用相同的10mM磷酸盐缓冲液平衡)纯化(浓缩)病毒颗粒。在进一步的超滤/渗滤步骤中使用新的缓冲液。与H1N1方法中使用Tris缓冲液不同，使用磷酸盐缓冲液(缓冲液A：50mM磷酸盐，pH 7.5)来平衡和渗滤。此外，与H1N1方法不同，该缓冲液不含聚山梨酸酯80。

然后用β-丙内酯灭活纯化的病毒颗粒。然而，不同于H1N1方法，β-丙内酯用缓冲液A制备。

然后用CTAB裂解灭活的病毒颗粒，但该CTAB也是用缓冲液A制备的。此外，不同于在低浓度Tris缓冲液中进行裂解，裂解是在200mM NaCl+50mM磷酸盐，pH 7.5中进行的。因此，裂解期间使用的离子强度和缓冲体系都是不同的。

用来制备表面抗原的超滤与H1N1方法相同，但对随后的CTAB去除步骤(通过吸附)进行了改变。在H1N1方法中，CTAB吸附剂是用Tris缓冲液平衡，而对于H5N1，是用添加了2.5g/L聚山梨酸酯80的缓冲液A平衡。在该阶段加入聚山梨酸酯80以代替H1N1方法中的加入聚山梨酸酯80预灭活。

随后的纯化步骤是相同的，除了仍旧用缓冲液A代替Tris缓冲液，同时更换了最终的超滤膜以降低疏水性和降低其大小排阻限制，可选择具有低嵌入蛋白吸附特征的亲水性乙酸纤维素膜。

图1和2显示了这些改变对抗原纯化的影响。图1显示了对H5N1病毒采用H1N1方法获得的结果，HA抗原量在裂解后大幅度降低，而在图2中没有看到相同的降低。此外，在随后的纯化步骤中仍旧存在高水平的HA。

当对H5N1病毒进行H1N1方法时得到的最终HA浓度＜10μg/mL，而改进方法得到的终浓度为505μg/mL，即提高了50倍以上。通过SRID测得总HA回收率为36％。HA纯度非常好。残余CTAB浓度为每μg HA＜0.05μg。

相同的方法也可用来处理其它甲型流感病毒，如H1N1毒株。改进方法也是有用的，其中，聚山梨酸酯80是在CS层析步骤之后但在裂解之前、或者在裂解之后但在除去CTAB之前加入的。如果任一步骤中聚山梨酸酯80的加入量小于1.5g/L，则可在随后的纯化步骤中、但在最终的超滤之前进一步加入聚山梨酸酯80。

应理解，仅以举例的方式描述了本发明，可以进行修改而仍在本发明的范围和构思内。

参考文献(将其内容纳入本文作参考)

[1]Vaccines(疫苗)，(Plotkin和Orenstein编)，第4版，2004，ISBN：0-7216-9688-0.

[2]WO02/067983.

[3]WO02/074336.

[4]WO01/21151.

[5].

[6]Gross等.(198I)J Clin Microbiol 14：534-8.

[7]WO02/097072.

[8]WO2005/113756.

[9]美国专利4140762.

[10]美国专利4327182.

[11]美国专利4158054.

[12]美国专利4064232.

[13]美国专利6048537.

[14]美国专利5948410.

[15]Lina等.(2000)Biologicals 28：95-103.

[16]Gross等(1983)Am J Dis Child.137：26-8.

[17]Tannock等.(1991)Biologicals 19：17-21.

[18]美国专利5522991.

[19]美国专利4253963.

[20]美国专利5505890.

[21]Opitz等.(2007)Vaccine 25：939-47.

[22]Wallis等.(1972)Appl Environ Microbiol 23：740-4.

[23]Mizutani(1963)Nature 198：109-10.

[24]Lapidus(1969)Appl Microbiol 17：504-6.

[25]Rota等.(1992)J Gen Virol 73：2737-42.

[26]GenBank序列GI：325176.

[27]Herlocher等.(2004)J Infect Dis 190(9)：1627-30.

[28]Le等.(2005)Nature 437(7062)：1108.

[29]Hoffmann等.(2002)Vaccine 20：3165-3170.

[30]Subbarao等.(2003)Virology 305：192-200.

[31]Liu等.(2003)Virology 314：580-590.

[32]Ozaki等.(2004)J.Virol.78：1851-1857.

[33]Webby等.(2004)Lancet 363：1099-1103.

[34]WOOO/60050.

[35]WO01/04333.

[36]美国专利6649372.

[37]Neumann等.(2005)Proc Natl Acad Sci USA 102：16825-9.

[38]WO2007/124327

[39]Wang和Duke(2007)Virology J 4：102

[40]WO2006/067211.

[41]WO01/83794.

[42]Hoffinann等.(2000)Virology 267(2)：310-7.

[43]Kistner^α/.(1998)Vaccine 16：960-8.

[44]Kistner等.(1999)Dev Biol Stand 98：101-110.

[45]Bruhl等.(2000)Vaccine 19：1149-58.

[46]Ysa等(2001)Vaccine 19：2716-21.

