CN101322847A - 基于siRNA池干扰的复合载体介导的抗乙肝病毒基因药物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于siRNA池干扰的复合载体介导的抗乙肝病毒基因药物，根据乙肝病毒及其表达产物的特点，以乙肝病毒表达的乙肝表面抗原中有效的表位蛋白与阳离子脂质体生物链接，借助乙肝表面抗原表位蛋白与肝细胞表面受体发生特异性结合，介导RNAi进入肝细胞内，同时利用阳离子脂质体与细胞脂质双分子层的可融性，加大siRNA表达载体进入肝细胞内的效率。本发明药物可改善siRNA的有效性、体内的生物稳定性、安全性和有效靶向传递，可以用于临床。
Description
技术领域
本发明涉及一种RNAi抗乙肝病毒药物，即以乙肝病毒表达的乙肝表面抗原中有效的表位蛋白与阳离子脂质体生物链接来介导RNAi进入肝细胞内的药物，本发明具体涉及基于siRNA池干扰的复合载体介导的抗乙肝病毒基因药物。
背景技术
乙型肝炎病毒(HBV)的持续感染是全球一个重要的健康问题。目前全球约有3.5亿感染者，其中75％分布在亚太地区。1992-1995年全国病毒性肝炎血清流行病学调查显示，我国人群乙肝病毒感染率为57.6％，乙肝病毒携带率为9.75％，据此推算全国有6.9亿人曾感染过乙肝病毒，其中1.2亿人长期携带乙肝病毒，据专家估计，目前全国有现患慢性乙肝病人2,000万人。在我国法定报告的传染病中，多年来乙肝的发病数和发病率一直高居前列。乙肝给病人、家庭、社会造成沉重的经济负担，给社会经济发展带来不容忽视的影响，是许多家庭因病致贫、因病返贫的重要原因，同时也引发一系列社会问题，是我国现阶段最为突出的公共卫生问题之一。因此，研究出一种新型的有效的抗乙型肝炎病毒药物将会带来巨大的社会和经济效益。
控制HBV感染的抗病毒治疗主要采用干扰素和核苷类似物，这二类药物是目前临床常用的治疗方法，但是这些药物对慢性乙型肝炎的抗病毒疗效都有缺陷，高剂量重组干扰素的持续应答率仅为30％，且临床副作用较大；核苷类似物虽然抗病毒活性较强，但停药后病毒复制快速反跳，以及长期应用后引起耐药病毒株，这些都有可能诱发原有肝炎的加重。
近年来RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术的发现，为慢性HBV感染的治疗开辟了新的途径，其原理是通过19-24个核苷酸片段的短双链RNA，即小干扰RNA(short interference RNA，siRNA)诱发对宿主细胞浆中内源或外源性RNA的特异性切割或降解作用，从而抑制目的基因的表达，即转录后基因沉默(post transcriptionalgene silencing，PTGS)。RNAi具有高效性和高特异性，已经被广泛应用于植物、真菌、蠕虫和低等动物以及高等哺乳动物的基因功能研究，由于RNAi技术显示出的巨大价值，被《Science》杂志评为2001和2002年的十大科学成就之一，同时获得2006年度的诺贝尔奖。RNA干扰可以被看成是一种与免疫系统类似的防御机制，初步的实验结果表明这种设想有可能变成现实。用小干扰RNA可抑制人类免疫缺陷病毒(HIV)的某些基因，如P24、Vif、nef、tat或rev可阻碍HIV在细胞内复制。也有通过RNA干扰抑制各类病毒在细胞内复制的报道，如脊隋灰质炎病毒、人乳头瘤病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒。大量的体外实验研究资料已经显现出该技术在基因功能研究中的应用前景和新药开发中得到巨大潜力。除使用人工合成的小干扰性RNA之外，人们已经成功地使用发夹状RNA或以质粒DNA或病毒为载体在细胞内生成小干扰性RNA样转录物，来特异性地抑制外源性或内源性基因在哺乳动物或人细胞内表达。
