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BR112020007405A2 - Produtos terapêuticos de anticorpo pós-translacionalmente modificados totalmente humanos - Google Patents

Produtos terapêuticos de anticorpo pós-translacionalmente modificados totalmente humanos Download PDF

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BR112020007405A2
BR112020007405A2 BR112020007405-5A BR112020007405A BR112020007405A2 BR 112020007405 A2 BR112020007405 A2 BR 112020007405A2 BR 112020007405 A BR112020007405 A BR 112020007405A BR 112020007405 A2 BR112020007405 A2 BR 112020007405A2
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BR
Brazil
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seq
antigen
human
binding fragment
mab
Prior art date
Application number
BR112020007405-5A
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English (en)
Inventor
Olivier Danos
Zhuchun Wu
Franz Gerner
Sherri Van Everen
Original Assignee
Regenxbio Inc.
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Filing date
Publication date
Application filed by Regenxbio Inc. filed Critical Regenxbio Inc.
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Abstract

são fornecidos métodos e composições para a liberação de anticorpos monoclonais terapêuticos pós-translacionalmente humanos e fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo. os anticorpos monoclonais pós-translacionalmente modificados totalmente humanos podem ser preferivelmente liberados por métodos de terapia genética, particularmente como um vetor de vírus adenoassociado recombinante (raav) para o tecido apropriado. são também fornecidos métodos de fabricação dos vetores de aav, composições farmacêuticas e métodos de tratamento. além disso, são fornecidos métodos de produção de anticorpos terapêuticos que são "biobetters" quando pós-translacionalmente modificados totalmente humanos. estes anticorpos pós-translacionalmente modificados totalmente humanos podem ser administrados a um indivíduo em necessidade de tratamento com o anticorpo terapêutico.

Description

Relatório = Descritivo da Patente de Invenção para “PRODUTOS — TERAPÊUTICOS DE ANTICORPO PÓS-
TRANSLACIONALMENTE MODIFICADOS TOTALMENTE HUMANOS”. O. LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
[001] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi enviada eletronicamente no formato ASCII e é por meio deste incorporada por referência na sua íntegra. A referida cópia ASCII, criada em 17 de outubro de 2018, é denominada 261 15 105004 SL.txt e tem 400, 185 bytes de tamanho.
1. INTRODUÇÃO
[002] As composições e métodos são descritos para a liberação de um anticorpo monoclonal ("mAb") terapêutico pós- translacionalmente modificado totalmente humano (HuPTM) ou o fragmento de ligação ao antígeno HUPTM de um mAb terapêutico - por exemplo, um Fab glicosilado totalmente humano (HuGly) do mAb terapêutico - para um indivíduo humano diagnosticado com uma doença ou condição indicada para tratamento com o mAb terapêutico.
2. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[003] Foi demonstrado que os mAbs terapêuticos são eficazes no tratamento de várias doenças e condições. No entanto, como esses agentes são eficazes por apenas um curto período de tempo, muitas vezes são necessárias injeções repetidas por longos períodos, criando assim uma carga considerável de tratamento para os pacientes.
3. “SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[004] Composições e métodos são descritos para a liberação de um mAb HuPTM ou um fragmento de ligação ao antígeno HUPTM de um mAb terapêutico (por exemplo, um Fab totalmente humano glicosilado (HuGlyFab) de um mAb terapêutico) a um paciente (indivíduo humano) diagnosticado com uma doença ou condição indicada para tratamento com o mAb terapêutico. Tais fragmentos de mAbs terapêuticos de ligação ao antígeno incluem um Fab, F(ab')2 ou scFv (fragmento variável de cadeia única) (coletivamente aqui referido como "fragmento de ligação ao antígeno"). "Fab HuUPTM" quando aqui utilizado pode incluir outros fragmentos de ligação ao antígeno de um mAb. Em uma modalidade alternativa, mAbs completos podem ser usados. A liberação pode ser vantajosamente realizada via terapia genética - por exemplo, administrando um vetor viral ou outra construção de expressão de DNA que codifica um mAb terapêutico ou seu fragmento de ligação ao antígeno (ou um derivado hiperglicosilado de qualquer um) a um paciente (indivíduo humano) diagnosticado com uma condição indicado para tratamento com o mAb terapêutico - para criar um depósito permanente em um tecido ou órgão do paciente que forneça continuamente o mAb HuPTM ou fragmento de ligação ao antígeno do mAb terapêutico, ou seja, um produto de transgene glicosilado humano, para um tecido alvo onde o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno exerce seu efeito terapêutico.
[005] O fragmento de ligação ao antígeno de HUPTM ou mAb HuPTM codificado pelo transgene pode incluir, porém não está limitado a, um fragmento de tamanho natural ou de ligação ao antígeno de um anticorpo terapêutico que se liga a:
[006] e Alvos do sistema nervoso, incluindo peptídeos beta amiloide (AB ou Abeta) derivados da proteína precursora amiloide (APP) implicada na doença de Alzheimer, incluindo, entre outros, aducanumabe, crenezumabe, gantenerumabe e BAN2401, indicados para o tratamento da doença de Alzheimer (veja as Figuras 2A-2C e 2F); Proteína Tau implicada em tauopatias, incluindo doença de Alzheimer, paralisia supranuclear progressiva, demência frontotemporal, encefalopatia traumática crônica, Complexo de Pick, taupotina primária relacionada à idade, incluindo, mas não limitado a
"aTAU" (veja, FIG. 2D) para tratamento de tauopatias; e receptor de CGRP implicado em enxaquecas e cefaleias em cachos, incluindo, mas não limitado a, erenumabe (AIMOVIGTY) (veja, FIG. 2E), eptinezumabe, fremanezumabe e galcanezumabe para o tratamento de enxaquecas e cefaleias em cachos;
[007] e Interleucinas ou receptores de interleucina, incluindo, sem limitação, ILA4R, como dupilumabe (veja, FIG 3 A), indicado para o tratamento de dermatite atópica; IL17A como ixekizumabe (TALTZO) ou secukinumabe (COSENTYXO) (veja, FIGURAS 3B e 3C) indicado para o tratamento da psoríase em placas, artrite psoriática e espondilite anquilosante; IL-5, como mepolizumabe (NUCALAG) (veja, FIG. 3D), indicado para o tratamento de asma; e I1L12/1123 como ustekinumabe (STELARAGO) (veja, FIG. 3E) indicado para o tratamento de psoríase e doença de Crohn;
[008] e Integrina, incluindo, sem limitação, vedolizumabe (ENTYVIOO), indicada para o tratamento de colite ulcerativa e doença de Crohn (veja, FIG. 4A) e natalizumabe (anti-integrina alfa 4) para tratamento de esclerose múltipla e doença de Crohn (consulte a FIG. 4B);
[009] e Alvos de hipercolesterolemia e doenças cardiovasculares, como PCSKS9, incluindo, entre outros, alirocumabe (PRALUENTO) e evolocumabe (REPATHAG), indicados para o tratamento de HeFH e HoFH (veja, FIGURAS 5 A e 5B); ou ANGPTL3, incluindo, sem limitação, evinacumabe (veja, FIG. 5C), indicado para o tratamento de HoFH e formas graves de dislipidemia e fosfolipídios pró- inflamatórios/pró-aterogênicos, incluindo, mas não limitado a E06-scFv para o tratamento de doenças cardiovasculares, incluindo aterosclerose (veja, FIG. 5D);
[0010] e RANKL, incluindo, sem limitação, denosumabe (XGEVAO e PROLIAGO), indicado para o tratamento da osteoporose, aumento da massa óssea em pacientes com câncer de mama e próstata e prevenção de eventos relacionados ao esqueleto devido a metástases ósseas (consulte a FIG. 6);
[0011] e PD-1, ou PD-L1 ou PD-L2 (esses anticorpos às vezes aqui referidos como bloqueadores de PD-1), incluindo, mas não limitado a, nivolumabe (OPDIVOGO) e pembrolizumabe (KEYTRUDAOGO), indicado para o tratamento de melanoma metastático, linfomas e carcinomas pulmonares de células não pequenas (veja, FIGURAS 7 A e 7B);
[0012] e BLyS (estimulador de linfócitos B, também conhecido como fator ativador de células B (BAFF)), incluindo, mas não limitado a belimumabe (BENLYSTAG), indicado para o tratamento de lúpus eritromatoso sistêmico (LES) (veja a FIG. 8E);
[0013] e Alvos oculares, incluindo, sem limitação, VEGF (fator de crescimento — endotelial— vascular), incluindo, sem limitação, ranibizumabe — (LUCENTISO), — bevacizumabe — (AVASTINO) e brolucizumabe indicado para o tratamento da degeneração macular relacionada à idade neovascular (por exemplo, "AMD úmida") (veja, figuras 8 A, 8B e 8D); fator D, incluindo, mas não limitado a lampalizumabe, para o tratamento da DMRI seca (veja, FIG. 8C); e metaloproteinase 9 da matriz (MMP9), incluindo, mas não limitado a andecaliximabe, para o tratamento da DMRI seca (FIG. 8G);
[0014] e TNF-alfa, incluindo, entre outros, adalimumabe (HUMIRAGO) e infliimabe (REMICADEGO) indicados para o tratamento da artrite reumatoide, artrite psoriática, espondilite anquilosante, doença de Crohn, psoríase em placas e colite ulcerativa (FIG. 9A para adalimumabe e FIG 9B para inflixóimabe); e
[0015] e Alvos de proteínas plasmáticas, como proteínas do complemento humano, incluindo, porém não limitados a proteínas do complemento anti-C5 e C5a, como o eculizumabe (SOLIRISO) para o tratamento de pacientes com hemoglobinúria paroxística noturna (PNH)
para reduzir a hemólise ou o tratamento de doenças atípicas síndrome hemolítico-urêmica (aHUS) para inibir a microangiopatia trombótica mediada por complemento (FIG. 8F); e calicreína plasmática, incluindo, mas não limitado a lanadelumabe para o tratamento de angioedema hereditário (veja, FIG 8H);
[0016] ou tais mAbs ou fragmentos de ligação ao antígeno modificados para conter sítios de glicosilação adicionais no domínio Fab (por exemplo, veja Courtois et a/., 2016, mAbs 8: 99-112, que é incorporado por referência aqui em sua íntegra para sua descrição de derivados de anticorpos que são hiperglicosilados no domínio Fab do anticorpo de tamanho natural).
[0017] O vetor recombinante usado para liberar o transgene inclui vetores de vírus adenoassociados recombinantes não replicantes ("rAAV"). No entanto, outros vetores virais podem ser utilizados, incluindo, entre outros, vetores lentivirais; vetores virais da vacínia ou vetores de expressão não viral referidos como construções de "DNA nu". A expressão do transgene pode ser controlada por elementos de controle de expressão constitutivos ou específicos de tecido.
[0018] As construções de terapia genética são projetadas de modo que as cadeias pesada e leve sejam expressas. As sequências de codificação para as cadeias pesada e leve podem ser modificadas em uma única construção na qual as cadeias pesada e leve são separadas por um ligante clivável ou IRES, de modo que os polipeptídeos das cadeias pesada e leve são expressos. Em certas modalidades, as sequências de codificação codificam para um Fab ou F(ab'), ou um scFv. Em outras modalidades, as construções expressam um scFv no qual os domínios variáveis das cadeias pesada e leve são conectados através de um ligante flexível e não clivável. Em certas modalidades, a construção expressa, a partir do terminal N, H>-V.-ligante-V-COOH ou Ha-Vu-ligante-V1-COOH.
[0019] Os anticorpos terapêuticos liberados pela terapia genética têm várias vantagens sobre os anticorpos terapêuticos injetados ou infundidos que se dissipam com o tempo, resultando em níveis de pico e vale. A expressão sustentada do anticorpo do produto transgene, em vez de injetar um anticorpo repetidamente, permite a presença de um nível mais consistente de anticorpo no sítio da ação, além de ser menos arriscada e mais conveniente para os pacientes, uma vez que menos injeções precisam ser feitas. Além disso, os anticorpos expressos de transgenes são pós-traducionais modificados de uma maneira diferente daqueles injetados diretamente devido aos diferentes microambientes presentes durante e após a translação. Sem se ligar a nenhuma teoria em particular, isso resulta em anticorpos com características diferentes de difusão, bioatividade, distribuição, afinidade, farmacocinética e imunogenicidade, de modo que os anticorpos liberados no sítio da ação sejam "biobetters" em comparação com os anticorpos injetados diretamente.
[0020] Além disso, é provável que os anticorpos expressos de transgenes in vivo não contenham produtos de degradação associados a anticorpos produzidos por tecnologias recombinantes, como agregação de proteínas e oxidação de proteínas. A agregação é um problema associado à produção e armazenamento de proteínas devido à alta concentração de proteínas, à interação da superfície com equipamentos e recipientes de fabricação e à purificação com certos sistemas tampão. Essas condições, que promovem agregação, não existem na expressão do transgene na terapia genética. A oxidação, como a oxidação da metionina, triptofano e histidina, também está associada à produção e armazenamento de proteínas, e é causada por condições estressadas de cultura de células, contato com metais e are impurezas nos tampões e excipientes. As proteínas expressas de transgenes in vivo também podem oxidar em uma condição estressada.
No entanto, os indivíduos humanos e muitos outros organismos estão equipados com um sistema de defesa antioxidante, que não apenas reduz o estresse oxidativo, mas também repara e/ou reverte a oxidação. Assim, é provável que as proteínas produzidas in vivo não estejam na forma oxidada. Tanto a agregação quanto a oxidação podem afetar a potência, a farmacocinética (depuração) e a imunogenicidade.
[0021] As composições farmacêuticas adequadas para administração em indivíduos humanos compreendem uma suspensão do vetor recombinante em um tampão de formulação compreendendo um tampão aquoso fisiologicamente compatível, um tensoativo e excipientes opcionais.
[0022] A invenção é baseada, em parte, nos seguintes princípios:
[0023] (i) A terapêutica com mAb atualmente no mercado é dos isótipos de imunoglobulina G (IgG), como IgGl, IgG2 e IgG4, que geralmente têm características farmacocinéticas (PK), como depuração lenta, meia-vida longa e distribuição limitada de tecidos. Após administração intravenosa, os perfis típicos de PK sérica no mAb são bifásicos, com uma fase de distribuição rápida e uma fase de eliminação mais lenta; assim, é necessária uma administração repetida para manter as doses necessárias para tratar condições crônicas. Além disso, a distribuição de mAbs é geralmente limitada aos espaços vasculares e intersticias devido ao seu grande tamanho e hidrofilicidade. A extensão da partição de mAb da circulação na maioria dos tecidos geralmente varia de cerca de 5-15%, exceto no cérebro, onde é muito menor. (Veja, por exemplo, Kamath, 2016, Drug Discovery Today: Technologies 21-22: 75-83, que é incorporado por referência aqui em sua íntegra). A produção contínua de mAbs de HUPTM ou Fab HuPTMSs in situ evita repetidas administrações e permite o uso de Fabs, que de outra forma teriam uma meia-vida sistêmica muito curta para obter eficácia; e os métodos de administração descritos permitem acesso direto aos tecidos alvo, como o cérebro, onde é possível obter doses mais altas a esses tecidos.
[0024] (ii) A região de Fab de vários mAbs terapêuticos possui sítios de glicosilação. Por exemplo, veja as FIGURAS 2A-2F, 3A-3E, 4A-4B, 5A-5D, 6, 7A-7B, 8A-8H e 9A-9B que identificam e destacam em azul e verde, respectivamente, sítios de glicosilação asparaginal de consenso e não consenso ("N"), bem como resíduos de glutamina ("Q") que são sítios de glicosilação na região de Fab de certos mAbs terapêuticos. (Veja, por exemplo, Valliere-Douglass et al., 2009, J. Biol. Chem. 284: 32493-32506 e Valliere-Douglass et al., 2010, J. Biol. Chem. 285: 16012-16022, cada um dos quais é incorporado por referência na sua íntegra para a identificação de sítios de glicosilação ligados a N em anticorpos). Além disso, a O-glicosilação compreende a adição de N- acetil-galactosamina a resíduos de serina ou treonina pela enzima. Foi demonstrado que os resíduos de aminoácidos presentes na região de articulação dos anticorpos podem ser O-glicosilados. A possibilidade de O-glicosilação confere outra vantagem aos anticorpos terapêuticos aqui fornecidos, em comparação, por exemplo, com fragmentos de ligação ao antígeno produzidos em E. coli, novamente porque a E. coli naturalmente não contém máquinas equivalentes às usadas na O- glicosilação humana. (Em vez disso, a O-glicosilação em E. coli foi demonstrada apenas quando a bactéria é modificada para conter máquinas específicas de O-glicosilação. Veja, por exemplo, Farid- Moayer et al., 2007, J. Bacteriol. 189: 8088-8098). Além disso, a sequência de aminoácidos de Fab pode ser modificada para projetar variantes hiperglicosiladas (por exemplo, veja substituições de aminoácidos que podem ser feitas para projetar regiões de Fab hiperglicosiladas de anticorpos terapêuticos mostrados nas FIGURAS 11A e 11B; e Courtois et al., 2016, mAbs 8: 99-112, o qual é incorporado por referência aqui em sua íntegra por sua descrição de derivados de anticorpos que são hiperglicosilados no domínio de Fab do anticorpo de tamanho natural).
[0025] (iii) Além dos sítios de glicosilação, as regiões de Fab podem conter sítios de sulfatação de tirosina ("Y") dentro ou próximo das CDRs; veja FIGURAS 2A-2F, 3A-3E, 4A-4B, 5A-5D, 6, 7A-7B, 8A-8H e 9A-9B que identificam sítios de tirosina-O-sulfatação na região de Fab de certos mAbs terapêuticos, destacados em amarelo. (Veja, por exemplo, Yang et al., 2015, Molecules 20: 2138-2164 (particularmente em 2154), que é incorporado por referência na sua íntegra para a análise de aminoácidos que envolvem resíduos de tirosina sujeitos a sulfatação de proteínas tirosina). As "regras" podem ser resumidas da seguinte forma: Y resíduo com E ou D na posição de +5 a -5 de Y e onde a posição -1 de Y é um aminoácido com carga neutra ou ácida - mas não um aminoácido básico, por exemplo, R, K ou H que abolem a sulfatação.
[0026] (iv) A glicosilação das regiões de Fab, como as mostradas nas FIGURAS 2A-2F, 3A-3E, 4A-4B, 5 A-5D, 6, 7A-7B, 8A-8H e 9A-9B por células humanas resultarão na adição de glicanos que podem melhorar a estabilidade, meia-vida e reduzir agregação indesejada e/ou imunogenicidade do produto transgênico. (Veja, por exemplo, Bovenkamp et al., 2016, J munol. 196: 1435-1441 para uma revisão da importância emergente da glicosilação de Fab; e a FIG. 10, que identifica glicanos que podem ser ligados ao HuGlyFab (adaptado de Bondt et al., 2014, Mol & Cell Proteomics 13.1: 3029-2029). As porções Fab e Fc dos anticorpos demonstraram ter padrões distintos de glicosilação, com os glicanos de Fab elevados em galactosilação, sialilação e bissecção (por exemplo, com GlicNAc em bissecção), mas baixos em fucosilação em relação aos glicanos de Fc. (Por exemplo, veja Bondt et al., 2014, Mol. & Cell. Proteomics 13.11: 3029-3039, incorporado por referência aqui em sua íntegra para a sua descrição de N-glicanos associados a Fab).
[0027] (v) Significativamente, glicanos que são adicionados a HuGlyFab da invenção são N-glicanos do tipo complexo altamente processados que contêm ácido 2,6-siálico. Tais glicanos não estão presentes em (a) mAbs terapêuticos produzidos em E. coli (que não são de todo glicosilados); (b) em anticorpos terapêuticos produzidos em células de CHO que não possuem a 2,6-sialiltransferase necessária para adicionar ácido 2,6-siálico durante a glicosilação; ou (c) em anticorpos terapêuticos produzidos em linhagens celulares de CHO ou murinas que adicionam ácido N-glicolinheuramínico ("Neu5Gc" ou "NeuGc") que não é natural para humanos (e potencialmente imunogênico), em vez de ácido N-acetilneuramínico ("NeuSAc "), o ácido siálico humano predominante. Veja, por exemplo, Dumont et al., 2015, Crit. Rev. Biotechnol. 36 (6): 1110-1122; Huang et al., 2006, Anal. Biochem. 349: 197-207 (NeuGc é o ácido siálico predominante em linhagens celulares de murino, como SP2/0 e NSO); e Song et al., 2014, Anal. Chem. 86: 5661-5666, cada um dos quais é incorporado por referência aqui em sua íntegra.
[0028] (vi) O padrão de glicosilação humana do HuGlyFab da invenção deve reduzir a imunogenicidade do produto transgene e melhorar a eficácia. Importante, quando os fragmentos de ligação ao antígeno, usados de acordo com os métodos aqui descritos, são expressos em células alvo humanas, a necessidade de produção in vitro em células hospedeiras procarióticas (por exemplo, E. coli) ou células hospedeiras eucarióticas (por exemplo, células de CHO ou células NSO ou SP2/0 de murino) é contornada. Em vez disso, como resultado dos métodos aqui descritos (por exemplo, uso de células alvo humanas para expressar os fragmentos de ligação ao antígeno), os sítios de N- glicosilação dos fragmentos de ligação ao antígeno são vantajosamente decorados com glicanos relevantes e benéficos para o tratamento de seres humanos. Essa vantagem é inatingível quando células de CHO,
células de murino ou E. coli são utilizadas na produção de fragmentos de ligação a anticorpos/antígenos, porque, por exemplo, (a) as células de CHO não possuem componentes necessários para a adição de certos glicanos (por exemplo, ácido 2,6 siálico e GICNAc bissectivo); (b) células de CHO e células de murino (células NSO e SP2/0) adicionam Neu5Gc como ácido siálico não típico dos indivíduos humanos em vez de Neu5Ac; (c) as células de CHO também podem produzir um glicano imunogênico, o antígeno a-Gal, que reage com os anticorpos anti-a-Gal presentes na maioria dos indivíduos, que em altas concentrações podem desencadear anafilaxia (veja, Bosques, 2010, Nat Biotech). 28: 1153-1156); e (d) E. coli não contém naturalmente componentes necessários para a N-glicosilação.
[0029] (vii) Sulfatação de tirosina de regiões de Fab, tais como as mostradas nas FIGURAS 2A-2F, 3A-3E, 4A-4B, 5A-5D, 6, 7A-7B, 8A- 8H e 9A-9B - um processo pós-translação robusto em muitas células humanas - deve resultar em produtos transgênicos com maior avidez para seus alvos moleculares. De fato, foi demonstrado que a sulfatação de tirosina do Fab de anticorpos aumenta drasticamente a avidez do antígeno e da atividade. (Veja, por exemplo, Loos et al., 2015, PNAS 112: 12675-12680 e Choe et al., 2003, Cell 114: 161-170). Tais modificações pós-traducionais não estão presentes nos anticorpos terapêuticos produzidos em E. coli (um hospedeiro que não possui as enzimas necessárias para a sulfatação da tirosina) e, na melhor das hipóteses, estão sub-representados nos mAbs terapêuticos produzidos nas células de CHO. As células de CHO não são células secretoras e têm capacidade limitada para sulfatação de tirosina pós-translacional. (Veja, por exemplo, Mikkelsen & Ezban, 1991, Biochemistry 30: 1533- 1537, especialmente discussão na p. 1537).
[0030] Pelas razões precedentes, a produção de mAb HuPTM ou Fab HuPTM deve resultar em uma molécula "biobetter" para o tratamento de doenças realizadas por terapia genética - por exemplo, administrando um vetor viral ou outra construção de expressão de DNA que codifica um Fab HUPTM ou de tamanho natural de um mMAb terapêutico para um paciente (indivíduo humano) diagnosticado com uma indicação de doença para esse mAb, para criar um depósito permanente no indivíduo que fornece continuamente o produto de transgene sulfatado, glicosilado e humano, produzido pelas células transduzidas do indivíduo. A construção de cDNA para o mAb HUPTM ou Fab HuUPTM deve incluir um peptídeo sinal que assegure O processamento co e pós-translacional adequado (glicosilação e sulfatação de proteínas) pelas células humanas transduzidas.
[0031] Como alternativa, ou um tratamento adicional à terapia genética, o Fab HuUPTM ou de tamanho natural pode ser produzido em linhagens celulares humanas por tecnologia de DNA recombinante e a glicoproteína pode ser administrada para os pacientes.
[0032] As terapias de combinação que envolvem a liberação do Fab HuPTM ou de tamanho natural ao paciente, acompanhadas pela administração de outros tratamentos disponíveis, são abrangidas pelos métodos da invenção. Os tratamentos adicionais podem ser administrados antes, simultaneamente ou após o tratamento da terapia genética. Tais tratamentos adicionais podem incluir, mas não estão limitados a, coterapia com o mAb terapêutico.
[0033] Também são fornecidos métodos de fabricação dos vetores virais, particularmente os vetores virais com base em AAV. Em modalidades específicas, são fornecidos métodos para produzir AAVs recombinantes compreendendo a cultura de uma célula hospedeira contendo um genoma Aartificia compreendendo um cassete de expressão cis flanqueado por ITRs de AAV, em que o cassete de expressão cis compreende um transgene que codifica um anticorpo terapêutico operacionalmente ligado a elementos de controle de expressão que controlar a expressão do transgene nas células humanas; um cassete de expressão trans sem ITRs de AAV, em que o cassete de expressão trans codifica uma proteína rep e capsídeo de AAV operacionalmente ligada a elementos de controle de expressão que dirigem a expressão das proteínas de rep e capsídeo de AAV na célula hospedeira em cultura e fornecem as proteínas de rep e cap em trans; funções auxiliares de adenovírus suficientes para permitir a replicação e acondicionamento do genoma artificial pelas proteínas do capsídeo do AAV; e recuperação de AAV recombinante encapsidando o genoma artificial da cultura celular.
3.1 MODALIDADES ILUSTRATIVAS Composições de Matéria
[0034] 1. Composição farmacêutica para o tratamento de doença de Alzheimer, enxaquecas, cefaleia em cacho, ou tauopatias incluindo encefalopatia traumática crônica, paralisia supranuclear progressiva, e demência frontotemporal em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, compreendendo um vetor de vírus adenoassociado (AAV) tendo:
[0035] (a) um capsídeo viral que é pelo menos 95% idêntico à sequência de aminoácido de um capsídeo de AAV9 (SEQ ID NO: 79) ou capsídeo AAVrhIO (SEQ ID NO: 80); e
[0036] (b) um genoma artificial compreendendo um cassete de expressão flanqueado por repetições de terminal invertido de AAV (ITRsS), em que o cassete de expressão compreende um transgene codificando um mAb antiamiloide beta, anti-Tau, ou anti-CGRPR, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células do CNS humano;
[0037] em que o referido vetor de AAV é formulado para administração intratecal ao CNS do referido indivíduo.
[0038] 2. Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 1, em que o mAb antiamiloide B é Aducanumabe, Crenezumabe, Gantenerumabe, ou BAN2401 e o mAb anti-Tau é aTAU e o anti- CGRPR é Erenumabe, eptinezumabe, fremanezumabe, ou galcanezumabe.
[0039] 3. Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 1 ou 2, em que o fragmento de ligação ao antígeno é um Fab, um F(ab')2, ou um domínio variável de cadeia única (scFv).
[0040] 4. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 3, em que o fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:2; ou uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4; ou uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 5 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:6; ou uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 53 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:54; uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 55 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:56; ou uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 57 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:58.
[0041] 5. Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 4, em que o transgene compreende uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 101 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 102 codificando a cadeia leve; ou uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 103 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 104 codificando a cadeia leve; ou uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 105 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 106 codificando a cadeia leve; ou uma cadeia pesada com uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 153 e uma cadeia leve com uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 154; uma cadeia pesada com uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 155 e uma cadeia leve com uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 156; ou uma cadeia pesada com uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 157 e uma cadeia leve com uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 158.
[0042] 6. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 4, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um mutante hiperglicosilado.
[0043] 7. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 6, em que o transgene codifica uma sequência sinal no N-terminal da cadeia pesada e a cadeia leve do referido fragmento de ligação ao antígeno que direciona a secreção e modificação pós- translacional nas referidas células do CNS humano.
[0044] 8. Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 7, em que a referida sequência sinal é MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161) ou uma sequência sinal de Tabela 1.
[0045] 9. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 8, em que o capsídeo do AAV é AAV9.
[0046] 10. Composição farmacêutica para o tratamento de dermatite atópica em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, compreendendo um vetor de AAV compreendendo:
[0047] (a) um capsídeo viral que é pelo menos 95% idêntico à sequência de aminoácido de um capsídeo de AAV8 (SEQ ID NO: 78) ou capsídeo de AAV9 (SEQ ID NO: 79); e
[0048] (b) um genoma artificial compreendendo um cassete de expressão flanqueado por ITRs de AAV em que o cassete de expressão compreende um transgene codificando um mAb anti-|L4R ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células de fígado ou células musculares humanas;
[0049] em que o referido vetor de AAV é formulado para administração intravenosa ao fígado ou músculo do referido indivíduo.
[0050] 11. Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 10 em que o mAb anti-IL4R é Dupilumabe.
[0051] 12. Composição farmacêutica de acordo com os parágrafos ou 11, em que o fragmento de ligação ao antígeno é um Fab, um F(ab')2, ou um scFv.
[0052] 13. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 10 a 12, em que o fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:8.
[0053] 14. Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 13, em que o transgene compreende uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 107 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 108 codificando a cadeia leve.
[0054] 15. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 10 a 13, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um mutante hiperglicosilado.
[0055] 16. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 10 a 15, em que o transgene codifica uma sequência sinal no N-terminal da cadeia pesada e a cadeia leve do referido fragmento de ligação ao antígeno que direciona a secreção e modificação pós-translacional nas referidas células de fígado ou células musculares humanas.
[0056] 17. Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 16, em que a referida sequência sinal é selecionada das sequências sinal na Tabela 2 ou 3.
[0057] 18. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 10 a 17, em que o capsídeo do AAV é AAV8.
[0058] 19. Composição farmacêutica para o tratamento de psoríase, artrite psoriática, espondilite ancilosante, ou doença de Crohn em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, compreendendo um vetor de AAV compreendendo:
[0059] (a) um capsídeo viral que é pelo menos 95% idêntico à sequência de aminoácido de um capsídeo de AAV8 (SEQ ID NO: 78) ou um capsídeo de AAV9 (SEQ ID NO: 79); e
[0060] (b) um genoma artificial compreendendo um cassete de expressão flanqueado por ITRs de AAV em que o cassete de expressão compreende um transgene codificando um mAb anti-IL17A ou mAb anti- IL12/1123, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células de fígado ou células musculares humanas;
[0061] em que o referido vetor de AAV é formulado para administração intravenosa ao fígado ou músculo do referido indivíduo.
[0062] 20. Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 19 em que o mMAb anti-lIL17A ou anti-IL12/1123 é Ixequizumabe, Seciquinumabe ou Ustequinumabe.
[0063] 21. Composição farmacêutica de acordo com os parágrafos 19 ou 20, em que o fragmento de ligação ao antígeno é um Fab, um F(ab')2, ou um scFv.
[0064] 22. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 19 a 21, em que o fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de
SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10; ou uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 11 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 12; ou uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14.
[0065] 23. Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 22, em que o transgene compreende uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 109 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 110 codificando a cadeia leve; ou uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 111 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 112 codificando a cadeia leve; ou uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 113 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 114 codificando a cadeia leve.
[0066] 24. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 19 a 22, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um mutante hiperglicosilado.
[0067] 25. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 19 a 24, em que o transgene codifica uma sequência sinal no N-terminal da cadeia pesada e a cadeia leve do referido fragmento de ligação ao antígeno que direciona a secreção e modificação pós-translacional nas referidas células de fígado ou células musculares humanas.
[0068] 26. Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 25, em que a referida sequência sinal é selecionada das sequências sinal na Tabela 2 ou 3.
[0069] 27. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 19 a 26, em que o capsídeo do AAV é AAV8.
[0070] 28. Composição farmacêutica para o tratamento de asma em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, compreendendo um vetor de AAV compreendendo:
[0071] (a) um capsídeo viral que é pelo menos 95% idêntico à sequência de aminoácido de um capsídeo de AAV8 (SEQ ID NO: 78) ou um capsídeo de AAV9 (SEQ ID NO: 79); e
[0072] (b) um genoma artificial compreendendo um cassete de expressão flanqueado por ITRs de AAV em que o cassete de expressão compreende um transgene codificando um mMAb anti-IL-5, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células de fígado ou células musculares humanas;
[0073] em que o referido vetor de AAV é formulado para administração intravenosa ao fígado ou músculo do referido indivíduo.
[0074] 29. Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 28, em que o mAb anti-IL-5 é Mepolizumabe.
[0075] 30. Composição farmacêutica de acordo com os parágrafos 28 ou 29, em que o fragmento de ligação ao antígeno é um Fab, um F(ab')2, ou um scFv.
[0076] 31. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 28 a 30, em que o fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 15 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 16.
[0077] 32. Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 31, em que o transgene compreende uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 115 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 116 codificando a cadeia leve.
[0078] 33. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 28 a 31, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um mutante hiperglicosilado.
[0079] 34. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 28 a 33, em que o transgene codifica uma sequência sinal no N-terminal da cadeia pesada e a cadeia leve do referido fragmento de ligação ao antígeno que direciona a secreção e modificação pós-translacional nas referidas células de fígado ou células musculares humanas.
[0080] 35. Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 34, em que a referida sequência sinal é selecionada das sequências sinal na Tabela 2 ou 3.
[0081] 36. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 28 a 35, em que o capsídeo do AAV é AAV8.
[0082] 37. Composição farmacêutica para o tratamento de esclerose múltipla, colite ulcerativa ou doença de Crohn em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, compreendendo um vetor de AAV compreendendo:
[0083] (a) um capsídeo viral que é pelo menos 95% idêntico à sequência de aminoácido de um capsídeo de AAV8 (SEQ ID NO: 78), um capsídeo de AAV9 (SEQ ID NO: 79), ou um capsídeo AAVrhlO (SEQ ID NO: 80); e
[0084] (b) um genoma artificial compreendendo um cassete de expressão flanqueado por ITRs de AAV em que o cassete de expressão compreende um transgene codificando um mAb anti-integrina, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células de fígado ou células musculares humanas ou células do CNS humano;
[0085] em que o referido vetor de AAV é formulado para administração intravenosa ao fígado ou músculo do referido indivíduo ou para a administração intratecal ao CNS do referido indivíduo.
[0086] 38. Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 37,
em que o mAb anti-integrina é Vedolizumabe ou Natalizumabe.
[0087] 39. Composição farmacêutica de acordo com os parágrafos 37 ou 38, em que o fragmento de ligação ao antígeno é um Fab, um F(ab')2, ou um scFv.
[0088] 40. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 37 a 39, em que o fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 17 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18; ou uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 19 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:20.
[0089] 41. Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 40, em que o transgene compreende uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 117 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 118 codificando a cadeia leve; ou uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 119 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 120 codificando a cadeia leve.
[0090] 42. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 37 a 41, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um mutante hiperglicosilado.
[0091] 43. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 37 a 42, em que o transgene codifica uma sequência sinal no N-terminal da cadeia pesada e a cadeia leve do referido fragmento de ligação ao antígeno que direciona a secreção e modificação pós-translacional nas referidas células de fígado ou células musculares humanas.
[0092] 44. Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 43, em que a referida sequência sinal é selecionada das sequências sinal na Tabela 1, 2 ou3.
[0093] 45. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 37 a 44, em que o capsídeo do AAV é AAVB8.
[0094] 46. Composição farmacêutica para o tratamento de HeFH, HoFH, dislipidemia, doença cardiovascular incluindo doença cardiovascular — aterosclerótica = (ACD), formação de placa aterosclerótica, níveis anormalmente elevados de colesterol não HDL e LDL, estenose aórtica, estenose hepática, ou hipercolesterolemia em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, compreendendo um vetor de AAV compreendendo:
[0095] (a) um capsídeo viral que é pelo menos 95% idêntico à sequência de aminoácido de um capsídeo de AAV8 (SEQ ID NO: 78) ou um capsídeo de AAV9 (SEQ ID NO: 79); e
[0096] (b) um genoma artificial compreendendo um cassete de expressão flanqueado por ITRs de AAV em que o cassete de expressão compreende um transgene codificando um anti-PCSK9, anti-ANGPTL3, ou anti-OxPL mAb, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células do fígado humano ou células musculares humanas;
[0097] em que o referido vetor de AAV é formulado para administração intravenosa ao fígado ou músculo do referido indivíduo.
[0098] 47. Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 46, em que o mAb anti-PCSK9 ou anticANGPTL3 é Alirocumabe, Evolocumabe ou Evinacumabe ou o anti-OxPL é E06.
[0099] 48. Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 46 ou 47, em que o fragmento de ligação ao antígeno é um Fab, um F(ab')2, ou um scFv.
[00100] 49. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 46 a 48, em que o fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de
SEQ ID NO: 21 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 22; ou uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 23 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:24; uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 25 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:26; ou uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 59 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:60.
[00101] 50. Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 49, em que o transgene compreende uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 121 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 122 codificando a cadeia leve; ou uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 123 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 124 codificando a cadeia leve; uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 125 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 126 codificando a cadeia leve; ou uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 159 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 160 codificando a cadeia leve.
[00102] 51. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 44 a 50, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um mutante hiperglicosilado.
[00103] 52. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 44 a 51, em que o transgene codifica uma sequência sinal no N-terminal da cadeia pesada e a cadeia leve do referido fragmento de ligação ao antígeno que direciona a secreção e modificação pós-translacional nas referidas células de fígado ou células musculares humanas.
[00104] 53.Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 52, em que a referida sequência sinal é selecionada das sequências sinal na Tabela 2 ou 3.
[00105] 54. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 44 a 53, em que o capsídeo do AAV é AAVB8.
[00106] 55. Composição farmacêutica para o tratamento de osteoporose em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, compreendendo um vetor de AAV compreendendo:
[00107] (a) um capsídeo viral que é pelo menos 95% idêntico à sequência de aminoácido de um capsídeo de AAV8 (SEQ ID NO: 78) ou capsídeo de AAV9 (SEQ ID NO: 79); e
[00108] (b)um genoma artificial compreendendo um cassete de expressão flanqueado por ITRs de AAV em que o cassete de expressão compreende um transgene codificando um mAb anti-RANKL, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células de fígado ou células musculares humanas;
[00109] em que o referido vetor de AAV é formulado para administração intravenosa ao fígado ou músculo do referido indivíduo.
[00110] 56.Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 55, em que o mAb anti-RANLK é Denosumabe.
[00111] 57. Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 55 ou 56, em que o fragmento de ligação ao antígeno é um Fab, um F(ab')2, ou um scFv.
[00112] 58. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 55 a 57, em que o fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 27 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:28.
[00113] 59.Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 58, em que o transgene compreende uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 127 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 128 codificando a cadeia leve.
[00114] 60. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 55 a 59, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um mutante hiperglicosilado.
[00115] 61. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 55 a 60, em que o transgene codifica uma sequência sinal no N-terminal da cadeia pesada e a cadeia leve do referido fragmento de ligação ao antígeno que direciona a secreção e modificação pós-translacional nas referidas células de fígado ou células musculares humanas.
[00116] 62.Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 61, em que a referida sequência sinal é selecionada das sequências sinal na Tabela 2 ou 3.
[00117] 63. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 55 a 62, em que o capsídeo do AAV é AAV8.
[00118] 64. Composição farmacêutica para o tratamento de melanoma metastático, linfoma ou carcinoma de pulmão de célula não pequena em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, compreendendo um vetor de AAV compreendendo:
[00119] (a)um capsídeo viral que é pelo menos 95% idêntico à sequência de aminoácido de um capsídeo de AAV8 (SEQ ID NO: 78) ou capsídeo de AAV9 (SEQ ID NO: 79); e
[00120] (b) um genoma artificia compreendendo um cassete de expressão flanqueado por ITRs de AAV em que o cassete de expressão compreende um transgene codificando um mAb bloqueador de PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células de fígado ou células musculares humanas;
[00121] em que o referido vetor de AAV é formulado para administração intravenosa ao fígado ou músculo do referido indivíduo.
[00122] 65.Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 64, em que o mAb bloqueador de PD-1 é Nivolumabe ou Pembrolizumabe.
[00123] 66. Composição farmacêutica de acordo com os parágrafos 64 ou 65, em que o fragmento de ligação ao antígeno é um Fab, um F(ab')2, ou um scFv.
[00124] 67. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 64 a 66, em que o fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 29 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 30; ou uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 31 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 32.
[00125] 68.Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 67, em que o transgene compreende uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 129 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 130 codificando a cadeia leve; ou uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 131 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 132 codificando a cadeia leve.
[00126] 69. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 64 a 68, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um mutante hiperglicosilado.
[00127] 70. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 64 a 69, em que o transgene codifica uma sequência sinal no N-terminal da cadeia pesada e a cadeia leve do referido fragmento de ligação ao antígeno que direciona a secreção e modificação pós-translacional nas referidas células de fígado ou células musculares humanas.
[00128] 71.Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 70,
em que a referida sequência sinal é selecionada das sequências sinal na Tabela 2 ou 3.
[00129] 72. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 64 a 71, em que o capsídeo do AAV é AAVB8.
[00130] 73. Composição farmacêutica para o tratamento de lúpus eritematoso sistêmico (SLE) em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, compreendendo um vetor de AAV compreendendo:
[00131] (a) um capsídeo viral que é pelo menos 95% idêntico à sequência de aminoácido de um capsídeo de AAV8 (SEQ ID NO: 78) ou um capsídeo de AAV9 (SEQ ID NO: 79); e
[00132] (b)um genoma artificia compreendendo um cassete de expressão flanqueado por ITRs de AAV em que o cassete de expressão compreende um transgene codificando um mMAb anti-BLyS, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células de fígado ou células musculares humanas;
[00133] em que o referido vetor de AAV é formulado para administração intravenosa ao fígado ou músculo do referido indivíduo.
[00134] 74.Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 73, em que o mAb anti-BLyS é Belimumabe.
[00135] 75.Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 73 ou 74, em que o fragmento de ligação ao antígeno é um Fab, um F(ab')2, ou um scFv.
[00136] 76. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 73 a 75, em que o fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 41 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:42.
[00137] 77.Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 76, em que o transgene compreende uma sequência de nucleotídeo de
SEQ ID NO: 141 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 142 codificando a cadeia leve.
[00138] 78. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 73 a 77, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um mutante hiperglicosilado.
[00139] 79. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 73 a 78, em que o transgene codifica uma sequência sinal no N-terminal da cadeia pesada e a cadeia leve do referido fragmento de ligação ao antígeno que direciona a secreção e modificação pós-translacional nas referidas células de fígado ou células musculares humanas.
[00140] 80. Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 79, em que a referida sequência sinal é selecionada das sequências sinal na Tabela 2 ou 3.
[00141] 81. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 73 a 80, em que o capsídeo do AAV é AAVB8.
[00142] 82. Composição farmacêutica para o tratamento de distúrbios oculares, incluindo degeneração macular relacionada com a idade, em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, compreendendo um vetor de AAV compreendendo:
[00143] (a) um capsídeo viral que é pelo menos 95% idêntico à sequência de aminoácido de um capsídeo de AAV8 (SEQ ID NO: 78) ou capsídeo de AAV9 (SEQ ID NO: 79); e
[00144] (b) um genoma artificia compreendendo um cassete de expressão flanqueado por ITRs de AAV em que o cassete de expressão compreende um transgene codificando um anti-MMP9, anti-VEGF ou anti-fD mAb, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células retinais humanas;
[00145] em que o referido vetor de AAV é formulado para administração sub-retinal, intravítrea ou supracoroidal ao olho do referido indivíduo.
[00146] 83.Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 82, em que o anti-VEGF mAb é Ranibizumabe, Bevacizumabe, ou Brolucizumabe, said anti-Fd mAb é Lampalizumabe ou said anti-MMP9 mAb é Andecaliximabe.
[00147] 84. Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 82 ou 83, em que o fragmento de ligação ao antígeno é um Fab, um F(ab')2, ou um scFv.
[00148] 85. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 82 a 84, em que o fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 33 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:34, ou uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 35 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:36; ou uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 37 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:38; ou uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 39 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 40; ou uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 45 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:46.
[00149] 86.Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 85, em que o transgene compreende uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 133 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 134 codificando a cadeia leve; ou uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 135 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 136 codificando a cadeia leve; ou uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID
NO: 137 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 138 codificando a cadeia leve; ou uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 139 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 140 codificando a cadeia leve; ou uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 145 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 146 codificando a cadeia leve.
[00150] 87. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 82 a 85, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um mutante hiperglicosilado.
[00151] 88. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 82 a 87, em que o transgene codifica uma sequência sinal no N-terminal da cadeia pesada e a cadeia leve do referido fragmento de ligação ao antígeno que direciona a secreção e modificação pós-translacional nas referidas células retinais humanas.
[00152] 89. Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 88, em que a referida sequência sinal é selecionada das sequências sinal na Tabela 1.
[00153] 90. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 82 a 89, em que o capsídeo do AAV é AAV8.
[00154] 91. Composição farmacêutica para o tratamento de artrite reumatoide, artrite psoriática, espondilite ancilosante, doença de Crohn, psoríase em placas, ou colite ulcerativa, em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, compreendendo um vetor de AAV compreendendo:
[00155] (a) um capsídeo viral que é pelo menos 95% idêntico à sequência de aminoácido de um capsídeo de AAV8 (SEQ ID NO: 78) ou capsídeo de AAV9 (SEQ ID NO:79); e
[00156] (b)um genoma artificia compreendendo um cassete de expressão flanqueado por ITRs de AAV em que o cassete de expressão compreende um transgene codificando um anticorpo anti-TNF, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células de fígado ou células musculares humanas;
[00157] em que o referido vetor de AAV é formulado para administração intravenosa ao referido indivíduo.
[00158] 92.Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 91, em que o mAb anti-TNF-alfa é Adalimumabe ou Infliximabe.
[00159] —93.Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 91 ou 92, em que o fragmento de ligação ao antígeno é um Fab, um F(ab')2, ou um scFv.
[00160] 94. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 91 a 93, em que o fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 49 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50; ou uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 51 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52.
[00161] 95.Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 94, em que o transgene compreende uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 149 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 150 codificando a cadeia leve; ou uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 151 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 152 codificando a cadeia leve.
[00162] 96. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 91 a 94, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um mutante hiperglicosilado.
[00163] 97. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 91 a 96, em que o transgene codifica uma sequência sinal no N-terminal da cadeia pesada e a cadeia leve do referido fragmento de ligação ao antígeno que direciona a secreção e modificação pós-translacional nas referidas células de fígado ou células musculares humanas.
[00164] 98.Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 97, em que a referida sequência sinal é selecionada das sequências sinal na Tabela 2 ou 3.
[00165] 99. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 91 a 98, em que o capsídeo do AAV é AAV8.
[00166] 100. Composição farmacêutica para o tratamento de hemoglobinúria noturna paroxismal (PNH) ou síndrome urêmica hemolítica atípica (aHUS), em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, compreendendo um vetor de AAV compreendendo:
[00167] (a)um capsídeo viral que é pelo menos 95% idêntico à sequência de aminoácido de um capsídeo de AAV8 (SEQ ID NO: 78) ou capsídeo de AAV9 (SEQ ID NO: 79); e
[00168] (b)um genoma artificia compreendendo um cassete de expressão flanqueado por ITRs de AAV em que o cassete de expressão compreende um transgene codificando um anticC5 ou C5a complemento protein mAb, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células de fígado humano;
[00169] em que o referido vetor de AAV é formulado para administração intravenosa ao referido indivíduo.
[00170] 101. Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 100, em que o mAb de proteína complemento anti-C5 ou C5a é Eculizumabe.
[00171] 102. Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 100 ou 101, em que o fragmento de ligação ao antígeno é um Fab, um F(ab')2, ou um scFv.
[00172] 103. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 100 a 102, em que o fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 43 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 44.
[00173] 104. Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 103, em que o transgene compreende uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 143 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 144 codificando a cadeia leve.
[00174] 105. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 101 a 104, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um mutante hiperglicosilado.
[00175] 106. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 100 a 105, em que o transgene codifica uma sequência sinal no N-terminal da cadeia pesada e a cadeia leve do referido fragmento de ligação ao antígeno que direciona a secreção e modificação pós-translacional nas referidas células de fígado humano.
[00176] 107. Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 106, em que a referida sequência sinal é selecionada das sequências sinal na Tabela 3.
[00177] 108. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 101 a 107, em que o capsídeo do AAV é AAV8
[00178] 109. Composição farmacêutica para o tratamento de angioedema, em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, compreendendo um vetor de AAV compreendendo:
[00179] (a) um capsídeo viral que é pelo menos 95% idêntico à sequência de aminoácido de um capsídeo de AAV8 (SEQ ID NO: 78) ou capsídeo de AAV9 (SEQ ID NO: 79); e
[00180] (b)um genoma artificia compreendendo um cassete de expressão flanqueado por ITRs de AAV em que o cassete de expressão compreende um transgene codificando um mAb de calicreína antiplasma, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células de fígado ou células musculares humanas;
[00181] em que o referido vetor de AAV é formulado para administração intravenosa ao referido indivíduo.
[00182] 110. Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 109, em que o mAb de calicreína antiplasma é Lanadelumabe.
[00183] 111. Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 109 ou 111, em que o fragmento de ligação ao antígeno é um Fab, um F(ab')2, ou um scFv.
[00184] 112. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 109 a 111, em que o fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 47 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 48.
[00185] 113. Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 112, em que o transgene compreende uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 147 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 148 codificando a cadeia leve.
[00186] 114. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 110 a 113, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um mutante hiperglicosilado.
[00187] 115. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 109 a 114, em que o transgene codifica uma sequência sinal no N-terminal da cadeia pesada e a cadeia leve do referido fragmento de ligação ao antígeno que direciona a secreção e modificação pós-translacional nas referidas células de fígado humano.
[00188] 116. Composição farmacêutica de acordo com o parágrafo
115, em que a referida sequência sinal é selecionada das sequências sinal na Tabela 3.
[00189] 117. Composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 110 a 116, em que o capsídeo do AAV é AAV8.
[00190] Método de Tratamento
[00191] 118. Método de tratamento de doença de Alzheimer, enxaquecas, cefaleia em cacho, ou tauopatias incluindo encefalopatia traumática crônica, paralisia supranuclear progressiva, e demência frontotemporal em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, compreendendo liberar para o fluido cérebro-espinhal (CSF) do referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um mAb anti-amiloide beta, anti-Tau, ou anti-cCGRPR ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, produzido por células do sistema nervoso central humano (CNS).
[00192] 119. Método de tratamento de doença de Alzheimer, enxaquecas, cefaleia em cacho, ou tauopatias incluindo encefalopatia traumática crônica, paralisia supranuclear progressiva, e demência frontotemporal em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, compreendendo administrar à cisterna magna do referido indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante compreendendo um transgene codificando um mAb anti-amiloide beta, anti-Tau, ou anti-CGRPR, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células do CNS humano, de modo que seja formado um depósito que libere uma forma pós-translacionalmente modificada humana (HUPTM) do referido mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00193] 120. Método de acordo com os parágrafos 118 ou 119 em que o mAb anti-amiloide beta é Aducanumabe, Crenezumabe, Gantenerumabe, ou BAN2401 ou de que o mAb anti-Tau é aTAU ou de que o anti-cCGRPR é Erenumabe, eptinezumabe, fremanezumabe, ou galcanezumabe.
[00194] 121.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 118 a 120 em que o fragmento de ligação ao antígeno é um Fab, um F(ab')2, ou um scFv.
[00195] 122. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 118 a 121, em que o fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:2; ou uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:4; ou uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 5 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:6; ou uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 53 e uma cadeia leve com uma sequência de ácido de SEQ ID NO:54; uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 55 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:56; ou uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 57 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:58.
[00196] 123. Método de acordo com o parágrafo 122, em que o transgene compreende uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 101 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 102 codificando a cadeia leve; ou uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 103 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 104 codificando a cadeia leve; ou uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 105 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 106 codificando a cadeia leve; ou uma cadeia pesada com uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 153 e uma cadeia leve com uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 154; uma cadeia pesada com uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 155 e uma cadeia leve com uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 156 ou uma cadeia pesada com uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 157 e uma cadeia leve com uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:158.
[00197] 124 .Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 118 a 122, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um mutante hiperglicosilado.
[00198] 125.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 118 a 124, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo contém um glicano alfa 2,6-sialilado.
[00199] 126.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 118 a 125, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é glicosilado porém não contém NeuGc e / ou a-Gal detectável.
[00200] 127. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 118 a 126, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo contém uma sulfação de tirosina.
[00201] 128. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 119 a 127, em que o vetor de expressão recombinante é AAV9 ou AAVrhIO.
[00202] 129. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 119 a 128, em que a produção da referida forma HuUPTM do referido mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é confirmada transduzindo células do CNS humano em cultura com o referido vetor de expressão de nucleotídeo recombinante e expressando o referido mMAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00203] 130. Método de tratamento de psoríase, artrite psoriática, espondilite ancilosante, ou doença de Crohn em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, compreendendo liberar para a circulação do referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um mAb anti-IL17A ou anti-IL12/I1123 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, produzida por células de fígado ou células musculares humanas.
[00204] 131. Método de tratamento de psoríase, artrite psoriática, espondilite ancilosante, ou doença de Crohn em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao fígado ou músculo do referido indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotíideo recombinante compreendendo um transgene codificando um mAb anti-IL17A ou anti- IL12/1123, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células de fígado ou células musculares humanas, de modo que seja formado um depósito que libere uma forma HuPTM do referido mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00205] 132. Método de acordo com o parágrafo 130 ou 131, em que o MAb anti-IL17A ou anti-IL12/1123 é IXequizumabe, Seciquinumabe, ou Ustequinumabe.
[00206] 133.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 130 a 132, em que o fragmento de ligação ao antígeno é um Fab, um F(ab')2, ou um scFv.
[00207] 134. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 130 a 133, em que o fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10; ou uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 11 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 12; ou uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14.
[00208] 135. Método de acordo com o parágrafo 134, em que o transgene compreende uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 109 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 110 codificando a cadeia leve; ou uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 111 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 112 codificando a cadeia leve; ou uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 113 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 114 codificando a cadeia leve.
[00209] 136.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 132 a 134, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um mutante hiperglicosilado.
[00210] 137. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 132 a 136, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo contém um glicano alfa 2,6-sialilado.
[00211] 138. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 132 a 137, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é glicosilado porém não contém NeuGc ou a-Gal detectável.
[00212] 139. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 132 a 138, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo contém uma sulfação de tirosina.
[00213] 140. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 133 a 139, em que o vetor de expressão recombinante é AAV8 ou AAV9.
[00214] 141. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 133 a 140, em que a produção da referida forma HUPTM do mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é confirmada transduzindo células de fígado ou células musculares humanas em cultura com o referido vetor de expressão de nucleotídeo recombinante e expressando o referido mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00215] 142. Método de tratamento de esclerose múltipla, colite ulcerativa ou doença de Crohn em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, compreendendo liberar para o CSF ou circulação do referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um mAb anti-integrina ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, produzida por células do CNS humano, células de fígado ou células musculares humanas.
[00216] 143. Método de tratamento de esclerose múltipla, colite ulcerativa ou doença de Crohn em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao CNS, fígado ou músculo do referido indivíduo humano uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante compreendendo um transgene codificando um mAb anti- integrina, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células do CNS humano, células de fígado humano ou em células de músculo humano, de modo que seja formado um depósito que libere uma forma HuPTM do referido mMAb ou fragmento de ligação ao antígeno.
[00217] 144. Método de acordo com os parágrafos 142 ou 143 em que o mAb anti-integrina é Natalizumabe ou Vedolizumabe.
[00218] 145. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 142 a 144 em que o fragmento de ligação ao antígeno é um Fab, um F(ab')2, ou um scFv.
[00219] 146. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 142 a 145, em que o fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 17 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18; ou uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 19 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:20.
[00220] 147. Método de acordo com o parágrafo 146, em que o transgene compreende uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 117 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 118 codificando a cadeia leve; ou uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 119 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 120 codificando a cadeia leve.
[00221] 148. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 142 a 145, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um mutante hiperglicosilado.
[00222] 149. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 142 a 148, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo contém um glicano alfa 2,6-sialilado.
[00223] 150. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 142 a 149, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é glicosilado porém não contém NeuGc ou a-Gal detectável.
[00224] 151.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 142 a 150, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo contém uma sulfação de tirosina.
[00225] 152. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 143 a 151, em que o vetor de expressão recombinante é AAV8, AAV9, ou AAVrhIO.
[00226] 153.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 143 a 152 em que a produção da forma HUPTM do mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é confirmada transduzindo células do CNS humano, células de fígado ou células musculares humanas em cultura com o referido vetor de expressão de nucleotídeo recombinante e expressando o referido mMAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00227] 154. Método de tratamento de dermatite atópica em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, compreendendo liberar para a circulação do referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anti-|L4R mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, produzida por células de fígado ou células musculares humanas.
[00228] 155. Método de tratamento de dermatite atópica em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, administering para o fígado ou músculo do referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante compreendendo um transgene codificando um mAb anti- IL4R ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células de fígado ou células musculares humanas, de modo que seja formado um depósito que libere uma forma HuPTM do referido mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00229] 156.Método de acordo com o parágrafo 154 ou 155, em que o mAb anti-IL-4R é Dupilumabe.
[00230] 157. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 154 a 156, em que o fragmento de ligação ao antígeno é um Fab, um F(ab')2, ou um scFv.
[00231] 158. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 154 a 157, em que o fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 8.
[00232] 159. Método de acordo com o parágrafo 158, em que o transgene compreende uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 107 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 108 codificando a cadeia leve.
[00233] 160. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 154 a 158, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um mutante hiperglicosilado.
[00234] 161.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 154 a 160, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo contém um glicano alfa 2,6-sialilado.
[00235] 162. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 154 a 161, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é glicosilado porém não contém NeuGc ou a-Gal detectável.
[00236] 163.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 154 a 162, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo contém uma sulfação de tirosina.
[00237] 164. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 155 a 163, em que o vetor de expressão recombinante é AAV8 ou AAV9.
[00238] 165. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 155 a 164, em que a produção da forma HuPTM do referido mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é confirmada transduzindo células de fígado ou células musculares humanas em cultura com o referido vetor de expressão de nucleotídeo recombinante e expressando o referido mMAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00239] 166. Método de tratamento de asma em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, compreendendo liberar para a circulação do referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um mAb anti-IL-5, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, produzida por células de fígado ou células musculares humanas.
[00240] 167. Método de tratamento de asma em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao fígado ou músculo do referido indivíduo humano uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante compreendendo um transgene codificando um mAb anti-
I.--5, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células de fígado ou células musculares humanas, de modo que seja formado um depósito que libere uma forma HUPTM do referido mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00241] 168. Método de acordo com o parágrafo 166 ou 167, em que o mAb anti-IL-5 é Mepolizumabe.
[00242] 169. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 166 a 168, em que o fragmento de ligação ao antígeno é um Fab, um F(ab')2, ou um scFv.
[00243] 170. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 166 a 169, em que o fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 15 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 16.
[00244] 171. Método de acordo com o parágrafo 170, em que o transgene compreende uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 115 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 116 codificando a cadeia leve.
[00245] 172. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 166 a 170, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um mutante hiperglicosilado.
[00246] 173.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 166 a 172, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo contém um glicano alfa 2,6-sialilado.
[00247] 174. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 166 a 173, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é glicosilado porém não contém NeuGc ou a-Gal detectável.
[00248] 175.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 166 a 174, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo contém uma sulfação de tirosina.
[00249] —176.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 167 a 175, em que o vetor de expressão recombinante é AAV8 ou AAV9.
[00250] 177. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 167 a 176, em que a produção da referida forma HuUPTM do referido mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é confirmada transduzindo células de fígado ou células musculares humanas em cultura com o referido vetor de expressão de nucleotídeo recombinante e expressando o referido mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00251] 178. Método de tratamento de HeFH, HoFH, dislipidemia, doença cardiovascular incluindo doença cardiovascular aterosclerótica (ACD), formação de placa aterosclerótica, níveis anormalmente elevados de colesterol não HDL e LDL, estenose aórtica, estenose hepática, ou hipercolesterolemia dislipidemia em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, compreendendo liberar para a circulação do referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um mAb anti-PCSK9, anti-ANGPTL3, anti-OxPL ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, produzida por células de fígado ou células musculares humanas.
[00252] 179. Método de tratamento de HeFH, HoFH, dislipidemia, doença cardiovascular incluindo doença cardiovascular aterosclerótica (ACD), formação de placa aterosclerótica, níveis anormalmente elevados de colesterol não HDL e LDL, estenose aórtica, estenose hepática, ou hipercolesterolemia em um indivíduo humano em necessidade do mesma, compreendendo administrar ao fígado ou músculo do referido indivíduo humano uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante compreendendo um transgene codificando um mAb anti- PCSK9, anti-OxPL, ou antic-ANGPTL3, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células de fígado ou células musculares humanas, de modo que seja formado um depósito que libere uma forma HUPTM do mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00253] 180. Método de acordo com o parágrafo 178 ou 179, em que o anti-PCSK9 é Alirocumabe ou Evolocumabe, ou o antic-ANGPTL3 mAb é Evinacumabe ou o anti-OxPL é E0O6.
[00254] 181. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 178 a 180 em que o fragmento de ligação ao antígeno é um Fab, um F(ab')2, ou um scFv.
[00255] 182. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 178 a 181, em que o fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 21 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:22; ou uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 23 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 24; uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 25 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:26; ou uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 59 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 60.
[00256] 183. Método de acordo com a reivindicação 182, em que o transgene compreende uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 121 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 122 codificando a cadeia leve; ou uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 123 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 124 codificando a cadeia leve; uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 125 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 126 codificando a cadeia leve; ou uma cadeia pesada com uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 159 e uma cadeia leve com uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 160.
[00257] 184. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 178 a 182, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um mutante hiperglicosilado.
[00258] 185. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 178 a 184, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo contém um glicano alfa 2,6-sialilado.
[00259] 186. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 178 a 185, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é glicosilado porém não contém NeuGc ou a-Gal detectável.
[00260] 187. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 178 a 186, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo contém uma sulfação de tirosina.
[00261] 188. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 179 a 187, em que o vetor de expressão recombinante é AAV8 ou AAV9.
[00262] 189. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 179 a 188, em que a produção da referida forma HUPTM do mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é confirmada transduzindo células de fígado ou células musculares humanas em cultura com o referido vetor de expressão de nucleotídeo recombinante e expressando o referido mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00263] 190. Método de tratamento de osteoporose, aumentando a massa óssea em pacientes com câncer de mama ou da próstata, ou prevenindo eventos relacionados ao esqueleto devido à metástase óssea em um indivíduo humano em necessidade do mesma, compreendendo liberar para a circulação do referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um mAb anti-RANKL, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, produzida por células de fígado ou células musculares humanas.
[00264] 191. Método de tratamento de osteoporose, aumentando a massa óssea em pacientes com câncer de mama ou da próstata, ou prevenindo eventos relacionados ao esqueleto devido à metástase óssea em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao fígado ou músculo do referido indivíduo humano uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante compreendendo um transgene codificando um mMAb anti-RANKL, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células de fígado ou células musculares humanas, de modo que seja formado um depósito que libere uma forma HUPTM do mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00265] 192. Método de acordo com o parágrafo 190 ou 191, em que o mAb anti-RANKL é Denosumabe.
[00266] 193.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 190 a 192, em que o fragmento de ligação ao antígeno é um Fab, um F(ab')2, ou um scFv.
[00267] 194. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 190 a 193, em que o fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 27 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 28.
[00268] 195. Método de acordo com o parágrafo 194, em que o transgene compreende uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 128 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 127 codificando a cadeia leve.
[00269] 196.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 190 a 194, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um mutante hiperglicosilado.
[00270] 197.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 190 a 196, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo contém um glicano alfa 2,6-sialilado.
[00271] 198. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 190 a 197, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é glicosilado porém não contém NeuGc ou a-Gal detectável.
[00272] 199. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 190 a 198, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo contém uma sulfação de tirosina.
[00273] 200. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 191 a 199, em que o vetor de expressão recombinante é AAV8 ou AAV9.
[00274] — 201. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 191 a 200, em que a produção da referida forma HuUPTM do referido mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é confirmada transduzindo células de fígado ou células musculares humanas em cultura com o referido vetor de expressão de nucleotídeo recombinante e expressando o referido mMAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00275] 202. Método de tratamento de melanoma metastático, linfoma, carcinoma de pulmão de célula não pequena, câncer de célula escamosa de cabeça e pescoço, carcinoma urotelial, câncer de alta instabilidade de microssalélite, câncer gástrico, carcinoma de célula renal, câncer de cólon metastático por déficit de reparo de pareamento incorreto, ou carcinoma hepatocelular em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, compreendendo liberar para a circulação do referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um mAb bloqueador de PD-1, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, produzida por células de fígado ou células musculares humanas.
[00276] 203. Método de tratamento de melanoma metastático, linfoma, carcinoma de pulmão de célula não pequena, câncer de célula escamosa de cabeça e pescoço, carcinoma urotelial, câncer de alta instabilidade de microssalélite, câncer gástrico, carcinoma de célula renal, câncer de cólon metastático por déficit de reparo de pareamento incorreto, ou carcinoma hepatocelular em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao fígado ou músculo do referido indivíduo humano uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante compreendendo um transgene codificando um mAb bloqueador de PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células de fígado ou células musculares humanas, de modo que seja formado um depósito que libere uma forma HuPTM do referido mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00277] 204. Método de acordo com o parágrafo 202 ou 203, em que o mAb bloqueador de PD-1 é Nivolumabe ou Pembrolizumabe.
[00278] 205.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 202 a 204, em que o fragmento de ligação ao antígeno é um Fab, um F(ab')2, ou um scFv.
[00279] —206.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 202 a 205, em que o fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 29 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:30; ou uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 31 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO 32:
[00280] 207. Método de acordo com o parágrafo 206, em que o transgene compreende uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:
129 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 130 codificando a cadeia leve; ou uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 131 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 132 codificando a cadeia leve.
[00281] 208.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 202 a 206, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um mutante hiperglicosilado.
[00282] 209. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 202 a 208, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo contém um glicano alfa 2,6-sialilado.
[00283] 210.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 202 a 209, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é glicosilado porém não contém NeuGc ou a-Gal detectável.
[00284] 211.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 202 a 210, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo contém uma sulfação de tirosina.
[00285] 212.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 203 a 211, em que o vetor de expressão recombinante é AAV8 ou AAV9.
[00286] 213.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 203 a 212, em que a produção da referida forma HuUPTM do referido mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é confirmada transduzindo células de fígado ou células musculares humanas em cultura com o referido vetor de expressão de nucleotídeo recombinante e expressando o referido mMAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00287] 214. Método de tratamento de lúpus eritematoso sistêmico (SLE) em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, compreendendo liberar para a circulação do referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um mAb anti-BLyS ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, produzida por células de fígado ou células musculares humanas.
[00288] 215.Método de tratamento de SLE em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao fígado ou músculo do referido indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotíideo recombinante compreendendo um transgene codificando um mAb anti-BLyS, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células de fígado humano ou em células de músculo humano, de modo que seja formado um depósito que libere uma forma HuPTM do referido mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00289] 216.Método de acordo com o parágrafo 214 ou 215, em que o mMAb anti-BLyS é Belimumabe.
[00290] 217.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 214 a 216, em que o fragmento de ligação ao antígeno é um Fab, um F(ab')2, ou um scFv.
[00291] 218. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 214 a 217, em que o fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQID NO: 41 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:42.
[00292] 219. Método de acordo com o parágrafo 218, em que o transgene compreende uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 139 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 142 codificando a cadeia leve.
[00293] 220. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 214 a 218, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um mutante hiperglicosilado.
[00294] 221.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 214 a 220, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo contém um glicano alfa 2,6-sialilado.
[00295] 222.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 214 a 221, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é glicosilado porém não contém NeuGc ou a-Gal detectável.
[00296] 223.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 214 a 222, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo contém uma sulfação de tirosina.
[00297] 224. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 215 a 223, em que o vetor de expressão recombinante é AAV8 ou AAV9.
[00298] 225.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 215 a 224, em que a produção da referida forma HuUPTM do referido mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é confirmada transduzindo células de fígado ou células musculares humanas em cultura com o referido vetor de expressão de nucleotídeo recombinante e expressando o referido mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00299] 226. Método de tratamento de um distúrbio ocular, incluindo neovascular degeneração macular relacionada com a idade (nAMD), AMD seca, retinopatia diabética, edema macular diabético (DME), central oclusão de veia retinal (RVO), miopia patológica, ou vasculopatia coroidal polipoidal, em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, compreendendo liberar para a retina do referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um mAb anti- MMPS9, anti-VEGF ou anti-fD, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, produzida por células da retina humana.
[00300] 227. Método de tratamento de um distúrbio ocular, incluindo nAMD, AMD seca, retinopatia diabética, DME, RVO, miopia patológica, ou vasculopatia coroidal polipoidal, em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, compreendendo administrar sub-retinalmente, intravitreamente ou supracoroidalmente ao referido indivíduo humano,
uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante compreendendo um transgene codificando um mAb anti-MMPS9, anti-VEGF ou anti-fD, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células retinais humanas, de modo que seja formado um depósito que libere uma forma HuPTM do referido mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00301] 228.Método de acordo com o parágrafo 226 ou 227, em que o mAb anti-MMP9, anti-VEGF ou antifD é Andecaliximabe, Ranibizumabe, Bevacizumabe, Brolucizumabe, ou Lampalizumabe.
[00302] 229. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 226 a 228 em que o fragmento de ligação ao antígeno é um Fab, um F(ab')2, ou um scFv.
[00303] 230.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 226 a 229, em que o fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 33 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 34; ou uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 35 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 36; ou uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 37 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:38; ou uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 39 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 40; ou uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 45 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 46.
[00304] 231. Método de acordo com o parágrafo 230, em que o transgene compreende uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 133 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de
SEQ ID NO: 134 codificando a cadeia leve; ou uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 135 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 136 codificando a cadeia leve; ou uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 137 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 138 codificando a cadeia leve; ou uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 139 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 140 codificando a cadeia leve; ou uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 145 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 146 codificando a cadeia leve.
[00305] 232.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 226 a 230, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um mutante hiperglicosilado.
[00306] 233.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 226 a 232, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo contém um glicano alfa 2,6-sialilado.
[00307] 234.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 226 a 233, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é glicosilado porém não contém NeuGc ou a-Gal detectável.
[00308] 235.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 226 a 234, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo contém uma sulfação de tirosina.
[00309] 236.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 227 a 235, em que o vetor de expressão recombinante é AAV8 ou AAV9.
[00310] 237.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 227 a 236, em que a produção da referida forma HuPTM do referido mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é confirmada transduzindo human retinal cells em cultura com o referido vetor de expressão de nucleotídeo recombinante e expressando o referido mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00311] 238. Método de tratamento de fibrose cística (CF), artrite reumatoide (RA), UC, CD, tumores sólidos, adenocarcinoma pancreático, adenocarcinoma de pulmão, carcinoma de célula escamosa pulmonar, adenocarcinoma esofagogástrico, câncer gástrico, câncer colorretal, ou câncer de mama em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, compreendendo liberar para a circulação do referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anti-MMP9 mAb, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, produzida por células de fígado ou células musculares humanas.
[00312] 239. Método de tratamento de fibrose cística (CF), artrite reumatoide (RA), UC, CD, tumores sólidos, adenocarcinoma pancreático, adenocarcinoma de pulmão, carcinoma de célula escamosa pulmonar, adenocarcinoma esofagogástrico, câncer gástrico, câncer colorretal, ou câncer de mama em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao fígado ou músculo do referido indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante compreendendo um transgene codificando um anti-MMP9 mAb, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células de fígado humano ou em células de músculo humano, de modo que seja formado um depósito que libere uma forma HuPTM do referido mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00313] 240. Método de acordo com o parágrafo 238 ou 239, em que o anti-MMP9 mAb é Andecaliximabe.
[00314] 241 .Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 238 a 240, em que o fragmento de ligação ao antígeno é um Fab, um F(ab')2, ou um scFv.
[00315] 242. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 238 a 241, em que o fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 45 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 46.
[00316] 243. Método de acordo com o parágrafo 242, em que o transgene compreende uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 145 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 146 codificando a cadeia leve.
[00317] 244. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 238 a 242, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um mutante hiperglicosilado.
[00318] 245.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 238 a 244, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo contém um glicano alfa 2,6-sialilado.
[00319] 246.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 238 a 245, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é glicosilado porém não contém NeuGc ou a-Gal detectável.
[00320] 247.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 238 a 246, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo contém uma sulfação de tirosina.
[00321] 248.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 239 a 247, em que o vetor de expressão recombinante é AAV8 ou AAV9.
[00322] 249. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 239 a 248 em que a produção da referida forma HuUPTM do referido mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é confirmada transduzindo células de fígado ou células musculares humanas em cultura com o referido vetor de expressão de nucleotídeo recombinante e expressando o referido mMAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00323] 250. Método de tratamento de angioedema hereditário em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, compreendendo liberar para a circulação do referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um mAb anti-calicreína, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, produzida por células de fígado ou células musculares humanas.
[00324] 251. Método de tratamento de angioedema hereditário em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao fígado ou músculo do referido indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante compreendendo um transgene codificando um mAb anticalicreína, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células de fígado humano ou em células de músculo humano, de modo que seja formado um depósito que libere uma forma HuPTM do referido mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00325] 252.Método de acordo com o parágrafo 250 ou 251, em que o mAb anti-calidreína é Lanadelumabe.
[00326] 253.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 250 a 252, em que o fragmento de ligação ao antígeno é um Fab, um F(ab')2, ou um scFv.
[00327] 254. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 250 a 253, em que o fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 47 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 48.
[00328] 255. Método de acordo com o parágrafo 254, em que o transgene compreende uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 147 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 148 codificando a cadeia leve.
[00329] 256.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 250 a 255, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um mutante hiperglicosilado.
[00330] 257.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 250 a 256, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo contém um glicano alfa 2,6-sialilado.
[00331] 258.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 250 a 257, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é glicosilado porém não contém NeuGc ou a-Gal detectável.
[00332] 259. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 250 a 258, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo contém uma sulfação de tirosina.
[00333] 260.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 251 a 259, em que o vetor de expressão recombinante é AAV8 ou AAV9.
[00334] 261.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 251 a 260, em que a produção da referida forma HuUPTM do referido mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é confirmada transduzindo células de fígado ou células musculares humanas em cultura com o referido vetor de expressão de nucleotídeo recombinante e expressando o referido mMAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00335] 262. Método de tratamento de artrite reumatoide, artrite psoriática, espondilite ancilosante, doença de Crohn, psoríase em placas, ou colite ulcerativa em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, compreendendo liberar para a circulação do referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um mAb anti-TNF-alfa, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, produzida por células de fígado ou células musculares humanas.
[00336] 263. Método de tratamento de artrite reumatoide, artrite psoriática, espondilite ancilosante, doença de Crohn, psoríase em placas, ou colite ulcerativa em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao fígado ou músculo do referido indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante compreendendo um transgene codificando um mAb anti-TNF-alfa, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células de fígado humano ou em células de músculo humano, de modo que seja formado um depósito que libere uma forma HUPTM do referido mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00337] 264.Método de acordo com o parágrafo 262 ou 263, em que o mMAb anti-TNF-alfa é Adalimumabe ou Inflixóimabe.
[00338] 265.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 262 a 264, em que o fragmento de ligação ao antígeno é um Fab, um F(ab')2, ou um scFv.
[00339] 266.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 262 a 265, em que o fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 49 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50; ou uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 51 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52.
[00340] 267. Método de acordo com o parágrafo 266, em que o transgene compreende uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 149 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 150 codificando a cadeia leve; uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 151 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 152 codificando a cadeia leve.
[00341] 268. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 262 a 266, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um mutante hiperglicosilado.
[00342] 269. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 262 a 268, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo contém um glicano alfa 2,6-sialilado.
[00343] 270.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 262 a 269, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é glicosilado porém não contém NeuGc ou a-Gal detectável.
[00344] 271.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 262 a 270, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo contém uma sulfação de tirosina.
[00345] 272.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 263 a 271, em que o vetor de expressão recombinante é AAV8 ou AAV9.
[00346] 273.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 263 a 272, em que a produção da referida forma HuPTM do referido mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é confirmada transduzindo células de fígado ou células musculares humanas em cultura com o referido vetor de expressão de nucleotídeo recombinante e expressando o referido mMAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00347] 274. Método de tratamento de PNH ou aHUS em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, compreendendo liberar para a circulação do referido indivíduo humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um mAb de proteína anti-C5 ou C5a, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, produzida por células de fígado humano.
[00348] 275. Método de tratamento de PNH ou aHUS em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao fígado do referido indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante compreendendo um transgene codificando um mAb de proteína anti-C5 ou C5a, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células de fígado humano, de modo que seja formado um depósito que libere uma forma HUPTM do referido mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00349] 276. Método de acordo com os parágrafos 274 a 275, em que o mAb de proteína anti-C5 ou C5a, ou fragmento de ligação ao antígeno, é Eculizumabe.
[00350] 277. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 274 a 276, em que o fragmento de ligação ao antígeno é um Fab, um F(ab')2, ou um scFv.
[00351] 278.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 274 a 277, em que o fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 43 e uma cadeia leve com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 44.
[00352] 279. Método de acordo com a reivindicação 278, em que o transgene compreende uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 143 codificando a cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 144 codificando a cadeia leve.
[00353] 280. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 274 a 279, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um mutante hiperglicosilado.
[00354] — 281.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 274 a 280, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo contém um glicano alfa 2,6-sialilado.
[00355] 282.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 274 a 281, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é glicosilado porém não contém NeuGc ou a-Gal detectável.
[00356] 283.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 274 a 282, em que o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo contém uma sulfação de tirosina.
[00357] 284. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 275 a 283, em que o vetor de expressão recombinante é AAV8 ou AAV9.