[47]http://www.atcc.org/

[48]http://locus.umdnj.edu/

[49]WO03/076601.

[50]WO2005/042728.

[51]WO03/043415.

[52]WO01/85938.

[53]WO2006/108846.

[54]WO97/37000.

[55]Brands等.(1999)Dev Biol Stand 98：93-100.

[56]Halperin等.(2002)Vaccine 20：1240-7.

[57]Tree等.(2001)Vaccine 19：3444-50.

[58]EP-A-1260581(WO01/64846).

[59]WO2006/071563.

[60]WO2005/113758.

[61]WO97/37001.

[62]WO2006/027698.

[63]Stanley(1944)J Exp Med 79：255-66.

[64]Reimer等.(1966)J Bacteriol 92：1271-2.

[65]Reimer等.(1966)Science 152：1379-81.

[66]Sokolov等.(1971)Arch Virol 35：356-63.

[67]Heyward等.(1977)Arch Virol 55：107-19.

[68]WO2007/052163.

[69]Treanor等.(1996)J Infect Dis 173：1467-70.

[70]Keitel等.(1996)Clin Diagn Lab Immunol 3：507-10.

[71]WO2007/085969.

[72]美国专利6355271.

[73]WO00/23105.

[74]US 5,057,540.

[75]WO96/33739.

[76]EP-A-0109942.

[77]WO96/11711.

[79]Barr等.(1998)Advanced Drug Delivery Reviews 32：247-271.

[80]Sjolanderet等.(1998)Advanced Drug Delivery Reviews 32：321-338.

[81]Pizza等.(2000)Int J Med Microbiol 290：455-461.

[82]Tebbey等.(2000)Vaccine 18：2723-34.

[83]WO95/17211.

[84]WO98/42375.

[85]Singh等.(2001)J Cont Release 70：267-276.

[86]WO99/27960.

[87]US 6,090,406

[88]US 5,916,588

[89]EP-A-0626169.

[90]Dyakonova等.(2004)Int Immunopharmacol 4(13)：1615-23.

[91]FR-2859633.

[92]Signorelli&Hadden(2003)Int Immunopharmacol 3(8)：1177-86.

[93]WO2004/064715.

[94]De Libero等，Nature Reviews Immunology，2005，5：485-496

[95]美国专利5,936,076.

[96]Oki等，J.Clin.Investig.，113：1631-1640

[97]US2005/0192248

[98]Yang等，Angew.Chem.Int.Ed.，2004，43：3818-3822

[99]WO2005/102049

[100]Gof[iota]et al，J.Am.Chem.，Soc，2004，126：13602-13603

[101]WO03/105769

[102]Cooper(1995)Pharm Biotechnol 6：559-80.

[103]Kandimalla等.(2003)Nucleic Acids Research 31：2393-2400.

[104]WO02/26757.

[105]WO99/62923.

[106]Krieg(2003)Nature Medicine 9：831-835.

[107]McCluskie等.(2002)FEMS Immunology and Medical Microbiology 32：179-185.

[108]WO98/40100.

[109]美国专利6,207,646.

[110]美国专利6,239,116.

[111]美国专利6,429,199.

[112]Kandimalla等.(2003)Biochemical Society Transactions 31(第3部分)：654-658.

[113]Blackwell等.(2003)J Immunol 170：4061-4068.

[114]Krieg(2002)Trends Immunol 23：64-65.

[115]WO01/95935.

[116]Kandimalla等.(2003)BBRC 306：948-953.

[117]Bhagat等.(2003)BBRC 300：853-861.

[118]WO03/035836.

[119]WO01/22972.

[120]Schellack等.(2006)Vaccine 24：5461-72.

[121]Myers等.(1990)Cellular and molecular aspects of endotoxinreactions(内毒素反应的细胞方面和分子方面)第145-156页.

[122]Ulrich(2000)参考文献158第16章(第273-282页).

[123]Johnson等.(1999)J Med Chem 42：4640-9.

[124]Baldrick等.(2002)Regulatory Toxicol Pharmacol 35：398-413.

[125]WO 94/21292.

[126]US 4,680,338.

[127]US 4,988,815.

[128]WO92/15582.

[129]Stanley(2002)Clin Exp Dermatol 27：571-577.

[130]Wu等.(2004)Antiviral Res.64(2)：79-83.

[131]Vasilakos等.(2000)Cell Immunol.204(1)：64-74.

[132]US专利4689338，4929624，5238944，5266575，5268376，5346905，5352784，5389640，5395937，5482936，5494916，5525612，6083505，6440992，6627640，6656938，6660735，6660747，6664260，6664264，6664265，6667312，6670372，6677347，6677348，6677349，6683088，6703402，6743920，6800624，6809203，6888000和6924293.

[133]Jones(2003)Curr Opin Investig Drugs 4：214-218.

[134]WO2004/060308.

[135]WO2004/064759.

[136]US 6,924,271.

[137]US2005/0070556.

[138]US 5,658,731.

[139]Wong等.(2003)J Clin Pharmacol 43(7)：735-42.

[140]US2005/0215517.

[141]WO03/011223.

[142]Meraldi等.(2003)Vaccine 21：2485-2491.