国内外已有学者用RNA干扰对乙肝病毒的作用进行了初步的研究。且一系列研究报道了RNA干扰技术在体内外试验中均显著抑制HBV的蛋白表达和DNA复制，显示了该技术在治疗慢性乙型肝炎中具有巨大的应用前景。但是RNA干扰在临床上的广泛使用还需要解决一些关键性问题：如更有效的设计、体内的生物稳定性、安全性和有效靶向传递等。目前多是采用直接注射或利用脂质体包裹将合成的siRNA或siRNA表达载体导入细胞内，但是以乙肝病毒表达的乙肝表面抗原中有效的表位蛋白与阳离子脂质体生物链接来介导RNAi进入肝细胞内的研究尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是：提供一种基于siRNA池干扰的复合载体介导的抗乙肝病毒基因药物，该药物的复合载体可改善siRNA的有效性、体内的生物稳定性、安全性和有效靶向传递，实现siRNA的临床应用，提高临床应用的有效性。
本发明为解决上述问题采用的技术方案是：根据乙肝病毒及其表达产物的特点，以乙肝病毒表达的乙肝表面抗原中有效的表位蛋白与阳离子脂质体生物链接，借助乙肝表面抗原表位蛋白与肝细胞表面受体发生特异性结合，介导siRNA进入肝细胞内，同时利用阳离子脂质体与细胞脂质双分子层的可融性，加大siRNA表达载体进入肝细胞内的效率。
本发明的步骤如下：
1、siRNA合成；
2、针对HBV各基因区(S、C、P、X)siRNA及siRNA池表达载体的构建；
3、以乙肝病毒表达的乙肝表面抗原中有效的表位蛋白与阳离子脂质体生物链接，介导RNAi进入肝细胞内。
本发明的关键在于乙型肝炎表面抗原中有效的表位蛋白介导的RNAi的细胞传递：确定乙型肝炎表面抗原中有效的表位蛋白的氨基酸序列，合成乙型肝炎表面抗原表位蛋白，将合成的乙型肝炎表面抗原中有效的表位蛋白和阳离子脂质体生物链接。
乙型肝炎表面抗原中有效的表位蛋白序列如下：
cag gcg ggg ttt ttc ttg ttg aca aga atc ctc aca ata cca cag agt cta gac tcg Q
A G F F L L T R I L T I P Q S L D S
由美国ABI公司合成。
阳离子脂质体的组成如下：
DC-chol〔3β-(N-(N′，N′-二甲基氨基乙基))氨基甲酸酯胆固醇〕/DOPE(二油酰磷酸乙醇胺)＝1∶1(摩尔比)，由Sigma公司提供。
合成的乙型肝炎表面抗原中有效的表位蛋白和阳离子脂质体的生物链接由美国ABI公司合成。
siRNA序列如下：
siRNA-S1：正义链(5’-GUGGUGGACUUCUCUCAAUTT-3’)
反义链(5’-AUUGAGAGAAGUCCACCACTT-3’)
siRNA-S2：正义链(5’-AACCUCCAAUCACUCACCAACTT-3’)
反义链(5’-GUUGGUGAGUGAUUGGAGGUUTT-3’)
siRNA-S3：正义链(5’-GCCUCAUCUUCUUGUUGGUTT-3’)
反义链(5’-ACCAACAAGAAGAUGAGGCTT-3’)
siRNA-S4：正义链(5’-GGUAUGUUGCCCGUUUGUCTT-3’)
反义链(5’-GACAAACGGGCAACAUACCTT-3’)
本发明具有以下优势：
(1)HBsAg的有效表位蛋白可与肝细胞表面受体发生特异性结合；
(2)阳离子脂质体与细胞脂质双分子层具有很好的相融性；
(3)HBsAg中有效的表位蛋白与阳离子脂质体生物链接可增加siRNA池表达载体细胞传递的靶向效应；
(4)siRNA池表达载体在体内具有较好的生物稳定性和安全性；
(5)siRNA池表达载体在体内对HBV具有较强的基因沉默效应；
(6)shRNA质粒转染后可减少细胞分泌HBsAg的水平。
附图说明
图1为针对HBV各基因区(S、C、P、X)siRNA及siRNA池表达载体的构建；
图2为本发明的siRNA复合载体具体传递方式图。
图3化学合成的siRNAs用复合载体运载体系转染入HepG2.2.15细胞后对HBsAg表达的抑制作用。(A)mRNA水平(B)蛋白水平。HBsAgmRNA和HBsAg蛋白水平在转染72小时后分别用实时RT-PCR和ELISA法检测。
