BR112016024970B1

BR112016024970B1 - MICRO-ORGANISM AND METHOD FOR PRODUCING PUTRESCINE OR CADAVERINE

Info

Publication number: BR112016024970B1
Application number: BR112016024970-4A
Authority: BR
Inventors: Kyoung Min Lee; Su Jin Park; Hee Kyoung Jung; Young Lyeol Yang; Hong Xian Li; Hye Won Um
Original assignee: Cj Cheiljedang Corporation
Priority date: 2014-04-25
Filing date: 2015-03-27
Publication date: 2024-12-03

Abstract

MICROORGANISMOS PARA PRODUZIR DIAMINA E PROCESSO PARA PRODUZIR DIAMINA USANDO OS MESMOS. A presente invenção refere-se a um microorganismo para produzir diamina, em que a atividade de uma proteína tendo uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6 ou uma sequência de aminoácido tendo homologia de sequência de 42 % ou mais alta com a SEQ ID NO: 6 é introduzida ou realçada, e um método de produzir diamina usando o mesmo.MICROORGANISMS FOR PRODUCING DIAMINE AND PROCESS FOR PRODUCING DIAMINE USING THE SAME. The present invention relates to a microorganism for producing diamine, in which the activity of a protein having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 or an amino acid sequence having 42% or higher sequence homology to SEQ ID NO: 6 is introduced or enhanced, and a method of producing diamine using the same.

Description

Technical Field

[001]A presente divulgação refere-se a um micro-organismo para produzir diamina e um método de produzir diamina usando o mesmo.[001]The present disclosure relates to a microorganism for producing diamine and a method of producing diamine using the same.

Fundamentals of the Technique

[002]Aminas biogênicas (BAs) são compostos nitrogenosos que são principalmente produzidos por descarboxilação de aminoácidos ou por aminação e transaminação de aldeídos e cetonas. Estas aminas biogênicas são compostos de peso molecular baixo e sintetizadas no metabolismo de micro-organismos, plantas e animais, e assim aminas biogênicas são conhecidas como componentes frequentemente encontrados nestas células. Em particular, aminas biogênicas são poliaminas tais como espermidina, espermina, putrescina ou 1,4-butanodiamina, e cadaverina.[002]Biogenic amines (BAs) are nitrogenous compounds that are mainly produced by decarboxylation of amino acids or by amination and transamination of aldehydes and ketones. These biogenic amines are low molecular weight compounds and synthesized in the metabolism of microorganisms, plants and animals, and thus biogenic amines are known as components frequently found in these cells. In particular, biogenic amines are polyamines such as spermidine, spermine, putrescine or 1,4-butanediamine, and cadaverine.

[003]Em geral, putrescina é uma matéria-prima importante para a produção de poliamina náilon-4,6 que é produzida reagindo-se putrescina com ácido adípico. Putrescina é usualmente produzida por síntese química envolvendo a conversão de propileno à acrilonitrila e à succinonitrila.[003]In general, putrescine is an important raw material for the production of polyamine nylon-4,6 which is produced by reacting putrescine with adipic acid. Putrescine is usually produced by chemical synthesis involving the conversion of propylene to acrylonitrile and succinonitrile.

[004]Como um método de produção de putrescina usando um microorganismo, um método de produzir putrescina em uma concentração alta por transformação de E. coli e Corynebacterium foi relatado (Publicação de Patente Internacional No WO06/005603; Publicação de Patente Internacional No WO09/125924; Qian ZD et al., Biotechnol. Bioeng. 104: 4, 651 - 662, 2009; Schneider et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 88: 4, 859 - 868, 2010; Schneider et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 95, 169 - 178., 2012). Além disso, estudos foram ativamente conduzidos em transportadores de putrescina em células de E. coli, levedura, planta e animal (K Igarashi, Plant Physiol. Biochem. 48: 506 - 512, 2010).[004]As a method of producing putrescine using a microorganism, a method of producing putrescine at a high concentration by transforming E. coli and Corynebacterium has been reported (International Patent Publication No. WO06/005603; International Patent Publication No. WO09/125924; Qian Z.D. et al., Biotechnol. Bioeng. 104:4, 651 - 662, 2009; Schneider et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 88:4, 859 - 868, 2010; Schneider et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 95, 169 - 178., 2012). Furthermore, studies have been actively conducted on putrescine transporters in E. coli, yeast, plant and animal cells (K Igarashi, Plant Physiol. Biochem. 48: 506 - 512, 2010).

[005]Entretanto, cadaverina é um composto de diamina de odor fétido produzido por hidrólise de proteína durante a putrefação de tecidos animais. Cadaverina tem a fórmula química de NH2(CH2)5NH2, que é similar àquela de putrescina.[005]However, cadaverine is a foul-smelling diamine compound produced by protein hydrolysis during the putrefaction of animal tissues. Cadaverine has the chemical formula NH2(CH2)5NH2, which is similar to that of putrescine.

[006]Cadaverina serve como um componente de polímeros tais como poliamida ou poliuretano, agentes quelantes, ou outros aditivos. Em particular, poliamida tendo um mercado global anual de 3,5 milhões de toneladas é conhecido como sendo preparado por policondensação de cadaverina ou ácido succínico, e assim cadaverina tem recebido muita atenção como um composto industrialmente útil.[006]Cadaverine serves as a component of polymers such as polyamide or polyurethane, chelating agents, or other additives. In particular, polyamide having an annual global market of 3.5 million tons is known to be prepared by polycondensation of cadaverine or succinic acid, and thus cadaverine has received much attention as an industrially useful compound.

[007]Cadaverina é uma diamina encontrada em alguns micro-organismos (Tabor e Tabor, MicrobiolRev., 49:81 - 99, 1985). Na bactéria gram-negativa E. coli, cadaverina é biossintetizada a partir de L-lisina por L-lisina descarboxilase. O nível de cadaverina em E. coli é regulado por biossíntese, degradação, captação e exportação de cadaverina (Soksawatmaekhin et al., MolMicrobiol., 51:1401 - 1412, 2004).[007]Cadaverine is a diamine found in some microorganisms (Tabor and Tabor, MicrobiolRev., 49:81 - 99, 1985). In the gram-negative bacterium E. coli, cadaverine is biosynthesized from L-lysine by L-lysine decarboxylase. The level of cadaverine in E. coli is regulated by cadaverine biosynthesis, degradation, uptake, and export (Soksawatmaekhin et al., MolMicrobiol., 51:1401 - 1412, 2004).

Disclosure Technical Problem

[008]Os presentes inventores fizeram esforços intensos para investigar uma proteína tendo uma capacidade de exportar diamina tal como putrescina ou cadaverina de modo a melhorar a produtividade de diamina em um micro-organismo tendo a produtividade de diamina. Como um resultado, eles descobriram que uma proteína derivada de Arcanobacterium haemolyticum ou uma proteína tendo homologia de sequência de aminoácido alta com esta tem um atividade de exportação de diamina, e esta proteína é introduzida em um micro-organismo para produzir diamina para realçar sua atividade, resultando em um aumento notável na capacidade de exportar diamina tal como putrescina e cadaverina, desse modo concluindo a presente invenção.[008] The present inventors have made intensive efforts to investigate a protein having a diamine export ability such as putrescine or cadaverine so as to improve diamine productivity in a microorganism having diamine productivity. As a result, they have discovered that a protein derived from Arcanobacterium haemolyticum or a protein having high amino acid sequence homology thereto has a diamine export activity, and this protein is introduced into a microorganism to produce diamine to enhance its activity, resulting in a remarkable increase in the ability to export diamine such as putrescine and cadaverine, thereby completing the present invention.

Technical Solution

[009]Um objetivo da presente invenção é fornecer um micro-organismo para produzir diamina.[009] An object of the present invention is to provide a microorganism for producing diamine.

[010]Um outro objetivo da presente invenção é fornecer um método de produzir diamina, incluindo as etapas de (i) cultivar o micro-organismo para produzir diamina para obter uma cultura celular; e (ii) recuperar diamina a partir do microorganismo cultivado ou da cultura celular.[010] Another object of the present invention is to provide a method of producing diamine, including the steps of (i) culturing the microorganism to produce diamine to obtain a cell culture; and (ii) recovering diamine from the cultured microorganism or the cell culture.

Best Mode

[011]Em um aspecto para obter os objetivos acima, a presente invenção fornece um micro-organismo para produzir diamina, em que a atividade de uma proteína tendo uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6 ou uma sequência de aminoácido tendo homologia de sequência de 42 % ou mais alta com a SEQ ID NO: 6 é introduzida ou realçada.[011] In one aspect to achieve the above objectives, the present invention provides a microorganism for producing diamine, wherein the activity of a protein having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 or an amino acid sequence having 42% or higher sequence homology to SEQ ID NO: 6 is introduced or enhanced.

[012]Como usado aqui, o termo “diamina” coletivamente refere-se a um composto tendo dois grupos amina, e exemplos específicos deste pode incluir putrescina e cadaverina. Putrescina é tetrametilenodiamina que pode ser produzida a partir de ornitina como um precursor. Cadaverina é chamada 1,5-pentanodiamina ou pentametilenodiamina, que pode ser produzida a partir de lisina como um precursor. Tais diaminas são compostos industrialmente aplicáveis que servem como matérias-primas valiosas para a síntese de polímeros tais como poliamina náilon, poliamida ou poliuretano.[012]As used herein, the term “diamine” collectively refers to a compound having two amine groups, and specific examples thereof may include putrescine and cadaverine. Putrescine is tetramethylenediamine that can be produced from ornithine as a precursor. Cadaverine is called 1,5-pentanediamine or pentamethylenediamine, which can be produced from lysine as a precursor. Such diamines are industrially applicable compounds that serve as valuable raw materials for the synthesis of polymers such as polyamine, nylon, polyamide or polyurethane.

[013]Como usado aqui, o termo “proteína tendo uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6” é uma proteína encontrada em Arcanobacterium haemolyticum, e também chamada ARCH_0271. Foi investigado que esta proteína mantém a homologia alta com uma proteína de membrana de Corynebacterium, NCgl2522. Em uma forma de realização da presente invenção, a proteína ARCH_0271 é identificada como uma proteína putativa que está envolvida na exportação de diamina em uma cepa tendo produtividade de diamina, desse modo aumentando notavelmente a produtividade de diamina.[013] As used herein, the term “protein having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 6” is a protein found in Arcanobacterium haemolyticum, and also called ARCH_0271. It has been investigated that this protein maintains high homology with a membrane protein of Corynebacterium, NCgl2522. In one embodiment of the present invention, the ARCH_0271 protein is identified as a putative protein that is involved in diamine export in a strain having diamine productivity, thereby notably increasing diamine productivity.

[014]Aqui, a proteína ARCH_0271 tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6 pode ser uma proteína que é codificada por uma sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7. No polinucleotídeo que codifica a proteína ARCH_0271, entretanto, várias modificações podem ser feitas na região de codificação contanto que elas não mudem a sequência de aminoácido do polipeptídeo expressado a partir da região de codificação, devido à degeneração de códon ou em consideração dos códons preferidos por um organismo em que a proteína deve ser expressada. Assim, a proteína CE2495 pode ser codificada por várias sequências de nucleotídeo assim como pela sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7. Delas, a sequência de nucleotídeo representada pela SEQ ID NO. 7 é uma sequência preparada otimizando-se o gene de ARCH_0271 (SEQ ID NO. 5) para uso de códon de Corynebacterium glutamicum, mas não é limitada a esta.[014] Here, the ARCH_0271 protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 may be a protein that is encoded by a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7. In the polynucleotide encoding the ARCH_0271 protein, however, various modifications may be made in the coding region as long as they do not change the amino acid sequence of the polypeptide expressed from the coding region, due to codon degeneracy or in consideration of the codons preferred by an organism in which the protein is to be expressed. Thus, the CE2495 protein may be encoded by various nucleotide sequences as well as by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7. Of these, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO. 7 is a sequence prepared by optimizing the ARCH_0271 gene (SEQ ID NO. 5) for codon usage of Corynebacterium glutamicum, but is not limited to it.

[015]Além disso, a proteína ARCH_0271 da presente invenção pode ser qualquer proteína tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6, ou tendo homologia de 40 % ou mais alta, preferivelmente 60 % ou mais alta, mais preferivelmente 80 % ou mais alta, muito mais preferivelmente 90 % ou mais alta, ainda muito mais preferivelmente 95 % ou mais alta, e o mais preferivelmente 99 % ou mais alta com esta, contanto que a proteína exiba uma atividade de exportação de diamina substancial. É evidente que uma sequência de aminoácido tendo tal homologia, da qual uma parte é suprimida, modificada, substituída, ou adicionada, também está dentro do escopo da presente invenção, contanto que a sequência de aminoácido resultante tenha uma atividade biológica substancialmente equivalente ou correspondendo à proteína da SEQ ID NO: 6.[015] Furthermore, the ARCH_0271 protein of the present invention may be any protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, or having 40% or higher, preferably 60% or higher, more preferably 80% or higher, much more preferably 90% or higher, still more preferably 95% or higher, and most preferably 99% or higher homology thereto, provided that the protein exhibits substantial diamine export activity. It is evident that an amino acid sequence having such homology, of which a portion is deleted, modified, substituted, or added, is also within the scope of the present invention, provided that the resulting amino acid sequence has a biological activity substantially equivalent to or corresponding to the protein of SEQ ID NO: 6.