[143]Pajak等.(2003)Vaccine 21：836-842.

[144]美国专利5,011,828.

[145]WO2004/87153.

[146]US 6,605,617.

[147]WO02/18383.

[148]WO2004/018455.

[149]WO03/082272.

[150]Johnson等.(1999)BioorgMed Chem Lett 9：2273-2278.

[151]Evans等.(2003)Expert Rev Vaccines 2：219-229.

[152]Andrianov等.(1998)Biomaterials 19：109-115.

[153]Payne等.(1998)Adv Drug Delivery Review 31：185-196.

[154]WO90/14837.

[155]Podda&Del Giudice(2003)Expert Rev Vaccines 2：197-203.

[156]Podda(2001)Vaccine 19：2673-2680.

[157]Vaccine Design：The Subunit and Adjuvant Approach(疫苗设计的亚单位也佐剂方法)(Powell和Newman编)普莱纳姆出版社(Plenum Press)1995(ISBN 0-306-44867-X).

[158]Vaccine Adjuvants：Preparation Methods and Research Protocols(疫苗佐剂的制备方法和研究方案)(分子药物方法系列丛书(Methods in MolecularMedicine series)第42卷)，ISBN：1-59259-083-7，O′Hagan编。

[159]WO2008/043774.

[160]Allison&Byars(1992)Res Immunol 143：519-25.

[161]Hariharan等.(1995)Cancer Res 55：3486-9.

[162]US-2007/014805.

[163]US-2007/0191314.

[164]SuIi等.(2004)Vaccine 22(25-26)：3464-9.

[165]WO95/11700.[166]美国专利6,080,725.

[167]WO2005/097181.

[168]WO2006/113373.

[169]Han等.(2005)Impact of Vitamin E on Immune Function and InfectiousDiseases in the Aged(维生素E对老年人免疫功能和传染病的影响)，Nutrition，Immune functions and Health EuroConference(欧洲营养、免疫功能和卫生大会)，巴黎，2005年6月9-10日.

[170]US-6630161.

[171]Gennaro(2000)Remington：The Science and Practice of Pharmacy(雷明顿药物科学和实践).第20版，ISBN：0683306472.

[172]Banzhoff(2000)Immunology Letters 71：91-96.

[173]WO02/097072.

[174]Nony ef α/.(2001)Vaccine 27：3645-51.

[175]EP-B-0870508.

[176]Lundblad(2001)Biotechnology and Applied Biochemistry 34：195-197.

[177]Guidance for Industry：Bioanalytical Method Validation.(生物分析验证方法的工业指南)U.S.Department of Health and Human Services Food and DrugAdministration Center for Drug Evaluation and Research(CDER)Center forVeterinary Medicine(CVM)(美国卫生和人类服务部，兽药药物评价和研究中心的食品药品管理中心(CDER)).2001年5月.

[178]Ji等.(2002)Biotechniques.32：1162-7.

[179]Briggs(1991)J Par enter Sci Technol.45：7-12.

[180]Lahijani等.(1998)Hum Gene Ther.9：1173-80.

[181]Lokteff等.(2001)Biologicals.29：123-32.

[182]WO2005/089837.

[183]美国专利6,692,468.

[184]WO00/07647.

[185]WO99/17820.

[186]美国专利5,971,953.

[187]美国专利4,060,082.

[188J EP-A-0520618.

[189]WO98/01174.

[190]Potter&Oxford(1979)Br Med Bull 35：69-75.

[191]Greenbaum等.(2004)Vaccine 22：2566-77.

[192]Zurbriggen等.(2003)Expert Rev Vaccines 2：295-304.

[193]Piascik(2003)J Am Pharm Assoc(Wash DC).43：728-30.

[194]Mann等.(2004)Vaccine 22：2425-9.

[195]Halperin等.(1979)Am J Public Health 69：1247-50.

[196]Herbert等.(1979)J Infect Dis 140：234-8.

[197]Chen等.(2003)Vaccine 21：2830-6.

Claims (11)

1.一种分裂流感病毒颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：(i)在存在磷酸盐缓冲液时获得包含流感病毒颗粒的组合物；(ii)在存在磷酸盐缓冲液时灭活所述流感病毒颗粒；和(iii)在存在磷酸盐缓冲液时裂解所述灭活的流感病毒颗粒。

2.一种制备流感疫苗的方法，其中，(a)通过采用权利要求1所述方法分裂流感病毒颗粒从病毒获得包含血凝素的抗原制品，和(b)用所述含血凝素的抗原制品制备疫苗。

3.如权利要求2所述的方法，所述疫苗是三价疫苗，包括两种A型流感毒株和一种B型流感毒株。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流感病毒颗粒来自甲型流感病毒。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流感病毒颗粒来自H5血凝素亚型甲型流感病毒。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流感病毒颗粒是从鸡蛋制备的。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流感病毒颗粒是从哺乳动物细胞培养物制备的。

8.如权利要求2-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述疫苗含7.5μg血凝素/毒株。

9.如权利要求2-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述疫苗含15μg血凝素/毒株。

10.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述疫苗包含佐剂。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述佐剂包含水包油乳液。

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