图4.shRNA表达质粒转染进HepG2.2.15细胞。在转录后72小时分别用ELISA、实时RT-PCR和实时检测PCR pHBV-S1，pHBV-S2，pHBV-S4，pHBV-2S和pHBV-3S质粒的HBsAg基因沉默效应(A)蛋白，(B)RNA和(C)DNA。
图5.质粒编码的shRNA在HepG2.2.15细胞中对HBsAg的RNAi干扰作用。细胞种于24孔板，用1mg/孔shRNA表达质粒转染。转染72小时后，细胞固定，HBsAg免疫染色，显微镜观察。这些结果显示与质控标本比较HBsAg的表达水平被减低到不同水平。
图6.shRNA表达质粒转染HepG2.2.15细胞72小时后，用ELISA法检测培养基中释放的IFN-γ。结果显示转染了shRNA表达质粒后HepG2.2.15细胞分泌的IFN-γ浓度变化不明显，说明没有诱导IFN应答。
具体实施方式
下面结合具体实例，进一步详细的阐述本发明，本发明的突出的实质性的特点和积极效果可从下述实例中得以体现，但它们并不是对本发明作出任何限制。
材料
psiSTRIKETM质粒试剂盒购自Promega公司，抗生素G418购自Sigma-Aldrich公司，小牛白蛋白血清(BSA)(成分V，纯度＞98％)购自USB公司，DMEM(Dulbecco’s modified eagle’s medium)、青霉素G(5000单位/ml)、Trypsin-EDTA、Trizol、DNase I、HBsAg表位蛋白-阳离子脂质体复合载体由ABI公司合成、PureLinkTM病毒RNA/DNA试剂盒、鼠单克隆抗-HBsAg和Alexa Fluor 488羊抗鼠IgG购自Invitrogen公司，限制性内切酶(PstI，EcoRI，ClaI，BsrGI，SgfI and BglII.)购自New England Biolabs公司，逆转录酶购自Applied Biosystems公司，HBsAg ELISA检测试剂盒购自Abazyme公司，siRNAs和引物由Integrated DNA Technologies公司合成。
siRNA设计与合成
针对乙型肝炎HBsAg不同区域设计siRNA(Gene Bank Accession#NM_U95551)，见表1，这些siRNA为19-21nt和2-nt脱氧核糖核苷酸并针对ayw HBV基因组的保守S区，这些siRNA的设计参照Ambion(http://www.ambion.com/techl ib/misc/siRNA_finder.html)和Invitrogen(https://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/design.do)，所有siRNA序列的特异性通过BLAST search(www.ncbi.nlm.nih.gov)验证，所有s iRNA由Integrated DNATechnologies公司合成。
表1si RNA序列和HBV的靶位点
shRNA表达质粒的构建
通过识别不同siRNA序列，选择三个有效序列转化为针对HBsAg不同靶区域的shRNA序列，见表2A，用psiSTRIKETM构建表达抗-HBsAg的pHBV-S1，pHBV-S2，pHBV-S4和质控的shRNA表达载体，其包含一个U6RNA多聚酶启动子。为了构建shRNA池表达质粒pHBV-2S和pHBV-3S，合成包含多个限制性内切酶的序列的一个序列正义链(5’-ACCGGA ATT CCG GAT ATC GAT GTA CAG CGG CCG CGA TCG CGA C-3)和反义链(5’-TGC AGT CGC GAT CGC GGC CGC TGT ACA TCG ATA TCCGGA ATT C-3’)插入psiSTRIKETM质粒称之为pEsiST载体；使用EcoRI和ClaI消化pEsiST并包含大量限制性内切酶位点，shRNA-S1’的正义链(5’-AAT