[00358] 285.Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 275 a 284, em que a produção da referida forma HuPTM do referido mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é confirmada transduzindo células de fígado ou células musculares humanas em cultura com o referido vetor de expressão de nucleotídeo recombinante e expressando o referido mMAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Método de Produção
[00359] 286.Método de produção de AAVs recombinantes compreendendo: (a) cultivar uma célula hospedeira contendo
[00360] (i) um genoma artificia compreendendo um cassete de expressão cis flanqueado por ITRs de AAV, em que o cassete de expressão cis compreende um transgene codificando um anticorpo terapêutico operavelmente ligado aos elementos de controle da expressão que controlarão a expressão do transgene em células humanas;
[00361] (ii)um cassete de expressão trans que não possui ITRs de AAV, em que o cassete de expressão trans codifica uma proteína rep e capsídeo do AAV operavelmente ligada aos elementos de controle da expressão que direcionam a expressão das proteínas AAV rep e de capsídeo na célula hospedeira em cultura e suprem as proteínas rep e cap em trans;
[00362] (iii)funções auxiliares de adenovírus suficientes para permitir a replicação e empacotamento do genoma artificial pelas proteínas capsídeo do AAV; e
[00363] (b)recuperar o AAV recombinante encapsidando o genoma artificial da cultura celular.
[00364] 287. Método de acordo com o parágrafo 286, em que o transgene codifica um mAb ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compreende os domínios variáveis de cadeias pesada e leve de Aducanumabe, Crenezumabe, Gantenerumabe, BAN2401, aTAU, Erenumabe, Eptinezumabe, Fremanezumabe, ou Galcanezumabe.
[00365] 288.Método de acordo com o parágrafo 286 ou 287, em que a proteína capsídeo do AAV é uma proteína capsídeo AAV9 ou AAVrhIO.
[00366] 289. Método de acordo com o parágrafo 286, em que o transgene codifica um mAb ou fragmento de ligação ao antígeno que compreende os domínios variáveis de cadeias pesada e leve de IXxequizumabe, Seciquinumabe ou Ustequinumabe.
[00367] 290. Método de acordo com o parágrafo 286, em que o transgene codifica um mAb ou fragmento de ligação ao antígeno que compreende os domínios variáveis de cadeias pesada e leve de Natalizumabe ou Vedolizumabe.
[00368] 291. Método de acordo com o parágrafo 286, em que o transgene codifica um mAb ou fragmento de ligação ao antígeno que compreende os domínios variáveis de cadeias pesada e leve de Dupilumabe
[00369] 292. Método de acordo com o parágrafo 286, em que o transgene codifica um mAb ou fragmento de ligação ao antígeno que compreende os domínios variáveis de cadeias pesada e leve de Mepolizumabe.
[00370] 293. Método de acordo com o parágrafo 286, em que o transgene codifica um mAb ou fragmento de ligação ao antígeno que compreende os domínios variáveis de cadeias pesada e leve de Alirocumabe, Evolocumabe, Evinacumabe ou E06.
[00371] 294. Método de acordo com o parágrafo 286, em que o transgene codifica um mAb ou fragmento de ligação ao antígeno que compreende os domínios variáveis de cadeias pesada e leve de Denosumabe.
[00372] 295. Método de acordo com o parágrafo 286, em que o transgene codifica um mAb ou fragmento de ligação ao antígeno que compreende os domínios variáveis de cadeias pesada e leve de Nivolumabe ou Pembrolizumabe.
[00373] 296. Método de acordo com o parágrafo 286, em que o transgene codifica um mAb ou fragmento de ligação ao antígeno que compreende os domínios variáveis de cadeias pesada e leve de Belimumabe.
[00374] 297. Método de acordo com o parágrafo 286, em que o transgene codifica um mAb ou fragmento de ligação ao antígeno que compreende os domínios variáveis de cadeias pesada e leve de Ranibizumabe, Bevacizumabe, ou Lampalizumabe.
[00375] 298. Método de acordo com o parágrafo 286, em que o transgene codifica um mAb ou fragmento de ligação ao antígeno que compreende os domínios variáveis de cadeias pesada e leve de Andecaliximabe.
[00376] 299. Método de acordo com o parágrafo 286, em que o transgene codifica um mAb ou fragmento de ligação ao antígeno que compreende os domínios variáveis de cadeias pesada e leve de Lanadelumabe.
[00377] 300. Método de acordo com o parágrafo 286, em que o transgene codifica um mAb ou fragmento de ligação ao antígeno que compreende os domínios variáveis de cadeias pesada e leve de Adalimumabe ou Inflióimabe
[00378] 301. Método de acordo com o parágrafo 286, em que o transgene codifica um mAb ou fragmento de ligação ao antígeno que compreende os domínios variáveis de cadeias pesada e leve de Eculizumabe.
[00379] 302. Método de acordo com qualquer um dos parágrafos 286 ou 289 a 301, em que a proteína capsídeo do AAV é uma proteína capsídeo AAV8 ou AAV9.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00380] O arquivo de patente ou pedido contém pelo menos um desenho executado em cores. Cópias desta patente ou publicação de pedido de patente com desenhos a cores serão fornecidas pelo Escritório mediante solicitação e pagamento da taxa necessária.
[00381] FIG.1.Um esquema de uma construção do genoma do vetor rAAV contendo um cassete de expressão que codifica as cadeias pesada e leve da região de Fab de um mAb terapêutico controlado por elementos de expressão, ladeado pelas ITRs do AAV.
[00382] FIGURAS 2A-F. A sequência de aminoácidos de uma construção transgênica para a região de Fab de anticorpos terapêuticos para o CNS tem como alvo: Fab anti-AB, de aducanumabe (FIG. 2A); Fab anti-AB, de crenezumabe (FIG. 2B); Fab anti-AB, de gantenerumabe (FIG. 2C), proteína anti-tau, Fab de aTAU (FIG. 2D) e Fab anti-cCGRPR, de erenumabe (FIG. 2E) e BAN2401 anti-AB (FIG. 2F). Os sítios de glicosilação estão em negrito. Os sítios de glicosilação da glutamina estão destacados em verde; os sítios de glicosilação asparaginal (N) estão destacados em magenta; os sítios de glicosilação asparaginal (N) não consenso estão destacados em azul; os sítios de tirosina-O-sulfatação (itálico) estão destacados em amarelo. As regiões das articulações da cadeia pesada estão destacadas em cinza.
[00383] FIGURAS 3A-E. A sequência de aminoácidos de uma construção transgênica para a região de Fab de anticorpos terapêuticos para interleucinas: dupilumabe anti-IL4R (FIG. 3A); ixekizumabe anti-IL- 17 (FIG. 3B); secucinumabe (FIG. 3C); ustekinumabe anti-IL-12/I1L-23 (FIG. 3D); e mepolizumabe anti-IL5 (FIG. 3E). Os sítios de glicosilação estão em negrito. Os sítios de glicosilação da glutamina estão destacados em verde e os sítios de glicosilação asparaginal (N) não consenso estão destacados em azul; os sítios de tirosina-O-sulfatação (itálico) estão destacados em amarelo. As regiões das articulações da cadeia pesada estão destacadas em cinza.
[00384] FIGURAS 4A-4B. A sequência de aminoácidos de uma construção de transgene para a região de Fab de anticorpos terapêuticos para integrina: vedolizumabe (FIG. 4A) e natalizumabe (FIG. 4B). Os sítios de glicosilação estão em negrito. Os sítios de glicosilação da glutamina estão destacados em verde e os sítios de glicosilação asparaginal (N) não consenso estão destacados em azul; os sítios de tirosina-O-sulfatação (itálico) estão destacados em amarelo. As regiões das articulações da cadeia pesada estão destacadas em cinza.
[00385] FIGURAS 5A-D. A sequência de aminoácidos de uma construção de transgene para a região de Fab de anticorpos terapêuticos para POCSKS9: alirocumabe (FIG. 5 A); evolocumabe (FIG. 5B); ANGPTL3: evinacumabe (FIG. 5C), OxPL: EO06-scFv. Os sítios de glicosilação estão em negrito. Os sítios de glicosilação da glutamina estão destacados em verde e os sítios de glicosilação asparaginal (N) não consenso estão destacados em azul; os sítios de tirosina-O- sulfatação (itálico) estão destacados em amarelo. As regiões da articulação estão destacadas em cinza.
[00386] AFIG.6.A sequência de aminoácidos de uma construção de transgene para a região de Fab de denosumabe, um anticorpo terapêutico para RA KL. Os sítios de glicosilação estão em negrito. Os sítios de glicosilação da glutamina estão destacados em verde e os sítios de glicosilação asparaginal (N) não consenso estão destacados em azul; os sítios de tirosina-O-sulfatação (itálico) estão destacados em amarelo. A região da articulação é destacada em cinza.
[00387] FIGURAS 7A e bB.A sequência de aminoácidos de uma construção transgênica para a região de Fab de anticorpos terapêuticos que são bloqueadores de PD-1: nivolumabe (FIG.7A); e pembrolizumabe (FIG. 7B). Os sítios de glicosilação estão em negrito. Os sítios de glicosilação da glutamina estão destacados em verde e os sítios de glicosilação asparaginal (N) não consenso estão destacados em azul; os sítios de tirosina-O-sulfatação (itálico) estão destacados em amarelo. As regiões da articulação estão destacadas em cinza.
[00388] FIGURAS 8A-H. A sequência de aminoácidos de uma construção de transgene para a região de Fab de anticorpos terapêuticos direcionados a fatores biológicos: ranibizumabe anti-VEGF (FIG. 8A), bevacizumabe (FIG. 8B) e brolucizumabe (FIG. 8D); lampalizumabe anti-fD (FIG. 8C); belimumabe anti-BLyS (FIG. 8E); proteína de complemento de C5 anti-humana, eculizumabe (FIG. 8F); andecaliximabe anti-MMP 9 (FIG. 8G); e lanadelumabe anti-calicreína (FIG. 8H). Os sítios de glicosilação estão em negrito. Os sítios de glicosilação da glutamina estão destacados em verde e os sítios de glicosilação asparaginal (N) não consenso estão destacados em azul; os sítios de tirosina-O-sulfatação (itálico) estão destacados em amarelo. As regiões da articulação estão destacadas em cinza.
[00389] FIGURAS 9A e B. A sequência de aminoácidos de uma construção transgênica para a região de Fab do anticorpo terapêutico direcionado a TF-alfa: adalimumabe (FIG. 9A) e infliimabe (FIG. 9B). Os sítios de glicosilação estão em negrito. Os sítios de glicosilação da glutamina estão destacados em verde e os sítios de glicosilação asparaginal (N) não consenso estão destacados em azul; os sítios de tirosina-O-sulfatação (itálico) estão destacados em amarelo. As regiões da articulação estão destacadas em cinza.
[00390] FIG. 10. Glicanos que podem ser ligados às regiões HuGlIyFab de mAbs de tamanho natural ou aos domínios de ligação ao antígeno. (Adaptado de Bondt et a/., 2014, Mol & Cell Proteomics 13.1:
3029-3039).
[00391] FIGURAS 11 A e B. Alinhamento da sequência de aminoácidos das sequências de aminoácidos das porções de Fab da cadeia pesada (FIG. 11 A) (SEQ ID NOS 283-299, 59, 300-302, 313, 303, 39 e 304-310, respectivamente, em ordem de aparência) e leve (FIG. 11B) (SEQ ID NOS 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 60, 58, 36, 54, 311, 314, 312, 38, 234, 42, 44, 48,247 e 235, respectivamente, em ordem de aparência) dos anticorpos terapêuticos aqui descritos. As posições que podem ser substituídas para produzir variantes hiperglicosiladas das regiões de Fab estão destacadas em verde. Quatro substituições (uma na cadeia pesada e três na cadeia leve) que devem resultar em hiperglicosilação da região de Fab pelas células humanas são anotadas acima das posições dos resíduos de aminoácidos. (Para que os mAbs de modificação ou fragmentos de ligação ao antígeno contenham sítios de glicosilação adicionais no domínio de Fab, consulte, por exemplo, Courtois et al., 2016, mAbs 8: 99-112 para obter uma descrição dos derivados de anticorpos hiperglicosilados no domínio de Fab do anticorpo de tamanho natural).
[00392] FIG. 12. Alinhamento de Sequência Múltipla Clustal de capsídeos AAV 1-9. As substituições de aminoácidos (mostradas em negrito nas linhas inferiores) podem ser feitas nos capsídeos AAV9 e AAVB8 "recrutando" resíduos de aminoácidos da posição correspondente de outros capsídeos AAV alinhados. Sequência mostrada em vermelho = regiões hipervariáveis. As sequências de aminoácidos dos capsídeos AAV são designadas SEQ ID NOs como se segue: AAV1 é SEQ ID NO: 71; AAV2 é SEQ ID NO: 72; AAV3-3 é SEQ ID NO: 73; AAV4-4 é SEQ ID NO: 74; AAV5 é SEQ ID NO: 75; AAV6 é SEQ ID NO: 76; AAV7 é SEQ ID NO: 77; AAV8 é SEQ ID NO: 78; AAV9 é SEQ ID NO: 79; hu31 é a SEQ ID NO: 81; e hu32 é a SEQ ID NO: 82.
5. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[00393] As composições e métodos são descritos para a liberação de um anticorpo monoclonal terapêutico (mMAb) pós-translacional (HuPTM) totalmente humano ou um fragmento de ligação ao antígeno de HuUPTM de um mAb terapêutico (por exemplo, um Fab totalmente glicosilado por humanos (HuGlyFab) de um mAb terapêutico) a um paciente (indivíduo humano) diagnosticado com uma doença ou condição indicada para tratamento com o mAb terapêutico. A liberação pode ser vantajosamente realizada via terapia genética - por exemplo, administrando um vetor viral ou outra construção de expressão de DNA que codifica um mAb terapêutico ou seu fragmento de ligação ao antígeno (ou um derivado hiperglicosilado de qualquer um) a um paciente (indivíduo humano) diagnosticado com uma condição indicado para tratamento com o mAb terapêutico - para criar um depósito permanente em um tecido ou órgão do paciente que forneça continuamente o mAb HuPTM ou fragmento de ligação ao antígeno do mAb terapêutico, por exemplo, um produto de transgene glicosilado humano, para um alvo tecido onde o mAb ou fragmento de ligação ao antígeno exerce seu efeito terapêutico.
[00394] “OmAb HuPTM ou fragmento de ligação ao antígeno HuPTM codificado pelo transgene pode incluir, mas não está limitado a, um fragmento de tamanho natural ou um de ligação ao antígeno de um anticorpo terapêutico que se liga a:
[00395] e Alvos do sistema nervoso, incluindo peptídeos beta- amiloides (AB ou Abeta), proteína Tau e receptor de CGRP,
[00396] e Interleucinas ou receptores interleucina, incluindo ILAR, IL17A, IL-5 e IL12/I1L23,
[00397] e lntegrinas, incluindo integrina-alfa-4,
[00398] e PCSK9, ANGPTL3 ou fosfolipídios oxidados, como OxPL,
[00399] e RANKL,
[00400] e PD-1ouPD-L1ouPD-L2,
[00401] e BLyS (estimulador de linfócitos B, também conhecido como fator de ativação de células B (BAFF)),
[00402] e Alvos oculares, incluindo VEGF, fD e metaloproteinase matriz 9 (MMP9),
[00403] e TNF-alfae
[00404] e Alvos de proteínas plasmáticas, como proteínas do complemento humano, incluindo proteínas do complemento C5 e C5a e calicreína plasmática,
[00405] ou tais mAbs ou fragmentos de ligação ao antígeno modificados para conter sítios de glicosilação adicionais no domínio de Fab (por exemplo, veja Courtois et a/., 2016, mAbs 8: 99-112, que é incorporado por referência aqui em sua íntegra para sua descrição de derivados de anticorpos que são hiperglicosilados no domínio de Fab do anticorpo de tamanho natural). As sequências de aminoácidos das cadeias pesada e leve dos fragmentos de ligação ao antígeno do precedente são fornecidas na Tabela 4, infra, e as sequências de nucleotídeo otimizadas por códon que codificam as cadeias pesada e leve desses fragmentos de ligação ao antígeno são fornecidas na Tabela 5.
[00406] O vetor recombinante usado para liberar o transgene inclui vetores de vírus adenoassociados recombinantes não replicantes ("rAAV"). Os rAAVs são vetores particularmente atrativos por várias razões - eles podem transduzir células não replicantes e, portanto, podem ser usados para liberar o transgene para os tecidos onde a divisão celular ocorre em níveis baixos, como o CNS; eles podem ser modificados para atingir preferencialmente um órgão específico de escolha; e existem centenas de sorotipos do capsídeo para escolher para obter a especificidade desejada do tecido e/ou evitar a neutralização por anticorpos preexistentes do paciente para alguns
AAVs. Esses rAAVs incluem, entre outros, vetores com base em AAV que compreendem componentes do capsídeo de um ou mais de AAV1, AAV2, AAV3, AAVA4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV1O, AAV11,
20. Nas modalidades preferidas, os vetores com base em AAV aqui fornecidos compreendem capsídeos de um ou mais dos sorotipos AAV8, AAV9, AAV10O, AAV11, AAVrh10 ou AAVrh20.
[00407] No entanto, outros vetores virais podem ser utilizados, incluindo, porém não limitados a vetores lentivirais; vetores virais da vacínia ou vetores de expressão não viral referidos como construções "DNA nu". A expressão do transgene pode ser controlada por elementos de controle de expressão constitutivos ou específicos de tecido.
[00408] As construções de terapia genética são planejadas de modo que as cadeias pesada e leve sejam expressas. Mais especificamente, as cadeias pesadas e leves devem ser expressas em quantidades aproximadamente iguais, em outras palavras, as cadeias pesadas e leves são expressas em aproximadamente uma relação de 1:1 de cadeias pesadas para cadeias leves. As sequências de codificação para as cadeias pesada e leve podem ser modificadas em uma única construção na qual as cadeias pesada e leve são separadas por um ligante clivável ou IRES, de modo que os polipeptídeos das cadeias pesada e leve sejam expressos. Em certas modalidades, as sequências de codificação codificam para um Fab ou F(ab')2 ou um scFv.
[00409] Em certas modalidades, as sequências de ácidos nucleicos (por exemplo, polinucleotídeos) e de ácidos nucleicos aqui descritas podem ser otimizadas por códon, por exemplo, através de qualquer técnica de otimização de códon conhecida por alguém versado na técnica (veja, por exemplo, revisão por Quax et a/., 2015, Mol Cell 59: 149-161). As sequências de nucleotídeo otimizadas por códon dos domínios variáveis das cadeias pesada e leve dos anticorpos terapêuticos são descritas na Tabela 5. Cada cadeia pesada e leve requer uma sequência líder para assegurar o processamento e secreção pós-translação apropriados (a menos que seja expresso como um scFv, no qual apenas a cadeia N-terminal requer uma sequência líder). Sequências líderes úteis para a expressão das cadeias pesada e leve dos anticorpos terapêuticos em células humanas são aqui descritas. Un exemplo de construção de expressão recombinante é mostrado na FIG. 1
[00410] A produção de MAb HUPTM ou Fab HuPTM (incluindo um scFv HuPTM) deve resultar em uma molécula "biobetter' para o tratamento de doenças realizadas por terapia genética - por exemplo, administrando um vetor viral ou outra construção de expressão de DNA que codifica um Fab de tamanho natural ou HuPTM ou outro fragmento de ligação ao antígeno, como um scFv, de um mAb terapêutico para um paciente (indivíduo humano) diagnosticado com uma indicação de doença para esse mAb, para criar um depósito permanente no indivíduo que continuamente forneça o produto transgênico sulfatado, glicosilado humano produzido pelas células transduzidas do indivíduo. A construção de cDNA para o mAb HuPTM ou Fab HuUPTM ou scFv HuPTM deve incluir um peptídeo sinal que assegure o processamento co- e pós-translação adequado (glicosilação e sulfatação de proteínas) pelas células humanas transduzidas.
[00411] As composições farmacêuticas adequadas para administração em indivíduos humanos compreendem uma suspensão do vetor recombinante em um tampão de formulação compreendendo um tampão aquoso fisiologicamente compatível, um tensoativo e excipientes opcionais. Esse tampão de formulação pode compreender um ou mais de um polissacarídeo, um tensoativo, polímero ou óleo.
[00412] Como alternativa, ou um tratamento adicional à terapia genética, o Fab de tamanho natural ou HUPTM ou outro fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser produzido em linhagens celulares humanas por tecnologia de DNA recombinante, e a glicoproteína pode ser administrada aos pacientes. As linhagens celulares humanas que podem ser usadas para essa produção de glicoproteína recombinante incluem, mas não se limitam a, células 293 de rim embrionário humano (HEK293), fibrossarcoma HT-1080, HKB- 11, CAP, HuH-7 e linhagens celulares da retina, PER.C6 ou RPE para citar alguns (por exemplo, veja Dumont et a/., 2015, Crit. Rev. Biotechnol. 36 (6): 1110-1122, que é incorporado por referência na sua íntegra para uma revisão das linhagens celulares humanas que pode ser usado para a produção recombinante do produto Fab HUPTM ou scFv HuPTM, por exemplo, glicoproteína de Fab HuUPTM). Para garantir glicosilação completa, especialmente sialilação e sulfatação de tirosina, a linhagem celular usada para produção pode ser realçada através da modificação das células hospedeiras para coexpressar a aa-2,6- sialiltransferase (ou a-2,3- e a-2,6-sialiltransferases) e/ou enzimas TPST-1 e TPST-2 responsáveis pela O-sulfatação de tirosina em células humanas.
[00413] Não é essencial que todas as moléculas produzidas na terapia genéticas ou na abordagem de terapia de proteínas sejam totalmente glicosiladas e sulfatadas. Em vez disso, a população de glicoproteínas produzidas deve ter glicosilação suficiente (incluindo 2,6- sialilação) e sulfatação para demonstrar eficácia. O objetivo do tratamento de terapia genética da invenção é retardar ou interromper a progressão da doença.
[00414] —Asterapias de combinação que envolvem a liberação do Fab HuPTM de tamanho natural ou fragmento de ligação ao antígeno ao paciente, acompanhadas pela administração de outros tratamentos disponíveis, são abrangidas pelos métodos da invenção. Os tratamentos adicionais podem ser administrados antes, simultaneamente ou após o tratamento da terapia genética. Tais tratamentos adicionais podem incluir, entre outros, coterapia com o mAb terapêutico.
[00415] “Também são fornecidos métodos de fabricação dos vetores virais, particularmente os vetores virais com base em AAV. Nas modalidades específicas, são fornecidos métodos para produzir AAVs recombinantes compreendendo a cultura de uma célula hospedeira contendo um genoma artificia compreendendo um cassete de expressão cis flanqueada por ITRs de AAV, em que o cassete de expressão cis compreende um transgene que codifica um anticorpo terapêutico operacionalmente ligado a elementos de controle de expressão que controlar a expressão do transgene nas células humanas; um cassete de expressão trans sem ITRs de AAV, em que o cassete de expressão trans codifica uma proteína de rep e capsídeo de AAV operacionalmente ligada a elementos de controle de expressão que direcionam a expressão das proteínas de rep e capsídeo de AAV na célula hospedeira em cultura e fornecem as proteínas de rep e cap em trans; funções auxiliares de adenovírus suficientes para permitir a replicação e acondicionamento do genoma artificial pelas proteínas do capsídeo do AAV; e recuperação de AAV recombinante encapsidando o genoma artificial da cultura celular.
5.1 CONSTRUÇÕES
[00416] Os vetores virais ou outras construções de expressão de DNA que codificam um mAb HuPTM ou seu fragmento de ligação ao antígeno, particularmente um HuGlyFabyi ou um derivado hiperglicosilado de um fragmento de ligação ao antígeno de mAb HuPTM são fornecidos aqui. Os vetores virais e outras construções de expressão de DNA aqui fornecidas incluem qualquer método adequado para a liberação de um transgene a uma célula alvo. Os meios de liberação de um transgene incluem vetores virais, lipossomas, outros complexos contendo lipídeos, outros complexos macromoleculares,
mRNA sintético modificado, mRNA não modificado, moléculas pequenas, moléculas não biologicamente ativas (por exemplo, partículas de ouro) moléculas polimerizadas (por exemplo, dendrímeros), DNA nu, plasmídeos, fagos, transposons, cosmídeos ou epissomas. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor direcionado, por exemplo, um vetor direcionado a células epiteliais de pigmento da retina, células CNS, células musculares ou células hepáticas.
[00417] Em alguns aspectos, a descrição fornece um ácido nucleico para uso, em que o ácido nucleico compreende uma sequência nucleotídica que codifica um mAb HuPTM ou HuGlyFab ou outro fragmento de ligação a antígeno, como um transgene aqui descrito, operacionalmente ligado a um promotor selecionado para expressão em tecido direcionado para expressão do transgene, por exemplo, mas não limitado ao promotor CB7 (veja, FIG. 1), promotor de citomegalovírus (CMV), promotor de Rous sarcoma virus (RSV), promotor de GFAP (proteína ácida fibrilar glial), Promotor MBP (proteína básica de mielina), promotor MMT, promotor alfa EF-1, promotor UB6, promotor beta-actina de frango, promotor CAG, promotor RPE65 e promotor de opsina, promotores específicos do fígado, como TBG (Globulina de ligação à tiroxina), APOA2, SERPINAI (hAAT) ou mIR122 ou promotor específico do músculo, como um promotor de desmina humana ou Pit3, promotores induzíveis, como um promotor induzido por hipoxia ou um promotor induzível por rapamicina.
[00418] Em certas modalidades, são aqui fornecidos vetores recombinantes que compreendem um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, polinucleotídeos). Os ácidos nucleicos podem compreender DNA, RNA ou uma combinação de DNA e RNA. Em certas modalidades, o DNA compreende uma ou mais das sequências selecionadas do grupo que consiste em sequências promotoras, a sequência do gene de interesse (o transgene, por exemplo, as sequências de nucleotídeo que codificam as cadeias pesada e leve do mAb HuUPTM ou HuGlyFab ou outro fragmento de ligação ao antígeno), regiões não transladadas e sequências de terminação. Em certas modalidades, os vetores virais aqui fornecidos compreendem um promotor operacionalmente ligado ao gene de interesse.
[00419] Em certas modalidades, ácidos nucleicos (por exemplo, polinucleotídeos) e sequências de ácidos nucleicos aqui descritas podem ser otimizadas por códon, por exemplo, através de qualquer técnica de otimização de códon conhecida por alguém versado na técnica (veja, por exemplo, revisão por Quax et al., 2015, Mol Cell 59: 149-161). As sequências de nucleotídeo otimizadas para códon para expressão em células humanas são fornecidas aqui para as cadeias pesada e leve dos HuGIlyFabs na Tabela 5.
[00420] Em uma modalidade específica, as construções aqui descritas compreendem os seguintes componentes: (1) repetições terminais invertidas de AAV2 que flanqueiam o cassete de expressão; (2) um ou mais elementos de controle, b) um íntron de B-actina de frango e c) um sinal poli A de B-globina de coelho; e (3) sequências de ácidos nucleicos que codificam para as cadeias pesada e leve do fragmento de ligação ao antígeno anti-VEGF, separadas por um ligante autoclivável de furina (F)/F2A, assegurando a expressão de quantidades iguais dos polipeptídeos da cadeia pesada e leve. Uma construção exemplar é mostrada na FIG. 1
5.1.1 Vetores de MRNA
[00421] Em certas modalidades, como uma alternativa aos vetores de DNA, os vetores aqui fornecidos são mMRNA modificados que codificam para o gene de interesse (por exemplo, o transgene, por exemplo, mAb HuUPTM ou HuGlyFab ou outro fragmento de ligação a antígeno do mesmo). A síntese de MRNA modificado e não modificado para liberação de um transgene para células epiteliais de pigmento da retina é ensinada, por exemplo, em Hansson et a/., J. Biol. Chem., 2015, 290 (9): 5661-5672, que é incorporado por referência aqui em sua íntegra. Em certas modalidades, é aqui fornecido um mMRNA modificado que codifica para um mAb HUPTM ou Fab HUPTM ou scFv HUPTM.
5.1.2 Vetores virais
[00422] Os vetores virais incluem adenovírus, vírus adenoassociado (AAV, por exemplo, AAV8, AAV9, AAVrh1O), lentivírus, adenovírus dependente de auxiliar, vírus do herpes simples, poxvírus, vírus da hemaglutinina do Japão (HVJ), alfavírus, vírus da vacina e vetores de retrovírus. Os vetores retrovirais incluem vetores com base no vírus da leucemia murina (MLV) e no vírus da imunodeficiência humana (HIV). Os vetores de alfavírus incluem o vírus da floresta semliki (SFV) e o vírus sindbis (SIN). Em certas modalidades, os vetores virais aqui fornecidos são vetores virais recombinantes. Em certas modalidades, os vetores virais aqui fornecidos são alterados de modo a serem deficientes de replicação em seres humanos. Em certas modalidades, os vetores virais são vetores híbridos, por exemplo, um vetor AAV colocado em um vetor adenoviral "indefeso". Em certas modalidades, são aqui fornecidos vetores virais compreendendo um capsídeo viral de um primeiro vírus e proteínas envelope virais de um segundo vírus. Nas modalidades específicas, o segundo vírus é o vírus da estomatite vesicular (VSV). Nas modalidades mais específicas, a proteína do envelope é a proteína VSV-G.
[00423] Em certas modalidades, os vetores virais aqui fornecidos são vetores virais com base em HIV. Em certas modalidades, os vetores com base em HIV aqui fornecidos compreendem pelo menos dois polinucleotídeos, em que os genes gag e pol são de um genoma do HIV e o gene env é de outro vírus.
[00424] Em certas modalidades, os vetores virais aqui fornecidos são vetores virais com base em vírus do herpes simples. Em certas modalidades, os vetores com base no vírus herpes simples aqui fornecidos são modificados de modo que não compreendam um ou mais genes imediatamente precoces (IE), tornando-os não citotóxicos.
[00425] Em certas modalidades, os vetores virais aqui fornecidos são vetores virais com base em MLV. Em certas modalidades, os vetores com base em MLV aqui fornecidos compreendem até 8 kb de DNA heterólogo no lugar dos genes virais.
[00426] Em certasmodalidades, os vetores virais aqui fornecidos são vetores virais com base em lentivírus. Em certas modalidades, os vetores lentivirais aqui fornecidos são derivados de lentivírus humanos. Em certas modalidades, os vetores lentivirais aqui fornecidos são derivados de lentivítus não humanos. Em certas modalidades, os vetores lentivirais aqui fornecidos são acondicionados em um capsídeo lentiviral. Em certas modalidades, os vetores lentivirais aqui fornecidos compreendem um ou mais dos seguintes elementos: repetições terminais longas, um sítio de ligação ao iniciador, um trato de polipurina, sítios att e um sítio de encapsidação.
[00427] —Emcertas modalidades, os vetores virais aqui fornecidos são vetores virais com base em alfavírus. Em certas modalidades, os vetores de alfavírus aqui fornecidos são alfavírus recombinantes deficientes de replicação. Em certas modalidades, os replicons de alfavírus nos vetores de alfavírus aqui fornecidos são direcionados a tipos celulares específicos, exibindo um ligante heterólogo funcional em sua superfície de vírion.
[00428] Em certasmodalidades, os vetores virais aqui fornecidos são vetores virais com base em AAV. Em certas modalidades, os vetores com base em AAV aqui fornecidos não codificam o gene rep de AAV (necessário para replicação) e/ou o gene cap de AAV (necessário para síntese das proteínas do capsídeo) (as proteínas de rep e cap podem ser fornecidas pelas células de acondicionamento em trans). Múltiplos sorotipos de AAV foram identificados.
Em certas modalidades, os vetores com base em AAV aqui fornecidos compreendem componentes de um ou mais sorotipos de AAV.
Em certas modalidades, os vetores com base em AAV aqui fornecidos compreendem componentes do capsídeo de um ou mais de AAV1, AAV2, AAV3, AAVA4, AAVS5, AAVG6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV1O, AAV11 ou AAVrhiO.
Nas modalidades preferidas, os vetores com base em AAV aqui fornecidos compreendem componentes de um ou mais dos sorotipos AAV8, AAV9, AAV1O, AAV11 ou AAVrh10. São fornecidos vetores virais nos quais a proteína do capsídeo é uma variante da proteína do capsídeo de AAV8 (SEQ ID NO: 78), proteína do capsídeo de AAV9 (SEQ ID NO: 79) ou proteína do capsídeo de AAVrh10 (SEQ ID NO: 80), mais particularmente, é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,9% idêntico à sequência de aminoácidos da proteína do capsídeo de AAV8 (SEQ ID NO: 78), proteína do capsídeo de AAV9 (SEQ ID NO: 79), ou proteína do capsídeo de AAVrh10O (SEQ ID NO: 80), mantendo a função biológica do capsídeo nativo.
Em certas modalidades, o capsídeo do AAV codificado tem a sequência da SEQ ID NO: 78, 79 ou 80 com 1,2,3,4, 5,6,7,8,9,10,11,12,13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,23, 24,25, 26, 27, 28, 29 ou 30 substituições de aminoácidos e mantendo a função biológica do capsídeo de AAV8 AAV9 ou AAVrh1O.
A FIG. 12 fornece um alinhamento comparativo das sequências de aminoácidos das proteínas do capsídeo de diferentes sorotipos de AAV com aminoácidos potenciais que podem ser substituídos em determinadas posições nas sequências alinhadas com base na comparação na linha rotulada como SUBS.
Por conseguinte, em modalidades específicas, o vetor AAV compreende uma variante do capsídeo de AAV8, AAV9 ou AAVrhiOo que possui 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21,22,23,24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 substituições de aminoácidos que não estão presentes nessa posição na sequência do capsídeo nativo do AAV conforme identificado nas linhas SUBS da FIG. 12. A sequência para AAVrh10 é fornecida na Tabela 4.
[00429] Em certas modalidades, o AAV usado nas composições e métodos aqui descritos é Anc80 ou Anc80L65, conforme descrito em Zinn et al/., 2015, Cell Rep. 12 (6): 1056-1068, que é incorporado por referência na sua íntegra. Em certas modalidades, o AAV que é usado nos métodos aqui descritos compreende uma das seguintes inserções de aminoácidos: LGETTRP (SEQ ID NO: 162) ou LALGETTRP (SEQ ID NO: 163), conforme descrito nas Patentes Norte-americanas Nos.
9.193.956; 9458517; e 9.587.282 e Publicação de Pedido de Patente no. 2016/0376323, cada um dos quais é aqui incorporado por referência na sua íntegra. Em certas modalidades, o AAV que é usado nos métodos aqui descritos é AAV .7m8 (incluindo variantes), como descrito nas Patentes Norte-americanas Nos. 9.193.956, 9.458.517, e
9.587.282, publicação do Pedido de Patente No. 2016/0376323 e Publicação Internacional WO 2018/075798, cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua íntegra. Em certas modalidades, o AAV que é usado nos métodos aqui descritos é qualquer AAV descrito na Patente Norte-americana No. 9.585.971, como AAV-PHP.B. Em certas modalidades, o AAV usado nas composições e métodos aqui descritos é um vetor AAV2/Rec2 ou AAV2/Rec3, que possui sequências de capsídeos híbridos derivados de capsídeos de AAV8 e capsídeos dos sorotipos cy5, rh20 ou rh39, conforme descrito em Charbel Issa et al., 2013, PLoS One 8 (4): e60361, que é aqui incorporado por referência para esses vetores. Em certas modalidades, o AAV que é usado nos métodos aqui descritos é um AAV descrito em qualquer uma das seguintes patentes e pedidos de patente, cada um dos quais é aqui incorporado por referência na sua íntegra: Patentes Norte-americanas Nos. 7.906.111; 8.524.446; 8.999.6/8; 8.628.966; 8.927.514;
8.734.809; US 9.284.357; 9.409.953; 9.169.299; 9.193.956; 9458517; e
9.587.282 publicação de pedido de patente nos. 2015/0374803; 2015/0126588; — 2017/006/908; 2013/0224836; 2016/0215024; 2017/0051257; e pedidos de patentes internacionais nos. PCT/US2015/034799; PCT/EP2015/053335.
[00430] Os vetores virais com base em AAV8, em AAV9 e em AAVrhiO0 são usados em alguns dos métodos aqui descritos. Sequências de nucleotídeo de vetores virais com base em AAV e métodos de produção de capsídeos de AAV e AAV recombinantes são ensinados, por exemplo, na Patente Norte-americana Nº 7.282, 199 B2, Patente Norte-americana Nº 7.790.449 B2, Patente Norte-americana
8.318.480 B2, Patente Norte-americana No. 8.962.332 B2 e Pedido de Patente Internacional No. POT/EP2014/076466, cada um dos quais é aqui incorporado por referência na sua íntegra. Em um aspecto, são aqui fornecidos os vetores virais com base em AAV (por exemplo, AAVB8, AAVO9 ou AAVrhiO) que codificam um transgene (por exemplo, um Fab HuPTM). As sequências de aminoácidos dos capsídeos do AAV, incluindo AAV8, AAV9 e AAVrh10 são fornecidas na Figura 12 e Tabela
4.
[00431] Em certas modalidades, um AAV de fita simples (ssSAAV) pode ser usado supra. Em certas modalidades, um vetor autocomplementar, por exemplo, scAAV, pode ser usado (veja, por exemplo, Wu, 2007, Human Gene Therapy, 18 (2): 171-82, McCarty et al., 2001, Gene Therapy, Vol. 8 , Número 16, páginas 1248-1254; e patentes US 6.596.535; 7, 125.717 e 7.456.683, cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua íntegra).
[00432] Em certas modalidades, os vetores virais utilizados nos métodos aqui descritos são vetores virais com base em adenovírus. Um vetor de adenovírus recombinante pode ser usado para transferir no transgene que codifica o mAb HUPTM ou HuGlyFab ou fragmento de ligação ao antígeno. O adenovírus recombinante pode ser um vetor de primeira geração, com uma exclusão El, com ou sem uma exclusão E3, e com o cassete de expressão inserida em qualquer região excluída. O adenovírus recombinante pode ser um vetor de segunda geração, que contém deleções completas ou parciais das regiões E2 e E4. Um adenovírus dependente de auxiliar retém apenas as repetições terminais invertidas do adenovírus e o sinal de acondicionamento (phi). O transgene é inserido entre o sinal de acondicionamento e o 3'ITR, com ou sem sequências de material para manter o genoma próximo ao tamanho selvagem de aproximadamente 36 kb. Um protocolo exemplar para a produção de vetores adenovirais pode ser encontrado em Alba et al., 2005, "Gutless adenovirus: last generation adenovirus for Gene Therapy", Gene Therapy 12: S18-S27, que é aqui incorporado por referência na sua íntegra.
[00433] Em certas modalidades, os vetores virais utilizados nos métodos descritos aqui são vetores virais com base em lentivírus. Um vetor de lentivírus recombinante pode ser usado para transferir no transgene que codifica o fragmento de ligação ao antígeno de mAb HuPTM. Quatro plasmídeos são usados para fazer a construção: sequência Gag/pol contendo plasmídeo, sequência Rev contendo plasmídeos, proteína Envelope contendo plasmídeo (isto é, VSV-G) e plasmídeo Cis com os elementos de embalagem e o gene do fragmento de ligação ao antígeno anti-VEGF.
[00434] Paraa produção do vetor lentiviral, os quatro plasmídeos são cotransfectados para as células (isto é, células à base de HEK293), em que a polietilenimina ou o fosfato de cálcio podem ser utilizados como agentes de transfecção, entre outros. O lentivírus é então colhido no sobrenadante (os lentivírus precisam brotar das células para serem ativos, portanto, nenhuma colheita de células precisa/deve ser feita). O sobrenadante é filtrado (0,45 um) e depois adicionado cloreto de magnésio e benzonase. Outros processos a jusante podem variar bastante, com o uso de TFF e cromatografia de coluna sendo os mais compatíveis com GMP. Outros usam ultracentrifugação com/sem cromatografia de coluna. Protocolos exemplares para produção de vetores lentivirais pode ser encontrado em Lesch et al, 2011, "Production and purification of lentiviral vector generated in 293T suspension cells with baculoviral vectors," Gene Therapy 18:531-538, and Ausubel et a/. 2012, "Production of! CGMP-Grade Lentiviral Vectors," Bioprocess Int. 10(2):32-43, os quais são incorporados por referência aqui em sua íntegra.
[00435] Em uma modalidade específica, um vetor para uso nos métodos descritos aqui é aquele que codifica um fragmento de ligação ao antígeno de mAb HUPTM, como um Fab HuGly, de modo que, após a introdução do vetor em uma célula relevante, um glicosilado e/ou a variante sulfatada em tirosina do fragmento de ligação ao antígeno de mAb HuPTM ou Fab HuGly é expressa pela célula.
5.1.3 Promotores e Modificadores da expressão de gene
[00436] Em certas modalidades, os vetores aqui fornecidos compreendem componentes que modulam a liberação ou expressão de gene (por exemplo, "elementos de controle de expressão"). Em certas modalidades, os vetores aqui fornecidos compreendem componentes que modulam a expressão de gene. Em certas modalidades, os vetores aqui fornecidos compreendem componentes que influenciam a ligação ou o direcionamento para as células. Em certas modalidades, os vetores aqui fornecidos compreendem componentes que influenciam a localização do polinucleotídeo (por exemplo, o transgene) dentro da célula após a captação. Em certas modalidades, os vetores aqui fornecidos compreendem componentes que podem ser utilizados como marcadores detectáveis ou selecionáveis, por exemplo, para detectar ou selecionar células que absorveram o polinucleotídeo.
[00437] Em certas modalidades, os vetores virais aqui fornecidos compreendem um ou mais promotores que controlam a expressão do transgene.
Em certas modalidades, o promotor é um promotor constitutivo.
Em certas modalidades, o promotor é um promotor CB7 (veja, Dinculescu et a/., 2005, Hum Gene Ther 16: 649-663, incorporado por referência aqui em sua íntegra). Em algumas modalidades, o promotor CB7 inclui outros elementos de controle de expressão que melhoram a expressão do transgene acionado pelo vetor.
Em certas modalidades, os outros elementos de controle de expressão incluem íntron de B-actina de frango e/ou sinal de B-globina poliA de coelho.
Em certas modalidades, o promotor compreende uma caixa TATA.
Em certas modalidades, o promotor compreende um ou mais elementos.
Em certas modalidades, os um ou mais elementos promotores podem ser invertidos ou movidos em relação um ao outro.
Em certas modalidades, os elementos do promotor estão posicionados para funcionar cooperativamente.
Em certas modalidades, os elementos do promotor estão posicionados para funcionar independentemente.
Em certas modalidades, os vetores virais aqui fornecidos compreendem um ou mais promotores selecionados do grupo que consiste no promotor genético precoce imediato do CMV humano, no promotor inicial SV40, na repetição terminal longa do vírus do sarcoma de Rous (RS) e no promotor de insulina de rato.
Em certas modalidades, os vetores aqui fornecidos compreendem um ou mais promotores de repetição terminal longa (LTR) selecionados do grupo que consiste em AAV, MLV, MMTV, SV40, RSV, HIV-1 e HIV-2 LTRs.
Em certas modalidades, os vetores aqui fornecidos compreendem um ou mais promotores específicos de tecido (por exemplo, um promotor específico de célula epitelial de pigmento da retina, um promotor específico de CNS, um promotor específico de fígado ou específico de músculo). Em certas modalidades, os vetores virais aqui fornecidos compreendem um promotor RPE65 ou um promotor de opsina (um promotor específico de célula da retina/CNS). Em certas modalidades, os vetores virais aqui fornecidos compreendem um promotor específico de célula hepática, como um promotor de TBG (Globulina de ligação à tiroxina), um promotor de APOA?2, um promotor de SERPINA1 (hAAT) ou um promotor de MIR122. Em certas modalidades, o vetor viral aqui fornecido compreende um promotor específico do músculo, como um promotor de desmina humano (Jonuschies et al., 2014, Curr. Gene Ther. 14: 276- 288) ou um promotor Pitx3 (Coulon et a/., 2007, JBC 282: 33192). Em outras modalidades, o vetor viral compreende um promotor VMD?2.
[00438] Em certasmodalidades, o promotor é um promotor induzível. Em certas modalidades, o promotor é um promotor induzido por hipoxia. Em certas modalidades, o promotor compreende um sítio de ligação ao fator induzível por hipoxia (HIF). Em certas modalidades, o promotor compreende um sítio de ligação ao HIF-1a. Em certas modalidades, o promotor compreende um sítio de ligação ao HIF-2a. Em certas modalidades, o sítio de ligação ao HIF compreende um motivo ROGTG. Para detalhes sobre a localização e sequência dos sítios de ligação ao HIF, consulte, por exemplo, Schodel, et a/., Blood, 2011, 117 (23): e207- e217, que é incorporado por referência aqui em sua íntegra. Em certas modalidades, o promotor compreende um sítio de ligação a um fator de transcrição induzido por hipoxia que não seja um fator de transcrição HIF. Em certas modalidades, os vetores virais aqui fornecidos compreendem um ou mais sítios IRES que são preferencialmente transladados em hipoxia. Para ensinamentos sobre expressão de gene induzível por hipoxia e os fatores envolvidos, consulte, por exemplo, Kenneth e Rocha, Biochem J., 2008, 414: 19-29, que é incorporado por referência aqui em sua íntegra. Nas modalidades específicas, o promotor induzível por hipoxia é o promotor N-WASP humano, consulte, por exemplo, Salvi, 2017, Relatórios de Bioquímica e Biofísica 9: 13-21 (incorporado por referência para o ensino do promotor N-WASP) ou é o promotor induzido por hipoxia do Epo humano, veja Tsuchiya et al., 1993, J. Biochem. 113: 395-400 (incorporado por referência para a descrição do promotor induzido por hipoxia Epo) Em outras modalidades, o promotor é um promotor induzível por fármaco, por exemplo, um promotor que é induzido pela administração de rapamicina ou seus análogos. Veja, por exemplo, a descrição de promotores induzíveis à rapamicina nas publicações PCT WO094/18317, WO 96/20951, WO 96/41865, WO 99/10508, WO 99/10510, WO 99/36553 e WO 99/41258 e US 7.067.526, que são aqui incorporadas por referência na sua Íntegra para a descrição de promotores induzíveis a fármacos.
[00439] Em certas modalidades, os vetores virais aqui fornecidos compreendem um ou mais elementos reguladores que não sejam um promotor. Em certas modalidades, os vetores virais aqui fornecidos compreendem um realçador. Em certas modalidades, os vetores virais aqui fornecidos compreendem um repressor. Em certas modalidades, os vetores virais aqui fornecidos compreendem um íntron ou um íntron quimérico. Em certas modalidades, os vetores virais aqui fornecidos compreendem uma sequência de poliadenilação.
5.1.4 Peptídeos de Sinal
[00440] Em certas modalidades, os vetores aqui fornecidos compreendem componentes que modulam a liberação de proteínas. Em certas modalidades, os vetores virais aqui fornecidos compreendem um ou mais peptídeos sinal. Os peptídeos sinal também podem ser aqui referidos como "sequências líderes" ou "peptídeos líderes". Em certas modalidades, os peptídeos sinal permitem que o produto transgene alcance o acondicionamento adequado (por exemplo, glicosilação) na célula. Em certas modalidades, os peptídeos sinal permitem que o produto transgene alcance a localização adequada na célula. Em certas modalidades, os peptídeos sinal permitem que o produto transgene alcance a secreção da célula.
[00441] Existem dois métodos gerais para selecionar uma sequência de sinal para produção de proteínas em um contexto de terapia genética ou em cultura de células. Um método é usar um peptídeo sinal de proteínas homólogas à proteína que está sendo expressa. Por exemplo, um peptídeo sinal de anticorpo humano pode ser usado para expressar lgGs em CHO ou outras células. Outro método é identificar peptídeos sinal otimizados para as células hospedeiras específicas usadas para expressão. Os peptídeos sinal podem ser trocados entre diferentes proteínas ou mesmo entre proteínas de diferentes organismos, mas geralmente as sequências de sinal das proteínas secretadas mais abundantes desse tipo de célula são usadas para expressão de proteínas. Por exemplo, verificou-se que o peptídeo sinal de albumina humana, a proteina mais abundante no plasma, aumenta substancialmente a produção de proteínas produzidas em células de CHO. No entanto, certos peptídeos sinal podem reter a função e exercer atividade após serem clivados da proteína expressa como "funções pós- direcionamento". Assim, em modalidades específicas, o peptídeo sinal é selecionado dentre peptídeos sinal das proteínas mais abundantes secretadas pelas células usadas para expressão para evitar as funções pós-direcionamento. Em uma modalidade preferida, a sequência de sinal é fundida às sequências de cadeia pesada e leve. Uma sequência preferida é MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161) (veja, FIGURAS 2-9). Alternativamente, sequências de sinal que são apropriadas para expressão do mAb HuPTM ou Fab no olho (incluindo CNS), músculo ou fígado são fornecidas nas Tabelas 1, 2 e 3, respectivamente, abaixo. Tabela 1. Peptídeos sinal para expressão no tecido ocular/CNS
[Origem do Peptídeo Sinal — [SEQID NO: [ISequênia === | complementar Quimiotripsinogênio 2 Tabela 2. Peptídeos Sinal para expressão em células musculares. [Origem do Peptídeo Sinal [SEQID NO: [Sequência colágeno humana Fiems | |SERPINF1 Humano ——— 180 > /MoAatvLLLCIGALLGHSSE ===" || [SERPINE1 Humano ——— [181 >> MQOMSPALTCLVLGLALVYFGEGSA = = | |Catepsina DHumana ——— 182 = [MOPSSLLPLALCLLAARPASA =| [TIMP1 Humano — > Jf183 IMAPFEPLASGILLLLWLIABSRA — => [Fibronectina Humana ——f184 => [MLRGPGPGLLLLAVOCLGTAVPSTGASKSKR| sieets E A Complementar Humano [Catepsina Ll Humana —— [186 => [MNPTLILARFCLGIASA "úÚÀ| Fosfoproteína % rica em 188 MLLILLSVALLAFSSA amis A fis humana Proteína 1 relacionada com MWKRWLALALALVAVAWVRA [E Toteiame tamanco [ee Tabela 3. Peptídeo sinal para expressão em células do fígado.
MMA humano SERPINA1 Humana Humana Humana Humano
C2 Complementar 195 MGPLMVLFCLLFLYPGLADS Humano Proteína 2 relacionada ao 196 MWLLVSVILISRISSVGG Fator H Complementar Humano CFHR2 LO | Proteína 5 relacionada ao 197 MLLLFSVILISWVSTVGG Fator H Complementar Humano (CFHR5 Cadeia a de Fibrinogênio [198 MFSMRIVCLVLSVVGTAWT Humano (FGA;: Cadeia B de Fibrinogênio [199 MKRMVSWSFHKLKTMKHLLLLLLCVFLVKS Humano (FGB) Cadeia y de Fibrinogênio |/200 MSWSLHPRNLILYFYALLFLSSTCVA Humano (FGG Glicoproteína 201 MKSLVLLLCLAQLWGCHS a-2-HS Humana (AHSG Hemopexina (HPX) 202 MARVLGAPVALGLWSLCWSLAIA Humana
MKLITILFLCSRLLLSLT Proteína C de ligação à 204 MSLFPSLPLLLLSMVAASYS Manose Humana (MBL2 Plasminogênio Humano [Pos — jMENKEVWLLILLALKSÕOS
PLMN Protrombina Humana 206 MAHVRGLQLPGCLALAALCSLVHS Fator |l de Coagulação Fosfoproteína 24 207 MISRMEKMTMMMKILIMFALGMNYWSCSG Segregada Humana Anti- 208 MYSNVIGTVTSGKRKVYLLSLLLIGFWDCVTC trombina-lll Humana (SERPINC1) Serotransferrina Humana [oo — [MRLAVGALLVEAVLGLOLA
UU
5.1.5? Mensagens Policistrônicas - ligantes IRES e F2A e construções de scFv
[00442] Sítios de entrada de ribossomas internos. Uma única construção pode ser modificada para codificar as cadeias pesada e leve separadas por um ligante clivável ou IRES, de modo que os polipeptídeos separados das cadeias pesada e leve sejam expressos pelas células transduzidas. Em certas modalidades, os vetores virais aqui fornecidos fornecem mensagens policistrônicas (por exemplo, bicistrônicas). Por exemplo, a construção viral pode codificar as cadeias pesada e leve separadas por elementos do local interno de entrada do ribossoma (IRES) (para exemplos do uso de elementos IRES para criar vetores bicistrônicos, veja, por exemplo, Gurtu et a/., 1996, Biochem. Biophys, Res. Comm. 229 (|): 295-8, que é aqui incorporado por referência na sua íntegra). Os elementos IRES ignoram o modelo de varredura de ribossomas e começam a translação em sites internos. À utilização de IRES no AAV é descrita, por exemplo, em Furling et al, 2001, Gene Ther 8 (11): 854-73, que é aqui incorporado por referência na sua íntegra. Em certas modalidades, a mensagem bicistrônica está contida em um vetor viral com uma restrição no tamanho dos polinucleotídeos nele contidos. Em certas modalidades, a mensagem bicistrônica está contida em um vetor baseado em vírus AAV (por exemplo, um vetor baseado em AAV8, em AAV9 ou em AAVrh10).
[00443] Ligantes Furina-F2A. Em outras modalidades, os vetores virais aqui fornecidos codificam as cadeias pesadas e leves separadas por um ligante clivável, como os ligantes furina de autoclivagem furina/F2A (F/F2A) (Fang et a/., 2005, Nature Biotechnology 23: 584-590 e Fang, 2007, Mol Ther 15: 1153-9, cada um dos quais é incorporado por referência aqui em sua íntegra). Por exemplo, um ligante furina-F2A pode ser incorporado em um cassete de expressão para separar as sequências de codificação das cadeias pesada e leve, resultando em uma construção com a estrutura:
[00444] Líder - Cadeia pesada - Sítio furina - Sítio F2A - Líder - Cadeia leve - PoliA.
[00445] O sítio F2A, com a sequência de aminoácidos LLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 210) é autoprocessado, resultando em "clivagem" entre os resíduos finais de aminoácidos G e P. Ligantes adicionais que podem ser usados incluem, entre outros:
[00446] T2A:(GSG) EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 211);
[00447] —P2A:(GSG) ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 212);
[00448] E2A: (GSG) QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 213);
[00449] —F2A: (GSG) VKOTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 214).
[00450] Uma ligação peptídica é pulada quando o ribossoma encontra a sequência F2A na estrutura de leitura aberta, resultando no término da translação ou na translação continuada da sequência a jusante (a cadeia leve). Esta sequência de autoprocessamento resulta em uma série de aminoácidos adicionais no final do terminal C da cadeia pesada. No entanto, esses aminoácidos adicionais são então clivados pela célula hospedeira Furina nos sítios da furina, localizados imediatamente antes do sítio F2A e após a sequência da cadeia pesada, e posteriormente clivados pelas carboxipeptidases. A cadeia pesada resultante pode ter um, dois, três ou mais aminoácidos adicionais incluídos no C-terminal ou pode não ter esses aminoácidos adicionais, dependendo da sequência do ligante de Furina usado e da carboxipeptidase que cliva o ligante no C-terminal in vivo (Veja, por exemplo, Fang et a/., 17 April 2005, Nature Biotechnol. Advance Online Publication; Fang et a/l., 2007, Molecular Therapy 15(6): 1153-1159; Luke, 2012, Innovations in Biotechnology, Ch. 8, 161-186). Os ligantes de furina que podem ser utilizados compreendem uma série de quatro aminoácidos básicos, por exemplo, RKRR (SEQ ID NO: 215), RRRR (SEQ ID NO: 216), RRKR (SEQ ID NO: 217) ou RKKR (SEQ |D NO: 218). Uma vez que esse ligante é clivado por uma carboxipeptidase, os aminoácidos adicionais podem permanecer, de modo que zero, um, dois, três ou quatro aminoácidos adicionais possam permanecer no C- terminal da cadeia pesada, por exemplo, R, RR, RK, RKR, RRR, RRK, RKK, RKRR (SEQ ID NO: 215), RRRR (SEQ ID NO: 216), RRKR (SEQ ID NO: 217) ou RKKR (SEQ ID NO: 218). Em certas modalidades, quando o ligante é clivado por uma carboxipeptidase, nenhum aminoácido adicional permanece. Em certas modalidades, 0,5% a 1%, 1% a 2%, 5%, 10%, 15% ou 20% do anticorpo, por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno, população produzida pelas construções para uso nos métodos descritos aqui tem um, dois, três ou quatro aminoácidos restantes no C-terminal da cadeia pesada após a clivagem. Em certas modalidades, o ligante de furina tem a sequência RXK/RR, de modo que os aminoácidos adicionais no C-terminal da cadeia pesada sejam R, RX, RXK, RXR, RXKR ou RXRR, em que X é qualquer aminoácido, por exemplo, alanina (A). Em certas modalidades, nenhum aminoácido adicional pode permanecer no C-terminal da cadeia pesada.
[00451] Ligante de peptídeo flexível. Em algumas modalidades, uma única construção pode ser modificada para codificar as cadeias pesada e leve (preferivelmente os domínios variáveis da cadeia pesada e leve) separadas por um ligante de peptídeo flexível, como aqueles que codificam um scFv. Um ligante de peptídeo flexível pode ser composto de resíduos flexíveis como glicina e serina, de modo que os domínios adjacentes da cadeia pesada e da cadeia leve estejam livres para se moverem um em relação ao outro. A construção pode ser disposta de modo que o domínio variável da cadeia pesada esteja no N-terminal do scFv, seguido pelo ligante e depois pelo domínio variável da cadeia leve. Alternativamente, a construção pode ser disposta de tal modo que o domínio variável da cadeia leve esteja no N-terminal do scFv, seguido pelo ligante e depois pelo domínio variável da cadeia pesada. Ou seja, os componentes podem ser dispostos como NH2-V.-ligante-VH-COOH ou NH2-Vu-ligante-V.-COOH.
[00452] Em certas modalidades, um cassete de expressão aqui descrito está contido em um vetor viral com uma restrição no tamanho do(s) polinucleotídeo(s) nele contido(s). Em certas modalidades, o cassete de expressão está contido em um vetor baseado em vírus AAV.
Devido às restrições de tamanho de certos vetores, o vetor pode ou não acomodar as sequências de codificação para as cadeias pesadas e leves completas do anticorpo terapêutico, porém, pode acomodar as sequências de codificação das cadeias pesadas e leves de fragmentos de ligação ao antígeno, como as cadeias pesada e leve de um fragmento Fab ou F(ab'), ou de um scFv. Em particular, os vetores de AAV aqui descritos podem acomodar um transgene de aproximadamente 4,7 kilobases. Para construções como a da FIG. 1 que contém o promotor CB7, o íntron de B-actina de frango, sinal poliA da B-globina de coelho e ITRs, o anticorpo terapêutico codificado pode ser de aproximadamente 752 aminoácidos. A substituição de elementos de expressão menores permitiria a expressão de produtos proteicos maiores, como anticorpos terapêuticos de tamanho natural.
5.1.6 Regiões não transladadas
[00453] Em certas modalidades, os vetores virais aqui fornecidos compreendem uma ou mais regiões não transladadas (UTRs), por exemplo, UTRs 3 'e/ou 5. Em certas modalidades, as UTRs são otimizadas para o nível desejado de expressão de proteína. Em certas modalidades, as UTRs são otimizadas para a meia-vida do MRNA do transgene. Em certas modalidades, as UTRs são otimizadas para a estabilidade do MRNA do transgene. Em certas modalidades, as UTRs são otimizadas para a estrutura secundária do MRNA do transgene.
5.1.7 Repetições terminais invertidas
[00454] Em certas modalidades, os vetores virais aqui fornecidos compreendem uma ou mais sequências de repetição terminal invertida (ITR). As sequências de ITR podem ser usadas para acondicionar o cassete de expressão de gene recombinante no virion do vetor viral. Em certas modalidades, a ITR é de um AAV, por exemplo, AAV8 ou AAV2 (veja, por exemplo, Yan et a/l., 2005, J. Virol., 79 (1): 364-379; Patente Norte-americana No. 7.282, 199 B2, Patente Norte-americana No.
7.790.449 B2, Patente Norte-americana No. 8.318.480 B2, Patente Norte-americana No. 8.962.332 B2 e Pedido de Patente Internacional No. PCT/EP2014/076466, cada um dos quais é aqui incorporado por referência na sua íntegra).
[00455] Em certas modalidades, as ITRs modificadas usadas para produzir o vetor autocomplementar, por exemplo, scAAV, podem ser usadas (veja, por exemplo, Wu, 2007, Human Gene Therapy, 18 (2): 171-82, McCarty et al. , 2001, Gene Therapy, Vol 8, Number 16, páginas 1248-1254; e Patentes Norte-americanas Nos. 6.596.535, 7.125.717,e
7.456.683, cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua íntegra).
5.1.8 Transgenes
[00456] Os transgenes codificam um mAb HuPTM, como um anticorpo de tamanho natural ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, preferivelmente um fragmento Fab (um HuGlIyFab) ou um F(ab')) ou um scFv com base em um anticorpo terapêutico aqui descrito. Nas modalidades específicas, o mAb HUPTM ou fragmento de ligação ao antígeno, particularmente o HuGIyFab, são modificados para conter sítios de glicosilação adicionais no domínio de Fab (por exemplo, veja Courtois et a/., 2016, mAbs 8: 99-112, que é aqui incorporado por referência na sua Íntegra por descrição de sítios de hiperglicosilação em um domínio de Fab). FIG. 11 fornece alinhamentos das cadeias pesada e leve de Fab dos anticorpos terapêuticos aqui descritos e destaca em resíduos verdes que podem ser substituídos por uma asparagina ou, em alguns casos, uma serina, resultando em hiperglicosilação.
[00457] Em certas modalidades, os transgenes codificam um anticorpo de tamanho natural ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com a sequência de codificação das cadeias pesada e leve. Quando se utiliza um anticorpo de tamanho natural, pode ser utilizada uma construção que codifique um mAb modificado. Por exemplo, as lisinas C-terminais (-K) conservadas nos genes da cadeia pesada de todas as subclases de IgG humanas geralmente estão ausentes de anticorpos circulando no soro - as lisinas C-terminais são clivadas em circulação, resultando em uma população heterogênea de IgGs de circulação. (van den Bremer et al/.,, 2015, mAbs 7: 672-680). Nas construções vetorizadas para mAbs de tamanho natural, o DNA que codifica a lisina C-terminal (-K) ou glicina-lisina (-GK) do terminal Fc pode ser excluído para produzir um produto de anticorpo mais homogêneo in situ. (Veja, Hu et al., 2017 Biotechnol. Prog. 33: 786-794, que é aqui incorporado por referência na sua íntegra).
[00458] —Alternativamente, os fragmentos de ligação ao antígeno são vantajosamente usados. As FIGURAS 2A-2F, 3A-3E, 4A-4B, 5A-5D, 6, TA, 7B, 8A-8H e 9A-9B fornecem as sequências de aminoácido das cadeias pesada e leve dos fragmentos Fab e scFv dos anticorpos terapêutico (veja, também a Tabela 4, que fornece as sequências de aminoácido das cadeias pesada e leve dos anticorpos terapêuticos). O transgene pode compreender as sequências de nucleotídeo que codificam as sequências das cadeias pesada e leve usando sequências de nucleotídeo que codificam a porção de Fab da cadeia pesada mais a porção do domínio constante da cadeia pesada para o isótipo apropriado, como também descrito aqui e a cadeia leve. As sequências de nucleotídeos que são otimizadas por códons para expressão em células humanas que codificam as porções do fragmento Fab das cadeias pesada e leve dos anticorpos terapêuticos aqui descritos são fornecidas na Tabela 5. O transgene pode codificar um fragmento Fab usando sequências de nucleotídeo que codificam as sequências fornecidas em FIGURAS 2A-2F, 3A-3E, 4A-4B, 5A-5C, 6, 7A, 7B, 8A- 8H e 9A-9B, porém, não incluindo a porção da região de articulação na cadeia pesada que forma ligações de dissulfeto de intercadeia (isto é, a porção que contém a sequência CPPCPA (SEQ ID NO: 219)). As sequências de domínio variável da cadeia pesada que não contêm uma sequência CPPCP (SEQ ID NO: 220) da região de articulação no C- terminal não formarão ligações dissulfeto de intercadeia e, assim, formarão fragmentos Fab com as sequências correspondentes do domínio variável da cadeia leve, enquanto que aquelas sequências de domínio variável da cadeia pesada com uma porção da região de articulação no C-terminal que contém a sequência CPPCP (SEQ ID NO: 220) formarão ligações dissulfeto de intercadeia e, assim, formarão fragmentos Fab2. Por exemplo, em algumas modalidades, o transgene pode codificar um scFv compreendendo um domínio variável da cadeia leve e um domínio variável da cadeia pesada conectados por um ligante flexível entre (onde o domínio variável da cadeia pesada pode estar na extremidade de terminação N ou na extremidade de terminação C do scFv), por exemplo, como representado para brolucizumabe na FIG. 8D e EO6 na FIG. 5D.
Alternativamente, em outras modalidades, o transgene pode codificar fragmentos F(ab')) compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica a cadeia leve e a sequência de cadeia pesada que inclui pelo menos a sequência CPPCA (SEQ ID NO: 221) da região de articulação, como representado nas FIGURAS 2A-2F, 3A-3E, 4A-4B, 5A-5C, 6, 7A, 7B, 8A-8C, 8E-8H e 9A-9B, que representam várias regiões da região de articulação que podem ser incluídas no C-terminal da sequência da cadeia pesada.
Anticorpos antiarticulação preexistentes (AHA) podem causar imunogenicidade e reduzir a eficácia.
Assim, em certas modalidades, para o isótipo I9gG1, as extremidades C-terminais com D221 ou extremidades com uma mutação T225L ou com L242 podem reduzir a ligação a AHA. (Veja, por exemplo, Brezski, 2008, J Immunol! 181: 3183-92 e Kim, 2016, 8: 1536- 1547). Para IgG2, o risco de AHA é menor, pois a região de articulação do IgG2 não é tão suscetível à clivagem enzimática necessária para gerar AHA endógeno. (Veja, por exemplo, Brezski, 2011, MAbs 3: 558-
567).
[00459] Em certas modalidades, os vetores virais aqui fornecidos compreendem os seguintes elementos na seguinte ordem: a) uma sequência promotora constitutiva ou induzível (por exemplo, induzida por hipóxia ou induzida por rifamicina, e b) uma sequência que codifica o transgene (por exemplo, um HuGlyFab). Em certas modalidades, a sequência que codifica o transgene compreende várias ORFs separadas por elementos IRES. Em certas modalidades, os ORFs codificam os domínios das cadeias pesada e leve de HuUGIyFab. Em certas modalidades, a sequência que codifica o transgene compreende várias subunidades em uma ORF separada por sequências F/F2A. Em certas modalidades, a sequência compreendendo o transgene codifica os domínios das cadeias pesada e leve do HUGIyFab separado por uma sequência F/F2A. Em certas modalidades, a sequência compreendendo o transgene codifica os domínios variáveis das cadeias pesada e leve de HuGlyFab separados por um ligante de peptídeo flexível. Em certas modalidades, os vetores virais aqui fornecidos compreendem os seguintes elementos na seguinte ordem: a) uma sequência promotora constitutiva ou induzível e b) uma sequência que codifica o transgene (por exemplo, um HuGlyFab), em que o transgene compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica um peptídeo sinal, uma porção Fab da cadeia leve e pesada separada por um elemento IRES. Em certas modalidades, os vetores virais aqui fornecidos compreendem os seguintes elementos na seguinte ordem: a) uma sequência promotora constitutiva ou induzível por hipóxia, e b) uma sequência que codifica o transgene compreendendo um peptídeo sinal, uma sequência de cadeia leve e uma de cadeia pesada separada por uma sequência F/F2A clivável ou um ligante de peptídeo flexível.
[00460] Em certas modalidades, os vetores virais aqui fornecidos compreendem os seguintes elementos na seguinte ordem: a) uma primeira sequência de ITR, b) uma primeira sequência ligante, c) uma sequência promotora constitutiva ou induzível, d) uma segunda sequência ligante, e) uma sequência de íntron, f) uma terceira sequência ligante, gq) uma primeira sequência de UTR, h) uma sequência que codifica o transgene (por exemplo, um HuGlIyFab), i) uma segunda sequência de UTR, j) uma quarta sequência ligante, k) uma sequência poli A , |) uma quinta sequência ligante, e m) uma segunda sequência de ITR.
[00461] Em certas modalidades, os vetores virais aqui fornecidos compreendem os seguintes elementos na seguinte ordem: a) uma primeira sequência de ITR, b) uma primeira sequência ligante, c) uma sequência promotora constitutiva ou induzível, d) uma segunda sequência ligante, e) uma sequência de íntron, f) uma terceira sequência ligante, g) uma primeira sequência de UTR, h) uma sequência que codifica o transgene (por exemplo, HuGIyFab), i) uma segunda sequência de UTR, j) uma quarta sequência ligante, k) uma sequência poli A, 1) uma quinta sequência ligante e m) uma segunda sequência de ITR, em que o transgene compreende um sinal e em que o transgene codifica uma sequência de cadeia leve e uma de pesada separadas por uma sequência clivável de F/F2A .
5.1.9 Produção e teste de vetores
[00462] Os vetores virais aqui fornecidos podem ser produzidos usando células hospedeiras. Os vetores virais aqui fornecidos podem ser produzidos usando células hospedeiras de mamíferos, por exemplo, A5S49, WEHI, 10T1/2, BHK, MDCK, COS1, COS7, BSC 1, BSC 40, BMT 10, VERO, W138, HeLa, 293, Saos, C2C12, L, HT1080, HepG2, fibroblasto primário, hepatócito e células de mioblastos. Os vetores virais aqui fornecidos podem ser produzidos usando células hospedeiras de humanos, macacos, camundongos, ratos, coelhos ou hamsters.
[00463] As células hospedeiras são transformadas de maneira estável com as sequências que codificam o transgene e os elementos associados (isto é, o genoma do vetor) e os meios de produção de vírus nas células hospedeiras, por exemplo, os genes de replicação e capsídeo (por exemplo, os genes rep e cap do AAV). Para um método de produção de vetores de AAV recombinantes com capsídeos de AAV8, veja, Seção IV da Descrição Detalhada da Patente Norte- americana 7.282.199 B2, que é aqui incorporada por referência na sua íntegra. Os títulos de cópia do genoma dos referidos vetores podem ser determinados, por exemplo, por análise TAQMANº. Os vírions podem ser recuperados, por exemplo, por sedimentação de CsCl>.
[00464] & Alternativamente, sistemas de expressão de baculovírus em células de inseto podem ser usados para produzir vetores de AAV. Para uma revisão, veja Aponte-Ubillus et a/., 2018, Appl. Microbiol. Biotechnol. 102:1045-1054, que é aqui incorporado por referência na sua Íntegra para técnicas de fabricação.
[00465] Ensaios in vitro, por exemplo, ensaios de cultura de célula, podem ser usados para medir a expressão de transgene a partir de um vetor aqui descrito, indicando, por exemplo, a potência do vetor. Por exemplo, a Linhagem Celular PER.C6º (Lonza), uma linhagem celular derivada de células da retina embrionárias humanas ou células epiteliais de pigmento da retina, por exemplo, a linhagem celular epitelial de pigmento da retina hNTERT RPE-1 (disponível de ATCCº), pode ser usado para avaliar a expressão do transgene. Uma vez expressas, as características do produto expresso podem ser determinadas, incluindo a determinação dos padrões de glicosilação e sulfatação da tirosina associados ao HuGIyFab. Os padrões de glicosilação e métodos para determinar os mesmos são descritos na Seção 5.2.1, enquanto os padrões de sulfatação de tirosina e métodos para determinar os mesmos são descritos na Seção 5.2.2. Além disso, os benefícios resultantes da glicosilação/sulfatação do HuGlyFab expresso em células podem ser determinados usando ensaios conhecidos na técnica, por exemplo, os métodos descritos nas Seções 5.2.1 e 5.2.2.
5.1.10 Composições
[00466] As composições farmacêuticas adequadas para administração em indivíduos humanos compreendem uma suspensão do vetor recombinante em um tampão de formulação compreendendo um tampão aquoso fisiologicamente compatível, um tensoativo e excipientes opcionais. Esse tampão de formulação pode compreender um ou mais dentre um polissacarídeo, um tensoativo, polímero ou óleo.
5.2 N-GLICOSILAÇÃO, SULFATAÇÃO DE TIROSINA E O-
GLICOSILAÇÃO
[00467] A sequência de aminoácido (sequência primária) de HuGlyFabs e scFvs de HuPTMs aqui descritos compreende cada qual pelo menos um sítio no qual ocorre a N-glicosilação ou sulfatação de tirosina (veja, FIGURAS 2A-2F, 3A-3E, 4A-4B, 5A-5D, 6, 7A-7B, 8A-8H e 9A-9B para posições de glicosilação e/ou sulfatação nas sequências de aminoácido dos fragmentos Fab dos anticorpos terapêuticos).
5.2.1 N-Glicosilação Sítios de Glicosilação Reversa
[00468] A sequência canônica de N-glicosilação é conhecida na técnica como Asn-X-Ser (ou Thr), em que X pode ser qualquer aminoácido exceto Pro. No entanto, recentemente foi demonstrado que os resíduos de asparagina (Asn) de anticorpos humanos podem ser glicosilados no contexto de um motivo de consenso reverso, Ser (ou Thr)-X-Asn, em que X pode ser qualquer aminoácido exceto Pro. Veja, Valliere-Douglass et a/., 2009, J. Biol. Chem. 284: 32493-32506; e Valliere-Douglass et a/., 2010, J. Biol. Chem. 285: 16012-16022. Como aqui descrito, certos scFfvs de HuGlyFabs e HuPTM aqui descritos compreendem essas sequências de consenso reversa.
Sítios de Glicosilação não consenso
[00469] Além dos sítios de N-glicosilação reversos, foi recentemente demonstrado que os resíduos de glutamina (Glh) de anticorpos humanos podem ser glicosilados no contexto de um motivo não consenso, Gln-Gly-Thr. Veja, Valliere-Douglass et a/., 2010, J. Biol. Chem. 285: 16012-16022. Surpreendentemente, alguns dos fragmentos HuGlyFab aqui descritos compreendem essas sequências de não consenso. Além disso, a O-glicosilação compreende a adição de N- acetil-galactosamina a resíduos de serina ou treonina pela enzima. Foi demonstrado que os resíduos de aminoácido presentes na região de articulação dos anticorpos podem ser O-glicosilados. A possibilidade de O-glicosilação confere outra vantagem aos anticorpos terapêuticos aqui fornecidos, em comparação, por exemplo, com fragmentos de ligação ao antígeno produzidos em E. coli, novamente porque o E. coli naturalmente não contém mecanismos equivalentes aos usados na O- glicosilação humana. (Em vez disso, a O-glicosilação em E. coli foi demonstrada apenas quando a bactéria é modificada para conter mecanismos específicos de O-glicosilação. Veja, por exemplo, Farid- Moayer et a/., 2007, J. Bacteriol. 189: 8088-8098.) Sítios de N-Glicosilação Modificados
[00470] Em certas modalidades, um ácido nucleico que codifica um HuGlyFab ou scFv de HUTPM é modificado para incluir 1, 2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9, 10 ou mais sítios de N-glicosilação (incluindo a sequência de consenso de N-glicosilação canônica, sítio de N-glicosilação reversa e sítios de N-glicosilação não consenso) que normalmente seriam associados ao HuGIlyFab ou scFv HuUPTM (por exemplo, em relação ao número de sítios de N-glicosilação associados ao HuGIyFab ou scFv HuPTM em seu estado não modificado). Em modalidades específicas, a introdução de sítios de glicosilação é realizada pela inserção de sítios de N-glicosilação (incluindo a sequência de consenso de N-glicosilação canônica, sítio de N-glicosilação reversa e sítios de N-glicosilação não consenso) em qualquer lugar na estrutura primário do fragmento de ligação ao antígeno, desde que a referida introdução não afete a ligação do fragmento de ligação ao antígeno ao seu antígeno. A introdução de sítios de glicosilação pode ser realizada, por exemplo, adicionando novos aminoácidos à estrutura primária do fragmento de ligação ao antígeno ou, ao anticorpo do qual o fragmento de ligação ao antígeno é derivado (isto é, os sítios de glicosilação são adicionados, na íntegra ou em parte) ou mutando os aminoácidos existentes no fragmento de ligação ao antígeno, ou ao anticorpo do qual o fragmento de ligação ao antígeno é derivado, de modo a gerar os sítios de N-glicosilação (isto é, os aminoácidos não são adicionados ao antígeno anticorpo/fragmento de ligação ao antígeno, porém, os aminoácidos selecionados do fragmento/anticorpo de ligação ao antígeno são mutados de modo a formar os sítios de N-glicosilação). Aqueles versados na técnica reconhecerão que a sequência de aminoácido de uma proteína pode ser facilmente modificada usando abordagens conhecidas na técnica, por exemplo, abordagens recombinantes que incluem a modificação da sequência de ácido nucleico que codifica a proteína.
[00471] Emuma modalidade específica, um HuGIlyMab ou fragmento de ligação ao antígeno é modificado de modo que, quando expresso em células de mamíferos, como retina, CNS, fígado ou células musculares, pode ser hiperglicosilado. Veja Courtois et a/., 2016, mAbs 8: 99-112, que é aqui incorporado por referência na sua íntegra.
N-Glicosilação de fragmentos de ligação ao antígeno HuPTM
[00472] —Aocontrário dos fármacos de moléculas pequenas, produtos biológicos geralmente compreendem uma mistura de muitas variantes com diferentes modificações ou formas que podem ter uma potência, farmacocinética e/ou perfil de segurança, diferentes. Não é essencial que todas as moléculas produzidas na terapia genética ou no método de terapia proteica sejam totalmente glicosiladas e sulfatadas. Em vez disso, a população de glicoproteínas produzidas deve ter glicosilação suficiente (incluindo 2,6-sialilação) e sulfatação para demonstrar a eficácia. O objetivo do tratamento de terapia genética aqui fornecido pode ser, por exemplo, retardar ou interromper a progressão de uma doença ou condição anormal ou reduzir a gravidade de um ou mais sintomas associados à doença ou condição anormal.