[016]Como usado aqui, o termo “proteína tendo uma sequência de aminoácido tendo homologia de sequência de 42 % ou mais alta com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6” significa qualquer proteína sem limitação, contanto que a proteína tenha uma sequência de aminoácido tendo homologia de sequência de 42 % ou mais alta com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6 e ela também tenha substancialmente atividade de exportação de diamina. Por exemplo, a proteína pode ser uma proteína tendo uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 26, mas não é limitada a esta.[016] As used herein, the term “protein having an amino acid sequence having 42% or higher sequence homology to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6” means any protein without limitation, provided that the protein has an amino acid sequence having 42% or higher sequence homology to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and it also has substantially diamine export activity. For example, the protein may be a protein having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 26, but is not limited thereto.

[017]Por exemplo, a proteína tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 23 é uma proteína encontrada em Alcaligenes faecalis subsp. faecalis, e também chamada QWA_00075. Foi investigado que esta proteína mantém 41 % de homologia com uma proteína de membrana de Corynebacterium, NCgl2522 e 42 % de homologia com ARCH_0271 de Arcanobacterium haemolyticum. Em uma forma de realização da presente invenção, foi investigado que a proteína QWA_00075 exibe atividade de exportação de diamina em uma cepa tendo produtividade de diamina, desse modo aumentando notavelmente a produtividade de diamina.[017] For example, the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 is a protein found in Alcaligenes faecalis subsp. faecalis, and also called QWA_00075. It has been investigated that this protein maintains 41% homology with a membrane protein of Corynebacterium, NCgl2522, and 42% homology with ARCH_0271 of Arcanobacterium haemolyticum. In an embodiment of the present invention, it has been investigated that the QWA_00075 protein exhibits diamine export activity in a strain having diamine productivity, thereby notably increasing the diamine productivity.

[018]A proteína QWA_00075 tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 23 pode ser uma proteína que é codificada por uma sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 22 ou 24. No polinucleotídeo que codifica esta proteína, entretanto, várias modificações podem ser feitas na região de codificação contanto que elas não mudem a sequência de aminoácido do polipeptídeo expressado a partir da região de codificação, devido à degeneração de códon ou em consideração dos códons preferidos por um organismo em que a proteína deve ser expressada. Assim, esta proteína pode ser codificada por várias sequências de nucleotídeo assim como pela sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 22 ou 24. Delas, a sequência de nucleotídeo representada pela SEQ ID NO: 24 é uma sequência preparada otimizando-se o gene de QWA_00075 (SEQ ID NO: 22) para uso de códon de Corynebacterium glutamicum, mas não é limitada a esta.[018]The QWA_00075 protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 may be a protein that is encoded by a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 22 or 24. In the polynucleotide encoding this protein, however, various modifications may be made in the coding region as long as they do not change the amino acid sequence of the polypeptide expressed from the coding region, due to codon degeneracy or in consideration of the codons preferred by an organism in which the protein is to be expressed. Thus, this protein can be encoded by several nucleotide sequences as well as by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 22 or 24. Of them, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 24 is a sequence prepared by optimizing the QWA_00075 gene (SEQ ID NO: 22) for codon usage of Corynebacterium glutamicum, but is not limited to it.

[019]Além disso, a proteína tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 26 é uma proteína encontrada em Stenotrophomonas maltophilia, e também chamada SMD_2351. Foi investigado que esta proteína mantém 52 % de homologia com uma proteína de membrana de Corynebacterium, NCgl2522 e 47 % de homologia com ARCH_0271 de Arcanobacterium haemolyticum. Em uma forma de realização da presente invenção, foi investigado que a proteína SMD_2351 exibe atividade de exportação de diamina em uma cepa tendo produtividade de diamina, desse modo aumentando notavelmente a produtividade de diamina.[019] Further, the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26 is a protein found in Stenotrophomonas maltophilia, and also called SMD_2351. It has been investigated that this protein maintains 52% homology with a membrane protein of Corynebacterium, NCgl2522, and 47% homology with ARCH_0271 of Arcanobacterium haemolyticum. In an embodiment of the present invention, it has been investigated that the SMD_2351 protein exhibits diamine export activity in a strain having diamine productivity, thereby notably increasing the diamine productivity.

[020]A proteína SMD_2351 tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 26 pode ser uma proteína que é codificada por uma sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 25 ou 27. No polinucleotídeo que codifica esta proteína, entretanto, várias modificações podem ser feitas na região de codificação contanto que elas não mudem a sequência de aminoácido do polipeptídeo expressado a partir da região de codificação, devido à degeneração de códon ou em consideração dos códons preferidos por um organismo em que a proteína deve ser expressada. Assim, esta proteína pode ser codificada por várias sequências de nucleotídeo assim como pela sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 25 ou 27. Delas, a sequência de nucleotídeo representada pela SEQ ID NO: 27 é uma sequência preparada otimizando-se o gene de SMD_2351 (SEQ ID NO: 25) para uso de códon de Corynebacterium glutamicum, mas não é limitada a esta.[020]The SMD_2351 protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26 may be a protein that is encoded by a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 25 or 27. In the polynucleotide encoding this protein, however, various modifications may be made in the coding region as long as they do not change the amino acid sequence of the polypeptide expressed from the coding region, due to codon degeneracy or in consideration of the codons preferred by an organism in which the protein is to be expressed. Thus, this protein can be encoded by several nucleotide sequences as well as by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 25 or 27. Of them, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 27 is a sequence prepared by optimizing the SMD_2351 gene (SEQ ID NO: 25) for codon usage of Corynebacterium glutamicum, but is not limited to it.

[021]O termo “homologia”, como usado aqui com referência a uma sequência, refere-se à identidade com uma sequência de aminoácido ou sequência de nucleotídeo dada, e a homologia pode ser expressada como uma porcentagem. Na presente invenção, uma sequência de homologia tendo atividade idêntica ou similar à sequência de aminoácido ou sequência de nucleotídeo dada é expressada como “% de homologia”. Por exemplo, homologia pode ser identificada usando um programa de software padrão que calcula parâmetros de contagem, identidade e similaridade, especificamente BLAST 2.0, ou comparando-se sequências em um experimento de hibridização de Southern sob condições severas como definido. Definir as condições de hibridização apropriadas está dentro da habilidade da técnica (por exemplo, ver Sambrook et al., 1989, infra), e é determinado por um método conhecido àqueles habilitados na técnica.[021] The term “homology,” as used herein with reference to a sequence, refers to identity with a given amino acid sequence or nucleotide sequence, and homology may be expressed as a percentage. In the present invention, a homology sequence having identical or similar activity to the given amino acid sequence or nucleotide sequence is expressed as “% homology.” For example, homology may be identified using a standard software program that calculates counting, identity, and similarity parameters, specifically BLAST 2.0, or by comparing sequences in a Southern hybridization experiment under stringent conditions as defined. Defining appropriate hybridization conditions is within the skill of the art (e.g., see Sambrook et al., 1989, infra), and is determined by a method known to those skilled in the art.

[022]Como usado aqui, o termo “micro-organismo para produzir diamina” refere-se a um micro-organismo preparado fornecendo-se produtividade de diamina para uma cepa precursora não tendo nenhuma produtividade de diamina ou um micro-organismo tendo produtividade de diamina endógena. Especificamente, o micro-organismo tendo produtividade de diamina pode ser um micro-organismo tendo produtividade de putrescina ou cadaverina.[022]As used herein, the term “diamine-producing microorganism” refers to a microorganism prepared by providing diamine productivity to a parent strain having no diamine productivity or a microorganism having endogenous diamine productivity. Specifically, the microorganism having diamine productivity may be a microorganism having putrescine or cadaverine productivity.

[023]O “micro-organismo tendo produtividade de putrescina” pode ser, mas não é limitado a, um micro-organismo em que a atividade de acetilglutamato sintase que converte glutamato a N-acetilglutamato, ornitina acetiltransferase (ArgJ) que converte acetil ornitina à ornitina, acetilglutamato cinase (ArgB) que converte acetil glutamato à N-acetilglutamil fosfato, acetil-gama-glutamil-fosfato redutase (ArgC) que converte acetil glutamil fosfato a semialdeído de N-acetil glutamato, ou acetilornitina aminotransferase (ArgD) que converte semialdeído de acetil glutamato à N- acetilornitina é realçada comparada à sua atividade endógena, de modo a realçar a via biossintética de glutamato à ornitina, e a produtividade de ornitina que é usada como um precursor para biossíntese de putrescina é realçada, mas não é limitada a esta.[023]The “microorganism having putrescine productivity” may be, but is not limited to, a microorganism in which the activity of acetylglutamate synthase that converts glutamate to N-acetylglutamate, ornithine acetyltransferase (ArgJ) that converts acetyl ornithine to ornithine, acetylglutamate kinase (ArgB) that converts acetyl glutamate to N-acetylglutamate phosphate, acetyl-gamma-glutamyl-phosphate reductase (ArgC) that converts acetyl glutamate phosphate to N-acetyl glutamate semialdehyde, or acetylornithine aminotransferase (ArgD) that converts acetyl glutamate semialdehyde to N-acetylornithine is enhanced compared to its endogenous activity, so as to enhance the glutamate to ornithine biosynthetic pathway, and the productivity of ornithine which is used as a precursor for putrescine biosynthesis is highlighted, but is not limited to this.

[024]Além disso, o micro-organismo tendo produtividade de putrescina pode ser um micro-organismo que é modificado para ter atividade de ornitina carbamoil transferase (ArgF) envolvida na síntese de arginina a partir de ornitina, uma proteína (NCgl1221) envolvida na exportação de glutamato, e/ou uma proteína (NCgl469) envolvida na acetilação de putrescina mais fraca do que sua atividade endógena, e/ou é modificada para ser introduzida com atividade de ornitina descarboxilase (ODC).[024]Furthermore, the microorganism having putrescine productivity may be a microorganism that is engineered to have ornithine carbamoyl transferase (ArgF) activity involved in the synthesis of arginine from ornithine, a protein (NCgl1221) involved in glutamate export, and/or a protein (NCgl469) involved in the acetylation of putrescine weaker than its endogenous activity, and/or is engineered to be introduced with ornithine decarboxylase (ODC) activity.

[025]Aqui, como exemplos não limitantes, a acetil gama glutamil fosfato redutase (ArgC) pode ter uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 15, a acetilglutamato sintase ou ornitina acetiltransferase (ArgJ) pode ter uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 16, a acetil glutamato cinase (ArgB) pode ter uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 17, e a acetilornitina aminotransferase (ArgD) pode ter uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 18. Entretanto, as sequências de aminoácido das respectivas proteínas enzimáticas não são particularmente limitadas a estas, e as enzimas podem ser proteínas tendo sequências de aminoácido tendo homologia de 80 % ou mais alta, preferivelmente 90 % ou mais alta, ou mais preferivelmente 95 % ou mais alta com estas, contanto que elas tenham atividades das respectivas enzimas.[025] Here, as non-limiting examples, acetyl gamma glutamyl phosphate reductase (ArgC) may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, acetylglutamate synthase or ornithine acetyltransferase (ArgJ) may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, acetyl glutamate kinase (ArgB) may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, and acetylornithine aminotransferase (ArgD) may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 18. However, the amino acid sequences of the respective enzyme proteins are not particularly limited to these, and the enzymes may be proteins having amino acid sequences having 80% or higher, preferably 90% or higher, or more preferably 95% or higher homology thereto, provided that they have activities of the respective enzymes.

[026]Além disso, como exemplos não limitantes, a ornitina carbamoil transferase (ArgF) pode ter uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 19, a proteína envolvida na exportação de glutamato pode ter uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 20, e ornitina descarboxilase (ODC) pode ter uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 21. Entretanto, as sequências de aminoácido das respectivas proteínas enzimáticas não são particularmente limitadas a estas, e as enzimas podem incluir sequências de aminoácido tendo homologia de 80 % ou mais alta, preferivelmente 90 % ou mais alta, mais preferivelmente 95 % ou mais alta, ou particular e preferivelmente 97 % ou mais alta com estas, contanto que elas tenham atividades das respectivas enzimas.[026] Furthermore, as non-limiting examples, ornithine carbamoyl transferase (ArgF) may have an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, the protein involved in glutamate export may have an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20, and ornithine decarboxylase (ODC) may have an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21. However, the amino acid sequences of the respective enzyme proteins are not particularly limited to these, and the enzymes may include amino acid sequences having 80% or higher, preferably 90% or higher, more preferably 95% or higher, or particularly and preferably 97% or higher homology thereto, provided that they have activities of the respective enzymes.

[027]Entretanto, o “micro-organismo tendo produtividade de cadaverina” pode ser, mas não é limitado a, um micro-organismo preparado introduzindo-se ou realçando-se adicionalmente a atividade de lisina descarboxilase (LDC) em um micro-organismo tendo produtividade de lisina. Por exemplo, o micro-organismo pode ser um tendo produtividade de lisina realçada de modo a aumentar a produção de cadaverina. Um método de realçar a produtividade de lisina pode ser realizada por um método conhecido que é previsível àqueles habilitados na técnica.[027]However, the “microorganism having cadaverine productivity” can be, but is not limited to, a microorganism prepared by introducing or further enhancing lysine decarboxylase (LDC) activity into a microorganism having lysine productivity. For example, the microorganism can be one having enhanced lysine productivity so as to increase cadaverine production. A method of enhancing lysine productivity can be carried out by a known method that is predictable to those skilled in the art.

[028]A lisina descarboxilase é uma enzima que catalisa a conversão de lisina à cadaverina, e sua atividade é introduzida ou realçada, desse modo eficazmente produzindo cadaverina.[028]Lysine decarboxylase is an enzyme that catalyzes the conversion of lysine to cadaverine, and its activity is introduced or enhanced, thereby effectively producing cadaverine.

