CN101948827A - 一种低载量乙型肝炎病毒全基因组克隆的方法 - Google Patents

Abstract

一种低载量乙型肝炎病毒全基因组克隆的方法，从患者血清内提取HBV DNA，采用巢式聚合酶链式反应扩增出HBV的CP-S区和RT-X区，使用内切酶酶切后连接，再以此为模板进行PCR扩增及克隆。该方法用于低载量HBV全基因组的扩增、克隆和序列分析，可为进一步分析低载量HBV的基础和临床研究提供有效帮助。

Description

一种低载量乙型肝炎病毒全基因组克隆的方法

技术领域：

本发明涉及一种低载量乙型肝炎病毒全基因组克隆的方法，特别是涉及采用两个片段连接法进行低载量乙型肝炎病毒全基因组的克隆。

背景技术：

乙型肝炎病毒(以下亦称HBV)全基因组克隆对于研究HBV病毒学特点及生物学特性具有重要的临床意义。

由于HBV全基因组是一个双链非闭合的松弛结构，两链不等长，加上基因组长度为3.2kb，增加了HBV全基因组扩增和克隆的困难，直到1995年美国学者Gunther等才成功进行HBV全基因扩增。但该方法要求HBV病毒载量不能低于10⁵copies/ml，而低载量很难得到PCR产物【Gunther S，Li B，Miska S，et al.J Virol，1995，69：5437-44.】。

目前随着抗HBV药物的广泛应用，患者体内HBV载量往往维持在较低水平复制，若想研究这些药物压力下HBV的生物学特点，必须要有灵敏度高、特异性强的低载量HBV全基因组克隆的方法。有学者建立了一种两个片段分别克隆HBV序列分别测序获得全序列信息的方法(未获得全基因组克隆)，低于10⁵拷贝/mL载量也可检出，但有可能不是同一病毒的克隆序列，没有生物学活性。【卢建溪，李莉等广东医学2008，29(7)：1095-7】还有一些HBV全基因扩增方法是Gunther方法的改进型方法【李瑞，闫永平等第四军医大学学报2002，23(6)：572-3】，也不能有效提高低载量HBV全基因扩增的检出率。

对于低载量HBV全基因组研究大多限于某一基因片段的研究，通过PCR扩增个体内HBV基因群中的某些亚基因片段，然后直接测序，可在模板量较低的条件下得到亚基因片段扩增产物，但由于HBV基因内部有调控基因，基因片段间又相互重叠，很可能形成HBV不同基因群片段构成一个可供分析的HBV基因片段，使出现在单个基因分子上的突变复杂性及致病和传播的关系无法精确和全面分析。有研究发现，由于病毒体内存在不同变异株，这种直接测部分序列的方法不能准确的提示病毒基因结构与病因及传播的关系。

采取普通的PCR方法扩增两个片段，对于低载量HBV DNA的扩增效果并不理想，特异性不强，且其采用两次克隆步骤，增加了实验的复杂程度和成本预算。

如果能够研发一种灵敏度高、特异性强、简单方便的低载量HBV全基因组克隆的方法，从患者低载量血清中扩增并克隆HBV全基因组序列，将有助于体外实验评价HBV复制力、HBV基因突变特征和频率、HBV体外感染力，对于监控抗病毒疗效及深入阐明HBV生物学活性具有重要意义。

发明内容：

本发明的目的是提供一种在低载量乙型肝炎病毒情况下，对HBV全基因组克隆的有效方法。

本发明的主要手段和方法是：

一种低载量乙型肝炎病毒全基因组克隆的方法，采用特异性引物将血清中提取的HBVDNA进行巢式PCR反应，扩增出HBV病毒的CP-S区和RT-X区两个片段，分别进行酶切后，将二者连接成完整的HBV全基因组，再以连接产物为模板用PCR方法扩增HBV全基因组后，进行克隆；

所述特异性引物的序列如下：

SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：2是CP-S区的外引物序列；

SEQ ID NO：3～SEQ ID NO：4是RT-X区的外引物序列；

SEQ ID NO：5～SEQ ID NO：6是CP-S区的内引物序列；

SEQ ID NO：7～SEQ ID NO：8是RT-X的内引物序列。

以3215个核苷酸长的环状HBV基因组的EcoRI酶切位点计为第1位核苷酸(nt 1)，从核心启动子区起始到S区终止即CP-S区(nt 1777-nt 274)，另一条是从逆转录酶区起始到X区终止即RT-X区(nt 3194-nt 1797)。

调整巢式PCR时的内外引物的浓度，可提高反应的灵敏度，使其能够进行一管式巢式PCR扩增。最佳的引物浓度为：外引物终浓度为10nmol/L；内引物终浓度为200nmol/L。