[00473] “Quando um HuGlyFab ou scFv HUPTM é expresso em uma célula humana, os sítios de N-glicosilação do fragmento de ligação ao antígeno podem ser glicosilados com vários glicanos diferentes. N- glicanos de fragmentos de ligação ao antígeno foram caracterizados na técnica. Por exemplo, Bondt et al., 2014, Mol. & Cell. Proteomics
13.11:3029-3039 (aqui incorporado por referência na sua íntegra para a descrição de N-glicanos associados a Fab; veja também, FIG. 10) caracteriza glicanos associados a Fabs e demonstra que as porções Fab e Fc de anticorpos compreendem padrões de glicosilação distintos, com os glicanos de Fab sendo elevados na galactosilação, sialilação e bissecção (por exemplo, com GICNAc em bissecção), porém, baixos em fucosilação em relação aos glicanos de Fc. Como Bondt, Huang et al., 2006, Anal. Biochem. 349: 197-207 (aqui incorporado por referência na sua Íntegra para a descrição de N-glicanos associados a Fab) descobriu que a maioria dos glicanos de Fabs são sialilados. No entanto, no Fab do anticorpo examinado por Huang (que foi produzido em uma base de células de murino), os resíduos siálicos identificados eram o ácido N- glicolilheuramínico ("Neu5Gc" ou "NeuGc") (que não é natural para os seres humanos) em vez do ácido N-acetilneuramínico ("NeuSAc", o ácido siálico humano predominante). Além disso, Song et al., 2014, Anal. Chem. 86: 5661-5666 (aqui incorporado por referência na sua íntegra para a descrição de N-glicanos associados ao Fab) descreve uma biblioteca de N-glicanos associados a anticorpos disponíveis comercialmente.
[00474] Importante, quando o HuGlyFab ou scFv HuPTM são expressos em células humanas, a necessidade de produção in vitro em células hospedeiras procarióticas (por exemplo, E. coli) ou células hospedeiras eucarióticas (por exemplo, células de CHO ou células NSO) é contornada. Em vez disso, como um resultado dos métodos aqui descritos, os sítios de N-glicosilação do HUGIyFab ou scFv HuPTM são vantajosamente decorados com glicanos relevantes e benéficos para o tratamento de seres humanos. Tal vantagem é inatingível quando células de CHO, células NSO ou E. coli são utilizadas na produção de anticorpo/fragmento de ligação a antígeno, porque, por exemplo, as células de CHO (1) não expressam 2,6 sialiltransferase e, portanto, não podem adicionar o ácido 2,6 siálico durante a N-glicosilação; (2) pode adicionar Neu5Gc como ácido siálico em vez de Neu5Ac; e (3) também pode produzir um glicano imunogênico, o antígeno a-Gal, que reage com os anticorpos anti-a-Gal presentes na maioria dos indivíduos, que em altas concentrações podem desencadear anafilaxia; e porque (4) E. coli não contém naturalmente componentes necessários para a N- glicosilação.
[00475] Os ensaios para determinar o padrão de glicosilação de anticorpos, incluindo fragmentos de ligação ao antígeno, são conhecidos na técnica. Por exemplo, a hidrazinólise pode ser usada para analisar os glicanos. Primeiro, os polissacarídeos são liberados de sua proteína associada por incubação com hidrazina (o Ludger Liberate Hydrazinolysis Glycan Release Kit, Oxfordshire, UK pode ser usado). À hidrazina nucleofílica ataca a ligação glicosídica entre o polissacarídeo e a proteína veículo e permite a liberação dos glicanos ligados. Os grupos N-acetila são perdidos durante este tratamento e precisam ser reconstituídos por re-N-acetilação. Os glicanos também podem ser liberados usando enzimas como glicosidases ou endoglicosidases,
como PNGase F e Endo H, que clivam de maneira limpa e com menos reações colaterais que as hidrazinas. Os glicanos livres podem ser purificados em colunas de carbono e subsequentemente marcados na extremidade redutora com o fluoroforo 2-amino benzamida. Os polissacarídeos marcados podem ser separados em uma coluna GlycoSep-N (GL Sciences) de acordo com o protocolo de HPLC de Royle et al/., Anal Biochem 2002, 304 (1):70-90. O cromatograma de fluorescência resultante indica o comprimento do polissacarídeo e o número de unidades de repetição. Informações estruturais podem ser reunidas —coletando-se picos individuais e subsequentemente executando análises de MS/MS. Desse modo, a composição de monossacarídeos e a sequência da unidade de repetição podem ser confirmadas e, adicionalmente, é possível identificar a homogeneidade da composição de polissacarídeo. Picos específicos de baixo ou alto peso molecular podem ser analisados por MALDI-MS/MS e o resultado usado para confirmar a sequência de glicano. Cada pico no cromatograma corresponde a um polímero, por exemplo, glicano, consistindo em um determinado número de unidades e fragmentos de repetição, por exemplo, resíduos de açúcar. O cromatograma permite, assim, a medição do polímero, por exemplo, glicano, distribuição de comprimento. O tempo de eluição é uma indicação para o comprimento do polímero, enquanto a intensidade da fluorescência se correlaciona com a abundância molar do respectivo polímero, por exemplo, glicano. Outros métodos para avaliar glicanos associados a fragmentos de ligação ao antígeno incluem aqueles descritos por Bondt et al., 2014, Mol. & Cell. Proteomics 13.11:3029-3039, Huang et a/., 2006, Anal. Biochem. 349:197-207, e/ou Song et a/., 2014, Anal. Chem. 86: 5661-
5666.
[00476] Homogeneidade ou heterogeneidade dos padrões de glicano associados a anticorpos (incluindo fragmentos de ligação ao antígeno), no que se refere igualmente ao comprimento ou tamanho do glicano e aos números de glicanos presentes nos sítios de glicosilação, pode ser avaliada usando métodos conhecidos na técnica, por exemplo, métodos que medem o comprimento ou tamanho do glicano e o raio hidrodinâmico. A HPLC, como a exclusão por tamanho, a fase normal, a fase reversa e a HPLC de troca aniônica, bem como a eletroforese capilar, permite a medição do raio hidrodinâmico. Um número maior de sítios de glicosilação em uma proteína leva a uma maior variação no raio hidrodinâmico em comparação a um veículo com menos sítios de glicosilação. No entanto, quando cadeias únicas de glicano são analisadas, elas podem ser mais homogêneas devido ao comprimento mais controlado. O comprimento do glicano pode ser medido por hidrazinólise, SDS PAGE e eletroforese em gel capilar. Além disso, a homogeneidade também pode significar que certos padrões de uso de sítio de glicosilação mudam para uma faixa mais ampla/mais estreita. Esses fatores podem ser medidos pelo Glycopeptideo LC-MS/MS.
[00477] Em certas modalidades, os mAbs de HuPTM, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, também não contêm NeuGc e/ou a- Gal detectável. Por "NeuGc detectável" ou "a-Gal detectável" ou " não contém ou não tem NeuGc ou a-Gal" significa aqui que o mAb HUPTM ou fragmento de ligação ao antígeno, não contém porções NeuGc ou a- Gal detectáveis por métodos de ensaio padrão conhecidos na técnica. Por exemplo, NeuGc pode ser detectado por HPLC de acordo com Hara et al., 1989, "Highly Sensitive Determination of N-Acetyl- and N- Glycolylneuraminic Acids in Human Serum and Urine and Rat Serum by Reversed-Phase Liquid Chromatography with Fluorescence Detection.” J. Chromatogr., B: Biomed. 377, 111-119, que é aqui incorporado por referência para o método de detecção de NeuGc. Alternativamente, NeuGc pode ser detectado por espectrometria de massa. O a-Gal pode ser detectado usando um ELISA, veja, por exemplo, Galili et a/., 1998,
"A sensitive assay for measuring a-Gal epitope expression on cells by a monoclonal anti-Gal antibody". Transplantation. 65(8):1129-32, ou por espectrometria de massa, veja, por exemplo, Ayoub et al., 2013, "Correct “primary structure assessment and extensive glyco-profiling of cetuximab by a combination of intact, middle-up, middle-down and bottom-up ESI| and MALDI mass spectrometry techniques.” Landes Bioscience. 5 (5):699-710. Veja, também, as referências citadas em Platts-Mills et a/., 2015, "Anaphylaxis to the Carbohydrate Side-Chain Alpha-gal" Immunol Allergy Clin North Am. 35(2):247-260.
Benefícios da N-Glicosilação
[00478] A N-glicosilação confere numerosos benefícios ao HuUGlyFab ou scFv HuPTM aqui descrito. Tais benefícios são inatingíveis pela produção de fragmentos de ligação ao antígeno em E. coli, porque a E. coli não possui naturalmente componentes necessários para a N- glicosilação. Além disso, alguns benefícios são inatingíveis através da produção de anticorpos em, por exemplo, células de CHO (ou células de murino, como as células NSO), porque as células de CHO não possuem componentes necessários para a adição de certos glicanos (por exemplo, ácido siálico 2,6 e GICNAc em bisseção) e porque as linhagens celulares de CHO ou de murino adicionam ácido N-N- Glicolilheuramínico ("Neu5Gc" ou "NeuGc") que não é natural para humanos (e potencialmente imunogênico), em vez de ácido N- Acetilneuramínico ("NeuS5Ac"), o ácido siálico humano predominante. Veja, por exemplo, Dumont et a/.,, 2015, Critt Rev. Biotechnol. 36(6):1110-1122; Huang et a/.,, 2006, Anal. Biochem. 349:197-207 (NeuGc é o ácido siálico predominante em linhagens celulares de murino, como SP2/0 e NSO0); e Song et a/., 2014, Anal. Chem. 86:5661- 5666, cada um dos quais é aqui incorporado por referência na sua íntegra). Além disso, as células de CHO também podem produzir um glicano imunogênico, o antígeno a-Gal, que reage com os anticorpos anti-ca-Gal presentes na maioria dos indivíduos, que em altas concentrações podem desencadear anafilaxia. Veja, por exemplo, Bosques, 2010, Nat. Biotech. 28:1153-1156. O padrão de glicosilação humana do HuGlyFab do scFv HuUPTM aqui descrito deve reduzir a imunogenicidade do produto transgene e melhorar a eficácia.
[00479] “Enquanto sítios de glicosilação não canônicos geralmente resultam em glicosilação de baixo nível (por exemplo, 1-5%) da população de anticorpos, os benefícios funcionais podem ser significativos (Veja, por exemplo, van de Bovenkamp et a/., 2016, J. Immunol. 196: 1435-1441). Por exemplo, a glicosilação de Fab pode afetar a estabilidade, a meia-vida e as características de ligação de um anticorpo. Para determinar os efeitos da glicosilação de Fab na afinidade do anticorpo para seu alvo, qualquer técnica conhecida por alguém versado na técnica pode ser usada, por exemplo, ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA) ou ressonância de plasmônio superficial (SPR). Para determinar os efeitos da glicosilação de Fab na meia-vida do anticorpo, qualquer técnica conhecida por alguém versado na técnica pode ser usada, por exemplo, pela medição dos níveis de radioatividade no sangue ou nos órgãos de um indivíduo a quem um anticorpo radiomarcado foi administrado. Para determinar os efeitos da glicosilação de Fab na estabilidade, por exemplo, níveis de agregação ou desenvolvimento de proteínas, do anticorpo, qualquer técnica conhecida por alguém versado na técnica pode ser usada, por exemplo, calorimetria de varredura diferencial (DSC), cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), por exemplo, cromatografia líquida de alto desempenho por exclusão de tamanho (SEC-HPLC), eletroforese capilar, espectrometria de massa ou medição de turbidez.
[00480] A presença de ácido siálico no HuUGIyFab ou scFv HUPTM usado nos métodos aqui descritos pode afetar a taxa de depuração do HuGlyFab ou scFv HuPTM. Por conseguinte, os padrões de ácido siálico de um HuGIlyFab ou scfv HUPTM podem ser utilizados para gerar uma terapêutica com uma taxa de depuração otimizada. Os métodos para avaliar a taxa de depuração de fragmento de ligação ao antígeno são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Huang et al,, 2006, Anal. Biochem. 349:197-207.
[00481] Em outramodalidade específica, um benefício conferido pela N-glicosilação é a agregação reduzida. Os sítios de N-glicosilação ocupados podem mascarar resíduos de aminoácidos propensos à agregação, resultando em menor agregação. Esses sítios de N- glicosilação podem ser nativos de um fragmento de ligação ao antígeno aqui utilizado, ou modificados em um fragmento de ligação ao antígeno aqui utilizado, resultando em HuGlyFab ou scFv HUPTM que é uma tendência menos propensa à agregação quando expressa, por exemplo, expressa em células humanas. Os métodos de avaliação da agregação de anticorpos são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Courtois et a/., 2016, mAbs 8:99-112, que é aqui incorporado por referência na sua íntegra.
[00482] “Em .outramodalidade específica, um benefício conferido pela N-glicosilação é a imunogenicidade reduzida. Esses sítios de N- glicosilação podem ser nativos de um fragmento de ligação ao antígeno aqui utilizado, ou modificados em um fragmento de ligação ao antígeno aqui utilizado, resultando em HuGlyFab ou scfv HuPTM menos propenso à imunogenicidade quando expresso, por exemplo, expresso em células da retina humana, células do CNS humanas, células hepáticas humanas ou células musculares humanas.
[00483] “Em outramodalidade específica, um benefício conferido pela N-glicosilação é a estabilidade da proteína. A N-glicosilação de proteínas é bem conhecida por conferir estabilidade a elas, e métodos de avaliação da estabilidade de proteínas resultantes da N-glicosilação são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Sola e Griebenow, 2009,
J Pharm Sci., 98(4):1223-1245.
[00484] Em outramodalidade específica, um benefício conferido pela N-glicosilação é a afinidade de ligação alterada. É conhecido na técnica que a presença de sítios de N-glicosilação nos domínios variáveis de um anticorpo pode aumentar a afinidade do anticorpo pelo seu antígeno. Veja, por exemplo, Bovenkamp et a/., 2016, J. Immunol. 196: 1435-
1441. Os ensaios para medir a afinidade de ligação ao anticorpo são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Wright et a/., 1991, EMBO J. 10:2717-2723; e Leibiger et al., 1999, Biochem. J. 338: 529-538.
5.2.
[00485] A sulfatação da tirosina ocorre nos resíduos de tirosina (Y) com glutamato (E) ou aspartato (D) na posição +5 a -5 de Y e onde a posição -1 de Y é um aminoácido com carga neutra ou ácida, porém, não um aminoácido básico, por exemplo, arginina (R), lisina (K) ou histidina (H) que abole a sulfatação. Surpreendentemente, os HuGlyFabs e scFvs HuUPTM aqui descritos compreendem sítios de sulfatação de tirosina (veja, FIGURAS 2A-2F, 3 A-3E, 4A 4B, 5A-5D, 6, 7A-7B, 8A-8H e 9A-9B).
[00486] É importante ressaltar que os fragmentos de ligação ao antígeno sulfatados da tirosina não podem ser produzidos em E. coli, que naturalmente não possui as enzimas necessárias para a sulfatação da tirosina. Além disso, as células de CHO são deficientes para a sulfatação por tirosina - elas não são células secretoras e têm uma capacidade limitada para a sulfatação da tirosina pós-translacional. Veja, por exemplo, Mikkelsen & Ezban, 1991, Biochemistry 30:1533-
1537. Vantajosamente, os métodos aqui fornecidos requerem a expressão de Fab HUPTM em células humanas que são secretórias e têm capacidade para sulfatação da tirosina.
[00487] A sulfatação da tirosina é vantajosa por várias razões. Por exemplo, a sulfatação da tirosina do fragmento de ligação ao antígeno dos anticorpos terapêuticos contra alvos demonstrou-se que aumenta drasticamente a avidez do antígeno e da atividade. Veja, por exemplo, Loos et a/., 2015, PNAS 112:12675-12680, e Choe et a/., 2003, Cell 114:161-170. Os ensaios para detecção da sulfatação da tirosina são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Yang et a/., 2015, Molecules 20:2138-2164.
5.2.3 O-Glicosilação
[00488] O-glicosilação compreende a adição de N-acetil- galactosamina a resíduos de serinas ou treonina pela enzima. Foi demonstrado sqsue resíduos de aminoácido presentes na região de articulação de anticorpos podem ser O-glicosilados. Em certas modalidades, o HuGlyFab compreende toda ou uma parte de sua região de articulação, e desse modo é capaz de ser O-glicosilado quando expresso em células humanas. A possibilidade de O-glicosilação confere outra vantage ao HuGIyFab fornecido aqui, quando comparado a, por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno produzidos em E. coli, novamente por que o E. coli naturalmente não contém mecanismo equivalente àquele usado em O-glicosilação humana. (em vez disso, O- glicosilação em E. coli foi demonstrada apenas quando a bactéria é modificada para conter mecanismo de O-glicosilação específico. Veja, por exemplo, Farid-Moayer et al., 2007, J. Bacteriol. 189:8088-8098.) HuGlyFab O-glicosilado, em virtude de processamento de glicanas, compartilha características vantajosas com o HyGlyFab N-glicosilado (como acima descrito).
5.3 ANTICORPS TERAPÊUTICOS VETORIAIS
5.3.1 Construções de HuPTM Anti-Abeta e Formulações para Doença de Alzheimer
[00489] “Composições e métodos são descritos para a liberação de MAbs de HuPTM e fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo, tais como Fabs HuPTM, que se ligam aos peptídeos amiloide beta (AB ou
Abeta) derivados da proteína precursora amiloide que pode ter benefício no tratamento da Doença de Alzheimer (AD) e similares. Em modalidades — particulares, o mAb HuPTM é Aducanumabe, Crenezumabe, Gantenerumabe, ou BAN2401, ou um fragmento de ligação ao antígeno de um dos anteriormente mencionados. As sequências de aminoácido de fragmentos Fab destes antibióticos são fornecidos nas FIGURAS 2A-2C e 2F. A liberação pode ser realizada por meio de terapia genética - por exemplo, administrando um vetor viral ou outra construção de expressão de DNA codificando um mAb HUPTM de ligação a AB (ou um fragmento de ligação ao antígeno e / ou um derivado hiperglicosilado ou outro derivado, do mesmo) a pacientes (indivíduos humanos) diagnosticados com, ou tendo um ou mais sintomas de, AD, para criar um depósito permanente que continuamente supre o PTM humano, por exemplo, produto de transgene, glicosilado humano. Transgenes
[00490] São fornecidos vetores recombinantes contendo um transgene codificando um mMAb HuPTM ou Fab HuPTM (ou outro fragmento de ligação ao antígeno do mAb HuPTM) que se liga a AB que pode ser administrado para liberar o mAb HuPTM ou fragmento de ligação ao antígeno em um paciente. O transgene é um ácido nucleico compreendendo as sequências de nucleotídeo codificando um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo que se liga a AB, tal como Aducanumabe, Crenezumabe, Gantenerumabe, ou BAN2401, ou variantes dos mesmos, como aqui detalhado. O transgene pode também codificar um fragmento de ligação a antígeno anti-AB que contém sítios de glicosilação adicionais (por exemplo, veja Courtois et al., 2016, mAbs 8: 99-112 que é incorporado aqui por referência em sua íntegra).
[00491] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-AB compreende as sequências de nucleotídeo codificando as cadeias pesadas e leves da porção Fab de Aducanumabe (tendo sequências de aminoácido de SEQ ID NOs. 1 e 2, respectivamente, veja a Tabela 4 e FIG 2A). As sequências de nucleotídeo podem ser otimizadas por códon para expressão em células humanas e podem, por exemplo, compreender as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NO: 101 (codificando uma porção Fab de cadeia pesada de Aducanumabe) e SEQ ID NO: 102 (codificando uma porção Fab de cadeia leve de Aducanumabe) como mencionado na Tabela 5. As sequências de cadeias pesada e leve ambas têm uma sequência sinal ou líder no N-terminal apropriado para expressão e secreção em células humanas, em particular, células do CNS humano. A sequência sinal pode ter a sequência de aminoácido de MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161) ou uma das sequências encontradas na Tabela 1 supra.
[00492] —Alémdas sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve, o transgenes pode compreender, no C-terminal da sequência de domínio variável de cadeia pesada, toda ou uma porção da região de articulação. Em modalidades específicas, o domínio de ligação ao antígeno anti-AB tem um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 1 com sequência de região de articulação adicional iniciando após o aspartato C-terminal (D), contém toda ou uma porção da sequência de aminoácido KTHTCPPCPAPELLGG (SEQ I|D NO: 222), e especificamente, KTHL (SEQ ID NO: 223), KTHT (SEQ ID NO: 224), KTHTCPPCPA (SEQ ID NO: 225), KTHLCPPCPA (SEQ ID NO: 226), KTHTCPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 227) ou KTHLCPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 228) como mencionado na FIG 2A. Estas regiões de articulação podem ser codificadas por sequências de nucleotídeo na extremidade 3' de SEQ ID NO: 1 pela região de articulação codificando as sequências mencionadas na
Tabela 4 (SEQ ID NO: 101).
[00493] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-AB codifica um fragmento de ligação ao antígeno AB que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 2. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-AB codifica fragmento de ligação ao antígeno que AB compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-AB codifica um fragmento de ligação ao antígeno que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 2 e uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 1. Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno AB compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 2A) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia pesada de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11 A. Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno AB compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:2 com 1, 2, 3,4, 5,6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 2A) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia leve de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11B.
[00494] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-AB codifica um Fab de Aducanumabe hiperglicosildo, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve de SEQ ID NOs: 1 e 2, respectivamente, com uma ou mais das seguintes mutações: T119N (cadeia pesada), Q160N ou Q1608S (cadeia leve), e / ou E195N (cadeia leve) (veja as FIGURAS 11A (cadeia pesada) e B (cadeia leve)).
[00495] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-AB codifica um fragmento de ligação ao antígeno e compreende as sequências de nucleotídeo codificando as seis CDRs de Aducanumabe que são sublinhadas nas sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve de FIG.2A que são espaçadas entre regiões de estrutura, geralmente regiões de estrutura humanas, e associadas com domínios constantes dependendo da forma da molécula de ligação ao antígeno, como é conhecido na técnica para formar o domínio variável de cadeia pesada e / ou leve de um anticorpo anti-AB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00496] Em certas modalidades, o anti-AB transgene de fragmento de ligação ao antígeno compreende as sequências de nucleotídeo codificando as cadeias pesadas e leves da porção Fab de
Crenezumabe (tendo sequências de aminoácido de SEQ ID NOs. 3 e 4, respectivamente, veja a Tabela 4 e FIG. 2B). As sequências de nucleotídeo podem ser otimizadas por códon para expressão em células humanas e podem, por exemplo, compreender as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NO: 103 (codificando uma porção Fab de cadeia pesada de Crenezumabe) e SEQ ID NO: 104 (codificando uma porção de Fab de cadeia leve de Crenezumabe) como mencionado na Tabela
5. As sequências de cadeias pesada e leve ambas têm uma sequência sinal ou líder no N-terminal apropriado para expressão e secreção em células humanas, em particular, células do CNS humano. A sequência sinal pode ter a sequência de aminoácido de MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161) ou uma sequência sinal encontrada na Tabela 1.
[00497] Além das sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve, o transgenes pode compreender, no C-terminal da sequência de domínio variável de cadeia pesada, toda ou uma porção da região de articulação. Em modalidades específicas, o domínio de ligação ao antígeno anti-AB tem um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 3 com sequência de região de articulação adicional iniciando após a tirosina (Y) C-terminal, contém toda ou uma porção da sequência de aminoácido GPPCPPCPA (SEQ ID NO: 229) ou GPPCPPCPAPEFLGGPSVFL (SEQ ID NO: 230) como mencionado na FIG 2B. Estas regiões de articulação podem ser codificadas por sequências de nucleotídeo na extremidade 3' de SEQ ID NO: 3 pela região de articulação codificando as sequências mencionadas na Tabela 5 (SEQ ID NO: 103).
[00498] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-AB codifica fragmento de ligação ao antígeno AB que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%,
91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 4. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-AB codifica fragmento de ligação ao antígeno AB que compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 3. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-AB codifica um fragmento de ligação ao antígeno que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 4 e uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 3. Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno AB compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3 com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 2B) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia pesada de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11 A.
Em modalidades específicas, o Fragmento de ligação ao antígeno AB compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 com 1, 2,3,4,5,6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 2B) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia leve de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11B.
[00499] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-AB codifica um Fab de Crenezumabe hiperglicosilado, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve de SEQ ID NOs: 3 e 4, respectivamente, com uma ou mais das seguintes mutações: T107N (cadeia pesada), Q165N ou Q165S (cadeia leve), e / ou E200N (cadeia leve) (veja as FIGURAS 11A (cadeia pesada) e B (cadeia leve)).
[00500] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-AB codifica um fragmento de ligação ao antígeno e compreende as sequências de nucleotídeo codificando as seis CDRs de Crenezumabe que são sublinhadas nas sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve de FIG. 2B que são espaçadas entre regiões de estrutura, geralmente regiões de estrutura humanas, e associadas com domínios constantes dependendo da forma da molécula de ligação ao antígeno, como é conhecido na técnica para formar o domínio variável de cadeia pesada e / ou leve de um anticorpo anti-AB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00501] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-AB compreende as sequências de nucleotídeo codificando as cadeias pesadas e leves da porção Fab de Gantenerumabe (tendo sequências de aminoácido de SEQ IDNOs. 5 e 6, respectivamente, veja a Tabela 4 e FIG. 2C). As sequências de nucleotídeo podem ser otimizadas por códon para expressão em células humanas e podem, por exemplo, compreender as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NO: 105 (codificando uma porção de Fab de cadeia pesada de Gantenerumabe) e SEQ ID NO: 106 (codificando uma porção Fab de cadeia leve de Gantenerumabe) como mencionado na Tabela 5. As sequências de cadeias pesada e leve ambas têm uma sequência sinal ou líder no N-terminal apropriado para expressão e secreção em células humanas, em particular, células do CNS humano. A sequência sinal pode ter a sequência de aminoácido de MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161) ou uma sequência sinal encontrada na Tabela 1.
[00502] Além das sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve, o transgenes pode compreender, no C-terminal da sequência de domínio variável de cadeia pesada, toda ou uma porção da região de articulação. Em modalidades específicas, o domínio de ligação ao antígeno anti-AB tem um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 5 com sequência de região de articulação adicional iniciando no aspartato (D) C-terminal, contém toda ou uma porção da sequência de aminoácido KTHTCPPCPAPELLGG (SEQ |D NO: 22) e especificamente, KTHL (SEQ ID NO: 223), KTHT (SEQ ID NO: 224), KTHTCPPCPA (SEQ ID NO: 225), KTHLCPPCPA (SEQ ID NO: 226), KTHTCPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 227) ou KTHLCPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 228) como mencionado na FIG 2C. Estas regiões de articulação podem ser codificadas por sequências de nucleotídeo na extremidade 3' de SEQ ID NO: 5 pela região de articulação codificando as sequências mencionadas na Tabela 5 (SEQ ID NO: 105).
[00503] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-AB codifica fragmento de ligação ao antígeno que AB compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 6. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-AB codifica fragmento de ligação ao antígeno que AB compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 5. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-AB codifica um fragmento de ligação ao antígeno que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 6 e uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 294%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 5. Em modalidades específicas, o Fragmento de ligação ao antígeno AB compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:5 com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 2C) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia pesada de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11 A.
Em modalidades específicas, o Fragmento de ligação ao antígeno AB compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 6 com 1,2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG.
2C) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia leve de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11B.
[00504] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-AB codifica um Fab de Gantenerumabe hiperglicosilado, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve de SEQ ID NOs: 5 e 6, respectivamente, com uma ou mais das seguintes mutações: L121N (cadeia pesada), Q161N ou Q1618 (cadeia leve), e / ou E196N (cadeia leve) (veja as FIGURAS 11A (cadeia pesada) e B (cadeia leve)).
[00505] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-AB codifica um fragmento de ligação ao antígeno e compreende as sequências de nucleotídeo codificando as seis CDRs de Gantenerumabe que são sublinhadas nas sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve de FIG. 2C que são espaçadas entre regiões de estrutura, geralmente regiões de estrutura humanas, e associadas com domínios constantes dependendo da forma da molécula de ligação ao antígeno, como é conhecido na técnica para formar o domínio variável de cadeia pesada e / ou leve de um anticorpo anti-AB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00506] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-AB compreende as sequências de nucleotídeo codificando as cadeias pesadas e leves da porção Fab de BAN2401 (tendo sequências de aminoácido de SEQ ID NOs. 57 e 58, respectivamente, veja a Tabela 4 e FIG 2F). As sequências de nucleotídeo podem ser otimizadas por códon para expressão em células humanas e podem, por exemplo, compreender as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NO: 157 (codificando uma porção Fab de cadeia pesada de BAN2401) e SEQ ID NO: 158 (codificando uma porção de Fab de cadeia leve de BAN2401) como mencionado na Tabela 5. As sequências de cadeias pesada e leve ambas têm uma sequência sinal ou líder no N-terminal apropriado para expressão e secreção em células humanas, em particular, células do CNS humano. A sequência sinal pode ter a sequência de aminoácido de MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161) ou uma das sequências encontradas na Tabela 1 supra.
[00507] Além das sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve, o transgene pode compreender, no C-terminal da sequência de domínio variável de cadeia pesada, toda ou uma porção da região de articulação. Em modalidades específicas, o domínio de ligação ao antígeno anti-AB tem um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 57 com sequência de região de articulação adicional iniciando após o aspartato C-terminal (D), contém toda ou uma porção da sequência de aminoácido KTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 222) ou KTHLCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 239), e especificamente, KTHL (SEQ ID NO: 223), KTHT (SEQ ID NO: 224), KTHTCPPCPA (SEQ ID NO: 225), ou KTHLCPPCPA (SEQ ID NO: 226), como mencionado na FIG 2E Estas regiões de articulação podem ser codificadas por sequências de nucleotídeo na extremidade 3' de SEQ ID NO: 57 pela região de articulação codificando as sequências mencionadas na Tabela 4 (SEQ ID NO: 157).
[00508] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-AB codifica um fragmento AB de ligação ao antígeno que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 58. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-AB codifica fragmento de ligação ao antígeno que AB compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ |D NO: 57. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-AB codifica um fragmento de ligação ao antígeno que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 58 e uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 57. Em modalidades específicas, o Fragmento de ligação ao antígeno AB compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 57 com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 2F) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia pesada de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11 A.
Em modalidades específicas, o Fragmento de ligação ao antígeno AB compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:58 com 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 2F) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia leve de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11B.
[00509] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-AB codifica um Fab de BAN2401 hiperglicosilado, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve de SEQ ID NOs: 57 e 58, respectivamente, com uma ou mais das seguintes mutações: TI 19N (cadeia pesada), Q165N ou Q165S (cadeia leve), e / ou E200N (cadeia leve) (veja as FIGURAS 11A (cadeia pesada) e B (cadeia leve)).
[00510] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-AB codifica um fragmento de ligação ao antígeno e compreende as sequências de nucleotídeo codificando as seis CDRs de BAN2401 que são sublinhadas nas sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve de FIG.2F que são espaçadas entre regiões de estrutura, geralmente regiões de estrutura humanas, e associadas com domínios constantes dependendo da forma da molécula de ligação ao antígeno, como é conhecido na técnica para formar o domínio variável de cadeia pesada e / ou leve de um anticorpo anti-AB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Métodos de Terapia genética
[00511] São fornecidos métodos de tratamento de indivíduos humanos de AD por administração de um vetor viral contendo um transgene codificando um anticorpo anti-AB, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. O anticorpo pode ser Aducanumabe, Crenezumabe, Gantenerumabe, ou BAN2401 e é preferivelmente um fragmento Fab do mesmo, ou outro fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em certas modalidades, o paciente foi diagnosticado com e / ou tem sintomas associados com AD prodrômico, isto é, um comprometimento cognitivo brando associado com AD precoce ou mesmo pre-AD. Vetores recombinantes para a liberação do transgene são descritos na Seção 5.4.1 e mostrados nas FIGS 2A-C. Tais vetores devem ter um tropismo para células do CNS humano e podem incluir rAAV não replicante, particularmente aqueles portadores de um capsídeo de AAV9, AAVrhlO, AAVrh20, AAVrh39, ou AAVcy5. Os vetores recombinantes podem ser administrados de qualquer maneira de modo que o vetor recombinante entre no CNS, preferivelmente introduzindo o vetor recombinante no fluido espinhal cerebral (CSF). Veja a Seção 5.5.1 para detalhes com respeito aos métodos de tratamento.
[00512] Indivíduos aos quais a tal terapia genética é administrada podem ser aqueles que respondem à terapia anti-AB. Em modalidades particulares, os métodos abrangem o tratamento de pacientes que foram diagnosticados com AD, ou têm um ou mais sintomas associados com eles, e identificados como responsivos ao tratamento com um anticorpo anti-AB ou considerados um bom candidato para terapia com um anticorpo anti-AB. Em modalidades específicas, os pacientes foram anteriormente tratados com Aducanumabe, Crenezumabe, Gantenerumabe, ou BAN2401, e descobriu-se serem responsivos a um ou mais of Aducanumabe, Crenezumabe, Gantenerumabe, ou BAN2401. Para determinar a capacidade de resposta, o anticorpo anti- AB ou produto de transgene de fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, produzido em cultura de célula humana, biorreatores, etc.) podem ser administrados diretamente ao indivíduo. Anticorpos Pós-Translacionalmente Modificados Humanos
[00513] A produção do Fab HUPTM ou mAb de GuPTM anti-AB, deve resultar em uma molécula “biobetter” para o tratamento de AD realizado por meio de terapia genética - por exemplo, administrando um vetor viral ou outra construção de expressão de DNA codificando o Fab HUPTM anti-AB, intratecalmente, particularmente administração intracisternal ou lombar, ou administração intravenosa a indivíduos humanos (pacientes) diagnosticados com ou tendo um ou mais sintomas de AD, para criar um depósito permanente no CNS que continuamente supre o produto de transgene sulfatado, pós-translacionalmente modificado totalmente humano, por exemplo, glicosilado humano produzido por células do CNS transduzidas.
[00514] A construção de cDNA para o mAb HuUPTM anti-AB ou Fab HuPTM anti-AB deve incluir um peptídeo sinal que assegura processamento co- e pós-translacional apropriado (glicosilação e sulfação de proteína) pelas células do CNS transduzidas. Por exemplo, a sequência sinal pode ser MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161).
[00515] Como uma alternativa, ou um tratamento adicional para terapia genética, o Fab HUPTM ou mAb HuPTM anti-AB pode ser produzido em linhagens de células humanas por tecnologia de DNA recombinante, e administrado a pacientes diagnosticados com AD, ou para quem a terapia para AD é considerada apropriada.
[00516] Em modalidades específicas, o mAb HuPTM anti-AB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem cadeias pesadas e leves com as sequências de aminoácido das porções de Fab de cadeias pesada e leve de Aducanumabe como mencionado na FIG. 2A (com sítios de glicosilação de asparaginase (N) não consenso realçados em verde, sítios de glicosilação de glutamina (Q) realçados em azul, e sítios de sulfação Y realçados em amarelo) has glicosilação, particularmente uma 2, ,6-sialilação, em uma ou mais das porções de aminoácido N166 da cadeia pesada (SEQ ID NO:1) ou N158 e / ou N210 da cadeia leve (SEQ ID NO: 2). Alternativamente ou em adição a, o MAb HuUPTM ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com as sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve Aducanumabe tem um grupo de sulfação em Y 94 e/ou Y95 da cadeia pesada (SEQ ID NO: 1) e/ ou Y86 e / ou Y87 da cadeia leve (SEQ ID NO: 2). Em outras modalidades, o mAb HuPTM anti-AB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não contém quaisquer porções de NeuGc detectáveis (por exemplo, quando detectado por ensaios conhecidos na técnica, por exemplo, aquelas descritas na Seção 5.2, infra) e / ou não contém quaisquer porções alfa-Gal detectáveis (por exemplo quando detectada por ensaios conhecidos na técnica, por exemplo, aquelas descritas na Seção 5.2 infra).
[00517] Em modalidades específicas, o mAb HuPTM anti-AB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem cadeias pesadas e leves com as sequências de aminoácido das porções de Fab de cadeias pesada e leve de Crenezumabe como mencionado na FIG. 2B (com sítios de glicosilação de asparaginase (N) não consenso realçados em verde, sítios de glicosilação de glutamina (Q) realçados em azul, e sítios de sulfação Y realçados em amarelo) has glicosilação, particularmente uma 2, 6-sialilação, em uma ou mais das porções de aminoácido N52, Q104, N154, e / ou N196 da cadeia pesada (SEQ ID NO: 3) ou Q105, N163 e / ou N215 da cadeia leve (SEQ ID NO: 4). Alternativamente ou em adição a, o MAb HuUPTM ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com as sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve Crenezumabe tem um grupo de sulfação em Y94 e/ou Y95 da cadeia pesada (SEQ ID NO: 3) e / ou Y91 e / ou Y92 da cadeia leve (SEQ ID NO: 4). Em outras modalidades, o mAb HuUPTM anti-AB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não contém quaisquer porções de NeuGc detectáveis e / ou não contém quaisquer porções alfa-Gal detectáveis.
[00518] Em modalidades específicas, o mAb HuPTM anti-AB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem cadeias pesadas e leves com as sequências de aminoácido das porções de Fab de cadeias pesada e leve de Gantenerumabe como mencionado na FIG. 2C (com sítios de glicosilação de asparaginase (N) em magenta, sítios de glicosilação de asparaginase (N) não consenso realçados em verde, sítios de glicosilação de glutamina (Q) realçados em azul, e sítios de sulfação Y realçados em amarelo) tem uma glicosilação, particularmente uma 2,6-sialilação, em uma ou mais das porções de aminoácido N52, N77, Q118 e / ou N168 da cadeia pesada (SEQ ID NO: 5) ou Q101, N159 e / ou N211 da cadeia leve (SEQ ID NO: 6). Alternativamente ou em adição a, o mAb HuPTM ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com as sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve Gantenerumabe tem um grupo de sulfação em Y94 e/ou Y95 da cadeia pesada (SEQ ID NO: 5) e / ou Y87 e/ou Y88 da cadeia leve (SEQ ID NO: 6). Em outras modalidades, o mAb HuPTM anti-AB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não contém quaisquer porções de NeuGc detectáveis e / ou não contém quaisquer porções alfa-Gal detectáveis.
[00519] Em modalidades específicas, o mAb HuPTM anti-AB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem cadeias pesadas e leves com as sequências de aminoácido das porções de Fab de cadeias pesada e leve de BAN2401 como mencionado na FIG. 2F (com sítios de glicosilação de asparaginase (N) não consenso realçados em verde, sítios de glicosilação de glutamina (Q) realçados em azul, e sítios de sulfação Y realçados em amarelo) tem uma glicosilação, particularmente uma 2,6-sialilação, em uma ou mais das porções de aminoácido Q116 e / ou N166 da cadeia pesada (SEQ ID NO: 57) ou N163 e / ou N215 da cadeia leve (SEQ ID NO: 58). Alternativamente ou em adição a, o MAb HuPTM ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com as sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve BAN2401 tem um grupo de sulfação em Y94 e / ou Y95 da cadeia pesada (SEQ ID NO: 57) e / ou Y91 da cadeia leve (SEQ ID NO: 58). Em outras modalidades, o mAb HUPTM anti-AB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não contém quaisquer porções de NeuGc detectáveis e / ou não contém quaisquer porções alfa-Gal detectáveis.
[00520] Em certas modalidades, o Fab ou mAb HuPTM é terapeuticamente eficaz e é pelo menos 0,5%, 1% ou 2% 2,6 sialilado e / ou sulfatado e pode ser pelo menos 5%, 10% ou mesmo 50% ou 100%) de 2,6 sialilação glicosilado e / ou sulfatado. O objetivo de tratamento de terapia genética fornecido aqui é retardar ou interromper a progressão de AD, comprometimento cognitivo particular. A eficácia pode ser monitorada medindo uma redução em formação de placas e / ou uma melhora em função cognitiva ou uma redução no declínio em função cognitiva.
[00521] “Combinações de liberação do mAb HuPTM anti-AB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, para o CNS acompanhadas por liberação de outros tratamentos disponíveis são abrangidas pelos métodos fornecidos aqui. Os tratamentos adicionais podem ser administrados antes, concomitantemente ou subsequente ao tratamento de terapia genética. Tratamentos disponíveis para AD que podem ser combinados com a terapia genética fornecida aqui incluem, porém não estão limitados à ARICEPTO (donepezil), RAZADYNEGO (galantamina), NAMENDAZG (rivastigmina), e NAMZARICO (donepezila e memantina), para citar alguns, e administração com anti-Ap agents, incluindo, porém não limitados a Aducanumabe, Crenezumabe, Gantenerumabe, ou BAN2401, ou agentes anti-Tau, tal como aTAU.
5.3.2. Construções de HuPTM Anti-Tau e Formulações para Tauopatias como a Doença de Alzheimer, Encefalopatia traumática crônica, Paralisia supranuclear progressiva, ou Demência Frontotemporal.
[00522] “Composições e métodos são descritos para a liberação de MAbs de HuPTM e fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo, tais como Fabs HuPTM, que se ligam à proteína Tau (Tau), tal como Tau monomérica, Tau oligomérica, Tau não fosforilada, e Tau fosforilado, que pode ter benefício no tratamento de doença de Alzheimer (AD), Encefalopatia traumática crônica (CTE), Complexo de Pick, tauopatia relacionada com a idade primária, paralisia supranuclear progressiva (PSP), demência frontotemporal (FD), e outras tauopatias. Em modalidades particulares, o mAb HUPTM é um anticorpo tendo os fragmentos de Fab fornecidos nas FIGURAS 2D (referidos aqui como "aTAU") ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. A liberação pode ser realizada por meio de terapia genética - por exemplo, administrando um vetor viral ou outra construção de expressão de DNA codificando um mAb HuPTM de ligação a Tau (ou um fragmento de ligação ao antígeno e / ou um derivado hiperglicosilado ou outro derivado, do mesmo) a pacientes (indivíduos humanos) diagnosticados com, ou tendo um ou mais sintomas de, AD, CTE, PSP, FD, ou outras tauopatias, para criar um depósito permanente que continuamente supre o PTM humano, por exemplo, produto de transgene, glicosilado humano.
Transgenes
[00523] São fornecidos vetores recombinantes contendo um transgene codificando um mMAb HuPTM ou Fab HuPTM (ou outro fragmento de ligação ao antígeno do mAb HuPTM) que se liga a Tau que pode ser administrado para liberar o mAb HuUPTM ou fragmento de ligação ao antígeno em um paciente. O transgene é um ácido nucleico compreendendo as sequências de nucleotídeo codificando um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo que se liga a Tau, tal como aTAU ou variantes do mesmo como detalhado aqui. O transgene pode também codificar o fragmento de ligação ao antígeno anti-Tau que contém sítios de glicosilação adicionais (por exemplo, veja Courtois et al., 2016, mAbs 8: 99-112 que é incorporado aqui por referência em sua íntegra).
[00524] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-Tau compreende as sequências de nucleotídeo codificando as cadeias pesadas e leves da porção Fab de aTAU (tendo sequências de aminoácido de SEQ ID NOs. 53 e 54, respectivamente, veja a Tabela 4 e FIG 2D). As sequências de nucleotídeo podem ser otimizadas por códon para expressão em células humanas e podem, por exemplo, compreender as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NO: 153 (codificando a uma porção de Fab de cadeia pesada aTAU) e SEQ ID NO: 154 (codificando a aTAU light chain Fab portion) como mencionado na Tabela 5. As sequências de cadeias pesada e leve ambas têm uma sequência sinal ou líder no N-terminal apropriado para expressão e secreção em células humanas, em particular, células do CNS humano. A sequência sinal pode ter a sequência de aminoácido de MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161) ou uma das sequências encontradas na Tabela 1 supra.
[00525] Além das sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve, o transgenes pode compreender, no C-terminal da sequência de domínio variável de cadeia pesada, toda ou uma porção da região de articulação. Em modalidades específicas, o domínio de ligação ao antígeno anti-Tau tem um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 53 com sequência de região de articulação adicional iniciando após o aspartato C-terminal (D), contém toda ou uma porção da sequência de aminoácido GPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 231), e especificamente, —GPPCPPCPA (SEQ I|D NO 229) ou GPPCPPCPAPEFLGGPSVFL (SEQ ID NO: 230) como mencionado na FIG 2D. Estas regiões de articulação podem ser codificadas por sequências de nucleotídeo na extremidade 3' de SEQ ID NO: 53 pela região de articulação codificando as sequências mencionadas na Tabela 4 (SEQ ID NO: 153).
[00526] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-Tau codifica um fragmento de ligação ao antígeno de Tau que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%,
89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 54. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-Tau codifica a fragmento de ligação ao antígeno de Tau que compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 53. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-Tau codifica um fragmento de ligação ao antígeno que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 294%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 54 e uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 53. Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno Tau compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 53 com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 2D) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia pesada de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11 A.
Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno Tau compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:54 com 1, 2, 3,4,5,6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 2D) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia leve de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11B.
[00527] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-Tau codifica um Fab de aTAU hiperglicosilado, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve de SEQ ID NOs: 53 e 54, respectivamente, com uma ou mais das seguintes mutações: T110N (cadeia pesada), Q164N ou Q164S (cadeia leve), e / ou E199N (cadeia leve) (veja as FIGURAS 11A (cadeia pesada) e B (cadeia leve)).
[00528] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-Tau codifica um fragmento de ligação ao antígeno e compreende as sequências de nucleotídeo codificando as seis CDRs de aTAU que são sublinhadas nas sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve de FIG. 2D que são espaçadas entre regiões de estrutura, geralmente regiões de estrutura humanas, e associadas com domínios constantes dependendo da forma da molécula de ligação ao antígeno, como é conhecido na técnica para formar o domínio variável de cadeia pesada e / ou leve de um anticorpo anti-Tau ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Métodos de Terapia genética
[00529] São fornecidos métodos de tratamento de indivíduos humanos de AD, CTE, PSP, FD, ou outras tauopatias por administração de um vetor viral contendo um transgene codificando um anticorpo anti- Tau, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. O anticorpo pode ser aTAU, e é preferivelmente um fragmento Fab do mesmo, ou outro fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em certas modalidades, o paciente foi diagnosticado com e / ou tem sintomas associados com AD prodrômico, isto é, um comprometimento cognitivo brando associado com AD precoce ou mesmo pre-AD. Um vetor recombinante usado para a liberação do transgene é descrito na Seção 5.4.1 e mostrado na FIG 2D. Tais vetores devem ter um tropismo para células do CNS humano e podem incluir rAAV não replicante, particularmente aqueles portadores de um capsídeo de AAV9, AAVrhlO, AAVrh20, AAVrh39, ou AAVcCy5. Os vetores recombinantes podem ser administrados de qualquer maneira de modo que o vetor recombinante entre no CNS, preferivelmente introduzindo o vetor recombinante no fluido espinhal cerebral (CSF). Veja a Seção 5.5.1 para detalhes com respeito aos métodos de tratamento.
[00530] Indivíduos aos quais a tal terapia genética é administrada podem ser aqueles que respondem à terapia anti-Tau. Em modalidades particulares, os métodos abrangem o tratamento de pacientes que foram diagnosticados com AD, PSP, ou FD, ou têm um ou mais sintomas associados com eles, e identificados como responsivos ao tratamento com um anticorpo anti-Tau ou considerados um bom candidato para a terapia com um anticorpo anti-Tau. Em modalidades específicas, os pacientes foram anteriormente tratados com aTAU, e descobriu-se serem responsivos a um ou mais of aTAU. Para determinar a capacidade de resposta, o anticorpo anti-Talu ou produto de transgene de fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, produzido em cultura de célula humana, biorreatores, etc.) podem ser administrados diretamente ao indivíduo. Anticorpos Pós-Translacionalmente Modificados Humanos
[00531] A produção do Fab HUPTM ou mAb HuPTM anti-Tau, deve resultar em uma molécula “biobetter” para o tratamento de AD, PSP, ou FD realizado por meio de terapia genética - por exemplo, administrando um vetor viral ou outra construção de expressão de DNA codificando o Fab HuPTM anti-Tau, administração intratecalmente, particularmente intracisternal ou lombar, ou administração intravenosa a indivíduos humanos (pacientes) diagnosticados com ou tendo um ou mais sintomas de AD, PSP, ou FD, para criar um depósito permanente no CNS que continuamente supre o produto de transgene sulfatado, pós- translacionalmente modificado totalmente humano, por exemplo, glicosilado humano produzido por células do CNS transduzidas.
[00532] A construção de cCDNA para o mAb HuPTM anti-Tau ou Fab HuPTM anti-Tau deve incluir um peptídeo sinal que assegura processamento co- e pós-translacional apropriado (glicosilação e sulfação de proteína) pelas células do CNS transduzidas. Por exemplo, a sequência sinal pode ser MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161).
[00533] Como uma alternativa, ou um tratamento adicional para terapia genética, o Fab HUPTM ou mAb HuPTM anti-Tau pode ser produzido em linhagens de células humanas por tecnologia de DNA recombinante, e administrado a pacientes diagnosticados com AD, PSP, ou FD, ou para quem a terapia para AD, PSP, ou FD é considerada apropriada.
[00534] Em modalidades específicas, o mAb HUPTM anti-Tau ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem cadeias pesadas e leves com as sequências de aminoácido das porções de Fab de cadeias pesada e leve de aTAU como mencionado na FIG. 2D (com sítios de glicosilação de asparaginase (N) não consenso realçados em verde, sítios de glicosilação de glutamina (Q) realçados em azul, e sítios de sulfação Y realçados em amarelo) tem glicosilação, particularmente uma 2, 6-sialilação, em uma ou mais das porções de aminoácido N57 e / ou Q107 e / ou N157 e / ou N199 da cadeia pesada (SEQ ID NO:53) ou N78 e / ou Q104 e / ou N162 e / ou N214 da cadeia leve (SEQ ID NO: 54). Alternativamente ou em adição a, o mAb HuPTM ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com as sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve aTAU tem um grupo de sulfação em
Y96 e / ou Y97 e / ou Y104 da cadeia pesada (SEQ ID NO: 53) e / ou Y90 e / ou Y91 da cadeia leve (SEQ ID NO: 54). Em outras modalidades, o mAb HuPTM anti-Tau ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não contém quaisquer porções de NeuGc detectáveis (por exemplo, quando detectado por ensaios conhecidos na técnica, por exemplo, aquelas descritas na Seção 5.2, infra) e / ou não contém quaisquer porções alfa-Gal detectáveis (por exemplo quando detectada por ensaios conhecidos na técnica, por exemplo, aquelas descritas na Seção 5.2 infra).
[00535] Em certas modalidades, o Fab ou mAb HuPTM é terapeuticamente eficaz e é pelo menos 0,5%, 1% ou 2% 2,6 sialilado e / ou sulfatado e pode ser pelo menos 5%, 10% ou mesmo 50% ou 100%) de 2,6 sialilação glicosilado e / ou sulfatado. O objetivo de tratamento de terapia genética fornecido aqui é retardar ou interromper a progressão de AD, PSP, ou FD, particularmente comprometimento cognitivo, comprometimento na capacidade motora grossa ou fina, ou comprometimento da visão. A eficácia pode ser monitorada medindo uma redução em formação de placas e / ou uma melhora em função cognitiva, com capacidades motoras, ou com visão ou uma redução no declínio em função cognitiva, capacidades motoras, ou visão.
[00536] Combinações de liberação do mAb HuUPTM anti-Tau ou fragmento de ligação ao antígenodo mesmo, para o CNS acompanhadas por liberação de outros tratamentos disponíveis são abrangidas pelos métodos fornecidos aqui. Os tratamentos adicionais podem ser administrados antes, concomitantemente ou subsequente ao tratamento de terapia genética. Tratamentos disponíveis para AD, PSP, ou FD que podem ser combinados com a terapia genética fornecida aqui incluem, porém não estão limitados à ARICEPTO (donepezila), RAZADYNEO (galantamina) NAMENDAGO (rivastigmina) e NAMZARICO (donepezila e memantina), para citar alguns, e administração com agentes anti-Tau, incluindo, porém não limitados a agentes aTAU e anti-AB, tais como, porém não limitados a Aducanumabe, Crenezumabe, e Gantenerumabe.
5.3.3. Construções de HUPTM Anti-CGRPR e Formulações para Enxaquecas e Cefaleia em cacho.
[00537] “Composições e métodos são descritos para a liberação de MAbs de HuPTM e fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo, tais como Fabs HuPTM, que se ligam ao receptor de peptídeo relacionado com o gene calcitonina (CGRPR) que podem ter benefício no tratamento de enxaquecas e cefaleia em cacho (referidos coletivamente como distúrbios de dor de cabeça). Em modalidades particulares, o mAb HuPTM é Erenumabe, eptinezumabe, fremanezumabe, galcanezumabe ou um fragmento de ligação ao antígeno de um dos anteriormente mencionados. Uma sequência de aminoácido para fragmentos Fab de Erenumabe é fornecido na FIG. 2E. A liberação pode ser realizada por meio de terapia genética - por exemplo, administrando um vetor viral ou outra construção de expressão de DNA codificando um mAb HuUPTM de ligação ao CGRPR (ou um fragmento de ligação ao antígeno e / ou um derivado hiperglicosilado ou outro derivado, do mesmo) a pacientes (indivíduos humanos) diagnosticados com, ou tendo um ou mais sintomas de, enxaquecas e cefaleia em cacho, para criar um depósito permanente que continuamente supre o PTM humano, por exemplo, produto de transgene, glicosilado humano. Transgenes
[00538] São fornecidos vetores recombinantes contendo um transgene codificando um mMAb HuPTM ou Fab HuPTM (ou outro fragmento de ligação ao antígeno do mAb HuPTM) que se liga a CGRPR que pode ser administrado para liberar o mAb HuUPTM ou fragmento de ligação ao antígeno em um paciente. O transgene é um ácido nucleico compreendendo as sequências de nucleotídeo codificando um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo que se liga a CGRPR, tal como Erenumabe, eptinezumabe, fremanezumabe, galcanezumabe ou variantes do mesmo como detalhado aqui ou de acordo com os detalhes mencionados aqui. O transgene pode também codificar fragmento de ligação ao antígeno anti-CGRPR que contém sítios de glicosilação adicionais (por exemplo, veja Courtois et a/., 2016, mAbs 8: 99-112 que é incorporado aqui por referência em sua Íntegra).
[00539] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anticOGRPR compreende as sequências de nucleotídeo codificando as cadeias pesadas e leves da porção Fab de Erenumabe (tendo sequências de aminoácido de SEQ ID NOs. 55 e 56, respectivamente, veja a Tabela 4 e FIG 2E). As sequências de nucleotídeo podem ser otimizadas por códon para expressão em células humanas e podem, por exemplo, compreender as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NO: 155 (codificando uma porção de Fab de cadeia pesada de Erenumabe) e SEQ ID NO: 156 (codificando uma porção Fab de cadeia leve de Erenumabe) como mencionado na Tabela
5. As sequências de cadeias pesada e leve ambas têm uma sequência sinal ou líder no N-terminal apropriado para expressão e secreção em células humanas, em particular, células do CNS humano. A sequência sinal pode ter a sequência de aminoácido de MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161) ou uma das sequências encontradas na Tabela 1 supra.
[00540] Além das sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve, o transgene pode compreender, no C-terminal da sequência de domínio variável de cadeia pesada, toda ou uma porção da região de articulação. Em modalidades específicas, o domínio de ligação ao antígeno anti-cCGRPR tem um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 55 com sequência de região de articulação adicional iniciando após o aspartato C-terminal (D), contém toda ou uma porção da sequência de aminoácido CPPCPAPPVAGG (SEQ ID NO: 232), e especificamente, CPPCPA (SEQ ID NO: 219) ou CPPCPAPPVAG (SEQ ID NO: 233) como quarto conjunto na FIG. 2E. Estas regiões de articulação podem ser codificadas por sequências de nucleotídeo na extremidade 3' de SEQ ID NO: 55 pela região de articulação codificando as sequências mencionadas na Tabela 4 (SEQ ID NO: 155).
[00541] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-cCGRPR codifica um fragmento de ligação ao antígeno CGRPR que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%) ou 99%) idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 56. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti- CGRPR codifica um fragmento de ligação ao antígeno CGRPR que compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 55. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anticCGRPR codifica um fragmento de ligação ao antígeno que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 56 e uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%), 98%) ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 55. Em modalidades específicas, o CGRPR fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 55 com 1,2,3,4,5,6,
7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 2E) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia pesada de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11 A. Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno Tau compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:56 com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 2E) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia leve de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11B.
[00542] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-cCGRPR codifica um Fab de Erenumabe hiperglicosilado, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve de SEQ ID NOs: 55 e 56, respectivamente, com uma ou mais das seguintes mutações: T125N (cadeia pesada) e / ou Q198N (cadeia leve) (veja as FIGURAS 11A (cadeia pesada) e B (cadeia leve)).
[00543] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-CGRPR codifica um fragmento de ligação ao antígeno e compreende as sequências de nucleotídeo codificando as seis CDRs de Erenumabe que são sublinhadas nas sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve de FIG. 2E que são espaçadas entre regiões de estrutura, geralmente regiões de estrutura humanas, e associadas com domínios constantes dependendo da forma da molécula de ligação ao antígeno, como é conhecido na técnica para formar o domínio variável de cadeia pesada e / ou leve de um anticorpo anti-Tau ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Métodos de Terapia genética
[00544] São fornecidos métodos de tratamento de indivíduos humanos de enxaquecas e cefaleia em cacho por administração de um vetor viral contendo um transgene codificando um anticorpo anti- CGRPR, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. O anticorpo pode ser Erenumabe, eptinezumabe, fremanezumabe, ou galcanezumabe e é preferivelmente um fragmento Fab do mesmo, ou outro fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em certas modalidades, o paciente foi diagnosticado com e / ou tem sintomas associados com enxaquecas episódicas ou enxaquecas crônicas. Em certas modalidades, o paciente foi diagnosticado com e / ou tem sintomas associados com episodic cefaleia em cacho ou cefaleia em cacho crônicas. Um vetor recombinante usado para a liberação do transgene é descrito na Seção 5.4.1 e mostrado na FIG 2E. Tais vetores devem ter um tropismo para células do CNS humano e podem incluir rAAV não replicante, particularmente aqueles portadores de um capsídeo de AAV9, AAVrIhlO, AAVrh20, AAVrh39, ou AAVcy5. Os vetores recombinantes podem ser administrados de qualquer maneira de modo que o vetor recombinante entre no CNS, preferivelmente introduzindo o vetor recombinante no fluido espinhal cerebral (CSF). Veja a Seção 5.5.1 para detalhes com respeito aos métodos de tratamento.
[00545] — Indivíduos aos quais a tal terapia genética é administrada podem ser aqueles que respondem à terapia anti-cCGRPR. Em modalidades particulares, os métodos abrangem o tratamento de pacientes que foram diagnosticados com enxaquecas ou cefaleia em cacho ou têm um ou mais sintomas associados com eles, e identificados como responsivos ao tratamento com um anticorpo anti-cCGRPR ou considerados um bom candidato para a terapia com um anticorpo anti- CGRPR. Em modalidades específicas, os pacientes foram anteriormente tratados com Erenumabe, eptinezumabe, fremanezumabe, ou galcanezumabe, e descobriu-se serem responsivos a um ou mais of Erenumabe, eptinezumabe, fremanezumabe, e galcanezumabe. Para determinar a capacidade de resposta, o anticorpo anticCGRPR ou produto de transgene de fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, produzido em cultura de célula humana, biorreatores, etc.) podem ser administrados diretamente ao indivíduo. Anticorpos Pós-Translacionalmente Modificado Humanos
[00546] A produção do MAb HUPTM anti-cCGRPR ou HuPTM Fab, deve resultar em uma molécula “biobetter” para o tratamento de enxaquecas ou cefaleia em cacho realizado por meio de terapia genética - por exemplo, administrando um vetor viral ou outra construção de expressão de DNA codificando o Fab HUPTM anti- CGRPR, administração intratecalmente, particularmente intracisternal ou lombar, ou administração intravenosa a indivíduos humanos (pacientes) diagnosticados com ou tendo um ou mais sintomas de enxaquecas ou cefaleia em cacho, para criar um depósito permanente no CNS que continuamente supre o produto de transgene sulfatado, pós-translacionalmente modificado totalmente humano, por exemplo, glicosilado humano produzido por células do CNS transduzidas.
[00547] A construção de cDNA para o mAb HuUPTM anti-CGRPR ou Fab HuUPTM anti-CGRPR deve incluir um peptídeo sinal que assegura processamento co- e pós-translacional apropriado (glicosilação e sulfação de proteína) pelas células do CNS transduzidas. Por exemplo, a sequência sinal pode ser MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161).
[00548] Como uma alternativa, ou um tratamento adicional para terapia genética, o Fab HUPTM ou mAb HuPTM anti-CGRPR pode ser produzido em linhagens de células humanas por tecnologia de DNA recombinante, e administrado a pacientes diagnosticados com enxaquecas ou cefaleia em cacho, ou para quem a terapia para enxaquecas ou cefaleia em cacho é considerada apropriada.
[00549] “Em modalidades específicas, o mAb HUPTM anti-CGRPR ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem cadeias pesadas e leves com as sequências de aminoácido das porções de Fab de cadeias pesada e leve de Erenumabe como mencionado na FIG. 2E (com sítios de glicosilação de asparaginase (N) não consenso realçados em verde, sítios de glicosilação de glutamina (Q) realçados em azul, e sítios de sulfação Y realçados em amarelo) has glicosilação, particularmente uma 2 ,6-sialilação, em uma ou mais das porções de aminoácido N77 e 1 ou Q122 e / ou N172 e / ou N205 e / ou N214 da cadeia pesada (SEQ ID NO:55) ou N28 e / ou N174 da cadeia leve (SEQ ID NO: 56). Alternativamente ou em adição a, o mAb HuPTM ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com as sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve Erenumabe tem um grupo de sulfação em Y94 e / ou Y95 da cadeia pesada (SEQ ID NO: 55) e / ou Y87 e / ou Y88 da cadeia leve (SEQ ID NO: 56). Em outras modalidades, o mAb HUPTM anti-cCGRPR ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não contém quaisquer porções de NeuGc detectáveis (por exemplo, quando detectado por ensaios conhecidos na técnica, por exemplo, aquelas descritas na Seção 5.2, infra) e / ou não contém quaisquer porções alfa- Gal detectáveis (por exemplo quando detectada por ensaios conhecidos na técnica, por exemplo, aquelas descritas na Seção 5.2 infra).
[00550] Em certas modalidades, o Fab ou mAb HuPTM é terapeuticamente eficaz e é pelo menos 0,5%, 1% ou 2% 2,6 sialilado e / ou sulfatado e pode ser pelo menos 5%, 10% ou mesmo 50% ou 100%
de 2,6 sialilação glicosilado e / ou sulfatado. O objetivo de tratamento de terapia genética fornecido aqui é prevenir ou reduzir a intensidade ou frequência de enxaquecas, cefaleia em cacho, ou um ou mais dos sintomas associados com elas, incluindo náusea, sensibilidade à luz, sensibilidade ao som, olho vermelho, edema da pálpebra, sudorese na testa e facial, lágrima (lacrimejamento), tamanho pequeno anormal da pupila (miose), congestão nasal, coriza (rinorreia) e pálpebra caída (ptose). A eficácia pode ser monitorada medindo uma redução na intensidade ou frequência de enxaquecas ou cefaleia em cacho, ou uma redução na quantidade de medicação específica de enxaqueca aguda usada durante um período de tempo definido.
[00551] “Combinações de liberação do mAb HUPTM anti-CGRPR ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, para o CNS acompanhadas por liberação de outros tratamentos disponíveis são abrangidas pelos métodos fornecidos aqui. Os tratamentos adicionais podem ser administrados antes, concomitantemente ou subsequente ao tratamento de terapia genética. Tratamentos disponíveis para cefaleia em cacho ou enxaquecas que podem ser combinados com a terapia genética fornecida aqui incluem, porém não estão limitados a triptanos, derivados de ergotamina e NSAIDs, para citar alguns, e administração com agentes anticCGRPR, incluindo, porém não limitados a Erenumabe, eptinezumabe, fremanezumabe, e galcanezumabe.
5.3.4 Construções de HuUPTM Anti-Interleucina e Receptor Anti- Interleucina e Formulações para Distúrbios Autoimunes
[00552] — Composições e métodos são descritos para a liberação de MAbs de HuPTM e fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo, tais como Fabs HuPTM, que se ligam às interleucinas (IL) ou receptores de interleucina (TLR) (por exemplo, /L4R, IL1I7A, IL12/I1L23, ou I1L-5) derivado de anti-lL.s ou anti-ILRs indicadas para o tratamento de um ou mais distúrbios relacionados com a autoimunidade, tal como dermatite atópica, psoríase (por exemplo, psoríase em placas, psoríase pustular, e psoríase eritrodérmica), artrite (por exemplo, artrite psoriática, e espondilite alquilante), doença de Crohn, ou asma (coletivamente referidos a seguir como "AlI-Ds objeto"). Em modalidades particulares, o mAb HuPTM tem a sequência de aminoácido of Dupilumabe, Ixequizumabe, Seciquinumabe, Ustequinumabe, ou Mepolizumabe ou um fragmento de ligação ao antígeno de um dos anteriormente mencionados. As sequências de aminoácido de fragmentos Fab destes anticorpos são fornecidas nas FIGURAS 3A a 3E, respectivamente. À liberação pode ser realizada por meio de terapia genética - por exemplo, administrando um vetor viral ou outra construção de expressão de DNA codificando um mAb HuPTM de ligação a IL/ILR (ou um fragmento de ligação ao antígeno e / ou um derivado hiperglicosilado ou outro derivado, do mesmo) a pacientes (indivíduos humanos) diagnosticados com, ou tendo um ou mais sintomas de dermatite atópica, psoríase (por exemplo, psoríase em placas), artrite (por exemplo, artrite psoriática, e espondilite alquilante), doença de Crohn, ou asma para criar um depósito permanente que continuamente supre o PTM humano, por exemplo, produto de transgene, glicosilado humano.
Transgenes
[00553] São fornecidos vetores recombinantes contendo um transgene codificando um mMAb HuPTM ou Fab HuPTM (ou outro fragmento de ligação ao antígeno do mAb HuPTM) que se liga a IL/ILR que pode ser administrado para liberar o mAb HUPTM ou fragmento de ligação ao antígeno em um paciente. O transgene é um ácido nucleico compreendendo as sequências de nucleotídeo codificando um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo que se liga a IL/ILR, tal como Dupilumabe, Ixequizumabe, Seciquinumabe, Ustequinumabe, Mepolizumabe, ou variantes do mesmo como detalhado aqui. O transgene pode também codificar um anti-IL/ILR fragmento de ligação ao antígeno que contém sítios de glicosilação adicionais (por exemplo, veja Courtois et al.).
[00554] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-ll4R compreende as sequências de nucleotídeo codificando as cadeias pesadas e leves da porção Fab de Dupilumabe (tendo sequências de aminoácido de SEQ ID NOs. 7 e 8, respectivamente, veja a Tabela 4 e FIG. 3A). As sequências de nucleotídeo podem ser otimizadas por códon para expressão em células humanas e podem, por exemplo, compreender as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NO: 107 (codificando uma porção de Fab de cadeia pesada de Dupilumabe) e SEQ ID NO: 108 (codificando uma porção de Fab de cadeia leve de Dupilumabe) como mencionado na Tabela 5. As sequências de cadeias pesada e leve ambas têm uma sequência sinal ou líder no N-terminal apropriado para expressão e secreção em células humanas, em particular, células de fígado humano (por exemplo, hepatócitos) ou células musculares humanas. A sequência sinal pode ter a sequência de aminoácido de MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161). Alternativamente, a sequência sinal pode ter uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma das sequências sinal mencionadas na Tabela 2 ou 3 que correspondem às proteínas secretadas por miócitos ou hepatócitos, respectivamente.
[00555] Além das sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve, os transgenes podem compreender, no C-terminal da sequência de domínio variável de cadeia pesada, toda ou uma porção da região de articulação. Em modalidades específicas, o domínio de ligação ao antígeno anti-integrina tem um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 7 com sequência de região de articulação adicional iniciando após a tirosina (Y) C-terminal, contém toda ou uma porção da sequência de aminoácido GPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 231), e especificamente, GPPCPPCPA (SEQ I|D NO 229) ou GPPCPPCPAPEFLGGPSVFL (SEQ ID NO: 230) como mencionado na FIG 3A. Estas regiões de articulação podem ser codificadas por sequências de nucleotídeo na extremidade 3' de SEQ ID NO: 7 pela região de articulação codificando as sequências mencionadas na Tabela 5.
[00556] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-|IL4R codifica um fragmento de ligação ao antígeno de IL4R que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 8. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-|IL4R codifica um fragmento de ligação ao antígeno de IL4R que compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 7. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-IL4R codifica um fragmento de ligação ao antígeno que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 8 e uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 7. Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno de ILA4R compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7 com 1, 2, 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições,
inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 3 A) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia pesada de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11 A. Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno de IL4R compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 8 com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 3 A) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia leve de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11B.
[00557] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-|L4R codifica um Fab de Dupilumabe hiperglicosilado, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve de SEQ ID NOs: 7 e 8, respectivamente, com uma ou mais das seguintes mutações: T120N (cadeia pesada), Q165N ou Q165S (cadeia leve), e / ou E200N (cadeia leve) (veja as FIGURAS 11A (cadeia pesada) e B (cadeia leve)).
[00558] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-|IL4R codifica um fragmento de ligação ao antígeno e compreende as sequências de nucleotídeo codificando as seis CDRs de Dupilumabe que são sublinhadas nas sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve de FIG. 3 A que são espaçadas entre regiões de estrutura, geralmente regiões de estrutura humanas, e associadas com domínios constantes dependendo da forma da molécula de ligação ao antígeno, como é conhecido na técnica para formar o domínio variável de cadeia pesada e / ou leve de um anticorpo anti-IL4R ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00559] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-|L1I7A compreende as sequências de nucleotídeo codificando as cadeias pesadas e leves da porção Fab de Ixequizumabe (tendo sequências de aminoácido de SEQ ID NOs. 9 e 10, respectivamente, veja a Tabela 4 e FIG. 3B). As sequências de nucleotídeo podem ser otimizadas por códon para expressão em células humanas e podem, por exemplo, compreender as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NO: 109 (codificando uma porção Fab de cadeia pesada de Ixequizumabe) e SEQ ID NO: 110 (codificando uma porção Fab de cadeia leve de IXequizumabe) como mencionado na Tabela 5. As sequências de cadeias pesada e leve ambas têm uma sequência sinal ou líder no N-terminal apropriado para expressão e secreção em células humanas, em particular, células de fígado humano (por exemplo, hepatócitos) ou células musculares. A sequência sinal pode ter a sequência de aminoácido de MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161). Alternativamente, a sequência sinal pode ter uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma das sequências sinal mencionadas na Tabela 2 ou 3 que correspondem às proteínas secretadas por miócitos ou hepatócitos, respectivamente.
[00560] Além das sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve, os transgenes podem compreender, no C-terminal da sequência de domínio variável de cadeia pesada, toda ou uma porção da região de articulação. Em modalidades específicas, o domínio de ligação ao antígeno anti-integrina tem um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 9 com sequência de região de articulação adicional iniciando após a tirosina (Y) C-terminal, contém toda ou uma porção da sequência de aminoácido GPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 231), e especificamente, GPPCPPCPA (SEQ ID NO 229) ou
GPPCPPCPAPEFLGGPSVFL (SEQ ID NO: 230) como mencionado na FIG 3B. Estas regiões de articulação podem ser codificadas por sequências de nucleotídeo na extremidade 3' de SEQ ID NO: 9 pela região de articulação codificando as sequências mencionadas na Tabela 5.
[00561] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-|LI7A codifica um fragmento de ligação ao antígeno IL17A que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 10. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-|IL17A codifica um fragmento de ligação ao antígeno IL17A que compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ |D NO: 9. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-IL17A codifica um fragmento de ligação ao antígeno que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 294%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 10 e uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 9. Em modalidades específicas, o IL17A fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9 com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 3B) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia pesada de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11 A. Em modalidades específicas, o ILI7A fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 com 1,2, 3,4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 3B) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia leve de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11B.
[00562] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-IL17A codifica um Fab de Ixequizumabe hiperglicosilado, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve de SEQ ID NOs: 9 e 10, respectivamente, com uma ou mais das seguintes mutações: L114N (cadeia pesada), Q165N ou Q165S (cadeia leve), e / ou E200N (cadeia leve) (veja as FIGURAS 11A (cadeia pesada) e B (cadeia leve)).
[00563] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-IL17A codifica um fragmento de ligação ao antígeno e compreende as sequências de nucleotídeo codificando as seis CDRs de Ixequizumabe que são sublinhadas nas sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve de FIG. 3B que são espaçadas entre regiões de estrutura, geralmente regiões de estrutura humanas, e associadas com domínios constantes dependendo da forma da molécula de ligação ao antígeno, como é conhecido na técnica para formar o domínio variável de cadeia pesada e / ou leve de um anticorpo anti-IL17A ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00564] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-|L1I7A compreende as sequências de nucleotídeo codificando as cadeias pesadas e leves da porção Fab de Seciquinumabe (tendo sequências de aminoácido de SEQ ID NOs. 11 e 12, respectivamente, veja a Tabela 4 e FIG. 3C). As sequências de nucleotídeo podem ser otimizadas por códon para expressão em células humanas e podem, por exemplo, compreender as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NO: 111 (codificando uma porção Fab de cadeia pesada de Seciquinumabe) e SEQ ID NO: 112 (codificando uma porção Fab de cadeia leve de Seciquinumabe) como mencionado na Tabela 5. As sequências de cadeias pesada e leve ambas têm uma sequência sinal ou líder no N-terminal apropriado para expressão e secreção em células humanas, em particular, células de fígado humano (por exemplo, hepatócitos) ou células musculares. A sequência sinal pode ter a sequência de aminoácido de MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161). Alternativamente, a sequência sinal pode ter uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma das sequências sinal mencionadas na Tabela 2 ou 3 que correspondem ao miócito ou proteínas secretadas por hepatócito, respectivamente.
[00565] Além das sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve, os transgenes podem compreender, no C-terminal da sequência de domínio variável de cadeia pesada, toda ou uma porção da região de articulação. Em modalidades específicas, o domínio de ligação ao antígeno anti-integrina tem um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 11 com sequência de região de articulação adicional iniciando após o ácido aspártico C-terminal (D), contém toda ou uma porção da sequência de aminoácido KTHT CPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 227), e especificamente, KTHT (SEQ ID NO: 224), KTHL (SEQ ID NO: 223), KTIHTCPPCPA (SEQ ID NO: 225), KTHLCPPCPA
(SEQ ID NO: 226), KTIHTCPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 227), ou KTHLCPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 228) como mencionado na FIG 3C. Estas regiões de articulação podem ser codificadas por sequências de nucleotídeo na extremidade 3' de SEQ ID NO: 11 pela região de articulação codificando as sequências mencionadas na Tabela 5.
[00566] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-|ILI7A codifica um fragmento de ligação ao antígeno IL17A que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 12. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-IL17A codifica um fragmento de ligação ao antígeno ILI7A que compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 11. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-IL17A codifica um fragmento de ligação ao antígeno que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 12 e uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 11. Em modalidades específicas, o IL17A fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 11 com 1,2, 3,4,5,6,7,8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 3C) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia pesada de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11 A. Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno ILI7A compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 12 com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 3C) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia leve de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11B.
[00567] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-ILI7A codifica um Fab de Seciquinumabe hiperglicosilado, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve de SEQ ID NOs: 11 e 12, respectivamente, com uma ou mais das seguintes mutações: L122N (cadeia pesada), Q161N ou Q1618 (cadeia leve), e / ou E196N (cadeia leve) (veja as FIGURAS 11A (cadeia pesada) e B (cadeia leve)).
[00568] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-|ILI7A codifica um fragmento de ligação ao antígeno e compreende as sequências de nucleotídeo codificando as seis CDRs de Seciquinumabe que são sublinhadas nas sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve de FIG. 3C que são espaçadas entre regiões de estrutura, geralmente regiões de estrutura humanas, e associadas com domínios constantes dependendo da forma da molécula de ligação ao antígeno, como é conhecido na técnica para formar o domínio variável de cadeia pesada e / ou leve de um anticorpo anti-IL/ILR ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00569] Em certas modalidades, o anti-IL12/1123 transgene de fragmento de ligação ao antígeno compreende as sequências de nucleotídeo codificando as cadeias pesadas e leves da porção Fab de Ustequinumabe (tendo sequências de aminoácido de SEQ ID NOs. 13 e 14, respectivamente, veja a Tabela 4 e FIG. 3D). As sequências de nucleotídeo podem ser otimizadas por códon para expressão em células humanas e podem, por exemplo, compreender as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NO: 113 (codificando uma porção de Fab de cadeia pesada de Ustequinumabe) e SEQ ID NO: 114 (codificando uma porção Fab de cadeia leve de Ustequinumabe) como mencionado na Tabela 5. As sequências de cadeias pesada e leve ambas têm uma sequência sinal ou líder no N-terminal apropriado para expressão e secreção em células humanas, em particular, células de fígado humano (por exemplo, hepatócitos) ou células musculares. A sequência sinal pode ter a sequência de aminoácido de MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161). Alternativamente, a sequência sinal pode ter uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma das sequências sinal mencionadas na Tabela 2 ou 3 que correspondem às proteínas secretadas por miócitos ou hepatócitos, respectivamente.