[029]A lisina descarboxilase pode ter uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 33, mas não é particularmente limitada a esta. A enzima pode ter uma sequência de aminoácido tendo homologia de 80 % ou mais alta, preferivelmente 90 % ou mais alta, ou mais preferivelmente 95 % ou mais alta com esta, contanto que ela tenha a atividade acima.[029]The lysine decarboxylase may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, but is not particularly limited thereto. The enzyme may have an amino acid sequence having 80% or higher, preferably 90% or higher, or more preferably 95% or higher homology thereto, provided that it has the above activity.

[030]Como usado aqui, o termo “produção” é um conceito que inclui liberação extracelular de diamina, por exemplo, liberação de diamina em um meio de cultura, assim como produção de diamina dentro de um micro-organismo.[030]As used herein, the term “production” is a concept that includes extracellular release of diamine, for example, release of diamine into a culture medium, as well as production of diamine within a microorganism.

[031]Entretanto, o termo “introdução de atividade de proteína”, como usado aqui, significa que um micro-organismo não tendo nenhuma proteína endógena é externamente fornecido com uma atividade da proteína, e por exemplo, ela pode ser realizada por introdução de um gene exógeno. Além disso, o termo “realce da atividade de proteína” significa que o estado ativo da proteína retida ou introduzida no micro-organismo é realçado, comparado ao seu estado ativo intrínseco.[031]However, the term “introduction of protein activity” as used herein means that a microorganism having no endogenous protein is externally provided with a protein activity, and for example, this may be accomplished by introduction of an exogenous gene. Furthermore, the term “enhancement of protein activity” means that the active state of the protein retained or introduced into the microorganism is enhanced, compared to its intrinsic active state.

[032]Exemplos não limitantes da introdução ou realce da atividade de proteína podem incluir melhora da atividade da proteína propriamente dita presente em um micro-organismo devido à mutação de modo a obter efeitos além das funções endógenas, e/ou melhora na atividade de gene endógeno da proteína presente no micro-organismo, amplificação do gene endógeno por fatores internos ou externos, aumento no número de cópia de gene, aumento na atividade por introdução adicional de um gene exógeno ou substituição ou modificação de um promotor, mas não são limitados a estes.[032] Non-limiting examples of the introduction or enhancement of protein activity may include, but are not limited to, improvement of the activity of the protein itself present in a microorganism due to mutation so as to obtain effects beyond endogenous functions, and/or improvement in the activity of the endogenous gene of the protein present in the microorganism, amplification of the endogenous gene by internal or external factors, increase in gene copy number, increase in activity by additional introduction of an exogenous gene or replacement or modification of a promoter.

[033]O aumento no número de cópia de gene pode ser, mas não é particularmente limitado a, realizado ligando-se operavelmente o gene a um vetor ou integrando-o no genoma da célula hospedeira. Especificamente, o número de cópia do polinucleotídeo no genoma da célula hospedeira pode ser aumentado introduzindo-se na célula hospedeira o vetor que é operavelmente ligado ao polinucleotídeo que codifica a proteína da presente invenção e replica e funciona independentemente da célula hospedeira, ou introduzindo-se na célula hospedeira o vetor que é operavelmente ligado ao polinucleotídeo e é capaz de integrar o polinucleotídeo no genoma da célula hospedeira.[033] Increasing the gene copy number can be, but is not particularly limited to, accomplished by operably linking the gene to a vector or integrating it into the genome of the host cell. Specifically, the copy number of the polynucleotide in the genome of the host cell can be increased by introducing into the host cell the vector that is operably linked to the polynucleotide encoding the protein of the present invention and replicates and functions independently of the host cell, or by introducing into the host cell the vector that is operably linked to the polynucleotide and is capable of integrating the polynucleotide into the genome of the host cell.

[034]Como usado aqui, “modificação da sequência reguladora de expressão para aumentar a expressão de polinucleotídeo” pode ser, mas não é particularmente limitado a, feita induzindo-se uma modificação na sequência reguladora de expressão através de supressão, inserção, substituição não conservativa ou conservativa de sequência de nucleotídeo, ou um combinação destes de modo a realçar ainda a atividade da sequência reguladora de expressão, ou substituindo-se a sequência reguladora de expressão com uma sequência de nucleotídeo tendo atividade mais forte. A sequência reguladora de expressão inclui, mas não é particularmente limitada a, um promotor, uma sequência operadora, uma sequência que codifica um sítio de ligação ao ribossomo, e uma sequência que regula a terminação da transcrição e tradução.[034] As used herein, “modification of the expression regulatory sequence to increase polynucleotide expression” may be, but is not particularly limited to, made by inducing a modification in the expression regulatory sequence through deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution of nucleotide sequence, or a combination thereof so as to further enhance the activity of the expression regulatory sequence, or by replacing the expression regulatory sequence with a nucleotide sequence having stronger activity. The expression regulatory sequence includes, but is not particularly limited to, a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosome binding site, and a sequence regulating the termination of transcription and translation.

[035]Como usado aqui, a substituição ou modificação de um promotor, embora não particularmente limitada a estas, podem ser realizadas por substituição ou modificação com um promotor mais forte do que o promotor original. Um promotor heterólogo forte ao invés do promotor original pode ser ligado a montante da unidade de expressão de polinucleotídeo, e exemplos do promotor forte podem incluir um promotor CJ7, um promotor lysCP1, um promotor EF-Tu, um promotor groEL, um promotor aceA ou aceB, e especificamente, um promotor derivado de Corynebacterium, promotor lysCP1 ou promotor CJ7 é operavelmente ligado ao polinucleotídeo que codifica a enzima de modo que sua taxa de expressão possa ser aumentada. Aqui, o promotor lysCP1 é um promotor melhorado através de substituição de sequência de nucleotídeo da região promotora do polinucleotídeo que codifica aspartato cinase e aspartato semialdeído desidrogenase (WO 2009/096689). Além disso, o promotor CJ7 é um promotor forte derivado a partir de Corynebacterium ammoniagenes(Patente Coreana No 0620092 e WO 2006/065095).[035] As used herein, replacement or modification of a promoter, although not particularly limited thereto, may be accomplished by replacement or modification with a stronger promoter than the original promoter. A strong heterologous promoter instead of the original promoter may be ligated upstream of the polynucleotide expression unit, and examples of the strong promoter may include a CJ7 promoter, a lysCP1 promoter, an EF-Tu promoter, a groEL promoter, an aceA or aceB promoter, and specifically, a Corynebacterium-derived promoter, lysCP1 promoter or CJ7 promoter is operably linked to the polynucleotide encoding the enzyme so that its expression rate may be increased. Here, the lysCP1 promoter is an improved promoter by nucleotide sequence replacement of the promoter region of the polynucleotide encoding aspartate kinase and aspartate semialdehyde dehydrogenase (WO 2009/096689). Furthermore, the CJ7 promoter is a strong promoter derived from Corynebacterium ammoniagenes (Korean Patent No. 0620092 and WO 2006/065095).

[036]Além disso, a modificação de uma sequência de polinucleotídeo no cromossomo, embora não particularmente limitada a esta, pode ser realizada induzindo-se uma mutação na sequência reguladora de expressão através de supressão, inserção, substituição não conservativa ou conservativa da sequência de polinucleotídeo, ou uma combinação destas de modo a realçar ainda a atividade da sequência de polinucleotídeo, ou substituindo-se a sequência com uma sequência de polinucleotídeo que é modificada para ter atividade mais forte.[036] Furthermore, modification of a polynucleotide sequence in the chromosome, although not particularly limited thereto, can be accomplished by inducing a mutation in the expression regulatory sequence through deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution of the polynucleotide sequence, or a combination thereof so as to further enhance the activity of the polynucleotide sequence, or by replacing the sequence with a polynucleotide sequence that is modified to have stronger activity.

[037]Como usado aqui, o termo “vetor” refere-se a uma construção de DNA incluindo uma sequência de nucleotídeo que codifica a proteína desejada, que é operavelmente ligada a uma sequência reguladora de expressão apropriada para expressar a proteína desejada em uma célula hospedeira adequada. A sequência reguladora pode incluir um promotor que pode iniciar a transcrição, uma sequência operadora opcional para regular a transcrição, uma sequência que codifica um sítio de ligação ao ribossomo de mRNA adequado, e uma sequência que regula a terminação da transcrição e tradução. Depois que o vetor é introduzido na célula hospedeira adequada, ele pode replicar ou funcionar independentemente do genoma hospedeiro, e pode ser integrado no genoma propriamente dito.[037] As used herein, the term “vector” refers to a DNA construct including a nucleotide sequence encoding the desired protein, which is operably linked to an appropriate expression regulatory sequence to express the desired protein in a suitable host cell. The regulatory sequence may include a promoter that can initiate transcription, an optional operator sequence to regulate transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and a sequence that regulates the termination of transcription and translation. Once the vector is introduced into the suitable host cell, it can replicate or function independently of the host genome, and can be integrated into the genome itself.

[038]O vetor usado na presente invenção não é particularmente limitado, contanto que ele seja capaz de replicar na célula hospedeira, e qualquer vetor conhecido na técnica pode ser usado. Exemplos de vetores convencionais podem incluir um plasmídeo natural ou recombinante, cosmídeo, vírus e bacteriófago. Por exemplo, pWE15, M13, ÀMBL3, ÀMBL4, ÀIXII, ÀASHII, ÀAPII, Àt10, Àt11, Charon4A, e Charon21A podem ser usados como um vetor de fago ou vetor de cosmídeo. O tipo pBR, tipo pUC, tipo pBluescriptII, tipo pGEM, tipo pTZ, tipo pCL e tipo pET podem ser usados como um vetor de plasmídeo. Um vetor utilizável na presente invenção não é particularmente limitado, e qualquer vetor de expressão conhecido pode ser usado. Preferivelmente, o vetor pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, ou pCC1BAC pode ser usado.[038] The vector used in the present invention is not particularly limited, as long as it is capable of replicating in the host cell, and any vector known in the art can be used. Examples of conventional vectors may include a natural or recombinant plasmid, cosmid, virus, and bacteriophage. For example, pWE15, M13, ΔMBL3, ΔMBL4, ΔIXII, ΔASHII, ΔAPII, Δt10, Δt11, Charon4A, and Charon21A can be used as a phage vector or cosmid vector. pBR type, pUC type, pBluescriptII type, pGEM type, pTZ type, pCL type, and pET type can be used as a plasmid vector. A vector usable in the present invention is not particularly limited, and any known expression vector can be used. Preferably, the vector pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, or pCC1BAC can be used.

[039]Além disso, o polinucleotídeo que codifica a proteína endógena desejada no cromossomo pode ser substituído por um polinucleotídeo mutado usando um vetor para inserção cromossômica bacteriana. A inserção do polinucleotídeo no cromossomo pode ser realizada por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, recombinação homóloga. Visto que o vetor da presente invenção pode ser inserido no cromossomo por recombinação homóloga, ele pode incluir ainda um marcador de seleção para confirmar a inserção cromossômica. O marcador de seleção deve selecionar células que são transformadas com o vetor, isto é, para confirmar a inserção do polinucleotídeo desejado, e o marcador de seleção pode incluir marcadores fornecendo fenótipos selecionáveis, tais como resistência a fármaco, auxotrofia, resistência a agentes citotóxicos, ou expressão de proteína superficial. Apenas células que expressam o marcador de seleção são capazes de sobreviver ou de mostrar fenótipos diferentes sob o ambiente tratado com o agente seletivo, e assim as células transformadas podem ser selecionadas.[039] Furthermore, the polynucleotide encoding the desired endogenous protein in the chromosome may be replaced by a mutated polynucleotide using a vector for bacterial chromosomal insertion. The insertion of the polynucleotide into the chromosome may be carried out by any method known in the art, for example, homologous recombination. Since the vector of the present invention may be inserted into the chromosome by homologous recombination, it may further include a selection marker to confirm the chromosomal insertion. The selection marker should select cells that are transformed with the vector, i.e., to confirm the insertion of the desired polynucleotide, and the selection marker may include markers providing selectable phenotypes, such as drug resistance, auxotrophy, resistance to cytotoxic agents, or surface protein expression. Only cells expressing the selection marker are capable of surviving or showing different phenotypes under the environment treated with the selective agent, and thus transformed cells may be selected.

[040]Como usado aqui, o termo “transformação” significa a introdução de um vetor incluindo um polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo em uma célula hospedeira em um tal modo que a proteína codificada pelo polinucleotídeo é expressada na célula hospedeira. Contanto que o polinucleotídeo transformado possa ser expressado na célula hospedeira, ele pode ser integrado e colocado no cromossomo da célula hospedeira, ou existir extracromossomicamente. Além disso, o polinucleotídeo inclui DNA e RNA que codificam a proteína alvo. O polinucleotídeo pode ser introduzido em qualquer forma, contanto que ele possa ser introduzido na célula hospedeira e expressado nesta. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser introduzida na célula hospedeira na forma de um cassete de expressão, que é uma construção de gene incluindo todos os elementos necessários para sua expressão autônoma. Tipicamente, o cassete de expressão inclui um promotor operavelmente ligado ao polinucleotídeo, sinais de terminação transcricional, sítios de ligação ao ribossomo, ou sinais de terminação da tradução. O cassete de expressão pode estar na forma de um vetor de expressão auto-replicável. Também, o polinucleotídeo como ele é pode ser introduzido na célula hospedeira e operavelmente ligado a sequências necessárias para expressão na célula hospedeira.[040] As used herein, the term “transformation” means the introduction of a vector including a polynucleotide encoding a target protein into a host cell in such a manner that the protein encoded by the polynucleotide is expressed in the host cell. Provided that the transformed polynucleotide can be expressed in the host cell, it can be integrated and placed into the chromosome of the host cell, or exist extrachromosomally. In addition, the polynucleotide includes DNA and RNA encoding the target protein. The polynucleotide can be introduced in any form, provided that it can be introduced into and expressed in the host cell. For example, the polynucleotide can be introduced into the host cell in the form of an expression cassette, which is a gene construct including all the elements necessary for its autonomous expression. Typically, the expression cassette includes a promoter operably linked to the polynucleotide, transcriptional termination signals, ribosome binding sites, or translation termination signals. The expression cassette may be in the form of a self-replicating expression vector. Also, the polynucleotide as it is may be introduced into the host cell and operably linked to sequences necessary for expression in the host cell.