所述酶切，是扩增两个片段后，将产物纯化后分别使用内切酶进行酶切；内切酶优选使用XbaI。

所述连接，是使用连接酶进行，优选使用T4DNA连接酶。

本方法还可采用以下一种或几种手段进行优化，可使发明效果更好或达到最佳：

在引物SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7序列中加入BspQ I酶切位点，扩增全长以后便于从载体上获得完全不含外源序列的HBV全长基因组。

若在PCR反应体系中以1∶10混合加入Pfu DNA聚合酶和普通Taq DNA聚合酶，既能提高扩增的特异性，又可显著降低成本。便于在实验室开展。

所述用PCR方法扩增出两个片段时，采用一管式巢式PCR技术，可减少污染，提高产量；且只需经过一次克隆，简化了操作步骤。

采用本发明的方法达到了发明目的：实验证明，扩增出的病毒具有复制力(见实施例2)。

本发明的有益效果是：

1、灵敏度高：可以扩增得到初始DNA模板浓度10³～10⁴拷贝/mL样本。通过调整巢式PCR时的内外引物的浓度和全基因组扩增的反应条件，可提高反应的灵敏度，达到10³拷贝/mL(比国际公认的Gunther方法提高2个数量级)。

2、特异性强：通过对引物的选择和反应体系的优化，使特异性显著提高，PCR反应的假突变发生机率控制在1/10万以下。

3、操作简便：使用一管式巢式PCR技术扩增两个片段，可减少污染，提高产量；并只经过一次克隆，简化了操作步骤。

4、成本低：主要试剂可采用国产试剂，价格便宜，易于在实验室开展。如Pfu/Taq酶混合物的成本约为进口高保真耐热DNA耐合酶的1/10，而反应效果相同。

附图说明：

图1是HBV DNA CP-S区的扩增结果1772bp；

图2是HBV DNA RT-X区的扩增结果1814bp；

图3是两个片段连接后全基因组扩增结果3215bp；

图4是两片段法扩增得到的全序列克隆转染HepG2细胞72小时后培养上清乙肝表面抗原结果比较；

图5是两片段法扩增得到的全序列克隆转染HepG2细胞72小时后细胞裂解液中HBVDNA定量结果。

具体实施方式：

以下所用的主要实验材料来源如下：

Pfu和Taq DNA聚合酶及病毒DNA提取试剂盒：为北京天恩泽基因科技有限公司产品。内切酶XbaI，T4DNA连接酶：为NEB公司产品。

实施例1低载量乙型肝炎病毒全基因组克隆

扩增引物设计：从GenBank中选取729条HBV全长基因组序列，其中中国人特有的B和C基因型序列209条，用NTI软件进行比对分析HBV CP-S区和RT-X区保守区设计引物，全长引物参考文献设计，并加入酶切位点，有助于下一步的复制力的分析。

表1PCR反应使用的引物序列

一.巢式PCR扩增HBV的CP-S区和RT-X区

第一轮PCR反应(总体系25μL)

引物1和3扩增CP-S区片段长1948bp，引物2和4扩增RT-X区片段长1894bp。

2×Mix Buffer(预加0.3％橙黄G)    12.5μL

1∶10稀释的引物1和3(10μmol/L)    0.25μL

1∶10稀释的引物2和4(10μmol/L)    0.25μL

Taq DNA聚合酶(5U/μL)             0.50μL

Pfu DNA聚合酶(5U/μL)             0.05μL

                                               

                                  14.0μL

模板DNA                           11.0μL

说明：

1、巢式PCR第一轮反应时，25μL标准反应体系中，外引物浓度配置成10μmol/L的储存液，用水稀释10倍后取0.25μL加入25μL反应体系中。

2、为提高反应特异性，体系中加入普通Taq DNA聚合酶(终浓度达到0.1U/μL)的同时按照10∶1的比例加入Pfu DNA聚合酶(终浓度达到0.01U/μL)。

3、第一轮PCR反应参数：

94℃5min预变性，

94℃45s，59℃50s，72℃100s  2个循环，

94℃45s，57℃50s，72℃100s  2个循环，

94℃45s，55℃50s，72℃100s  2个循环，

94℃45s，53℃50s，72℃100s  2个循环，

94℃45s，51℃50s，72℃100s  2个循环，

94℃45s，56℃50s，72℃100s  30个循环，

72℃5min，68℃5min最后降到4℃。

第二轮PCR反应(总体系50μL，包括25μL新配缓冲液和25μL模板，)引物5和7扩增CP-S区片段长1668bp，引物6和8扩增RT-X区片段长1846bp

H₂O                              8.5μL

2×Mix Buffer(预加0.3％橙黄G)    15μL

引物5和7(10μmol/L)              0.5μL

引物6和8(10μmol/L)              0.5μL

Taq DNA聚合酶(5U/μL)            0.45μL

Pfu DNA聚合酶(5U/μL)            0.05μL

                                              