[00570] Além das sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve, os transgenes podem compreender, no C-terminal da sequência de domínio variável de cadeia pesada, toda ou uma porção da região de articulação. Em modalidades específicas, o domínio de ligação ao antígeno anti-integrina tem um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 13 com sequência de região de articulação adicional iniciando após o ácido aspártico C-terminal (D), contém toda ou uma porção da sequência de aminoácido KTHT CPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 227), e especificamente, KTHT (SEQ ID NO: 224), KTHL
(SEQ ID NO: 223), KTIHTCPPCPA (SEQ ID NO: 225), KTHLCPPCPA (SEQ ID NO: 226), KTIHTCPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 227), ou KTHLCPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 228) como mencionado na FIG 3D. Estas regiões de articulação podem ser codificadas por sequências de nucleotídeo na extremidade 3' de SEQ ID NO: 13 pela região de articulação codificando as sequências mencionadas na Tabela 5.
[00571] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-IL12/I1L23 codifica um fragmento de ligação ao antígeno IL/ILR que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 14. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-IL12/1123 codifica um fragmento de ligação ao antígeno IL12/I1L23 que compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 13. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-1L12/1L23 codifica um fragmento de ligação ao antígeno que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 14 e uma cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 13. Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno IL12/I1L23 compreende uma cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13 com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 3D) ou são substituições com um aminoácido presente naquela posição na cadeia pesada de um ou mais dos anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento em FIG. 11 A. Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno I|L12/I1123 compreende uma cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14 com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas em FIG. 3D) ou são substituições com um aminoácido presente naquela posição na cadeia leve de um ou mais dos anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11B.
[00572] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-IL12/1123 codifica um Fab de ustequinumabe hiperglicosilado, que compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve de SEQ ID NOs: 13 e 14, respectivamente, com uma ou mais das seguintes mutações: L114N (cadeia pesada), Q160N ou Q1608S (cadeia leve), e / ou E195N (cadeia leve) (veja FIGURAS 11A (cadeia pesada) e B (cadeia leve)).
[00573] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-IL12/I1L23 codifica um fragmento de ligação ao antígeno e compreende as sequências de nucleotídeo codificando as seis CDRs de ustequinumabe que são sublinhadas em sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve de FIG. 3D que são espaçadas entre regiões de estrutura, geralmente regiões de estrutura humanas, e associadas com domínios constantes dependendo da forma da molécula de ligação ao antígeno, como é conhecido na técnica para formar o domínio variável de cadeia pesada / leve de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno anti-IL12/I11L23 do mesmo.
[00574] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-IL-5 compreende as sequências de nucleotídeo codificando as cadeias leves e pesadas da porção Fab de mepolizumabe (tendo sequências de aminoácido de SEQ ID NOs. 15 e 16, respectivamente, veja Tabela 4 e FIG. 3E). As sequências de nucleotídeo podem ser códons otimizados para expressão em células humanas e podem, por exemplo, compreender as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NO: 115 (codificando uma porção Fab de cadeia pesada de mepolizumabe) e SEQ ID NO: 116 (codificando uma porção Fab de cadeia leve de mepolizumabe) como fornecido na Tabela 5. As sequências de cadeias pesada e leve ambas têm uma sequência sinal ou líder no N-terminal apropriado para expressão e secreção em células humanas, em particular, células de fígado humano (por exemplo, hepatócitos) ou células musculares. A sequência sinal pode ter a sequência de aminoácido de MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161). Alternativamente, a sequência sinal pode ter uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma das sequências sinal mencionadas na Tabela 2 ou 3 que correspondem à proteínas secretadas por miócitos ou hepatócitos, respectivamente.
[00575] Além das sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve, os transgenes podem compreender, no C-terminal da sequência de domínio variável de cadeia pesada, toda ou uma porção da região de articulação. Em modalidades específicas, o domínio de ligação ao antígeno anti-integrina tem um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 15 com a sequência de região de articulação adicional iniciando após o ácido aspártico C-terminal (D), contém toda ou uma porção da sequência de aminoácido KTHT CPPCPAPELLGGPSVFL
(SEQ ID NO: 227), e especificamente, KTHT (SEQ ID NO: 224), KTHL (SEQ ID NO: 223), KTIHTCPPCPA (SEQ ID NO: 225), KTHLCPPCPA (SEQ ID NO: 226), KTIHTCPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 227), ou KTHLCPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 228) como fornecido na FIG 3E. Estas regiões de articulação podem ser codificadas por sequências de nucleotídeos na extremidade 3' de SEQ ID NO: 15 pela região de articulação codificando sequências fornecidas na Tabela 5.
[00576] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-IL-5 codifica um fragmento de ligação ao antígeno IL-5 que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 16. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-IL-5 codifica um fragmento de ligação ao antígeno IL-5 que compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 15. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-IL-5 codifica um fragmento de ligação ao antígeno que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 16 e uma cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 15. Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno IL-5 compreende uma cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 15 com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas em FIG. 3E) ou são substituições com um aminoácido presente naquela posição na cadeia pesada de um ou mais dos anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11 A. Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno |L-5 compreende uma cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 16 com 1,2,3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas em FIG. 3E) ou são substituições com um aminoácido presente naquela posição na cadeia leve de um ou mais dos anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11B.
[00577] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-lIL-5 codifica um Fab de mepolizumabe hiperglicosilado, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve de SEQ ID NOs: 15 e 16, respectivamente, com uma ou mais das seguintes mutações: T114N (cadeia pesada), Q166N ou Q1668S (cadeia leve), e / ou E201N (cadeia leve) (veja FIGURAS 11A (cadeia pesada) e B (cadeia leve)).
[00578] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-IL-5 codifica um fragmento de ligação ao antígeno e compreende as sequências de nucleotídeo codificando as seis CDRs de mepolizumabe que são sublinhadas em sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve de FIG. 3E que são espaçadas entre regiões de estrutura, geralmente regiões de estrutura humanas, e associadas com domínios constantes dependendo da forma da molécula de ligação ao antígeno, como é conhecido na técnica para formar o domínio variável de cadeia pesada / leve de um anticorpo anti-lIL-5 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Métodos de Terapia genética
[00579] São fornecidos métodos de tratamento de indivíduos humanos para um ou mais dos indivíduos AI-Ds por administração de um vetor viral contendo um transgene codificando um anticorpo anti- IL/ILR, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. O anticorpo pode ser dupilumabe, ixequizumabe, seciquinumabe, ustequinumabe, ou mepolizumabe, e é preferivelmente um fragmento Fab dos mesmos, ou outro fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em modalidades, o paciente foi diagnosticado com e / ou tem sintomas associados com um ou mais dos indivíduos AI-Ds. Vetores recombinantes usados para liberação do transgene são descritos na Seção 5.4.2. Tais vetores devem ter um tropismo para o fígado humano ou células musculares e podem incluir rAAV não replicante, particularmente aquele carregando um capsídeo AAV8 ou AAV9. Os vetores recombinantes, tais como aqueles mostrados nas FIGURAS 3A-3E, podem ser administrados de qualquer maneira de modo que o vetor recombinante entre no tecido do fígado ou músculo, preferivelmente introduzindo o vetor recombinante na corrente sanguínea (ou em uma modalidade alternativa na corrente sanguínea hepática, tal como através da artéria hepática). Veja Seção
5.5.2 para detalhes a respeito dos métodos de tratamento.
[00580] Indivíduos aos quais terapia genética é administrada podem ser aqueles responsivos para terapia anti-|IL/ILR. Em modalidades particulares, os métodos englobam tratar pacientes que foram diagnosticados com um ou mais dos indivíduos AI-Ds, ou têm um ou mais sintomas associados com, e identificados como responsivos ao tratamento com um anticorpo anti-|IL/ILR ou considerados um bom candidato para terapia com um anticorpo anti-IL/ILR. Em modalidades específicas, os pacientes foram previamente tratados com dupilumabe, ixequizumabe, seciquinumabe, ustequinumabe, ou mepolizumabe, e foram responsivos para dupilumabe, ixequizumabe, seciquinumabe, ustequinumabe, ou mepolizumabe. Para determinar responsividade, o anticorpo anti-IL/ILR ou produto de transgene de fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, produzidos em cultura de células humanas, biorreatores, etc.) pode ser administrado diretamente ao indivíduo. Anticorpos Pós-Translacionalmente Modificados Humanos
[00581] A produção do mAb HuUPTM ou Fab HUPTM anti-IL/ILR, deve resultar em uma molécula "biobetter" para o tratamento de um ou mais do AlI-Ds objeto realizado por meio de terapia genética, por exemplo, administrando um vetor viral ou outra construção de expressão de DNA codifcando o Fab HUuPTM anti-lI/ILR, —subcutaneamente, intramuscularmente, ou intravenosamente a indivíduos humanos (pacientes) diagnosticados com ou tendo um ou mais sintomas de um ou mais dos indivíduos AI-Ds, para criar um depósito permanente no tecido do fígado ou músculo que fornece continuamente o produto de transgene pós-translacionalmente modificado totalmente humano, por exemplo, glicosilado humano, sulfatado produzido por fígado ou células musculares transduzidas.
[00582] A construção de cDNA para o mAb HuPTM anti-IL/ILR ou Fab HuUPTM anti-|IL/ILR deve ser incluído um peptídeo de sinal que garante processamento de co- e pós-translacional adequado (glicosilação e sulfatação de proteína) pelo fígado ou células musculares transduzidas. Por exemplo, a sequência sinal pode ser MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161). Alternativamente, a sequência sinal pode ter uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma das sequências sinal mencionadas na Tabela 2 ou 3 que corresponde à proteínas secretadas por miócitos ou hepatócitos, respectivamente.
[00583] Como uma alternativa, ou um tratamento adicional para terapia genética, o mAb HUPTM ou Fab HuPTM anti-IL/ILR pode ser produzido em linhagens celulares humanas por tecnologia de DNA recombinante, e administrado a pacientes diagnosticados com um ou mais dos indivíduos AI-Ds, ou para quem terapia para um ou mais indivíduos AI-Ds é considerada apropriada.
[00584] Em modalidades específicas, o mMAb HuUPTM anti-|IL4R ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem cadeias pesadas e leves com as sequências de aminoácido das porções Fab de cadeias pesada e leve de dupilumabe como mencionado na FIG. 3A (locais de glicosilação por asparagina sem consenso (N) destacados em aqua, sítios de glicosilação da glutamina (Q) destacados em verde, e sítios de sulfatação em Y destacados em amarelo) tem uma glicosilação, particularmente uma 2,6-sialilação, em uma ou mais posições de aminoácidos N77, N167, e / ou Q117 da cadeia pesada (SEQ ID NO:7) ou Q105, N163, e / ou N215 da cadeia leve (SEQ ID NO:8). Alternativamente ou em adição o mAb HuPTM ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve de dupilumabe tem um grupo de sulfatação em Y94 e / ou Y95 da cadeia pesada (SEQ ID NO: 7) e / ou Y91 e / ou Y92 da cadeia leve (SEQ ID NO: 8). Em outras modalidades, o mAb HUPTM anti-IL4R ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não contém qualquer porção de NeuGc detectável e / ou não contém qualquer porção alfa-Gal detectável.
[00585] Em modalidades específicas, o mAb HUPTM anti-IL17A ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem cadeias pesadas e leves comas sequências de aminoácido das porções Fab de cadeias pesada e leve de ixequizumabe como mencionado na FIG. 3B (com sítios de glicosilação de asparagina (N) não consensuais destacados em aqua, sítios de glicosilação da glutamina (Q) destacados em verde,
e sítios de sulfatação em Y destacados em amarelo) tem uma glicosilação, particularmente um 2,6-sialilação, em uma ou mais posições de aminoácidos QIll, N161, e / ou N203 da cadeia pesada (SEQ ID NO: 9) ou Q105, N163 e / ou N215 da cadeia leve (SEQ ID NO: 10). Alternativamente ou em adição ao mAb HuPTM ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve de ixequizumabe tem um grupo de sulfatação em Y94 e / ou Y95 da cadeia pesada (SEQ ID NO: 9) e / ou Y91e / ou Y92 da cadeia leve (SEQ ID NO: 10). Em outras modalidades, o mAb HUPTM anti-IL17A ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não contém qualquer porções de NeuGc detectável e / ou não contém qualquer porção a-Gal detectável.
[00586] Em modalidades específicas, o mAb HUPTM anti-IL17A ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem cadeias pesada e leve com as sequências de aminoácido das porções Fab de cadeias pesada e leve de seciquinumabe como mencionado na FIG. 3C (com sítios de glicosilação de asparagina (N) não consensuais destacados em aqua, sítios de glicosilação da glutamina (Q) destacados em verde, e sítios de sulfatação em Y destacados em amarelo) tem uma glicosilação, particularmente uma 2,6-sialilação, em uma ou mais das posições de aminoácido N169 da cadeia pesada (SEQ ID NO:1I) ou Q101, N159, e / ou N211 da cadeia leve (SEQ ID NO: 12). Alternativamente ou em adição ao mAb HuPTM ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve de seciquinumabe tem um grupo de sulfatação em Y94 e / ou Y95 e / ou Y107 e / ou Y108 da cadeia pesada (SEQ ID NO: 11) e/ou Y87 e/ou Y88 da cadeia leve (SEQ ID NO: 12. Em outras modalidades, o mAb HuPTM anti-IL17A ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não contém porções NeuGc detectáveis e / ou não contém porções a-Gal detectáveis.
[00587] Em modalidades específicas, o mAb HUPTM anti-IL12/11L23 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem cadeias pesada e leve com as sequências de aminoácido das porções Fab de cadeias pesada e leve de ustequinumabe como mencionado na FIG. 3D (com sítios de glicosilação sem consenso de asparagina (N) destacados em aqua, sítios de glicosilação da glutamina (Q) destacados em verde, e sítios de sulfatação em Y destacados em amarelo) tem uma glicosilação, particularmente uma 2,6-sialilação, em uma ou mais das posições de aminoácido Q!ll e / ou N161 da cadeia pesada (SEQ ID NO: 13) ou Q100, N158, e / ou N210 da cadeia leve (SEQ ID NO: 14). Alternativamente ou em adição a, o mAb HuPTM ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve de ustequinumabe tem um grupo de sulfatação em Y86 e / ou Y87 da cadeia leve (SEQ ID NO: 14). Em outras modalidades, o mAb HuPTM anti-IL12/I1123 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não contém porções NeuGc detectáveis e / ou não contém porções a-Gal detectáveis.
[00588] Em modalidades específicas, o mAb HuPTM anti-IL-5 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem cadeias pesada e leve com as sequências de aminoácido das porções Fab de cadeias pesada e leve de mepolizumabe como mencionado na FIG. 3E (com sítios de glicosilação de asparagina (N) não consensuais destacados em aqua, sítios de glicosilação da glutamina (Q) destacados em verde, e sítios de sulfatação em Y destacados em amarelo) tem uma glicosilação, particularmente uma 2,6-sialilação, em uma ou mais das posições de aminoácido N76 e / ou N161 da cadeia pesada (SEQ ID NO: 15) ou N22, N34, N164, e / ou N216 da cadeia leve (SEQ |D NO: 16). Alternativamente ou em adição ao mAb HuPTM ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve de mepolizumabe tem um grupo de sulfatação em Y93 e
/ ou Y94 da cadeia pesada (SEQ ID NO: 15) e / ou Y92 e / ou Y93 da cadeia leve (SEQ ID NO: 16). Em outras modalidades, o mAb HUPTM anti-lIL-5 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não contém porções NeuGc detectáveis e / ou não contém porções alfa-Gal detectáveis.
[00589] Em certas modalidades, o mAb ou Fab HuPTM é terapeuticamente eficaz e é pelo menos 0,5%, 1% ou 2% de 2,6- sialilação e / ou sulfatado e pode ser pelo menos 5%, 10% ou ainda 50% ou 100%) glicosilado e / ou sulfatado. O objetivo de tratamento de terapia genética fornecido aqui é retardar ou interromper a progressão de AI-Ds objeto.
[00590] Eficácia pode ser monitorada pontuando os sintomas ou grau de inflamação no tecido ou área do corpo afetado, por exemplo, tal como a pele, cólon, ou articulações. Por exemplo, a respeito de CD, eficácia pode ser monitorada avaliando Índice de Atividade de Doença de Crohn [CDAI] durante o curso do tratamento (por exemplo, veja Best WR et al. (1976) Gastroenterology 70(3):439-44, "Development of a Crohn's disease activity index. National Cooperative Crohn Disease Study."). A respeito de psoríase e dermatite atópica, eficácia pode ser monitorada avaliando alterações na pele afetada ou na qualidade da vida do paciente durante o curso do tratamento. Uma ou mais avaliações padronizadas pode ser usada para avaliar a alteração, (veja por exemplo, Feldman & Krueger, (2005) Ann. Rheum. Dis. 64 (Suppl IDi65-ii68: "Psoriasis assessment tools in clinical trials" descrevendo avaliações padronizadas incluindo um Índice de Severidade e Área de Psoríase (PASI), Avaliação Global Médica (PGA), sistema de treliça, Pontuação de Psoríase NPF (NPF-PS), Formulário abreviado da Pesquisa de resultados médicos 36 (SF-36), o Euro QoL, Índice de Qualidade de Vida em Dermatologia (DLQI), e um peledex; Schram et al. (2012) Allergy; 67: 99-106: "EAS]|, (objetivo) SCORAD e POEM for atopic eczema: responsiveness and minimal clinically important difference" descrevendo avaliações padronizadas incluindo Índice de Severidade e Área de Eczema (EASI) e a Pontuação de Severidade de Índice de Dermatite Atópica (SCORAD)). Com respeito a artrite, eficácia pode ser monitorada avaliando uma ou mais atividade da doença, o nível de função do paciente, ou o grau de dano estrutural às articulações do paciente (por exemplo, veja Zockling & Braun (2005) Clin. Exp. Rheumatol 23 (Suppl. 39) S133-S141: "Assessment of ankylosing spondylitis" descrevendo avaliação padronizada para espondilite anquilosante; veja também Coates et al. (2011) J. Rheumatol. 38(7): 1496-1501: "Development of a disease severity and responder index for arthritis psoriatic (PSA)-report of the OMERACT 10 PsA special interest group" descrevendo avaliações padronizadas para artrite psoriática.)
[00591] “Combinações de liberação do mAb HuPTM anti-IL/ILR ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, para o fígado ou músculo acompanhadas por liberação de outros tratamentos disponíveis são abrangidas pelos métodos fornecidos aqui. Os tratamentos adicionais podem ser administrados antes, concomitantemente, ou subsequente ao tratamento de terapia genética. Tratamentos disponíveis para indivíduos AI-Ds que podem ser combinados com a terapia genética fornecidos aqui incluem, porém não são limitados a fototerapia para psoríase, aminossalicilatos, agentes imunomoduladores (por exemplo, azatioprina (AZA), 6-mercaptopurina (6-MP), metotrexato (MTX)), corticosteroides orais ou tópicos (por exemplo, prednisona ou budesonida), inibidores de calcineurina tópicos, corticosteroides inalados para asma, e / ou antibióticos para Doença de Crohn e administração com agentes anti-IL/ILR, incluindo, porém não limitado a dupilumabe, ixequizumabe, seciquinumabe, ustequinumabe, ou mepolizumabe.
5.3.5 Construções de HuPTM Anti-Integrina e Formulações para IBD ou Esclerose Múltipla
[00592] “Composições e métodos são descritos para a liberação de mAbs de HUPTM e fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo, tal como Fabs HuPTM, que se liga a integrina (por exemplo, integrina 4 ou a4B7) derivada de integrina anti-a4 ou integrina anti-a48B7 e indicada para tratar doença do intestino inflamatória (TBD), tal como colite ulcerativa (UC) ou Doença de Crohn (CD), e esclerose múltipla (MS). Em modalidades particulares, o mAb HuPTM tem a sequência de aminoácido de vedolizumabe, natalizumabe, ou um fragmento de ligação ao antígeno de um dos anteriormente mencionados. As sequências de aminoácido de fragmentos Fab de vedolizumabe e natalizumabe são fornecidos em FIGURAS 4A e 4B, respectivamente. Liberação pode ser realizada por meio de terapia genética, por exemplo, administrando um vetor viral ou outra construção de expressão de DNA codificando um mAb HuPTM de ligação à integrina (ou um fragmento de ligação ao antígeno e / ou um derivado hiperglicosilado ou outro derivado, do mesmo) a pacientes (indivíduos humanos) diagnosticados com, ou tendo um ou mais sintomas de IBD ou MS para criar um depósito permanente que continuamente fornece o PTM humano, por exemplo, produto transgene glicosilado humano. Transgenes
[00593] São fornecidos vetores recombinantes contendo um transgene codificando um mAb HuPTM ou Fab HuPTM (ou outro fragmento de ligação ao antígeno do mAb HuPTM) que se liga à integrina que pode ser administrada para liberar o mAb HuUPTM ou fragmento de ligação ao antígeno em um paciente. O transgene é um ácido nucleico compreendendo as sequências de nucleotídeo codificando um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo que se liga a integrina, tal como, vedolizumabe, natalizumabe, ou variantes dos mesmos como detalhado aqui. O transgene pode também codificar um fragmento de ligação ao antígeno anti-integrina que contém sítios de glicosilação adicionais (por exemplo, veja Courtois et al.).
[00594] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-integrina compreende as sequências de nucleotídeo codificando as cadeias leves e pesadas da porção Fab de vedolizumabe (tendo sequências de aminoácido de SEQ ID NOs. 17 e 18, respectivamente, veja Tabela 4 e FIG. 4A). As sequências de nucleotídeo podem ser códon otimizado para expressão em células humanas e podem, por exemplo, compreender as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NO: 117 (codificando uma porção Fab de cadeia pesada de vedolizumabe) e SEQ ID NO: 118 (codificando uma porção Fab de cadeia leve de vedolizumabe) como fornecido na Tabela 5. As sequências de cadeias pesada e leve ambas têm uma sequência sinal ou líder no N-terminal apropriado para expressão e secreção em células humanas, em particular, células de fígado humano (por exemplo, hepatócitos) ou células musculares. A sequência sinal pode ter a sequência de aminoácido de MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161). Alternativamente, a sequência sinal pode ter uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma das sequências sinal mencionadas na Tabela 2 ou 3 que corresponde às proteínas secretadas por miócitos ou hepatócitos, respectivamente.
[00595] Em adição às sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve, os transgenes podem compreender, no C-terminal da sequência de domínio variável de cadeia pesada, toda ou uma porção da região de articulação. Em modalidades específicas, o domínio de ligação ao antígeno anti-integrina tem um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 17 com sequência de região de articulação adicional iniciando após o aspartato C-terminal (D), contém toda ou uma porção da sequência de aminoácido KTHTCPPCPAPELAGA (SEQ ID
NO: 236), e especificamente, KTHL (SEQ ID NO: 223), KTHT (SEQ ID NO: 224), KTHTCPPCPA (SEQ ID NO: 225), KTHLCPPCPA (SEQ ID NO: 226), KTHTCPPCPAPELAGAPSVFL (SEQ ID NO: 237) ou KTHLCPPCPAPELAGAPSVFL (SEQ ID NO: 238) como mencionado na FIG. 4A. Estas regiões de articulação podem ser codificadas por sequências de nucleotídeos na extremidade 3' de SEQ ID NO: 117 pela região de articulação codificando sequências fornecidas na Tabela 5.
[00596] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-integrina codifica um fragmento de ligação ao antígeno integrina que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 0r99%) idêntica à sequência fornecida na SEQ ID NO: 18. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-integrina codifica um fragmento de ligação ao antígeno integrina que compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 17. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-integrina codifica um fragmento de ligação ao antígeno que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 18 e uma cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 17. Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno integrina compreende uma cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 17 com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas em FIG. 4A) ou são substituições com um aminoácido presentes naquela posição na cadeia pesada de um ou mais dos anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento em FIG. 11 A. Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno integrina compreende uma cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18 com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas em FIG. 4A) ou são substituições com um aminoácido presente naquela posição na cadeia leve de um ou mais dos anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11B.
[00597] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-integrina codifica um Fab de vedolizumabe hiperglicosilado, que compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve de SEQ ID NOs: 17 e 18, respectivamente, com uma ou mais das seguintes mutações: L116N (cadeia pesada), Q165N ou Q165S (cadeia leve), e / ou E200N (cadeia leve) (veja FIGURAS 11A (cadeia pesada) e B (cadeia leve)).
[00598] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-integrina codifica um fragmento de ligação ao antígeno e compreende as sequências de nucleotídeo codificando as seis CDRs de vedolizumabe que são sublinhadas em sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve de FIG. 4A que são espaçadas entre regiões de estrutura, geralmente regiões de estrutura humanas, e associadas com domínios constantes dependendo da forma da molécula de ligação ao antígeno, como é conhecido na técnica para formar o domínio variável de cadeia pesada / leve de um anticorpo anti-integrina ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00599] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-integrina compreende as sequências de nucleotídeo codificando as cadeias leves e pesadas da porção Fab de natalizumabe (tendo sequências de aminoácido de SEQ ID NOs. 19 e 20, respectivamente, veja Tabela 4 e FIG. 4B). As sequências de nucleotídeo podem ser códons otimizados para expressão em células humanas e podem, por exemplo, compreender as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NO: 119 (codificando uma porção Fab de cadeia pesada de natalizumabe) e SEQ ID NO: 120 (codificando uma porção Fab de cadeia leve de natalizumabe) como fornecido na Tabela 5. As sequências de cadeias pesada e leve ambas têm uma sequência sinal ou líder no N-terminal apropriado para expressão e secreção em células humanas, em particular, células de fígado humano (por exemplo, hepatócitos) ou células musculares. A sequência sinal pode ter a sequência de aminoácido de MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161). Alternativamente, a sequência sinal pode ter uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma das sequências sinal mencionadas na Tabela 2 ou 3 que corresponde às proteínas secretadas —por miócitos ou hepatócitos, respectivamente. Alternativamente, particularmente para o tratamento de MS, as cadeias leves e pesadas têm uma sequência sinal ou líder no N-terminal apropriado para expressão e secreção em células do SNC humano, por exemplo, qualquer uma das sequências sinal mencionadas na Tabela 1.
[00600] Em adição às sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve, os transgenes podem compreender, no C-terminal da sequência de domínio variável de cadeia pesada, toda ou uma porção da região de articulação. Em modalidades específicas, o domínio de ligação ao antígeno anti-integrina tem um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 19 com a sequência de região de articulação adicional iniciando após o aspartato C-terminal (D), contém toda ou uma porção da sequência de aminoácido GPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 231), e especificamente, GPPCPPCPA (SEQ ID NO: 229) ou GPPCPPCPAPEFLGGPSVFL (SEQ ID NO: 230) como mencionado na FIG. 4B. Estas regiões de articulação podem ser codificadas por sequências de nucleotídeo na extremidade 3' de SEQ ID NO: 119 pela região de articulação codificando sequências fornecidas Tabela 5.
[00601] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-integrina codifica um fragmento de ligação ao antígeno integrina que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) idêntica à sequência fornecida SEQ ID NO: 20. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-integrina codifica um fragmento de ligação ao antígeno integrina que compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 19. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-integrina codifica um fragmento de ligação ao antígeno que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 294%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 20 e uma cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 19. Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno integrina compreende uma cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 19 com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura(isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas em FIG. 4B) ou são substituições com um aminoácido presentes naquela posição na cadeia pesada de um ou mais dos anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11 A. Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno integrina compreende uma cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 20 com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas em FIG. 4B) ou são substituições com um aminoácido presentes naquela posição na cadeia leve de um ou mais dos anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11B.
[00602] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-integrina codifica um Fab de natalizumabe hiperglicosilado, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve de SEQ ID NOs: 19 e 20, respectivamente, com uma ou mais das seguintes mutações: L118N (cadeia pesada), Q159N ou Q159S (cadeia leve), e / ou E194N (cadeia leve) (veja FIGURAS 11A (cadeia pesada) e B (cadeia leve)).
[00603] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-integrina codifica um fragmento de ligação ao antígeno e compreende as sequências de nucleotídeo codificando as seis CDRs de natalizumabe que são sublinhadas em sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve de FIG. 4B que são espaçadas entre regiões de estrutura, geralmente regiões de estrutura humanas, e associadas com domínios constantes dependendo da forma da molécula de ligação ao antígeno, como é conhecido na técnica para formar o domínio variável de cadeia pesada / leve de um anticorpo anti-integrina ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00604] Em modalidades específicas, são fornecidos aqui vetores AAV compreendendo um capsídeo viral que é pelo menos 95% idêntico à sequência de aminoácido de um capsídeo AAV8 (SEQ ID NO: 78), capsídeo AAV9 (SEQ ID NO: 79) ou capsídeo AANrhlO (SEQ ID NO:80); e um genoma artificial que compreende um cassete de expressão flanqueado por repetições de terminal invertido de AAV (ITRsS), em que o cassete de expressão compreende um transgene codificando um mAb de anti-integrina, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam expressão do transgene no fígado humano ou células musculares. Métodos de Terapia genética
[00605] São fornecidos métodos de tratamento de indivíduos humanos para IBD ou MS por administração de um vetor viral contendo um transgene codificando um anticorpo anti-integrina, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. O anticorpo pode ser vedolizumabe ou natalizumabe, e é preferivelmente um fragmento Fab do mesmo, ou outro fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em modalidades, o paciente foi diagnosticado com e / ou tem sintomas associados a |BD, tais como UC ou CD, ou MS. Em modalidades particulares, IBD pode ser moderadamente ou severamente ativo. Vetores recombinantes usados para liberação do transgene são descritos na Seção 5.4.1 e
5.4.2. Em algumas modalidades, tais vetores devem ter um tropismo para células de fígado humano e podem incluir rAAV não replicante,
particularmente aqueles carregando capsídeo AAV8 ou AAV9. Os vetores recombinantes, tais como aqueles mostrados nas FIGURAS 4A e 4B, podem ser administrados de qualquer maneira de modo que o vetor recombinante entre no tecido do fígado ou músculo, preferivelmente introduzindo o vetor recombinante na corrente sanguínea. Veja 5.5.2 para detalhes a respeito dos métodos de tratamento. Em outras modalidades, tais vetores devem ter um tropismo para células do SNC humano e podem incluir rAAV não replicante, particularmente aqueles carregando um capsídeo AAV9, AAVFThIO, AAVrh20, AAVrh39, ou AAVcy5. O vetor recombinante, tal como mostrado na FIG. 4B, pode ser administrado de qualquer maneira de modo que o vetor recombinante entre no SNC, preferivelmente introduzindo o vetor recombinante no fluido espinhal cerebral (CSF). Veja Seção 5.5.1 para detalhes a respeito dos métodos de tratamento.
[00606] Indivíduos aos quais a tal terapia genética é administrada podem ser aqueles responsivos à terapia anti-integrina, Em modalidades particulares, os métodos englobam tratar pacientes que foram diagnosticados com IBD, MS, ou tem um ou mais sintomas associados a isso, e identificados como responsivos ao tratamento com um anticorpo anti-integrina ou considerados um bom candidato para terapia com um anticorpo anti-integrina. Em modalidades específicas, os pacientes foram previamente tratados com vedolizumabe e / ou natalizumabe, e foram responsivos para vedolizumabe ou natalizumabe. Para determinar a responsividade, o anticorpo anti- integrina ou produto de transgene de fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, produzidos em cultura de células, biorreatores, etc.) pode ser administrado diretamente ao indivíduo.
Anticorpos Pós-Translacionalmente Modificados Humanos
[00607] A produção do mAb HuPTM anti-integrina ou Fab HUPTM deve resultar em uma molécula "biobetter" para tratamento de IBD ou
MS realizado por meio de terapia genética, por exemplo, administrando um vetor viral ou outra construção de expressão de DNA que codifica o Fab HuPTM anti-integrina, por via subcutânea, intramuscular ou intravenosa de um paciente humano diagnosticado com ou com um ou mais sintomas de IBD ou MS, para criar um depósito permanente no fígado, músculo ou tecido do CNS que fornece continuamente um pós- translacionalmente modificado totalmente humano, como o produto transgênico sulfatado, glicosilado por humanos, produzido por células do fígado, músculo ou CNS transduzidas.
[00608] A construção de cDNA para o mAb HuPTM anti-integrina ou Fab HuPTM anti-integrina deve incluir um peptídeo sinal que assegure o processamento co e pós-translacional adequado (glicosilação e sulfatação de proteínas) pelo fígado ou células musculares transduzidas. Por exemplo, um sinal de sequência pode ser MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161). Alternativamente, em algumas modalidades, uma sequência de sinal pode ter uma sequência de aminoácido selecionada para qualquer uma das sequências de sinal estabelecidas nas Tabelas 1, 2 ou 3 que correspondem às proteínas secretadas pelas células do CNS, miócitos ou hepatócitos, respectivamente.
[00609] “Como alternativa ou tratamento adicional à terapia genética, o mAb HuPTM anti-integrina ou Fab HUPTM pode ser produzido em linhas celulares humanas por tecnologia de DNA recombinante e administrado a pacientes diagnosticados com IBD ou MS, ou para quem a terapia para IBD ou MS é considerada apropriada.
[00610] Em modalidades específicas, o mAb HuPTM anti-integrina ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem cadeias pesadas e leves com as sequências de aminoácidos das porções Fab das cadeias pesada e leve de vedolizumabe como mencionado na FIG. 4A (com sítios de glicosilação de asparaginase (N) não consenso realçados em aqua, sítios de glicosilação de glutamina (Q) realçados em verde, e sítios de sulfação Y realçados em amarelo) tem uma glicosilação, particularmente uma 2,6-sialilação, em uma ou mais das posições de aminoácidos Q113 e/ou N163 da cadeia pesada (SEQ ID NO: 17) ou Q105 e/ou N163 e/ou N215 da cadeia leve (SEQ ID NO: 18). Alternativamente ou em adição a, o mAb HuPTM ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com as sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve vedolizumabe com um grupo sulfação em Y94, Y95 e/ou Y106 da cadeia pesada (SEQ ID NO: 17) e/ou Y91 e/ou Y92 da cadeia leve (SEQ ID NO: 18). Em outras modalidades, o mAb HUPTM anti-integrina ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não contém porções NeuGc detectáveis e/ou não contém porções alfa-Gal detectáveis.
[00611] Em modalidades específicas, o mAb HuPTM anti-integrina ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem cadeias pesadas e leves com as sequências de aminoácidos das porções Fab das cadeias pesada e leve de natalizumabe como mencionado na FIG. 4B (com sítios de glicosilação de asparaginase (N) não consenso realçados em aqua, sítios de glicosilação de glutamina (Q) realçados em verde, e sítios de sulfação Y realçados em amarelo) com uma glicolisação, particularmente uma 2,6-sialilação, em uma ou mais das posições de aminoácidos Q115, N165, e/ou N207 da cadeia pesada (SEQ ID NO:19) ou Q99, N157 e/ou N209 da cadeia leve (SEQ ID NO:20). Alternativamente ou em adição a, o mAb HuPTM ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com as sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve natalizumabe com um grupo de sulfação em Y94 e/ou Y95 da cadeia pesada (SEQ ID NO: 19) e/ou Y86 e/ou Y87 da cadeia leve (SEQ ID NO:20). Em outras modalidades, o mAb HUPTM anti-integrina ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não contém porções NeuGc detectáveis e/ou não contém porções alfa-Gal detectáveis.
[00612] Em certas modalidades, o mAb ou Fab HuPTM é terapeuticamente eficaz e é no mínimo 0,5%, 1% ou 2% glicosilado e/ou sulfatado e pode ser pelo menos 5%, 10% ou mesmo 50% ou 100% glicosilado e/ou sulfatado. O objetivo do tratamento de terapia genética fornecido aqui é retardar ou interromper a progressão da IBD ou da MS, particularmente uma redução na dor e desconforto do paciente e/ou no caso da MS, melhorias na mobilidade. A eficácia pode ser monitorada através da pontuação dos sintomas ou grau de inflamação no tecido afetado, por exemplo, no que diz respeito à UC, a eficácia pode ser monitorada através da avaliação de uma pontuação de Mayo e de um subpontuação de endoscopia durante o tratamento (por exemplo, ver Lobaton et al. (2015) J. Crohns Colitis. 2015 Oct;9(10):846-52, "The Modified Mayo Endoscopic Score (MMES): A New Index for the Assessment of Extension and Severity of Endoscopic Activity in Ulcerative Colitis Patients."). No que diz respeito à CD, a eficácia pode ser monitorada através da avaliação do Índice de Atividade de Doença de Crohn [CDAI] ao longo do tratamento (por exemplo, ver Best WR et al. (1976) Gastroenterology, Mar;70(3):439-44, "Development of a Doença de Crohn activity index. National Cooperative Doença de Crohn Study."). Por exemplo, em relação à MS, a eficácia pode ser monitorada através da avaliação da frequência de recidivas (por exemplo, taxa de recidiva anual), estado da incapacidade física (por exemplo, pontuação na escala de estado de Incapacidade Expandida de Kurtzke (EDSS)) e marcadores biológicos, incluindo exames cerebrais usando ressonância magnética (MRI) (por exemplo, avaliação de lesões que aumentam o gadolínio (Gd), ponderadas em T1 e lesões hiperintensas em T2 por meio de ressonância magnética).
[00613] “Combinações de liberação da mAb HuPTM anti-integrina ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, para o CNS, fígado, ou músculos acompanhados por liberação de outros tratamentos disponíveis são abrangidas pelos métodos fornecidos aqui. Os tratamentos — adicionais = podem ser administrados antes, concomitantemente, ou subsequente ao tratamento de terapia genética. Os tratamentos disponíveis para IBD que poderiam ser combinados com a terapia genética aqui fornecida incluem, mas não estão limitados a, aminossalicilatos, corticosteróides e imunomoduladores (por exemplo, azatioprina, G6-mercaptopurina, e/ou metotrexato) e administração com agentes anti-integrina, incluindo, mas não limitado a vedolizumabe ou natalizumabe. Os tratamentos disponíveis para MS que poderiam ser combinados com a terapia genética aqui fornecida incluem, mas não são limitados a, interferon beta, interferon beta 1a, acetato de glatirâmer, ciclofosfamida, corticosteróides, imunomoduladores (por exemplo, azatioprina, 6-mercaptopurina, e/ou metotrexato) e mitoxantrona e administração com agentes anti-integrina incluindo, mas não limitado a, natalizumabe.
5.3.6 mAbs HuPTM Anti-PCSK9 e anti-ANGPTL3
[00614] “Composições e métodos são descritos para a liberação de mAbs HuPTM e fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo, tal como Fabs HuPTM, que se ligam à pró-proteina convertase subtilisina/quexina tipo 9 (PCSK9) derivada de anti-PCSK9 ou tipo angiopoetina 3 (ANGPTL3) indicado para o tratamento da hipercolesterolemia familiar heterozigótica (HeFH), hipercolesterolemia familiar homozigótica (HoFH) ou doença cardiovascular aterosclerótica (DAC), redução do colesterol lipoproteína de baixa densidade (LDL-C), triglicerídeo (TG), e/ou níveis totais de colesterol (CT), e/ou reduzindo ou retardando a formação de placas ateroscleróticas. Em modalidades particulares, o mAb HuPTM tem a sequência de aminoácidos de alirocumabe, evolocumabe, evinacumabe, ou um fragmento de ligação ao antígeno de um dos anteriormente mencionados. As sequências de aminoácidos dos fragmentos Fab de alirocumabe, evolocumabe, e evinacumabe são fornecidas nas FIGURAS 5A a 5C, respectivamente. A liberação pode ser realizada por meio de terapia genética, por exemplo, pela administração de um vetor viral ou outra construção de expressão de DNA codificando um mAb HuPTM de ligação a POSK9 ou de ligação a anticANGPTL3 (ou um fragmento de ligação ao antígeno e/ou um derivado hiperglicosilado ou outro derivado do mesmo) para pacientes (indivíduos humanos) diagnosticados com, ou com um ou mais sintomas de HeFH, HoFH, ou ACD; níveis anormalmente elevados de LDL-C, TG, e/ou TC; ou placa aterosclerótica anormal para criar um depósito permanente que forneça continuamente o PTM humano, por exemplo, produto de transgene glicosilado por seres humanos. Transgenes
[00615] São fornecidos vetores recombinantes contendo um transgene que codifica um mAb HUPTM ou Fab HuPTM (ou outro fragmento de ligação ao antígeno do mAb HuPTM) que se liga a POSK9 ou ANGPTL3 que pode ser administrado para liberar o mAb HUPTM ou fragmento de ligação ao antígeno em um paciente. O transgene é um ácido nucleico compreendendo as sequências nucleotídicas que codificam um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo que se liga a POSK9 ou ANGPTL3, tal como alirocumabe, evolocumabe, evinacumabe ou variantes dos mesmos, conforme detalhado aqui. O transgene também pode codificar um fragmento de ligação ao antígeno anti:-PCSK9 ou anticANGPTL3 que contém sítios de glicosilação adicionais (por exemplo, ver Courtois et al.).
[00616] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-PCSK9 compreende as sequências nucleotídicas que codificam as cadeias pesadas e leves da porção Fab do alirocumabe (possuindo sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs. 21 e 22, respectivamente, consulte a Tabela 4 e FIG. 5A). As sequências nucleotídicas podem ser otimizadas por códon para expressão em células humanas e podem, por exemplo, compreender as sequências nucleotídicas de SEQ ID NO: 121 (codificando uma porção Fab de cadeia pesada de alirocumabe) e SEQ ID NO: 122 (codificando uma porção Fab de cadeia leve de alirocumabe) como mencionado na Tabela 5. As sequências de cadeia pesada e leve têm uma sequência sinal ou líder no N-terminal apropriado para expressão e secreção em células humanas, em particular, células de fígado humano (por exemplo, hepatócitos) ou células musculares humanas. À sequência sinal pode ter a sequência de aminoácido de MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161). Alternativamente, a sequência sinal pode ter uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma das sequências sinal mencionadas na Tabela 2 ou 3 que correspondem às proteínas secretadas por miócitos ou hepatócitos, respectivamente.
[00617] Além das sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve, os transgenes podem compreender, no C-terminal da sequência de domínio variável de cadeia pesada, todo ou uma porção da região de articulação. Em modalidades específicas, o domínio de ligação ao antígeno anti-PCSK9 com um domínio variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 21 com sequência de região de articulação adicional iniciada após o ácido aspártico (D) C-terminal, contém todo ou uma parte da sequência de aminoácidos KTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 222), e especificamente, KTHT (SEQ ID NO: 224), KTHL (SEQ ID NO: 223), KTHTCPPCPA (SEQ ID NO: 225), KTHLCPPCPA (SEQ ID NO: 226), KTHTCPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 227), ou KTHLCPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 228) como estabelecido na FIG 5A. Essas regiões de articulação podem ser codificadas por sequências de nucleotídeos na extremidade 3' da SEQ ID NO: 21 pela região de articulação codificando as sequências mencionadas na
Tabela 5.
[00618] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-PCSK9 codifica um fragmento de ligação ao antígeno PCSK9 que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 22. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-PCSK9 codifica um fragmento de ligação ao antígeno PCSK9 que compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 21. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-PCSK9 codifica um fragmento de ligação ao antígeno que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 22 e uma cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 21. Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno PCSK9 compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 5 A) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia pesada de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, conforme identificado pelo alinhamento na FIG. 11A. Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno PCSK9 compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 com 1, 2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 5 A) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia leve de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, conforme identificado pelo alinhamento na FIG. 11B.
[00619] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-PCSK9 codifica um Fab de alirocumabe hiperglicosilado, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve de SEQ ID NOs: 21 e 22, respectivamente, com uma ou mais das seguintes mutações: L113N (cadeia pesada), Q166N ou Q1668 (cadeia leve), e/ou E201N (cadeia leve) (ver FIGURAS 11A (cadeia pesada) e B (cadeia leve)).
[00620] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-PCSK9 codifica um fragmento de ligação ao antígeno e compreende as sequências nucleotídicas que codificam as seis CDRs de alirocumabe que estão sublinhadas nas sequências de domínio variável das cadeias pesada e leve da FIG. 5A que estão espaçadas entre regiões de estrutura, geralmente regiões de estrutura humanas, e associados a domínios constantes, dependendo da forma da molécula de ligação ao antígeno, como é conhecido na técnica para formar o domínio variável da cadeia leve e/ou pesada de um anticorpo anti-PCSK9 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00621] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-PCSK9 compreende as sequências nucleotídicas que codificam as cadeias pesadas e leves da porção Fab de evolocumabe (contendo sequências de aminoácidos da SEQ ID NOs. 23 e 24, respectivamente, ver Tabela 4 e FIG. 5B). As sequências nucleotídicas podem ser otimizadas por códon para expressão em células humanas e podem, por exemplo, compreender as sequências nucleotídicas de SEQ ID NO: 123 (codificando a porção Fab de evolocumabe de cadeia pesada) e SEQ ID NO: 124 (codificando a porção Fab de evolocumabe de cadeia leve) como mencionado na Tabela 5. As sequências das cadeias pesada e leve possuem uma sequência de sinal ou líder no N-terminal apropriado para expressão e secreção em células humanas, em particular, células de fígado humano (por exemplo, hepatócitos) ou células musculares. A sequência sinal pode ter a sequência de aminoácido de MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161). Alternativamente, a sequência sinal pode ter uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma das sequências sinal mencionadas na Tabela 2 ou 3 que correspondem às proteínas secretadas por miócitos ou hepatócitos, respectivamente.
[00622] Além das sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve, os transgenes podem compreender, no C-terminal da sequência de domínio variável de cadeia pesada, toda ou uma porção da região de articulação. Em modalidades específicas, o domínio de ligação ao antígeno anti-PCSK9 com um domínio variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 23 com sequência de região de articulação adicional iniciada após o ácido glutâmico (E) C-terminal contém toda ou uma parte da sequência de aminoácidos KTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 222), e especificamente, KTHT (SEQ ID NO: 224), KTHL (SEQ ID NO: 223), KTHTCPPCPA (SEQ ID NO: 225), KTHLCPPCPA (SEQ ID NO: 226), KTHTCPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 227), ou KTHLCPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 228) como estabelecido na FIG 5B. Essas regiões de articulação podem ser codificadas por sequências nucleotídicas na extremidade 3' da SEQ ID NO: 23 pela região de articulação codificando as sequências mencionadas na Tabela 5.
[00623] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-PCSK9 codifica um fragmento de ligação ao antígeno PCSK9 que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 24. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti- PCSK9 codifica um fragmento de ligação ao antígeno PCSK9 que compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 294%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 23. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-PCSK9 codifica um fragmento de ligação ao antígeno que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 24 e uma cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica às sequências mencionadas na SEQ ID NO: 23. Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno POSK9 compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 com 1,2,3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 5B) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia pesada de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, conforme identificado pelo alinhamento em FIG. 11 A. Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno PCSK9 compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 5B) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia leve de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, conforme identificado pelo alinhamento na FIG. 11B.
[00624] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-PCSK9 codifica um Fab evolocumabe hiperglicosilado, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve de SEQ ID NOs: 23 e 24, respectivamente, com uma ou mais das seguintes mutações: T110N (cadeia pesada) e/ou Q197N (cadeia leve) (ver FIGURAS 11A (cadeia pesada) e B (cadeia leve)).
[00625] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-PCSK9 codifica um fragmento de ligação ao antígeno e compreende as sequências nucleotídicas que codificam as seis CDRs de evolocumabe que estão sublinhadas nas sequências de domínio variável das cadeias pesada e leve da FIG. 5B que estão espaçadas entre regiões de estrutura, geralmente regiões de estrutura humanas, e associadas a domínios constantes, dependendo da forma da molécula de ligação ao antígeno, como é conhecido na técnica para formar o domínio variável da cadeia leve e/ou pesada de um anticorpo anti-PCSK9 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00626] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anticANGPTL3 compreende as sequências de nucleotídeos que codificam os domínios variáveis das cadeias pesadas e leves do evinacumabe (possuindo sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs. 25 e 26, respectivamente, ver Tabela 4 e FIG. 5C). Estes podem ser fundidos ao domínio constante CI da cadeia pesada e/ou ao domínio constante da cadeia leve para formar um fragmento Fab. As sequências nucleotídicas podem ser otimizadas por códon para expressão em células humanas e podem, por exemplo, compreender as sequências nucleotídicas da SEQ ID NO: 25 (codificando um domínio variável da cadeia pesada de evinacumabe) e SEQ ID NO: 26 (codificando um domínio variável da cadeia leve de evinacumabe) como mencionado na Tabela 5. As sequências das cadeias pesadas e leves possuem uma sequência de sinal ou terminação N apropriada para expressão e secreção em células humanas, em particular, células de fígado humano (por exemplo, hepatócitos) ou células musculares. À sequência sinal pode ter a sequência de aminoácido de MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161). Alternativamente, a sequência sinal pode ter uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma das sequências sinal mencionadas na Tabela 2 ou 3 que correspondem às proteínas secretadas por miócitos ou hepatócitos, respectivamente.
[00627] Além das sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve, os transgenes podem compreender, no C-terminal da sequência de cadeia pesada, toda ou uma porção da região de articulação. Em modalidades específicas, o domínio de ligação ao antígeno anti- ANGPTL3 com um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: com sequência adicional de região de articulação começando após o ácido aspártico (D) C-terminal, contém toda ou uma porção da sequência de aminoácido KTHT CPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 227), e especificamente, KTHT (SEQ ID NO: 224), KTHL (SEQ ID NO: 223), KTHTCPPCPA (SEQ |D NO: 225), KTHLCPPCPA (SEQ ID NO:
226), KTHTCPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 227), ou KTHLCPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 228) como estabelecido na FIG 5C. Essas regiões de articulação podem ser codificadas por sequências de nucleotídeos na extremidade 3' da SEQ ID NO: 25 pela região de articulação codificando as sequências mencionadas na Tabela 5.
[00628] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-ANGPTL3 codifica um fragmento de ligação ao antígeno ANGPTL3 que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 26. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-ANGPTL3 codifica um fragmento de ligação ao antígeno ANGPTL3 que compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 25. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-ANGPTL3 codifica um fragmento de ligação ao antígeno que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 294%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 26 e uma cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 25. Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno ANGPTL3 compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido,
e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 5C) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia pesada de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, conforme identificado pelo alinhamento em FIG. 11 A. Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno ANGPTL3 compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 5C) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia leve de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, conforme identificado pelo alinhamento na FIG. 11B.
[00629] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno antic-ANGPTL3 codifica um Fab de evinacumabe hiperglicosilado, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve da SEQ ID NOs: 25 e 26, respectivamente, com uma ou mais das seguintes mutações: M121N (cadeia pesada), Q160N ou Q160S (cadeia leve), e/ou E195N (cadeia leve) (ver FIGURAS 11A (cadeia pesada) e B (cadeia leve)).
[00630] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-ANGPTL3 codifica um fragmento de ligação ao antígeno e compreende as sequências nucleotídicas que codificam as seis CDRs de evinacumabe que estão sublinhadas nas sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve da FIG. 5C que são espaçadas entre regiões de estrutura, regiões de estrutura geralmente humanas e associadas a domínios constantes, dependendo da forma da molécula de ligação ao antígeno, como é conhecido na técnica para formar o domínio variável de cadeia leve e/ou pesada de um anticorpo anti-ANGPTL3 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Métodos de Terapia genética
[00631] São fornecidos métodos de tratamento de indivíduos humanos para HeFH, HoFH ou ADC pela administração de um vetor viral contendo um transgene que codifica um anti-PCSK9 ou anti- ANGPTL3 mAb, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. O anticorpo pode ser alirocumabe, evolocumabe ou evinacumabe, e é preferivelmente um fragmento Fab deste ou outro fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Nas modalidades, o paciente foi diagnosticado com, e/ou apresenta sintomas associados a HeFH, HoFH ou ADC. Os vetores recombinantes utilizados para a liberação do transgene são descritos na Seção 5.4.2. Esses vetores devem ter um tropismo para células do fígado ou músculos humanos e podem incluir rAAV não replicantes, particularmente aquelas portadoras de um capsídeo AAV8 ou AAV9. Os vetores recombinantes, como os mostrados nas FIGURAS 5A a 5C, pode ser administrado de qualquer maneira tal que o vetor recombinante entre no tecido do fígado ou músculo, preferivelmente introduzindo o vetor recombinante na corrente sanguínea. Consulte a Seção 5.5.2 para detalhes sobre os métodos de tratamento.
[00632] Indivíduos aos quais a tal terapia genética é administrada podem ser responsáveis pela terapia anti-PCSK9 ou anti-ANGPTL3. Em modalidades particulares, os métodos abrangem o tratamento de pacientes que foram diagnosticados com HeFH, HoFH ou ADC, ou que têm um ou mais sintomas associados, identificados como responsivos ao tratamento com um anticorpo anti-PCSK9 ou anti-ANGPTL3 ou considerado um bom candidato à terapia com um anticorpo anti-PCSK9 ou anticANGPTL3. Em modalidades específicas, os pacientes foram tratados — anteriormente = com alirocumabe, evo-locumabe ou evinacumabe e foram encontrados como responsivos a alirocumabe,
evolocumabe ou evinacumabe. Para determinar a capacidade de resposta, o anticorpo anti-PCSK9 ou anti-ANGPTL3 ou transgene de fragmento de ligação ao produto de antígeno (por exemplo, produzidos em cultura celular, biorreatores, etc.) podem ser administrados diretamente ao indivíduo. Anticorpos Pós-Translacionalmente Modificados Humanos
[00633] A produção do anticPCSK9 ou mAb HuPTM anti-ANGPTL3 ou Fab HUPTM deve resultar em uma molécula “biobetter” para o tratamento de HeFH, HoFH, ou ADC realizado por meio de terapia genética - por exemplo, administrando um vetor viral ou outra construção de expressão de DNA codificando o anti-PCSK9 ou Fab HuPTM anticANGPTL3, por via subcutânea, intramuscular ou intravenosa a indivíduos humanos (pacientes) diagnosticado ou com um ou mais sintomas de HeFH, HoFH, ou ADC, para criar um depósito permanente no tecido do fígado ou músculo que fornece continuamente o produto de transgene sulfatado, pós-translacionalmente modificado totalmente humano, por exemplo, glicosilado humano produzido por células de fígado ou músculo transduzidas.
[00634] Em modalidades específicas, o mAb HUPTM anti-PCSK9 ou fragmento de ligação ao antígeno tem cadeias pesadas e leves com as sequências de aminoácidos das porções Fab de cadeia pesada e leve de aliocumabe como mencionado na FIG. 5A (com sítios de glicosilação de asparaginase (N) não consenso realçados em aqua, sítios de glicosilação de glutamina (Q) realçados em verde, e sítios de sulfação Y realçados em amarelo) com uma glicolisação, particularmente uma 2,6-sialilação, em uma ou mais das posições de aminoácidos N30, N59, e/ou N160 da cadeia pesada (SEQ ID NO:21) ou N22, N35, Q106, N164, e/ou N216 da cadeia leve (SEQ ID NO: 22). Alternativamente ou em adição a, o mAb HuPTM ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com as sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve alirocumabe com um grupo de sulfação em Y94 e/ou Y95 da cadeia pesada (SEQ ID NO: 21) e/ou Y92 e/ou Y93 da cadeia leve (SEQ ID NO: 22). Em outras modalidades, o anti-PCSK9 mAb HuPTM ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não contém porções NeuGc detectáveis e/ou não contém porções alfa-Gal detectáveis.
[00635] Em modalidades específicas, o antic:PCSK9 mAb HUPTM ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem cadeias pesadas e leves com as sequências de aminoácidos das porções Fab das cadeias pesada e leve do evolocumabe como mencionado na FIG. 5B (com sítios de glicosilação de asparaginase (N) não consenso realçados em aqua, sítios de glicosilação de glutamina (Q) realçados em verde, e sítios de sulfação Y realçados em amarelo) com uma glicolisação, particularmente uma 2,6-sialilação, em uma ou mais das posições de aminoácidos Q107 e/ou N157 e/ou N190 e/ou N199 da cadeia pesada (SEQ ID NO: 23) ou N71 e/ou N173 da cadeia leve (SEQ ID NO: 24). Alternativamente ou em adição a, o mAb HuPTM ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com as sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve evolocumabe com um grupo de sulfação em Y94 e/ou Y95 da cadeia pesada (SEQ ID NO: 23) e/ou Y88 e/ou Y89 da cadeia leve (SEQ ID NO: 24). Em outras modalidades, o mAb HUPTM anti-PCSK9 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não contém porções NeuGc detectáveis e/ou não contém porções alfa-Gal detectáveis.
[00636] Em modalidades específicas, o mAb HUPTM anti-ANGPTL3 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem cadeias pesadas e leves com as sequências de aminoácidos das porções Fab das cadeias pesada e leve de evinacumabe como mencionado na FIG. 5C (com sítios de glicosilação de asparaginase (N) não consenso realçados em aqua, sítios de glicosilação de glutamina (Q) realçados em verde, e sítios de sulfação Y realçados em amarelo) com uma glicolisação, particularmente uma 2,6-sialilação, em uma ou mais das posições de aminoácidos N77, Q118, e/ou N168 da cadeia pesada (SEQ ID NO: 25) ou Q100, N158 e/ou N210 da cadeia leve (SEQ ID NO: 26). Alternativamente ou em adição a, o mAb HuPTM ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com as sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve de evinacumabe com um grupo de sulfação em Y95 da cadeia pesada (SEQ ID NO: 25) e/ou Y86 e/ou Y87 da cadeia leve (SEQ ID NO: 26). Em outras modalidades, o mAb HUPTM anti-PCSK9 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não contém porções NeuGc detectáveis e/ou não contém porções alfa-Gal detectáveis.
[00637] Em certas modalidades, o mAb ou Fab HuUPTM é terapeuticamente eficaz e é no mínimo 0,5%, 1% ou 2% glicosilado e/ou sulfatado e pode ser pelo menos 5%, 10% ou mesmo 50% ou 100% glicosilado e/ou sulfatado. O objetivo do tratamento de terapia genética fornecido aqui é retardar ou interromper a progressão de HeFH, HoFH ou ADC e/ou para diminuir os níveis de colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL-C). A eficácia pode ser monitorada monitorando os níveis de LDL-C, por exemplo, a eficácia pode ser monitorada avaliando a variação percentual média do LDL-C a partir da linha de base.
[00638] Combinações de liberação do mAb HuPTM anti-ANGPTL3 ou anti-PCSK9 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, para o fígado ou músculo acompanhadas por liberação de outros tratamentos disponíveis são abrangidas pelos métodos fornecidos aqui. Os tratamentos — adicionais = podem ser administrados antes, concomitantemente, ou subsequente ao tratamento de terapia genética. Os tratamentos disponíveis para HeFH, HoFH ou ACD que podem ser combinados com a terapia genética aqui fornecida incluem, mas não são limitados a, dieta, estatinas, ezetimiba e aférese e administração de LDL com agentes anti-PCSK9 ou anti-ANGPTL3, incluindo, mas não limitados a, alirocumabe, evolocumabe ou evinacumabe.
5.3.7 mAb HuPTMs Anti-OxPL
[00639] “Composições e métodos são descritos para a liberação de um mAb HuPTM;s e fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo, tal como Fab HuPTMs, que se ligam a fosfolipídios oxidados (OxPL) indicados para o tratamento de redução de e/ou retardamento da doença cardiovascular, incluindo doença cardiovascular aterosclerótica (DAC), formação de placa aterosclerótica, níveis anormalmente elevados de colesterol não HDL e LDL, estenose aórtica, estenose hepática, ou hipercolesterolemia. Em modalidades particulares, o mAb HuPTM possui a sequência de aminoácidos E06-scFv ou um fragmento de ligação ao antígeno da mesma. As sequências de aminoácidos de EO6-scFv são fornecidas na FIG. 5D. A liberação pode ser realizada por meio de terapia genética, por exemplo, administrando um vetor viral ou outra construção de expressão de DNA codificando um mAb HuUPTM de ligação a OxPL (ou um fragmento de ligação ao antígeno e/ou um derivado hiperglicosilado ou outro derivado do mesmo) a pacientes (indivíduos humanos) diagnosticados ou com um ou mais sintomas de doença cardiovascular, DCA, hipercolesterolemia, níveis anormalmente elevados de colesterol não HDL e/ou LDL, estenose aórtica, estenose hepática, e/ou placa aterosclerótica anormal para criar um depósito permanente que forneça continuamente o PTM humano, por exemplo, produto de transgene glicosilado por humanos. Transgenes
[00640] São fornecidos vetores recombinantes contendo um transgene que codifica um mAb HuPTM ou Fab HuPTM (ou outro fragmento de ligação ao antígeno do mAb HuPTM) que se liga ao OxPL que pode ser administrado para liberar o mAb HUPTM ou fragmento de ligação ao antígeno em um paciente. O transgene é um ácido nucleico compreendendo as sequências nucleotídicas que codificam um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo que se liga ao OxPL, como E06-scFv ou variantes dos mesmos, conforme detalhado aqui. O transgene também pode codificar um fragmento de ligação ao antígeno anti-OxPL que contém sítios de glicosilação adicionais (por exemplo, ver Courtois et al.).
[00641] Em certas modalidades, o anti-OxPL transgene de fragmento de ligação ao antígeno compreende as sequências nucleotídicas que codificam os domínios variáveis das cadeias pesada e leve de E06-scFv (possuindo sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs. 59 e 60, respectivamente, ver Tabela 4 e FIG. 5D). O E06-scFv é uma molécula de scFv e, portanto, contém os domínios variáveis das cadeias pesada e leve de um mAb anti-OxPL conectado por um ligante flexível. As sequências nucleotídicas podem ser otimizadas por códon para expressão em células humanas e podem, por exemplo, compreender as sequências nucleotídicas da SEQ ID NO: 159 (codificando um domínio variável da cadeia pesada de E06-scFv) e SEQ ID NO: 160 (codificando uma E0O6- variável de cadeia leve do scFv) como mencionado na Tabela 5. EO06 é um scFv e, como tal, o scFv é expresso como uma cadeia proteica, com um ligante entre as cadeias leve e pesada. O scFv possui uma sequência líder no terminal N para expressão e secreção apropriadas em células humanas, particularmente células de fígado humano (como hepatócitos) ou células musculares humanas. Em outras modalidades onde as cadeias pesadas e leves são expressas como proteínas separadas, ambas têm uma sequência sinal ou líder no N-terminal apropriado para expressão e secreção em células humanas, em particular, células de fígado humano (por exemplo, hepatócitos) ou células musculares humanas. À sequência sinal pode ter a sequência de aminoácido de
MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161). Alternativamente, a sequência sinal pode ter uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma das sequências sinal mencionadas na Tabela 2 ou 3 que correspondem às proteínas secretadas por miócitos ou hepatócitos, respectivamente.
[00642] Além das sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve, os trangenes podem compreender, no C-terminal da sequência de domínio variável da cadeia leve, um ligante peptídico flexível. À sequência ligante peptídica flexível pode compreender resíduos flexíveis, como glicina (G) ou serina (S). Em algumas modalidades, o ligante peptídico flexível pode compreender 10 a 30 resíduos ou G, S ou Ge S. Os resíduos carregados, como E e K, podem ser usados e intercalados para aumentar a solubilidade. A sequência ligante peptídica flexível pode ter a sequência de aminoácidos de (GGGGS),, em que n pode ser 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 (SEQ ID NO: 243). Nesse caso, a sequência sinal é fundido ao terminal N do scFv ou a sequência de domínio variável da cadeia pesada ou leve, conforme o caso.
[00643] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-OxPL codifica um fragmento de ligação ao antígeno OxPL que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 294%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 60. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-OxPL codifica um fragmento de ligação ao antígeno OxPL que compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 59. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-OxPL codifica um fragmento de ligação ao antígeno que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 294%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 60 e uma cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 59. Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno OxPL compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59 com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feita nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 5D) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia pesada de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, conforme identificado pelo alinhamento em FIG. 11 A. Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno OxPL compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 com 1,2, 3,4, 5,6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 5D) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia leve de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, conforme identificado pelo alinhamento em FIG. 11B.
[00644] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-OxPL codifica a E06-scFv Fab hiperglicosilado, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve de SEQ ID NOs: 59 e 60, respectivamente, com opcionalmente a mutação T118N
(cadeia pesada) (ver FIGURAS 11A (cadeia pesada) e B (cadeia leve)).
[00645] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-OxPL codifica um fragmento de ligação ao antígeno e compreende as sequências nucleotídicas que codificam as seis CDRs E06-scFv que estão sublinhadas nas sequências de domínio variável das cadeias pesada e leve da FIG. 5D que estão espaçadas entre regiões de estrutura, regiões de estrutura geralmente humanas e associadas a domínios constantes, dependendo da forma da molécula de ligação ao antígeno, como é conhecido na técnica para formar o domínio variável da cadeia leve e/ou pesada de um anticorpo anti-OxPL ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
Métodos de Terapia genética
[00646] São fornecidas métodos de tratar indivíduos humanos para doenças cardiovasculares, ACD, hipercolesterolemia, níveis anormalmente elevados de colesterol não HDL e/ou LDL, estenose aórtica, estenose hepática, e/ou placa aterosclerótica anormal pela administração de um vetor viral contendo um transgene que codifica um mAb anti-OxPL, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. O anticorpo pode ser E06-scFv e é preferencialmente um fragmento Fab do mesmo, ou outro fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em modalidades, o paciente pode ser diagnosticado com e/ou tendo sintomas — associados “com doença cardiovascular, ACD, hipercolesterolemia, níveis anormalmente elevados de colesterol não HDL e/ou LDL, estenose aórtica, estenose hepática, e/ou placa aterosclerótica anormal. Os vetores recombinantes utilizados para a liberação do transgene são descritos na Seção 5.4.2. Esses vetores devem ter um tropismo para células de fígado ou músculo humanas e pode incluir rAAV não replicante, particularmente aquelas portadoras de um capsídeo AAV8 ou AAV9. Os vetores recombinantes, como mostrados na FIG. 5D, podem ser administrados de qualquer maneira tal que o vetor recombinante entre no fígado ou tecido muscular, preferencialmente introduzindo o vetor recombinante na corrente sanguínea. Consulte a Seção 5.5.2 para detalhes sobre os métodos de tratamento.
[00647] Indivíduos ao qual a terapia genética é administrada podem ser aqueles que respondem à terapia anti-OxPL. Em modalidades particulares, os métodos abrangem o tratamento de pacientes diagnosticados com doença cardiovascular, ACD, hipercolesterolemia, níveis anormalmente elevados de colesterol não HDL e/ou LDL, estenose aórtica, estenose hepática, e/ou placa aterosclerótica anormal ou com um ou mais sintomas associados a ela e identificados como responsivos ao tratamento com um anticorpo anti-cOxXPL ou considerados bons candidatos à terapia com um anticorpo anti-OxPL. Em modalidades específicas, os pacientes foram tratados anteriormente com EO06-scFv ou E06 e foram encontrados para responder a EO06-scFv ou E06. Para determinar a capacidade de resposta, o anticorpo anti- OxPL ou produto de transgene de fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, produzidos em cultura celular, biorreatores, etc.) podem ser administrados diretamente ao indivíduo. Anticorpos Pós-Translacionalmente Modificados Humanos
[00648] A produção domAb HuPTM anti-OxPL ou Fab HUPTM deve resultar em uma molécula "biobetter" para o tratamento de doença cardiovascular, ACD, hipercolesterolemia, níveis anormalmente elevados de colesterol não HDL e/ou LDL, estenose aórtica, estenose hepática, e/ou placa aterosclerótica anormal realizado por meio de terapia genética - por exemplo, administrando um vetor viral ou outra construção de expressão de DNA codificando o Fab HuUPTM anti-OxPL, por via subcutânea, intramuscular ou intravenosa a indivíduos humanos (pacientes) diagnosticado com ou tendo um ou mais sintomas de doença cardiovascular, ACD, hipercolesterolemia, níveis anormalmente elevados de colesterol não HDL e/ou LDL, estenose aórtica, estenose hepática, e/ou placa aterosclerótica anormal, para criar um depósito permanente no tecido do fígado ou músculo que fornece continuamente o produto de transgene sulfatado, pós-translacionalmente modificado totalmente humano, por exemplo, glicosilado humano produzido por células de fígado ou músculo transduzidas.
[00649] Em modalidades específicas, o anticOxPL mAb HuPTM ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem cadeias pesadas e leves com as sequências de aminoácidos das porções Fab das cadeias pesada e leve de E06-scFv como mencionado na FIG. 5D (com sítios de glicosilação de asparaginase (N) não consenso realçados em aqua, sítios de glicosilação de glutamina (Q) realçados em verde, e sítios de sulfação Y realçados em amarelo) com uma glicolisação, particularmente uma 2,6-sialilação, em uma ou mais das posições de aminoácidos N53 da cadeia pesada (SEQ ID NO:59). Alternativamente ou em adição a, o HUPTM scFv ou outro fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com as sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve E06-scFv com um grupo de sulfação em Y58 e/ou Y62 e/ou Y96 e/ou Y97 da cadeia pesada (SEQ ID NO: 59) e/ou Y42 da cadeia leve (SEQ ID NO: 60). Em outras modalidades, o mAb HUPTM anti-OxPL ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não contém porções NeuGc detectáveis e/ou não contém porções alfa-Gal detectáveis.
[00650] Em certas modalidades, o MAb HuUPTM ou Fab de scFv é terapeuticamente eficaz e é no mínimo 0,5%, 1% ou 2% glicosilado e/ou sulfatado e pode ser pelo menos 5%, 10% ou até 50% ou 100% glicosilado e/ou sulfatado. O objetivo do tratamento de terapia genética fornecido aqui é tratar, retardar e/ou interromper a progressão de doença cardiovascular, ACD, hipercolesterolemia, níveis anormalmente elevados de colesterol não HDL e/ou LDL, estenose aórtica, estenose hepática, e/ou placa aterosclerótica anormal. A eficácia pode ser monitorada monitorando os níveis de LDL, marcadores de inflamação ou alterações no grau de estenose aórtica, como monitorando alterações na área da válvula aórtica, gradientes transvalvares de pico e médios, e/ou velocidade máxima da aorta. Por exemplo, a eficácia pode ser monitorada avaliando a variação percentual média do LDL a partir da linha de base.
[00651] “Combinações de liberação do mAb HuUPTM anti-OxPL ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, para o fígado ou músculo acompanhadas por liberação de outros tratamentos disponíveis são abrangidas pelos métodos fornecidos aqui. Os tratamentos adicionais podem ser administrados antes, concomitantemente, ou subsequente ao tratamento de terapia genética. Tratamentos disponíveis para doenças cardiovasculares, ACD, hipercolesterolemia, níveis anormalmente elevados de colesterol não HDL e/ou LDL, estenose aórtica, estenose hepática, e/ou placa aterosclerótica anormal que poderiam ser combinados com a terapia genética aqui fornecida incluem, mas não são limitados a, dieta, estatinas, ezetimiba e aférese e administração de LDL com agentes anti-OxPL, incluindo, mas não limitado a, EO6-scFv.
5.3.8. Construções e Formulações Anti-RANKL HuPTM para Osteoporose
[00652] Composições e métodos são descritos para a liberação de mAb HuPTMs e fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo, como Fabs HUPTM , que se ligam ao ativador de receptor do fator nuclear kappa-B ligante (RANKL) derivado de anticorpo anti-RANKL, como denosumabe (FIG. 6), e indicado para o tratamento da osteoporose ou perda ou fraqueza óssea anormal (por exemplo, tratamento de tumor de células gigantes do osso, tratamento da perda óssea induzida pelo tratamento, diminuição da perda (ou aumento) de massa óssea na mama e pacientes com câncer de próstata, prevenindo eventos relacionados ao esqueleto devido a metástase óssea ou diminuindo a reabsorção e renovação óssea. Em modalidades particulares, o mAb HuPTM possui a sequência de aminoácidos do denosumabe ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. A sequência de aminoácidos do fragmento Fab deste anticorpo é fornecida na FIG. 6. À liberação pode ser realizada por meio de terapia genética, por exemplo, administrando um vetor viral ou outra construção de expressão de DNA codificando um mAb HuUPTM de ligação a RANKL (ou um fragmento de ligação ao antígeno e/ou um derivado hiperglicosilado ou outro derivado) para pacientes (indivíduos humanos) diagnosticado com osteoporose ou sofrendo perda óssea para criar um depósito permanente que forneça continuamente o PTM humano, por exemplo, produto de transgene glicosilado por humano. Transgenes
[00653] São fornecidos vetores recombinantes contendo um transgene que codifica um mAb HuUPTM ou Fab HUPTM (ou outro fragmento de ligação ao antígeno do mAb HuPTM) que se liga ao RANKL que pode ser administrado para fornecer o mAb HuPTM ou fragmento de ligação ao antígeno em um paciente. O transgene é um ácido nucleico que compreende as sequências nucleotídicas que codificam um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo que se liga ao RANKL, tal como denosumabe ou variantes dos mesmos, conforme detalhado aqui. O transgene também pode codificar um fragmento de ligação ao antígeno anti-RANKL que contém sítios de glicosilação adicionais (por exemplo, ver Courtois et al.).
[00654] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno antiRANKL compreende as sequências nucleotídicas que codificam as cadeias pesadas e leves da porção Fab do denosumabe (possuindo sequências de aminoácidos das SEQ ID
NOs. 27 e 28, respectivamente, ver Tabela 4 e FIG 6). As sequências nucleotídicas podem ser otimizadas por códon para expressão em células humanas e podem, por exemplo, compreender as sequências nucleotídicas da SEQ ID NO: 127 (codificando uma porção Fab da cadeia pesada de denosumabe) e SEQ ID NO: 128 (codificando uma porção da cadeia leve Fab de denosumabe) como mencionado na Tabela 5. As sequências das cadeias pesada e leve possuem uma sequência de sinal ou terminação N apropriada para expressão e secreção em células humanas, em particular, células de fígado humano (por exemplo, hepatócitos) ou células musculares. A sequência sinal pode ter a sequência de aminoácido de MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161). Alternativamente, a sequência sinal pode ter uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma das sequências sinal mencionadas na Tabela 2 ou 3 que correspondem às proteínas secretadas por miócitos ou hepatócitos, respectivamente.
[00655] Além das sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve, os trangenes podem compreender, no C-terminal da sequência de domínio variável de cadeia pesada, toda ou uma porção da região de articulação. Em modalidades específicas, o domínio de ligação ao antígeno RANKL com um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 27 com sequência adicional de região de articulação começando após o aspartato (D) C-terminal, contém toda ou uma parte da sequência de aminoácidos KTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 222), e especificamente, KTHL (SEQ ID NO: 223), KTHT (SEQ ID NO: 224), KTHTCPPCPA (SEQ ID NO: 225), KTHLCPPCPA (SEQ ID NO: 226), KTHTCPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 227) ou KTHLCPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 228) como estabelecido na FIG 6. Essas regiões de articulação podem ser codificadas por sequências de nucleotídeos na extremidade 3' da SEQ ID NO: 27 pela região de articulação codificando as sequências mencionadas na
Tabela 5.
[00656] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-RANKL codifica um fragmento de ligação ao antígeno RANKL que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 28. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-RANKL codifica um fragmento de ligação ao antígeno RANKL que compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 27. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-RANKL codifica um fragmento de ligação ao antígeno que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 28 e uma cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 27. Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno RANKL compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 6) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia pesada de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, conforme identificado pelo alinhamento na FIG. 11 A. Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno RANKL compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 com 1, 2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 6) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia leve de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, conforme identificado pelo alinhamento na FIG. 11B.
[00657] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-RANKL codifica um Fab de denosumabe hiperglicosilado, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve de SEQ ID NOs: 27 e 28, respectivamente, com uma ou mais das seguintes mutações: L117N (cadeia pesada), Q161N ou Q1618 (cadeia leve), e/ou E196N (cadeia leve) (ver FIGURAS 11A (cadeia pesada) e B (cadeia leve)).
[00658] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-RANKL codifica um fragmento de ligação ao antígeno e compreende as sequências nucleotídicas que codificam as seis CDR denosumabe que estão sublinhadas nas sequências de domínio variável das cadeias pesada e leve da FIG. 6 que estão espaçadas entre regiões de estrutura, geralmente regiões de estrutura humanas, e associados a domínios constantes, dependendo da forma da molécula de ligação ao antígeno, como é conhecido na técnica para formar o domínio variável da cadeia leve e/ou pesada de um anticorpo anti-RANKL ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Métodos de Terapia genética
[00659] São fornecidos métodos de tratamento de indivíduos humanos para osteoporose ou perda óssea anormal (por exemplo, em pacientes com câncer de mama ou próstata ou devido a metástases ósseas) pela administração de um vetor viral contendo um transgene que codifica um anticorpo anti-RANKL ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. O anticorpo pode ser denosumabe, e é preferivelmente um fragmento Fab deste ou outro fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Nas modalidades, o paciente foi diagnosticado com e/ou apresenta sintomas associados à osteoporose ou perda óssea anormal. Os vetores recombinantes utilizados para a liberação do transgene são descritos na Seção 5.4.2. Esses vetores devem ter um tropismo para células de fígado ou músculo humanas e podem incluir rAAV não replicante, particularmente aquelas portadoras de um capsídeo AAV8 ou AAV9. O vetor recombinante, como mostrado na FIG. 6, pode ser administrado de qualquer maneira tal que o vetor recombinante entre no tecido do fígado ou músculo, preferencialmente introduzindo o vetor recombinante na corrente sanguínea. Consulte a Seção 5.5.2 para detalhes sobre os métodos de tratamento.