[041]Além disso, como usado aqui, o termo “operavelmente ligado” significa uma ligação funcional entre uma sequência de polinucleotídeo que codifica a proteína desejada da presente invenção e uma sequência promotora que inicia e medeia a transcrição da sequência de polinucleotídeo.[041]Furthermore, as used herein, the term “operably linked” means a functional linkage between a polynucleotide sequence encoding the desired protein of the present invention and a promoter sequence that initiates and mediates transcription of the polynucleotide sequence.

[042]Além disso, o micro-organismo tendo produtividade de diamina pode ser um micro-organismo, em que a atividade de diamina acetiltransferase é enfraquecida comparada à atividade endógena, de modo a aumentar a produção de diamina.[042]Furthermore, the microorganism having diamine productivity may be a microorganism in which the diamine acetyltransferase activity is weakened compared to the endogenous activity, so as to increase diamine production.

[043]Como usado aqui, o termo “diamina acetiltransferase” é uma enzima que catalisa a transferência de um grupo acetila de acetil-CoA à diamina, e ela pode ser exemplificada por NCgl1469 de Corynebacterium glutamicum ou SpeG de E. coli, mas seu nome pode diferir dependendo da espécie de um micro-organismo tendo produtividade de diamina. NCgl1469 pode ter uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 12 ou 13, e SpeG pode ter uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 14, mas a sequência pode diferir dependendo da espécie do micro-organismo. A proteína pode ter uma sequência de aminoácido tendo homologia de 80 % ou mais alta, preferivelmente 90 % ou mais alta, ou mais preferivelmente 95 % ou mais alta, ou particular e preferivelmente 97 % ou mais alta com esta, contanto que ela tenha a atividade de diamina acetiltransferase.[043]As used herein, the term “diamine acetyltransferase” is an enzyme that catalyzes the transfer of an acetyl group from acetyl-CoA to diamine, and it may be exemplified by NCgl1469 from Corynebacterium glutamicum or SpeG from E. coli, but its name may differ depending on the species of a microorganism having diamine productivity. NCgl1469 may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 or 13, and SpeG may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, but the sequence may differ depending on the species of microorganism. The protein may have an amino acid sequence having 80% or higher, preferably 90% or higher, or more preferably 95% or higher, or particularly and preferably 97% or higher homology thereto, provided that it has diamine acetyltransferase activity.

[044]Visto que a diamina acetiltransferase converte diamina à acetil-diamina (por exemplo, N-Ac-putrescina ou N-Ac-cadaverina), a produtividade de diamina pode ser aumentada enfraquecendo-se sua atividade, comparada à atividade endógena.[044]Since diamine acetyltransferase converts diamine to acetyldiamine (e.g., N-Ac-putrescine or N-Ac-cadaverine), diamine productivity can be increased by weakening its activity compared to endogenous activity.

[045]Como usado aqui, o termo “atividade endógena” refere-se à atividade da proteína que o micro-organismo original possui em seu estado nativo ou não desnaturado, e “modificada para ter atividade enfraquecida, comparada à atividade endógena” significa que a atividade da proteína é mais enfraquecida comparada à atividade da proteína correspondente que o micro-organismo original possui no estado nativo ou não desnaturado.[045]As used herein, the term “endogenous activity” refers to the activity of the protein that the original microorganism possesses in its native or undenatured state, and “modified to have weakened activity compared to the endogenous activity” means that the activity of the protein is more weakened compared to the activity of the corresponding protein that the original microorganism possesses in its native or undenatured state.

[046]O enfraquecimento da atividade de proteína significa que a atividade de proteína é reduzida, comparada a uma cepa não modificada, ou a atividade é eliminada. É possível aplicar um método bem conhecido na técnica ao enfraquecimento da atividade de proteína.[046]Impairment of protein activity means that the protein activity is reduced, compared to an unmodified strain, or the activity is eliminated. A method well known in the art can be applied to the impairment of protein activity.

[047]Exemplos do método podem incluir um método de substituir o gene que codifica a proteína no cromossomo por um gene que é mutado para reduzir a atividade enzimática ou para eliminar a atividade de proteína, um método de introduzir uma mutação na sequência reguladora de expressão do gene que codifica a proteína no cromossomo, um método de substituir a sequência reguladora de expressão do gene que codifica a proteína por uma sequência tendo atividade mais fraca, um método de suprimir uma parte ou um inteiro do gene que codifica a proteína no cromossomo, um método de introduzir oligonucleotídeo anti-sentido que complementarmente liga-se a um transcrito do gene no cromossomo para inibir a tradução de mRNA à proteína, um método de adicionar artificialmente uma sequência complementar à sequência SD à montante da sequência SD do gene que codifica a proteína para formar uma estrutura secundária, desse modo impedindo o acesso das subunidades ribossômicas, e um método de engenharia de transcrição reversa (RTE) de adicionar um promotor para a transcrição reversa no término 3’ da estrutura de leitura aberta (ORF) da sequência correspondente, e combinações destes, mas não são particularmente limitados a estes.[047] Examples of the method may include a method of replacing the protein-coding gene in the chromosome with a gene that is mutated to reduce enzymatic activity or to eliminate protein activity, a method of introducing a mutation in the expression regulatory sequence of the protein-coding gene in the chromosome, a method of replacing the expression regulatory sequence of the protein-coding gene with a sequence having weaker activity, a method of deleting a part or an entire protein-coding gene in the chromosome, a method of introducing antisense oligonucleotide that complementarily binds to a transcript of the gene in the chromosome to inhibit translation of mRNA into protein, a method of artificially adding a sequence complementary to the SD sequence upstream of the SD sequence of the protein-coding gene to form a secondary structure, thereby preventing access of ribosomal subunits, and a reverse transcription engineering (RTE) method of adding a promoter for reverse transcription at the 3' end of the open reading frame (ORF) of the corresponding sequence, and combinations thereof, but are not particularly limited to these.

[048]Em detalhe, uma supressão parcial ou completa do gene que codifica a proteína pode ser feita introduzindo-se um vetor para inserção cromossômica em um micro-organismo, desse modo substituindo-se o polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo endógena no cromossomo com um polinucleotídeo tendo uma supressão parcial ou um gene marcador. O “parcial” pode variar dependendo do tipo de polinucleotídeo, mas especificamente refere-se a 1 a 300, preferivelmente 1 a 100, e mais preferivelmente 1 a 50 nucleotídeos.[048]In detail, a partial or complete deletion of the gene encoding the protein can be made by introducing a vector for chromosomal insertion into a microorganism, thereby replacing the polynucleotide encoding an endogenous target protein in the chromosome with a polynucleotide having a partial deletion or a marker gene. The "partial" may vary depending on the type of polynucleotide, but specifically refers to 1 to 300, preferably 1 to 100, and more preferably 1 to 50 nucleotides.

[049]Entretanto, o micro-organismo da presente invenção é um micro-organismo tendo produtividade de diamina, e inclui um micro-organismo procariótico que expressa a proteína tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6, e exemplos deste podem incluir micro-organismos que pertencem a Escherichia sp., Shigella sp., Citrobacter sp., Salmonella sp., Enterobacter sp., Yersinia sp., Klebsiella sp., Erwinia sp., Corynebacterium sp., Brevibacterium sp., Lactobacillus sp., Selenomanas sp., Vibrio sp., Pseudomonas sp., Streptomyces sp., Arcanobacterium sp., Alcaligenes sp. ou semelhantes, mas não são limitados a estes. O micro-organismo da presente invenção é especificamente um microorganismo que pertence a Corynebacterium sp. ou Escherichia sp., e mais especificamente, Corynebacterium glutamicum ou Escherichia coli, mas não é limitado a estes.[049] Meanwhile, the microorganism of the present invention is a microorganism having diamine productivity, and includes a prokaryotic microorganism expressing the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and examples thereof may include microorganisms belonging to Escherichia sp., Shigella sp., Citrobacter sp., Salmonella sp., Enterobacter sp., Yersinia sp., Klebsiella sp., Erwinia sp., Corynebacterium sp., Brevibacterium sp., Lactobacillus sp., Selenomanas sp., Vibrio sp., Pseudomonas sp., Streptomyces sp., Arcanobacterium sp., Alcaligenes sp. or the like, but are not limited thereto. The microorganism of the present invention is specifically a microorganism belonging to Corynebacterium sp. or Escherichia sp., and more specifically, Corynebacterium glutamicum or Escherichia coli, but not limited to these.

[050]Um exemplo específico pode ser um micro-organismo preparado suprimindo-se NCgl2522, que é uma proteína tendo atividade de exportação de putrescina, a partir de uma cepa de produção putrescina KCCM11240P com base em ATCC13032 de Corynebacterium glutamicum (Publicação de Patente Coreana No 2013-0082478) e depois introduzindo-se ARCH_0271 no gene de transpóson. Portanto, este micro-organismo KCCM11240P ΔNCgl2522 Tn:P(cj7)-ARCH_0271 é designado como CC01-0758, e depositado sob o Tratado de Budapeste ao Centro de Cultura Coreano de Micro-organismos (KCCM) em 15 de Novembro de 2013, com No de Acesso KCCM11476P.[050]A specific example may be a microorganism prepared by deleting NCgl2522, which is a protein having putrescine export activity, from a putrescine-producing strain KCCM11240P based on Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (Korean Patent Publication No. 2013-0082478) and then introducing ARCH_0271 into the transposon gene. Therefore, this microorganism KCCM11240P ΔNCgl2522 Tn:P(cj7)-ARCH_0271 is designated as CC01-0758, and deposited under the Budapest Treaty to the Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) on November 15, 2013, with Accession No. KCCM11476P.

[051]Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método de produzir diamina, compreendendo: (i) cultivar o micro-organismo tendo putrescina diamina, em que a atividade da proteína tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6 ou homologia de sequência de 42 % ou mais alta com esta é introduzida ou realçada, de modo a obter uma cultura celular; e (ii) recuperar a diamina a partir do micro-organismo cultivado ou da cultura celular.[051] In another aspect, the present invention provides a method of producing diamine, comprising: (i) culturing the microorganism having putrescine diamine, wherein the activity of the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 or 42% or higher sequence homology thereto is introduced or enhanced, so as to obtain a cell culture; and (ii) recovering the diamine from the cultured microorganism or the cell culture.

[052]A diamina, a proteína tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6 ou a proteína tendo a sequência de aminoácido tendo homologia de sequência de 42 % ou mais alta com esta, a introdução da atividade de proteína, o realce da atividade de proteína, a diamina, e o micro-organismo tendo produtividade de diamina são os mesmos como descrito acima.[052]The diamine, the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 or the protein having the amino acid sequence having 42% or higher sequence homology thereto, the introduction of protein activity, the enhancement of protein activity, the diamine, and the microorganism having diamine productivity are the same as described above.

[053]No método, a etapa de cultivar o micro-organismo pode ser, embora não particularmente limitada a, preferivelmente realizada por cultura descontínua, cultura contínua, e cultura descontínua alimentada conhecidas na técnica. Sob esse aspecto, as condições de cultura não são particularmente limitadas, mas um pH ideal (por exemplo, pH 5 a 9, preferivelmente pH 6 a 8, e o mais preferivelmente pH 6,8) pode ser mantido usando-se uma substância química básica (por exemplo, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou amônia) ou substância química ácida (por exemplo, ácido fosfórico ou ácido sulfúrico). Também, uma condição aeróbica pode ser mantida adicionando-se oxigênio ou mistura gasosa contendo oxigênio a uma cultura celular. A temperatura da cultura pode ser mantida a 20 a 45 °C, e preferivelmente a 25 a 40 °C, e o cultivo pode ser realizado por cerca de 10 a 160 horas.[053] In the method, the step of culturing the microorganism can be, although not particularly limited to, preferably carried out by batch culture, continuous culture, and fed-batch culture known in the art. In this regard, the culture conditions are not particularly limited, but an optimum pH (e.g., pH 5 to 9, preferably pH 6 to 8, and most preferably pH 6.8) can be maintained using a basic chemical (e.g., sodium hydroxide, potassium hydroxide, or ammonia) or acidic chemical (e.g., phosphoric acid or sulfuric acid). Also, an aerobic condition can be maintained by adding oxygen or a gas mixture containing oxygen to a cell culture. The culture temperature can be maintained at 20 to 45 °C, and preferably at 25 to 40 °C, and the cultivation can be carried out for about 10 to 160 hours.