                                 25.0μL

模板(第1轮PCR产物)               25.0μL

说明：

1、巢式PCR第一轮25μL产物全部作为第二轮PCR的模板，第二轮PCR引物浓度配置成10μmol/L的储存液，取0.5μL加入50μL体系中，将配制好的二轮反应液直接加到第一管25μL反应液中，完成单管巢式PCR反应。

2、第二轮PCR反应参数：94℃3min预变性，94℃40s，55℃45s，72℃90s 35个循环，72℃5min，68℃5min最后降到4℃。

取3μL PCR终产物，用1％琼脂糖进行电泳。其余47μL PCR终产物纯化回收(按照Qiagen PCR产物纯化试剂盒说明书进行)。

二、HBV的CP-S区和RT-X区的酶切纯化及连接

1.酶切体系如下：

Xba I               1.5μL

PCR纯化产物         38.5μL

10×M Buffer        5μL

0.1％BSA            5μL

                                   

                    50μL

说明：酶切条件：37℃过夜。为了提高酶的活性，增加酶切的效率，酶切前要纯化巢式PCR产物。

2.连接体系如下：

10×Buffer          4μL

T4DNA连接酶         1.5μL

灭菌ddH₂O           14μL

CP-S区酶切后产物    10μL

RT-X区酶切后产物    10μL

                              

                    40μL

说明：连接条件：37℃过夜。HBV病毒的CP-S区和RT-X区的巢式PCR产物都仅存在单一的XbaI酶切位点，所以二者可以定向连接为完整的HBV全基因组。

三、HBV全基因组扩增

反应体系：

10×LA PCR Buffer          2.5μL

2.5mmol/L dNTP Mixture     2μL

1∶5稀释的5                1μL

1∶5稀释的7                1μL

LATaq(5U/μL)              0.5μL

H₂O        17μL

                                 

DNA模板    1μL

说明

1、在全基因组扩增时，25μL标准反应体系中，引物浓度配置成10μmol/L的储存液，用水稀释5倍后取1μL加入25μL反应体系中。

2.反应参数：

94℃   5min预变性；

94℃   40s，60℃1min40s，72℃5min 10个循环；

94℃   40s，60℃1min40s，72℃6min 10个循环；

94℃   40s，60℃1min40s，72℃7min 15个循环；

72℃   10min，最后降到4℃

四、PCR产物末端加A

反应体系：

PCR产物          50μL

Taq DNA聚合酶    1μL

dATP             6μL

10×LA buffer    6μT

                           

                 63μL

说明：反应条件：72℃20min。由于LA Taq酶本身具有外切酶活性，所以为了提高的T-A克隆的效率，有必要对PCR产物进行纯化，以除去其对连接的影响。

五、连接

反应体系

2×连接buffer      5μL

T4DNA连接酶        1μL

pGEM T-easy载体    1μL

纯化后的DNA        3μL

                             

                   10μL

说明：连接条件：4℃过夜。经过实验优化，DNA∶pGEMT-easy载体为3∶1时连接效率较高。

六、转化

取感受态细胞冰上放置5min，融解备用，5μL连接产物中加入25μL感受态细胞(冰上操作)，冰浴20min，42℃热击1min，冰浴2min后，加入950μL预热的SOC培养基，37℃130rpm/min培养1小时，1000g离心10min后200μL涂板，37℃培养过夜，挑选白色菌斑测序分析。

七、结果获得1条HBV全长基因组克隆序列，提交GenBank，Accession Number：GQ372968

实施例2低载量乙型肝炎病毒全基因组的克隆及复制力分析

对解放军第302医院就诊的低载量HBV DNA慢性乙型肝炎患者血清样本进行克隆，并进行复制力分析如下：

病例：3例患者均为慢性乙型肝炎患者，诊断标准符合2000年西安病毒性肝炎诊断标准【中华医学会感染病和寄生虫病学会；中华肝脏病学会：病毒性肝炎诊断和治疗标准.中华肝脏病杂志2000；6：324-329.】。患者6380采样时血清HBV DNA载量为9.77×10³拷贝/mL，患者Z3采样时血清HBV DNA载量为6.85×10³拷贝/mL。患者Z31采样时血清HBV DNA载量为2.48×10³拷贝/mL。