[00660] Indivíduos aos qual tal terapia genética é administrada podem ser aqueles que respondem à terapia anti-RANKL. Em modalidades particulares, Os métodos abrangem o tratamento de pacientes que foram diagnosticados com osteoporose ou perda óssea anormal, ou que têm um ou mais sintomas associados, e identificados como responsivos ao tratamento com um anticorpo anti-RANKL ou considerados bons candidatos à terapia com um anticorpo anti-RANKL. Em modalidades específicas, os pacientes foram tratados anteriormente com denosumabe e foram encontrados para responder a denosumabe. Para determinar a capacidade de resposta, o anticorpo anti-RANKL ou o produto de transgene de fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, produzido em cultura de células, biorreatores, etc.) pode ser administrado diretamente ao indivíduo. Anticorpos Pós-Translacionalmente Modificados Humanos
[00661] A produção do mAb HuPTM anti-RANKL ou Fab HuPTM, deve resultar em uma molécula "biobetter" para o tratamento de osteoporose ou perda óssea realizado por meio de terapia genética, por exemplo, administrando um vetor viral ou outra construção de expressão de DNA codificando o Fab HUPTM anti-RANKL, por via intrevenosa a indivíduos humanos (pacientes) diagnosticado com ou tendo um ou mais sintomas de perda óssea, para criar um depósito permanente no tecido do fígado ou músculo que fornece continuamente o produto de transgene sulfatado, pós-translacionalmente modificado totalmente humano, por exemplo, glicosilado humano produzido por células de fígado ou músculo transduzidas.
[00662] A construção de cDNA para o mAb HUPTM anti-RANKL ou Fab HUPTM anti-RANKL deve incluir um peptídeo sinal que garanta o processamento co- e pós-traslacional adequado (glicosilação e sulfatação de proteínas) pelo fígado ou células musculares transduzidas. Por exemplo, um sinal de sequência pode ser MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161). Alternativamente, a sequência sinal pode ter uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma das sequências sinal mencionadas na Tabela 2 ou 3 que correspondem às proteínas secretadas por miócitos ou hepatócitos, respectivamente.
[00663] Como alternativa, ou um tratamento adicional à terapia genética, o mAb HuPTM anti-RANKL ou Fab HuPTM pode ser produzido em linhas de células humanas por tecnologia de DNA recombinante e administrado a pacientes diagnosticados com osteoporose ou perda óssea ou para quem terapia para osteoporose ou perda óssea é considerada apropriada.
[00664] Em modalidades específicas, o mAb HuUPTM anti-RANKL ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo possui cadeias pesadas e leves com as sequências de aminoácidos das porções Fab das cadeias pesada e leve de denosumabe como mencionado na FIG. 6 (com sítios de glicosilação de asparaginase (N) não consenso realçados em aqua, sítios de glicosilação de glutamina (Q) realçados em verde, e sítios de sulfação Y realçados em amarelo) com uma glicolisação, particularmente uma 2,6-sialilação, em uma ou mais das posições de aminoácidos N77 e/ou N164 e/ou Q114 da cadeia pesada (SEQ ID NO:27) ou N159 e/ou N211 e/ou Q101 da cadeia leve (SEQ ID NO:28). Alternativamente ou em adição a, o mAb HuPTM ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com as sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve denosumabe com um grupo de sulfação em Y94 e/ou Y95 da cadeia pesada (SEQ ID NO:27) e/ou Y88 da cadeia leve (SEQ ID NO:28). Em outras modalidades, o mAb HuUPTM anti- RANKL ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não contém porções NeuGc detectáveis e/ou não contém porções alfa-Gal detectáveis.
[00665] Em certas modalidades, o mAb ou Fab HuPTM é terapeuticamente eficaz e é no mínimo 0,5%, 1% ou 2% sulfatado e/ou glicosilado e pode ser de pelo menos 5%, 10% ou mesmo 50% ou 100% sulfatado e/ou glicosilado. O objetivo do tratamento de terapia genética, aqui fornecido, é retardar ou interromper a progressão da osteoporose ou perda óssea. A eficácia pode ser monitorada através da avaliação de tecido Ósseo ou eventos esqueléticos ou a falta de eventos esqueléticos. Por exemplo, em relação à osteoporose, a eficácia pode ser monitorada por uma avaliação do conteúdo mineral ósseo, avaliação de radiografias para fraturas vertebrais ou imagiologia diagnóstica para confirmação de fraturas clínicas.
[00666] Combinações de liberação do mAb HuUPTM anti-RANKL ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, para o fígado ou músculo acompanhadas por liberação de outros tratamentos disponíveis são abrangidas pelos métodos fornecidos aqui. Os tratamentos adicionais podem ser administrados antes, concomitantemente, ou subsequente ao tratamento de terapia genética. Os tratamentos disponíveis para osteoporose ou perda óssea que podem ser combinados com a terapia genética aqui fornecida incluem, mas não são limitados a, os bisfosfonatos (por exemplo, ácido zoledrônico), hormônio da paratireóide (por exemplo, teriparatida [PTH 1-34] e/ou PTH 1-84), cálcio, vitamina D e quimioterapia, crioterapia ou radioterapia em pacientes diagnosticados com câncer e administração com agentes anti-RANKL, incluindo, mas não limitado a, denosumabe.
5.3.9 Construções HuPTM Bloqueadoras de PD e Formulações para Câncer e Linfoma
[00667] “Composições e métodos são descritos para a liberação de mAb HuPTMs e fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo, como Fab HuPTMs, que se ligam à proteína de morte celular programada 1 (PD-1), ao ligante de morte programado 1 (PD-L1), ou ligante de morte programado 2 (PD-L2) derivado de bloqueadores de PD-1 (por exemplo, anti-PD-1, anti-PD-L1 ou anti-PD-L2), indicado para o tratamento de melanoma irressecável/metastático, linfomas (por exemplo, linfoma de Hodgkin) e carcinomas (por exemplo, carcinoma de células renais, carcinoma de células escamosas e carcinomas de pulmão de células não pequenas). Em modalidades particulares, o mAb HUPTM possui a sequência de aminoácidos de nivolumabe, pembrolizumabe, ou um fragmento de ligação ao antígeno de um dos anteriormente mencionados. As sequências de aminoácidos dos fragmentos Fab de nivolumabe e pembrolizumabe são fornecidas nas FIGURAS 7A e 7B, respectivamente. A liberação pode ser realizada por meio de terapia genética, por exemplo, administrando um vetor viral ou outra construção de expressão de DNA codificando PD-1/PD-L1/PD-L2 ligando mAb HuPTM (ou um fragmento de ligação ao antígeno e/ou um derivado hiperglicosilado ou outro derivado) a pacientes (indivíduos humanos)
diagnosticado com ou tendo um ou mais sintomas de melanoma, carcinoma ou linfomas para criar um depósito permanente que fornece continuamente o PTM humano, por exemplo, produto de transgene glicosilado humano. Transgenes
[00668] São fornecidos vetores recombinantes contendo um transgene codificando um mMAb HuPTM ou Fab HuPTM (ou outro fragmento de ligação ao antígeno do mAb HuPTM) que se liga a PD- 1/PD-L1/PD-L2 que pode ser administrado para liberar o mAb HUPTM ou fragmento de ligação ao antígeno em um paciente. O transgene é um ácido nucleico compreendendo as sequências de nucleotídeo codificando um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo que se liga a PD-1/PD-L1/PD-L2, tal como Nivolumabe, Pembrolizumabe, ou variantes do mesmo como detalhado aqui. O transgene pode também codificar um fragmento de ligação ao antígeno anti-PD-1, anti- PD-LI, ou anti-PD-L2 que contém sítios de glicosilação adicionais (por exemplo, veja Courtois et al.).
[00669] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-PD-1 compreende as sequências de nucleotídeo codificando as cadeias pesadas e leves da porção Fab de Nivolumabe (tendo sequências de aminoácido de SEQ ID NOs. 29 e 30, respectivamente, veja a Tabela 4 e FIG. 7A). As sequências de nucleotídeo podem ser otimizadas por códon para expressão em células humanas e podem, por exemplo, compreender as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NO: 129 (codificando uma porção Fab de cadeia pesada de Nivolumabe) e SEQ ID NO: 130 (codificando uma porção Fab de cadeia leve de Nivolumabe) como mencionado na Tabela 5. As sequências de cadeias pesada e leve ambas têm uma sequência sinal ou líder no N-terminal apropriado para expressão e secreção em células humanas, em particular, células de fígado humano (por exemplo,
hepatócitos) ou células musculares humanas. A sequência sinal pode ter a sequência de aminoácido de MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161). Alternativamente, a sequência sinal pode ter uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma das sequências sinal mencionadas na Tabela 2 ou 3 que correspondem às proteínas secretadas por miócitos ou hepatócitos, respectivamente.
[00670] Além das sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve, os transgenes podem compreender, no C-terminal da sequência de domínio variável de cadeia pesada, toda ou uma porção da região de articulação. Em modalidades específicas, o domínio de ligação ao antígeno anti-integrina tem um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 29 com sequência de região de articulação adicional iniciando após a tirosina (Y) C-terminal, contém toda ou uma porção da sequência de aminoácido GPPCPPCPAPEFLG (SEQ ID NO: 240), e especificamente, GPPCPPCPA (SEQ I|D NO 229) ou GPPCPPCPAPEFLGPSVFL (SEQ ID NO: 241) como mencionado na FIG 7A. Estas regiões de articulação podem ser codificadas por sequências de nucleotídeo na extremidade 3' de SEQ ID NO: 29 pela região de articulação codificando as sequências mencionadas na Tabela 5.
[00671] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-PD-1 codifica um fragmento de ligação ao antígeno de PD-1 que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 30. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-PD-1 codifica um fragmento de ligação ao antígeno de PD-1 que compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,
96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 29. Em certas modalidades, o anti-PD-1, transgene de fragmento de ligação ao antígeno codifica um fragmento de ligação ao antígeno que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 30 e uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 29. Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno de PD-1 compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 29 com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 7A) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia pesada de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11 A. Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno de PD-1 compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 30 com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. TA) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia leve de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11B.
[00672] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-PD-1 codifica um Fab de Nivolumabe hiperglicosilado, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve de SEQ ID NOs: 29 e 30, respectivamente, com uma ou mais das seguintes mutações: L108N (cadeia pesada), Q160N ou Q1608S (cadeia leve), e / ou E195N (cadeia leve) (veja as FIGURAS 11A (cadeia pesada) e B (cadeia leve)).
[00673] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-PD-1 codifica um fragmento de ligação ao antígeno e compreende as sequências de nucleotídeo codificando as seis CDRs de Nivolumabe que são sublinhadas nas sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve de FIG. 7 A que são espaçadas entre regiões de estrutura, geralmente regiões de estrutura humanas, e associadas com domínios constantes dependendo da forma da molécula de ligação ao antígeno, como é conhecido na técnica para formar o domínio variável de cadeia pesada e / ou leve de um anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00674] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-PD-1 compreende as sequências de nucleotídeo codificando as cadeias pesadas e leves da porção Fab de Pembrolizumabe (tendo sequências de aminoácido de SEQ ID NOs. 31 e 32, respectivamente, veja a Tabela 4 e FIG. 7B). As sequências de nucleotídeo podem ser otimizadas por códon para expressão em células humanas e podem, por exemplo, compreender as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NO: 131 (codificando uma porção Fab de cadeia pesada de Pembrolizumabe) e SEQ ID NO: 132 (codificando uma porção Fab de cadeia leve de Pembrolizumabe) como mencionado na Tabela 5. As sequências de cadeias pesada e leve ambas têm uma sequência sinal ou líder no N-terminal apropriado para expressão e secreção em células humanas, em particular, células de fígado humano (por exemplo, hepatócitos) ou células musculares. A sequência sinal pode ter a sequência de aminoácido MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161). Alternativamente, a sequência sinal pode ter uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma das sequências sinal mencionadas na Tabela 2 ou 3 que correspondem às proteínas secretadas por miócitos ou hepatócitos, respectivamente.
[00675] Além das sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve, os transgenes podem compreender, no C-terminal da sequência de domínio variável de cadeia pesada, toda ou uma porção da região de articulação. Em modalidades específicas, o domínio de ligação ao antígeno anti-integrina tem um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 31 com sequência de região de articulação adicional iniciando após a tirosina (Y) C-terminal, contém toda ou uma porção da sequência de aminoácido GPPCPPCPAPEFLG (SEQ ID NO: 240), e especificamente, GPPCPPCPA (SEQ I|D NO 229) ou GPPCPPCPAPEFLGPSVFL (SEQ ID NO: 241) como mencionado na FIG 7B. Estas regiões de articulação podem ser codificadas por sequências de nucleotídeo na extremidade 3' de SEQ ID NO: 31 pela região de articulação codificando as sequências mencionadas na Tabela 5.
[00676] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-PD-1 codifica um fragmento de ligação ao antígeno de PD-1 compreendendo uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 32. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-PD-1 codifica um fragmento de ligação ao antígeno de PD-1 que compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID
NO: 31. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-PD-1 codifica um fragmento de ligação ao antígeno que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 32 e uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 31. Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno de PD-1 compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 31 com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 7B) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia pesada de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11 A. Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno de PD-1 compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 32 com 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 7B) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia leve de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11B.
[00677] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-PD-1 codifica um Fab de Pembrolizumabe hiperglicosilado, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve de SEQ ID NOs: 31 e 32, respectivamente, com uma ou mais das seguintes mutações: T115N (cadeia pesada) Q164N ou Q164S (cadeia leve), e / ou E199N (cadeia leve) (veja as FIGURAS 11A (cadeia pesada) e B (cadeia leve)).
[00678] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-PD-1 codifica um fragmento de ligação ao antígeno e compreende as sequências de nucleotídeo codificando as seis CDRs de Pembrolizumabe que são sublinhadas nas sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve de FIG. 7B que são espaçadas entre regiões de estrutura, geralmente regiões de estrutura humanas, e associadas com domínios constantes dependendo da forma da molécula de ligação ao antígeno, como é conhecido na técnica para formar o domínio variável de cadeia pesada e / ou leve de um anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Métodos de Terapia genética
[00679] São fornecidos métodos de tratamento de indivíduos humanos de melanoma, carcinoma, ou linfoma por administração de um vetor viral contendo um transgene codificando um ou mais dos anticorpos anti-PD-1, anti-PD-LI, e anti-PD-L2, ou fragmento de ligação ao antígeno dos mesmos. Em particular, são fornecidos métodos para o tratamento de melanoma metastático, linfoma, carcinoma de pulmão de célula não pequena, câncer de célula escamosa de cabeça e pescoço, carcinoma uroteliall, câncer de alta instabilidade de microssalélite, câncer gástrico, carcinoma de célula renal, câncer de cólon metastático por déficit de reparo de pareamento incorreto, ou carcinoma hepatocelular por administração de um vetor viral contendo um transgene codificando um ou mais dos anticorpos anti-PD-1, anti- PD-LI, e anti-PD-L2, ou fragmento de ligação ao antígeno dos mesmos. O anticorpo pode ser Nivolumabe e pembrozumabe, e são preferivelmente um fragmento de Fab dos mesmos, ou outro fragmento de ligação ao antígeno dos mesmos. Em modalidades, o paciente foi diagnosticado com e / ou tem sintomas associados com melanoma, carcinoma, ou linfoma. Vetores recombinantes para a liberação do transgene são descritos na Seção 5.4.2. Tais vetores devem ter um tropismo para células do fígado ou musculares humanas e podem incluir rAAV não replicantes, particularmente aqueles portadores de um capsídeo AAV8 ou AAV9. Os vetores recombinantes, tais como aqueles mostrados nas FIGURAS 7A e 7B, podem ser administrados de qualquer maneira tal como o vetor recombinante entre no tecido do fígado ou músculo, preferivelmente introduzindo o vetor recombinante na corrente sanguínea. Veja a Seção 5.5.2 para detalhes com respeito aos métodos de tratamento.
[00680] Indivíduos aos quais a tal terapia genética é administrada podem ser aqueles que respondem à terapia anti-PD-1, anti-PD-LI, ou anti-PD-L2. Em modalidades particulares, os métodos abrangem o tratamento de pacientes que foram diagnosticados com melanoma, carcinoma, ou linfoma, ou têm um ou mais sintomas associados com eles, e identificados como responsivos ao tratamento com um anticorpo anti-PD-1, anti-PD-LI, ou anti-PD-L2 ou considerados um bom candidato para a terapia com um anticorpo anti-PD-1, anti-PD-LI, ou anti-PD-L2. Em modalidades específicas, os pacientes foram anteriormente tratados com Nivolumabe ou pembrozumabe, e descobriu-se serem responsivos a Nivolumabe ou pembrozumabe. Para determinar a capacidade de resposta, o anticorpo anti-PD-1, anti-PD-LI, ou anti-PD-L2 ou produto de transgene de fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, produzido em cultura celular, biorreatores, etc.) podem ser administrados diretamente ao indivíduo. Anticorpos Pós-Translacionalmente Modificados Humanos
[00681] A produção do mAb anti-PD-1, anti-PD-LI, e / ou anti-PD-L2 de HuPTM ou Fab HuUPTM, deve resultar em uma molécula “biobetter” para o tratamento de melanoma, carcinomas, ou linfomas realizado por meio de terapia genética - por exemplo, administrando um vetor viral ou outra construção de expressão de DNA codificando o Fab HUPTM anti- PD-1, antiPDll, e / ou antiPD12, subcutaneamente, intramuscularmente, ou intravenosamente a indivíduos humanos (pacientes) diagnosticados com ou tendo um ou mais sintomas de melanoma, carcinomas, linfoma, ou outros cânceres para criar um depósito permanente no tecido do fígado ou músculo que continuamente supre o produto de transgene sulfatado, pós- translacionalmente modificado totalmente humano, por exemplo, glicosilado humano produzido por células de fígado ou músculo transduzidas.
[00682] As construções de cDNA para o Fab ou mAb HuPTM de HuPTM devem incluir um peptídeo sinal que assegura processamento co- e pós-translacional apropriado (glicosilação e sulfação de proteína) pelas células do fígado ou musculares transduzidas. Por exemplo, a sequência sinal pode ser MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161). Alternativamente, a sequência sinal pode ter uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma das sequências sinal mencionadas na Tabela 2 ou 3 que correspondem às proteínas secretadas por miócitos ou hepatócitos, respectivamente.
[00683] Como uma alternativa, ou um tratamento adicional para terapia genética, o Fab HUPTM ou mAb HuPTM anti-PD-1, anti-PD-LI, ou anti-PD-L2 pode ser produzido em linhagens de células humanas por tecnologia de DNA recombinante, e administrado a pacientes diagnosticados com melanoma metastático, linfoma, carcinoma de pulmão de célula não pequena, câncer de célula escamosa de cabeça e pescoço, carcinoma urotelial, câncer de alta instabilidade de microssalélite, câncer gástrico, carcinoma de célula renal, câncer de cólon metastático por déficit de reparo de pareamento incorreto, ou carcinoma hepatocelular, ou para quem a terapia para melanoma metastático, linfoma, carcinoma de pulmão de célula não pequena, câncer de célula escamosa de cabeça e pescoço, carcinoma urotelial, câncer de alta instabilidade de microssalélite, câncer gástrico, carcinoma de célula renal, câncer de cólon metastático por déficit de reparo de pareamento incorreto, ou carcinoma hepatocelular é considerada apropriada.
[00684] Em modalidades específicas, o mAb HuPTM anti-PD-1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo tem cadeias pesadas e leves com as sequências de aminoácido das porções de Fab de cadeias pesada e leve de Nivolumabe como mencionado na FIG. 7 A (com sítios de glicosilação de asparaginase (N) não consenso realçados em aqua, sítios de glicosilação de glutamina (Q) realçados em verde, e sítios de sulfação Y realçados em amarelo) tem uma glicosilação, particularmente uma 2,6-sialilação, em uma ou mais das porções de aminoácido N77, Q105, e / ou N155 da cadeia pesada (SEQ ID NO:29) ou N93, Q100, N158, e / ou N210 da cadeia leve (SEQ ID NO:30). Alternativamente ou em adição a, o mAb HuPTM ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com as sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve de Nivolumabe tem um grupo de sulfação em Y94 e / ou Y95 da cadeia pesada (SEQ ID NO: 29) e / ou Y86 e / ou Y87 da cadeia leve (SEQ ID NO: 30). Em outras modalidades, o mAb HUPTM anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não contém porções de NeuGc detectáveis e / ou não contém porções alfa-Gal detectáveis.
[00685] Em modalidades específicas, o mAb HUPTM anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem cadeias pesadas e leves com as sequências de aminoácido das porções de Fab de cadeias pesada e leve de Pembrolizumabe como mencionado na FIG. 7B (com sítios de glicosilação de asparaginase (N) não consenso realçados em aqua, sítios de glicosilação de glutamina (Q) realçados em verde, e sítios de sulfação Y realçados em amarelo) tem uma glicosilação, particularmente uma 2,6-sialilação, em uma ou mais das porções de aminoácido Q112, N162, e / ou N204 da cadeia pesada (SEQ ID NO: 31) ou N1I62 e / ou N214 da cadeia leve (SEQ ID NO: 32). Alternativamente ou em adição a, o mAb HuPTM ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com as sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve de Pembrolizumabe tem um grupo de sulfação em Y94 e / ou Y95 da cadeia pesada (SEQ ID NO: 31) e / ou Y90 e / ou Y91 da cadeia leve (SEQ ID NO: 32). Em outras modalidades, o mAb HuPTM anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não contém porções de NeuGc detectáveis e / ou não contém porções alfa-Gal detectáveis.
[00686] Em certas modalidades, o Fab ou mAb HuPTM é terapeuticamente eficaz e é pelo menos 0,5%, 1% ou 2% glicosilado e/ou sulfatado e pode ser pelo menos 5%, 10% ou mesmo 50% ou 100%) glicosilado e / ou sulfatado. O objetivo de tratamento de terapia genética fornecido aqui é retardar ou interromper a progressão de melanoma metastático, linfoma, carcinoma de pulmão de célula não pequena, câncer de célula escamosa de cabeça e pescoço, carcinoma urotelial, câncer de alta instabilidade de microssalélite, câncer gástrico, carcinoma de célula renal, câncer de cólon metastático por déficit de reparo de pareamento incorreto, ou carcinoma hepatocelular. A eficácia pode ser monitorada por uma ou mais finalidades de oncologia incluindo sobrevivência geral, sobrevivência livre de progressão, tempo para a progressão, tempo para a falência do tratamento, sobrevivência livre de evento, tempo para o próximo tratamento, taxa de resposta objetiva, ou duração de resposta (veja, por exemplo, U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Drug
Evaluation and Research, Center for Biologies Evaluation and Research. Guidance for industry: clinical trial endpoints for the approval of cancer drugs and biologies.
[00687] — https://www.fda.gov/downloads/Drugs/Guidances/ucmO0715
90.pdf Publicado em maio de 2007. Acessado em 13 de outubro de 2017; Oncology Endpoints in a Changing Landscape. Manag. Care. 2016; I(suppl):1-12).
[00688] “Combinações de liberação de um ou mais mAbs de HUPTM anti-PD-1, anti-PD-LI, e anti-PD-L2 ou fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo, para o fígado ou músculo acompanhadas por liberação de outros tratamentos disponíveis são abrangidas pelos métodos fornecidos aqui. Os tratamentos adicionais podem ser administrados — antes, concomitantemente, ou subsequente ao tratamento de terapia genética. Tratamentos disponíveis para melanoma metastático, linfoma, carcinoma de pulmão de célula não pequena, câncer de célula escamosa de cabeça e pescoço, carcinoma urotelial, câncer de alta instabilidade de microssalélite, câncer gástrico, carcinoma de célula renal, câncer de cólon metastático por déficit de reparo de pareamento incorreto, ou carcinoma hepatocelular que podem ser combinados com a terapia genética fornecida aqui incluem, porém não estão limitados à quimioterapia (por exemplo, cisplatina, gencitabina, pemetrexed, carboplatina, e / ou paclitaxel), radioterapia, crioterapia, terapias de molécula pequena direcionadas, outros anticorpos, e terapia de vacina e administração com um ou mais dos agentes anti-PD-1, anti-PD-LI, e anti-PD-L2, incluindo, porém não limitados a Nivolumabe e Pembrolizumabe.
5.3.10 Construções de HuPTM Anti-VEGF ou anti-fD e Formulações para Distúrbios Oculares
[00689] “Composições e métodos são descritos para a liberação de mAb HuPTM e fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo, tais como
Fabs HuPTM, que se ligam ao fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) ou complemento (por exemplo, fator D (fD)) derivado de anti- VEGF ou anticomplemento (por exemplo, anti-fD), respectivamente, indicados para o tratamento de um ou mais distúrbios retinais incluindo retinopatia diabética, neovascularização coroidal miópica (mMCNV), degeneração macular (por exemplo, neovascular (wet) degeneração macular relacionada com a idade neovascular (úmida) (AMD)), edema macular (por exemplo, edema macular após uma oclusão de veia retinal (RVO) ou edema macular diabético (DME)); para suprimir angiogênese; OU, no caso daqueles derivados de anti-VEGF, para o tratamento de um ou mais tipos de câncer incluindo câncer ovariano epitelial, câncer das trompas de falópio, câncer peritoneal, câncer cervical, câncer colorretal metastático, câncer de mama negativo para HER2 metastático, carcinoma de célula renal metastático, glioblastoma, câncer de pulmão de célula não pequena (NSCLC). Em modalidades particulares, o mAb HuUPTM tem a sequência de aminoácido de Ranibizumabe, Bevacizumabe, Lampalizumabe, Brolucizumabe, ou um fragmento de ligação ao antígeno de um dos anteriormente mencionados.
As sequências de aminoácido de fragmentos Fab de Ranibizumabe, Bevacizumabe, e Lampalizumabe, e o scFv de Brolucizumabe são fornecidos nas FIGURAS 8A a 8D, respectivamente.
A liberação pode ser realizada por meio de terapia genética - por exemplo, administrando um vetor viral ou outra construção de expressão de DNA codificando um mAb HuPTM de ligação a VEGF ou ligação ao Fator D (ou um fragmento de ligação ao antígeno e / ou um derivado hiperglicosilado ou outro derivado do mesmo, incluindo um scFv) a pacientes (indivíduos humanos) diagnosticados com, ou tendo um ou mais sintomas de um distúrbio retinal (por exemplo retinopatia diabética, nCNV, degeneração macular, ou edema macular) ou câncer (por exemplo, câncer ovariano epitelial, câncer das trompas de falópio, câncer peritoneal, câncer cervical, câncer colorretal metastático, câncer de mama negativo para FIER2 metastático, carcinoma de célula renal metastático, glioblastoma, ou NSCLC) para criar um depósito permanente que continuamente supre o PTM humano, por exemplo, produto de transgene, glicosilado humano.
[00690] São fornecidos vetores recombinantes contendo um transgene codificando um mMAb HuPTM ou Fab HuPTM (ou outro fragmento de ligação ao antígeno do mAb HuUPTM) que se liga a VEGF ou fD que pode ser administrado para liberar o mAb HuPTM ou fragmento de ligação ao antígeno em um paciente. O transgene é um ácido nucleico compreendendo as sequências de nucleotídeo codificando um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo que se liga a VEGF ou fD, tal como Ranibizumabe, Bevacizumabe, Lampalizumabe, Brolucizumabe, ou variantes do mesmo como detalhado aqui. O transgene pode também codificar um fragmento de ligação ao antígeno anti-VEGF ou anti-fD que contém sítios de glicosilação adicionais (por exemplo, veja Courtois et al.).
[00691] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-VEGF compreende as sequências de nucleotídeo codificando as cadeias pesadas e leves da porção Fab de Ranibizumabe (tendo sequências de aminoácido de SEQ ID NOs. 33 e 34, respectivamente, veja a Tabela 4 e FIG. 8A). As sequências de nucleotídeo podem ser otimizadas por códon para expressão em células humanas e podem, por exemplo, compreender as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NO: 133 (codificando uma porção Fab de cadeia pesada de Ranibizumabe) e SEQ ID NO: 134 (codificando uma porção Fab de cadeia leve de Ranibizumabe) como mencionado na Tabela 5. As sequências de cadeias pesada e leve ambas têm uma sequência sinal ou líder no N-terminal apropriado para expressão e secreção em células humanas, em particular, uma ou mais células que formam a retina. A sequência sinal pode ter a sequência de aminoácido de MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161). Alternativamente, a sequência sinal pode ter uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma das sequências sinal mencionadas na Tabela 1 que correspondem às proteínas secretadas por uma ou mais células que formam a retina. Alternativamente, a sequência sinal pode ser apropriada para expressão em células musculares ou do fígado, tal como aquelas listadas nas Tabelas 2 e 3 infra.
[00692] Além das sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve, os transgenes podem compreender, no C-terminal da sequência de domínio variável de cadeia pesada, toda ou uma porção da região de articulação. Em modalidades específicas, o domínio de ligação ao antígeno anti-VEGF tem um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 33 com sequência de região de articulação adicional iniciando após o ácido aspártico C-terminal (D), contém toda ou uma porção da sequência de aminoácido KTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 222), e especificamente, KTHT (SEQ ID NO: 224), KTHL (SEQ ID NO: 223), KTHTCPPCPA (SEQ ID NO: 225), KTHLCPPCPA (SEQ ID NO: 226), KTHTCPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 227), ou KTHLCPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 228) como mencionado na FIG 8A. Estas regiões de articulação podem ser codificadas por sequências de nucleotídeo na extremidade 3' de SEQ ID NO: 33 pela região de articulação codificando as sequências mencionadas na Tabela 5.
[00693] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-VEGF codifica um fragmento de ligação ao antígeno de VEGF que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 34. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-VEGF codifica um fragmento de ligação ao antígeno de VEGF que compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 33. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-VEGF codifica um fragmento de ligação ao antígeno que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 34 e uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 33. Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno de VEGF compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 33 com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 8A) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia pesada de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11 A.
Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno de VEGF compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 34 com 1,2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG.
8A) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia leve de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11B.
[00694] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-VEGF codifica um Fab de Ranibizumabe hiperglicosilado, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve de SEQ ID NOs: 33 e 34, respectivamente, com uma ou mais das seguintes mutações: L118N (cadeia pesada), Q160N ou Q1608S (cadeia leve), e / ou E195N (cadeia leve) (veja as FIGURAS 11A (cadeia pesada) e B (cadeia leve)).
[00695] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-VEGF codifica um fragmento de ligação ao antígeno e compreende as sequências de nucleotídeo codificando as seis CDRs de Ranibizumabe que são sublinhadas nas sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve de FIG. 8A que são espaçadas entre regiões de estrutura, geralmente regiões de estrutura humanas, e associadas com domínios constantes dependendo da forma da molécula de ligação ao antígeno, como é conhecido na técnica para formar o domínio variável de cadeia pesada e / ou leve de um anticorpo anti-VEGF ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00696] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-VEGF compreende as sequências de nucleotídeo codificando as cadeias pesadas e leves da porção Fab de Bevacizumabe (tendo sequências de aminoácido de SEQ ID NOs. 35 e 36, respectivamente, veja a Tabela 4 e FIG. 8B). As sequências de nucleotídeo podem ser otimizadas por códon para expressão em células humanas e podem, por exemplo, compreender as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NO: 135 (codificando uma porção Fab de cadeia pesada de Bevacizumabe) e SEQ ID NO: 136 (codificando uma porção Fab de cadeia leve de Bevacizumabe) como mencionado na Tabela 5.
As sequências de cadeias pesada e leve ambas têm uma sequência sinal ou líder no N-terminal apropriado para expressão e secreção em células humanas, em particular, um ou mais tipos de célula da retina ou célula do fígado. A sequência sinal pode ter a sequência de aminoácido de MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161). Alternativamente, a sequência sinal pode ter uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma das sequências sinal mencionadas na Tabela 1 ou 3 que correspondem às proteínas secretadas por tipos de célula da retina ou célula do fígado, respectivamente.
[00697] Além das sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve, os transgenes podem compreender, no C-terminal da sequência de domínio variável de cadeia pesada, toda ou uma porção da região de articulação. Em modalidades específicas, o domínio de ligação ao antígeno anti-integrina tem um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 35 com sequência de região de articulação adicional iniciando após o ácido aspártico C-terminal (D), contém toda ou uma porção da sequência de aminoácido KTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 222), e especificamente, KTHT (SEQ ID NO: 224), KTHL (SEQ ID NO: 223), KTHTCPPCPA (SEQ ID NO: 225), KTHLCPPCPA (SEQ ID NO: 226), KTHTCPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 227), ou KTHLCPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 228) como mencionado na FIG 8B. Estas regiões de articulação podem ser codificadas por sequências de nucleotídeo na extremidade 3' de SEQ ID NO: 35 pela região de articulação codificando as sequências mencionadas na Tabela 5.
[00698] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-VEGF codifica um fragmento de ligação ao antígeno de VEGF que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 36. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-VEGF codifica um fragmento de ligação ao antígeno de VEGF que compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 35. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-VEGF codifica um fragmento de ligação ao antígeno que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 36 e uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 35. Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno de VEGF compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 35 com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 8B) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia pesada de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11 A.
Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno de VEGF compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 36 com 1,2, 3,4, 5,6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é,
aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 8B) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia leve de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11B.
[00699] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno antiVEGF codifca a hiperglicosilado Bevacizumabe Fab, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve de SEQ ID NOs: 35 e 36, respectivamente, com uma ou mais das seguintes mutações: L118N (cadeia pesada) e / ou Q160N ou Q160S (cadeia leve), e / ou E195N (cadeia leve) (veja as FIGURAS 11A (cadeia pesada) e B (cadeia leve)).
[00700] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-VEGF codifica um fragmento de ligação ao antígeno e compreende as sequências de nucleotídeo codificando as seis CDRs de Bevacizumabe que são sublinhadas nas sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve de FIG. 8B que são espaçadas entre regiões de estrutura, geralmente regiões de estrutura humanas, e associadas com domínios constantes dependendo da forma da molécula de ligação ao antígeno, como é conhecido na técnica para formar o domínio variável de cadeia pesada e / ou leve de um anticorpo anti-VEGF ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00701] Emcertas modalidades, o transgene anti-fD de fragmento de ligação ao antígeno compreende as sequências de nucleotídeo codificando as cadeias pesadas e leves da porção Fab de Lampalizumabe (tendo sequências de aminoácido de SEQ ID NOs. 37 e 38, respectivamente, veja a Tabela 4 e FIG. 8C). As sequências de nucleotídeo podem ser otimizadas por códon para expressão em células humanas e podem, por exemplo, compreender as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NO: 137 (codificando uma porção Fab de cadeia pesada de Lampalizumabe) e SEQ ID NO: 138 (codificando uma porção
Fab de cadeia leve de Lampalizumabe) como mencionado na Tabela 5. As sequências de cadeias pesada e leve ambas têm uma sequência sinal ou líder no N-terminal apropriado para expressão e secreção em células humanas, em particular, uma ou mais células humanas que formam a retina. A sequência sinal pode ter a sequência de aminoácido de MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161). Alternativamente, a sequência sinal pode ter uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma das sequências sinal mencionadas na Tabela 1 que correspondem às proteínas secretadas por células que formam a retina.
[00702] Além das sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve, os transgenes podem compreender, no C-terminal da sequência de domínio variável de cadeia pesada, toda ou uma porção da região de articulação. Em modalidades específicas, o domínio de ligação ao antígeno anti-integrina tem um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 37 com sequência de região de articulação adicional iniciando após o ácido aspártico C-terminal (D), contém toda ou uma porção da sequência de aminoácido KTHT CPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 227), e especificamente, KTHT (SEQ ID NO: 224), KTHL (SEQ ID NO: 223), KTIHTCPPCPA (SEQ ID NO: 225), KTHLCPPCPA (SEQ ID NO: 226), KTIHTCPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 227), ou KTHLCPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 228) como mencionado na FIG 8C. Estas regiões de articulação podem ser codificadas por sequências de nucleotídeo na extremidade 3' de SEQ ID NO: 37 pela região de articulação codificando as sequências mencionadas na Tabela 5.
[00703] Emcertas modalidades, o transgene anti-fD de fragmento de ligação ao antígeno codifica um fragmento de ligação ao antígeno fD que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 38. Em certas modalidades, o transgene anti-fD de fragmento de ligação ao antígeno codifica um fragmento de ligação ao antígeno fD que compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 37. Em certas modalidades, o transgene anti-fD de fragmento de ligação ao antígeno codifica um fragmento de ligação ao antígeno que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 38 e uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 37. Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno fD compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 37 com 1,2, 3,4, 5,6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 8C) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia pesada de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11 A.
Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno fD compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 38 com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou more substituições de aminoácido, inserções ou deleções, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 8C) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia leve de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11B.
[00704] Emcertas modalidades, o transgene anti-fD de fragmento de ligação ao antígeno codifca um Fab de Lampalizumabe hiperglicosilado, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve de SEQ ID NOs: 37 e 38, respectivamente, com uma ou mais das seguintes mutações: L110N (cadeia pesada), Q160N ou Q1608S (cadeia leve), e / ou E195N (cadeia leve) (veja as FIGURAS 11A (cadeia pesada) e B (cadeia leve)).
[00705] Em certas modalidades, o transgene anti-fD de fragmento de ligação ao antígeno codifica um fragmento de ligação ao antígeno e compreende as sequências de nucleotídeo codificando as seis CDRs de Lampalizumabe que são sublinhadas nas sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve de FIG. 8C que são espaçadas entre regiões de estrutura, geralmente regiões de estrutura humanas, e associadas com domínios constantes dependendo da forma da molécula de ligação ao antígeno, como é conhecido na técnica para formar o domínio variável de cadeia pesada e / ou leve de um anticorpo anti-fD ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00706] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno antiVEGF compreende as sequências de nucleotídeo codificando os domínios variáveis de cadeias pesada e leve de Brolucizumabe (tendo sequências de aminoácido de SEQ ID NOs. 39 e 40, respectivamente, veja a Tabela 4 e FIG. 8D). Brolucizumabe é uma molécula scFv e, desse modo, contém os domínios variáveis de cadeias pesada e leve de um mAb anti-VEGF conectado por um ligante flexível. As sequências de nucleotídeo podem ser otimizadas por códon para expressão em células humanas e podem, por exemplo,
compreender as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NO: 139 (codificando uma porção de domínio variável de cadeia pesada de Brolucizumabe) e SEQ ID NO: 142 (codificando uma porção de domínio variável de cadeia leve Brolucizumabe) como mencionado na Tabela 5. Mesmo nos domínios variáveis de cadeias pesada e leve em que são expressas como proteínas separadas, as sequências de cadeias pesada e leve cada uma tem uma sequência sinal ou líder no N-terminal apropriado para expressão e secreção em células humanas, em particular, uma ou mais células que formam a retina. A sequência sinal pode ter a sequência de aminoácido de MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161). Alternativamente, a sequência sinal pode ter uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma das sequências sinal mencionadas na Tabela 1 que correspondem às proteínas secretadas por uma ou mais células que formam a retina.
[00707] Além das sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve, os transgenes podem compreender, no C-terminal da sequência de domínio variável de cadeia leve, um ligande de peptídeo flexível. A sequência ligante de peptídeo flexível pode compreender resíduos flexíveis tal como glicina (G) ou serina (S). Em algumas modalidades, o ligante de peptídeo flexível pode compreender 10 a 30 resíduos ou G, S, ou ambos G e S. Os resíduos carregados, tais como E e K podem ser usados e intercalados para realçar a solubilidade. A sequência ligante de peptídeo flexível pode ter a sequência de aminoácido de (GGGGS),, em que n pode ser 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 (SEQ ID NO: 243). Neste caso, a sequência sinal é fundida à terminação N do scFv, ou a sequência de domínio variável de cadeia pesada ou leve, como for o caso.
[00708] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-VEGF codifica um fragmento de ligação ao antígeno de VEGF que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 40. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-VEGF codifica um fragmento de ligação ao antígeno de VEGF que compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 39. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-VEGF codifica um fragmento de ligação ao antígeno que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 294%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 40 e uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 39. Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno de VEGF compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 39 com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 8D) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia pesada de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11 A.
Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno de VEGF compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 40 com 1,2,3,4,5,6,7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou more substituições de aminoácido, inserções ou deleções, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 8D) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia leve de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11B.
[00709] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-VEGF codifica um scFv de Brolucizumabe hiperglicosilado, compreendendo uma cadeia única de SEQ ID NOs: 39 e 40, respectivamente, com a seguinte mutação: L115N (cadeia pesada) (veja as FIGURAS 11A (cadeia pesada).
[00710] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-VEGF codifica um fragmento de ligação ao antígeno e compreende as sequências de nucleotídeo codificando as seis CDRs de Brolucizumabe que são sublinhadas nas sequências de domínio variável de cadeia única de FIG. 8D que são espaçadas entre regiões de estrutura, geralmente regiões de estrutura humana, e associadas com domínios constantes dependendo da forma da molécula de ligação ao antígeno, como é conhecido na técnica para formar o domínio variável de cadeia pesada e / ou leve de um anticorpo anti-VEGF ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Métodos de Terapia genética
[00711] São fornecidos métodos de tratamento de indivíduos humanos de um ou mais distúrbios retinais (tais como retinopatia diabética, nMCNV, degeneração macular, ou edema macular) ou câncer (tal como câncer ovariano epitelial, câncer das trompas de falópio, câncer peritoneal, câncer cervical, câncer colorretal metastático, câncer de mama negativo para HER2 metastático, carcinoma de célula renal metastático, glioblastoma, ou NSCLC) por administração de um vetor viral contendo um transgene codificando um anticorpo anti-VEGF ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. O anticorpo ou fragmento Fab do mesmo pode ser Ranibizumabe Bevacizumabe, ou Brolucizumabe. Em modalidades, o paciente foi diagnosticado com e / ou tem sintomas associados com um ou mais dos vários distúrbios retinais ou cânceres listados acima.
[00712] Além disso, são fornecidos métodos de tratamento de indivíduos humanos de um ou mais distúrbios retinais (tais como retinopatia diabética, nCNV, degeneração macular, ou edema macular) por administração de um vetor viral contendo um transgene codificando um anticorpo anti-fD ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. O anticorpo pode ser Lampalizumabe, e é preferivelmente um fragmento Fab do mesmo, ou outro fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em modalidades, o paciente foi diagnosticado com e / ou tem sintomas associados com um ou mais dos vários distúrbios retinais listados acima.
[00713] Vetorrecombinante usado para a liberação do transgene são descritos na Seção 5.4.3. Tais vetores devem ter um tropismo para células tipo retina humana e podem incluir rAAV não replicante, particularmente aqueles portadores de um capsídeo de AAVB8. Alternativamente, vetores portadores de um capsídeo de AAV.7m8 podem ser usados para indicações oculares. Os vetores recombinantes, tais como aqueles mostrados nas FIGURAS 8A-8D, podem ser administrados de qualquer maneira tal como o vetor recombinante entre na retina, preferivelmente introduzindo o vetor recombinante no olho. Veja a Seção 5.5.3 para detalhes com respeito aos métodos de tratamento. Para liberação para o fígado, por exemplo, para o tratamento de câncer, o vetor recombinante usado para a liberação do transgene são descritos na Seção 5.4.2. Tais vetores devem ter um tropismo para células de fígado humano e podem incluir rAAV não replicante, particularmente aqueles portadores de um capsídeo AAV8 ou AAV9. Os vetores recombinantes, tais como aqueles mostrados nas FIGURAS 8A-8C, podem ser administrados de qualquer maneira tal como o vetor recombinante entre no fígado, preferivelmente introduzindo o vetor recombinante na corrente sanguínea. Veja a Seção
5.5.2 para detalhes com respeito aos métodos de tratamento.
[00714] Indivíduos aos quais a tal terapia genética é administrada podem ser aqueles que respondem à terapia anti-VEGF ou anti-fD. Em modalidades particulares, os métodos abrangem o tratamento de pacientes que foram diagnosticados com um ou mais distúrbios retinais ou tipos de câncer, ou têm um ou mais sintomas associados com eles, e identificados como responsivos ao tratamento com um anticorpo anti- VEGF ou anticorpo anti-fD, ou considerados um bom candidato para a terapia com um anticorpo anti-VEGF ou anticorpo anti-fD. Em modalidades específicas, os pacientes foram anteriormente tratados com Ranibizumabe, Bevacizumabe, Lampalizumabe, ou Brolucizumabe, e descobriu-se serem responsivos a Ranibizumabe, Bevacizumabe, Lampalizumabe, ou Brolucizumabe. Para determinar a capacidade de resposta, o anticorpo anti-VEGF ou anti-fD ou produto de transgene de fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, produzido em cultura celular, biorreatores, etc.) podem ser administrados diretamente ao indivíduo. Anticorpoos Pós-Translacionalmente Modificados Humanos
[00715] A produção do Fab HIPTM ou mAb HuPTM anti-VEGF ou anti-fD, deve resultar em uma molécula “biobetter” para o tratamento de um ou mais distúrbios retinais ou cânceres realizado por meio de terapia genética - por exemplo, administrando um vetor viral ou outra construção de expressão de DNA codificando o Fab anti-VEGF ou anti- fD, sub-retinalmente, intravitreamente, ou supracoroidalmente a indivíduos humanos (pacientes) diagnosticados com ou tendo um ou mais sintomas de um ou mais distúrbios retinais, ou administrando um vetor viral ou outra construção de expressão de DNA codificando o Fab HuPTM anti-VEGF, subcutaneamente, intramuscularmente, ou intravenosamente a indivíduos humanos (pacientes) diagnosticados com um câncer, para criar um depósito permanente na retina ou fígado que continuamente supre o produto de transgene sulfatado, pós- translacionalmente modificado totalmente humano, por exemplo, glicosilado humano produzido por células transduzidas da retina ou fígado.
[00716] Como uma alternativa, ou um tratamento adicional para terapia genética, o Fab HUPTM ou mAb HuPTM anti-VEGF ou anti-fD pode ser produzido em linhagens de células humanas por tecnologia de DNA recombinante, e administrado a pacientes diagnosticados com um distúrbio retinal ou câncer para quem a terapia para um distúrbio retinal ou câncer é considerada apropriada.
[00717] Em modalidades específicas, o mAb HUPTM anti-VEGF ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem cadeias pesadas e leves com as sequências de aminoácido das porções de Fab de cadeias pesada e leve de Ranibizumabe como mencionado na FIG. 8A (com sítios de glicosilação de asparaginase (N) não consenso realçados em aqua, sítios de glicosilação de glutamina (Q) realçados em verde, e sítios de sulfação Y realçados em amarelo) tem uma glicosilação, particularmente uma 2,6-sialilação, em uma ou mais das porções de aminoácido Q115 e / ou N165 da cadeia pesada (SEQ ID NO:33) ou Q100, N158, e / ou N210 da cadeia leve (SEQ ID NO:34). Alternativamente ou em adição a, o mAb HuPTM ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com as sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve Ranibizumabe tem um grupo de sulfação em Y94 e / ou Y95 da cadeia pesada (SEQ ID NO: 33) e / ou Y86 e / ou Y87 da cadeia leve (SEQ ID NO: 34). Em outras modalidades, o mAb HUPTM anti-VEGF ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não contém porções de NeuGc detectáveis e / ou não contém porções alfa-Gal detectáveis.
[00718] Em modalidades específicas, o mAb HUPTM anti-VEGF ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem cadeias pesadas e leves com as sequências de aminoácido das porções de Fab de cadeias pesada e leve de Bevacizumabe como mencionado na FIG. 8B (com sítios de glicosilação de asparaginase (N) não consenso realçados em aqua, sítios de glicosilação de glutamina (Q) realçados em verde, e sítios de sulfação Y realçados em amarelo) tem uma glicosilação, particularmente uma 2,6-sialilação, em uma ou mais das porções de aminoácido Q115, e / ou N165 da cadeia pesada (SEQ ID NO: 35) ou Q100, N158, e / ou N210 da cadeia leve (SEQ ID NO: 36). Alternativamente ou em adição a, o mAb HuPTM ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com as sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve Bevacizumabe tem um grupo de sulfação em Y94 e / ou Y95 da cadeia pesada (SEQ ID NO: 35) e / ou Y86 e / ou Y87 da cadeia leve (SEQ ID NO: 36). Em outras modalidades, o mAb HUPTM anti-VEGF ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não contém porções de NeuGc detectáveis e / ou não contém porções alfa-Gal detectáveis.
[00719] Em modalidades específicas, o mAb anti-fD de HUPTM ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem cadeias pesadas e leves com as sequências de aminoácido das porções de Fab de cadeias pesada e leve de Lampalizumabe como mencionado na FIG. 8C (com sítios de glicosilação de asparaginase (N) não consenso realçados em aqua, sítios de glicosilação de glutamina (Q) realçados em verde, e sítios de sulfação Y realçados em amarelo) tem uma glicosilação, particularmente uma 2,6-sialilação, em uma ou mais das porções de aminoácido Q107 e / ou N157 da cadeia pesada (SEQ ID NO: 37) ou Q100 e / ou N158 e / ou N210 da cadeia leve (SEQ ID NO: 38).
Alternativamente ou em adição a, o mAb HuPTM ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com as sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve Lampalizumabe tem um grupo de sulfação em Y60 e / ou Y94 e / ou Y95 da cadeia pesada (SEQ ID NO: 37) e / ou Y86 e / ou Y87 da cadeia leve (SEQ ID NO: 38). Em outras modalidades, o mAb anti-fD de HUPTM ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não contém porções de NeuGc detectáveis e / ou não contém porções alfa-Gal detectáveis.
[00720] Em modalidades específicas, o mAb HUPTM anti-VEGF ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem cadeias pesadas e leves com as sequências de aminoácido de os domínios variáveis de cadeias pesada e leve de Brolucizumabe como mencionado na FIG. 8D (com sítios de glicosilação de asparaginase (N) não consenso realçados em aqua, sítios de glicosilação de glutamina (Q) realçados em verde, e sítios de sulfação Y realçados em amarelo) tem uma glicosilação, particularmente uma 2,6-sialilação, em uma ou mais das porções de aminoácido N77 e / ou Q112 da cadeia pesada (SEQ ID NO: 39) ou N97 e / ou Q103 da cadeia leve (SEQ ID NO: 40). Alternativamente ou em adição a, o mAb HuPTM ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com as sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve Brolucizumabe tem um grupo de sulfação em Y32 e/ou Y33 e / ou Y34 e / ou Y59 e / ou Y60 e / ou Y94 e / ou Y95 da cadeia pesada (SEQ |D NO: 39) e / ou Y86 e / ou Y87 da cadeia leve (SEQ ID NO: 40). Em outras modalidades, o mAb HUPTM anti-VEGF ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não contém porções de NeuGc detectáveis e / ou não contém porções alfa-Gal detectáveis.
[00721] Em certas modalidades, o Fab ou mAb HuPTM é terapeuticamente eficaz e é pelo menos 0,5%, 1% ou 2% glicosilado e / ou sulfatado e pode ser pelo menos 5%, 10% ou mesmo 50% ou 100%) glicosilado e / ou sulfatado. O objetivo de tratamento de terapia genética fornecido aqui é retardar ou interromper a progressão de um distúrbio retinal ou tipo de câncer, e / ou para suprimir a angiogênese. No caso de distúrbios retinais, a eficácia pode ser monitorada por monitoração da acuidade visual. Por exemplo, a eficácia pode ser monitorada avaliando a mudança em acuidade visiual a partir da linha de base. No caso de um câncer, a eficácia pode ser monitorada avaliando uma ou mais finalidades de oncologia incluindo sobrevivência geral, sobrevivência livre de progressão, tempo para a progressão, tempo para a falência do tratamento, sobrevivência livre de evento, tempo para o próximo tratamento, taxa de resposta objetiva, ou duração de resposta, (veja, por exemplo, U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research, Center for Biologies Evaluation and Research. Guidance for industry: clinical trial endpoints for the approval of cancer drugs and biologies. https://www.fda.gov/downloads/Drugs/Guidances/ucm0O7 1590. pdf Publicado em maio de 2007. Acessado em 13 de outubro de 2017; Oncology Endpoints in a Changing Landscape. Manag. Care. 2016; lísuppl):1-12).
[00722] “Combinações de liberação do mAb HuPTM anti-VEGF ou anti-fD ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para a retina ou fígado acompanhadas por liberação de outros tratamentos disponíveis são abrangidas pelos métodos fornecidos aqui. Os tratamentos adicionais podem ser administrados antes, concomitantemente, ou subsequente ao tratamento de terapia genética. Tratamentos disponíveis para retinopatia diabética, mMCNV, degeneração macular, ou edema macular que podem ser combinados com a terapia genética fornecida aqui incluem, porém não estão limitados à fotocoagulação a laser, terapia fotodinâmica com verteporfina, aflibercept, e/ou esteroides intravítreos e administração com agentes anti-VEGF ou anti-fD,
incluindo, porém não limitados a Ranibizumabe, Bevacizumabe, Lampalizumabe, ou Brolucizumabe. Tratamentos disponíveis para câncer ovariano epitelial, câncer das trompas de falópio, câncer peritoneal, câncer cervical, câncer colorretal metastático, câncer de mama negativo para HER2 metastático, carcinoma de célula renal metastático, glioblastoma, ou NSCLC que podem ser combinados com a terapia genética fornecida aqui incluem, porém não estão limitados à quimioterapia (por exemplo, cisplatina, gencitabina, pemetrexed, 5- fluorouracila, carboplatina, irinotecano, interferon alfa, oxaliplatina, doxorubicina lipossômica pegilada de paclitaxel, e/ou topotecano), fármacos protetores de quimioterapia (por exemplo, leucovorina), radioterapia, crioterapia, terapias de molécula pequena direcionadas, outros anticorpos, afilbercept, e / ou terapia de vacina e administração com anti-VEGF, incluindo, porém não limitados a Ranibizumabe ou Bevacizumabe.
5.3.11.. Construções de HuPTM Anti-BLyS e Formulações para Lúpus Eritematoso Sistêmico
[00723] “Composições e métodos são descritos para a liberação de MAbs de HuPTM e fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo, tais como Fabs HuPTM, que se ligam ao estimulador de B-linfócito (BLyS) derivado de um anticorpo anti-BLyS, tal como Belimumabe (FIG. 8E), e indicado para o tratamento de lúpus eritematoso sistêmico (SLE) e reduzindo os níveis de células B autorreativas e células plasmáticas produtoras de imunoglobulina. Em modalidades particulares, o mAb HuPTM tem a sequência de aminoácido de Belimumabe ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. A sequência de aminoácido de fragmento Fab deste anticorpo é fornecida na FIG. 8E. A liberação pode ser realizada por meio de terapia genética - por exemplo, administrando um vetor viral ou outra construção de expressão de DNA codificando um mAb HuPTM de ligação a BLyS (ou um fragmento de ligação ao antígeno e / ou um derivado hiperglicosilado ou outro derivado, do mesmo) a pacientes (indivíduos humanos) diagnosticados com SLE para criar um depósito permanente que continuamente supre o PTM humano, por exemplo, produto de transgene glicosilado humano. Transgenes
[00724] São fornecidos vetores recombinantes contendo um transgene codificando um mMAb HuPTM ou Fab HuPTM (ou outro fragmento de ligação ao antígeno do mAb HuPTM) que se liga a BLyS que pode ser administrado para liberar o mAb HUPTM ou fragmento de ligação ao antígeno em um paciente. O transgene é um ácido nucleico compreendendo as sequências de nucleotídeo codificando um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo que se liga a BLyS, tal como Belimumabe ou variantes do mesmo como detalhado aqui. O transgene pode também codificar um anti-BLyS fragmento de ligação ao antígeno que contém sítios de glicosilação adicionais (por exemplo, veja Courtois et a/.).
[00725] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-BLyS compreende as sequências de nucleotídeo codificando as cadeias pesadas e leves da porção Fab de Belimumabe (tendo sequências de aminoácido de SEQ ID NOs. 41 e 42, respectivamente, veja a Tabela 4 e FIG. 8E). As sequências de nucleotídeo podem ser otimizadas por códon para expressão em células humanas e podem, por exemplo, compreender as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NO: 141 (codificando uma porção de Fab de cadeia pesada de Belimumabe) e SEQ ID NO: 142 (codificando uma porção de Fab de cadeia leve de Belimumabe) como mencionado na Tabela 5. As sequências de cadeias pesada e leve ambas têm uma sequência sinal ou líder no N-terminal apropriado para expressão e secreção em células humanas, em particular, células de fígado humano
(por exemplo, hepatócitos) ou células musculares. A sequência sinal pode ter a sequência de aminoácido de MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161). Alternativamente, a sequência sinal pode ter uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma das sequências sinal mencionadas na Tabela 2 ou 3 que correspondem às proteínas secretadas por miócitos ou hepatócitos, respectivamente.
[00726] Além das sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve, os transgenes podem compreender, no C-terminal da sequência de domínio variável de cadeia pesada, toda ou uma porção da região de articulação. Em modalidades específicas, o domínio de ligação a antígeno anti-BLyS tem um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 41 com sequência de região de articulação adicional iniciando após o aspartato C-terminal (D), contém toda ou uma porção da sequência de aminoácido KTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 222), e especificamente, KTHL (SEQ ID NO: 223), KTHT (SEQ ID NO: 224), KTHTCPPCPA (SEQ ID NO: 225), KTHLCPPCPA (SEQ ID NO: 226), KTHTCPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 227) ou KTHLCPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 228) como mencionado na FIG 8E. Estas regiões de articulação podem ser codificadas por sequências de nucleotídeo na extremidade 3' de SEQ ID NO: 41 pela região de articulação codificando as sequências mencionadas na Tabela 5.
[00727] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-BLyS codifica um fragmento de ligação a antígeno BLyS que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 42. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-BLyS codifica um fragmento de ligação a antígeno BLyS que compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 41. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-BLyS codifica um fragmento de ligação ao antígeno que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 42 e uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 41. Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno BLyS compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 41 com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 8E) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia pesada de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11 A.
Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno BLyS compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 42 com 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 8E) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia leve de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11B.
[00728] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-BLyS codifica um Fab de Belimumabe hipergliosilado, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve de SEQ ID NOs: 41 e 42, respectivamente, com uma ou mais das seguintes mutações: M118N (cadeia pesada) e / ou Q196N (cadeia leve) (veja as FIGURAS 11A (cadeia pesada) e B (cadeia leve)).
[00729] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-BLyS codifica um fragmento de ligação ao antígeno e compreende as sequências de nucleotídeo codificando as seis CDRs de Belimumabe que são sublinhadas nas sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve de FIG. 8E que são espaçadas entre regiões de estrutura, geralmente regiões de estrutura humanas, e associadas com domínios constantes dependendo da forma da molécula de ligação ao antígeno, como é conhecido na técnica para formar o domínio variável de cadeia pesada e / ou leve de um anticorpo anti-BLyS ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Métodos de Terapia genética
[00730] São fornecidos métodos de tratamento de indivíduos humanos de SLE por administração de um vetor viral contendo um transgene codificando um anticorpo anti-BLyS, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. O anticorpo pode ser Belimumabe, e é preferivelmente um fragmento Fab do mesmo, ou outro fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em modalidades, o paciente foi diagnosticado com e / ou tem sintomas associados com SLE. Vetores recombinantes para a liberação do transgene são descritos na Seção
5.4.2. Tais vetores devem ter um tropismo para células do fígado ou musculares humanas e podem incluir rAAV não replicantes, particularmente aqueles portadores de um capsídeo AAV8 ou AAV9. Os vetores recombinantes, tal como aqueles mostrados na FIG. 8E, podem ser administrados de qualquer maneira tal como o vetor recombinante entre no tecido do fígado ou músculo, preferivelmente introduzindo o vetor recombinante na corrente sanguínea. Veja a Seção 5.5.2 para detalhes com respeito aos métodos de tratamento.
[00731] Indivíduos aos quais a tal terapia genética é administrada podem ser aqueles que respondem à terapia anti-BLyS. Em modalidades particulares, os métodos abrangem o tratamento de pacientes que foram diagnosticados com SLE, ou têm um ou mais sintomas associados com eles, e identificados como responsivos ao tratamento com um anticorpo anti-BLyS ou considerados um bom candidato para a terapia com um anticorpo anti-BLyS. Em modalidades específicas, os pacientes foram anteriormente tratados com Belimumabe, e descobriu-se serem responsivos a Belimumabe. Para determinar a capacidade de resposta, o anticorpo anti-BLyS ou produto de transgene de fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, produzido em cultura celular, biorreatores, etc.) podem ser administrados diretamente ao indivíduo. Anticorpos Pós-Translacionalmente Modificados Humanos
[00732] A produção do Fab HUPTM ou mAb HuPTM anti-BLyS, deve resultar em uma molécula “biobetter” para o tratamento de SLE realizado por meio de terapia genética - por exemplo, administrando um vetor viral ou outra construção de expressão de DNA codificando o Fab HuPTM anti-BLyS, intravenosamente a indivíduos humanos (pacientes) diagnosticados com ou tendo um ou mais sintomas de SLE, para criar um depósito permanente no tecido do fígado ou músculo que continuamente supre o produto de transgene sulfatado, pós- translacionalmente modificado totalmente humano, por exemplo, glicosilado humano produzido por células de fígado ou músculo transduzidas.
[00733] A construção de cDNA para o mAb HuPTM anti-BLyS ou Fab
HuPTM anti-BLyS devem incluir um peptídeo sinal que assegura processamento co- e pós-translacional apropriado (glicosilação e sulfação de proteína) pelas células do fígado ou musculares transduzidas. Por exemplo, a sequência sinal pode ser MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161). Alternativamente, a sequência sinal pode ter uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma das sequências sinal mencionadas na Tabela 2 ou 3 que correspondem às proteínas secretadas por miócitos ou hepatócitos, respectivamente.
[00734] Como uma alternativa, ou um tratamento adicional para terapia genética, o mAb HUPTM anti-BLyS ou Fab HUPTM pode ser produzido em linhagens de células humanas por tecnologia de DNA recombinante, e administrado a pacientes diagnosticados com SLE, ou para quem a terapia para SLE é considerada apropriada.
[00735] Em modalidades específicas, o mAb HUPTM anti-BLyS ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem cadeias pesadas e leves com as sequências de aminoácido das porções de Fab de cadeias pesada e leve de Belimumabe como mencionado na FIG. 8E (com sítios de glicosilação de asparaginase (N) não consenso realçados em aqua, sítios de glicosilação de glutamina (Q) realçados em verde, e sítios de sulfação Y realçados em amarelo) tem uma glicosilação, particularmente uma 2,6-sialilação, em uma ou mais das porções de aminoácido N30 e / ou N63 e / ou N165 da cadeia pesada (SEQ |D NO:41) ou N68 e / ou N95 da cadeia leve (SEQ ID NO:42). Alternativamente ou em adição a, o mAb HuPTM ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com as sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve Belimumabe tem um grupo de sulfação em Y94 e / ou Y95 da cadeia pesada (SEQ ID NO:41) e / ou Y85 e / ou Y86 da cadeia leve (SEQ ID NO:42). Em outras modalidades, o mAb HUPTM anti-BLyS ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não contém porções de NeuGc detectáveis e / ou não contém porções alfa-Gal detectáveis.
[00736] Em certas modalidades, o Fab ou mAb HuPTM é terapeuticamente eficaz e é pelo menos 0,5%), 1%> ou 2% glicosilado e / ou sulfatado e pode ser pelo menos 5%, 10% > ou mesmo 50% > ou 100%) glicosilado e / ou sulfatado. O objetivo de tratamento de terapia genética fornecido aqui é retardar ou interromper a progressão de SLE, reduzir os níveis de dor ou desconforto para o paciente, ou reduzir os níveis de células B autorreativas e células plasmáticas produtoras de imunoglobulina. A eficácia pode ser monitorada por pontuação da função, sintomas, ou grau de inflamação do tecido ou área afetada do corpo, por exemplo, tal como a pele, articulações, rins, pulmões, células sanguíneas, coração, e cérebro. Por exemplo, a eficácia pode ser monitorada por monitoração da presença, extensão, ou taxa de um ou mais sintomas incluindo convulsões, psicose, síndrome cerebral orgânica, distúrbio visual, outros problemas neurológicos, alopécia, erupção cutânea, fraqueza muscular, artrite, inflamação do vaso sanguíneo, úlceras mucosais, dor no peito pior com respiração profunda e manifestações de pleurisia e / ou pericardite e febre. Índices de doença padronizados podem ser usados, tal como Safety of Estrogens in Lupus Erythematosus National Assessment Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index (SELENA-SLEDAI); British Isles Lupus Assessment Group (BILAG) A, BILAG B, Systemic Lupus Activity Measure (SLAM), ou pontuação de PGA. (Veja, por exemplo, Liang MH et al. (1988) "Measurement of systemic lupus erythematosus activity in clinical research," Artrite Rheum. 31:817-25; Diaz et al. (2011) "Measures of adult systemic lupus erythematosus: updated version of British Isles Lupus Assessment Group (BILAG 2004), European Consensus Lupus Activity Measurements (ECLAM), Systemic Lupus Activity Measure, Revised (SLAM-R), Systemic Lupus Activity
Questionnaire for Population Studies (SLAQ), Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index 2000 (SLEDAI-2 K), e Systemic Lupus," International Collaborating Clinics/American College of Rheumatology Damage Index (SDI) Artrite Care Res. 63: S3 7-46).
[00737] “Combinações de liberação do mAb HuPTM anti-BLyS ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, para o fígado ou músculos acompanhadas por liberação de outros tratamentos disponíveis são abrangidas pelos métodos fornecidos aqui. Os tratamentos adicionais podem ser administrados antes, concomitantemente, ou subsequente ao tratamento de terapia genética. Tratamentos disponíveis para SLE que podem ser combinados com a terapia genética fornecida aqui incluem, porém não estão limitados à corticosteroides, antimalariais, NSAIDs, e imunossupressivos, e administração com agentes anti-BLyS, incluindo, porém não limitados a Belimumabe.
5.3.12. Construções de HuPTM Anti-CP-C5 e Formulações para Hemoglobinúria Noturna Paroxismal e Síndrome Urêmica Hemolítica Atípica
[00738] “Composições e métodos são descritos para a liberação de MAbs de HuPTM e fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo, tais como Fabs HuPTM, que se ligam à proteína C5 complemento (ou C5a) (CP-C5) derivada de um anticorpo anti-CP-C5, tal como Eculizumabe (FIG. 8F), e indicadas para o tratamento de hemoglobinúria noturna paroxismal (PNH), tratamento de síndrome urêmica hemolítica atípica (aHUS), reduzindo a destruição de células sanguíneas, e / ou reduzindo a necessidade de transfusões sanguíneas. Em modalidades particulares, o mAb HuPTM tem a sequência de aminoácido de Eculizumabe ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. À sequência de aminoácido do fragmento Fab deste anticorpo é fornecido na FIG. 8F. A liberação pode ser realizada por meio de terapia genética - por exemplo, administrando um vetor viral ou outra construção de expressão de DNA codificando um mAb HuPTM de ligação a CP-C5 (ou um fragmento de ligação ao antígeno e / ou um derivado hiperglicosilado ou outro derivado, do mesmo) a pacientes (indivíduos humanos) diagnosticados com PNH ou aHUS para criar um depósito permanente que continuamente supre o PTM humano, por exemplo, produto de transgene, glicosilado humano. Transgenes
[00739] São fornecidos vetores recombinantes contendo um transgene codificando um mMAb HuPTM ou Fab HuPTM (ou outro fragmento de ligação ao antígeno do mAb HuPTM) que se liga a CP-C5 que pode ser administrado para liberar o mAb HuUPTM ou fragmento de ligação ao antígeno em um paciente. O transgene é um ácido nucleico compreendendo as sequências de nucleotídeo codificando um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo que se liga a CP-C5, tal como Eculizumabe ou variantes do mesmo como detalhado aqui. O transgene pode também codificar um anti-CP-C5 fragmento de ligação ao antígeno que contém sítios de glicosilação adicionais (por exemplo, veja Courtois et al.).
[00740] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-CP-C5 compreende as sequências de nucleotídeo codificando as cadeias pesadas e leves da porção Fab de Eculizumabe (tendo sequências de aminoácido de SEQ ID NOs. 43 e 44, respectivamente, veja a Tabela 4 e FIG. 8F). As sequências de nucleotídeo podem ser otimizadas por códon para expressão em células humanas e podem, por exemplo, compreender as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NO: 143 (codificando uma porção de Fab de cadeia pesada de Eculizumabe) e SEQ ID NO: 144 (codificando uma porção de Fab de cadeia leve de Eculizumabe) como mencionado na Tabela 5. As sequências de cadeias pesada e leve ambas têm uma sequência sinal ou líder no N-terminal apropriado para expressão e secreção em células humanas, em particular, células de fígado humano (por exemplo, hepatócitos). A sequência sinal pode ter a sequência de aminoácido de MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161). Alternativamente, a sequência sinal pode ter uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma das sequências sinal mencionadas na Tabela 3 que correspondem às proteínas secretadas por hepatócitos.
[00741] Além das sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve, os transgenes podem compreender, no C-terminal da sequência de domínio variável de cadeia pesada, toda ou uma porção da região de articulação. Em modalidades específicas, o domínio de ligação a antígeno anti-CP-C5 tem um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 43 com sequência de região de articulação adicional iniciando após o ácido glutâmico C-terminal (E), contém toda ou uma porção da sequência de aminoácido CPPCPAPPVAGG (SEQ ID NO: 232), e especificamente, CPPCPA (SEQ ID NO: 219) ou CPPCPAPPVAG (SEQ ID NO: 233) como mencionado na FIG 8F. Estas regiões de articulação podem ser codificadas por sequências de nucleotídeo na extremidade 3' de SEQ ID NO: 43 pela região de articulação codificando as sequências mencionadas na Tabela 5.
[00742] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-CP-C5 codifica um fragmento CP-C5 de ligação ao antígeno que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 44. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-CP- C5 codifica um fragmento CP-C5 de ligação ao antígeno que compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%,
92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 43. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-CP-C5 codifica um fragmento de ligação ao antígeno que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 44 e uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 43. Em modalidades específicas, o CP-C5 fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 43 com 1,2,3,4,5,6,7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 8F) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia pesada de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11 A.
Em modalidades específicas, o CP-C5 fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 44 com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 8F) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia leve de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11B.
[00743] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-CP-C5 codifica um Fab de Eculizumabe hiperglicosilado, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve de SEQ ID NOs: 43 e 44, respectivamente, com uma ou mais das seguintes mutações: L117N (cadeia pesada), Q160N ou Q1608S (cadeia leve), e / ou E195N (cadeia leve) (veja as FIGURAS 11A (cadeia pesada) e B (cadeia leve)).
[00744] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-CP-C5 codifica um fragmento de ligação ao antígeno e compreende as sequências de nucleotídeo codificando as seis CDRs de Eculizumabe que são sublinhadas nas sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve de FIG. 8F que são espaçadas entre regiões de estrutura, geralmente regiões de estrutura humanas, e associadas com domínios constantes dependendo da forma da molécula de ligação ao antígeno, como é conhecido na técnica para formar o domínio variável de cadeia pesada e / ou leve de um anticorpo anti-CP-C5 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Métodos de Terapia genética
[00745] São fornecidos métodos de tratamento de indivíduos humanos de PNH ou aHUS por administração de um vetor viral contendo um transgene codificando um anticorpo anti-CP-C5, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. O anticorpo pode ser Eculizumabe, e é preferivelmente um fragmento Fab do mesmo, ou outro fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em modalidades, o paciente foi diagnosticado com e / ou tem sintomas associados com PNH ou aHUS. Vetores recombinantes para a liberação do transgene são descritos na Seção 5.4.2. Tais vetores devem ter um tropismo para células de fígado humano e podem incluir rAAV não replicante, particularmente aqueles portadores de um capsídeo AAV8 ou AAV9. Os vetores recombinantes, tal como aqueles mostrados na FIG. 8F, podem ser administrados de qualquer maneira tal como o vetor recombinante entre no fígado, preferivelmente introduzindo o vetor recombinante na corrente sanguínea. Veja a Seção 5.5.2 para detalhes com respeito aos métodos de tratamento.
[00746] Indivíduos, aos quais tal terapia genética é administrada, podem ser aqueles que respondem à terapia anti-CP-C5. Em modalidades particulares, os métodos abrangem o tratamento de pacientes que foram diagnosticados com PNH ou aHUS, ou têm um ou mais sintomas associados com eles, e identificados como responsivos ao tratamento com um anticorpo anti-CP-C5 ou considerados um bom candidato para a terapia com um anticorpo anti-CP-C5. Em modalidades específicas, os pacientes foram anteriormente tratados com Eculizumabe, e descobriu-se serem responsivos a Eculizumabe. Para determinar a capacidade de resposta, o anticorpo anti-CP-C5 ou produto de transgene de fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, produzido em cultura celular, biorreatores, etc.) podem ser administrados diretamente ao indivíduo. Anticorpos Pós-Translacionalmente Modificados Humanos
[00747] A produção do Fab HUPTM ou mAb HuPTM anti-CP-C5, deve resultar em uma molécula “biobetter' para o tratamento de PNH ou aHUS realizado por meio de terapia genética - por exemplo, administrando um vetor viral ou outra construção de expressão de DNA codificando o Fab HUPTM anti-CP-C5, intravenosamente a indivíduos humanos (pacientes) diagnosticados com ou tendo um ou mais sintomas de PNH ou aHUS, para criar um depósito permanente no tecido do fígado que continuamente supre o produto de transgene sulfatado pós-translacionalmente modificado totalmente humano, por exemplo, glicosilado humano produzido por células do fígado transduzidas.
[00748] A construção de cDNA para o mAb HuUPTM anti-CP-C5 ou
Fab HuPTM anti-CP-C5 devem incluir um peptídeo sinal que assegura processamento co- e pós-translacional apropriado (glicosilação e sulfação de proteína) pelas células do fígado transduzida. Por exemplo, a sequência sinal pode ser MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161). Alternativamente, a sequência sinal pode ter uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma das sequências sinal mencionadas na Tabela 3 que correspondem às proteínas secretadas por hepatócitos.
[00749] Como uma alternativa, ou um tratamento adicional para terapia genética, o MmAb HUPTM anti-CP-C5 ou Fab HUPTM pode ser produzido em linhagens de células humanas por tecnologia de DNA recombinante, e administrado a pacientes diagnosticados com PNH ou aHUS, ou para quem a terapia para PNH ou aHUS é considerada apropriada.
[00750] Em modalidades específicas, o mAb HUPTM anti-CP-C5 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem cadeias pesadas e leves com as sequências de aminoácido das porções de Fab de cadeias pesada e leve de Eculizumabe como mencionado na FIG. 8F (com sítios de glicosilação de asparaginase (N) não consenso realçados em aqua, sítios de glicosilação de glutamina (Q) realçados em verde, e sítios de sulfação Y realçados em amarelo) tem uma glicosilação, particularmente uma 2,6-sialilação, em uma ou mais das porções de aminoácido N63 e / ou Q114 e / ou N164 e / ou N197 e / ou N206 da cadeia pesada (SEQ ID NO:43) ou N28 e / ou Q100 e / ou NI158 e / ou N210 da cadeia leve (SEQ ID NO:44). Alternativamente ou em adição a, o MmAb HuPTM ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com as sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve Eculizumabe tem um grupo de sulfação em Y94 e / ou Y95 da cadeia pesada (SEQ ID NO:43) e / ou Y86 e / ou Y87 da cadeia leve (SEQ ID NO:44). Em outras modalidades, o mAb HuPTM anti-CP-C5 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não contém quaisquer porções de NeuGc detectáveis e / ou não contém quaisquer porções alfa-Gal detectáveis.
[00751] Em certas modalidades, o Fab ou mAb HuPTM é terapeuticamente eficaz e é pelo menos 0,5%, 1% ou 2% glicosilado e / ou sulfatado e pode ser pelo menos 5%, 10% ou mesmo 50% ou 100%) glicosilado e / ou sulfatado. O objetivo de tratamento de terapia genética fornecido aqui é retardar ou interromper a progressão de PNH ou aHUS, reduzir a necessidade de uma transfusão sanguínea, ou reduzir a destruição de células sanguíneas vermelhas. A eficácia pode ser monitorada medindo a estabilização de hemoglobina e / ou o número de unidades RBC transfundidas ou avaliando os níveis de fadiga e / ou qualidade de vida relacionada com a saúde durante o curso de tratamento.
[00752] Combinações de liberação do mAb HuPTM anti-CP-C5 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, para o fígado acompanhadas por liberação de outros tratamentos disponíveis são abrangidas pelos métodos fornecidos aqui. Os tratamentos adicionais podem ser administrados antes, concomitantemente, ou subsequente ao tratamento de terapia genética. Tratamentos disponíveis para PNH ou aHUS que podem ser combinados com a terapia genética fornecida aqui incluem, porém não estão limitados à anticoagulantes e tratamentos com esteroides/imunossupressores, e administração com agentes anti-CP-C5, incluindo, porém não limitados a Eculizumabe.
5.3.13 Construções de HuPTM anti-MMP9 e Formulações para Distúrbios Oculares, Fibrose cística, Artrite reumatoide, Doença do Intestino Inflamatória, e Câncer
[00753] “Composições e métodos são descritos para a liberação de MAbs de HuPTM e fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo, tais como Fabs HuPTM, que se ligam à metaloproteinase matriz 9 (MMP9)
derivado de anti-MMP9 indicados para o tratamento de um ou mais distúrbios retinais incluindo degeneração macular (por exemplo, degeneração macular seca relacionada com a idade (AMD)), fibrose cística (CF), artrite reumatoide (RA), IBD (por exemplo, UC e CD), e um ou mais tipos de câncer (por exemplo, tumores sólidos, adenocarcinoma pancreático, adenocarcinoma de pulmão, carcinoma de célula escamosa pulmonar, adenocarcinoma esofagogástrico, câncer gástrico, câncer colorretal, ou câncer de mama), ou para suprimir a degradação de matriz extracelular. Em modalidades particulares, o mAb HUPTM tem a sequência de aminoácido de Andecaliximabe ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. A sequência de aminoácido de fragmentos Fab de Andecaliximabe é fornecido na FIG. 8G. A liberação pode ser realizada por meio de terapia genética - por exemplo, administrando um vetor viral ou outra construção de expressão de DNA codificando um mAb HuPTM de ligação a MMP9 (ou um fragmento de ligação ao antígeno e / ou um derivado hiperglicosilado ou outro derivado, do mesmo) a pacientes (indivíduos humanos) diagnosticados com, ou tendo um ou mais sintomas de um distúrbio retinal (por exemplo degeneração macular), RA, CF, IBD (por exemplo, UC ou CD), ou um ou mais cânceres (tais como aqueles listados acima) para criar um depósito permanente que continuamente supre o PTM humano, por exemplo, produto de transgene, glicosilado humano.