[054]Além disso, um meio a ser usado para a cultura pode incluir açúcar e carboidrato (por exemplo, glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melaço, amido e celulose), óleo e gordura (por exemplo, óleo de soja, óleo de semente de girassol, óleo de amendoim e óleo de coco), ácido graxo (por exemplo, ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoleico), álcool (por exemplo, glicerol e etanol), e ácido orgânico (por exemplo, ácido acético) individualmente ou em combinação como uma fonte de carbono; composto orgânico contendo nitrogênio (por exemplo, peptona, extrato de levedura, suco de carne, extrato de malte, solução de milho, pó de farinha de soja e ureia), ou composto inorgânico (por exemplo, sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio, e nitrato de amônio) individualmente ou em combinação como uma fonte de nitrogênio; diidrogeno fosfato de potássio, fosfato de dipotássio, ou sal contendo sódio correspondendo a estes individualmente ou em combinação como uma fonte de fósforo; outras substâncias essenciais estimulantes do crescimento incluindo sais metálicos (por exemplo, sulfato de magnésio ou sulfato de ferro), aminoácidos, e vitaminas. Na presente invenção, o meio pode ser usado como um sinônimo para o líquido de cultura.[054] In addition, a medium to be used for culture may include sugar and carbohydrate (e.g., glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch, and cellulose), oil and fat (e.g., soybean oil, sunflower seed oil, peanut oil, and coconut oil), fatty acid (e.g., palmitic acid, stearic acid, and linoleic acid), alcohol (e.g., glycerol and ethanol), and organic acid (e.g., acetic acid) individually or in combination as a carbon source; nitrogen-containing organic compound (e.g., peptone, yeast extract, meat juice, malt extract, corn solution, soybean meal powder, and urea), or inorganic compound (e.g., ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate, and ammonium nitrate) individually or in combination as a nitrogen source; potassium dihydrogen phosphate, dipotassium phosphate, or sodium-containing salt corresponding to these individually or in combination as a source of phosphorus; other essential growth-stimulating substances including metal salts (e.g., magnesium sulfate or iron sulfate), amino acids, and vitamins. In the present invention, the medium may be used as a synonym for the culture liquid.

[055]Como usado aqui, o termo “cultura celular” é um material obtido cultivando-se um micro-organismo, e inclui o meio, o micro-organismo cultivado, e substâncias liberadas a partir do micro-organismo cultivado. Por exemplo, um nutriente fornece fonte necessária para a cultura celular, tais como minerais, aminoácidos, vitaminas, ácidos nucleicos e/ou outros componentes geralmente contidos no meio de cultura (ou líquido de cultura) além da fonte de carbono, e a fonte de nitrogênio pode ser incluída. Além disso, uma substância desejada ou uma enzima produzida/secretada pelas células pode ser incluída.[055]As used herein, the term “cell culture” is a material obtained by cultivating a microorganism, and includes the medium, the cultured microorganism, and substances released from the cultured microorganism. For example, a nutrient source provides a necessary source for cell culture, such as minerals, amino acids, vitamins, nucleic acids and/or other components generally contained in the culture medium (or culture liquid) in addition to the carbon source, and the nitrogen source may be included. In addition, a desired substance or an enzyme produced/secreted by the cells may be included.

[056]Visto que a diamina produzida pela cultura pode ser secretada no meio ou permanecer nas células, a cultura celular pode incluir diamina que é produzida cultivando-se o micro-organismo.[056]Since the diamine produced by the culture can be secreted into the medium or remain in the cells, the cell culture can include diamine that is produced by culturing the microorganism.

[057]O método de recuperar a putrescina produzida na etapa de cultura da presente invenção pode ser realizado, por exemplo, usando um método adequado conhecido na técnica de acordo com um método de cultura, por exemplo, cultura descontínua, cultura contínua, ou cultura descontínua alimentada, desse modo coletando-se os aminoácidos desejados a partir do líquido de cultura.[057]The method of recovering the putrescine produced in the culture step of the present invention can be carried out, for example, using a suitable method known in the art according to a culture method, for example, batch culture, continuous culture, or fed-batch culture, thereby collecting the desired amino acids from the culture liquid.

Advantageous Effects

[058]Na presente invenção, é demonstrado que a proteína ARCH_0271 derivada de Arcanobacterium haemolyticum é uma proteína tendo atividade de exportação de diamina, e atividade de exportação de putrescina pode ser realçada introduzindo-se esta atividade de proteína no micro-organismo Corynebacterium sp. que tem uma via sintética de putrescina, mas atividade de exportação de putrescina baixa. Também é demonstrado que a produção de putrescina e cadaverina pode ser aumentada ao mesmo tempo introduzindo-se esta atividade de proteína em E. coli que tem vias sintéticas de putrescina e cadaverina. Consequentemente, a diamina pode ser eficazmente produzida aplicando-se proteína ARCH_0271 derivada de Arcanobacterium haemolyticum a um micro-organismo tendo produtividade de diamina.[058] In the present invention, it is demonstrated that the ARCH_0271 protein derived from Arcanobacterium haemolyticum is a protein having diamine export activity, and putrescine export activity can be enhanced by introducing this protein activity into the microorganism Corynebacterium sp. which has a putrescine synthetic pathway but low putrescine export activity. It is also demonstrated that the production of putrescine and cadaverine can be increased at the same time by introducing this protein activity into E. coli which has putrescine and cadaverine synthetic pathways. Accordingly, diamine can be effectively produced by applying ARCH_0271 protein derived from Arcanobacterium haemolyticum to a microorganism having diamine productivity.

Mode for the Invention

[059]Em seguida, a presente invenção será descrita em mais detalhe com referência aos Exemplos. Entretanto, estes Exemplos são para propósitos ilustrativos apenas, e a invenção não é intencionada a ser limitada por estes Exemplos.[059]In the following, the present invention will be described in more detail with reference to the Examples. However, these Examples are for illustrative purposes only, and the invention is not intended to be limited by these Examples.

Reference Example 1. Preparation of microorganism Corynebacterium sp. having putrescine productivity

[060]Foi confirmado que a produção de putrescina foi reduzida quando NCgl2522, uma permease que pertence à superfamília de facilitador principal (MFS), foi suprimida em um cepa de produção de putrescina KCCM11240P com base em ATCC13032 de Corynebacterium glutamicum (Publicação de Patente Coreana No 2013-0082478) e uma cepa de produção de putrescina DAB12-a ΔNCgl1469 com base em ATCC13869 de Corynebacterium glutamicum (supressão de argF, supressão de NCgl1221, introdução de speC de E. coli, substituição de promotor de operão arg, supressão de NCgl1469; designada como DAB12-b, Publicação de Patente Coreana No 2013-0082478) como micro-organismos Corynebacterium sp. tendo produtividade de putrescina.[060] It was confirmed that putrescine production was reduced when NCgl2522, a permease belonging to the major facilitator superfamily (MFS), was suppressed in a putrescine-producing strain KCCM11240P based on Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (Korean Patent Publication No. 2013-0082478) and a putrescine-producing strain DAB12-a ΔNCgl1469 based on Corynebacterium glutamicum ATCC13869 (argF deletion, NCgl1221 deletion, E. coli speC introduction, arg operon promoter replacement, NCgl1469 deletion; designated as DAB12-b, Korean Patent Publication No. 2013-0082478) as microorganisms Corynebacterium sp. having putrescine productivity.

[061]Também foi confirmado que a putrescina foi produzida em um rendimento alto em cepas de Corynebacterium glutamicum preparadas por introdução adicional de gene NCgl2522 no transpóson em KCCM11240P ou DAB12- b, ou por substituição de promotor de NCgl2522 no cromossomo com promotor de cj7 para realçar a atividade de NCgl2522. Além disso, a quantidade intracelular de putrescina foi medida na cepa em que a expressão de NCgl2522 foi realçada, e como um resultado, uma quantidade menor de putrescina foi observada, comparado àquela de um grupo de controle. Isto está indicando que NCgl2522 tem uma capacidade de exportar putrescina.[061] It was also confirmed that putrescine was produced in high yield in Corynebacterium glutamicum strains prepared by additionally introducing NCgl2522 gene into the transposon in KCCM11240P or DAB12-b, or by replacing NCgl2522 promoter in the chromosome with cj7 promoter to enhance the activity of NCgl2522. Furthermore, the intracellular amount of putrescine was measured in the strain in which NCgl2522 expression was enhanced, and as a result, a lower amount of putrescine was observed, compared to that in a control group. This is indicating that NCgl2522 has an ability to export putrescine.

[062]Em detalhe, com base na sequência de nucleotídeo do gene que codifica NCgl2522 de ATCC13032 de Corynebacterium glutamicum, um par de iniciadores das SEQ ID NOS: 1 e 2 para obter uma fragmento de recombinação homóloga da região de terminal N de NCgl2522 e um par de iniciadores das SEQ ID NOS: 3 e 4 para obter um fragmento de recombinação homóloga da região de terminal C de NCgl2522 foram usados como na Tabela 1 seguinte. [Tabela 1] [062]In detail, based on the nucleotide sequence of the gene encoding NCgl2522 of ATCC13032 from Corynebacterium glutamicum, a pair of primers of SEQ ID NOS: 1 and 2 to obtain a homologous recombination fragment of the N-terminal region of NCgl2522 and a pair of primers of SEQ ID NOS: 3 and 4 to obtain a homologous recombination fragment of the C-terminal region of NCgl2522 were used as in the following Table 1. [Table 1]

[063]PCR foi realizada usando o DNA genômico de ATCC13032 de Corynebacterium glutamicum como um padrão e dois pares de iniciadores de modo a amplificar os fragmentos de PCR das regiões de terminal N e terminal C, respectivamente. Estes fragmentos de PCR foram submetidos à eletroforese para obter os fragmentos desejados. Neste momento, a reação PCR foi realizada por 30 ciclos de desnaturação por 30 segundos a 95 °C, recozimento por 30 segundos a 55 °C, e extensão por 30 segundos a 72 °C. O fragmento da região de terminal N assim obtida foi tratado com as enzimas de restrição, BamHI e SalI, e o fragmento da região de terminal C assim obtida foi tratado com as enzimas de restrição, SalI e XbaI. Os fragmentos assim tratados foram clonados no vetor pDZ tratado com as enzimas de restrição, BamHI e XbaI, de modo a construir um plasmídeo pDZ- 1’NCgl2522(K/O).[063]PCR was performed using the genomic DNA of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 as a template and two pairs of primers in order to amplify the PCR fragments of the N-terminal and C-terminal regions, respectively. These PCR fragments were subjected to electrophoresis to obtain the desired fragments. At this time, the PCR reaction was carried out by 30 cycles of denaturation for 30 seconds at 95 °C, annealing for 30 seconds at 55 °C, and extension for 30 seconds at 72 °C. The fragment of the N-terminal region thus obtained was treated with the restriction enzymes, BamHI and SalI, and the fragment of the C-terminal region thus obtained was treated with the restriction enzymes, SalI and XbaI. The fragments thus treated were cloned into the pDZ vector treated with the restriction enzymes, BamHI and XbaI, in order to construct a plasmid pDZ-1’NCgl2522(K/O).

[064]O plasmídeo pDZ-1’NCgl2522(K/O) foi introduzido em KCCM11240P de Corynebacterium glutamicum por eletroporação, de modo a obter um transformante. Depois, o transformante foi plaqueado e cultivado em placa BHIS (37 g/l de infusão de cérebro e coração, 91 g/l de sorbitol, e 2 % de ágar) contendo canamicina (25 μg/ml) e X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolin-D-galactosídeo) para formação de colônia. A partir das colônias assim formadas, as colônias de cor azul foram selecionadas como a cepa introduzida com o plasmídeo pDZ-1’NCgl2522(K/O).[064]Plasmid pDZ-1’NCgl2522(K/O) was introduced into Corynebacterium glutamicum KCCM11240P by electroporation to obtain a transformant. Then, the transformant was plated and cultured on BHIS plate (37 g/L brain heart infusion, 91 g/L sorbitol, and 2% agar) containing kanamycin (25 μg/ml) and X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolin-D-galactoside) for colony formation. From the colonies thus formed, blue-colored colonies were selected as the strain introduced with plasmid pDZ-1’NCgl2522(K/O).

[065]As cepas selecionadas foram cultivadas com agitação em meio CM (10 g/l de glicose, 10 g/l de polipeptona, 5 g/l de extrato de levedura, 5 g/l de extrato de carne, 2,5 g/l de NaCl, e 2 g/l de ureia, pH 6,8) a 30 °C por 8 horas. Subsequentemente, cada cultura celular foi serialmente diluída de 10-4 a 10-10. Depois, as amostras diluídas foram plaqueadas e cultivadas em um meio sólido contendo X-gal para a formação de colônia. A partir das colônias assim formadas, as colônias brancas que apareceram em frequência relativamente baixa foram selecionadas para finalmente obter uma cepa de Corynebacterium glutamicum em que o gene que codifica NCgl2522 foi suprimido e a produtividade de putrescina foi enfraquecida. A cepa de Corynebacterium glutamicum em que a atividade de exportação de putrescina foi enfraquecida foi designada como KCCM11240P △NCgl2522.[065]The selected strains were cultured with shaking in CM medium (10 g/L glucose, 10 g/L polypeptone, 5 g/L yeast extract, 5 g/L meat extract, 2.5 g/L NaCl, and 2 g/L urea, pH 6.8) at 30 °C for 8 h. Subsequently, each cell culture was serially diluted from 10-4 to 10-10. Then, the diluted samples were plated and cultured on a solid medium containing X-gal for colony formation. From the colonies thus formed, white colonies that appeared at relatively low frequency were selected to finally obtain a Corynebacterium glutamicum strain in which the gene encoding NCgl2522 was deleted and putrescine productivity was weakened. The Corynebacterium glutamicum strain in which putrescine export activity was weakened was designated as KCCM11240P △NCgl2522.