TCG TGG TGG ACT TCT CTC AAT CTT CCT GTC AATTGA GAG AAG TCC ACC ACAT-3’)和反义链(5’-CGAT GT GGT GGA CTT CTC TCA ATT GAC AGG AAG ATT GAG AGA AGT CCA CCA CG-3’)退火克隆入pEsiST载体的EcoRI-ClaI位点，称之为pshRNA-S1’质粒；使用SgfI和BglII消化pshRNA-S1’质粒，shRNA-S4’的正义链(5’-CGC GGT ATG TTG CCC GTT TGT CCT TCC TGT CAG ACA AAC GGG CAA CAT ACC TTT TTA-3’)和反义链(5’-GATCT AAA AAG GTA TGT TGC CCG TTT GTC TGA CAG GAA GGA CAA ACG GGC AAC ATACC GCGAT-3’)退火克隆入pshRNA-S1’质粒的SgfI-BglII位点，称之为pHBV-2S质粒，shRNA-S4’末端包含一个TTTTT伸展产生pol III终止信号。然后使用BsrGI和SgfI消化pHBV-2S质粒，shRNA-S2’的正义链(5’-GTACA AAC CTC CAA TCA CTC ACC AAC CTT CCT GTC AGT TGG TGA GTG ATT GGA GGT T GCGAT-3’)和反义链(5’-CGC AAC CTC CAA TCACTC ACC AAC TGA CAG GAA GGT TGG TGA GTG ATT GGA GGT TT-3’)退火克隆入pHBV-2S质粒的BsrGI-SgfI位点，称之为pHBV-3S载体质粒；所以2-3个shRNA(见表2B)插入到psiSTRIKETM载体中(见图1)产生pHBV-2S和pHBV-3S质粒载体。
表2针对HBsAg不同靶区域的shRNA的序列
细胞传递系统的构建
乙肝病毒表达的乙肝表面抗原中有效的表位蛋白序列如下：
cag gcg ggg ttt ttc ttg ttg aca aga atc ctc aca ata cca cag agt cta gac tcg Q
A G F F L L T R I L T I P Q S L D S
阳离子脂质体的组成如下：
DC-chol〔3β-(N-(N′，N′-二甲基氨基乙基))氨基甲酸酯胆固醇〕/DOPE(二油酰磷酸乙醇胺)＝1∶1(摩尔比)，由Sigma公司提供。
合成的HBsAg蛋白和阳离子脂质体的生物链接均由美国ABI公司合成。
细胞培养和转染
HepG2.2.15细胞系在4％胎牛血清和330μg/ml和抗生素G418的DMEM培养液中，于增湿孵化器中37℃、5％CO2培养，转染前24小时，在24孔培养板上细胞以每孔1×105的密度分种。
siRNA质粒载体用乙肝表面抗原中有效的表位蛋白序列与阳离子脂质体生物链接所形成的复合载体以1μg/1μg的比率包裹后以40-80nmol/L的浓度转染细胞，同样，shRNA表达载体也以复合载体包裹后分别以0.5μg、1μg、2μg/孔的浓度转染细胞，设空白和转染试剂对照，各做三复孔，转染72小时后，收获细胞做进一步分析。
颗粒大小和ζ势能的检测
质粒和复合脂质体分别以5％w/v的葡萄糖稀释到250μl，然后把DNA加入到复合脂质体中，于室温作用45分钟。改变脂质/质粒的混合比率，用Malvern Zetasizer于25℃通过动态光散射法分别检测颗粒大小和ζ势能。
荧光定量PCR检测HBsAg mRNA和培养基中的HBV DNA
分别用siRNA或shRNA表达质粒转染HepG2.2.15细胞，将转染后72h的细胞用胰蛋白酶消化、离心收集，再用PBS重悬、离心收集，用DNA提取试剂盒严格按照说明提取总DNA，用实时荧光定量PCR和实时RT-PCR检测培养基中的HBV DNA和HBsAg mRNA。