[00754] São fornecidos vetores recombinantes contendo um transgene codificando um mAb HuPTM ou Fab HuPTM (ou outro fragmento de ligação ao antígeno do mAb HuUPTM) que se liga à MMP9 que pode ser administrado para liberar o mAb HUPTM ou fragmento de ligação ao antígeno em um paciente. O transgene é um ácido nucleico compreendendo as sequências de nucleotídeo codificando um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo que se liga à MMP9, tal como Andecaliximabe, ou variantes do mesmo como detalhado aqui.
O transgene pode também codificar um fragmento de ligação ao antígeno anti-MMP9 que contém sítios de glicosilação adicionais (por exemplo, veja Courtois et a/.).
[00755] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-MMP9 compreende as sequências de nucleotídeo codificando as cadeias pesadas e leves da porção Fab de Andecaliximabe (tendo sequências de aminoácido de SEQ ID NOs. 45 e 46, respectivamente, veja a Tabela 4 e FIG. 8G). As sequências de nucleotídeo podem ser otimizadas por códon para expressão em células humanas e podem, por exemplo, compreender as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NO: 145 (codificando uma porção de Fab de cadeia pesada de Andecaliximabe) e SEQ ID NO: 146 (codificando uma porção Fab de cadeia leve de Andecaliximabe) como mencionado na Tabela 5. No caso de tratamento de ocular diseases, as sequências de cadeias pesada e leve ambas têm uma sequência sinal ou líder no N- terminal apropriado para expressão e secreção em células humanas, em particular, uma ou mais células que formam a retina. A sequência sinal pode ter a sequência de aminoácido de MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161). Alternativamente, a sequência sinal pode ter uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma das sequências sinal mencionadas na Tabela 1 que correspondem às proteínas secretadas por uma ou mais células que formam a retina. No caso de tratamento de doenças não oculares, as sequências de cadeias pesada e leve ambas têm uma sequência sinal ou líder no N-terminal apropriado para expressão e secreção em células humanas, em particular, células de fígado humano (por exemplo, hepatócitos) ou células musculares. A sequência sinal pode ter a sequência de aminoácido de MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161). Alternativamente, a sequência sinal pode ter uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma das sequências sinal mencionadas na Tabela 2 ou 3 que correspondem às proteínas secretadas por miócitos ou hepatócitos, respectivamente.
[00756] Além das sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve, os transgenes podem compreender, no C-terminal da sequência de domínio variável de cadeia pesada, toda ou uma porção da região de articulação. Em modalidades específicas, o domínio de ligação a antígeno anti-MMP9 tem um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 45 com sequência de região de articulação adicional iniciando após o ácido aspártico C-terminal (D), contém toda ou uma porção da sequência de aminoácido GPPCPPCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 231), e especificamente, GPPCPPCPA (SEQ I|D NO 229) ou GPPCPPCPAPEFLGGPSVFL (SEQ ID NO: 230) como mencionado na FIG 8G. Estas regiões de articulação podem ser codificadas por sequências de nucleotídeo na extremidade 3' de SEQ ID NO: 45 pela região de articulação codificando as sequências mencionadas na Tabela 5.
[00757] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-MMP9 codifica um Fragmento de ligação ao antígeno de MMP9 que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 46. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti- MMP9 codifica um fragmento de ligação ao antígeno de MMP9 que compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 294%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 45. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-MMP9 codifica um fragmento de ligação ao antígeno que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 46 e uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 45. Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno de MMP9 compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 45 com 1,2,3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 8G) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia pesada de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11 A. Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno de MMP9 compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 46 com 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 8G) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia leve de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11B.
[00758] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-MMP9 codifica um Fab hiperglicosilado Andecaliximabe, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve de SEQ ID NOs: 45 e 46, respectivamente, com uma ou mais das seguintes mutações: L110N (cadeia pesada), Q160N ou Q1608S (cadeia leve), e / ou E195N (cadeia leve) (veja as FIGURAS 11A (cadeia pesada) e B (cadeia leve)).
[00759] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-MMP9 codifica um fragmento de ligação ao antígeno e compreende as sequências de nucleotídeo codificando as seis CDRs de Andecaliximabe que são sublinhadas nas sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve de FIG. 8G que são espaçadas entre regiões de estrutura, geralmente regiões de estrutura humanas, e associadas com domínios constantes dependendo da forma da molécula de ligação ao antígeno, como é conhecido na técnica para formar o domínio variável de cadeia pesada e / ou leve de um anticorpo anti-MMP9 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Métodos de Terapia genética
[00760] São fornecidos métodos de tratamento de indivíduos humanos de um ou mais distúrbios retinais (tais como degeneração macular), IBD, CF, RA, ou cânceres por administração de um vetor viral contendo um transgene codificando um anticorpo anti-MMP9 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. O anticorpo pode ser Andecaliximabe, e é preferivelmente um fragmento Fab do mesmo, ou outro fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em modalidades, o paciente foi diagnosticado com e / ou tem sintomas associados com um ou mais de distúrbios retinais, IBD, CF, RA, ou cânceres.
[00761] Vetorrecombinante usado para a liberação do transgene são descritos na Seção 5.4.3. Tais vetores devem ter um tropismo para células tipo retina humana e podem incluir rAAV não replicante, particularmente aqueles portadores de um capsídeo de AAV8. Os vetores recombinantes, tal como aqueles mostrados na FIG. 8G, podem ser administrados de qualquer maneira tal como o vetor recombinante entre na retina, preferivelmente introduzindo o vetor recombinante no olho. Veja a Seção 5.5.3 para detalhes com respeito aos métodos de tratamento. Para liberação para o fígado, por exemplo, para o tratamento de câncer, o vetor recombinante usado para a liberação do transgene é descrito na Seção 5.4.2. Tais vetores devem ter um tropismo para células de fígado humano e podem incluir rAAV não replicante, particularmente aqueles portadores de um capsídeo AAV8 ou AAV9. Os vetores recombinantes, tal como aqueles mostrados na FIG. 8G, podem ser administrados de qualquer maneira tal como o vetor recombinante entre no fígado, preferivelmente introduzindo o vetor recombinante na corrente sanguínea. Veja a Seção 5.5.2 para detalhes com respeito aos métodos de tratamento.
[00762] Indivíduos aos quais a tal terapia genética é administrada podem ser aqueles que respondem à terapia anticMMP9. Em modalidades particulares, os métodos abrangem o tratamento de pacientes que foram diagnosticados com um ou mais distúrbios retinais ou tipos de câncer, ou têm um ou mais sintomas associados com eles, e identificados como responsivos ao tratamento com um anticorpo anti- MMPS9, ou considerados um bom candidato para a terapia com um anticorpo anti-MMP9. Em modalidades específicas, os pacientes foram anteriormente tratados com Andecaliximabe, e descobriu-se serem responsivos a Andecaliximabe. Para determinar a capacidade de resposta, o anti-MMP9 ou produto de transgene de fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, produzido em cultura celular, biorreatores, etc.) podem ser administrados diretamente ao indivíduo. Anticorpos Pós-Translacionalmente Modificados Humanos
[00763] A produção do Fab HUPTM ou mAb HuPTM anti-MMP9, deve resultar em uma molécula “biobetter” para o tratamento de um ou mais distúrbios retinais, CF, RA, IBD, ou cânceres realizado por meio de terapia genética - por exemplo, administrando um vetor viral ou outra construção de expressão de DNA codificando o Fab HuPTM anti-MMP9,
sub-retinalmente, intravitreamente ou supracoroidalmente a indivíduos humanos (pacientes) diagnosticados com ou tendo um ou mais sintomas de um ou mais distúrbios retinais, ou administrando um vetor viral ou outra construção de expressão de DNA codificando o Fab HuPTM anti-MMP9, subcutaneamente, intramuscularmente, ou intravenosamente a indivíduos humanos (pacientes) diagnosticados com RA, CF, IBD, ou cancer, para criar um depósito permanente na retina ou fígado que continuamente supre o produto de transgene sulfatado, pós-translacionalmente modificado totalmente humano, por exemplo, glicosilado humano produzido por células transduzidas da retina ou fígado.
[00764] A construção de cDNA para o mAb HuUPTM anti-MMP9 ou Fab HuUPTM anti-MMP9 devem incluir um peptídeo sinal que assegura processamento co- e pós-translacional apropriado (glicosilação e sulfação de proteína) pelas células transduzidas da retina ou fígado. Por exemplo, a sequência sinal pode ser MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161). Alternativamente, a sequência sinal pode ter uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma das sequências sinal mencionadas na Tabela 1 ou 3 que correspondem às proteínas secretadas por células da retina ou fígado, respectivamente.
[00765] Como uma alternativa, ou um tratamento adicional para terapia genética, o mAb HuUPTM anti-MMP9 ou Fab HUPTM pode ser produzido em linhagens de células humanas por tecnologia de DNA recombinante, e administrado a pacientes diagnosticados com um distúrbio retinal ou câncer para quem a terapia para um distúrbio retinal, IBD, CF, RA, ou câncer é considerada apropriada.
[00766] Em modalidades específicas, o mAb HuUPTM anti-MMP9 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem cadeias pesadas e leves com as sequências de aminoácido das porções de Fab de cadeias pesada e leve de Andecalixóimabe como mencionado na FIG. 8G (com sítios de glicosilação de asparaginase (N) não consenso realçados em aqua, sítios de glicosilação de glutamina (Q) realçados em verde, e sítios de sulfação Y realçados em amarelo) tem uma glicosilação, particularmente uma 2,6-sialilação, em uma ou mais das porções de aminoácido N58, N76, Q107, N157, e / ou N199 da cadeia pesada (SEQ ID NO:45) ou N158 e / ou N210 da cadeia leve (SEQ ID NO:46). Alternativamente ou em adição a, o mAb HuPTM ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com as sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve Andecaliximabe tem um grupo de sulfação em Y93 e / ou Y94 da cadeia pesada (SEQ ID NO: 45) e / ou Y86 e / ou Y87 da cadeia leve (SEQ ID NO: 46). Em outras modalidades, o mAb HuPTM anti-MMP9 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não contém porções de NeuGc detectáveis e / ou não contém porções alfa- Gal detectáveis.
[00767] Em certas modalidades, o Fab ou mAb HuPTM é terapeuticamente eficaz e é pelo menos 0,5%, 1% ou 2% glicosilado e / ou sulfatado e pode ser pelo menos 5%, 10% ou mesmo 50% ou 100%) glicosilado e / ou sulfatado. O objetivo de tratamento de terapia genética fornecido aqui é retardar ou interromper a progressão da doença que está sendo tratada ou aliviar um ou mais sintomas da mesma. No caso de distúrbios retinais, a eficácia pode ser monitorada por monitoração da acuidade visual. Por exemplo, a eficácia pode ser monitorada avaliando a mudança em acuidade visiual a partir da linha de base. No caso de um câncer, a eficácia pode ser monitorada avaliando uma ou mais finalidades de oncologia incluindo sobrevivência geral, sobrevivência livre de progressão, tempo para a progressão, tempo para a falência do tratamento, sobrevivência livre de evento, tempo para o próximo tratamento, taxa de resposta objetiva, ou duração de resposta, (veja, por exemplo, U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and
Research, Center for Biologies Evaluation and Research. Guidance for industry: clinical trial endpoints for the approval of cancer drugs and biologies.
[00768] — https://www.fda.gov/downloads/Drugs/Guidances/ucmO0715
90.pdf Publicado em maio de 2007. Acessado em 13 de outubro de 2017; Oncology Endpoints in a Changing Landscape. Manag. Care. 2016; I(suppl):1|-12). No caso de RA, a eficácia pode ser monitorada avaliando um ou mais de (1) contagem de articulação inchada, (2) contagem de articulação tenra, (3) avaliação global do médico de atividade da doença, (4) auto-relato do estado funcional do paciente, (5) auto-relato de dor do paciente, (6) Avaliação geral do pasciente de atividade da doença, (7) Uma medida de laboratório de proteína reativa C e taxa de sedimentação de eritrócito, e (8) progressão radiográfica, (veja, por exemplo, Smolen JS, Aletaha D. "Assessment of reumatoide artritis activity in clinical trials and clinical practice" UptoDate.com Wolters Kluwer Health. Accessed at: www.uptodate.com Dec. 2017) por exemplo, com relação À CD, a eficácia pode ser monitorada avaliando o Índice de Atividade da Doença Crohn [CDAI] durante o curso de tratamento (por exemplo, veja Best WR et al. (1976) Gastroenterology, Mar; 70(3):439-44, "Development of a Crohn Disease Activity Index. National Cooperative Crohn Disease Study."). Com relação à UC, a eficácia pode ser monitorada avaliando uma pontuação Mayo e uma subpontuação de endoscopia durante o curso de tratamento (por exemplo, veja Lobaton et al., "The Modified Mayo Endoscopic Score (MMES): A New Index for the Assessment of Extension and Severity of Endoscopic Activity in Ulcerative Colitis Patients," J. Crohns Colitis. 9 de outubro de 2015 (10):846-52). No caso de CF, a eficácia pode ser monitorada avaliando o Volume Expiratório Forçado em 1s (FEV), frequência reduzida de exacerbações pulmonares, melhora da qualidade de vida (QoL), e, para pacientes mais jovens, melhora do crescimento, (por exemplo, veja VanDevanter e Konstan, "Outcome measurement for clinical trials assessing treatment of cistic fibrosis lung disease," Clin. Investig. 2(2): 163-175 (2012)).
[00769] “Combinações de liberação do mAb HUPTM anti-MMP9 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para a retina ou fígado acompanhadas por liberação de outros tratamentos disponíveis são abrangidas pelos métodos fornecidos aqui. Os tratamentos adicionais podem ser administrados antes, concomitantemente, ou subsequente ao tratamento de terapia genética. Tratamentos disponíveis para degeneração macular que podem ser combinados com a terapia genética fornecida aqui incluem, porém não estão limitados à fotocoagulação a laser, terapia fotodinâmica com verteporfina, aflibercept, e / ou esteroides intravítreos e administração com anti- MMP9 agents, incluindo, porém não limitados a Andecaliximabe. Tratamentos disponíveis para um ou mais dos cânceres acima listados que podem ser combinados com a terapia genética fornecida aqui incluem, porém não estão limitados à quimioterapia (por exemplo, cisplatina, gencitabina, pemetrexed, 5-fluorouracila, carboplatina, irinotecano, interferon alfa, oxaliplatina,y doxorubicina lipossômica pegilada de paclitaxel, e / ou topotecano), fármacos protetores de quimioterapia (por exemplo, leucovorina), radioterapia, crioterapia, terapias de molécula pequena direcionadas, outros anticorpos, aflibercept, e / ou terapia de vacina e administração com anti-MMP9, incluindo, porém não limitados a Andecaliximabe. Tratamentos disponíveis para RA que podem ser combinados com a terapia genética fornecida aqui incluem, porém não estão limitados a bisfosfonatos, fármacos anti-inflamatórios não esteroidais (por exemplo, celecoxibe, naproxeno, aspirina, indometacina, sulfasalazina, e cetoprofeno), esteroides (por exemplo, prednisona), fármacos antirreumáticos modificadores da doença e outros imunossupressores (por exemplo,
leflunomida, metotrexato, tofactinibe, azatioprina,y micofenolato, ciclofosfamida, ciclosporina), hidroxicloroquina, abatacept, anacinra, apremilast, inibidores de TNF, outros anticorpos (por exemplo, tocilizumabe, seciquinimabe, rituximabe) e administração com anti- MMPS9, incluindo, porém não limitados a Andecaliximabe. Tratamentos disponíveis para IBD que podem ser combinados com a terapia genética fornecida aqui incluem, porém não estão limitados à fármacos anti- inflamatórios não esteroidais (por exemplo, mesalamina, sulfasalazina), esteroids (por exemplo, hidrocortisona, prednisona, budesonida), imunossupressores (por exemplo, metotrexato, mercaptopurina, azatioprina), vitaminas (por exemplo, ferro, colecalciferol), antibióticos (por exemplo, ácido aminossalicílico, metronidazol), outros anticorpos (por exemplo, Inflióimabe, Adalimumabe) e administração com anti- MMPS9, incluindo, porém não limitados a Andecaliximabe. Tratamentos disponíveis para CF que podem ser combinados com a terapia genética fornecida aqui incluem, porém não estão limitados a antibióticos, vacinas, e medicamentos para tosse (por exemplo, acetilcisteína e dornasa alfa) e administração com anti-MMPS9, incluindo, porém não limitados a Andecaliximabe.
5.3.14. Construções de HuPTM Anti-pKal e Formulações para Angioedema
[00770] São fornecidos composições e métodos para a liberação de MAbs de HuPTM e fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo, tais como Fabs HuPTM, que se ligam à calicreína (pKal) derivado de um anticorpo anti-pKal e indicados para o tratamento de angioedema, tal como angioedema hereditário. Em modalidades particulares, o mAb HuPTM tem a sequência de aminoácido de Lanadelumabe ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. A sequência de aminoácido de fragmento Fab deste anticorpo é fornecida na FIG. 8H. A liberação pode ser realizada por meio de terapia genética - por exemplo, administrando um vetor viral ou outra construção de expressão de DNA codificando um mAb HuPTM de ligação a pKal (ou um fragmento de ligação ao antígeno e / ou um derivado hiperglicosilado ou outro derivado, do mesmo) a pacientes (indivíduos humanos) diagnosticados com angioedema para criar um depósito permanente que continuamente supre o PTM humano, por exemplo, produto de transgene, glicosilado humano. Transgenes
[00771] São fornecidos vetores recombinantes contendo um transgene codificando um mMAb HuPTM ou Fab HuPTM (ou outro fragmento de ligação ao antígeno do mAb HuUPTM) que se liga a pKal que pode ser administrado para liberar o mAb HUPTM ou fragmento de ligação ao antígeno em um paciente. O transgene é um ácido nucleico compreendendo as sequências de nucleotídeo codificando um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo que se liga a pKal, tal como Lanadelumabe ou variantes do mesmo como detalhado aqui. O transgene pode também codificar um fragmento de ligação ao antígeno anti-pKal que contém sítios de glicosilação adicionais (por exemplo, veja Courtois et al/.).
[00772] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anticpbKal compreende as sequências de nucleotídeo codificando as cadeias pesadas e leves da porção Fab de Lanadelumabe (tendo sequências de aminoácido de SEQ ID NOs. 47 e 48, respectivamente, veja a Tabela 4 e FIG. 8H). As sequências de nucleotídeo podem ser otimizadas por códon para expressão em células humanas e podem, por exemplo, compreender as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NO: 147 (codificando uma porção Fab de cadeia pesada de Lanadelumabe) e SEQ ID NO: 148 (codificando uma porção Fab de cadeia leve de Lanadelumabe) como mencionado na Tabela 5. As sequências de cadeias pesada e leve ambas têm uma sequência sinal ou líder no N-terminal apropriado para expressão e secreção em células humanas, em particular, células de fígado humano (por exemplo, hepatócitos) ou células musculares. A sequência sinal pode ter a sequência de aminoácido de MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161). Alternativamente, a sequência sinal pode ter uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma das sequências sinal mencionadas na Tabela 2 ou 3 que correspondem às proteínas secretadas por miócitos ou hepatócitos, respectivamente.
[00773] Além das sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve, os transgenes podem compreender, no C-terminal da sequência de domínio variável de cadeia pesada, toda ou uma porção da região de articulação. Em modalidades específicas, o domínio de ligação a antígeno anti-pKal tem um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 47 com sequência de região de articulação adicional iniciando após o aspartato C-terminal (D), contém toda ou uma porção da sequência de aminoácido KTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 222), e especificamente, KTHL (SEQ ID NO: 223), KTHT (SEQ ID NO: 224), KTHTCPPCPA (SEQ ID NO: 225), KTHLCPPCPA (SEQ ID NO: 226), KTHTCPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 227) ou KTHLCPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 228) como mencionado na FIG 8H. Estas regiões de articulação podem ser codificadas por sequências de nucleotídeo na extremidade 3' de SEQ ID NO: 47 pela região de articulação codificando as sequências mencionadas na Tabela 5.
[00774] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-pKal codifica um fragmento de ligação ao antígeno pKal que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 48. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-pKal codifica um fragmento de ligação ao antígeno pKal que compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 47. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-pKal codifica um fragmento de ligação ao antígeno que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 48 e uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 47. Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno pKal compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 47 com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 8H) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia pesada de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11 A.
Em modalidades específicas, o pKal fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 48 com 1,2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG.
8H) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia leve de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11B.
[00775] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-pKal codifica um Fab hiperglicosilado de Lanadelumabe, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve de SEQ ID NOs: 47e€ 48, respectivamente, com uma ou mais das seguintes mutações: M117N (cadeia pesada) e / ou Q159N, Q1598, e / ou E194N (cadeia leve) (veja as FIGURAS 11A (cadeia pesada) e B (cadeia leve)).
[00776] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-pKal codifica um fragmento de ligação ao antígeno e compreende as sequências de nucleotídeo codificando as seis CDRs de Lanadelumabe que são sublinhadas nas sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve de FIG. 8H que são espaçadas entre regiões de estrutura, geralmente regiões de estrutura humanas, e associadas com domínios constantes dependendo da forma da molécula de ligação ao antígeno, como é conhecido na técnica para formar o domínio variável de cadeia pesada e / ou leve de um anticorpo anti-pKal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Métodos de Terapia genética
[00777] São fornecidos métodos de tratamento de indivíduos humanos de angioedema por administração de um vetor viral contendo um transgene codificando um anticorpo anti-pKal, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. O anticorpo pode ser Lanadelumabe, e é preferivelmente um fragmento Fab do mesmo, ou outro fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em modalidades, o paciente foi diagnosticado com e / ou tem sintomas associados com angioedema. Vetores recombinantes para a liberação do transgene são descritos na Seção 5.4.2. Tais vetores devem ter um tropismo para células do fígado ou musculares humanas e podem incluir rAAV não replicantes, particularmente aqueles portadores de um capsídeo AAV8 ou AAV9. Os vetores recombinantes, tal como mostrado na FIG. 8H, podem ser administrados de qualquer maneira tal como o vetor recombinante entre no tecido do fígado ou músculo, preferivelmente introduzindo o vetor recombinante na corrente sanguínea. Veja a Seção 5.5.2 para detalhes com respeito aos métodos de tratamento.
[00778] Indivíduos aos quais a tal terapia genética é administrada podem ser aqueles que respondem à terapia anti-pKal. Em modalidades particulares, os métodos abrangem o tratamento de pacientes que foram diagnosticados com angioedema, ou têm um ou mais sintomas associados com eles, e identificados como responsivos ao tratamento com um anticorpo anti-pKal ou considerados um bom candidato para a terapia com um anticorpo anti-pKal. Em modalidades específicas, os pacientes foram anteriormente tratados com Lanadelumabe, e descobriu-se serem responsivos a Lanadelumabe. Para determinar a capacidade de resposta, o anticorpo anti-pKal ou produto de transgene de fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, produzido em cultura celular, biorreatores, etc.) podem ser administrados diretamente ao indivíduo. Anticorpos Pós-Translacionalmente Modificados Humanos
[00779] A produção do Fab HUuPTM ou mAb HuUPTM anti-pKal, deve resultar em uma molécula “biobetter” para o tratamento de angioedema realizado por meio de terapia genética - por exemplo, administrando um vetor viral ou outra construção de expressão de DNA codificando o Fab HuPTM anti-pKal, intravenosamente a indivíduos humanos (pacientes) diagnosticados com ou tendo um ou mais sintomas de angioedema, para criar um depósito permanente no tecido do fígado ou músculo que continuamente supre o produto de transgene sulfatado, pós- translacionalmente modificado totalmente humano, por exemplo,
glicosilado humano produzido por células de fígado ou músculo transduzidas.
[00780] Em modalidades específicas, o mAb HuPTM anti-pKal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem cadeias pesadas e leves com as sequências de aminoácido das porções de Fab de cadeias pesada e leve de Lanadelumabe como mencionado na FIG. 8H (com sítios de glicosilação de asparaginase (N) não consenso realçados em aqua, sítios de glicosilação de glutamina (Q) realçados em verde, e sítios de sulfação Y realçados em amarelo) tem uma glicosilação, particularmente uma 2,6-sialilação, em uma ou mais das porções de aminoácido N77, Q114 e / ou N164 da cadeia pesada (SEQ ID NO:47) ou Q99, N157, e / ou N209 da cadeia leve (SEQ ID NO:48). Alternativamente ou em adição a, o mAb HuPTM ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com as sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve de Lanadelumabe tem um grupo de sulfação em Y94 e / ou Y95 da cadeia pesada (SEQ ID NO:47) e / ou Y86 e / ou Y87 da cadeia leve (SEQ ID NO:48). Em outras modalidades, o mAb HuPTM anti-pKal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não contém porções de NeuGc detectáveis e / ou não contém porções alfa- Gal detectáveis.
[00781] Em certas modalidades, o Fab ou mAb HuPTM (ou um derivado hiperglicosilado de qualquer dos dois) é terapeuticamente eficaz e é pelo menos 0,5%, 1% ou 2% glicosilado e/ou sulfatado e pode ser pelo menos 5%, 10% ou mesmo 50% ou 100% glicosilado e / ou sulfatado. O objetivo de tratamento de terapia genética fornecido aqui é retardar ou interromper a progressão de angioedema, reduzir os níveis de dor ou desconforto para o paciente, ou reduzir os níveis de células B autorreativas e células plasmáticas produtoras de imunoglobulina. A eficácia pode ser monitorada por pontuação da função, sintomas, ou grau de inflamação do tecido ou área afetada do corpo, por exemplo, tal como a pele, articulações, rins, pulmões, células sanguíneas, coração, e cérebro. Por exemplo, a eficácia pode ser monitorada avaliando mudança na severidade ou frequência da crise.
[00782] “Combinações de liberação do mAb HuPTM anti-pKal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, para o fígado ou músculo acompanhadas por liberação de outros tratamentos disponíveis são abrangidas pelos métodos fornecidos aqui. Os tratamentos adicionais podem ser administrados antes, concomitantemente, ou subsequente ao tratamento de terapia genética. Tratamentos disponíveis para angioedema que podem ser combinados com a terapia genética fornecida aqui incluem, porém não estão limitados à danazol, antagonista do receptor de bradicinina (por exemplo, icatibant), inibidor da calicreína plasmática (por exemplo, ecalantida), inibidor de CI esterase, conestat alfa, agentes antifibrinolíticos (por exemplo, ácido tranexâmico), omalizumabe, e transfusões de plasma congelado fresco, anti-histaminas, e corticosteroides e administração com agentes anti- pKal, incluindo, porém não limitados a Lanadelumabe.
5.3.15. Construções de HuPTM Anti-TNFa e Formulações para vários distúrbios autoimunes — Adalimumabe e Infliximabe
[00783] Composições e métodos são descritos para a liberação de MAbs de HuPTM e fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo, tais como Fabs HuPTM, que se ligam ao fator alfa de necrose de tumor (TNFa) derivado de um anticorpo anti-TNFa, tal como Adalimumabe (FIG. 9A) ou Infliximabe (FIG. 9B), e indicados para o tratamento de um ou mais distúrbios relacionados com a autoimunidade, tal como hidradenite supurativa (HS), dermatite atópica, psoríase (por exemplo, psoríase em placas, psoríase pustular, e psoríase eritrodérmica), artrite (por exemplo, artrite idiopática juvenil, artrite reumatoide, artrite psoriática, e espondilite alquilante), e / ou IBD (por exemplo, doença de Crohn e colite ulcerativa) (coletivamente referidos a seguir como "Al-
Ds(2) sujeitas"). Em modalidades particulares, o mAb HUPTM tem a sequência de aminoácido de Adalimumabe ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em outras modalidades, o mAb HuUPTM tem a sequência de aminoácido de infiiximabe ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Sequências de aminoácido de fragmentos Fab de o anticorpo são fornecidos nas FIGURAS 9A e 9B. A liberação pode ser realizada por meio de terapia genética - por exemplo, administrando um vetor viral ou outra construção de expressão de DNA codificando um mAb HuPTM de ligação a TNFa (ou um fragmento de ligação ao antígeno e / ou um derivado hiperglicosilado ou outro derivado, do mesmo) a pacientes (indivíduos humanos) diagnosticados com um ou mais Al-Ds(2) sujeitas para criar um depósito permanente que continuamente supre o PTM humano, por exemplo, produto de transgene, glicosilado humano. Transgenes
[00784] São fornecidos vetores recombinantes contendo um transgene codificando um mMAb HuPTM ou Fab HuPTM (ou outro fragmento de ligação ao antígeno do mAb HuPTM) que se liga a TNFa que pode ser administrado para liberar o mAb HuUPTM ou fragmento de ligação ao antígeno em um paciente. O transgene é um ácido nucleico compreendendo as sequências de nucleotídeo codificando um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo que se liga a TNFa, tal como Adalimumabe ou infiiximabe ou variantes do mesmo como detalhado aqui. O transgene pode também codificar um anti-TNFa fragmento de ligação ao antígeno que contém sítios de glicosilação adicionais (por exemplo, veja Courtois et a/.).
[00785] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-TNFa compreende as sequências de nucleotídeo codificando as cadeias pesadas e leves da porção Fab de Adalimumabe (tendo sequências de aminoácido de SEQ ID NOs. 49 e
50, respectivamente, veja a Tabela 4 e FIG. 9A). As sequências de nucleotídeo podem ser otimizadas por códon para expressão em células humanas e podem, por exemplo, compreender as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NO: 149 (codificando uma porção Fab de cadeia pesada de Adalimumabe) e SEQ ID NO: 150 (codificando uma porção Fab de cadeia leve de Adalimumabe) como mencionado na Tabela 5. As sequências de cadeias pesada e leve cada qual tem uma sequência sinal ou líder no N-terminal apropriado para expressão e secreção em células humanas, em particular, células de fígado humano (por exemplo, hepatócitos) ou células musculares. A sequência sinal pode ter a sequência de aminoácido de MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161). Alternativamente, a sequência sinal pode ter uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma das sequências sinal mencionadas na Tabela 2 ou 3 que correspondem às proteínas secretadas por miócitos ou hepatócitos, respectivamente.
[00786] Além das sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve, os transgenes podem compreender, no C-terminal da sequência de domínio variável de cadeia pesada, toda ou uma porção da região de articulação. Em modalidades específicas, o domínio de ligação a antígeno anti-TNFa tem um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 49 com sequência de região de articulação adicional iniciando após o aspartato C-terminal (D), contém toda ou uma porção da sequência de aminoácido KTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 222), e especificamente, KTHL (SEQ ID NO: 223), KTHT (SEQ ID NO: 224), KTHTCPPCPA (SEQ ID NO: 225), KTHLCPPCPA (SEQ ID NO: 226), KTHTCPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 227) ou KTHLCPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 228) como mencionado na FIG 9A. Estas regiões de articulação podem ser codificadas por sequências de nucleotídeo na extremidade 3' de SEQ ID NO: 49 pela região de articulação codificando as sequências mencionadas na
Tabela 5.
[00787] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-TNFa codifica um fragmento de ligação ao antígeno TNFa que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 50. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-TNFa codifica um fragmento de ligação ao antígeno TNFa que compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 49. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-TNFa codifica um fragmento de ligação ao antígeno que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 50 e uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 49. Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno TNFa compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 49 com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 9A) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia pesada de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11 A. Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno TNFa compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 com 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 9A) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia leve de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11B.
[00788] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-TNFa codifica um Fab de Adalimumabe hiperglicosilado, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve de SEQ ID NOs: 49 e 50, respectivamente, com uma ou mais das seguintes mutações: L116N (cadeia pesada), Q160N ou Q1608S (cadeia leve), e / ou E195N (cadeia leve) (veja as FIGURAS 11A (cadeia pesada) e B (cadeia leve)).
[00789] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-TNFa codifica um fragmento de ligação ao antígeno e compreende as sequências de nucleotídeo codificando as seis CDRs de Adalimumabe que são sublinhadas nas sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve de FIG. 9A que são espaçadas entre regiões de estrutura, geralmente regiões de estrutura humanas, e associadas com domínios constantes dependendo da forma da molécula de ligação ao antígeno, como é conhecido na técnica para formar o domínio variável de cadeia pesada e / ou leve de um anticorpo anti-TNFa ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00790] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-TNFa compreende as sequências de nucleotídeo codificando as cadeias pesadas e leves da porção Fab de infiximabe (tendo sequências de aminoácido de SEQ ID NOs. 51 e 52, respectivamente, veja a Tabela 4 e FIG. 9B). As sequências de nucleotídeo podem ser otimizadas por códon para expressão em células humanas e podem, por exemplo, compreender as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NO: 151 (codificando uma porção Fab de cadeia pesada de infiiximabe) e SEQ ID NO: 152 (codificando uma porção Fab de cadeia leve de infiximabe) como mencionado na Tabela 5. As sequências de cadeias pesada e leve cada qual tem uma sequência sinal ou líder no N-terminal apropriado para expressão e secreção em células humanas, em particular, células de fígado humano (por exemplo, hepatócitos) ou células musculares. A sequência sinal pode ter a sequência de aminoácido de MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161). Alternativamente, a sequência sinal pode ter uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma das sequências sinal mencionadas na Tabela 2 ou 3 que correspondem às proteínas secretadas por miócitos ou hepatócitos, respectivamente.
[00791] Além das sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve, os transgenes podem compreender, no C-terminal da sequência de domínio variável de cadeia pesada, toda ou uma porção da região de articulação. Em modalidades específicas, o domínio de ligação a antígeno anti-TNFa tem um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 51 com sequência de região de articulação adicional iniciando após o aspartato C-terminal (D), contém toda ou uma porção da sequência de aminoácido KTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 222), e especificamente, KTHL (SEQ ID NO: 223), KTHT (SEQ ID NO: 224), KTHTCPPCPA (SEQ ID NO: 225), KTHLCPPCPA (SEQ ID NO: 226), KTHTCPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 227) ou KTHLCPPCPAPELLGGPSVFL (SEQ ID NO: 228) como mencionado na FIG 9B. Estas regiões de articulação podem ser codificadas por sequências de nucleotídeo na extremidade 3' de SEQ ID NO: 51 pela região de articulação codificando as sequências mencionadas na Tabela 5.
[00792] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-TNFa codifica um fragmento de ligação ao antígeno TNFa que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 294%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 52. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-TNFa codifica um fragmento de ligação ao antígeno TNFa que compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 51. Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-TNFa codifica um fragmento de ligação ao antígeno que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 294%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 52 e uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência mencionada na SEQ ID NO: 51. Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno TNFa compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 51 com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 9B) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia pesada de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11 A. Em modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno TNFa compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52 com 1,2, 3,4, 5,6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido, e as substituições, inserções ou deleções preferivelmente são feitas nas regiões de estrutura (isto é, aquelas regiões fora das CDRs, cujas CDRs são sublinhadas na FIG. 9B) ou são substituições com um aminoácido presente nessa posição na cadeia leve de um ou mais dos outros anticorpos terapêuticos, por exemplo, como identificado pelo alinhamento na FIG. 11B.
[00793] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-TNFa codifica um Fab de Infliimabe hiperglicosilado, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve de SEQ ID NOs: 51 e 52, respectivamente, com uma ou mais das seguintes mutações: T115N (cadeia pesada), Q160N ou Q1608S (cadeia leve), e / ou E195N (cadeia leve) (veja as FIGURAS 11A (cadeia pesada) e B (cadeia leve)).
[00794] Em certas modalidades, o transgene de fragmento de ligação ao antígeno anti-TNFa codifica um fragmento de ligação ao antígeno e compreende as sequências de nucleotídeo codificando as seis CDRs de Infliimabe que são sublinhadas nas sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve de FIG. 9B que são espaçadas entre regiões de estrutura, geralmente regiões de estrutura humanas, e associadas com domínios constantes dependendo da forma da molécula de ligação ao antígeno, como é conhecido na técnica para formar o domínio variável de cadeia pesada e / ou leve de um anticorpo anti-TNFa ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Métodos de Terapia genética
[00795] São fornecidos métodos de tratamento de indivíduos humanos de um ou mais da Al-Ds(2) objeto por administração de um vetor viral contendo um transgene codificando um anticorpo anti-TNFa, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. O anticorpo pode ser Adalimumabe ou Inflixóimabe, e é preferivelmente um fragmento Fab do mesmo, ou outro fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em modalidades, o paciente foi diagnosticado com e / ou tem sintomas associados com um ou mais da Al-Ds(2) objeto. Vetores recombinantes para a liberação do transgene são descritos na Seção 5.4.2. Tais vetores devem ter um tropismo para células do fígado ou musculares humanas e podem incluir rAAV não replicantes, particularmente aqueles portadores de um capsídeo AAV8 ou AAV9. Os vetores recombinantes, tais como aqueles mostrados nas FIGURAS 9A e 9B, podem ser administrados de qualquer maneira tal como o vetor recombinante entre no tecido do fígado ou músculo, preferivelmente introduzindo o vetor recombinante na corrente sanguínea. Veja a Seção 5.5.2 para detalhes com respeito aos métodos de tratamento
[00796] Indivíduos aos quais a tal terapia genética é administrada podem ser aqueles que respondem à terapia anti-TNFa. Em modalidades particulares, os métodos abrangem o tratamento de pacientes que foram diagnosticados com um ou mais da Al-Ds(2) objeto, ou têm um ou mais sintomas associados com eles, e identificados como responsivos ao tratamento com um anticorpo anti- TNFa ou considerados um bom candidato para a terapia com um anticorpo anti-TNFa. Em modalidades específicas, os pacientes foram anteriormente tratados com Adalimumabe ou Infliximabe, e descobriu- se serem responsivos a Adalimumabe ou Infliimabe. Em outras modalidades, os pacientes foram anteriormente tratados com um anticorpo anti-TNF-alfa ou proteína de fusão, tal como etanercept, golimumabe, ou certolizumabe, ou outro agente anti-TNF-alfa. Para determinar a capacidade de resposta, o anticorpo anti-TNFa ou produto de transgene de fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, produzido em cultura celular, biorreatores, etc.) podem ser administrados diretamente ao indivíduo. Anticorpos Pós-Translacionalmente Modificados Humanos
[00797] A produção do Fab HUPTM ou mAb HuPTM anti-TNFa, deve resultar em uma molécula “biobetter” para o tratamento de uma ou mais AI-Ds(2) objeto realizado por meio de terapia genética - por exemplo, administrando um vetor viral ou outra construção de expressão de DNA codificando o Fab HUPTM anti-TNFa, intravenosamente a indivíduos humanos (pacientes) diagnosticados com ou tendo um ou mais sintomas de um ou mais Al-Ds(2) objeto, para criar um depósito permanente no tecido do fígado ou músculo que continuamente supre o produto de transgene sulfatado, pós-translacionalmente modificado totalmente humano, por exemplo, glicosilado humano produzido por células de fígado ou músculo transduzidas.
[00798] Em modalidades específicas, o mAb HUPTM anti-TNFa ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem cadeias pesadas e leves com as sequências de aminoácido das porções de Fab de cadeias pesada e leve de Adalimumabe como mencionado na FIG. 9A (com sítios de glicosilação de asparaginase (N) não consenso realçados em aqua, sítios de glicosilação de glutamina (Q) realçados em verde, e sítios de sulfação Y realçados em amarelo) tem uma glicosilação, particularmente uma 2,6-sialilação, em uma ou mais das porções de aminoácido N54 e / ou N163 e / ou Q113 da cadeia pesada (SEQ |D NO:49) ou Q100 e / ou N158 e / ou N210 da cadeia leve (SEQ ID NO:50). Alternativamente ou em adição a, o mAb HUPTM ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com as sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve Adalimumabe tem um grupo de sulfação em Y94 e / ou Y95 e / ou Y32 da cadeia pesada (SEQ |D NO:49) e / ou Y86 e / ou Y87 da cadeia leve (SEQ ID NO:50). Em outras modalidades, o mAb HuPTM anti-TNFa ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não contém quaisquer porções de NeuGc detectáveis e / ou não contém quaisquer porções alfa-Gal detectáveis.
[00799] Em modalidades específicas, o mAb HUPTM anti-TNFa ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem cadeias pesadas e leves com as sequências de aminoácido das porções de Fab de cadeias pesada e leve de infiiximabe como mencionado na FIG. 9B (sítios de glicosilação de asparaginase (N) com consenso e não consenso realçados em aqua, sítios de glicosilação de glutamina (Q) realçados em verde, e sítios de sulfação Y realçados em amarelo) tem uma glicosilação, particularmente uma 2,6-sialilação, em uma ou mais das porções de aminoácido N57 e / ou N101 e / ou Q112 e / ou N162 da cadeia pesada (SEQ ID NO:51) ou N41 e / ou N76 e / ou NI158 e / ou N210 da cadeia leve (SEQ ID NO:52). Alternativamente ou em adição a, o MAb HuPTM ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com as sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve Adalimumabe tem um grupo de sulfação em Y96 e / ou Y97 da cadeia pesada (SEQ ID NO:51) e / ou Y86 e / ou Y87 da cadeia leve (SEQ ID NO:52). Em outras modalidades, o mAb HuPTM anti-TNFa ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não contém quaisquer porções de NeuGc detectáveis e / ou não contém quaisquer porções alfa-Gal detectáveis.
[00800] Em certas modalidades, o Fab ou mAb HuPTM é terapeuticamente eficaz e é pelo menos 0,5%), 1% > ou 2% > glicosilado e / ou sulfatado e pode ser pelo menos 5% >, 10% > ou mesmo 50% > ou 100%) glicosilado e / ou sulfatado. O objetivo de tratamento de terapia genética fornecido aqui é retardar ou interromper a progressão de ou aliviar um ou mais sintomas de uma ou mais Al-Ds(2) objeto, tal como reduzir os níveis de dor ou desconforto para o paciente.
[00801] A eficácia pode ser monitorada por classificação dos sintomas ou grau de inflamação do tecido ou área do corpo afetada, por exemplo, tal como a pele, cólon, ou articulações.
Por exemplo, com relação à CD, a eficácia pode ser monitorada avaliando o Índice de Atividade da Doença de Crohn [CDAI] durante o curso de tratamento (por exemplo, veja Best WR et al. (1976) Gastroenterology, Mar; 70(3):439-44, "Development of a Crohn's disease activity index.
National Cooperative Crohn's Disease Study."). Com relação à UC, a eficácia pode ser monitorada avaliando uma pontuação Mayo e uma subpontuação de endoscopia durante o curso de tratamento (por exemplo, veja Lobaton et al. (2015) J.
Crohns Colitis. 2015 Oct; 9(10):846-52, "The Modified Mayo Endoscopic Score (MMES): A New Index for the Assessment of Extension and Severity of Endoscopic Activity in Ulcerative Colitis Patients."). Com relação à psoríase, HS, e dermatite atópica, a eficácia pode ser monitorada avaliando mudanças na pele afetada ou na qualidade da vida do paciente durante o curso de tratamento.
Uma ou mais avaliações padronizadas podem ser usadas para avaliar a mudança, (veja, por exemplo, Feldman & Krueger, (2005) Ann.
Rheum.
Dis. 64(Suppl 11):ii65-ii68: "Psoriasis assessment tools in clinical trials" que descreve avaliações padronizadas incluindo o Psoriasis Area and Severity Index (PASI), Physician Global Assessment (PGA), sistema de treliça, NPF Psoriasis Score (NPF-PS), Medical Outcome Survey Short Form 36 (SF-36), o Euro QoL, Dermatology Life Quality Index (DLQI), e o Skindex; Schram et a/. (2012) Allergy; 67: 99- 106: "EAS|I, (objective) SCORAD and POEM for atopic eczema: responsiveness and minimal clinically important difference" que descreve avaliações padronizadas incluindo o Eczema Area and Severity Index (EASI) e o Severity Scoring of atopic dermatitis Index (SCORAD); Sisic et al. (2017) J Cutan Med Surg. 21(2): 152-155 "Development of a Quality-of-Life Measure for Hidradenitis Suppurativa."). Com relação à artrite, a eficácia pode ser monitorada avaliando uma ou mais da atividade da doença, o nível de função do paciente, ou o grau de dano estrutural às articulações do paciente (por exemplo, veja Zockling & Braun (2005) Clin. Exp. Rheumatol 23 (Supl. 39) S133-S141: "Assessment of Ankylosing Spondylitis " que descreve a avaliação padronizada para espondilite ancilosante; veja também Coates et al. (2011) J. Rheumatol. 38(7): 1496-1501: "Development of a disease severity and responder index for psoriatic artritis (PSA)-report of the OMERACT 10 PsA special interest group" que descreve avaliações padronizadas para artrite psoriática.).
[00802] “Combinações de liberação do mAb HuPTM anti-TNFa ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, para o fígado ou músculo acompanhadas por liberação de outros tratamentos disponíveis são abrangidas pelos métodos fornecidos aqui. Os tratamentos adicionais podem ser administrados antes, concomitantemente, ou subsequente ao tratamento de terapia genética. Tratamentos disponíveis para Al- Ds(2) objeto que podem ser combinados com a terapia genética fornecida aqui incluem, porém não estão limitados à fototerapia para psoríase, aminosalicylates, immunomodulatory agents (por exemplo, azatioprina (AZA), 6-mercaptopurina (6-MP), metotrexato (MTX)), corticosteroides orais ou tópicos (por exemplo, prednisona ou budesonida), inibidores de calcineurina tópicos, antibióticos para IBD, e administração com agentes anti-TNFa, incluindo, porém não limitados a Adalimumabe ou Infliximabe.
5.4 Liberação de Construções de Terapia genética
5.4.1 Construções para liberação para o CNS
[00803] Seções 5.3.1, 5.3.2, 5.3.3, e 5.34 descrevem vetores recombinantes que contêm um transgene codificando um mAb HUPTM ou Fab HuUPTM (ou outro fragmento de ligação ao antígeno do mAb HuPTM) que se liga a AB, proteína Tau, CGRPR, e integrina, respectivamente. Tal vetor recombinante usado para a liberação do transgene deve ter um tropismo para células do CNS humano, tal como células gliais e neuronais. Tais vetores podem incluir vetores de vírus adenoassociado recombinante não replicante ("rAAV"), particularmente aqueles portadores de um capsídeo de AAV9, AAVrhiO, AAVrh20, AAVrh39, ou AAVcy5. Entretanto, outros vetores virais podem ser usados, incluindo, porém não limitados a vetores lentivirais, vetores virais de vacínia, ou vetores de expressão não virais referidos como construções de “DNA nu”.
[00804] Em modalidades específicas, são fornecidas construções para administração de terapia genética a um indivíduo humano, compreendendo um vetor AAV, que compreende um capsídeo viral que é pelo menos 95% idêntico à sequência de aminoácido de um capsídeo de AAV9 (SEQ ID NO: 79), e um genoma viral ou artificial compreendendo um cassete de expressão flanqueado por repetições de terminal invertido de AAV (ITRs) em que o cassete de expressão compreende um transgene codificando as cadeias pesadas e leves do anticorpo terapêutico, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células humanas que expressam e liberam o anticorpo terapêutico de uma maneira — terapeuticamente — apropriada — como aqui descrito, particularmente expressos de células do CNS. Em certas modalidades, o capsídeo de AAV9 codificado tem a sequência de SEQ ID NO: 79 com 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 substituições de aminoácido, particularmente substituições com resíduos de aminoácido encontrados na posição correspondente em outros capsídeos AAV, por exemplo, na faixa SUBS de FIG. 12 que fornece uma comparação das sequências de aminoácido das sequências de capsídeo de vários AAVs, realçando os aminoácidos apropriados para substituição em diferentes posições dentro da sequência de capsídeo.
[00805] Em outras modalidades específicas, são fornecidas construções para administração de terapia genética a um indivíduo humano, compreendendo um vetor AAV, que compreende um capsídeo viral que é pelo menos 95% idêntico à sequência de aminoácido de um capsídeo de AAVrhlO (SEQ ID NO: 80); e um genoma viral ou artificial compreendendo um cassete de expressão flanqueado por repetições de terminal invertido de AAV (ITRs) em que o cassete de expressão compreende um transgene codificando as cadeias pesadas e leves do anticorpo terapêutico, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células humanas que expressam e liberam o anticorpo terapêutico de uma maneira terapeuticamente — apropriada como aqui descrito, particularmente de células do CNS. Em certas modalidades, o capsídeo de AAVTrhIO codificado tem a sequência de SEQ ID NO: 80 com 1,2,3, 4,5,6,7,8, 9,10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 substituições de aminoácido, particularmente substituições com resíduos de aminoácido encontrados na posição correspondente em outros capsídeos AAV, por exemplo, na faixa SUBS de FIG. 12 que fornece uma comparação das sequências de aminoácido das sequências de capsídeo de vários AAVs, realçando os aminoácidos apropriados para substituição em diferentes posições dentro da sequência de capsídeo.
[00806] Preferivelmente, o mAb HuPTM ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, incluindo o transgene de Fab HUPTM deve ser controlado por elementos de controle da expressão apropriados para expressão do Fab HUPTM em células do CNS humano, por exemplo, o promotor CB7 (um promotor de B-actina de frango e realçador de CMV), promotor RSV, promotor GFAP (proteína acídica fibrilar glial), Promotor MBP (proteína básica de mielina), Promotor MMT, EF-1a, promotor U86, promotor RPE65 ou promotor de opsina, um promotor induzível,
por exemplo, um promotor induzível por hipoxia ou um promotor induzível por fármaco, tais como promotores induzidos por rapamicina e agentes relacionados, e outros elementos de controle da expressão que realçam a expressão do transgene direcionado pelo vetor (por exemplo, íntrons tal como o íntron de B-actina de frango, vírus diminuto de íntron de camundongos (MVM), íntron de fator IX humano (por exemplo, íntron 1 truncado de FIX), Íntron doador de emenda de Beta- globina / aceptor de emenda de cadeia pesada de imunoglobulina, íntron doador de emenda de adenovírus / aceptor de emenda de imunoglobulina, Íntron doador de emenda / aceptor de emenda tardio de SV40, e íntron doador de emenda de adenovírus híbrido / aceptor de emenda de IgG e sinais poliA tal como o sinal poliA de Beta-globina de coelho, sinal poliA de hormônio de crescimento humano (hGH), sinal poliA tardio de SV40, sinal poliA sintético (SPA), e sinal poliA de hormônio de crescimento bovino (bGH)). Veja, por exemplo, Powell and Rivera-Soto, 2015, Discov. Med., 19(102):49-57.
[00807] Construções de terapia genética são designadas de modo que ambas as cadeias pesada e leve sejam expressas. Mais especificamente, as cadeias pesada e leve devem ser expressas em quantidades aproximadamente iguais, em outras palavras, as cadeias pesada e leve são expressas em uma relação de aproximadamente 1:1 de cadeias pesadas para cadeias leves. As sequências de codificação para as cadeias pesadas e leves podem ser construídas em uma única construção na qual as cadeias pesadas e leves são separadas por um ligante clivável ou IRES de modo que polipeptídeos de cadeias pesada e leve separados sejam expressos. A sequência líder para cada uma das cadeias pesadas e leves é preferivelmente MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161). A Seção 5.1.5, supra, fornece IRES específicos, 2A, e outras sequências ligantes que podem ser usadas com os métodos e composições fornecidos aqui. Em modalidades específicas, o ligante é um ligande de Furina-F2A RKRRAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 242). Em modalidades específicas, o transgene é uma sequência de nucleotídeo que codifica o seguinte: Porção Fab de cadeia pesada de sequência sinal - ligante de Furina-F2A - porção Fab de cadeia leve de sequência sinal . Veja, por exemplo, FIGURAS 2A-2C e 2F para sequências para expressão de Fab de Aducanumabe, Crenezumabe, Gantenerumabe, ou BAN2401, respectivamente; FIG. 2D para uma sequência para expressão de Fab de aTAU; FIG. 2E para uma sequência para expressão de Fab de Erenumabe; e FIG. 4B para uma sequência para expressão de Fab de Natalizumabe.
[00808] Em uma modalidade específica, as construções aqui descritas compreendem os seguintes componentes: (1) repetições terminais invertidas de AAV2 que flanqueiam o cassete de expressão; (2) elementos de controle, que incluem a) o promotor de CB7, compreendendo o realçador de CMV / promotor Beta-actina de frango, b) um íntron de Beta-actina de frango e c) um sinal poli A de Beta- globina de coelho; e (3) sequências de ácido nucleico codificando para as cadeias pesadas e leves da ligação AB, Ligação a Tau, ligação a CGRPR, Fab de ligação à integrina, separadas por um ligante de furina (F) / F2A auto-clivável, assegurando a expressão de quantidades iguais dos polipeptídeos de cadeias pesada e leve. Uma construção exemplar é fornecida na FIG. 1.
[00809] Em modalidades específicas, são fornecidos vetores AAV compreendendo um capsídeo viral que é pelo menos 95% idêntico à sequência de aminoácido de um capsídeo de AAV9 (SEQ ID NO: 79) ou AAVrhIO (SEQ ID NO: 80); e um genoma artificial compreendendo um cassete de expressão flanqueado por repetições de terminal invertido de AAV (ITRs), em que o cassete de expressão compreende um transgene codificando um mAb anti-AB, anti-Tau, anti-CGRPR, ou anti-integrina, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células do CNS humano.
5.4.2 Construções para liberação para células do fígado ou musculares
[00810] As Seções 5.3.4, 5.3.5, 5.3.6, 5.3.7, 5.3.8, 5.3.9, 5.3.10,
5.3.11, 5.3.12, 5.3.13, 5.3.14, 5.3.15 descrevem vetores recombinantes que contêm um transgene codificando um mAb HUPTM ou Fab HUPTM (ou outro fragmento de ligação ao antígeno do mAb HuUPTM) que se liga a interleucinas (IL) ou receptores de interleucina (ILR), integrina, PCSK9, ANGPTL3, OxPL RANKL, PD-1/PD-L1/PD-L2, VEGF, fator D (fD), BLyS, CP-C5, MMP9, pKal, ou TNFa. Tal vetor recombinante usado para a liberação do transgene pode ter um tropismo para células de fígado ou musculares humanas. Tais vetores podem incluir vetores de vírus adenoassociado recombinante não replicante ("rAAV"), particularmente aqueles portadores de um AAVB8 ou capsídeo de AAV9 são preferidos. Entretanto, outros vetores virais podem ser usados, incluindo, porém não limitados a vetores lentivirais, vetores virais de vacínia, ou vetores de expressão não virais referidos como construções de “DNA nv”.
[00811] Em modalidades específicas, são fornecidas construções para administração de terapia genética a um indivíduo humano, compreendendo um vetor AAV, que compreende um capsídeo viral que é pelo menos 95% idêntico à sequência de aminoácido de um capsídeo de AAV8 (SEQ I|D NO: 78), e um genoma viral ou artificial compreendendo um cassete de expressão flanqueado por repetições de terminal invertido de AAV (ITRs) em que o cassete de expressão compreende um transgene codificando as cadeias pesadas e leves do anticorpo terapêutico, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células humanas (por exemplo, células musculares ou do fígado humanas) que expressam e liberam o anticorpo terapêutico de uma maneira terapeuticamente — apropriada como aqui descrito. Em certas modalidades, o capsídeo de AAV8 codificado tem a sequência de SEQ ID NO: 78 com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 substituições de aminoácido, particularmente substituições com resíduos de aminoácido encontrados na posição correspondente em outros capsídeos AAV, por exemplo, na faixa SUBS de FIG. 12 que fornece uma comparação das sequências de aminoácido das sequências de capsídeo de vários AAVs, realçando os aminoácidos apropriados para substituição em diferentes posições dentro da sequência de capsídeo.
[00812] Em modalidades específicas, são fornecidas construções para administração de terapia genética a um indivíduo humano, compreendendo um vetor AAV, que compreende um capsídeo viral que é pelo menos 95% idêntico à sequência de aminoácido de um capsídeo de AAV9 (SEQ ID NO: 79), e um genoma viral ou artificial compreendendo um cassete de expressão flanqueado por repetições de terminal invertido de AAV (ITRs) em que o cassete de expressão compreende um transgene codificando as cadeias pesadas e leves do anticorpo terapêutico, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células humanas (por exemplo, células musculares ou do fígado humanas) que expressam e liberam o anticorpo terapêutico de uma maneira terapeuticamente — apropriada como aqui descrito. Em certas modalidades, o capsídeo de AAV9 codificado tem a sequência de SEQ ID NO: 79 com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 substituições de aminoácido, particularmente substituições com resíduos de aminoácido encontrados na posição correspondente em outros capsídeos AAV, por exemplo, na faixa SUBS de FIG. 12 que fornece uma comparação das sequências de aminoácido das sequências de capsídeo de vários AAVs, realçando os aminoácidos apropriados para substituição em diferentes posições dentro da sequência de capsídeo.
[00813] Preferivelmente, o mAb HuPTM ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, incluindo o transgene de Fab HuUPTM deve ser controlado por elementos de controle da expressão apropriados para expressão do Fab HUPTM em células do fígado ou musculares humanas, por exemplo, o promotor CB7 (um promotor de B-actina de frango e realçador de CMV), promotores específicos do fígado tais como o promotor TBG (Globulina de ligação à tiroxina), o promotor APOA2, o promotor SERPINA1 (hAAT) ou o promotor MHU22, ou promotores específicos do músculo, tal como o promotor desmina humano ou o promotor Pitx3 humano, ou promotores induzíveis, tais como promotoes induzíveis por hipoxia ou promotor induzível por rapamicina, e podem incluir outros elementos de controle da expressão que realçam a expressão do transgene direcionado pelo vetor (por exemplo, íntrons tal como o íntron de B-actina de frango, vírus diminuto de íntron de camundongos (MVM), íntron de fator IX humano (por exemplo, íntron 1 truncado de FIX), íntron doador de emenda de B-globina / aceptor de emenda de cadeia pesada de imunoglobulina, íntron doador de emenda de adenovírus / aceptor de emenda de imunoglobulina, Íntron doador de emenda / aceptor de emenda tardio de SV40, e íntron doador de emenda de adenovírus híbrido / aceptor de emenda de IgG e sinais poliA tal como o sinal poliA de B-globina de coelho, sinal poliA de hormônio de crescimento humano (hGH), sinal poliA tardio de SV40, sinal poliA sintético (SPA), e sinal poliA de hormônio de crescimento bovino (bGH)). Veja, por exemplo, Powell and Rivera-Soto, 2015, Discov. Med., 19(102):49-57.
[00814] Construções de terapia genética são designadas de modo que ambas as cadeias pesada e leve sejam expressas.
Mais especificamente, as cadeias pesada e leve devem ser expressas em quantidades aproximadamente iguais, em outras palavras, as cadeias pesada e leve são expressas em uma relação de aproximadamente 1:1 de cadeias pesadas para cadeias leves.
As sequências de codificação para as cadeias pesadas e leves podem ser construídas em uma única construção na qual as cadeias pesadas e leves são separadas por um ligante clivável ou IRES de modo que polipeptídeos de cadeias pesada e leve separados sejam expressos.
A sequência líder para cada uma das cadeias pesadas e leves é preferivelmente MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161). A Seção 5.1.5, supra, fornece IRES específicos, 2A, e outras sequências ligantes que podem ser usadas com os métodos e composições, fornecidos aqui.
Em modalidades específicas, o ligante é um ligande de Furina-F2A RKRRAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 242). Em modalidades específicas, o transgene é uma sequência de nucleotídeo que codifica o seguinte: Porção Fab de cadeia pesada de sequência sinal - ligante de Furina-F2A - porção Fab de cadeia leve de sequência sinal.
Veja, por exemplo, as FIGURAS 3A a 3E para sequências para expressão de Fab de Dupilumabe, Ixequizumabe, Seciquinumabe, Ustequinumabe, e Mepolizumabe, respectivamente; As FIGURAS 4A e 4B para uma sequência para expressão de Fab de Vedolizumabe and Natalizumabe, respectivamente; as FIGURAS 5A a 5D para sequências para expressão de Fab de Alirocumabe, Evolocumabe, Evinacumabe, e EO6-scFv, respectivamente; a FIG. 6 para uma sequência para expressão de Fab de Denosumabe; FIGURAS 7A e 7B para sequências para Nivolumabe e Pembrolizumabe Fab expression, respectivamente; FIGURAS 8A a 8C para sequências para expressão de Fab de Ranibizumabe, Bevacizumabe, e Lampalizumabe, respectivamente; FIG. 8E para uma sequência para expressão de Fab de Belimumabe;
FIG. 8F para uma sequência para expressão de Fab de Eculizumabe; FIG. 8G para uma sequência para expressão de Fab de Andecaliximabe; FIG. 8H para uma sequência para expressão de Fab de Lanadelumabe; e as FIGURAS 9A e 9B para uma sequência para expressão de Fab de Adalimumabe e expressão de Fab de Infliximabe, respectivamente.
[00815] Em uma modalidade específica, as construções aqui descritas compreendem os seguintes componentes: (1) repetições terminais invertidas de AAV2 que flanqueiam o cassete de expressão; (2) elementos de controle, que incluem a) um promotor induzível, preferivelmente um promotor induzível por hipoxia, b) um íntron de Beta- actina de frango e c) um sinal poli A de Beta-globina de coelho; e (3) sequências de ácido nucleico codificando para as cadeias pesadas e leves do Fab de ligação a IL/ILR, ligação de integrina, ligação de PCSKS9, ligação de ANGPTL3, ligação de RANKL, ligação de OxPL, ligação de PD-1/PD-L1/PD-L2, ligação de VEGF, Fab de ligação a fD, ligação a BLyS, ligação a pKal, ou ligação a TNFa, separadas por um ligante de furina (F) / F2A auto-clivável, assegurando a expressão de quantidades iguais dos polipeptídeos de cadeias pesada e leve. Uma construção exemplar é fornecida na FIG. 1.
[00816] Em uma modalidade específica, as construções aqui descritas compreendem os seguintes componentes: (1) repetições terminais invertidas de AAV2 que flanqueiam o cassete de expressão; (2) elementos de controle, que incluem a) um promotor induzível, preferivelmente um promotor induzível por hipoxia, b) um íntron de Beta- actina de frango e c) um sinal poli A de Beta-globina de coelho; e (3) sequências de ácido nucleico codificando para as cadeias pesadas e leves do Fab de ligação a IL/ILR, ligação à integrina, ligação a POSK9, ligação a ANGPTL3, ligação a OxPL, ligação a RANKL, ligação a PD- 1/PD-L1/PD-L2, ligação a VEGF, Fab de ligação a fD, ligação a BLyS,
ligação a CP-C5, ligação a MMPS9, ligação a pKal, ligação a TNFa, separadas por um ligante de furina (F) / F2A auto-clivável, assegurando a expressão de quantidades iguais dos polipeptídeos de cadeias pesada e leve. Uma construção exemplar é fornecida na FIG. 1.
[00817] Em modalidades específicas, são fornecidos vetores AAV compreendendo um capsídeo viral que é pelo menos 95% idêntico à sequência de aminoácido de um capsídeo de AAV8 (SEQ ID NO: 78); e um genoma artificia compreendendo um cassete de expressão flanqueado por repetições de terminal invertido de AAV (ITRs), em que O cassete de expressão compreende um transgene codificando um mAb anti-IL/ILR, anti-integrina, anticPCSK9, anti-ANGPTL3, anti-OxPL, anti- RANKL, anti-PD-1, anti-PD-LI, anti-PD-L2, anti-VEGF, anti-fD, anti- BLyS, anti-CP-C5, anti-MMP9, anti-pKal, ou anti-TNFa, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células do fígado ou musculares humanas.
[00818] Em modalidades específicas, são fornecidos vetores AAV compreendendo um capsídeo viral que é pelo menos 95% idêntico à sequência de aminoácido de um AAV9 (SEQ ID NO: 79); e um genoma artificial compreendendo um cassete de expressão flanqueado por repetições de terminal invertido de AAV (ITRs), em que o cassete de expressão compreende um transgene codificando um mAb anti-IL/ILR, anti-integrina, anti-PCSK9, antic-ANGPTL3, anti-RANKL, anti-OxPL, anti-PD-1, anti-PD-LI, anti-PD-L2, anti-VEGF, anti-fD, anti-BLyS, anti- pKal, ou anti-TNFa, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células musculares humanas.
5.4.3 Construções para liberação para Tipos de Célula Retinal
[00819] As Seções 5.3.9e 5.3.12 descrevem vetores recombinantes que contêm um transgene codificando um mAb HUPTM ou Fab HUPTM
(ou outro fragmento de ligação ao antígeno do mAb HuUPTM) que se liga a VEGF, fator D (fD), ou MMP9. Tais vetores recombinantes usados para liberação do transgene podem ter um tropismo para um ou mais tipos de célula retinal humana. Tais vetores podem incluir vetores de vírus —adenoassociado recombinante não replicante ("rAAV"), particularmente aqueles portadores de um capsídeo de AAV8 são preferidos. Alternativamente, um vetor de AAV portador de um capsídeo de AAV7m8 pode ser usado. Entretanto, outros vetores virais podem ser usados, incluindo, porém não limitados a vetores lentivirais, vetores virais de vacínia, ou vetores de expressão não virais referidos como construções de “DNA nu”.
[00820] Em modalidades específicas, são fornecidas construções para administração de terapia genética a um indivíduo humano, compreendendo um vetor AAV, que compreende um capsídeo viral que é pelo menos 95% idêntico à sequência de aminoácido de um capsídeo de AAV8 (SEQ I|D NO: 78); e um genoma viral ou artificial compreendendo um cassete de expressão flanqueado por repetições de terminal invertido de AAV (ITRs) em que o cassete de expressão compreende um transgene codificando as cadeias pesadas e leves do anticorpo terapêutico, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células humanas (por exemplo, tipos de célula da retina ou célula do fígado) que expressam e liberam o anticorpo terapêutico de uma maneira terapeuticamente — apropriada como aqui descrito. Em certas modalidades, o capsídeo de AAV8 codificado tem a sequência de SEQ ID NO: 78 com 1, 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13, 14,15, 16, 17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 substituições de aminoácido, particularmente substituições com resíduos de aminoácido encontrados na posição correspondente em outros capsídeos AAV, por exemplo, na faixa SUBS de FIG. 12 que fornece uma comparação das sequências de aminoácido das sequências de capsídeo de vários AAVs, realçando os aminoácidos apropriados para substituição em diferentes posições dentro da sequência de capsídeo.
[00821] —Preferivelmente, o mAb HuPTM ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, incluindo o transgene de Fab HuUPTM deve ser controlado por elementos de controle da expressão apropriados para expressão do Fab HuUPTM em tipos de célula da retina ou do fígado humana, por exemplo, promotor de CB7 (um promotor de B-actina de frango e realçador de CMV), ou promotores específicos de tecido tais como promotores específicos de RPE por exemplo, o promotor de RPEG65, ou promotores específicos de cone, por exemplo, o promotor de opsina, ou promotores específicos do fígado, tal como, o promotor de TBG (globina de ligação à tiroxina), o promotor de APOA?2, o promotor de SERPINA1 (hAAT) ou o promotor de MIR122, promotores induzíveis, por exemplo, promotores induzidos por hipoxia e promotores induzíveis por fármaco, tal como promotores induzidos por rapamicina e agentes relacionados, e podem incluir outros elementos de controle da expressão que realçam a expressão do transgene direcionado pelo vetor (por exemplo, íntrons tal como o íntron de B-actina de frango, vírus diminuto de íntron de camundongos (MVM), íntron de fator IX humano (por exemplo, íntron 1 truncado de FIX), íntron doador de emenda de B- globina / aceptor de emenda de cadeia pesada de imunoglobulina, íntron doador de emenda de adenovírus / aceptor de emenda de imunoglobulina, íntron doador de emenda / aceptor de emenda tardio de SV40, e íntron doador de emenda de adenovírus híbrido / aceptor de emenda de IgG e sinais poliA tal como o sinal poliA de B-globina de coelho, sinal poliA de hormônio de crescimento humano (hGH), sinal poliA tardio de SV40, sinal poliA sintético (SPA), e sinal poliA de hormônio de crescimento bovino (bGH)). Veja, por exemplo, Powell and Rivera-Soto, 2015, Discov. Med., 19(102):49-57.
[00822] Construções de terapia genética são designadas de modo que ambas as cadeias pesada e leve sejam expressas. Mais especificamente, as cadeias pesada e leve devem ser expressas em quantidades aproximadamente iguais, em outras palavras, as cadeias pesada e leve são expressas em uma relação de aproximadamente 1:1 de cadeias pesadas para cadeias leves. As sequências de codificação para as cadeias pesadas e leves podem ser construídas em uma única construção na qual as cadeias pesadas e leves são separadas por um ligante clivável ou IRES de modo que polipeptídeos de cadeias pesada e leve separados sejam expressos. A sequência líder para cada uma das cadeias pesadas e leves é preferivelmente MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161). A Seção 5.1.5, supra, fornece IRES específicos, 2A, e outras sequências ligantes que podem ser usadas com os métodos e composições, fornecidos aqui. Em modalidades específicas, o ligante é um ligande de Furina-F2A RKRRAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 242). Em modalidades específicas, o transgene é uma sequência de nucleotídeo que codifica o seguinte: Porção Fab de cadeia pesada de sequência sinal - ligante de Furina-F2A - porção Fab de cadeia leve de sequência sinal. Veja as FIGURAS 8A a 8C para sequências para expressão de Fab de Ranibizumabe, Bevacizumabe, e Lampalizumabe, respectivamente, e FIG. 8G para uma sequência para expressão de Fab de Andecaliximabe.
[00823] Em uma modalidade específica, as construções aqui descritas compreendem os seguintes componentes: (1) repetições terminais invertidas de AAV2 que flanqueiam o cassete de expressão; (2) elementos de controle, que incluem a) o promotor de CB7, compreendendo o realçador de CMV / promotor de B-actina de frango, b) um íntron de Beta-actina de frango e c) um sinal poli A de B-globina de coelho; e (3) sequências de ácido nucleico codificando para as cadeias pesadas e leves do Fab de ligação a VEGF, ligação de fD, ou ligaçãode MMP9 separadas por um ligante de furina (F) / F2A auto- clivável, assegurando a expressão de quantidades iguais dos polipeptídeos de cadeias pesada e leve. Uma construção exemplar é fornecida na FIG. 1.
[00824] Em outra modalidade, as construções aqui descritas compreendem os seguintes componentes: (1) repetições terminais invertidas de AAV2 que flanqueiam o cassete de expressão; (2) elementos de controle, que incluem a) o promotor de CB7, compreendendo o realçador de CMV / promotor de B-actina de frango, b) um íntron de B-actina de frango e c) um sinal poli A de B-globina de coelho; e (3) sequências de ácido nucleico codificando para as cadeias pesadas e leves do Fab de ligação a VEGF, ligação de fD, ou ligação de MMP9 separadas por ligante de peptídeo flexível, assegurando duplicação e solubilidade apropriadas.
[00825] Em modalidades específicas, são fornecidos vetores AAV compreendendo um capsídeo viral que é pelo menos 95% idêntico à sequência de aminoácido de um capsídeo de AAV8 (SEQ ID NO: 78); e um genoma artificia compreendendo um cassete de expressão flanqueado por repetições de terminal invertido de AAV (ITRs), em que O Cassete de expressão compreende um transgene codificando um mAb anti-VEGF, mAb anti-fD, ou anti-MMP9, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em um ou mais tipos de célula da retina (tais como células fotorreceptoras humanas (células de cone, células de bastão); células horizontais; células bipolares; células amárcrinas; células ganglionares da retina (célula anã, célula parasol, célula biestratificada, célula ganglionar da retina gigante, célula ganglionar fotossensível, e glia muller); e células epiteliais de pigmento retinal).
5.5 Administração de Dose
5.5.1 Administração para liberação para o CNS.
[00826] As Seções 5.3.1, 5.3.2, 5.3.3, e 5.3.4 descrevem vetores recombinantes que contêm um transgene codificando um mAb HUPTM ou Fab HuUPTM (ou outro fragmento de ligação ao antígeno do mAb HuPTM) que se liga a AB, proteína Tau, CGRPR, e integrina, respectivamente. Doses terapeuticamente eficazes de qualquer tal vetor recombinante devem ser administradas em qualquer maneira tal que o vetor recombinante entre no CNS, preferivelmente introduzindo o vetor recombinante no fluido espinhal cerebral (CSF). Em específico, modalidades, o vector é administrado intratecalmente, especificamente intracisternalmente (tals como para a cisterna magna) ou, alternativamente, liberação lombar. Alternativamente, o vetor recombinante pode ser administrado intravenosamente. Em particular, vetores AAV9 recombinantes foram mostrados atravessar a barreira hematoencefálica e, desse modo, podem ser úteis para liberar o produto de transgene de anticorpo anti-AB, anti-Tau, anti-cCGRPR, ou anti- integrina para o CNS. Especificamente, um scAAV9 pode ser particularmente útil para a administração intravenosa. A administração intratecal, incluindo intracisternal ou lombar, ou administração intravenosa deve resultar na expressão do produto de transgene solúvel em células do CNS. A expressão do produto de transgene (por exemplo, o anticorpo anti-AB, anti-Tau, anti-CGRPR, ou anti-integrina codificado) resulta na liberação e manutenção do produto de transgene no CNS. Por que o produto de transgene é continuamente produzido, a manutenção de concentrações menores pode ser eficaz. A concentração do produto de transgene pode ser medida em amostras de paciente do CSF.
[00827] “Composições farmacêuticas adequadas para administração intratecal, intracisternal, lombar ou intravenosa compreendem uma suspensão do vetor recombinante compreendendo o transgene codificando o anticorpo anti-AB, anti-Tau, anticCGRPR, ou anti- integrina, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em um tampão de formulação compreendendo um tampão aquoso fisiologicamente = compatível... O tampão de formulação pode compreender um ou mais de um polissacarídeo, um tensoativo, polímero, ou óleo.
5.5.2 Administração para liberação para o tecido do fígado ou músculo
[00828] As Seções 5.3.4, 5.3.5, 5.3.6, 5.3.7, 5.3.8, 5.3.9, 5.3.10,
5.3.11, 5.3.12, 5.3.13, e 5.3.14 descrevem vetores recombinantes que contêm um transgene codificando um mAb HUPTM ou Fab HuUPTM (ou outro fragmento de ligação ao antígeno do mAb HUPTM) que se liga a interleucinas (IL) ou receptores de interleucina (ILR), integrina, PCSK9, ANGPTL3, RANKL, PD-1/PD-L1/PD-L2, VEGF, fator D (fD), BLyS, CP- C5, MMP9, pKal, ou TNFa. Doses terapeuticamente eficazes de qualquer tal vetor recombinante devem ser administradas em qualquer maneira de modo que o vetor recombinante entre no fígado ou músculo (por exemplo, músculo esqueletal), preferivelmente introduzindo o vetor recombinante na corrente sanguínea. Alternativamente, o vector pode ser administrado diretamente ao fígado através do fluxo de sangue hepático, por exemplo, por meio das veias supra-hepáticas ou por meio da artéria hepática. Em modalidades específicas o vector é administrado subcutaneamente, intramuscularmente ou intravenosamente. — Administração intramuscular, subcutânea, intravenosa ou hepática deve resultar em expressão do produto de transgene solúvel em células do fígado ou músculo. Alternativamente, o vetor pode ser administrado diretamente ao fígado através do fluxo de sangue hepático, por exemplo, por meio das veias supra-hepáticas ou por meio da artéria hepática. A expressão do produto de transgene (por exemplo, um anticorpo anti-IL/ILR, anti-integrina, anti-PCSK9, anti- ANGPTL3, anti-RANKL, anti-PD-1, anti-PD-LI, anti-PD-L2, anti-VEGF, anti-fD, anti-BLyS, anti-CP-C5, anti-MMP9, anti-pKal, ou anti-TNFa codificado) resulta na liberação e manutenção do produto de transgene no fígado ou músculo.
[00829] A concentração do produto de transgene pode ser medida em amostras de soro de sangue do paciente. Em modalidades específicas, doses que mantêm uma concentração do produto de transgene de anticorpo anti-IL/ILR em uma Cmin de pelo menos 2 uvg/mL são desejadas, tal como Cmin de 5 a 30 ug/mL, 5 s 50 ug/mL, ou a 80 ug/mL, ou 5 a 100 ug/mL, ou 5 a 200 ug/mL dependendo do mAb usado. Por exemplo, para obter uma Cmin de aproximadamente 60 a 90 pyg/mL de Dupilumabe (comparável à dosagem bissemanal) ou 170 a 200 pug/ml de Dupilumabe (comparável à dosagem semanal), ou aproximadamente 2 upgml a 12 upoml de Ixequizumabe, ou aproximadamente 13 ug/mL a 50 ug/mL de Seciquinumabe.
[00830] Em modalidades específicas, doses que mantêm uma concentração do produto de transgene de anticorpo anti-TNFa em uma Cmin de pelo menos 5 ug/mL ou pelo menos 1 ug/mL (por exemplo, Cmin de 1 a 10 ug/mL, 3 a 30 ug/mL ou 5 a 15 ug/mL ou 5 a 30 ug/mL) são desejadas.
[00831] Em modalidades específicas, doses que mantêm uma concentração do produto de transgene de anticorpo anti-integrina em uma Cmin de pelo menos 10 ug/mL (por exemplo, Cmin de 10 a 60 Vg/mL) são desejadas.
[00832] Em modalidades específicas, doses que mantêm uma concentração do produto de transgene de anticorpo anti-PCSK9 ou anti- ANGPTL3 em uma Cmin de pelo menos 10 ug/mL são desejadas, tal como Cmin de 10 a 80 ua/ml.
[00833] Em modalidades específicas, doses que mantêm uma concentração do produto de transgene de anticorpo anti-RANKL em uma Cmin de pelo menos 10 pg/mL (por exemplo, Cmin de 10 a 50 ug/mL ou 15 a 30 ug/mL) são desejadas.