[066]Da mesma maneira, PCR foi realizada usando o DNA genômico de ATCC13869 de Corynebacterium glutamicum como um padrão e dois pares de iniciadores fornecidos na tabela 1 de modo a construir um plasmídeo pDZ- 2’NCgl2522(K/O) pelo método descrito acima. Uma cepa de Corynebacterium glutamicum, em que o gene que codifica NCgl2522 de cepa DAB12-b foi suprimido usando o vetor de acordo com o método descrito acima para enfraquecer a produtividade de putrescina, foi construída. Esta cepa de Corynebacterium glutamicum tendo atividade de exportação de putrescina enfraquecida foi designada como DAB12-b ΔNCgl2522.[066]In the same manner, PCR was performed using the genomic DNA of Corynebacterium glutamicum ATCC13869 as a template and two pairs of primers provided in Table 1 so as to construct a plasmid pDZ-2’NCgl2522(K/O) by the method described above. A Corynebacterium glutamicum strain, in which the gene encoding NCgl2522 of strain DAB12-b was deleted using the vector according to the method described above to weaken putrescine productivity, was constructed. This Corynebacterium glutamicum strain having weakened putrescine export activity was designated as DAB12-b ΔNCgl2522.

Example 1. Selection of Arcanobacterium haemolyticum ARCH 0271

[067]Como confirmado no Exemplo de Referência 1, a proteína de membrana NCgl2522 foi descoberta funcionar para exportar putrescina. Portanto, com base na sequência de aminoácido de NCgl2522, os presentes inventores examinaram os genes tendo homologia com esta exceto genes de Corynebacterium sp. usando o programa BlastP do National Center for Biotechnology Information (NCBI, www.ncbi.nlm.nih.gov), e como um resultado, eles adquiriram uma sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 5) e uma sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 6) de ARCH_0271 de DSM 20595 de Arcanobacterium haemolyticum, que tem 56 % de homologia com esta. Entre as proteínas de membrana tendo uma homologia com a sequência de aminoácido de NCgl2522, que são encontradas em outras espécies exceto Corynebacterium sp., a sequência de aminoácido de ARCH_0271 é filogenicamente mais próxima à sequência de aminoácido de NCgl2522.[067] As confirmed in Reference Example 1, the membrane protein NCgl2522 was found to function to export putrescine. Therefore, based on the amino acid sequence of NCgl2522, the present inventors screened the genes having homology with it except genes of Corynebacterium sp. using the BlastP program of the National Center for Biotechnology Information (NCBI, www.ncbi.nlm.nih.gov), and as a result, they acquired a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 5) and an amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) of ARCH_0271 of DSM 20595 of Arcanobacterium haemolyticum, which has 56% homology with it. Among the membrane proteins having a homology to the amino acid sequence of NCgl2522, which are found in other species except Corynebacterium sp., the amino acid sequence of ARCH_0271 is phylogenetically closest to the amino acid sequence of NCgl2522.

[068]Da mesma maneira, a sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 22) e sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 23) de QWA_00075 derivada a partir de NCIB 8687 de Alcaligenes faecalis subsp. faecalis, que mostra 41 % de homologia com a sequência de aminoácido de NCgl2522, e a sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 25) e sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 26) de SMD_2351 derivada a partir de D457 de Stenotrophomonas maltophilia, que mostra 52 % de homologia com a sequência de aminoácido da NCgl2522, foram obtidas. A sequência de aminoácido de QWA_00075 e a sequência de aminoácido de SMD_2351 mostram 42 % e 47 % de homologia com a sequência de aminoácido de ARCH_0271, respectivamente, como mostrado na Tabela 2 seguinte. [Tabela 2] Com paração da homologia de sequência de aminoácido [068]In the same manner, the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 22) and amino acid sequence (SEQ ID NO: 23) of QWA_00075 derived from NCIB 8687 of Alcaligenes faecalis subsp. faecalis, which shows 41% homology to the amino acid sequence of NCgl2522, and the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 25) and amino acid sequence (SEQ ID NO: 26) of SMD_2351 derived from D457 of Stenotrophomonas maltophilia, which shows 52% homology to the amino acid sequence of NCgl2522, were obtained. The amino acid sequence of QWA_00075 and the amino acid sequence of SMD_2351 show 42% and 47% homology with the amino acid sequence of ARCH_0271, respectively, as shown in the following Table 2. [Table 2] Comparison of amino acid sequence homology

[069]Entretanto, micro-organismos tendo genes que mostram homologia com NCgl2522, e homologia deste são fornecidos na Tabela 3 seguinte. [Tabela 3] [069]However, microorganisms having genes showing homology to NCgl2522, and homology thereof are provided in the following Table 3. [Table 3]

Example 2. Fermentation of putrescine by introduction of protein having putrescine export activity into putrescine-producing strain derived from Corynebacterium sp. <2-1> Introduction of ARCH_0271, QWA_00075, or SMD_2351 into transposon gene in chromosome of putrescine-producing strain based on ATCC13032

[070]De modo a examinar se a inserção cromossômica de gene ARCH_0271, QWA_00075 ou SMD_2351 afeta a exportação de putrescina em KCCM11240P ΔNCgl2522 tendo atividade de exportação de putrescina reduzida que foi preparada no Exemplo de Referência 1, ARCH_0271, QWA_00075, ou SMD_2351 foi introduzido em um gene de transpóson pelo método seguinte.[070] In order to examine whether the chromosomal insertion of ARCH_0271, QWA_00075, or SMD_2351 gene affects putrescine export in KCCM11240P ΔNCgl2522 having reduced putrescine export activity that was prepared in Reference Example 1, ARCH_0271, QWA_00075, or SMD_2351 was introduced into a transposon gene by the following method.

[071]Como um vetor para transformação, que permite uma inserção de gene no cromossomo usando um gene de transpóson de micro-organismo de Corynebacterium sp., pDZTn (WO 2009/125992) foi usado, e cj7 (WO 2006/65095) foi usado como um promotor.[071]As a vector for transformation, which allows a gene insertion into the chromosome using a transposon gene from the microorganism Corynebacterium sp., pDZTn (WO 2009/125992) was used, and cj7 (WO 2006/65095) was used as a promoter.

[072]Com base na sequência de nucleotídeo de DSM 20595 de Arcanobacterium haemolyticum, o gene ARCH_0271 foi sintetizado otimizando-se a sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 7) para o uso de códon de Corynebacterium glutamicum. Da mesma maneira, QWA_00075 derivado a partir de NCIB 8687 de Alcaligenes faecalis subsp. faecalis e SMD_2351 derivado a partir de D457 de Stenotrophomonas maltophilia também foram sintetizados otimizando-se as sequências de nucleotídeo (SEQ ID NO: 24, e SEQ ID NO: 27) para o uso de códon de Corynebacterium glutamicum, respectivamente. Os genes sintetizados foram obtidos como genes clonados em pGEM B1.[072] Based on the nucleotide sequence of DSM 20595 of Arcanobacterium haemolyticum, the ARCH_0271 gene was synthesized by optimizing the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 7) for the codon usage of Corynebacterium glutamicum. Similarly, QWA_00075 derived from NCIB 8687 of Alcaligenes faecalis subsp. faecalis and SMD_2351 derived from D457 of Stenotrophomonas maltophilia were also synthesized by optimizing the nucleotide sequences (SEQ ID NO: 24, and SEQ ID NO: 27) for the codon usage of Corynebacterium glutamicum, respectively. The synthesized genes were obtained as cloned genes in pGEM B1.

[073]Os plasmídeos assim obtidos foram designados como pGEM B1- ARCH_0271, pGEM B1-QWA_00075, e pGEM B1-SMD_2351, respectivamente.[073]The plasmids thus obtained were designated as pGEM B1-ARCH_0271, pGEM B1-QWA_00075, and pGEM B1-SMD_2351, respectively.

[074]Um fragmento de gene de cerca de 1,51 kb, 1,53 kb, ou 1,53 kb foi amplificado usando plasmídeo pGEM B1-ARCH_0271, pGEM B1-QWA_00075, ou pGEM B1-SMD_2351 como um padrão e um par de iniciadores das SEQ ID NOs. 10 e 11, SEQ ID NOs. 28 e 29, ou SEQ ID NOs. 30 e 31 (Ver Tabela 4), respectivamente. Neste momento, a reação PCR foi realizada por 30 ciclos de desnaturação por 30 segundos a 95 °C, recozimento por 30 segundos a 55 °C, e extensão por 1 minuto e 30 segundos a 72 °C. Em seguida, estes produtos de PCR foram submetidos à eletroforese em um gel de agarose a 0,8 % para eluir e purificar cada faixa do tamanho desejado.[074]A gene fragment of about 1.51 kb, 1.53 kb, or 1.53 kb was amplified using plasmid pGEM B1-ARCH_0271, pGEM B1-QWA_00075, or pGEM B1-SMD_2351 as a template and a primer pair of SEQ ID NOs. 10 and 11, SEQ ID NOs. 28 and 29, or SEQ ID NOs. 30 and 31 (See Table 4), respectively. At this time, the PCR reaction was performed by 30 cycles of denaturation for 30 seconds at 95 °C, annealing for 30 seconds at 55 °C, and extension for 1 minute and 30 seconds at 72 °C. These PCR products were then electrophoresed on a 0.8% agarose gel to elute and purify each band of the desired size.

[075]Além disso, a região promotora cj7 foi obtida realizando-se PCR por 30 ciclos de desnaturação por 30 segundos a 95 °C, recozimento por 30 segundos a 55 °C, e extensão por 30 segundos a 72 °C usando p117-Pcj7-gfp como um padrão e um par de iniciadores das SEQ ID NOs. 8 e 9 (Ver Tabela 4). Um fragmento do gene promotor cj7 foi submetido à eletroforese em um gel de agarose a 0,8 % para eluir e purificar uma faixa do tamanho desejado. [Tabela 4] [075]Furthermore, the cj7 promoter region was obtained by performing PCR for 30 cycles of denaturation for 30 seconds at 95 °C, annealing for 30 seconds at 55 °C, and extension for 30 seconds at 72 °C using p117-Pcj7-gfp as a template and a primer pair of SEQ ID NOs. 8 and 9 (See Table 4). A fragment of the cj7 promoter gene was electrophoresed in a 0.8% agarose gel to elute and purify a band of the desired size. [Table 4]

[076]O vetor pDZTn foi digerido com XhoI, e a clonagem por fusão de cada produto de PCR obtido acima foi realizada. O kit de Clonagem In-Fusion^HD (Clontech) foi usado na clonagem por fusão. Os plasmídeos resultantes foram designados como pDZTn-P(cj7)-ARCH_0271, pDZTn-P(cj7)-QWA_00075, e pDZTn- P(cj7)-SMD_2351, respectivamente.[076]The pDZTn vector was digested with XhoI, and fusion cloning of each PCR product obtained above was performed. The In-Fusion^HD Cloning Kit (Clontech) was used for fusion cloning. The resulting plasmids were designated as pDZTn-P(cj7)-ARCH_0271, pDZTn-P(cj7)-QWA_00075, and pDZTn-P(cj7)-SMD_2351, respectively.

[077]Cada um dos três plasmídeos pDZTn-P(cj7)-ARCH_0271, pDZTn- P(cj7)-QWA_00075, e pDZTn-P(cj7)-SMD_2351 foi introduzido em KCCM11240P △NCgl2522 de Corynebacterium glutamicum tendo atividade de exportação de putrescina reduzida descrita no Exemplo de Referência 1 por eletroporação para obter transformantes. Os transformantes foram cultivados com agitação em meio CM (10 g/l de glicose, 10 g/l de polipeptona, 5 g/l de extrato de levedura, 5 g/l de extrato de carne, 2,5 g/l de NaCl, e 2 g/l de ureia, pH 6,8) (30 °C por 8 horas). Subsequentemente, cada cultura celular foi serialmente diluída de 10-4 a 10-10. Depois, as amostras diluídas foram plaqueadas e cultivadas em um meio sólido contendo X-gal para formação de colônia.[077]Each of the three plasmids pDZTn-P(cj7)-ARCH_0271, pDZTn-P(cj7)-QWA_00075, and pDZTn-P(cj7)-SMD_2351 was introduced into Corynebacterium glutamicum KCCM11240P △NCgl2522 having reduced putrescine export activity described in Reference Example 1 by electroporation to obtain transformants. The transformants were grown with shaking in CM medium (10 g/L glucose, 10 g/L polypeptone, 5 g/L yeast extract, 5 g/L meat extract, 2.5 g/L NaCl, and 2 g/L urea, pH 6.8) (30 °C for 8 h). Subsequently, each cell culture was serially diluted from 10-4 to 10-10. Then, the diluted samples were plated and cultured on a solid medium containing X-gal for colony formation.

[078]A partir das colônias formadas, as colônias brancas que apareceram em frequência relativamente baixa foram selecionadas para finalmente obter cepas em que o gene que codifica ARCH_0271, QWA_00075 ou SMD_2351 foi introduzido por cruzamento secundário. As cepas finalmente selecionadas foram submetidas a PCR usando um par de iniciadores das SEQ ID NOs. 8 e 11, SEQ ID NOs. 8 e 29, ou SEQ ID NOs. 8 e 31 para confirmar a introdução do gene que codifica ARCH_0271, QWA_00075 ou SMD_2351. Estas cepas mutantes de Corynebacterium glutamicum foram designadas como KCCM11240P △NCgl2522 Tn:P(cj7)-ARCH_0271, KCCM11240P △NCgl2522 Tn:P(cj7)-QWA_00075, e KCCM11240P △NCgl2522 Tn:P(cj7)-SMD_2351, respectivamente.[078] From the colonies formed, white colonies that appeared at relatively low frequency were selected to finally obtain strains in which the gene encoding ARCH_0271, QWA_00075, or SMD_2351 was introduced by secondary crossing. The finally selected strains were subjected to PCR using a pair of primers from SEQ ID NOs. 8 and 11, SEQ ID NOs. 8 and 29, or SEQ ID NOs. 8 and 31 to confirm the introduction of the gene encoding ARCH_0271, QWA_00075, or SMD_2351. These Corynebacterium glutamicum mutant strains were designated as KCCM11240P △NCgl2522 Tn:P(cj7)-ARCH_0271, KCCM11240P △NCgl2522 Tn:P(cj7)-QWA_00075, and KCCM11240P △NCgl2522 Tn:P(cj7)-SMD_2351, respectively.