针对HBV S基因的特异性引物为正义链：5’-GAT TCC TAG GAC CCCTTC TC-3’，反义链：5’-GGA GGA CAG GAG GTT GGT GA-3’，实时PCR的条件如下：50℃，2min；95℃，10min；95℃，15s；54℃，1min，×40cycles；72℃，5min。
免疫荧光检测
用shRNA表达质粒转染HepG2.2.15细胞在转染后72小时后，用3％福尔马林固定15min，用DPBS洗3次，用0.1％Briji98/PBS作用2min，用DPBS洗2次，用20％羊血清封闭30min，用单克隆鼠抗-HBsAg抗体作为第一抗体和Cy3-羊抗鼠IgG作为第二抗体室温反应1h，制片，显微镜观察。
结果
siRNA序列的基因沉默效应
选择HBsAg作为靶基因，检测siRNA沉默HBV基因表达的能力。比较靶向HBsAg四个不同基因区的4个不同19-21bp的siRNA的基因沉默作用(见表1)。这些siRNA单独或者4个混合以混合载体包裹转染HepG2.2.15细胞。如图2所示，siRNA对HBsAg的基因沉默是序列特异性和剂量依赖性的，3种siRNAs都引起了HBsAg mRNA水平的大幅度降低，而对照siRNA对HBsAg的基因表达几乎没有作用。用siRNA-S1、siRNA-S2、siRNA-S3和siRNA-S4以40nmol/L的剂量作用于标本可使HBsAg mRNA表达水平降低40.9、13.41、17.4and 40.16％。当siRNA-S1、siRNA-S2、siRNA-S3和siRNA-S4剂量增加到80nmol/L，可增加HBsAg的基因沉默效应，分别为71.77、58.79、54.49and 84.69％，如图3A。
用ELISA法检测转染3天后HBsAg分泌到培养基中的水平。在siRNA-S1、siRNA-S2、siRNA-S3和siRNA-S4以40nmol/L的剂量作用后，分泌到培养基中HBsAg水平分别被降低了39.67、31.79、30.55和42.29％；当作用剂量增加到80nmol/L时，培养基中HBsAg的浓度大幅度降低，分别为58.72、55.03、46.01和61.71％，如图3B；siRNA-S4在这几种siRNA中显示了最高的基因沉默水平，当转染剂量达到80nmol/L时，HBsAg的mRNA和蛋白水平分别被降低了84.69％和61.71％。别的siRNA对HBsAg的表达表现为不同水平的抑制作用。siRNA对照组HBsAg的表达水平无变化，说明siRNA对HBsAg的抑制作用具有序列特异性。
shRNA表达质粒的构建
通过识别不同siRNA序列，选择三个高活性的siRNA序列转化为靶向HBsAg不同靶区域的shRNA序列，这些序列在5’和3’末端包含克隆所需的唯一的限制性位点，并在正义链的有一个可产生pol III终止信号的TTTTT序列(见表2A)，然后把这些序列克隆入psiSTRIKETM，如图1所列。pHBV-S1、pHBV-S2、pHBV-S4用限制性内切酶消化产生2个大约3047bp和1370bp的DNA片段。pHBV-2S和pHBV-3S载体用EcoRI和Bgl II酶消化鉴别。pHBV-2S和pHBV-3S产物的长度分别为118bp和163bp，DNA序列结果显示插入的片段有所要的序列。
shRNA表达对HBsAg分泌的作用
为了评价siRNA池对HBV生活周期的影响，用psiSTRIKETM载体在HepG2.2.15细胞系中直接合成大量的siRNA。克隆、扩增和纯化后的pHBV-S 1，pHBV-S2，pHBV-S4，pHBV-2S和pHBV-3S，形成质粒复合载体的混合物，通过动态光散射技术检测颗粒大小和ζ势能。这些质粒复合载体的混合物颗粒的平均大小为200-400nm，ζ势能为20-30Mv。检测以0.5、1和2μg/孔的浓度转染进HepG2.2.15细胞的shRNA表达质粒对HBsAg基因沉默的效应，每一个序列都获得了大量的HBsAg基因沉默效应(见图4)。与对照shRNA表达质粒转染群比较，shRNA表达质粒转染HepG2.2.15细胞可大量的抑制培养基中的HBsAg的浓度(见图4A)。与编码单一shRNA的质粒比较，编码针对HBsAg基因不同区域的3个shRNA质粒显示更有效的HBsAg沉默效应。