[00834] Em modalidades específicas, doses que mantêm uma concentração do produto de transgene do anticorpo anti-PD-1, anti-PD- L1, ou anti-PD-L2 em uma Cmin de pelo menos 10 ug/mL são desejadas, tal como Cmin de 10 a 100 ug/ml ou 100 a 300 pg/ml ou 300 a 600 po/ml são desejadas.
[00835] Em modalidades específicas, doses que mantêm uma concentração do produto de transgene do anticorpo anti-BLyS em uma Cmin de pelo menos 70 ug/mL (por exemplo, Cmin de 70 a 150 pg/ml ou 100 a 200 pug/mL ou 200 a 350 pug/mL) são desejadas.
[00836] Em modalidades específicas, doses que mantêm uma concentração do produto de transgene do anticorpo anti-pKal em uma Cmin de pelo menos 70 ug/mL (por exemplo, Cmin de 70 a 150 ug/mL ou 100 a 200 ug/mL ou 200 a 350 pug/mL) são desejadas.
[00837] A expressão do produto de transgene (por exemplo, o anticorpo anti-VEGF codificado) resulta na liberação e manutenção do produto de transgene no fígado. Em algumas modalidades, doses que mantêm uma concentração do produto de transgene de VEGF em uma Cmin de pelo menos 90 ug/mL são desejadas, tal como Cmin de 90 ug/mL a 200 pug/mLl. Em modalidades específicas, doses que mantêm uma concentração do produto de transgene do anticorpo anti-CP-C5 em uma Cmin de pelo menos 30 meg/mL, por exemplo, Cmin de 30 a 300 meg/ml ou 100 a 200 meg/mL, são desejadas.
[00838] Entretanto, em todos os casos porque o produto de transgene é continuamente produzido, manutenção de concentrações menores pode ser eficaz. Não obstante, porque o produto de transgene é continuamente produzido, manutenção de concentrações menores pode ser eficaz. A concentração do produto de transgene pode ser medida em amostras de soro de sangue do paciente.
[00839] “Composições farmacêuticas adequadas para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea ou hepática compreendem uma suspensão do vetor recombinante compreendendo o transgene codificando o anticorpo anti-IL/ILR, anti-integrina, anti-PCSK9, anti- ANGPTL3, anti-RANKL, anti-PD-1, anti-PD-L1, anti-PD-L2, anti-VEGF, anti-fD, anti-BLyS, anti-CP-C5, anti-MMP9, anti-pKal, ou anti-TNFa, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em um tampão de formulação compreendendo um tampão aquoso fisiologicamente compatível. O tampão de formulação pode compreender um ou mais de um polissacarídeo, um tensoativo, polímero, ou óleo.
5.5.3 Administração para liberação para células do tipo retinal
[00840] “Doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante devem ser administradas de qualquer maneira de modo que o vetor recombinante entre na retina, preferivelmente introduzindo o vetor recombinante diretamente no olho. Em específico, modalidades, o vector é administrado sub-retinalmente (um procedimento cirúrgico realiado por cirurgiões retinais treinados que envolve uma vitrectomia com o indivíduo sob anestesia local, e injeção da terapia genética na retina; veja, por exemplo, Campochiaro et a/., 2016, Hum Gen Ther Sep 26 epub:doi: 10.1089/hum.2016.117, que é incorporado aqui por referência em sua íntegra), ou intravitreamente, ou supracoroidalmente tal como por microinjeção ou micronanulação. (veja, por exemplo, Patel et al., 2012, Invest Ophth & Vis Sci 53:4433-4441; Patel et al., 2011, Pharm Res 28:166-176; Olsen, 2006, Am J Ophth 142:777-787 cada um dos quais é incorporado por referência em sua íntegra). Administração sub-retinal, intravítrea ou supracoroidal deve resultar em expressão do produto de transgene solúvel em um ou mais dos seguintes tipos de célula retinal: células fotorreceptoras humanas (células de cone, células de bastão); células horizontais; células bipolares; células amárcrinas;
células ganglionares da retina (célula anã, célula parasol, célula biestratificada, célula ganglionar da retina gigante, célula ganglionar fotossensível, e glia muller); e células epiteliais de pigmento retinal. A expressão do produto de transgene (por exemplo, o anticorpo anti- VEGF, antifD, anti-MMP9 codificado) resulta na liberação e manutenção do produto de transgene na retina.
[00841] —A concentração do produto de transgene pode ser medid em amostras do paciente do humor vítreo e / ou câmara anterior do olho tratado. Em modalidades específicas, doses que mantêm uma concentração do produto de transgene anti-VEGF, anti-fD em uma Cmin de pelo menos 0,33 ug/mL no humor vítreo, ou 0,11 ug/mL no humor aquoso (a câmara anterior do olho) para três meses são desejadas; a seguir, concentrações Cmin Vítreas do produto de transgene variando de 1,70 a 6,60 ug/mL, e / ou concentrações Cmin aquosas variando de 0,567 a 2,20 ug/ml devem ser mantidas. Entretanto, porque o produto de transgene é continuamente produzido, manutenção de concentrações menores pode ser eficaz. Alternativamente, concentrações de humor vítreo podem ser estimadas e / ou monitoradas medindo as concentrações séricas paciente do produto de transgene — a relação do exposição sistêmica para vítrea para o produto de transgene é de aproximadamente 1:90.000. (Por exemplo, veja, concentrações se humor vítreo e soro de reportadas em Xu L, et a/., 2013, Invest. Opthal. Vis. Sci. 54: 1616-1624, na p. 1621 e Tabela 5 na p. 1623, que é incorporado aqui por referência em sua íntegra). Entretanto, porque o produto de transgene é continuamente produzido, manutenção de concentrações menores pode ser eficaz.
[00842] “Composições farmacêuticas adequadas para administração compreendem uma suspensão do vetor recombinante compreendendo o transgene codificando o anticorpo anti-VEGF, anti-fD, ou anti-MMP9, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em um tampão de formulação compreendendo um tampão aquoso fisiologicamente compatível. O tampão de formulação pode compreender um ou mais de um polissacarídeo, um tensoativo, polímero, ou óleo.
EXEMPLOS
6.1 EXEMPLO 1: Vetor com base em cDNA de Fab de Aducanumabe
[00843] “Um vetor com base em cDNA de Fab de Aducanumabe é construída compreendendo um transgene compreendendo sequências de nucleotídeo codificando a porção de Fab das sequências de cadeias pesada e leve de Aducanumabe (sequências de aminoácido sendo SEQ ID NOs. 1 e 2, respectivamente). A sequência de nucleotídeo codificando para a porção de Fab das cadeias pesada e leve é otimizada por códon para expressão em células do CNS humano e pode ser a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOS: 101 e 102, respectivamente. O transgene também compreende sequências de nucleotídeo que codificam um peptídeo sinal, particularmente, MYRMAQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161). As sequências de nucleotídeo, codificando a cadeia leve e a cadeia pesada, são separadas por elementos de IRES ou sítios de clivagem 2A para criar um vetor bicistrônico. Veja a FIG. 2A para sequência de aminoácido de um produto de transgene. O vetor adicionalmente inclui um promotor constitutivo, tal como CB7 ou um promotor induzível, tal como um promotor induzível por hipoxia.
6.2 EXEMPLO 2: Vetor com Base em cDNA de Fab de Crenezumabe
[00844] “Um vetor com base em cDNA de Fab de Crenezumabe é construído compreendendo um transgene compreendendo sequências de nucleotídeo codificando a porção Fab das sequências de cadeias pesada e leve de Crenezumabe (sequências de aminoácido sendo SEQ ID NOs. 3 e 4, respectivamente). A sequência de nucleotídeo codificando para a porção de Fab das cadeias pesada e leve é otimizada por códon para expressão em células do CNS humano e pode ser a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOS: 103 e 104, respectivamente. O transgene também compreende sequências de nucleotídeo que codificam um peptídeo sinal, particularmente, MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161). As sequências de nucleotídeo, codificando a cadeia leve e a cadeia pesada, são separadas por elementos de IRES ou sítios de clivagem 2A para criar um vetor bicistrônico. Veja a FIG. 2B para sequência de aminoácido de um produto de transgene. O vetor adicionalmente inclui um promotor constitutivo, tal como CB7 ou um promotor induzível, tal como um promotor induzível por hipoxia.
6.3 EXEMPLO 3: Vetor com Base em cDNA de Fab de Gantenerumabe
[00845] “Um vetor com base em cDNA de Fab de Gantenerumabe é construído compreendendo um transgene compreendendo sequências de nucleotídeo codificando a porção Fab das sequências de cadeias pesada e leve de Gantenerumabe (sequências de aminoácido sendo SEQ ID NOs. 5 e 6, respectivamente). A sequência de nucleotídeo codificando para a porção de Fab das cadeias pesada e leve é otimizada por códon para expressão em células do CNS humano e pode ser a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOS: 105 e 106, respectivamente. O transgene também compreende sequências de nucleotídeo que codificam um peptídeo sinal, particularmente, MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161). As sequências de nucleotídeo, codificando a cadeia leve e a cadeia pesada, são separadas por elementos de IRES ou sítios de clivagem 2A para criar um vetor bicistrônico. Veja a FIG. 2C para sequência de aminoácido de um produto de transgene. O vetor adicionalmente inclui um promotor constitutivo, tal como CB7 ou um promotor induzível, tal como um promotor induzível por hipoxia.
6.4. EXEMPLO 4: Vetor com base em cDNA de Fab de Dupilumabe
[00846] Um vetor com base em cDNA de Dupilumabe é construído compreendendo um transgene compreendendo sequências de nucleotídeo codificando a porção Fab das sequências de cadeias pesada e leve de Dupilumabe (sequências de aminoácido sendo SEQ ID NOs. 7 e 8, respectivamente). A sequência de nucleotídeo codificando para a porção de Fab das cadeias pesada e leve é otimizada por códon para expressão em células do fígado ou musculares humanas e pode ser a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOS: 107 e 108, respectivamente. O transgene também compreende sequências de nucleotídeo que codificam um peptídeo sinal que pode ser MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161) ou é uma sequência sinal específica do fígado de Tabela 2 ou uma sequência sinal específica de músculo de Tabela 3. As sequências de nucleotídeo, codificando a cadeia leve e a cadeia pesada, são separadas por elementos de IRES ou sítios de clivagem 2A para criar um vetor bicistrônico. Veja a FIG. 3A para sequência de aminoácido de um produto de transgene. O vetor adicionalmente inclui um promotor constitutivo, tal como CB7 ou um promotor induzível, tal como um promotor induzível por hipoxia.
6.5" EXEMPLO 5: Vetor com base em cDNA de Fab de
[00847] Um vetor com base em cDNA de Fab de Ixequizumabe é construído compreendendo um transgene compreendendo sequências de nucleotídeo codificando a porção Fab das sequências de cadeias pesada e leve de Ixequizumabe (sequências de aminoácido sendo SEQ ID NOs. 9 e 10, respectivamente). A sequência de nucleotídeo codificando para a porção de Fab das cadeias pesada e leve é otimizada por códon para expressão em células musculares ou de fígado humanas e pode ser a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOS: 109 e 110, respectivamente. O transgene também compreende sequências de nucleotídeo que codificam um peptídeo sinal que pode ser MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161) ou é uma sequência sinal específica do fígado de Tabela 2 ou uma sequência sinal específica de músculo de Tabela 3. As sequências de nucleotídeo, codificando a cadeia leve e a cadeia pesada, são separadas por elementos de IRES ou sítios de clivagem 2A para criar um vetor bicistrônico. Veja a FIG. 3B para sequência de aminoácido de um produto de transgene. Opcionalmente, o vector adicionalmente compreende um promotor induzível por hipoxia.
6.6 EXEMPLO 6: Vetor com base em cDNA de Fab de Seciquinumabe
[00848] “Um vetor com base em cDNA de Fab de Seciquinumabe é construído compreendendo um transgene compreendendo sequências de nucleotídeo codificando a porção Fab das sequências de cadeias pesada e leve de Seciquinumabe (sequências de aminoácido sendo SEQ ID NOs. 11 e 12, respectivamente). A sequência de nucleotídeo codificando para a porção de Fab das cadeias pesada e leve é otimizada por códon para expressão em células do fígado ou musculares humanas e pode ser a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOS: 111 e 112, respectivamente. O transgene também compreende sequências de nucleotídeo que codificam um peptídeo sinal selecionado do grupo listado na Tabela 2 ou 3, respectivamente. As sequências de nucleotídeo, codificando a cadeia leve e a cadeia pesada, são separadas por elementos de IRES ou sítios de clivagem 2A para criar um vetor bicistrônico. O transgene também compreende sequências de nucleotídeo que codificam um peptídeo sinal que pode ser MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161) ou é uma sequência sinal específica do fígado de Tabela 2 ou uma sequência sinal específica de músculo de Tabela 3. As sequências de nucleotídeo,
codificando a cadeia leve e a cadeia pesada, são separadas por elementos de IRES ou sítios de clivagem 2A para criar um vetor bicistrônico. Veja a FIG. 3C para sequência de aminoácido de um produto de transgene. O vetor adicionalmente inclui um promotor constitutivo, tal como CB7 ou um promotor induzível, tal como um promotor induzível por hipoxia.
6.7 EXEMPLO 7: Vetor com base em cDNA de Fab de Ustequinumabe
[00849] Um vetorcom base em cDNA de Fab de Ustequinumabe é construído compreendendo um transgene compreendendo sequências de nucleotídeo codificando a porção Fab das sequências de cadeias pesada e leve de Ustequinumabe (sequências de aminoácido sendo SEQ ID NOs. 13 e 14, respectivamente). A sequência de nucleotídeo codificando para a porção de Fab das cadeias pesada e leve é otimizada por códon para expressão em células do fígado ou musculares humanas e pode ser as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NOS: 113 e 114, respectivamente. O transgene também compreende sequências de nucleotídeo que codificam um peptídeo sinal que pode ser MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161) ou é uma sequência sinal específica do fígado de Tabela 2 ou uma sequência sinal específica de músculo de Tabela 3. As sequências de nucleotídeo, codificando a cadeia leve e a cadeia pesada, são separadas por elementos de IRES ou sítios de clivagem 2A para criar um vetor bicistrônico. Veja a FIG. 3D para sequência de aminoácido de um produto de transgene. O vetor adicionalmente inclui um promotor constitutivo, tal como CB7 ou um promotor induzível, tal como um promotor induzível por hipoxia.
6.8 EXEMPLO 8: Vetor com base em cDNA de Fab de Mepolizumabe
[00850] Um vetor com base em cDNA de Fab de Mepolizumabe é construído compreendendo um transgene compreendendo sequências de nucleotídeo codificando a porção Fab das sequências de cadeias pesada e leve de Mepolizumabe (sequências de aminoácido sendo SEQ ID NOs. 15 e 16, respectivamente). A sequência de nucleotídeo codificando para a porção de Fab das cadeias pesada e leve é otimizada por códon para expressão em células musculares ou de fígado humanas e pode ser a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOS: 115 e 116, respectivamente. O transgene também compreende sequências de nucleotídeo que codificam um peptídeo sinal que pode ser MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161) ou é uma sequência sinal específica do fígado de Tabela 2 ou uma sequência sinal específica de músculo de Tabela 3. As sequências de nucleotídeo, codificando a cadeia leve e a cadeia pesada, são separadas por elementos de IRES ou sítios de clivagem 2A para criar um vetor bicistrônico. Veja a FIG. 3E para sequência de aminoácido de um produto de transgene. O vetor adicionalmente inclui um promotor constitutivo, tal como CB7 ou um promotor induzível, tal como um promotor induzível por hipoxia.
6.9 EXEMPLO 9: Vetor com base em cDNA de Fab de Vedolizumage
[00851] “Um vetor com base em cDNA de Fab de Vedolizumabe é construído compreendendo um transgene compreendendo sequências de nucleotídeo codificando a porção Fab das sequências de cadeias pesada e leve de Vedolizumabe (sequências de aminoácido sendo SEQ ID NOs. 17 e 18, respectivamente). A sequência de nucleotídeo codificando para a porção de Fab das cadeias pesada e leve é otimizada por códon para expressão em células do fígado ou musculares humanas e pode ser a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOS: 117 e 118, respectivamente. O transgene também compreende sequências de nucleotídeo que codificam um peptídeo sinal que pode ser
MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161) ou é uma sequência sinal específica do fígado de Tabela 2 ou uma sequência sinal específica de músculo de Tabela 3. As sequências de nucleotídeo, codificando a cadeia leve e a cadeia pesada, são separadas por elementos de IRES ou sítios de clivagem 2A para criar um vetor bicistrônico. Veja a FIG. 4A para sequência de aminoácido de um produto de transgene. O vetor adicionalmente inclui um promotor constitutivo, tal como CB7 ou um promotor induzível, tal como um promotor induzível por hipoxia.
6.100 EXEMPLO 10: Vetor com base em cDNA de Fab de Natalizumabe
[00852] Um vetor com base em cDNA de Fab de Natalizumabe é construído compreendendo um transgene compreendendo sequências de nucleotídeo codificando a porção Fab das sequências de cadeias pesada e leve de Natalizumabe (sequências de aminoácido sendo SEQ ID NOs. 19 and 20, respectivamente). A sequência de nucleotídeo codificando para a porção de Fab das cadeias pesada e leve é otimizada por códon para expressão em células do fígado ou musculares humanas e pode ser a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOS: 119 e 120, respectivamente. O transgene também compreende sequências de nucleotídeo que codificam um peptídeo sinal que pode ser MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161) ou é uma sequência sinal específica do fígado de Tabela 2 ou uma sequência sinal específica de músculo de Tabela 3. As sequências de nucleotídeo, codificando a cadeia leve e a cadeia pesada, são separadas por elementos de IRES ou sítios de clivagem 2A para criar um vetor bicistrônico. Veja a FIG. 4B para sequência de aminoácido de um produto de transgene. O vetor adicionalmente inclui um promotor constitutivo, tal como CB7 ou um promotor induzível, tal como um promotor induzível por hipoxia.
6.11 EXEMPLO 11: Vetor com base em cDNA de Fab de Alirocumabe
[00853] Um vetor com base em cDNA de Fab de Alirocumabe é construído compreendendo um transgene compreendendo sequências de nucleotídeo codificando a porção Fab das sequências de cadeias pesada e leve de Alirocumabe (sequências de aminoácido sendo SEQ ID NOs. 21 and 22, respectivamente). A sequência de nucleotídeo codificando para a porção de Fab das cadeias pesada e leve é otimizada por códon para expressão em células do fígado ou musculares humanas e pode ser a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOS: 121 e 122, respectivamente. O transgene também compreende sequências de nucleotídeo que codificam um peptídeo sinal que pode ser MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161) ou é uma sequência sinal específica do fígado de Tabela 2 ou uma sequência sinal específica de músculo de Tabela 3. As sequências de nucleotídeo, codificando a cadeia leve e a cadeia pesada, são separadas por elementos de IRES ou sítios de clivagem 2A para criar um vetor bicistrônico. Veja a FIG. 5A para sequência de aminoácido de um produto de transgene. O vetor adicionalmente inclui um promotor constitutivo, tal como CB7 ou um promotor induzível, tal como um promotor induzível por hipoxia.
6.12. EXEMPLO 12: Vetor com Base em cDNA de Fab de Evolocumabe
[00854] “Um vetor com base em cDNA de Fab de Evolocumabe é construído compreendendo um transgene compreendendo sequências de nucleotídeo codificando a porção Fab das sequências de cadeias pesada e leve de Evolocumabe (sequências de aminoácido sendo SEQ ID NOs. 23 e 24, respectivamente). A sequência de nucleotídeo codificando para a porção de Fab das cadeias pesada e leve é otimizada por códon para expressão em células do fígado ou musculares humanas e pode ser a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOS: 123 e 124, respectivamente. O transgene também compreende sequências de nucleotídeo que codificam um peptídeo sinal que pode ser MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161) ou é uma sequência sinal específica do fígado de Tabela 2 ou uma sequência sinal específica de músculo de Tabela 3. As sequências de nucleotídeo, codificando a cadeia leve e a cadeia pesada, são separadas por elementos de IRES ou sítios de clivagem 2A para criar um vetor bicistrônico. Veja a FIG. 5B para sequência de aminoácido de um produto de transgene. O vetor adicionalmente inclui um promotor constitutivo, tal como CB7 ou um promotor induzível, tal como um promotor induzível por hipoxia.
6.13 EXEMPLO 13: Vetor com base em cDNA de Evinacumabe
[00855] “Um vetor com base em cDNA de Fab de Evinacumabe é construído compreendendo um transgene compreendendo sequências de nucleotídeo codificando a porção Fab das sequências de cadeias pesada e leve de Evinacumabe (sequências de aminoácido sendo SEQ ID NOs. 25 e 26, respectivamente). A sequência de nucleotídeo codificando para a porção de Fab das cadeias pesada e leve é otimizada por códon para expressão em células do fígado ou musculares humanas e pode ser a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOS: 125 e 126, respectivamente. O transgene também compreende sequências de nucleotídeo que codificam um peptídeo sinal que pode ser MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161) ou é uma sequência sinal específica do fígado de Tabela 2 ou uma sequência sinal específica de músculo de Tabela 3. As sequências de nucleotídeo, codificando a cadeia leve e a cadeia pesada, são separadas por elementos de IRES ou sítios de clivagem 2A para criar um vetor bicistrônico. Veja a FIG. 5C para sequência de aminoácido de um produto de transgene. O vetor adicionalmente inclui um promotor constitutivo, tal como CB7 ou um promotor induzível, tal como um promotor induzível por hipoxia.
6.14º EXEMPLO 14: Vetor com Base em cDNA de Fab de Denosumabe
[00856] Um vetor com base em cDNAS de A Denosumabe é construído compreendendo um transgene compreendendo sequências de nucleotídeo codificando a porção Fab das sequências de cadeias pesada e leve de Denosumabe (sequências de aminoácido sendo SEQ ID NOs. 27 e 28, respectivamente). A sequência de nucleotídeo codificando para a porção de Fab das cadeias pesada e leve é otimizada por códon para expressão em células do fígado ou musculares humanas e pode ser a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOS: 127 e 128, respectivamente. O transgene também compreende sequências de nucleotídeo que codificam um peptídeo sinal que pode ser MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161) ou é uma sequência sinal específica do fígado de Tabela 2 ou uma sequência sinal específica de músculo de Tabela 3. As sequências de nucleotídeo, codificando a cadeia leve e a cadeia pesada, são separadas por elementos de IRES ou sítios de clivagem 2A para criar um vetor bicistrônico. Veja a FIG. 6 para sequência de aminoácido de um produto de transgene. O vetor adicionalmente inclui um promotor constitutivo, tal como CB7 ou um promotor induzível, tal como um promotor induzível por hipoxia.
6.155 EXEMPLO 15: Vetor com Base em cDNA de Fab de Nivolumabe
[00857] Um vetor com base em cDNA de Fab de Nivolumabe é construído compreendendo um transgene compreendendo sequências de nucleotídeo codificando a porção Fab das sequências de cadeias pesada e leve de Nivolumabe (sequências de aminoácido sendo SEQ ID NOs. 29 e 30 respectivamente). A sequência de nucleotídeo codificando para a porção de Fab das cadeias pesada e leve é otimizada por códon para expressão em células do fígado ou musculares humanas e pode ser a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOS: 129 e 130, respectivamente. O transgene também compreende sequências de nucleotídeo que codificam um peptídeo sinal que pode ser MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161) ou é uma sequência sinal específica do fígado de Tabela 2 ou uma sequência sinal específica de músculo de Tabela 3. As sequências de nucleotídeo, codificando a cadeia leve e a cadeia pesada, são separadas por elementos de IRES ou sítios de clivagem 2A para criar um vetor bicistrônico. Veja a FIG. 7A para sequência de aminoácido de um produto de transgene. O vetor adicionalmente inclui um promotor constitutivo, tal como CB7 ou um promotor induzível, tal como um promotor induzível por hipoxia.
6.16 EXEMPLO 16: Vetor com Base em cDNA de Fab de Pembrolizumabe
[00858] Um vetorcom base em cDNA de Fab de Pembrolizumabe é construído compreendendo um transgene compreendendo sequências de nucleotídeo codificando a porção Fab das sequências de cadeias pesada e leve de Pembrolizumabe (sequências de aminoácido sendo SEQ ID NOs. 31 e 32, respectivamente). A sequência de nucleotídeo codificando para a porção de Fab das cadeias pesada e leve é otimizada por códon para expressão em células do fígado ou musculares humanas e pode ser a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOS: 131 e 132, respectivamente. O transgene também compreende sequências de nucleotídeo que codificam um peptídeo sinal que pode ser MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161) ou é uma sequência sinal específica do fígado de Tabela 2 ou uma sequência sinal específica de músculo de Tabela 3. As sequências de nucleotídeo, codificando a cadeia leve e a cadeia pesada, são separadas por elementos de IRES ou sítios de clivagem 2A para criar um vetor bicistrônico. Veja a FIG. 7B para sequência de aminoácido de um produto de transgene. O vetor adicionalmente inclui um promotor constitutivo, tal como CB7 ou um promotor induzível, tal como um promotor induzível por hipoxia.
6.17º EXEMPLO 17: Vetor com Base em cDNA de Fab de Ranibizumabe
[00859] Um vetor com base em cDNA de Fab de Ranibizumabe é construído compreendendo um transgene compreendendo sequências de nucleotídeo codificando a porção Fab das sequências de cadeias pesada e leve de Ranibizumabe (sequências de aminoácido sendo SEQ ID NOs. 33 e 34, respectivamente). A sequência de nucleotídeo codificando para a porção de Fab das cadeias pesada e leve é otimizada por códon para expressão em células retinais ou do fígado humanas e pode ser a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOS: 133 e 134, respectivamente. O transgene também compreende sequências de nucleotídeo que codificam um peptídeo sinal que pode ser MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161) ou é uma sequência sinal específica da retina de Tabela 1 ou uma sequência sinal específica do fígado de Tabela 3. As sequências de nucleotídeo, codificando a cadeia leve e a cadeia pesada, são separadas por elementos de IRES ou sítios de clivagem 2A para criar um vetor bicistrônico. Veja a FIG. 8A para sequência de aminoácido de um produto de transgene. O vetor adicionalmente inclui um promotor constitutivo, tal como CB7 ou um promotor induzível, tal como um promotor induzível por hipoxia.
6.18 EXEMPLO 18: Vetor com Base em cDNA de Fab de Bevacizumabe
[00860] Um vetor com base em cDNA de Fab de Bevacizumabe é construído compreendendo um transgene compreendendo sequências de nucleotídeo codificando a porção Fab das sequências de cadeias pesada e leve de Bevacizumabe (sequências de aminoácido sendo SEQ ID NOs. 35 e 36, respectivamente). A sequência de nucleotídeo codificando para a porção de Fab das cadeias pesada e leve é otimizada por códon para expressão em células retinais ou do fígado humanas e pode ser a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOS: 135 e 136, respectivamente. O transgene também compreende sequências de nucleotídeo que codificam um peptídeo sinal que pode ser MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161) ou é uma sequência sinal específica da retina de Tabela 1 ou uma sequência sinal específica do fígado de Tabela 3. As sequências de nucleotídeo, codificando a cadeia leve e a cadeia pesada, são separadas por elementos de IRES ou sítios de clivagem 2A para criar um vetor bicistrônico. Veja a FIG. 8B para sequência de aminoácido de um produto de transgene. O vetor adicionalmente inclui um promotor constitutivo, tal como CB7 ou um promotor induzível, tal como um promotor induzível por hipoxia.
6.19 EXEMPLO 19: Vetor com Base em cDNA de Fab de Lampalizumabe
[00861] “Um vetor com base em cDNA de Fab de Lampalizumabe é construído compreendendo um transgene compreendendo sequências de nucleotídeo codificando a porção Fab das sequências de cadeias pesada e leve de Lampalizumabe (sequências de aminoácido sendo SEQ ID NOs. 37 e 38, respectivamente). A sequência de nucleotídeo codificando para a porção de Fab das cadeias pesada e leve é otimizada por códon para expressão em células retinais humanas e pode ser a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOS: 137 e 138, respectivamente. O transgene também compreende sequências de nucleotídeo que codificam um peptídeo sinal que pode ser MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161) ou é uma sequência sinal específica da retina de Tabela 1. As sequências de nucleotídeo, codificando a cadeia leve e a cadeia pesada, são separadas por elementos de IRES ou sítios de clivagem 2A para criar um vetor bicistrônico. Veja a FIG. 8C para sequência de aminoácido de um produto de transgene. O vetor adicionalmente inclui um promotor constitutivo, tal como CB7 ou um promotor induzível, tal como um promotor induzível por hipoxia.
6.200 EXEMPLO 20: Vetor com Base em cDNA de scFv de Brolucizumabe
[00862] Um vetor com base em cDNA de scFv de Brolucizumabe é construído compreendendo um transgene compreendendo sequências de nucleotídeo codificando o domínio variável das sequências de cadeias pesada e leve de Brolucizumabe (sequências de aminoácido sendo SEQ ID NOs. 39 e 40, respectivamente). A sequência de nucleotídeo codificando para os domínios variáveis das cadeias pesada e leve é otimizada por códon para expressão em células retinais ou do fígado humanas e pode ser a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOS: 139 e 140, respectivamente. O transgene também compreende sequências de nucleotídeo que codificam um peptídeo sinal que pode ser MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161) ou é uma sequência sinal específica da retina de Tabela 1 ou uma sequência sinal específica do fígado de Tabela 3. As sequências de nucleotídeo codificando a cadeia leve e a cadeia pesada são separadas por um ligande de peptídeo flexível. Veja a FIG. 8D para sequência de aminoácido de um produto de transgene. O vetor adicionalmente inclui um promotor constitutivo, tal como CB7 ou um promotor induzível, tal como um promotor induzível por hipoxia.
6.21 EXEMPLO 21: Vetor com Base em cDNA de Fab de Belimumabe
[00863] Um vetor com base em cDNA de Fab de Belimumabe é construído compreendendo um transgene compreendendo sequências de nucleotídeo codificando a porção Fab das sequências de cadeias pesada e leve de Belimumabe (sequências de aminoácido sendo SEQ
ID NOs. 41 e 42, respectivamente). A sequência de nucleotídeo codificando para a porção de Fab das cadeias pesada e leve é otimizada por códon para expressão em células de fígado humano e pode ser a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOS: 141 e 142, respectivamente. O transgene também compreende sequências de nucleotídeo que codificam um peptídeo sinal que pode ser MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161) ou é uma sequência sinal específica do fígado de Tabela 3. As sequências de nucleotídeo, codificando a cadeia leve e a cadeia pesada, são separadas por elementos de IRES ou sítios de clivagem 2A para criar um vetor bicistrônico. Veja a FIG. 8E para sequência de aminoácido de um produto de transgene. O vetor adicionalmente inclui um promotor constitutivo, tal como CB7 ou um promotor induzível, tal como um promotor induzível por hipoxia.
6.22 EXEMPLO 22: Vetor com Base em cDNA de Fab de Eculizumabe
[00864] Um vetor com base em cDNA de Fab de Eculizumabe é construído compreendendo um transgene compreendendo sequências de nucleotídeo codificando a porção Fab das sequências de cadeias pesada e leve de Eculizumabe (sequências de aminoácido sendo SEQ ID NOs. 43 e 44, respectivamente). A sequência de nucleotídeo codificando para a porção de Fab das cadeias pesada e leve é otimizada por códon para expressão em células de fígado humano e pode ser a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOS: 143 e 144, respectivamente. O transgene também compreende sequências de nucleotídeo que codificam um peptídeo sinal que pode ser MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161) ou é uma sequência sinal específica do fígado de Tabela 3. As sequências de nucleotídeo, codificando a cadeia leve e a cadeia pesada, são separadas por elementos de IRES ou sítios de clivagem 2A para criar um vetor bicistrônico. Veja a FIG. 8F para sequência de aminoácido de um produto de transgene. O vetor adicionalmente inclui um promotor constitutivo, tal como promotor CB7.
6.23 EXEMPLO 23: Vetor com Base em cDNA de Fab de Andecaliximabe
[00865] “Um vetor com base em cDNA de Fab de Andecaliximabe é construído compreendendo um transgene compreendendo sequências de nucleotídeo codificando a porção Fab das sequências de cadeias pesada e leve de Andecaliximabe (sequências de aminoácido sendo SEQ ID NOs. 45 e 46, respectivamente). A sequência de nucleotídeo codificando para a porção de Fab das cadeias pesada e leve é otimizada por códon para expressão em células de fígado humano e pode ser a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOS: 145 e 146, respectivamente. O transgene também compreende sequências de nucleotídeo que codificam um peptídeo sinal que pode ser MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161) ou é uma sequência sinal específica do fígado de Tabela 3. As sequências de nucleotídeo, codificando a cadeia leve e a cadeia pesada, são separadas por elementos de IRES ou sítios de clivagem 2A para criar um vetor bicistrônico. Veja a FIG. 8G para sequência de aminoácido de um produto de transgene. O vetor adicionalmente inclui um promotor constitutivo, tal como CB7 ou um promotor induzível, tal como um promotor induzível por hipoxia.
6.24 EXEMPLO 24: Vetor com Base em cDNA de Fab de Lanadelumabe
[00866] Um vetor com base em cDNA de Fab de Lanadelumabe é construído compreendendo um transgene compreendendo sequências de nucleotídeo codificando a porção Fab das sequências de cadeias pesada e leve de Lanadelumabe (sequências de aminoácido sendo SEQ ID NOs. 47 e 48, respectivamente). A sequência de nucleotídeo codificando para a porção de Fab das cadeias pesada e leve é otimizada por códon para expressão em células de fígado humano e pode ser a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOS: 147 e 148, respectivamente.
O transgene também compreende sequências de nucleotídeo que codificam um peptídeo sinal que pode ser MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161) ou é uma sequência sinal específica do fígado de Tabela 3. As sequências de nucleotídeo, codificando a cadeia leve e a cadeia pesada, são separadas por elementos de IRES ou sítios de clivagem 2A para criar um vetor bicistrônico. Veja a FIG. 8H para sequência de aminoácido de um produto de transgene. O vetor adicionalmente inclui um promotor constitutivo, tal como CB7 ou um promotor induzível, tal como um promotor induzível por hipoxia.
6.255 EXEMPLO 25: Vetor com Base em cDNA de Fab de Adalimumabe
[00867] Um vetor com base em cDNA de Fab de Adalimumabe é construído compreendendo um transgene compreendendo sequências de nucleotídeo codificando a porção Fab das sequências de cadeias pesada e leve de Adalimumabe (sequências de aminoácido sendo SEQ ID NOs. 49 e 50, respectivamente). A sequência de nucleotídeo codificando para a porção de Fab das cadeias pesada e leve é otimizada por códon para expressão em células do fígado ou musculares humanas e pode ser a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOS: 149 e 150, respectivamente. O transgene também compreende sequências de nucleotídeo que codificam um peptídeo sinal que pode ser MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161) ou é uma sequência sinal específica do fígado ou músculo de Tabela 2 ou 3. As sequências de nucleotídeo, codificando a cadeia leve e a cadeia pesada, são separadas por elementos de IRES ou sítios de clivagem 2A para criar um vetor bicistrônico. Veja a FIG. 9A para sequência de aminoácido de transgene product. O vetor adicionalmente inclui um promotor induzível, tal como um promotor induzível por hipoxia.
6.26 EXEMPLO 26: Vetor com Base em cDNA de Fab de Infliximabe
[00868] Um vetor com base em cDNA de Fab de Infliiimabe é construído compreendendo um transgene compreendendo sequências de nucleotídeo codificando a porção Fab das sequências de cadeias pesada e leve de Inflióimabe (sequências de aminoácido sendo SEQ ID NOs. 51 e 52, respectivamente). A sequência de nucleotídeo codificando para a porção de Fab das cadeias pesada e leve é otimizada por códon para expressão em células de fígado humano e pode ser a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOS: 151 e 152, respectivamente. O transgene também compreende sequências de nucleotídeo que codificam um peptídeo sinal que pode ser MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161) ou é uma sequência sinal específica do fígado de Tabela 3. As sequências de nucleotídeo, codificando a cadeia leve e a cadeia pesada, são separadas por elementos de IRES ou sítios de clivagem 2A para criar um vetor bicistrônico. Veja a FIG. 9B para sequência de aminoácido de um produto de transgene. O vetor adicionalmente inclui um promotor constitutivo, tal como promotor CB7.
6.27” EXEMPLO 27: Vetor com base em cDNA de Fab de aTAU
[00869] “Um vetorcom base em cDNA de Fab de aTAU é construído compreendendo um transgene compreendendo sequências de nucleotídeo codificando a porção Fab das sequências de cadeias pesada e leve de aTAU (sequências de aminoácido sendo SEQ ID NOs. 53 e 54, respectivamente). A sequência de nucleotídeo codificando para a porção de Fab das cadeias pesada e leve é otimizada por códon para expressão em células do CNS humano e pode ser a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOS: 153 e 154, respectivamente. O transgene também compreende sequências de nucleotídeo que codificam um peptídeo sinal, particularmente, MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161). As sequências de nucleotídeo, codificando a cadeia leve e a cadeia pesada, são separadas por elementos de IRES ou sítios de clivagem 2A para criar um vetor bicistrônico. Veja a FIG. 2D para sequência de aminoácido de um produto de transgene. O vetor adicionalmente inclui um promotor constitutivo, tal como CB7 ou um promotor induzível, tal como um promotor induzível por hipoxia.
6.28 EXEMPLO 28: Vetor com Base em cDNA de Fab de Erenumabe
[00870] Um vetor com base em cDNA de Fab de Erenumabe é construído compreendendo um transgene compreendendo sequências de nucleotídeo codificando a porção Fab das sequências de cadeias pesada e leve de Erenumabe (sequências de aminoácido sendo SEQ ID NOs. 55 e 56, respectivamente). A sequência de nucleotídeo codificando para a porção de Fab das cadeias pesada e leve é otimizada por códon para expressão em células do CNS humano e pode ser a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOS: 155 e 156, respectivamente. O transgene também compreende sequências de nucleotídeo que codificam um peptídeo sinal, particularmente, MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161). As sequências de nucleotídeo, codificando a cadeia leve e a cadeia pesada, são separadas por elementos de IRES ou sítios de clivagem 2A para criar um vetor bicistrônico. Veja a FIG. 2E para sequência de aminoácido de um produto de transgene. O vetor adicionalmente inclui um promotor constitutivo, tal como CB7 ou um promotor induzível, tal como um promotor induzível por hipoxia.
6.29 EXEMPLO 29: Vetor com Base em cDNA de Fab de BAN2401
[00871] Um vetor com basse em cDNA de Fab de BAN2401 é construído compreendendo um transgene compreendendo sequências de nucleotídeo codificando a porção Fab das sequências de cadeias pesada e leve de BAN2401 (sequências de aminoácido sendo SEQ ID NOs. 57 e 58, respectivamente). A sequência de nucleotídeo codificando para a porção de Fab das cadeias pesada e leve é otimizada por códon para expressão em células do CNS humano e pode ser a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOS: 157 e 158, respectivamente. O transgene também compreende sequências de nucleotídeo que codificam um peptídeo sinal, particularmente, MYRMOQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161). As sequências de nucleotídeo, codificando a cadeia leve e a cadeia pesada, são separadas por elementos de IRES ou sítios de clivagem 2A para criar um vetor bicistrônico. Veja a FIG. 2F para sequência de aminoácido de um produto de transgene. O vetor adicionalmente inclui um promotor constitutivo, tal como CB7 ou um promotor induzível, tal como um promotor induzível por hipoxia.
6.30 EXEMPLO 30: Vetor com Base em cDNA de Fab de E06-scFv
[00872] Um vetor com base em cDNA de Fab de EO6-scFv é construído compreendendo um transgene compreendendo sequências de nucleotídeo codificando as sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve de E06-scFv (sequências de aminoácido sendo SEQ ID NOs. 59 e 60, respectivamente). A sequência de nucleotídeo codificando para os domínios variáveis de cadeias pesada e leve é otimizada por códon para expressão em células do fígado ou musculares humanas e pode ser a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOS: 159 e 160, respectivamente. O transgene também compreende sequências de nucleotídeo que codificam um peptídeo sinal que pode ser MYRMQLLLLIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 161) ou é uma sequência sinal específica do fígado de Tabela 2 ou uma sequência sinal específica de músculo de Tabela 3. As sequências de nucleotídeo codificando a cadeia leve e a cadeia pesada são separadas por um ligande de peptídeo flexível. Veja a FIG. 5D para sequência de aminoácido de um produto de transgene. O vetor adicionalmente inclui um promotor constitutivo, tal como CB7 ou um promotor induzível, tal como um promotor induzível por hipoxia.
TABELA 4. Tabela de Sequências de Aminoácido de Fragmento de
Fab. mMAb Cadeia / [Sequência Ea NO. 'Aducanumabe Pesada / | XVQLVESGGG WQPGRSLRL SCAASGFAFS SEQ ID |SYGMHWVRQA PGKGLEWVAV INFDGTKKYY NO:| TDSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNTLRAED
TAVYYCARDR GIGARRGPYY MDVWGKGTTV TVSSASTKGP SVFPLAPSSK STSGGTAALG CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV LOSSGLYSLS
SWTVPSSSL GTQOTYICNVN HKPSNTKVDK RVEPKSCD +/- KTHT (ou KTHL) +/- CPPCPA +/-
PELLGGPSVFL 'Aducanumabe Leve/ |DIQMTOSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSIS SEQID |SYLNWYQQKP GKAPKLLIYA ASSLOSGVPS NO: 2 RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCAQ
SYSTPLTFGG GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SWCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHOQG LSSPVTKSFN
RGEC Crenezumabe Pesada/ |EVOQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SEQ ID |SYGMSWVRQA PGKGLELVAS INSNGGSTYY NO: 3 PDSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED
TAVYYCASGD YWGQGTTVTV SSASTKGPSV FPLAPCSRST SESTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLOQ SSGLYSLSSV
VTVPSSSLGT KTYTCNVDHK PSNTKVDKRV ESKY +/- GPPCPPCPA +/-PEFLGGPSVFL
Crenezumabe Leve/ |DIVMTOSPLS LPVTPGEPAS ISCRSSOSLV SEQ ID |[YSNGDTYLHW YLOKPGQSPQ LLIYKVSNRF NO: 4 SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV
YYCSQSTHVP WTFGQGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASWCL LNNFYPREAK VOWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV
TKSFNRGEC Gantenerumabe |Pesada/ |QVELVESGGG LVOPGGSLRL SCAASGFTFS SEQ ID |SYAMSWVRQA PGKGLEWVSA INASGTRTYY NO: 5º J|ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED
TAVYYCARGK GNTHKPYGYV RYFDVWGQOGT LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKSTSGGTAA LGCLVKDYFP EPVTVSWNSG ALTSGVHTFP
AVLOSSGLYS LSSWTVPSS SLGTQTYICN VNHKPSNTKV DKKVEPKSCD +/- KTHT (ou KTHL) +/- CPPCPA +/- PELLGGPSVFL Gantenerumabe jLeve/ |DIVLTOSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SEQ ID |[SSYLAWYQQK PGQAPRLLIY GASSRATGVP NO:6 JARFSGSGSGT DFTLTISSLE PEDFATYYCL
QIYNMPITFG QGTKVEIKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT ASWCLLNNF YPREAKVQOWK VDNALQOSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL TLSKADYEKH KVYACEVTHO GLSSPVTKSF
NRGEC Dupilumabe Pesada/ |EVQLVESGGG LEQPGGSLRL SCAGSGFTFR SEQ ID |DYAMTWVRQA PGKGLEWVSS ISGSGGNTYY NO: 7 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LOQOMNSLRAED
TAVYYCAKDR LSITIRPRYY GLDVWGQGTT VTVSSASTKG PSVFPLAPCS RSTSESTAAL
Dupilumabe Leve/ |IDIVMTOSPLS LPVTPGEPAS ISCRSSOSLL SEQID |YSIGYNYLDW YLOKSGQOSPQ LLIYVLGSNRA NO:8 ISGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGF
YYCMQALQTP YTFGOGTKLE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASWCL LNNFYPREAK VOWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHOGLSSPV
TKSFNRGEC Ixequizumabe Pesada/ |QVQLVOSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYSFT SEQID |DYHIHWVRQA PGAQGLEWMGV INPMYGTTDY NO: 9º INORFKGRVTI TADESTSTAY MELSSLRSED
TAVYYCARYD YFTGTGVYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APCSRSTSES TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLOSSG
LYSLSSWTV PSSSLGTKTY TCNVDHKPSN TKVDKRVESK Y +/- GPPCPPCPA +/-
PEFLGGPSVFL Ixequizumabe Leve/ |DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCRSSRSLV SEQID |HSRGNTYLHW YLOKPGOSPQ LLIYKVSNRF NO:10 lIGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV
YYCSQSTHLP FTFGQGTKLE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASWCL LNNFYPREAK VOWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHOGLSSPV
TKSFNRGEC Seciquinumabe — |Pesada/ IEVOQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SEQID |NYWMNWVRQA PGKGLEWVAA INQDGSEKYY NO: 11º |IVGSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRVED
TAVYYCVRDY YDILTDYYIH YWYFDLWGRG TLVTVSSAST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF
PAVLOSSGLY SLSSWTVPS SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKRVEPKSC D +/- KTHT (ou KTHL) +/- CPPCPA +/- PELLGGPSVFL
Seciquinumabe —|Leve/ |[EIVLTOSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SEQID |SSYLAWYQQK PGQAPRLLIY GASSRATGIP NO: 12º /IDRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ
QYGSSPCTFG QGTRLEIKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT ASWCLLNNF YPREAKVQOWK VDNALQOSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL TLSKADYEKH KVYACEVTHOQ GLSSPVTKSF
NRGEC Ustequinumabe |Pesada/ |EVQLVOSGAE VKKPGESLKI SCKGSGYSFT SEQID |TYWLGWVROM PGKGLDWIGI MSPVDSDIRY NO: 13º |[SPSFOGQVTM SVDKSITTAY LOWNSLKASD
TAMYYCARRR PGQGYFDFWG QGTLVTVSSS STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLOSSG
LYSLSSWTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCD +/- KTHT (ou KTHL)+/- CPPCPA +/-PELLGGPSVFL Ustequinumabe |Leve/ |DIQMTQOSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS SEQID |SWLAWYQQKP EKAPKSLIYA ASSLOSGVPS NO: 14º IRFSGSGSGTD FTLTISSLOQP EDFATYYCQQ
YNIYPYTFGOQ GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SWCLLNNFY PREAKVOQWKV DNALQOSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHOG
O ESSPVTKSEN RGEC Mepolizumabe Pesada/ |QVTLRESGPA LVKPTQTLTL TCTVSGFSLT SEQ ID |SYSVHWVRQP PGKGLEWLGV WASGGTDYN NO: 15. |SALMSRLSIS KDTSRNQWL TMTNMDPVDT
ATYYCARDPP SSLLRLDYWG RGTPVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD
Mepolizumabe Leve/ |DIVMTOSPDS LAVSLGERAT INCKSSOSLL
SEQ ID INSGNQKNYLA WXQQKPGQPP KLLIYGASTR NO: 16, JESGVPDRFSG SGSGTDFTLT ISSLOAEDVA
VYYCQNVHSF PFTFGGGTKL EIKRTVAAPS VFIFPPSDEQ LKSGTASWC LLNNFYPREA KVOWKVDNAL OSGNSQESVT EQDSKDSTYS LSSTLTLSKA DYEKHKVYAC EVTHQGLSSP
VTKSFNRGEC Vedolizumabe Pesada/ |QVOLVOSGAE VKKPGASVKV SCKGSGYTFT SEQ ID |SYWMHWVRQA PGORLEWIGE IDPSESNTNY NO: 17º |[NOKFKGRVTL TVDISASTAY MELSSLRSED
TAVYYCARGG YDGWDYAIDY WGQGTLVTVS SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLOS
SGLYSLSSW TVPSSSLGTQ TYICNVNHKP SNTKVDKKVE PKSCD +/- KTHT (ou KTHL) +/- CPPCPA +/- PELAGAPSVFL Vedolizumabe Leve/ |DWMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSSOSLA SEQ ID |KSYGNTYLSW YLOKPGOSPQ LLIYGISNRF NO: 18 |ISGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV
YYCLOGTHQP YTFGQGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASWCL LNNFYPREAK VOWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV
TKSFNRGEC Natalizumabe Pesada/ |QVQLVAOSGAE VKKPGASVKV SCKASGFNIK SEQ ID |DTYIHWVRQA PGAQRLEWMGR IDPANGYTKY NO: 19º /DPKFOQGRVTI TADTSASTAY MELSSLRSED
TAVYYCAREG YYGNYGVYAM DYWGQGTLVT VSSASTKGPS VFPLAPCSRS TSESTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL
QSSGLYSLSS WTVPSSSLG TKTYTCNVDH KPSNTKVDKR VESKY +/- GPPCPPCPA +/-
PEFLGGPSVFL
Natalizumabe Leve/ |DIQMTOSPSS LSASVGDRVT ITCKTSQDIN SEQ ID |KYMAWYQQTP GKAPRLLIHY TSALQPGIPS NO: 20º |[|RFSGSGSGRD YTFTISSLQP EDIATYYCLQ
YDNLWTFGOQG TKVEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS WCLLNNFYP REAKVOWKVD NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHOGL SSPVTKSFNR
GEC Alirocumabe Pesada/ |EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFN SEQ ID |[NYAMNWVRQA PGKGLDWVST ISGSGGTTNY NO: 21 |ADSVKGRFII SRDSSKHTLY LOMNSLRAED
TAVYYCAKDS NWGNFDLWGR GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLOSSGL YSLSSWTVP
SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKKVEPKS CD +/- KTHT (ou KTHL) +/- CPPCPA +/-
PELLGGPSVFL Alirocumabe Leve/ |DIVMTOSPDS LAVSLGERAT INCKSSQSVL SEQ ID |[YRSNNRNFLG WYQQKPGQPP NLLIVWASTR NO: 22. JESGVPDRFSG SGSGTDFTLT ISSLOAEDVA
VYYCQQAYYTT PYTFGQOGTKL EIKRTVAAPS VFIFPPSDEQ LKSGTASWC LLNNFYPREA KVOWKVDNAL QSGNSQESVT EQDSKDSTYS LSSTLTLSKA DYEKHKVYAC EVTHOGLSSP
VTKSFNRGEC Evolocumabe Pesada/ |EVQLVOSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTLT SEQ ID |SYGISWVRQA PGQAQGLEWMGW VSFYNGNTNY NO: 23! J|AQKLOGRGTM TTDPSTSTAY MELRSLRSDD
TAVYYCARGY GMDVWGQGTT VTVSSASTKG
Evolocumabe Leve/ JESALTQOPASV SGSPGOSITI SCTGTSSDVG SEQ ID |GYNSVSWYQQ HPGKAPKLMI YEVSNRPSGV NO: 24º |ISNRFSGSKSG NTASLTISGL QAEDEADYYC
NSYTSTSMVF GGGTKLTVLG QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA GVETTTPSKQ SNNKYAASSY LSLTPEQWKS HRSYSCQVTH EGSTVEKTVA
PTECS Evinacumabe Pesada/ |EVQLVESGGG VIQPGGSLRL SCAASGFTFD SEQ ID |DYAMNWVRQOG PGKGLEWVSA ISGDGGSTYY NO: 25! J|ADSVKGRFTI SRDNSKNSLY LQMNSLRAED
TAFFYCAKDL RNTIFGWIP DAFDIWGQOGT MVTVSSASTK GPSVFPLAPC SRSTSESTAA LGCLVKDYFP EPVTVSWNSG ALTSGVHTFP
AVLOSSGLYS LSSWTVPSS SLGTKTYTCN VDHKPSNTKV DKRVESKYGP P +/-CPPCPA +/-
PEFLGGPSVFL Evinacumabe Leve/ |DIQMTOSPST LSASVGDRVT ITCRASQSIR SEQ ID |[SWLAWYQQKP GKAPKLLIYK ASSLESGVPS NO: 26. [|RFSGSGSGTE FTLTISSLOP DDFATYYCQQ
YNSYSYTFGQ GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SWCLLNNFY PREAKVOWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHOQG LSSPVTKSFN
RGEC Denosumabe Pesada/ |EVQLLESGGG LVOQPGGSLRL SCAASGFTFS SEQ ID |SYAMSWVRQA PGKGLEWVSG ITGSGGSTYY NO: 27º JADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED
TAVYYCAKDP GTTVIMSWFD PWGQGTLVTV SSASTKGPSV FPLAPSSKST SGGTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ
SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT QTYICNVNHK PSNTKVDKKV EPKSCD +/- KTHT (ou KTHL) +/- CPPCPA +/- PELLGGPSVFL
Denosumabe Leve/ JEIVLTASPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVR SEQ ID |GRYLAWYQQK PGQAPRLLIY GASSRATGIP NO: 28! |IDRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVFYCQ
QYGSSPRTFG QGTKVEIKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT ASWCLLNNF YPREAKVQWK VDNALQOSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL TLSKADYEKH KVYACEVTHOQ GLSSPVTKSF
NRGEC Nivolumabe Pesada/ |QVOLVESGGG WQPGRSLRL DCKASGITFS SEQ ID |[NSGMHWVRQA PGKGLEWVAV IWYDGSKRYY NO: 29 JADSVKGRFTI SRDNSKNTLF LOMNSLRAED
TAVYYCATND DYWGQGTLVT VSSASTKGPS VFPLAPCSRS TSESTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QOSSGLYSLSS
WTVPSSSLG TKTYTCNVDH KPSNTKVDKR VESKY +/- GPPCPPCPA +/-PEFLGGPSVFL Nivolumabe Leve/ JEIVLTOSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SEQ ID |[SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRATGIPA NO: 30º |RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ
SSNWPRTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SWCLLNNFY PREAKVOQWKV DNALQOSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHOG LSSPVTKSFN
RGEC Pembrolizumabe |Pesada/ |QVOLVOSGVE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SEQ ID |NYYMYWVRQA PGQGLEWMGG INPSNGGTNF NO: 31º |INEKFKNRVTL TTDSSTTTAY MELKSLQFDD
TAVYYCARRD YRFDMGFDYW GQGTTVTVSS ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK
Pembrolizumabe |Leve/ EIVLTOSPAT LSLSPGERAT LSCRASKGVS SEQ ID |TSGYSYLHWY QAKPGQAPRL LIYLASYLES NO: 32. |GVPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY
YCQHSRDLPL TFGGGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASWCLL NNFYPREAKV QWKVDNALOS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV THQOGLSSPVT
KSFNRGEC Ranibizumabe Pesada/ |EVOQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYDFT SEQ ID |[HYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY NO: 33 |AADFKRRFTF SLDTSKSTAY LOMNSLRAED
TAVYYCAKYP YYYGTSHWYF DVWGQGTLVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL
QSSGLYSLSS WTVPSSSLG TQTYICNVNH KPSNTKVDKK VEPKSCD +/- KTHT (ou KTHL) +/- CPPCPA +/- PELLGGPSVFL Ranibizumabe Leve/ |DIQLTOSPSS LSASVGDRVT ITCESASQDIS SEQ ID |NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF TSSLHSGVPS NO: 34º [|RFSGSGSGTD FTLTISSLOP EDFATYYCQQ
YSTVPWTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SWCLLNNFY PREAKVOWKV DNALQOSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHOG LSSPVTKSFN RGEC
Bevacizumabe Pesada/ |EVOQLVESGGG LVOQPGGSLRL SCAASGYTFT SEQ ID |NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY
AADFKRRFTF SLDTSKSTAY NO: 35. |LOMNSLRAED TAVYYCAKYP HYYGSSHWYF
DVWGQGTLVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT
SGVHTFPAVL QOSSGLYSLSS WTVPSSSLG TQTYICNVNH KPSNTKVDKK VEPKSCD +/- KTHT (KTHL) +/- CPPCPA +/- PELLGGPSVFL Bevacizumabe — |Leve/ |DIQMTOSPSS LSASVGDRVT ITCESASQDIS SEQ ID |NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF TSSLHSGVPS NO: 36, [RFSGSGSGTD FTLTISSLOP EDFATYYCQQ
YSTVPWTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SWCLLNNFY PREAKVOWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHOG LSSPVTKSFN
RGEC Lampalizumabe |Pesada/ |EVOLVOSGPE LKKPGASVKV SCKASGYTFT SEQ ID |NYGMNWVRQA PGQAQGLEWMGW INTYTGETTY NO: 37º JADDFKGRFVF SLDTSVSTAY LOQISSLKAED
TAVYYCEREG GVNNWGOQGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KSTSGGTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLOSSGLYSL
SSWTVPSSS LGTQTYICNV NHKPSNTKVD KKVEPKSCD +/- KTHT (ou KTHL) +/-CPPCPA +/-
PELLGGPSVFL Lampalizumabe |Leve/ |DIQVTAOSPSS LSASVGDRVT ITCITSTDID SEQ ID |DDMNWYQQKP GKVPKLLISG GNTLRPGVPS NO: 38 |RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCLO
SDSLPYTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SWCLLNNFY PREAKVOWKV DNALQOSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHOQG LSSPVTKSFN RGEC
Brolucizumabe Pesada/ |EVOLVESGGG LVQPGGSLRL SCTASGFSLT SEQ ID |DYYYMTWVRQ APGKGLEWVG FIDPDDDPYY NO: 39º J|ATWAKGRFTI SRDNSKNTLY LOMNSLRAED
TAVYYCAGGD HNSGWGLDIW GQOGTLVTVSS Brolucizumabe — |Leve/ JEIVMTOSPST LSASVGDRVI ITCQASEIIH SEQ ID |SWLAWYQQKP GKAPKLLIYL ASTLASGVPS NO: 40º |[|RFSGSGSGAE FTLTISSLQP DDFATYYCQN
VYLASTNGAN FGQOGTKLTVL G Belimumabe Pesada/ |QVQLQQASGAE VKKPGSSVRV SCKASGGTFN SEQ ID |[NNAINWVRQA PGQAQGLEWMGG IIPMFGTAKY NO: 41º |SONFOQGRVAI TADESTGTAS MELSSLRSED
TAVYYCARSR DLLLFPHHAL SPWGRGTMVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL
QSSGLYSLSS WTVPSSSLG TQTYICNVNH KPSNTKVDKK VEPKSCD +/- KTHT (ou KTHL) +/- CPPCPA +/-PELLGGPSVFL Belimumabe Leve / |SSELTQDPAV SVALGQTVRV TCOGDSLRSY SEQ ID |[YASWYQQKPG QAPVLVIYGK NNRPSGIPDR NO: 42. |FSGSSSGNTA SLTITGAQAE DEADYYCSSR
DSSGNHWVFG GGTELTVLGQ PKAAPSVTLF PPSSEELQAN KATLVCLISD FYPGAVTVAW KADSSPVKAG VETTTPSKQOS NNKYAASSYL
SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE Lo | JesvekxmmeerTES | Eculizumabe Pesada/ |QVQLVOSGAE VKKPGASVKV SCKASGYIFS SEQ ID |NYWIQWVRQOA PGQGLEWMGE ILPGSGSTEY NO: 43 |TENFKDRVTM TRDTSTSTVY MELSSLRSED
TAVYYCARYF FGSSPNWYFD VWGQGTLVTV SSASTKGPSV FPLAPCSRST SESTAALGCL
Eculizumabe Leve/ |DIQMTOSPSS LSASVGDRVT ITCEGASENIY SEQ ID |GALNWYQQKP GKAPKLLIYG ATNLADGVPS NO: 44º |RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQN
VLNTPLTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SWCLLNNFY PREAKVOWKV DNALQOSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHOG LSSPVTKSFN
RGEC Andecaliximabe |Pesada/ |QVOLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGFSLL SEQ ID |SYGVHWVRQP PGKGLEWLGV IWTGGTTNYN NO: 45. |[SALMSRFTIS KDDSKNTVYL KMNSLKTEDT
AIYYCARYYY GMDYWGQGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPCS RSTSESTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLOSSGLYSL
SSWTVPSSS LGTKTYTCNV DHKPSNTKVD KRVESKY +/- GPPCPPCPA +/-PEFLGGPSVFL Andecaliximabe |Leve/ |DIQMTOSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVR SEQ ID |NTVAWYQQKP GKAPKLLIYS SSYRNTGVPD NO: 46, |RFSGSGSGTD FTLTISSLOA EDVAVYYCQAQ
HYITPYTFGG GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SWCLLNNFY PREAKVOWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHOQG LSSPVTKSFN
RGEC Lanadelumabe — [Pesada/ |[EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SEQ ID |HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY NO: 47º JADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED
TAVYYCAYRR IGVPRRDEFD INGQGTMVTV SSASTKGPSV FPLAPSSKST SGGTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLOQ
SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT QTYICNVNHK PSNTKVDKRV EPKSCD +/- KTHT (ou KTHL) +/- CPPCPA +/- PELLGGPSVFL
Lanadelumabe Leve/ |DIQMTOSPST LSASVGDRVT ITCRASQSIS SEQ ID |[SWLAWYQQKP GKAPKLLIYK ASTLESGVPS NO: 48 |RFSGSGSGTE FTLTISSLOP DDFATYYCQQ
YNTYWTFGOQG TKVEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS WCLLNNFYP REAKVOWKVD NALQOSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHOGL SSPVTKSFNR
GEC Adalimumabe Pesada/ |EVOQLVESGGG LVOQPGRSLRL SCAASGFTFD SEQ ID |DYAMHWVRQA PGKGLEWVSA ITWNSGHIDY NO: 49º |ADSVEGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED
TAVYYCAKVS YLSTASSLDY WGQGTLVTVS SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLOS SGLYSLSSW
TVPSSSLGTQ TYICNVNHKP SNTKVDKKVE PKSCD +/- KTHT (KTHL) +/- CPPCPA +/-
PELLGGPSVFL Adalimumabe Leve / RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCOR SEQ ID |IYNRAPYTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP NO: 50º |SDEQLKSGTA SWCLLNNFY PREAKVOWKV
DNALQOSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHOG LSSPVTKSFN
RGEC Infliimabe Pesada/ |EVKLEESGGG LVQPGGSMKL SCVASGFIFS
SEQ ID INHWMNWVROS PEKGLEWVAE IRSKSINSAT NO: 51. |HYAESVKGRF TISRDDSKSA VYLQMTDLRT
EDTGVYYCSR NYYGSTYDYW GQOGTTLTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLOSS
GLYSLSSWT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCD +/- KTHT (KTHL) +/- CPPCPA +/--PELLGGPSVFL
Infliimabe Leve / DILLTOSPAI LSVYSPGERVS FSCRASQFVG SEQ ID |SSIHWYQQRT NGSPRLLIKY ASESMSGIPS NO: 52. JRFSGSGSGTD FTLSINTVES EDIADYYCQQ
SHSWPFTFGS GTNLEVKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SWCLLNNFY PREAKVOWKV DNALQOSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHOG LSSPVTKSFN
RGEC aTAU Pesada/ |EVKWESGGG LVQPGGSMKL SCWSGFTFS SEQ ID |NYWVNWVROQA PGKGLEWVAQ IRLKSDNYAT NO: 53 |HYEESVKGRF TISRDDSKSS VYLQMNNLRA
EDSGIYYCTN WEDYWGQGTT VTVSSASTKG PSVFPLAPCS RSTSESTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLOSSGLYSL
SSWTVPSSS LGTKTYTCNV DHKPSNTKVD KRVESKY +/- GPPCPPCPA +/-PEFLGGPSVFL aTAU Leve / DIVLTOSPDS LAVSLGERAT ISCRASQOSVS SEQ ID |TSRYSYIHWY QAKPGQPPKL LIKYASNLES NO: 54º |GVPSRFSGSG SGTDFTLNIH PLEPEDFATY
YCHHSWEIPL TFEGQGTKLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASWCLL NNFYPREAKV QWKVDNALOS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV THOGLSSPVT
KSFNRGEC Erenumabe Pesada/ |QVQLVESGGG WQPGRSLRL SCAASGFTFS SEQ ID |SFGMHWVRQA PGKGLEWVAV ISFDGSIKYS NO: 55 |VDSVKGRFTI SRDNSKNTLF LOMNSLRAED
TAVYYCARDR LNYYDSSGYY HYKYYGMAVW GQGTTVTVSS ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLOSS GLYSLSSWT VPSSNFGTOT YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KCCVE +/-CPPCPA +/-PPVAG
Erenumabe Leve/ JOSVLTQPPSV SAAPGQKVTI SCSGSSSNIG SEQ ID |NNYVSWYQAQL PGTAPKLLIY DNNKRPSGIP NO: 56, |DRFSGSKSGT STTLGITGLQ TGDEADYYCG
TWDSRLSAW FGGGTKLTVL GQPKANPTVT LFPPSSEELQ ANKATLVCLI SDFYPGAVTV AWKADGSPVK
AGVETTKPSK QOSNNKYAASS YLSLTPEQWK ma da TETAS | BAN2401 Pesada/ |EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCSASGFTFS SEQ ID |[SFGMHWVRQA PGKGLEWVAY ISSGSSTIYY NO: 5677 |GDTVKGRFTI SRDNAKNSLF LOMSSLRAED
TAVYYCAREG GYYYGRSYYT MDOYWGQGTTV TVSSASTKGP SVFPLAPSSK STSGGTAALG CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV
LOSSGLYSLS SWTVPSSSL GTQTYICNVN HKPSNTKVDK KVEPKSCD +/- KTHT (KTHL) +/- CPPCPA +/- PELLGG BAN2401 Leve/ |DWMTQSPLS LPVTPGAPAS ISCRSSQOSIV SEQ ID |[HSNGNTYLEW YLOKPGOSPK LLIYKVSNRF NO: 58 ISGVPDRFSGS GSGTDFTLRI SRVEAEDVGI
YYCFOGSHVP PTFGPGTKLE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASWCL LNNFYPREAK VQOWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV
TKSFNRGEC E06-scFV Pesada/ |EVKLVESGGG LVOQPGGSLRL SCATSGFTFS SEQ ID |DFYMEWVRQA PGKRLEWIAA SRNKANDYTT NO: 59º JEYADSVKGRF IVSRDTSQOSI LYLOMNALRA
EDTAIYYCAR DYYGSSYWYF DVWGAGTTVT vSS
EO6-scFV Leve/ |DIVMTOSPSS LSVSAGKKVT ISCTASESLY SEQ ID |SSKHKVHYLA WYQKKPEQSP KLLIYGASNR NO: 60º [YIGVPDRFTG SGSGTDFTLT ISSVQVEDLT
HYYCAQFYSY PLTFGAGTKL EIK AAVIhlo SEQ ID |MAADGYLPDW LEDNLSEGIR EWWDLKPGAP NO: 80º |KPKANQQKQD DGRGLVLPGY KYLGPFNGLD
KGEPVNAADA AALEHDKAYD QQLKAGDNPY LRYNHADAEF QERLQEDTSF GGNLGRAVFQ AKKRVLEPLG LVEEGAKTAP GKKRPVEPSP QRSPDSSTGI GKKGQQPAKK RLNFGQATGDS ESVPDPQPIG EPPAGPSGLG SGTMAAGGGA PMADNNEGAD GVGSSSGNWH CDSTWLGDRV ITTSTRTWAL PTYNNHLYKOQ ISNGTSGGST NDNTYFGYST PWGYFDFNRF HCHFSPRDWQ RLINNNWGFR PKRLNFKLFN IQVKEVTONE GTKTIANNLT STIQVFTDSE YQLPYVLGSA HQGCLPPFPA DVFMIPQYGY LTLNNGSQAV GRSSFYCLEY FPSQMLRTGN NFEFSYQFED VPFHSSYAHS QOSLDRLMNPL IDQYLYYLSR TQASTGGTAGT QQLLFSQAGP NNMSAQAKNW LPGPCYRQQR VSTTLSQNNN SNFAWTGATK YHLNGRDSLV NPGVAMATHK DDEERFFPSS GVLMFGKQGA GKDNVDYSSV MLTSEEEIKT TNPVATEQYG WADNLQQQN AAPIVGAVNS QGALPGMVWOQ NRDVYLQGPI WAKIPHTDGN FHPSPLMGGF GLKHPPPOQIL IKNTPVPADP PTTFSQAKLA SFITQYSTGQ VSVEIEWELQ KENSKRWNPE IQYTSNYYKS TNVDFAVNTD GTYSEPRPIG TRYLTRNL
TABELA 5. Tabela de Sequências de Ácido Nucleico de Fragmento de Fab mAb Cadeia / |Sequência
SEQ ID NO. Aducanumabe |Pesada/ |gtgcagctgg tagagagegg cageggcegta gtgcageceg SEQID |gcagaagcct gagactgagc tacgeegeca geggettege NO:101 cttecagcage tacggcatgc actaggtgag acaggecece ggcaagggcc tagagtgggt ggaccegtgatec tagttegacg gcaccaagaa gtactacacc gacagcegtga agggcagatt caccatcagc agagacaaca gcaagaacac cctgtaccta cagatgaaca ccctgagage cgaggacace geegtgtact actgcgccag agacagaggc ateggegeca gaagaggece ctactacatg gacgtgtggg gcaagggcac cacegtgace gtgagcagcg ccagcaccaa gggececage gtattecece tggcccecag cagcaagage accageggeg gcacegecge cetgggctac ctagtgaagg actacttecc egagecegta accgtgagct ggaacagegg cgcecetgace ageggegtge acaccttccec cgcegtgeta cagageageg gectgtacag cetgagcagce gtggtgaceg tacecageag cagectagge acccagacct acatctgcaa cgtgaaccac aagccecagea acaccaaggt ggacaagaga gtggagccca agagcetgega c +/- aagacccacacc (or aagacccaccta) +/- tgccececetgeceeagee +/- ceegagcetgetaggeggceccagegtattecta Aducanumabe jLeve/ gacatccaga tgacccagag ccecagcagce ctgagegeca SEQID gcgtaggega cagagtgacc ateacetgca gagecageca NO: 102 |gagcatcagc agctacctga actggtacca gcagaagece ggcaaggccce craagetget gatetacgec gecageagec tgcagagcgg cgtgcecagc agattcageg gecageggeag cggcaccegac tteacectga ccateageag cetgcagece gaggacttcg ccaccetacta ctgccagcag agctacagca ceccececetgac ctteggegge ggcaccaagg tagagatcaa gagaaccgtg gcegececca gegtgticat ctteceeece agcgacgagc agctgaagag cggcacegec agegtggtgat gcctgctgaa caacttctac cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgcce tacagagegg caacagecag gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccecetgace ctgagcaagg cegactacga gaagcacaag gtgtacgcct gogaggtgac ccaccaggge ctgagcagcc cegtgaccaa gagcttcaac agaggegagt ge Crenezumabe —|Pesada/ |gaggtacagc tagtagagag cggeggcggc ctagtacage SEQID |ceggeggcag cetgagactg agetacgeeg ccragegarctt NO: 103 |caccttcagc agctacggca tgagctgggt gagacaggcc mAb Cadeia / |Sequência
SEQ ID NO. cceggeaagg gectagaget ggtggccagce atcaacagca acggcggcag cacctactac ccegacageg tgaagggcag attcaccatc agcagagaca acgccaagaa cagcctgtac ctgcagatga acagcctgag agcegaggac acegecgtat actactgegc cageggegac tactagggce agggcaccac cgtgaccgtg agcagegeca gcaccaaggg ceceagegtg ttecccectgg ccccctgcag cagaageace agegagagea cegecgecet gggctacecetg gtgaaggact actteceega gccecegtgacce gtgagctaga acageggegce cetgaceage ggcgtgcaca cetteceege cegtgctgcag ageageggec tgtacagcct gagcagcgtg gtgaccegtgc ccagcagceag cectgggcaco aagacctaca cctgcaacgt ggaccacaag cccagcaaca ccaaggtaga caagagagtg gagagcaagt ac +/- ggecececetgecececetgeceegee +/- cecegagttectaggeggececagegtaticeta Crenezumabe |Leve/ gacatcgtga tgacccagag cecectgagce ctgccegtga SEQID Jccecceeggega gecegecage atcragetgca gaagcageca NO: 104 |gagcctagtag tacagcaacg gegacaccta cetgcactgg tacctgcaga agcceggeca gagececceag ctactgatet acaaggtgag caacagattc agcggegtgc cegacagatt cagcggcage ggcageggca cegacttcac cetgaagate agcagagtgg aggccegagga cgtaggacagta tactactgca gccagagcac ccacgtgece tagacettcg geccagggeac caaggtggag atcaagagaa cegtggecge ceccagegta ttcatcttec ceccecagega cgagcagetg aagageggca cegecagegt ggtataceta ctgaacaact tetaccecag agaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa cgccctgcag agcggcaaca gccaggagag cgtgacegag caggacagea aggacagcac ctacagcetg agcagcacec tgacectgag caaggcegac tacgagaage acaaggtata cgcctgcgag gtgacccacc agggcectgag cagecceegtg accaagaget tcaacagagg cgagtgc Gantenerumabe |Pesada |caggtggagc tagtagagag cageggegac ctagtgcage SEQID |ceggeggcag cetgagactg agetgcgecg ccragegactt NO: 105 |caccttcagc agctacgceca tgagctaggt gagacaggec ceceggceaagg gectagagta ggtgagegoc atraacgeca geggcaccag aacctactac gcegacageg tagaagggcag attcaccatc agcagagaca acagcaagaa caccctgtac ctgcagatga acagcctgag agccegaggac acegecgtagt actactgcgc cagaggcaag ggcaacaccc acaageceta cggctacgtg agatacttcg acgtgtgggg ccagggcace ctggtgaccg tagagcagege cagcaccaag ggececageg tgtteccect ggcececage agcaagagea crageggegg cacecgceegcec ctgggetgcec tagtgaagga ctacttecce mAb Cadeia / |Sequência
SEQ ID NO. gagcccegtga cegtgagetg gaacagegge gecetgacea geggcegtgca cacettecee gecgtgctgc agagcagegg cectgtacagc ctgagcageg tagtgaccegt geccecageage agcctgggca cccagaccta catctgcaac gtgaaccaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaagg tagageccaa gagctgegac +/- aagacccacacc (or aagacccaccta) +/- tgccececetgeceeagee +/ cegagctactaggeggcececagegtattceta Gantenerumabe |Leve / gacatcgtgc tgacccagag cecegecacce ctgagectga SEQID |gcceceggega gagagecacc ctgagetgca gagecageca NO: 106 |gagcgtgagc agcagcetace tagectagta ccagcagaag cceggecagg cececagact getgatetac ggegecagea gcagagccac cggegtgece gecagattca geggcagegg cagcggcacc gacttcacec tgaccatcag cagectggag ccegaggact tegecacceta ctactgcctg cagatctaca acatgcccat caccttegge cagggcacca aggtagagat caagagaacc gtggcegece ceagegtagtt catettecee cccagegacg agcagctgaa gageggcace gecagegtgg tgtgcctgct gaacaacttc taccccagag aggccaaggt gcagtggaag gtggacaacg ccctgcagag cggcaacage caggagagcg tgaccegagca ggacagcaag gacagcacet acagcctgag cagcacccetg accetgagca aggecgacta cgagaagcac aaggtgtacg cctgcgaggt gacccaccag ggccetgagca geccegtgac caagagcette aacagaggeg agtgc Dupilumabe Pesada/ |gaggtacagc tagtagagag cageggceggc ctgagagcage SEQID Jceggeggcag cetgagacta agetgegecg gcagegactt NO: 107 |caccttcaga gactacgcca tgacctaggt gagacaggcc cceggcaagg gectagagta ggtgagcage atcageggca gcggeggcaa cacctactac gcegacageg tagaagggcag attcaccatc agcagagaca acagcaagaa cacccetgtac ctgcagatga acagcctgag agcegaggac acegecgtat actactgcgc caaggacaga ctgagcatca ccatcagace cagatactac ggcctggacg tatagggeca gggcaccace gtgaccgtga gcagegecag caccaaggge cecagegtat tececetgge cecetgcage agaageacea gegagagcac cgceegeceta ggetgccetag taaaggacta ctteccegag cecegtgaceg tgagetggaa cageggegec ctgacecageg gcgtgcacac cttececgec gtgctgcaga gcageggcect gtacagcctg agcagcgtag tagacegtgcc cagcagcage ctgggcacca agacctacac ctgcaacgtg gaccacaage ccagcaacac caaggtggac aagagagtgg agagcaagtac +/-ggccececetgecececetgeceeagee +/- [ [| — Jecegagticetaggegaceccagegtaticta ===>)
mAb Cadeia / |Sequência
SEQ ID NO.