<2-2>Introduction of ARCH_0271, QWA_00075, or SMD_2351 into transposon gene in chromosome of putrescine-producing strain based on ATCC13869

[079]De modo a examinar se a inserção cromossômica do gene ARCH_0271 afeta a exportação de putrescina em DAB12-b ΔNCgl2522 tendo atividade de exportação de putrescina reduzida que foi preparada no Exemplo de Referência 1, pDZTn-P(cj7)-ARCH_0271, pDZTn-P(cj7)-QWA_00075, ou pDZTn-P(cj7)- SMD_2351 preparado acima foi introduzido em DAB12-b ΔNCgl2522 de Corynebacterium glutamicum e as cepas são confirmadas por introdução de ARCH_0271, QWA_00075 ou SMD_2351 no gene de transpóson da mesma maneira como no exemplo <2-1>.[079] In order to examine whether the chromosomal insertion of the ARCH_0271 gene affects putrescine export in DAB12-b ΔNCgl2522 having reduced putrescine export activity which was prepared in Reference Example 1, pDZTn-P(cj7)-ARCH_0271, pDZTn-P(cj7)-QWA_00075, or pDZTn-P(cj7)-SMD_2351 prepared above was introduced into DAB12-b ΔNCgl2522 of Corynebacterium glutamicum and the strains are confirmed by introducing ARCH_0271, QWA_00075 or SMD_2351 into the transposon gene in the same manner as in Example <2-1>.

[080]Cepas mutantes de Corynebacterium glutamicum assim selecionadas foram designadas como DAB12-b ΔNCgl2522 Tn:P(cj7)-ARCH_0271, DAB12-b ΔNCgl2522 Tn:P(cj7)- QWA_00075, e DAB12-b ΔNCgl2522 Tn:P(cj7)-SMD_2351, respectivamente. <2-3>Avaliação da produtividade de putrescina de cepa de produção de putrescina derivada de Corynebacterium sp. introduzida com ARCH_0271, QWA_00075 ou SMD_2351[080] Corynebacterium glutamicum mutant strains thus selected were designated as DAB12-b ΔNCgl2522 Tn:P(cj7)-ARCH_0271, DAB12-b ΔNCgl2522 Tn:P(cj7)- QWA_00075, and DAB12-b ΔNCgl2522 Tn:P(cj7)-SMD_2351, respectively. <2-3>Evaluation of putrescine productivity of putrescine-producing strain derived from Corynebacterium sp. introduced with ARCH_0271, QWA_00075, or SMD_2351

[081]De modo a confirmar o efeito da introdução de ARCH_0271 sobre a produtividade de putrescina na cepa de produção de putrescina, produtividades de putrescina das cepas mutantes de Corynebacterium glutamicum preparadas nos exemplos <2-1> e <2-2> foram comparadas.[081]In order to confirm the effect of introducing ARCH_0271 on putrescine productivity in the putrescine-producing strain, putrescine productivities of the Corynebacterium glutamicum mutant strains prepared in examples <2-1> and <2-2> were compared.

[082]Em detalhe, 10 tipos de mutantes de Corynebacterium glutamicum (KCCM11240P; KCCM11240P △NCgl2522; KCCM11240P △NCgl2522 Tn:P(cj7)- ARCH_0271; KCCM11240P △NCgl2522 Tn:P(cj7)-QWA_00075; KCCM11240P △NCgl2522 Tn:P(cj7)-SMD_2351; DAB12-b; DAB12-b △NCgl2522; DAB12-b △NCgl2522 Tn:P(cj7)-ARCH_0271; DAB12-b ΔNCgl2522 Tn:P(cj7)- QWA_00075, e DAB12-b ΔNCgl2522 Tn:P(cj7)-SMD_2351) foram plaqueados em 1 mM de meio de placa CM contendo arginina (1 % de glicose, 1 % de polipeptona, 0,5 % de extrato de levedura, 0,5 % de extrato de carne, 0,25 % de NaCl, 0,2 % de ureia, 100 μl de NaOH a 50 %, e 2 % de ágar, pH 6,8, com base em 1 L), e cultivados a 30 °C por 24 horas, respectivamente. 1 ansa de platina de cada cepa assim cultivada foi inoculada em 25 ml de meio de titulação (8 % de Glicose, 0,25 % de proteína de soja, 0,50 % de sólidos de infusão de milho, 4 % de (NH4)2SO4, 0,1 % de KH2PO4, 0,05 % de MgSO4 • 7H2O, 0,15 % de ureia, 100 μg de biotina, 3 mg de cloridreto de tiamina, 3 mg de cálcio-ácido pantotênico, 3 mg de nicotinamida, e 5 % de CaCO3, pH 7,0, com base em 1 L), e depois cultivada com agitação a 30 °C e 200 rpm por 98 horas. 1 mM de arginina foi adicionado a todos os meios para cultivar as cepas. A concentração de putrescina em cada cultura celular foi medida, e os resultados são mostrados na Tabela 5 seguinte. [Tabela 5] [082] In detail, 10 types of Corynebacterium glutamicum mutants (KCCM11240P; KCCM11240P △NCgl2522; KCCM11240P △NCgl2522 Tn:P(cj7)- ARCH_0271; KCCM11240P △NCgl2522 Tn:P(cj7)-QWA_00075; KCCM11240P △NCgl2522 Tn:P(cj7)-SMD_2351; DAB12-b ΔNCgl2522 Tn:P(cj7)- QWA_00075, and DAB12-b ΔNCgl2522 Tn:P(cj7)-SMD_2351) were plated on 1 mM CM plate medium containing arginine (1% glucose, 1% polypeptone, 0.5 % yeast extract, 0.5% meat extract, 0.25% NaCl, 0.2% urea, 100 μl 50% NaOH, and 2% agar, pH 6.8, based in 1 L), and cultivated at 30 °C for 24 hours, respectively. 1 platinum loop of each strain thus cultivated was inoculated into 25 ml of titration medium (8% Glucose, 0.25% soy protein, 0.50% corn infusion solids, 4% (NH4) 2SO4, 0.1% KH2PO4, 0.05% MgSO4 • 7H2O, 0.15% urea, 100 μg biotin, 3 mg thiamine hydrochloride, 3 mg calcium pantothenic acid, 3 mg nicotinamide, and 5% CaCO3, pH 7.0, based on 1 L), and then grown with shaking at 30 °C and 200 rpm for 98 h. 1 mM arginine was added to all media to grow the strains. The putrescine concentration in each cell culture was measured, and the results are shown in the following Table 5. [Table 5]

[083]Como mostrado na tabela 5, a produção de putrescina foi descoberta ser aumentada em ambos os 2 tipos das cepas mutantes de Corynebacterium glutamicum introduzidas por ARCH_0271. Além disso, a produção de putrescina foi descoberta ser aumentada na cepa introduzida por QWA_00075 ou SMD_2351, comparada à cepa precursora, KCCM 11240P △NCgl2522 ou DAB12-b △NCgl2522. Isto está indicando que QWA_00075 ou SMD_2351 tem atividade de exportação de putrescina.[083]As shown in Table 5, putrescine production was found to be increased in both 2 types of Corynebacterium glutamicum mutant strains introduced by ARCH_0271. Furthermore, putrescine production was found to be increased in the strain introduced by QWA_00075 or SMD_2351, compared to the parent strain, KCCM 11240P △NCgl2522 or DAB12-b △NCgl2522. This is indicating that QWA_00075 or SMD_2351 has putrescine export activity.

Example 3. Fermentation of cadaverine by introduction of ARCH 0271 and expression of lysine decarboxylase in a lysine-producing strain derived from Corynebacterium sp. <3-1> Introduction of ARCH_0271 into transposon gene in chromosome of KCCM11016P of L-lysine producing Corynebacterium glutamicum

[084]De modo a confirmar a atividade de exportação de cadaverina da proteína ARCH_0271, o gene de ARCH_0271 foi introduzido no cromossomo de uma cepa de produção de lisina KCCM11016P (este micro-organismo foi depositado no Centro de Cultura Coreano de Micro-organismos em 18 de Dezembro de 1995 com o No de Acesso KFCC10881, e depois depositado na Autoridade Depositária Internacional sob Tratado de Budapeste com No de Acesso KCCM11016P, Patente Coreana No 10-0159812). pDZTn-P(cj7)-ARCH_0271 preparado acima foi introduzido em KCCM11016P de Corynebacterium glutamicum e a cepa é confirmada por introdução de ARCH_0271 no transpóson da mesma maneira como no exemplo <2-1>.[084] In order to confirm the cadaverine export activity of the ARCH_0271 protein, the ARCH_0271 gene was introduced into the chromosome of a lysine-producing strain KCCM11016P (this microorganism was deposited in the Korean Culture Center for Microorganisms on December 18, 1995 with Accession No. KFCC10881, and then deposited in the International Depository Authority under Budapest Treaty with Accession No. KCCM11016P, Korean Patent No. 10-0159812). pDZTn-P(cj7)-ARCH_0271 prepared above was introduced into Corynebacterium glutamicum KCCM11016P, and the strain is confirmed by introducing ARCH_0271 into the transposon in the same manner as in Example <2-1>.

[085]Uma cepa mutante de Corynebacterium glutamicum assim selecionada foi designada como KCCM11016P Tn:P(cj7)-ARCH_0271.[085]A mutant strain of Corynebacterium glutamicum thus selected was designated as KCCM11016P Tn:P(cj7)-ARCH_0271.

<3-2> Introduction of E. coli-derived lysine decarboxylase gene into L-lysine-producing strain introduced by ARCH_0271

[086]A cepa de produção de L-lisina introduzida por ARCH_0271, KCCM11016P Tn:P(cj7)-ARCH_0271 que foi preparada no exemplo <3-1> foi introduzida com gene de lisina descarboxilase derivado de E. coli em uma forma de plasmídeo para a produção de cadaverina. A sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 32) e sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 33) da lisina descarboxilase ldcC de E. coli foram obtidas a partir da base de dados de NCBI.[086]The L-lysine producing strain introduced by ARCH_0271, KCCM11016P Tn:P(cj7)-ARCH_0271 which was prepared in Example <3-1> was introduced with E. coli-derived lysine decarboxylase gene in a plasmid form for the production of cadaverine. The nucleotide sequence (SEQ ID NO: 32) and amino acid sequence (SEQ ID NO: 33) of E. coli lysine decarboxylase ldcC were obtained from the NCBI database.

[087]Um fragmento de gene ldcC de cerca de 2,1 kb foi obtido realizando-se PCR por 30 ciclos de desnaturação por 30 segundos a 95 °C, recozimento por 30 segundos a 52 °C, e extensão por 2 minutos a 72 °C usando o cromossomo da cepa W3110 de E. coli como um padrão e um par de iniciadores das SEQ ID NOS: 36 e 37 (Ver Tabela 6). Este produto foi tratado com HindIII e XbaI, e depois submetido à eletroforese em um gel de agarose a 0,8 % para eluir e purificar uma faixa do tamanho desejado.[087]A fragment of the ldcC gene of approximately 2.1 kb was obtained by performing PCR for 30 cycles of denaturation for 30 seconds at 95 °C, annealing for 30 seconds at 52 °C, and extension for 2 minutes at 72 °C using the chromosome of E. coli strain W3110 as a template and a pair of primers from SEQ ID NOS: 36 and 37 (See Table 6). This product was treated with HindIII and XbaI, and then electrophoresed on a 0.8% agarose gel to elute and purify a band of the desired size.

[088]Além disso, a região promotora de cj7 foi obtida realizando-se PCR por 30 ciclos de desnaturação por 30 segundos a 95 °C, recozimento por 30 segundos a 55 °C, e extensão por 30 segundos a 72 °C usando p117-Pcj7-gfp como um padrão e um par de iniciadores das SEQ ID NOs. 34 e 35 (Ver Tabela 6). Um fragmento de gene do gene promotor de cj7 foi tratado com KpnI e HindII, e depois submetido à eletroforese em um gel de agarose a 0,8 % para eluir e purificar uma faixa do tamanho desejado. [Tabela 6] [088]Furthermore, the cj7 promoter region was obtained by performing PCR for 30 cycles of denaturation for 30 seconds at 95 °C, annealing for 30 seconds at 55 °C, and extension for 30 seconds at 72 °C using p117-Pcj7-gfp as a template and a primer pair of SEQ ID NOs. 34 and 35 (See Table 6). A gene fragment of the cj7 promoter gene was treated with KpnI and HindII, and then electrophoresed on a 0.8% agarose gel to elute and purify a band of the desired size. [Table 6]

[089]Um fragmento de gene que foi obtido realizando-se eletroforese de vetor de pECCG117 tratado por KpnI e XbaI (Biotechnology letters vol 13, No 10, p. 721 - 726 (1991)) em um gel de agarose a 0,8 % e depois eluindo-se e purificando- se uma faixa do tamanho desejado, o fragmento de gene promotor de cj7 tratado com KpnI e HindIII, e o fragmento de gene ldcC de lisina descarboxilase tratado com HindIII e XbaI foram clonados usando T4 DNA ligase (NEB). O plasmídeo que codifica ldcC de E. coli obtido pelo experimento acima foi designado como pECCG117-Pcj7-ldcC.[089]A gene fragment which was obtained by performing electrophoresis of KpnI and XbaI treated pECCG117 vector (Biotechnology letters vol 13, No 10, p. 721 - 726 (1991)) on a 0.8% agarose gel and then eluting and purifying a band of the desired size, the KpnI and HindIII treated cj7 promoter gene fragment and the HindIII and XbaI treated lysine decarboxylase ldcC gene fragment were cloned using T4 DNA ligase (NEB). The plasmid encoding E. coli ldcC obtained by the above experiment was designated as pECCG117-Pcj7-ldcC.