我们用实时RT-PCR检测了转染的HepG2.2.15细胞中提取的总RNA，结果确证了编码三个shRNAs(pHBV-3S)的质粒，可使HBsAgmRNA的浓度减少63.2-87.7％(见图4B)。
用实时PCR检测了培养基中的HBV DNA，如图3C所示，当HepG2.2.15细胞转染了编码靶向HBsAg的shRNA质粒可大量的降低其HBV DNA的水平。当用编码3个shRNAs(pHBV-3S)的质粒转染时抑制率约为85％。
HBsAg表达的的免疫荧光分析
在HepG2.2.15细胞转染了编码针对HBsAg的shRNA质粒72小时后，细胞免疫染色后用显微镜观察。HBsAg染色的荧光强度依次为：HBV-S1＞HBV-S2＞HBV-S4＞HBV-2S＞HBV-3S(见图5)。说明用shRNA质粒转染的细胞HBsAg水平被减少到不同程度。pHBV-2S和pHBV-3S质粒转染的细胞显示低的荧光，说明HBsAg的低表达。
shRNA诱导的IFN应答
为了检测shRNA是否诱导了IFN应答，在shRNA表达质粒转染HepG2.2.15细胞72小时后，用ELISA法检测培养基中释放的IFN-γ，如图6所示，用shRNA表达质粒转染的后IFN-γ浓度不增加，说明没有诱导IFN应答。
以上结果显示乙肝病毒表达的乙肝表面抗原中有效的表位蛋白序列和阳离子脂质体生物链接作为s iRNA表达载体的细胞传递体系，与目前常用的单一的阳离子传递体系统相比，基因传递效率较高，非靶位效应小，非特异性免疫应答作用小，符合预期设想的抗乙型肝炎病毒的作用，可以用于临床。
Claims (4)
1、基于siRNA池干扰的复合载体介导的抗乙肝病毒基因药物，其特征在于：该药物根据乙肝病毒及其表达产物的特点，以乙肝病毒表达的乙肝表面抗原中有效的表位蛋白与阳离子脂质体生物链接，借助乙肝表面抗原表位蛋白与肝细胞表面受体发生特异性结合，介导RNAi进入肝细胞内，同时利用阳离子脂质体与细胞脂质双分子层的可融性，加大siRNA表达载体进入肝细胞内的效率。
2、根据权利要求1所述的基于siRNA池干扰的复合载体介导的抗乙肝病毒基因药物，其特征在于：乙型肝炎表面抗原中有效的表位蛋白序列如下：
cag gcg ggg ttt ttc ttg ttg aca aga atc ctc aca ata cca cag agt cta gac tcg
Q A G F F L L T R I L T I P Q S L D S。
3.根据权利要求1所述的基于siRNA池干扰的复合载体介导的抗乙肝病毒基因药物，其特征在于：阳离子脂质体的组成如下：
DC-chol〔3β-(N-(N′，N′-二甲基氨基乙基))氨基甲酸酯胆固醇〕/DOPE(二油酰磷酸乙醇胺)＝1∶1(摩尔比)。
4.根据权利要求1所述的基于siRNA池干扰的复合载体介导的抗乙肝病毒基因药物，其特征在于：siRNA序列如下：
siRNA-S1：正义链(5’-GUGGUGGACUUCUCUCAAUTT-3’)
反义链(5’-AUUGAGAGAAGUCCACCACTT-3’)
siRNA-S2：正义链(5’-AACCUCCAAUCACUCACCAACTT-3’)
反义链(5’-GUUGGUGAGUGAUUGGAGGUUTT-3’)
siRNA-S3：正义链(5’-GCCUCAUCUUCUUGUUGGUTT-3’)
反义链(5’-ACCAACAAGAAGAUGAGGCTT-3’)
siRNA-S4：正义链(5’-GGUAUGUUGCCCGUUUGUCTT-3’)
反义链(5’-GACAAACGGGCAACAUACCTT-3’)。
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20081217 |