Dupilumabe Leve / gacatcgtga tgacccagag cecectgagce ctgcceegtga SEQID [ccececeggega gecegecage atcragetgca gaagcageca NO: 108 |gagcctactg tacagcatcg gctacaacta cctagactag tacctgcaga agageggcca gagececcag ctgactgatet acctgggcag caacagagcc ageggegtgc cegacagatt cagcggcage ggcageggca cegacttcac cetgaagate agcagagtgg aggcegagga cgtaggcttc tactactgca tgcaggccct gcagacecec tacacetteg gecagggeac caagctggag atcaagagaa cegtggeege ceccagegta ttcatcttec cececagega cgagcagetg aagageggca cegecagegt ggtatgccta ctgaacaact tetaccecag agaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa cgccctgcag agcggcaaca gccaggagag cgtgacegag caggacagea aggacagcac ctacagcetg agcagcacec tgacectgag caaggcegac tacgagaage acaaggtata cgcctgcgag gtgacccacc agggcectgag cagecceegtg accaagagoet tcaacagagg cgagtgc Ixequizumabe Pesada/ |caggtgcagc tagtacagag cggegecgag gtgaagaage SEQID Jceggcagceag cgtgaaggta agctgcaagg ccageggacta NO: 109 |cagcttcacc gactaccaca tecactgggt gagacaggcc ceceggecagg gectggagta gataggcgata atcaacecca tgtacggcac cacegactac aaccagagat ttaagggcag agitgaccatc acegeegacg agagcaccag cacegectac atggagctga gcagcctgag aagegaggac acegecatat actactgcgc cagatacgac tactteaceg gcaceggegt gtactggggc cagggcaccc tagtgacegt gagcagegec agcaccaagg gccecagegt gttececetg gececetgca gcagaagcac cagegagage acegecegece taggetgect ggtgaaggac tactteccceg agccecegtgac cgtgagctgg aacagcggcg cectgacceag cggegtgcac acettececg cegtgctgca gagcageggc ctgtacagec tagageagegt ggtgaccgtg cccagcagca gectgggcac caagaccectac acctgcaacg tggaccacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt ggagagcaag tac +/- ggcececectgecececetgeceeges +/- ceegagttectaggeggececagegtattecta Ixequizumabe — |Leve/ gacatcgtga tgacccagac cecectgage ctgagegtga SEQID |cceceeeggeca gecegecage ateagetgca gaagcagcag NO: 110 [aagcctagtg cacagcagag gcaacaccta cctgcactag tacctgcaga agcceggeca gagececceag ctactgatet acaaggtgag caacagattc atcggegtgc cegacagatt cagcggcage ggcageggca cegacttcac cetgaagate agcagagtgg aggccegagga cgataggacagta tactactgca mAb Cadeia / |Sequência
SEQ ID NO. gccagagcac ceacetgecce tteacetteg gecagggeac caagctggag atcaagagaa cegtggeege ceccagegtg ttcatcttec cccecagega cgagcagetg aagageggca cegecagegt ggtataceta ctgaacaact tetaccccag agaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa cgccctgcag agcggcaaca gccaggagag cgtgacegag caggacagea aggacagcac ctacagcetg agcagcacec tgacectgag caaggcegac tacgagaage acaaggtata cgcctgcgag gtgacccacc agggcctgag cagececegtg accaagagcet tcaacagagg cgagtgc Seciquinumabe |Pesada/ |gaggtgcagc tagtagagag cggeggacgage ctagtgcage SEQID Jceggeggcag cetgagacta agetagegecg cragegagrett NO: 111 |caccttcagc aactactgga tgaactgggt gagacaggcc ceceggceaagg gectagagta ggtggeogec atraaccagg acggcagega gaagtactac gtgggcageg taaagggcag attcaccatc agcagagaca acgccaagaa cagcctgtac ctgcagatga acagcctgag agtggaggac acegecegtat actactgcgt gagagactac tacgacatcc tgacegacta ctacatccac tactggtact tegacctgta gggcagagge accctggtga ccegtgagcag cgccagcace aagggececa gegtattece cetggeceee agcageaaga gcaccagegg cggcacegec gecetaggct gectagtgaa ggactactte ccegageceg tgacegtgag ctaggaacage ggegecetga ccageggcegt gcacaccette ccegeegtge tacagageag cggcctgtac agcctgagca gegtggtgac cgtgcccage agcagcctag gcacccagac ctacatctgc aacgtgaace acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagtggagec caagagctac gac +/- aagacccacacc (or aagacccacctg) +/- tgcccceecetgeeceges +/ cegagcectactaggeggececagegtattceta Seciquinumabe |Leve/ gagatcgtac tgacccagag ceceggeace ctgagectga SEQID |gceceggega gagagecacce ctgagetgca gagecageca NO: 112 |gagcgtgagc agcagcetacc tagectagta ccagcagaag cceggecagg cececagact gcetgatetac ggegecageca gcagagccac cggcatecee gacagattca geggcagegg cagcggcacc gactticacec tgaccatcag cagactggag ccegaggact tegecegtgta ctactaccag cagtacggca gcagcceccetga cacettegge cagggcacca gactggagat caagagaacc gtggcegece ceagegtatt catettecee cccagegacg agcagctgaa gageggcace gecagegtgg tgtgcctgct gaacaacttc taccccagag aggccaaggt gcagtggaag gtggacaacg ccctgcagag cggcaacage caggagagcg tgaccegagca ggacagcaag gacagcacct acagcctgag cagcacccetg accetgagca aggecgacta mAb Cadeia / |Sequência
SEQ ID NO. cgagaagcac aaggtgtacg cctgegaggt gacccaccag ggcctgagca geccegtgac caagagcette aacagaggeg agtgc Ustequinumabe |Pesada/ i|gaggtgcagc tagtacagag cggegecgag gtgaagaage SEQID Jceggegagag cetgaagatc agctgcaagg gcageggacta NO: 113 |cagcttcacc acctactage taggctagat gagacagata cceggeaagg gectagacta gateggcate atgagececg tggacagcga catcagatac agcccecagcet tecagggeca ggtgaccatg agcgtggaca agagcatcac cacegectac ctgcagtgga acagcctgaa ggccagegac acegecatgt actactgcgc cagaagaaga cceggecagg getacttega cttetgggge cagggcaccce tagtgacegt gagcagcage agcaccaagg gccecagegt gtteceectg geceecageca gcaagagcac cageggegge acegecgece taggetacet ggtgaaggac tactteccceg agccecegtgac cgtgagetgg aacagcggcg cectgaceag cggegtgcac acetteceeg cegtgctgca gagcageggc ctgtacagec tagagcagegt ggtgacecgtg cceagcagca gectgggcac ccagacetac atctgcaacg tgaaccacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt ggagcccaag agctgegac +/-aagacccaca cc (or aagacccacceta)+/-taceceeeetgeceegee +/- ceegagcetgetaggeggceccagegtattecta Ustequinumabe |Leve/ gacatccaga tgacccagag ccecagcagce ctgagegeca SEQID gcgtaggega cagagigacc ateacetgca gagecageca NO: 114 |gggcatcagc agcetagctag cctagtacca gcagaagece gagaaggccc craagagect gatetacgec gecageagec tgcagagcgg cgtgcecagc agatteageg gecageggeag cggcaccegac ttcacectga ccateagcag cetgcagece gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacaacatet accccetacac ctteggecag ggcaccaagce tagagatcaa gagaaccgtg gcegececca gegtgticat ctteceeece agcgacgagc agctgaagag cggcacegec agegtgagtat gcctgctgaa caacttctac cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgcce tacagagegg caacagecag gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccetgace ctgageaagg cegactacga gaagcacaag gtgtacgcct gogaggtgac ccaccaggge ctgagcagcc cegtgaccaa gagctticaac agaggegagt ge Mepolizumabe “|Pesada/ |caggtgaccc tagagagagag cggcecceegec ctggtgaage SEQID ccaccecagac cetgacectg acctgcaceg tgageggcett NO: 115 |cagcctgacc agcetacageg tacactgggt gagacagece cceggcaagg gectagagta gctaggcata atctgggcca mAb Cadeia / |Sequência
SEQ ID NO. geggceggcac cgactacaac agegecetga tgagcagact gagcatcagc aaggacacca gcagaaacca ggtaggtgctg accatgacca acatggaccc cgtggacacc gecaccetact actgcgccag agaccecece agcagectgce tgagactgga ctactggggc agaggcaccc cegtgacegt gagcagegec agcaccaagg gccecagegt gtteceeetg geceecagea gcaagagcac cageggegge acegeegece taggetacet ggtgaaggac tactteccceg agccecegtgac cgtgagetgg aacagcggcg cectgaccecag cggegtgcac acettececg cegtgctgca gagcageggc ctgtacagec tagageagegt ggtgaccgtg cccagcagca gectgggcac ccagacetac atctgcaacg tgaaccacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt ggagcccaag agctgegac +/- aagacccacacc (or aagacccaccta) +/- tgccececetgeceagece +/- ceegagcetgctgggeggececagegtattceta Mepolizumabe [Leve/ gacatcgtga tgacccagag cecegacage ctageegtga SEQID gcctgggega gagagecacc ateaactgca agagcageca NO: 116 |gagcctactg aacageggca accagaagaa ctacctggee tggcagcaga agcceeggeca geceeecaag ctgctgatct acggcgcecag caccagagag ageggcegtgc cegacagatt cagcggcage ggcageggca cegacttcac cetgaccate agcagcctgc aggcegagga cgtggecagta tactactgcc agaacgtgca cagctteecee ttcacettoeg geggeggeac caagctggag atcaagagaa cegtggecge ceccagegtg ttcatcttcc ccececagega cgagcagetg aagageggca cegecagegt ggtagtgcctg ctgaacaact tetaccecag agaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa cgccctgcag agcggcaaca gccaggagag cgtgaccegag caggacagea aggacagcac ctacagcctg agcagcaccec tgaccectgag caaggcegac tacgagaage acaaggtgata cgcctgegag gtgacccacc agggectgag cageceegta accaagaget tcaacagagg cgagtgc Vedolizumabe — |[Pesada/ |caggtgcagc tagtgcagag cggegeegag gtgaagaage SEQID |ceggegecag cgtgaaggta agctgcaagg gcageggacta NO: 117 |caccttcacc agctactaga tacactgggt gagacaggce cceggecaga gactagagta gatcggegag ategacecca gcgagagcaa caccaactac aaccagaagt teaagggcag agtgaccctg accgtggaca teagegecag cacegectac atggagctga gcagcctgag aagegaggac acegcecagtat actactgcgc cagaggeggc tacgacggct gggactacgec catcgactac taggggccagg gcaccctggt gaccegtgage agcgccagcea craagggecce cagegtatte cecetagece ccagcagcaa gagcaccage ggeggeaceg cegecetggg mAb Cadeia / |Sequência
SEQ ID NO. ctgcctggtg aaggactact teccegagec cgtgacegta agctggaaca gcggegeccet gaccagegge gtgcacacet teceegecgt getacagage ageggcectgat acagceetgag cagcgtagtg acegtgeeca gcagcagect gggcaccecag acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggtagag cccaagagcet gegac +/- aagacccacacc (or aagacccaccta) +/- tgccececetgeceagee +/- cecegagcetggecggegececeagegtgattecta Vedolizumabe — [Leve / gacgtggtga tgacccagag cecectgage ctgcecgtga SEQID |cceeceggega gecegecage atcragetgca gaagcageca NO: 118 |gagcctagec aagagctacg gcaacaccta ccetgagetag tacctgcaga agcceggeca gagecececag ctgctgatet acggcatcag caacagattc ageggegtgc cegacagatt cagcggcage ggcageggca cegacticac cetgaagate agcagagtgg aggccegagga cgtaggcgta tactactgce tgcagggcac ccaccagece tacacetteg geccagggcac caaggtggag atcaagagaa cegtggeege ceccagegta ttcatcttec cececagega cgagcagetg aagageggca cegecagegt ggtatgacctg ctgaacaact tetaccecag agaggccaag gtgcagtgga aggtagacaa cgcccetgcag agcggcaaca gccaggagag cgtgacegag caggacagea aggacagcac ctacagcctg agcagcaccc tgaccectgag caaggcogac tacgagaage acaaggtata cgcctgcgag gtgacccacc agggcectgag cageceegtg accaagagoet tcaacagagg cgagtge Natalizumabe Pesada/ |caggtgcagc tagtgcagag cggegecgag gtgaagaage SEQID Jceggegecag cgtgaaggta agctgcaagg ccagegarctt NO: 119 |caacatcaag gacacctaca tecactgggt gagacaggce cceggecaga gactagagta gatgggcaga atcgaceceg ccaacggcta caccaagtac gacccecaagt tecagggcag agtgaccatc acegeegaca ceagegecag cacegectac atggagctga gcagcctgag aagegaggac acegecagtat actactgcgc cagagagggc tactacggca actacggcgt gtacgccatg gactactggg gccagggcac cetagtgace gtgagcagcg ccagcaccaa gggcececage gtattececo tggccceectg cagcagaage accagegaga geacegecge cetgggctac ctagtgaagg actacttecc cgagcccegtga accgtgagct ggaacagegg cgecetgace ageggegtge acaccttece cegecegtacta cagagcageg gectgtacag cectgagcagc gtggtgaceg tacecagcag cagectagge accaagacct acacctgcaa cgtggaccac aagceccageca acaccaaggt ggacaagaga gtggagagca agtac +/- ggcceceeceectgecececetgeceegees +/- [ [| — Jecegagticetaggegaceccagegtaticta ===>)
mAb Cadeia / |Sequência
SEQ ID NO.
Natalizumabe Light gacatccaga tgacccagag ccecagcagce ctgagegeca SEQID gcgtaggega cagagitgacc ateacctgca agaccageca NO: 120 |ggacatcaac aagtacatgg cctggtacca gcagacecec ggcaaggccce cragactgcet gatccactac accagegece tgcagcceegg catceccagce agatteageg gecageggeag cggcagagac tacaccttca ccatcagcag cetgcagece gaggacatcg ccacctacta ctgcctgcag tacgacaace tgtggacctt cagccagggc accaaggtgg agatcaagag aaccgtggec gececceageg tattcatett ccecececeage gacgagcagc tgaagagegg cacegecage gtagtgtace tgctgaacaa cttctacccc agagaggceca aggtgcagtg gaaggtggac aacgccetgc agageggcaa cagecaggag agcgtgaccg agcaggacag caaggacage acctacagec tgagcagcac ccetgaccectg agcaaggecog actacgagaa gcacaaggtg tacgcctgcg aggtgaccca ccagggecta agcagcceceg tgaccaagag ctteaacaga ggegagtgc Alirocumabe Pesada/ |gaggtacagc tagtagagag cageggceggc ctagtacage SEQID |ceggeggcag cetgagacta agetgegeeg ceagegacett NO: 121 |cacctticaac aactacgcca tgaactgggt gagacaggec cceggeaagg gectagacta ggtgagcacce atcageggca gcggeggcac caccaactac gcegacageg tgaagggcag attcatcatc agcagagaca gcagcaagca caccctgtac ctgcagatga acagcctgag agccegaggac acegecgtat actactgcgc caaggacagc aactggggca acttegacet gtggggcaga ggcaccetag tgacegigag cagegecage accaagggcc ceagegtatt ccecetagec ceceagcagea agagcaccag cggeggcace geegecetag getgccetagt gaaggactac ttcccegage cegtgacegt gagctggaac agcggegecce tgaccagegg cgtacacacce tteceegecg tgctgcagag cagcggcectga tacagcectga gcagegtagt gaccgtgccc agcagcagec taggcaceca gaccetacatc tgcaacgtga accacaagcc cagcaacacc aaggtagaca agaaggtgga gcccaagage tgegac +/-aagacccacace (or aagacccacctg) +/-tacececectgeceegee +/- cecgagcetgctaggeggeeccagegtattceta Alirocumabe Leve / gacatcgtga tgacccagag cecegacage ctagecegtga SEQID |gcctgggega gagagcecacc atcaactgca agagcageca NO: 122 |gagcgtactg tacagaagca acaacagaaa cttcctagge tggtaccagc agaagceeegg ceagececec aacetagetga tctactagggc cagcaccaga gagageggcg tacecgacag attcageggc ageggcageg gcacegactt cacectgace atcagcagcc tacaggeega ggacgtggec gtgtactact mAb Cadeia / |Sequência
SEQ ID NO. gccagcagta ctacaccacc cectacacet teggecaggg caccaagctg gagatcaaga gaacegtggc egeeeecage gtgtticatct teccececag cgacgagcag ctgaagageg gcacegcecag cgataggtgtac ctgctgaaca acttctacce cagagaggcc aaggtgcagt ggaaggtgga caacgceccetg cagagcggca acagccagga gagegtgacc gagcaggaca gcaaggacag cacctacagec ctgagcagca cectgacect gagcaaggcc gactacgaga agcacaaggt gtacgcctge gaggtgaccc accagggcct gagcagecec gtigaccaaga gcttcaacag aggegagtgc Evolocumabe Pesada/ |gaggtgcagc tagtgcagag cagegecegag gtgaagaage SEQID [ceggegecag cgtgaaggta agctgcaagg ccageggceta NO: 123 |caccctgacc agctacggca teagctgggt gagacaggcc cceeggecagg gectagagta gatgggctag gtgagocttct acaacggcaa caccaactac gcccagaage tacagggeag aggcaccatg accacegacc ccageaceag cacegectac atggagctga gaagcctgag aagegacgac acegecatat actactgcgc cagaggctac ggcatggacg tatagggeca gggcaccacc gtgacegtga gcagegecag caccaaggge cecagegtgat teeeectgge cecetgcage agaagcaccea gegagagcac cegeegecetg ggctgcctgg taaaggacta cttcccegag cecgtgaceg taagetagaa cageggegec ctgaccagcg gegtgcacac ctteceegec gtgctgcaga gcagceggcct gtacagecetg agcagegtgg tagacegtgec cagcagcaac tteggcaccc agacctacac ctgcaacgta gaccacaagc ccagcaacac caaggtggac aagacegtag agagaaagtg ctgcgtagag +/- tacececectgeceegee +/- cececegtggeegge Evolocumabe Leve / gagagecgccce tgacecagec cgccagegta ageggcagec SEQID Jceggecagag cateaccate agctgcaceg gcaccageag NO: 124 |cgacgtaggc ggctacaaca gcegtgagceta gtaccagcag cacceceggca aggecececaa getgatgatc tacgaggtga gcaacagacc cagcggcegtg agcaacagat ttageggcag caagagcggc aacacegeca gectgaccat cageggecta caggcegagg acgaggcega ctactactgc aacagetaca ccagcaccag catggtatte ggeggeggca ccaagetgac cgtgctgggc cageccaagg cegececeag cgtgacecta ttcccecoca gcagegagga gctgcaggec aacaaggeca cectagtata cctgatcage gacttetace ceggegecgt gaccgtagcc tagaaggecg acagcagecc cgtgaaggec ggcgtggaga ccaccacece cageaageag agcaacaaca agtacgcegc cagcagetac ctgagectga ceecegagea gtggaagagc cacagaagct acagctgcca ggtgacccac gagggcagca cegtggagaa gacegitggcece cecacegagt LCD ee mAb Cadeia / |Sequência
SEQ ID NO.
Evinacumabe Pesada/ |gaggtacagc tagtagagag cageggeggac gtgatceage SEQID Jceggeggcag cetgagacta agetagcgeceg ccragegactt NO: 125 |caccttegac gactacgcca tgaactaggt gagacagggc cceggcaagg gectagagta ggtgagegec atrageggeg acggcggcag cacctactac gcegacageg tagaagggcag attcaccatc agcagagaca acagcaagaa cagcctgtac ctgcagatga acagcctgag agcegaggac acegecttet tctactgcgc caaggacctg agaaacacca tctteggegt ggtgatcccc gacgcectteg acatctgggg ccagggeace atggtgaccg tagagcagege cagcacceaag ggececageg tgtteccect ggccecetge agcagaagea ccagegagag cacegecgcec ctgggetgcoe tagtgaagga ctacttecce gagccegtga cegtgagetg gaacageggce gecetgacea geggcegtgca cacettecee geegtgetge agagcagegg cectgtacagc ctgagcageg tagtgaccegt gecccageage agcctgggca ccaagaccta cacctgcaac gtggaccaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag tagagagcaa gtacggcecee cece +/- tagcececectgeceegee +/- cecegagttectaggeggececagegtattecta Evinacumabe Leve / gacatccaga tgacccagag cceccagceace ctgagegeca SEQID gcgtgggega cagagigacc atcacetgca gagecageca NO: 126 |gagcatcaga agctagetag ccetggtacca gcagaagece ggcaaggccc craagetgcet gatcetacaag gecagcagec tggagagecgg cgtgcccagce agattcageg gcageggcag cggcaccgag tteacectga ccatcagcag cetgcagece gacgacttcg ccaccetacta ctgccagcag tacaacaget acagctacac ctteggecag ggcaccaagce tagagatcaa gagaaccgta gcegececca gegtgtteat ctteceecee agcgacgagc agctgaagag cggcacegec agegtagtat gcctgctgaa caacttctac cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tacagagegg caacagecag gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccetgacc ctgagcaagg cegactacga gaagcacaag gtgtacgcct gegaggtgac ccaccaggge ctgagcagcc cegtgaccaa gagctticaac agaggegagt go Denosumabe Pesada/ |gaggtagcagc tactagagag cageggcegac ctagtgcage SEQID Jceggeggcag cetgagactg agctgegeeg ccagegacett NO: 127 |caccttcagc agctacgceca tagagctaggt gagacaggec cceggcaagg gectagagta ggtgageggc atcaceggca gcggeggcag cacctactac gcegacageg tagaagggcag attcaccatc agcagagaca acagcaagaa caccctgtac ctgcagatga acagcctgag agcegaggac acegecgtat mAb Cadeia / |Sequência
SEQ ID NO. actactgcgc caaggaceccec ggcaccaceg tgatcatgag ctggttegac ccctggggec agggcacccet ggtgacegtg agcagcgcca gcaccaaggg ceccagegtg ttececetgg cccecageag caagageace ageggeggea cegecgeccet ggagctgcctg gtgaaggact actteccega gecegtgace gtgagctgga acagcggegc cetgaccage ggegtgcaca cetteeeege egtgctgcag agcageggec tatacagect gagcagcgta gtgaccegtgc ccagcagcag cetgggeace cagacctaca tctgcaacgt gaaccacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaggtg gagcccaaga gcetgegac +/- aagacccacacc (aagacccaccetg) +/- tgccececetgeceeagece +/- ceegagcetgctaggeggececagegtattceta Denosumabe Leve / gagatcgtac tagacccagag ceceggeacce ctgagectga SEQID |gcceceggega gagagecacce ctgagetgca gagecageca NO: 128 |gagcgtgaga ggcagatacc tagectggta ccagcagaag cceggecagg cececagact gcetgatetac ggegecagea gcagagccac cggcateccee gacagattca geggcagegg cageggcacce gacttcacec tgaccateag cagactagag cecegaggact tegecgtatt ctactgceag cagtacggca gcagceccag aaccettegge cagggcacca aggtagagat caagagaacc gtggcegece ceagegtatt catettecee cccagegacg agcagctgaa gageggceace gecagegtag tgtgcctgct gaacaacttc taccccagag aggccaaggt gcagtggaag gtggacaacg ccctgcagag cageaacage caggagagcg tgaccegagca ggacagcaag gacagcacct acagcctgag cagcaccecetg accctgagca aggecgacta cgagaagcac aaggtgtacg cctgcgaggt gacccaccag ggcctgagca geccegigac caagagette aacagaggeg agtgc Nivolumabe Pesada/ |caggtgcagc tagtagagag cageggeggc gtggtacage SEQID |cceggcagaag ccetgagactg gactgcaagg ccageggcat NO: 129 |caccttcagc aacageggca tacactgggt gagacaggec cceggcaagg gectagagta ggtagecgta atctggtacg acggcagcaa gagatactac gcegacageg tgaagggcag attcaccatc agcagagaca acagcaagaa cacccetgtte ctgcagatga acagcctgag agcegaggac acegecgtat actactgcgc caccaacgac gactactagg gccagggcac cetggtgacc gtgagcageg ccagcaccaa gggccecage gtgtteccce tageceeetg cagecagaage accagegaga gcacegecgce cetgggcetac ctagtgaagg actacttece cgagccecegtg acegtgagct ggaacagegg cgecetgace agcggcegtac acaccettece cgcegtgetg cagageageg gcctgtacag cctgagcagce gtggtgaceg tacccagcag mAb Cadeia / |Sequência
SEQ ID NO. cagcctgggc accaagacct acacctgcaa cgtggaccac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga gtggagagca agtac +/- ggcceceectgeececectgeceegee +/- ceegagttectaggeggceecagegtgttceta Nivolumabe Leve / gagatcgtac tgacccagag cecegecace ctgagectga SEQID |gcceceggega gagagecacce ctgagctgca gagecageca NO: 130 |gagcgtgagc agctacctag cctagtacca gcagaagece ggccaggccec cceagactact gatctacgac geccagcaaca gagccaccecgg catcecegec agattcageg gcageggeag cggcaccegac ttcacectga ccateageag cetggagece gaggacttcg cegtgtacta ctgccagcag agcageaact ggcccagaac ctteggecag ggcaccaagg tagagatcaa gagaaccgta gcegecececa gegtgatteat cttececeeee agcgacgagc agctgaagag cggcacegec agegtggtgat gcctgctgaa caacttetac cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tacagagegg caacagecag gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccetgacce ctgagcaagg cegactacga gaagcacaag gtgtacgcct gegaggtgac ccaccaggge ctgagcagcc cegtgaccaa gagctticaac agaggegagt ge Pembrolizumabe |Pesada/ lcaggtagcagc tagtacagag cggcgtagag gtgaagaage SEQID |cceggegecag catagaaggta agcetacaagg ccageggceta NO: 131 |caccttcacc aactactaca tgtactgggt gagacaggcc ceeggecagg gectagagta gatgggceggce atraacecca gcaacggcgg caccaacttc aacgagaagt traagaacag agitgaccctg accacegaca gcagcaccac cacegectac atggagctga agagcctgca gttegacgac acegecgtat actactgcgc cagaagagac tacagattcg acatgggctt cgactactgg ggccagggca ccacegtgac cgtgageage gccagcacca agggceccecag cgtattecee ctggecececet gcagcagaag caccagegag agcacegecg cectaggeta cetggtgaag gactacttec cegagecegt gacegtgage tggaacagcg gegecetgac cageggegtg cacaccettec cegecgtget gcagageage ggectgtaca gcctgageag cgtggtgacc gtgececagca gceagectggg caccaagace tacacctgca acgtggacca caagcccage aacaccaagg tggacaagag agtggagagc aagtac +/- ggccececectgecececetgeceeges +/- ceegagttectaggeggececagegtgttceta Pembrolizumabe |Leve / gagatcgtac tgacccagag cecegecace ctgagectga SEQID |gcceceggega gagagcecacc ctgagcetgca gagecagcaa NO: 132 |gggcgtgage accageggct acagctacet gcactagtac cagcagaagc ceggecagge ceccagactg ctgatetace mAb Cadeia / |Sequência
SEQ ID NO. tggccagcta cctggagage ggegtgeceog ccagattcag cggcagegge ageggcaceg acttcacect gaccateage agcctggage cegaggactt cgcegtgtac tactgccage acagcagaga cctgccecectg acetteggeg geggcaceaa ggtagagatc aagagaaceg tageegecec cagegtgtte atcttececc ccagegacga gcagctgaag ageggcaceg ccagcegtagt gtgcctactg aacaacttct accccagaga ggccaaggta cagtggaagg tagacaacgc cctgcagage ggcaacagcc aggagagegt gaccegagcag gacagcaaggo acagcaccta cagcctgage agcaccectga cectgageaa ggcecgactac gagaagcaca aggtgtacgc ctacgaggta acccaccagg gectgageag cecegtgace aagagcettca acagaggcga gtge Ranibizumabe — |[Pesada/ |gaggtgcagc tagtagagag cageggceggce ctagtacage SEQID ceggeggcag cetgagacta agetgegecg ccrageggeta NO: 133 |cgacttcacc cactacggca tgaactgggt gagacaggcc cceggcaagg gectagagta ggtgggactag atcaacacct acaccggega geccacetac geegecgact teaagagaag attcacctte agcctggaca ccagcaagag cacegectac ctgcagatga acagcctgag agcegaggac acegecgtagt actactgcgc caagtaccecece tactactacg gcaccageca ctggtacttc gacgtgtagg gecagggcac cetggtgace gtgagcagcg ccagcaccaa gggcececagce gtattecece tggcccecag cageaagage accageggeg gcacegecge cetgggctac ctagtgaagg actacttecce cgagecegtg accgtgagct ggaacagcegg cgecetgace ageggegtge acaccttecc egeegtgetg cagagcageg gectgtacag cetgagcagc gtggtgaceg tacecageag cagectagge acccagacct acatctgcaa cgtgaaccac aagccecagca acaccaaggt ggacaagaaggtggagcccaagagetgegac +/- aagacccacacc (or aagacccaccta) +/- tgccececeetgeceeagece +/- cecegagcetgctaggeggececagegtattceta Ranibizumabe — |Leve / gacatccagc tgacccagag ccecagcage ctgagegeca SEQID gcgtgggega cagagigacc atcacctgca gegecageca NO: 134 |ggacatcagc aactacctga actggtacca gcagaagece ggcaaggccc craaggtact gatctacttce accagcagec tgcacagcgg cgtgcccage agattcageg gcageggcag cggcaccgac ttcacectga ccateagcag cetgcagece gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacagcaceg tgccctggac ctteggccag ggcaccaagg tagagatcaa gagaaccgta gcegecececa gegtgttcat ctteceecee agcgacgagc agctgaagag cggcacegec agegtagtat gcctgctgaa caacttctac cccagagagg ccaaggtgca mAb Cadeia / |Sequência
SEQ ID NO. gtggaaggtg gacaacgccc tacagagegg caacagecag gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccetgacc ctgagcaagg cegactacga gaagcacaag gtgtacgcct gegaggtgac ccaccaggge ctgagcagcc cegtgaccaa gagctticaac agaggegagt ge Bevacizumabe [Pesada/ |gaggtgcagc tagtagagag cageggcggce ctggtgacage SEQID |cceggeggcag cetgagacta agctgegeeg ccageggreta NO: 135 |caccttcacc aactacggca tgaactaggt gagacaggcc cceggcaagg gectagagta ggtagactag atcaacacct acaceggega geccacetac geegecgact traagagaag attcacctte agcctggaca ccagcaagag cacegectac ctgcagatga acagcctgag agcegaggac acegecgtat actactgcgc caagtacccec cactactacg gcagcageca ctggtacttc gacgtgtagg gecagggcac cetagtgace gtgagcagecg ccagcaccaa gggececage gtgttecece tggcccecag cagcaagage accageggeg gcacegecge cetgggctac ctagtgaagg actacttece egagecegta accgtgagct ggaacagegg cgecetgace ageggegtge acaccttece cegecgtagctga cagagcageg gectgtacag cetgagcagce gtggtgaceg tacccageag cagectagge acccagacct acatctgcaa cgtgaaccac aagccecagea acaccaaggt ggacaagaag gtggagccca agagctgega c +/- aagacccacacc (aagacccaccta) +/- tgccececeetgeceegee +/- cecegagetgetaggeggceccagegtattecta Bevacizumabe |Leve/ gacatccaga tgacccagag ceccageage ctgagegeca SEQID gcgtaggega cagagigacce atcacctgca gegecageca NO: 136 |ggacatcagc aactacctga actggtacca gcagaagece ggcaaggccce craaggtact gatctactte accagcagec tgcacagcgg cgtgcccage agattcageg gcageggcag cggcaccgac ttcacectga ccateagcag cetgcagece gaggacttcg ccaccetacta ctgccagcag tacagcaceg tgccctggac ctteggecag ggcaccaagg tagagatcaa gagaaccgta gcegececca gegtgattcat cttecececee agcgacgagc agctgaagag cggcacegec agegtggtgat gcctgctgaa caacttetac cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tacagagegg caacagecag gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccetgacce ctgagcaagg cegactacga gaagcacaag gtgtacgcct gegaggtgac ccaccaggge ctgagcagcc cegtgaccaa gagctticaac agaggegagt ge mAb Cadeia / |Sequência
SEQ ID NO. Lampalizumabe |Pesada/ i|gaggtgcagc tagtgcagag cggeccegag ctgaagaage SEQID [ceggegecag cgtgaaggta agctgcaagg ccageggceta NO: 137 |caccttcacc aactacggca tgaactaggt gagacaggcc ceceggecagg gectggagta gatgggctag atcaacacct acaccggega gaccaccetac geegacgact traagggcag attcgtgtte agcctggaca ccagegtgag cacegectac ctgcagatca gcagcetgaa ggcegaggac acegecagtat actactgcga gagagagggc ggcgtgaaca actggggceca ggagcacccetg gtgacegtga gcagegecag caccaaggge cecagegtgat tececetgge ceecageage aagageacea geggeggcac cgeegecetg ggctgecetgg taaaggacta cttcccegag cecegtgaceg tagagctggaa cageggegee ctgaccageg gegtgcacac ctteceegec gtgctgcaga gcagcggcct gtacagecetg agcagegtgg taacegtgec cagcagcagc ctgggcacec agacctacat ctgcaacgta aaccacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaggtgg agcccaagag ctgegac +/- aagacccacace (or aagacccacctg) +/- tacececeetgeceeagee +/- ceegagcetgctgggeggececagegtattceta Lampalizumabe |Leve / gacatccagg tgacccagag ccecagcagce ctgagegeca SEQID gcgtaggega cagagigacc atcaccetgca teaccageac NO: 138 |cgacatcgac gacgacatga actggtacca gcagaagece ggcaaggtgc ccaagcetget gatcagegge ggcaacacec tgagacccegg cgtgeccage agattecageg gcageggcag cggcaccgac tteacectga ccateagcag cetgcagece gaggacgtag ccacctacta ctgcctgcag agegacagec tgccctacac ctteggecag ggcaccaagg tagagatcaa gagaaccgta gcegececca gegtgattcat cttececeeee agcgacgagc agctgaagag cggcacegec agegtgagtat gccetgctgaa caacttctac cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tacagagegg caacagecag gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccetgacc ctgagcaagg cegactacga gaagcacaag gtgtacgcct gegaggtgac ccaccaggge ctgagcagcc cegtgaccaa gagettcaac agaggegagt ge Brolucizumabe [Leve / gaggtgcagc tagtagagag cageggeggce ctagtgcage SEQID |cceggeggcag cetgagactg agctgcaceg ccagegagcrett NO: 139 |cagcctgacc gactactact acatgacctg ggtgagacag gccececeggca agggcctaga gtaggtagac tteategace cegacgacga cecetactac gecacetggg ccaagggcag attcaccatc agcagagaca acagcaagaa cacccetgtac ctgcagatga acagcctgag agcegaggac acegecgtat actactgcgc cggeggegac cacaacageg gctggggect [ — [| — lggacatdtagggccagggea ccctagigac catgageage — |)
mAb Cadeia / |Sequência
SEQ ID NO.
Brolucizumabe |Pesada/ |gagatcgtga tgacccagag cccecagcace ctgagegeca SEQID gcgtaggacga cagagigatc atcacetgec aggecagega NO: 140 |gatcatccac agctagctgg cctagtacca gcagaagece ggcaaggccce craagetget gatetacetg gecageacec tggccagegg cgtgcccage agattcageg gcageggcag cggcgcecegag tteacectga ccatcagcag cetgcagece gacgacttcg ccaccetacta ctgccagaac gtgtacctgg ccagcaccaa cggegecaac tteggeccagg gcaccaagcet gaccgtactg ggc Belimumabe Pesada/ |caggtgcagc tacagcagag cggegeggaa gtgaaaaaac SEQID Jcgggcagcag cgtgcgegtg agctgcaaag cgageggegg NO: 141 |cacctttaac aacaacgcga ttaactgggt gegccaggeg cegggecagg gectagaatg gatgggcggc attattecga tgtttaggcac cgegaaatat agccagaact ttreagggecg cgtggcgatt acegeggatg aaagcacegg cacegegage atggaactga gcagcctgeg cagegaagat accegeggtat attattgcge gegcagecge gatetgctac tatttecgca tcatgcgctg agccegtggg geegeggcac catggtgace gtgagcagcg cgagcaccaa aggccegagc gtgatttecge tggcgccegag cagcaaaage acceageggeg geacegegge gctaggctac ctagtgaaag attattttec ggaaccggta accgtgagca acagcggcegc getgaccage ggcegtgcata cettteegge ggtgctacag agcageggcc tatatagect gagcagegtg gtgacegtgc cgagcagecag cetaggcace cagacctata tttgcaacgt gaaccataaa ccgagcaaca ccaaagigga taaaaaagtg gaaccgaaaagcetgcgat+/- aaaacccatacc (or aaaacccatctga) +/- tgccegecgtgeceggeg +/- ceggaactactgggeggecegagegtatttcta Belimumabe Leve / agcagcgaac tgacccagga tecggeggtg agegtggege SEQID tgggccagac cgtacgacata acctgccagg gegatagcct NO: 142 |gcgcagctat tatacgagcet ggtateagca gaaaceggge caggcgccgg tactagitgat ttatggcaaa aacaacegec cgagcggcat teeggategce tttageggca gcageagegg caacaccgeg agectgacca ttacecggege gcaggeggaa gatgaagcgg attattattg cagcagcege gatagcageg gcaaccattg ggtatttage ggcggcaceg aactgacegt gctgggecag cegaaagegg cgcegagegt gaccectattt cegceegagca gegaagaact gcaggegaac aaagegacec tagtgtgcct gattageogat ttttatecgg gegeggtgac cgtggcgtag aaageggata gcageceggt ggcgggcata gaaaccacca cccegageaa acagagcaac aacaaatatg cggcegagcag ctatctgage ctgacecegg aacagtggaa aagccatcegc agcetataget gccaggtgac ccatgaagge agcaccgtgg aaaaaaccgt ggcgcegace gaatgcage mAb Cadeia / |Sequência
SEQ ID NO.
Eculizumabe Pesada/ |caggtgcagc tagtgcagag cggegecgag gtgaagaage SEQID [ceggegecag cgtgaaggta agctgcaagg ccageggceta NO: 143 |catcttcagc aactactgga tecagtgggt gagacaggce cceggecagg gectggagta gataggegag atcctgeeeg gcagcggcag cacegagtac accgagaact traaggacag agtgaccatg accagagaca ccagcaccag caccecgtgtac atggagctga gcagcctgag aagegaggac acegecagtat actactgcgc cagatacttc tteggcagca gececaacta gtacttegac gtgtgagggcec agggcacccet ggtgaccegta agcagcgcca gcaccaaggg ceccagegtg ttececetgg cecectgcag cagaageace agegagagea cegecgecet ggagctgcectg gtgaaggact acttececega gecegtgace gtgagctgga acagceggegce cetgaccage ggegtgcaca cetteeeege egtgctgcag agcageggec tatacagect gagcagcgta gtgacegtgc ccagcagcaa ctteggcace cagacctaca cctgcaacgt ggaccacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaccgtg gagagaaagt gctgcgtaga g +/- tgceceeeetgeceegee +/- cececegiggecgge Eculizumabe Leve / gacatccaga tgacccagag ceccagcage ctgagegeca SEQID gcgtaggega cagagigacce atcacetgeg gegecagega NO: 144 |gaacatctac ggcgceccetga actagtacca gcagaagece ggcaaggccce ceaagetgacet gatetacgge gecaceaace tggccgacgg cgtgccecage agattcageg gcageggeag cggcaccgac tteacectga ccateagcag cetgcagece gaggacttcg ccacctacta ctgccagaac gtgctgaaca cececetgac ctteggecag ggcaccaagg tagagatcaa gagaaccgta gcegecececa gegtgattcat ctteceecee agcgacgagc agctgaagag cggcacegec agegtggtat gcctgctgaa caacttetac cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tacagagegg caacagecag gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccetgace ctgageaagg cegactacga gaagcacaag gtgtacgcct gegaggtgac ccaccaggge ctgagcagcc cegtgaccaa gagctticaac agaggegagt ge Andecaliximabe |Pesada/ |caggtgcagc tacaggagag cggececggce ctagtgaage SEQID Jccagegagac cetgagectag acctgcaceg taageggoett NO: 145 |cagcctgacta agctacggceg tacactgggt gagacagcce ceceggcaagg gectagagta gctagacgata atctggaceg gcggcaccac caactacaac agegeccetga tgagcagatt caccatcagc aaggacgaca gcaagaacac cgtgtaccta aagatgaaca gcctgaagac cgaggacacc gecatetact mAb Cadeia / |Sequência
SEQ ID NO. actgcgccag atactactac ggcatggact actaggggeca ggagcaccctg gtgacegtga gcagegecag caccaaggge cecagegtgat tececetgge cecetgcage agaagcacca gegagagcac cegeegecetg ggctgcectgg taaaggacta cttcccegag cecgtgaceg tgagctggaa cageggegee ctgaccagecg gegtgcacac ctteceegec gtgctgcaga gcagcggcct gtacageeta agcagegtag taacegtgeeo cagcagcagc ctgggcacca agacctacac ctgcaacgtg gaccacaagc ccagcaacac caaggtggac aagagagtgg agagcaagta c +/- ggcccecectgecececetgeceegee +/- ceegagttectaggeggececagegtattecta Andecaliximabe [Leve / gacatccaga tgacccagag ccecagcage ctgagegeca SEQID gcgtaggega cagagigacc ateacetgca aggecageca NO: 146 |ggacgtgaga aacaccgtag cctagtacca gcagaagece ggcaaggccce craagetgacet gatetacage agcagetaca gaaacaccgg cgtgccegac agatteageg gecageggeag cggcaccegac tteacectga ccateagceag cetgcaggec gaggacgtag cegtgtacta ctgccagcag cactacatca cecececetacac ctteggegge ggcaccaagg tagagatcaa gagaaccgta gcegececca gegtgttcat ctteceeeee agcgacgagc agctgaagag cggcacegec agegtgagtat gcctgctgaa caacttctac cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgcce tacagagegg caacagecag gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccetgace ctgageaagg cegactacga gaagcacaag gtgtacgcct gogaggtgac ccaccaggge ctgagcagcc cegtgaccaa gagcetticaac agaggegagt ge Lanadelumabe |Pesada/ |gaggtgcagc tgctagagag cageggeggc ctagtgcage SEQID Jceggeggcag cetgagactag agetgegeeg ccragegarctt NO: 147 |caccttcagc cactacatca tgatgtgggt gagacaggec cceggcaagg gectagagta ggtgageggc atctacagca gceggceggcat cacegtgtac gcegacageg tagaagggcag attcaccatc agcagagaca acagcaagaa caccctgtac ctgcagatga acagcctgag agcegaggac acegecgtat actactgcgc ctacagaaga atceggegtgc ccagaagaga cgagttcgac atctagggec agggcaccat ggtgaccgta agcagcgcca gcaccaaggg ceccagegtg ttececetgg cccecageag caagageace ageggeggea cegecgecct ggagctgcctg gtgaaggact actteccega gecegtgace gtgagctgga acagcggegc cetgaccage ggegtgcaca cetteecege egtgctgcag agcageggec tatacagect gagcagcgta gtgaccegtgc ccagcagcag cetgggeace cagacctaca tctgcaacgt gaaccacaag cccagcaaca mAb Cadeia / |Sequência
SEQ ID NO. ccaaggtgga caagagagtg gagcccaaga gcetgegac +/- aagacccacacc (or aagacccaccta) +/- tgccececetgeceeagece +/- ceegagetgetaggeggceccagegtattecta Lanadelumabe |jLeve/ gacatccaga tgacccagag ceccageace ctgagegeca SEQID |gcgtgggega cagagtgacc atcacctgca gagecageca NO: 148 |gagcatcagc agctagctag cctagtacca gcagaagece ggcaaggccce craagetgaet gatetacaag gecageacec tggagagcgg cgtgcccagc agattcageg gcageggcag cggcaccgag tteaccecetga ccatcagcag cetgcagece gacgacttcg ccacctacta ctgccagcag tacaacacct actggacctt cagccagggc accaaggtgg agatcaagag aaccgtggee gececcageg tattcatett ccececeage gacgagcagc tgaagagegg cacegecagce gtggtatgce tgctgaacaa cttetacccc agagaggeca aggtacagta gaaggtggac aacgccetgc agageggcaa cagecaggag agcgtgaccg agcaggacag caaggacagce acctacagec tgagcagcac ccetgacectg agcaaggeeog actacgagaa gcacaaggtg tacgcctgcg aggtgaccca ccagggecta agcagcceceeg tgaccaagag cttcaacaga ggegagtge Adalimumabe Pesada/ |gaggtgcagc tagtagagag cageggeggc ctggtgcage SEQID Jceggcagaag cetgagactg agctgegecg cerageggctt NO: 149 |caccttegac gactacgcca tacactgggt gagacaggce cceggcaagg gectagagta ggtgagegcec atcacctgga acagcggcca categactac gecegacageg tagagggcag attcaccatc agcagagaca acgccaagaa cagccetgtac ctgcagatga acagcctgag agcegaggac acegecgtat actactgcgc caaggtgagc tacctgagca cegecagceag cetggactac tagggccagg gcaccctggt gaccegtgage agcgccagcea craagggecce cagegtatte cecetagece ccagcagcaa gagcaccage ggeggeaceg cegecetggg ctgcctggtg aaggactact teccegagec cegtgacegtg agctggaaca geggegecet gaccagegge gtgcacacet teceegecgt getacagage ageggcectgat acagccetgag cagecgtagtg acegtgeeca gcagcagect gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa ccacaagceccc agcaacacca aggtggacaa gaaggtggag cccaagaget gegac +/- aagacccacacc (aagacccacctg) +/- tgccececetgeceagece +/- cegagetactaggeggceecagegtattecta Adalimumabe Leve / agattcageg gcageggcag cggcacegac ttcacceetga SEQID ccatceagcag cetacagece gaggacgtag ccaccetacta NO: 150 [ctgccagaga tacaacagag ccecececetacac ctteggecag ggcaccaagg tagagatcaa gagaaccgtg gecgececea mAb Cadeia / |Sequência
SEQ ID NO. gcgtattcat cttecececeee agegacgagce agctgaagag cggcacegec agegtagtgt gcctactgaa caacttetac cccagagagg ccaaggtgca gtgagaaggtg gacaacgece tgcagagcgg caacagccag gagagegtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccetgace ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gegaggtgac ccaccaggge ctgagcagec cegigaceaa gagcttcaac agaggcgagt gc Infliimabe Pesada/ |gaggtgaagc tagaggagag cageggcgagce ctagtacage SEQID |cceggegacag catgaageta agetacgtag ccageggctt NO: 151 |catcttcage aaccactgga tgaactgggt gagacagagc ccegagaagg gcectagagta ggtageegag atcagaagca agagcatcaa cagegcecacce cactacgeeg agagegtgaa gggcagattc accatcagca gagacgacag caagagegec gtgtacctgc agatgacega cctgagaace gaggacaceg gcgtgtacta ctgcagcaga aactactacg gcagcaccta cgactactgg ggccagggca ccacccetgac cgtgagcage gccagcacca agggececag cgtgttecee ctaggeceeea gcagcaagag caccagegge ggcacegecg cectaggcta cetggtgaag gactacttec cegagecegt gacegtgage tggaacagecg gegecetgac cageggegta cacacettec cegcecegtget gcagagcage ggcectgtaca gcctgagcag cgtggtgacc gtgcccagca gcagectggg cacccagace tacatctgca acgtgaacca caagccecage aacaccaagg tggacaagaa ggtggagccc aagagctagcog ac +/- aagacccacacc (aagacccaccetg) +/- tgccececetgeceagece +/- cecegagetgetaggeggceccagegtattecta Inflióimabe Leve / gacatcctgc tgacccagag cecegecate ctgagegtga SEQID |gceceggega gagagigage tteagetgca gagecageca NO: 152 |gttcgtaggc agcagcatcc actggtacca gcagagaace aacggcagcce ccragactgacet gatcaagtac gecagegaga gcatgagcgg catcceccage agattcageg gcageggcag cggcaccgac ttcacectga gcatcaacac cgtagagage gaggacatcg cogactacta ctgccagcag agccacaget ggccecttcac ctteggcage ggcaceaace tagaggtgaa gagaaccgta gcegecececa gegtgatteat ctteceeeee agcgacgagc agctgaagag cggcacegec agegtggtgat gcctgctgaa caacttetac cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tacagagegg caacagecag gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccetgacce ctgageaagg cegactacga gaagcacaag gtgtacgcct gegaggtgac ccaccaggge ctgagcagcc cegtgaccaa gagctticaac agaggcgagt
ER RR CR mAb Cadeia / |Sequência
SEQ ID NO. aTAU Pesada/ |gaggtgaagg tagtagagag cggeggcegac ctagtgcage SEQID Jceggeggcag catgaageta agetacgtag taagegaoctt NO: 153 |caccttcagc aactactggg taaactaggt gaggcaggcc cceggcaagg gectagagta ggtggeccag atcaggetga agagcgacaa ctacgccacc cactacgagg agagcgtgaa gggcaggttc accatcagca gggacgacag caagagcage gtgtacctgc agatgaacaa cctgagggec gaggacageg gcatctacta ctgcaccaac tgggaggact actagggcca gggcaccacce gtgacegtga gcagegecag caccaaggge cecagegtgat tececetgge cecetgcage aggagcacea gegagagcac egecgecetg ggetgectgg taaaggacta cttcccegag cecegtgaceg tagagctggaa cageggegec ctgaccagecg gegtgcacac ctteceegec gtgctgcaga gcagcggcct gtacagectg agcagegtgg taacegtgec cagcagcagc ctgggcacca agacctacac ctgcaacgtg gaccacaagc ccagcaacac caaggtggac aagagggtgg agagcaagta c +/- ggcccceeetgecececetgeceegee +/- ceegagttectaggeggececagegtattecta aTAU Leve / gacatcgtgc tgacccagag cecegacagce ctggecgtga SEQID |gcctgggega gagggcecacce atceagetgca gggccageca NO: 154 |gagcgtgage accagcaggt acagctacat ccactagtac cagcagaagc ceggecagec ceceaageta ctgatcaagt acgccagcaa cetggagage ggegtgecca gcaggticag cggcagegge ageggcaceg acttcacect gaacatecac ceccectggage cegaggactt cgecacetac tactgecace acagctagga gatcceccetg accetteggec agggcaccaa gctggagatc aagaggaceg tagecgecee cagegtatte atcttccece ccragegacga gcagctgaag ageggcaceg ccagegtagt gtgcctactg aacaacttct acceccaggga ggccaaggtg cagtggaagg tagacaacgc cetgcagage ggcaacagcc aggagagegt gaccegagcag gacagcaago acagcaccta cagcctgage agcacccetga ccetgagcaa ggcegactac gagaagcaca aggtatacgc ctacgaggta acccaccagg gectgageag cecegtgace aagagettca acaggggcga gtgc Erenumabe Pesada/ |caggtgcagc tagtagagag cageggceggc gtaggtacage SEQID Jceggcagaag cetgagactg agctaegecg ccragegactt NO: 155 |caccttcagc agctteggca tacactgggt gagacaggce cceggcaagg gectagagta ggtagecgta atcagcetteg acggcagcat caagtacagc gtggacageg tagaagggcag attcaccatc agcagagaca acagcaagaa caccctgttc ctgcagatga acagcctgag agcegaggac acegecgtat actactgcgc cagagacaga ctgaactact acgacagcag mAb Cadeia / |Sequência
SEQ ID NO. cggctactac cactacaagt actacggcat ggccegtatag ggccagggca ccacegitgac cgtgagcage gecagcacea agggccececag cgtgttecee ctggeeceect gcagcagaag caccagcgag agcacegecg cectgggctg cctagigaag gactacttcc cegagecegt gacegtgagc tagaacageg gegeccetgac cageggegta cacacettee cegeegtget gcagagcagc ggccetataca gcctgageag cgtagtgace gtgcccagca gcaacttegg cacccagacc tacacctgca Erenumabe Leve / cagagcgtac tgacccagec ceccagegtg agegecgece SEQID Jceggecagaa ggtgaccatc agetgcageg gcagcageag NO: 156 |caacatcggc aacaactacg tgagctagta ccagcagcetga cceggeaceg cececaaget getgatetac gacaacaaca agagacccag cggcatceeoc gacagattca goggcagcaa gagcggcacc agcaccacec taggcateac cggectgcag accggegacg aggcegacta ctactgegge acctgggaca gcagactgag cgcegtggta tteggeggeg gcaccaaget BAN2401 Pesada/ |gaggtgcagc tagtggagag cageggceggce ctagtgcage SEQID |cceggeggcag cetgaggcta agctgcageg ccagegacett NO: 157 |caccttcagc agetteggca tacactgggt gaggcaggec cceggcaagg gcectagagta ggtggcectac attagcageg gcagcagcac catctactac ggegacaceg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca acgccaagaa cagcctatte ctgcagatga gcagcctgag ggcegaggac acegecgtat actactgcgc cagggagggce ggctactact acggcaggag gcaacaccaa ggtggacaag aaggtggagcccaagagcetgcegac +/- aagacccacacce (or aagacccaccta) +/- tacececectgeeeegee +/ cegagcetactaggegge BAN2401 Leve / gacgtggtga tgacccagag ccecectgage ctgceegtiga SEQID |cececggege cecegecage ateagetgca ggagcageca NO: 158 |gagcatcgtg cacagcaacg gcaacaccta cctagagtag tacctgcaga agcceggeca gagecececaag ctgctgatct acaaggtgag caacaggttc ageggegtge cegacagagtt cagcggcage ggcageggca cegactticac cetgaggate agcagggtgg aggccegagga cgtgggcate tactactgct tccagggcag ccacgtagecee cecacetteg geeceeggeac mAb Cadeia / |Sequência
SEQ ID NO. EO6-scFV Pesada/ |gaggtgaagc tagtagagag cggeggcggc ctagtgcage SEQID Jceggeggcag cetgaggcta agetagcgeca cragegagrett NO: 159 |caccttcagc gacttetaca tagagtgggt gaggcaggce cceggcaaga ggctgagagta gategecgec agcaggaaca aggccaacga ctacaccacc gagtacgceeg acagegtgaa gggcaggttc atcgtgagca gggacaccag ccagagcatc ctgtacctgc agatgaacgc cctgagggec gaggacaceg ccatcectacta ctgcgecagg gactactacg gcagcagceta EO6-scFV Leve / gacatecgtga tgacccagag ccccagcage ctgagcgtga SEQID [gcgceceggcaa gaaggatgacc atcagcetgca cegecagega NO: 160 |gagcctatac agcagcaagec acaaggtgca ctacctagec tggtaccaga agaagccega gcagagecec aagcetgctga tcetacggege cagcaacagg tacateggeg tacecogacag gttcacegge ageggcageg gcacegactt caccetgace atcagcagcg tgcaggtgga ggacctgacc cactactact gegeccagtt ctacagctac cecetgacet teggegeegg
EQUIVALENTES
[00873] Embora ainvenção seja descrita em detalhes com referência às modalidades específicas da mesma, entende-se que variações que são funcionalmente equivalentes incluem-se no escopo desta invenção. De fato, várias modificações da invenção além daquelas mostradas e descritos aqui se tornarão evidentes para aqueles versados na técnica a partir da descrição acima mencionada e desenhos de acompanhamento. Tais modificações devem incluir-se no escopo das reivindicações anexas. Aqueles versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de verificar o uso de não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas da invenção descritas aqui. Tais equivalentes devem ser abrangidos pelas reivindicações que seguem.
[00874] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados neste relatório descritivo são aqui incorporados por referência no relatório descritivo na mesma extensão como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado aqui por referência em suas íÍntegras.

Claims (26)

REIVINDICAÇÕES
1. Composição farmacêutica para o tratamento de doença de Alzheimer, enxaquecas, cefaleia em cacho, ou tauopatias incluindo encefalopatia traumática crônica, paralisia supranuclear progressiva, e demência frontotemporal em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, caracterizada pelo fato de compreender um vetor de vírus adenoassociado (AAV) que compreende: (a) um capsídeo viral que é pelo menos 95% idêntico à sequência de aminoácido de um capsídeo de AAV9 (SEQ ID NO: 78) ou AAVrhIO (SEQ ID NO: 80); e (b) um genoma artificial compreendendo um cassete de expressão flanqueado por repetições de terminal invertido de AAV (ITRs), em que o cassete de expressão compreende um transgene codificando um mAb anti-amiloide beta, anti-Tau, ou anti-CGRPR, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células do CNS humano; em que o referido vetor de AAV é formulado para administração intratecal ao CNS do referido indivíduo.
2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o mAb anti-amiloide É é Aducanumabe, Crenezumabe, BAN2401, ou Gantenerumabe e o mAb anti-Tau é aTAU e o anti-cCGRPR é Erenumabe, eptinezumabe, fremanezumabe, ou galcanezumabe.
3. Composição farmacêutica para o tratamento de psoríase, artrite psoriática, espondilite ancilosante, ou doença de Crohn em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, caracterizada pelo fato de compreender um vetor de AAV que compreende: (a) um capsídeo viral que é pelo menos 95% idêntico à sequência de aminoácido de um capsídeo de AAV8 (SEQ ID NO: 78)
ou capsídeo de AAV9 (SEQ ID NO: 79); e (b) um genoma artificial compreendendo um cassete de expressão flanqueado por ITRs de AAV em que o cassete de expressão compreende um transgene codificando um mAb anti-|LI7A ou anti- IL12/1123, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células de fígado humano ou em células de músculo humano; em que o referido vetor de AAV é formulado para administração intravenosa ao fígado ou músculo do referido indivíduo.
4. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o mAb anti-IL17A ou anti IL12/I1123 é IXequizumabe, Seciquinumabe, ou Ustequinumabe.
5. Composição farmacêutica para o tratamento de esclerose múltipla, colite ulcerativa ou doença de Crohn em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, caracterizada pelo fato de compreender um vetor de AAV compreendendo: (a) um capsídeo viral que é pelo menos 95% idêntico à sequência de aminoácido de um capsídeo de AAV8 (SEQ ID NO: 78), capsídeo de AAV9 (SEQ ID NO: 79), ou AAVrhlO (SEQ ID NO: 80); e (b) um genoma artificial compreendendo um cassete de expressão flanqueado por ITRs de AAV em que o cassete de expressão compreende um transgene codificando um mAb anti-integrina, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células de fígado humano, células musculares humanas ou células do CNS humano; em que o referido vetor de AAV é formulado para administração intravenosa ao fígado ou músculo do referido indivíduo ou administração intratecal ao CNS do referido indivíduo.
6. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o mAb anti-integrina é Vedolizumabe ou Natalizumabe.
7. Composição farmacêutica para o tratamento de dermatite atópica em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, caracterizada pelo fato de compreender vetor de AAV que compreende: (a) um capsídeo viral que é pelo menos 95% idêntico à sequência de aminoácido de um capsídeo de AAV8 (SEQ ID NO: 78) ou um capsídeo de AAV9 (SEQ ID NO: 79); e (b) um genoma artificial compreendendo um cassete de expressão flanqueado por ITRs de AAV em que o cassete de expressão compreende um transgene codificando um mAb anti-|L4R ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células de fígado ou células musculares humanas; em que o referido vetor de AAV é formulado para administração intravenosa ao fígado ou músculo do referido indivíduo.
8. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o mAb anti-IL-4R é Dupilumabe.
9. Composição farmacêutica para o tratamento de asma em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, caracterizada pelo fato de compreender um vetor de AAV que compreende: (a) um capsídeo viral que é pelo menos 95% idêntico à sequência de aminoácido de um capsídeo de AAV8 (SEQ ID NO: 78) ou um capsídeo de AAV9 (SEQ ID NO: 79); e (b) um genoma artificial compreendendo um cassete de expressão flanqueado por ITRs de AAV em que o cassete de expressão compreende um transgene codificando um mAb anti-IL-5, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células de fígado ou células musculares humanas; em que o referido vetor de AAV é formulado para administração intravenosa ao fígado ou músculo do referido indivíduo.
10. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o mAb anti-IL-5 é Mepolizumabe.
11. Composição farmacêutica para o tratamento de HeFH, HoFH, dislipidemia, doença cardiovascular incluindo doença cardiovascular — aterosclerótica = (ACD), formação de placa aterosclerótica, níveis anormalmente elevados de colesterol não HDL e LDL, estenose aórtica, estenose hepática, ou hipercolesterolemia em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, caracterizada pelo fato de compreender um vetor de AAV que compreende: (a) um capsídeo viral que é pelo menos 95% idêntico à sequência de aminoácido de um capsídeo de AAV8 (SEQ ID NO: 78) ou um capsídeo de AAV9 (SEQ ID NO: 79); e (b) um genoma artificial compreendendo um cassete de expressão flanqueado por repetições de terminal invertido de AAV (ITRs) em que o cassete de expressão compreende um transgene codificando um anti-PCSK9, anti-ANGPTL3, anti-OxPL mAb, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células de fígado ou células musculares humanas; em que o referido vetor de AAV é formulado para administração intravenosa ao fígado ou músculo do referido indivíduo.
12. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o mAb anti-PCSK9 ou anti-ANGPTL3 é Alirocumabe, Evolocumabe ou Evinacumabe ou de que o anti-OxPL é EO6.
13. Composição farmacêutica para o tratamento de osteoporose em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, caracterizada pelo fato de compreender um vetor de AAV que compreende: (a) um capsídeo viral que é pelo menos 95% idêntico à sequência de aminoácido de um capsídeo de AAV8 (SEQ ID NO: 78) ou capsídeo de AAV9 (SEQ ID NO: 79); e (b) um genoma artificial compreendendo um cassete de expressão flanqueado por ITRs de AAV em que o cassete de expressão compreende um transgene codificando um mAb anti-RANKL, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células de fígado ou células musculares humanas; em que o referido vetor de AAV é formulado para administração intravenosa ao fígado ou músculo do referido indivíduo.
14. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o mAb anti-RANLK é densomabe.
15. Composição farmacêutica para o tratamento de melanoma metastático, linfoma ou carcinoma de pulmão de célula não pequena em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, caracterizada pelo fato de compreender um vetor de AAV que compreende: (a) um capsídeo viral que é pelo menos 95% idêntico à sequência de aminoácido de um capsídeo de AAV8 (SEQ ID NO: 78) ou capsídeo de AAV9 (SEQ ID NO: 79); e (b) um genoma artificial compreendendo um cassete de expressão flanqueado por ITRs de AAV em que o cassete de expressão compreende um transgene codificando um mAb bloqueador de PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células de fígado ou células musculares humanas; em que o referido vetor de AAV é formulado para administração intravenosa ao fígado ou músculo do referido indivíduo.
16. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o mAb bloqueador de PD-1 é Nivolumabe ou Pembrolizumabe.
17. Composição farmacêutica para o tratamento de lúpus eritematoso sistêmico (SLE) em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, caracterizada pelo fato de compreender um vetor de AAV que compreende: (a) um capsídeo viral que é pelo menos 95% idêntico à sequência de aminoácido de um capsídeo de AAV8 (SEQ ID NO: 78) ou um capsídeo de AAV9 (SEQ ID NO: 79); e (b) um genoma artificial compreendendo um cassete de expressão flanqueado por ITRs de AAV em que o cassete de expressão compreende um transgene codificando um mMAb anti-BLyS, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células de fígado ou células musculares humanas; em que o referido vetor de AAV é formulado para administração intravenosa ao fígado ou músculo do referido indivíduo.
18. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o mMAb anti-BLyS é Belimumabe.
19. Composição farmacêutica para o tratamento de distúrbios oculares, incluindo degeneração macular relacionada com a idade, em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, caracterizada pelo fato de compreender um vetor de AAV que compreende:
(a) um capsídeo viral que é pelo menos 95% idêntico à sequência de aminoácido de um capsídeo de AAV8 (SEQ ID NO: 78) ou um capsídeo de AAV9 (SEQ ID NO: 79); e (b) um genoma artificial compreendendo um cassete de expressão flanqueado por ITRs de AAV em que o cassete de expressão compreende um transgene codificando um anti-VEGF, anti-MMP9, ou anti-fD mAb, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células retinais humanas; em que o referido vetor de AAV é formulado para administração sub-retinal, intravítrea ou supracoroidal ao olho do referido indivíduo.
20. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que o mAb anti-MMP9 é Andecaliximabe, o anticvEGF é Ranibizumabe, Bevacizumabe, Brolucizumabe, e o anti-fD é Lampalizumabe.
21. Composição farmacêutica para o tratamento de fibrose cística (CF), artrite reumatoide (RA), UC, CD, tumores sólidos, adenocarcinoma pancreático, adenocarcinoma de pulmão, carcinoma de célula escamosa pulmonar, adenocarcinoma esofagogástrico, câncer gástrico, câncer colorretal, ou câncer de mama em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, caracterizada pelo fato de compreender um vetor de AAV que compreende: (a) um capsídeo viral que é pelo menos 95% idêntico à sequência de aminoácido de um capsídeo de AAV8 (SEQ ID NO: 78) ou um capsídeo de AAV9 (SEQ ID NO: 79); e (b) um genoma artificial compreendendo um cassete de expressão flanqueado por ITRs de AAV em que o cassete de expressão compreende um transgene codificando um anti-MMP9 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células de fígado ou células musculares humanas; em que o referido vetor de AAV é formulado para administração intravenosa ao fígado ou músculo do referido indivíduo.
22. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que o anti-MMP9 mAb é Andecaliximabe.
23. Composição farmacêutica para o tratamento de angioedema hereditário em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, caracterizada pelo fato de compreender um vetor de AAV que compreende: (a) um capsídeo viral que é pelo menos 95% idêntico à sequência de aminoácido de um capsídeo de AAV8 (SEQ ID NO: 78) ou um capsídeo de AAV9 (SEQ ID NO: 79); e (b) um genoma artificial compreendendo um cassete de expressão flanqueado por ITRs de AAV em que o cassete de expressão compreende um transgene codificando uma anti-calicreína ou um fragmento de ligação ao antígeno da mesma, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células musculares humanas ou células de fígado humano; em que o referido vetor de AAV é formulado para administração intravenosa ao fígado ou músculo do referido indivíduo.
24. Composição de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que o mMAb anti-calidreína é Lanadelumabe.
25. Composição farmacêutica para o tratamento de artrite reumatoide, artrite psoriática, espondilite ancilosante, doença de Crohn, psoríase em placas, ou colite ulcerativa, em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, caracterizada pelo fato de compreender um vetor de AAV que compreende:
(a) um capsídeo viral que é pelo menos 95% idêntico à sequência de aminoácido de um capsídeo de AAV8 (SEQ ID NO: 78) ou capsídeo de AAV9 (SEQ ID NO: 79); e (b) um genoma artificial compreendendo um cassete de expressão flanqueado por ITRs de AAV em que o cassete de expressão compreende um transgene codificando um mAb anti-TNF-alfa, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias que controlam a expressão do transgene em células musculares ou de fígado humanas; em que o referido vetor de AAV é formulado para administração intravenosa ao fígado ou músculo do referido indivíduo.
26. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que o mAb anti-TNF-alfa é Adalimumabe ou Infliximabe
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Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2954767A1 (en) * 2014-07-14 2016-01-21 Amgen Inc. Crystalline antibody formulations
US12227567B2 (en) 2017-07-25 2025-02-18 Truebinding, Inc. Treating cancer by blocking the interaction of TIM-3 and its ligand
EP3727468A4 (en) 2017-12-19 2021-09-22 Akouos, Inc. AAV-MEDIATED THERAPEUTIC ANTIBODIES DELIVERY TO THE INTERNAL EAR
US20220042035A1 (en) * 2018-02-14 2022-02-10 Generation Bio Co. Non-viral dna vectors and uses thereof for antibody and fusion protein production
JP2021523702A (ja) * 2018-05-04 2021-09-09 オレゴン ヘルス アンド サイエンス ユニバーシティ ヒト抗ａａｖ２カプシドポリクローナル抗体エピトープ
WO2020123773A2 (en) * 2018-12-12 2020-06-18 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Anellosomes for delivering secreted therapeutic modalities
CN119390787A (zh) 2019-01-31 2025-02-07 俄勒冈健康与科学大学 用于aav衣壳的使用转录依赖性定向进化的方法
CA3137284A1 (en) * 2019-04-24 2020-10-29 Regenxbio Inc. Fully-human post-translationally modified antibody therapeutics
TW202106705A (zh) * 2019-04-29 2021-02-16 美商航海家醫療公司 用於tau蛋白病變之治療之組合物及方法
AR119271A1 (es) * 2019-06-11 2021-12-09 Shire Human Genetic Therapies Administración del vector viral adenoasociado para el tratamiento de enfermedades mediadas por la calicreína plasmática desregulada
WO2021015237A1 (ja) * 2019-07-24 2021-01-28 国立研究開発法人科学技術振興機構 抗体酵素の革新的製造技術
US20220298514A1 (en) * 2019-09-11 2022-09-22 Aav Gene Therapeutics, Inc. Aav-zyme and use for infusion replacement therapy
WO2021169167A1 (en) * 2020-02-29 2021-09-02 Nanjing GenScript Biotech Co., Ltd. Method for treating coronavirus infections
SE544001C2 (en) * 2020-03-17 2021-10-26 Xbrane Biopharma Ab Novel combination of tis sequences, signal peptide sequences and nucleic acid sequences encoding heavy and light chains of an antibody
SE544000C2 (en) * 2020-03-17 2021-10-26 Xbrane Biopharma Ab Novel combination of tis sequence, signal peptide sequence and nucleic acid sequence encoding a recombinant protein
WO2021242776A2 (en) 2020-05-26 2021-12-02 Truebinding, Inc. Methods of treating inflammatory diseases by blocking galectin-3
WO2022015960A2 (en) * 2020-07-17 2022-01-20 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Biomarkers and classifier of psoriasis and methods of treatment
EP4213890A1 (en) * 2020-09-15 2023-07-26 RegenxBio Inc. Vectorized lanadelumab and administration thereof
WO2022094157A1 (en) * 2020-10-28 2022-05-05 Regenxbio Inc. Vectorized anti-cgrp and anti-cgrpr antibodies and administration thereof
US20230390418A1 (en) * 2020-10-29 2023-12-07 Regenxbio Inc. Vectorized factor xii antibodies and administration thereof
CA3197936A1 (en) 2020-12-01 2022-06-09 Akouos, Inc. Anti-vegf antibody constructs and related methods for treating vestibular schwannoma associated symptoms
WO2022147087A1 (en) * 2020-12-29 2022-07-07 Regenxbio Inc. Tau-specific antibody gene therapy compositions, methods and uses thereof
AU2022211971A1 (en) 2021-01-29 2023-08-10 Illimis Therapeutics, Inc. Fusion molecule having non-inflammatory phagocytosis inducing activity
US20240091380A1 (en) 2021-02-01 2024-03-21 Regenxbio Inc. Gene therapy for neuronal ceroid lipofuscinoses
CN113651882B (zh) * 2021-08-04 2022-06-10 广州呼研所医药科技有限公司 人源化抗HAdV-B3单克隆中和抗体、制备方法及其应用
CN115772544B (zh) * 2021-09-06 2024-04-26 合肥星眸生物科技有限公司 抗vegf-a和ang-2的aav载体
CN116925234B (zh) * 2022-04-02 2024-05-31 合肥星眸生物科技有限公司 一种编码抗vegf-a和ang-2双特异性抗体的aav载体
IL316249A (en) * 2022-05-02 2024-12-01 Novo Nordisk As Novel anti-angptl3 antibodies suitable for high concentration compositions and subcutaneous administration
EP4518973A1 (en) * 2022-05-03 2025-03-12 RegenxBio Inc. Vectorized anti-tnf-alpha inhibitors for ocular indications
WO2024125530A1 (zh) * 2022-12-12 2024-06-20 苏州荷光科汇生物科技有限公司 一种感染视网膜的aav载体、阿达木单抗及其应用
WO2024224164A2 (en) * 2023-04-28 2024-10-31 Vectory B.V. Methods of treating oxidized phosphatidylcholine-associated diseases
CN119192369A (zh) * 2023-06-25 2024-12-27 百奥泰生物制药股份有限公司 抗angptl3抗体及其应用
WO2025073297A1 (zh) * 2023-10-06 2025-04-10 甘李药业股份有限公司 表达抗vegf融合蛋白的aav病毒载体及其用途
WO2025108407A2 (en) 2023-11-23 2025-05-30 Neuexcell Therapeutics (Suzhou) Co., Ltd. Gene therapy compositions and methods for treating glioma
WO2025113676A1 (en) 2023-11-29 2025-06-05 Neuexcell Therapeutics (Suzhou) Co., Ltd. Compositions and methods for treating stroke in primates

Family Cites Families (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994018317A1 (en) 1993-02-12 1994-08-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Regulated transcription of targeted genes and other biological events
EP0805819B1 (en) 1994-12-29 2012-02-08 Massachusetts Institute Of Technology Chimeric dna-binding proteins
CA2219080A1 (en) 1995-06-07 1996-12-27 Ariad Gene Therapeutics, Inc. Rapamycin-based regulation of biological events
CA2300376A1 (en) 1997-08-26 1999-03-04 Ariad Gene Therapeutics, Inc. Fusion proteins comprising a dimerization, trimerization or tetramerization domain and an additional heterologous transcription activation, transcription repression, dna binding or ligand binding domain
WO1999010508A1 (en) 1997-08-27 1999-03-04 Ariad Gene Therapeutics, Inc. Chimeric transcriptional activators and compositions and uses related thereto
EP1045915A2 (en) 1998-01-15 2000-10-25 Ariad Gene Therapeutics, Inc. Regulation of biological events using multimeric chimeric proteins
AU766513B2 (en) 1998-02-13 2003-10-16 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Novel dimerizing agents, their production and use
DK1204739T3 (da) 1999-08-09 2008-10-20 Targeted Genetics Corp Forögelse af ekspression af en enkeltstrenget, heterolog nukleotidsekvens fra rekombinante, virale vektorer ved en sådan udformning af sekvensen at den danner intrastrengbasepar
US7067526B1 (en) 1999-08-24 2006-06-27 Ariad Gene Therapeutics, Inc. 28-epirapalogs
PL220644B1 (pl) 2001-11-13 2015-11-30 Univ Pennsylvania Wirus stowarzyszony z adenowirusem (AAV), kompozycja, wyizolowane białko kapsydowe, wyizolowane lub syntetyczne cząsteczki kwasu nukleinowego, sposób wytwarzania zrekombinowanego wirusa, komórka gospodarza
US7198951B2 (en) * 2001-12-17 2007-04-03 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus (AAV) serotype 9 sequences, vectors containing same, and uses therefor
ES2717377T3 (es) 2001-12-17 2019-06-20 Univ Pennsylvania Secuencias de serotipo 8 de virus adeno-asociado (AAV), vectores que las contienen y usos de las mismas
CN1753693A (zh) * 2003-02-13 2006-03-29 辉瑞产品公司 抗－胰岛素样生长因子ⅰ受体抗体的用途
ES2874298T3 (es) 2003-09-30 2021-11-04 Univ Pennsylvania Clados de virus adenoasociados (AAV), secuencias, vectores que contienen el mismo, y usos de los mismos
ES2525143T3 (es) 2005-04-07 2014-12-18 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Cápsides de AAVrh.64 modificado, composiciones que las contienen y usos de las mismas
US7456683B2 (en) 2005-06-09 2008-11-25 Panasonic Corporation Amplitude error compensating device and quadrature skew error compensating device
FI20075278A0 (fi) * 2007-04-20 2007-04-20 Biotie Therapies Corp Uudet täysin ihmisperäiset anti-VAP-1 monoklonaaliset vasta-aineet
WO2010138263A2 (en) 2009-05-28 2010-12-02 University Of Massachusetts Novel aav 's and uses thereof
US20110020814A1 (en) * 2009-06-05 2011-01-27 Ipierian, Inc. Methods and compositions for selection of stem cells
BR112012024934A2 (pt) * 2010-03-29 2016-12-06 Univ Pennsylvania sistemas de ablação de transgene induzida farmacologicamente
US8927514B2 (en) 2010-04-30 2015-01-06 City Of Hope Recombinant adeno-associated vectors for targeted treatment
US8628966B2 (en) 2010-04-30 2014-01-14 City Of Hope CD34-derived recombinant adeno-associated vectors for stem cell transduction and systemic therapeutic gene transfer
CN103189507A (zh) 2010-10-27 2013-07-03 学校法人自治医科大学 用于向神经系统细胞导入基因的腺相关病毒粒子
DK2673289T3 (da) 2011-02-10 2023-07-24 Univ North Carolina Chapel Hill Virusvektorer med modificerede transduktionsprofiler og fremgangsmåder til fremstilling og anvendelse deraf
US9193956B2 (en) 2011-04-22 2015-11-24 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
TWI496886B (zh) * 2011-06-24 2015-08-21 Taipei Veteran General Hospital 提升感染性與惡性疾病之治療之免疫反應
EP3795581A3 (en) 2011-08-24 2021-06-09 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University New avv capsid proteins for nucleic acid transfer
EP2847337A4 (en) 2012-05-09 2016-04-27 Univ Oregon Health & Science ADENO ASSOCIATED VIRUS PLASMIDS AND VECTORS
CA2905952A1 (en) 2013-03-13 2014-10-02 The Children's Hospital Of Philadelphia Adeno-associated virus vectors and methods of use thereof
EP3594244A1 (en) * 2013-03-15 2020-01-15 Dyax Corp. Anti-plasma kallikrein antibodies
WO2015035190A1 (en) * 2013-09-05 2015-03-12 Cornell University Gene therapy for alzheimer's and other neurodegenerative diseases and conditions
EP3561062A1 (en) 2013-09-13 2019-10-30 California Institute of Technology Selective recovery
NZ718926A (en) 2013-10-11 2021-12-24 Massachusetts Eye & Ear Infirmary Methods of predicting ancestral virus sequences and uses thereof
JP6845012B2 (ja) * 2014-01-21 2021-03-17 ダイアックス コーポレーション 遺伝性血管浮腫の治療における血漿カリクレイン結合タンパク質およびその使用
GB201403684D0 (en) * 2014-03-03 2014-04-16 King S College London Vector
EP3134115A4 (en) * 2014-04-25 2017-10-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and compositions for treating metastatic breast cancer and other cancers in the brain
US10746742B2 (en) 2014-04-25 2020-08-18 Oregon Health & Science University Methods of viral neutralizing antibody epitope mapping
AU2015373910B2 (en) * 2015-01-02 2021-11-18 Takeda Pharmaceutical Company Limited Bispecific antibodies against plasma kallikrein and factor XII
US11535665B2 (en) * 2015-05-13 2022-12-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania AAV-mediated expression of anti-influenza antibodies and methods of use thereof
WO2017011773A2 (en) * 2015-07-15 2017-01-19 Modernatx, Inc. Codon-optimized nucleic acids encoding antibodies
SG10202107733QA (en) * 2015-09-28 2021-09-29 Univ North Carolina Chapel Hill Methods and compositions for antibody-evading virus vectors
BR112018008407A2 (pt) * 2015-10-28 2018-11-27 Univ Pennsylvania administração intratecal de vetores virais adenoassociados para terapia genética
EP3384015A4 (en) * 2015-12-01 2019-05-29 Spark Therapeutics, Inc. SCALABLE PROCESS FOR THE PREPARATION OF A RECOMBINANT ADENO ASSOCIATED VIRAL VECTOR IN A SERUM-FREE SUSPENSION CELL CULTURE SYSTEM SUITABLE FOR THE CLINICAL APPLICATION
WO2018075798A1 (en) 2016-10-19 2018-04-26 Adverum Biotechnologies, Inc. Modified aav capsids and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
AU2018350992A1 (en) 2020-05-21
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