实验步骤

一、两段法分别PCR扩增CP-S区和RT-X区：具体步骤同实施例1。

二、HBV全长基因组克隆：具体步骤同实施例1。

三、1.0倍HBV基因组细胞转染：

1.酶切：BspQ I和Sca I(购于NEB公司)酶切含有HBV全长基因组的T-easy载体过夜，胶回收3.2kb的HBV序列，获得不含外源序列的完整HBV全长基因组，紫外分光光度计测量其浓度。

2.转染：将HepG2细胞按1×10⁵/孔分养到12孔板中，37℃，5％CO₂培养24小时后让其充分贴壁，1×PBS洗2-3遍，加入无FBS(胎牛血清)的培养液，每孔加入1μg胶回收的质粒与2μL Fugene HD(购于Roche公司)，培养4-5小时后1×PBS洗2-3次，加入含FBS的完全培养液，37℃，5％CO₂培养72小时后收获细胞。

四、ELISA(酶联免疫)方法检测培养上清分泌HBsAg：按照乙型肝炎表面抗原(HBsAg)ELISA检测试剂盒(购于北京科卫生物技术有限公司)说明书进行。

五、荧光定量PCR测定HBV基因组复制力：转染72小时后的HepG2细胞用0.5％NP-40裂解20分钟，裂解液离心弃沉淀，加入20U DNase和10U RNase 37℃水浴2-3小时，加入蛋白酶K消化液37℃水浴消化2-3小时，加入等体积的苯酚和氯仿抽提HBV DNA，异丙醇和乙醇沉淀，最后溶解在30μL蒸馏水中，取3μL用HBV荧光定量(SYBGreen I)检测试剂盒(购于杭州博日科技有限公司)定量检测。

结果一不同HBV DNA载量乙型肝炎病毒全基因组的表面抗原分析：应用两片段法从3例低病毒载量患者血清得到的6条全长HBV基因组克隆分别转染HepG2细胞，收集上清酶联免疫法检测表面抗原(见图4)，OD值介于0.13～0.58。提示：通过两片段法拼接的HBV全基因组，转染入肝细胞后可自行完成整个生活周期，并成功分泌表面抗原，证明该方法具有可行性，扩增的HBV基因组具有生物学活性。

结果二不同HBV DNA载量的HBV全基因组的荧光定量PCR分析：裂解转染细胞，提取HBV DNA，进行荧光定量分析(见图5)。提示：通过两片段法拼接得到的HBV全基因组，HBV DNA复制力介于6.75×10⁶～5.8×10⁷拷贝/mL。说明通过该方法不仅可获得全长HBV DNA，还具有较强的复制力，为研究HBV病毒学特点提供工具。

总之，本发明所述的低载量乙型肝炎病毒全基因组克隆的方法灵敏度高，在实际应用中具有很好的前景，可精确和全面的分析低病毒载量标本在单个基因分子上的突变复杂性及致病和传播的关系，对于临床医生早期干预具有重要意义。

Claims (9)

1.一种低载量乙型肝炎病毒全基因组克隆的方法，采用特异性引物将血清中提取的乙型肝炎病毒DNA进行巢式PCR反应；将扩增出乙型肝炎病毒的CP-S区和RT-X区两个片段分别进行酶切后，将二者连接成完整的病毒全基因组，再以连接产物为模板用PCR方法扩增该全基因组后，进行克隆；所述CP-S区为nt 1777～nt 274，RT-X区为nt 3194～nt 1797；所述特异性引物的序列如下：

SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：2是CP-S区的外引物序列；

SEQ ID NO：3～SEQ ID NO：4是RT-X区的外引物序列；

SEQ ID NO：5～SEQ ID NO：6是CP-S区的内引物序列；

SEQ ID NO：7～SEQ ID NO：8是RT-X的内引物序列。

2.权利要求1或2所述的方法，进行巢式PCR反应时，调整内外引物的浓度至：外引物终浓度为10nmol/L，内引物终浓度为200nmol/L。

3.权利要求1或2所述的方法，所述酶切，是扩增两个片段后，将产物纯化后分别使用内切酶进行酶切。

4.权利要求3所述的方法，所述内切酶是XbaI。

5.权利要求1或2所述的方法，所述连接，是使用连接酶进行。

6.权利要求5所述的方法，所述连接酶是T4DNA。

7.权利要求1或2所述的方法，在引物SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7序列中加入BspQ I酶切位点。

8.权利要求1或2所述的方法，在PCR反应体系中以1∶10的体积比混合加入Pfu DNA聚合酶和普通Taq DNA聚合酶。

9.权利要求1或2所述的方法，用PCR方法扩增出两个片段时，采用一管式巢式PCR方法。

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