[090]O vetor pECCG117-Pcj7-ldcC ou vetor pECCG117 preparado foi introduzido em KCCM11016P e KCCM11016P Tn:P(cj7)-ARCH_0271 por eletroporação, respectivamente. Os transformantes foram plaqueados em placa BHIS contendo 25 μg/ml de canamicina para seleção. As cepas selecionadas foram designadas como KCCM11016P pECCG117, KCCM11016P pECCG117-Pcj7-ldcC, KCCM11016P Tn:P(cj7)-ARCH_0271 pECCG117, e KCCM11016P Tn:P(cj7)- ARCH_0271 pECCG117-Pcj7-ldcC, respectivamente.[090]The prepared pECCG117-Pcj7-ldcC vector or pECCG117 vector was introduced into KCCM11016P and KCCM11016P Tn:P(cj7)-ARCH_0271 by electroporation, respectively. The transformants were plated on BHIS plate containing 25 μg/ml kanamycin for selection. The selected strains were designated as KCCM11016P pECCG117, KCCM11016P pECCG117-Pcj7-ldcC, KCCM11016P Tn:P(cj7)-ARCH_0271 pECCG117, and KCCM11016P Tn:P(cj7)-ARCH_0271 pECCG117-Pcj7-ldcC, respectively.

<3-3>Evaluation of cadaverine productivity of lysine-producing strain derived from Corynebacterium sp. having chromosomal insertion of ARCH_0271 and lysine decarboxylase gene as plasmid

[091]De modo a examinar se a introdução de ARCH_0271 na cepa de produção de cadaverina afeta a produção de cadaverina, a produtividade de cadaverina foi comparada entre cepas mutantes de Corynebacterium glutamicum preparadas no exemplo <3-2>.[091]In order to examine whether the introduction of ARCH_0271 into the cadaverine-producing strain affects cadaverine production, cadaverine productivity was compared between mutant strains of Corynebacterium glutamicum prepared in example <3-2>.

[092]Em detalhe, 4 tipos de cepas mutantes de Corynebacterium glutamicum (KCCM11016P pECCG117; KCCM11016P pECCG117-Pcj7-ldcC; KCCM11016P Tn:P(cj7)-ARCH_0271 pECCG117; e KCCM11016P Tn:P(cj7)-ARCH_0271 pECCG117-Pcj7-ldcC) foram cultivados pelo método seguinte, e a produtividade de cadaverina foi comparada com estes.[092]In detail, 4 kinds of Corynebacterium glutamicum mutant strains (KCCM11016P pECCG117; KCCM11016P pECCG117-Pcj7-ldcC; KCCM11016P Tn:P(cj7)-ARCH_0271 pECCG117; and KCCM11016P Tn:P(cj7)-ARCH_0271 pECCG117-Pcj7-ldcC) were cultured by the following method, and the cadaverine productivity was compared with these.

[093]As respectivas cepas mutantes foram plaqueadas em meio de placa CM (1 % de glicose, 1 % de polipeptona, 0,5 % de extrato de levedura, 0,5 % de extrato de carne, 0,25 % de NaCl, 0,2 % de ureia, 100 μl de NaOH a 50 %, e 2 % de ágar, pH 6,8, com base em 1 L), e cultivadas a 30 °C por 24 horas. Cada uma das cepas cultivadas foi inoculada a um frasco de septo de canto de 250 ml contendo 25 ml de meio de semente (2 % de glicose, 1 % de peptona, 0,5 % de extrato de levedura, 0,15 % de ureia, 0,4 % de KH2PO4, 0,8 % de K2HPO4, 0,05 % de MgSO4 7H2O, 100 μg de biotina, 1000 μg de HCl de tiamina, 2000 μg de cálcio-ácido pantotênico, e 2000 μg de nicotinamida, pH 7,0, com base em 1 L), e cultivada com agitação a 30 °C e 200 rpm por 20 horas.[093]The respective mutant strains were plated on CM plate medium (1% glucose, 1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 0.5% meat extract, 0.25% NaCl, 0.2% urea, 100 μL 50% NaOH, and 2% agar, pH 6.8, based on 1 L), and grown at 30 °C for 24 h. Each of the cultured strains was inoculated into a 250 ml corner septum flask containing 25 ml of seed medium (2% glucose, 1% peptone, 0.5% yeast extract, 0.15% urea, 0.4% KH2PO4, 0.8% K2HPO4, 0.05% MgSO4 7H2O, 100 μg biotin, 1000 μg thiamine HCl, 2000 μg calcium pantothenic acid, and 2000 μg nicotinamide, pH 7.0, based on 1 L), and grown with shaking at 30 °C and 200 rpm for 20 h.

[094]Depois, 1 ml da cultura de semente foi inoculado a um frasco de septo de canto de 250 ml contendo 24 ml de meio de produção (4 % de Glicose, 2 % de (NH4)2SO4, 2,5 % de proteína de soja, 5 % de sólidos de infusão de milho, 0,3 % de ureia, 0,1 % de KH2PO4, 0,05 % de MgSO4 7H2O, 100 μg de biotina, 1000 μg de cloridreto de tiamina, 2000 μg de cálcio-ácido pantotênico, 3000 μg de nicotinamida, 0,2 g de leucina, 0,1 g de treonina, 0,1 g de metionina, e 5 % de CaCO3, pH 7,0, com base em 1 L), e depois cultivado com agitação a 30 °C e 200 rpm por 72 horas.[094]Then, 1 ml of the seed culture was inoculated into a 250 ml corner septum flask containing 24 ml of production medium (4% glucose, 2% (NH4)2SO4, 2.5% soy protein, 5% corn steep solids, 0.3% urea, 0.1% KH2PO4, 0.05% MgSO4 7H2O, 100 μg biotin, 1000 μg thiamine hydrochloride, 2000 μg calcium pantothenic acid, 3000 μg nicotinamide, 0.2 g leucine, 0.1 g threonine, 0.1 g methionine, and 5% CaCO3, pH 7.0, based on 1 L), and then cultivated with shaking at 30 °C and 200 rpm for 72 hours.

[095]Depois da cultura, as produtividades de cadaverina foram medidas por HPLC. As concentrações de cadaverina na cultura celular de cada cepa são fornecidas na Tabela 7 seguinte. [Tabela 7] [095]After culturing, cadaverine productivities were measured by HPLC. Cadaverine concentrations in the cell culture of each strain are given in the following Table 7. [Table 7]

[096]Como mostrado na tabela 7, a produção de cadaverina foi aumentada nas cepas mutantes de Corynebacterium glutamicum introduzidas por ARCH_0271 em mais do que 17 %.[096]As shown in Table 7, cadaverine production was increased in the mutant strains of Corynebacterium glutamicum introduced by ARCH_0271 by more than 17%.

Example 4. Diamine fermentation by introduction of protein having diamine export activity into E. coli' <4-1> Strain Preparation by Introduction of ARCH_0271, QWA_00075, or SMD_2351 into W3110

[097]De modo a examinar se a expressão de ARCH_0271 derivado de DSM 20595 de Arcanobacterium haemolyticum, QWA_00075 derivado de Alcaligenes faecalis, ou SMD_2351 derivado de Stenotrophomonas maltophilia aumenta as produções de putrescina e cadaverina na cepa W3110 de E. coli do tipo selvagem tendo via biossintética de putrescina e cadaverina, pDZTn-P(cj7)-ARCH_0271, pDZTn-P(cj7)-QWA_00075, ou pDZTn-P(cj7)-SMD_2351 com base em vetor de transporte de Corynebacterium e E. coli foi introduzido em W3110, respectivamente.[097] In order to examine whether the expression of ARCH_0271 derived from DSM 20595 of Arcanobacterium haemolyticum, QWA_00075 derived from Alcaligenes faecalis, or SMD_2351 derived from Stenotrophomonas maltophilia increases the productions of putrescine and cadaverine in the wild-type E. coli strain W3110 having putrescine and cadaverine biosynthetic pathway, pDZTn-P(cj7)-ARCH_0271, pDZTn-P(cj7)-QWA_00075, or pDZTn-P(cj7)-SMD_2351 based Corynebacterium and E. coli shuttle vector was introduced into W3110, respectively.

[098]Uma solução de TSS 2X (Epicentre) foi usada para transformação em E. coli, e o transformante foi plaqueado e cultivado em placa LB (10 g de Triptona, 5 g de Extrato de levedura, 10 g de NaCl, e 2 % de ágar, com base em 1 L) contendo canamicina (50 μg/ml) para formação de colônia. As colônias assim formadas foram designadas como W3110 pDZTn-P(cj7)-ARCH_0271, W3110 pDZTn-P(cj7)- QWA_00075, e W3110 pDZTn-P(cj7)- SMD_2351, respectivamente.[098]A 2X TSS solution (Epicentre) was used for transformation into E. coli, and the transformant was plated and grown on LB plate (10 g Tryptone, 5 g Yeast extract, 10 g NaCl, and 2% agar, based on 1 L) containing kanamycin (50 μg/ml) for colony formation. The colonies thus formed were designated as W3110 pDZTn-P(cj7)-ARCH_0271, W3110 pDZTn-P(cj7)- QWA_00075, and W3110 pDZTn-P(cj7)- SMD_2351, respectively.

<4-2>Comparison of diamine productivity of E. coli spiked with ARCH_0271, QWA_00075, or SMD_2351

[099]As produtividades de putrescina e cadaverina das cepas obtidas acima foram examinadas.[099]The putrescine and cadaverine productivities of the strains obtained above were examined.

[0100]Em detalhe, W3110 e W3110 pDZTn-P(cj7)-ARCH_0271, W3110 pDZTn-P(cj7)-QWA_00075, ou W3110 pDZTn-P(cj7)-SMD_2351 foram cultivados em meio sólido LB a 37 °C por 24 horas.[0100]In detail, W3110 and W3110 pDZTn-P(cj7)-ARCH_0271, W3110 pDZTn-P(cj7)-QWA_00075, or W3110 pDZTn-P(cj7)-SMD_2351 were cultured on LB solid medium at 37 °C for 24 h.

[0101]Depois, cada um deles foi cultivado em 25 ml de meio de titulação (2 g de (NH4)2PO4, 6,75 g de KH2PO4, 0,85 g de ácido cítrico, 0,7 g de MgSO4 • 7H2O, 0,5 % (v/v) de microelemento, 10 g de glicose, 3 g de AMS, e 30 g de CaCO3, com base em 1 L) a 37 °C por 24 horas. Uma solução metálica de traço continha HCl 5 M: 10 g de FeSO4 • 7H2O, 2,25 g de ZnSO4 • 7H2O, 1 g de CuSO4 • 5H2O, 0,5 g de MnSO4 • 5H2O, 0,23 g de Na2B4O7 • I0H2O, 2 g de CaCl2 • 2H2O, e 0,1 g de (NH4)6Mθ7θ2 • 4H2O por 1 litro.[0101]Then, each of them was cultured in 25 ml of titration medium (2 g of (NH4)2PO4, 6.75 g of KH2PO4, 0.85 g of citric acid, 0.7 g of MgSO4 • 7H2O, 0.5% (v/v) of trace element, 10 g of glucose, 3 g of AMS, and 30 g of CaCO3, based on 1 L) at 37 °C for 24 h. A trace metal solution contained 5 M HCl: 10 g FeSO4 • 7H2O, 2.25 g ZnSO4 • 7H2O, 1 g CuSO4 • 5H2O, 0.5 g MnSO4 • 5H2O, 0.23 g Na2B4O7 • I0H2O, 2 g CaCl2 • 2H2O, and 0.1 g (NH4)6Mθ7θ2 • 4H2O per 1 liter.

[0102]As concentrações de putrescina e cadaverina produzidas a partir de cada cultura celular foram medidas, e os resultados são fornecidos na Tabela 8 seguinte.[Tabela 8] [0102]The concentrations of putrescine and cadaverine produced from each cell culture were measured, and the results are given in the following Table 8.[Table 8]

[0103]Como mostrado na tabela 8, comparado à cepa precursora W3110, produções de putrescina e cadaverina foram notavelmente aumentadas em cepa W3110 pDZTn-P(cj7)-ARCH_0271, W3110 pDZTn-P(cj7)-QWA_00075, ou W3110 pDZTn-P(cj7)-SMD_2351 que foi introduzida com ARCH_0271, QWA_00075 ou SMD_2351, respectivamente.[0103]As shown in Table 8, compared to the parent strain W3110, putrescine and cadaverine productions were remarkably increased in strain W3110 pDZTn-P(cj7)-ARCH_0271, W3110 pDZTn-P(cj7)-QWA_00075, or W3110 pDZTn-P(cj7)-SMD_2351 that was introduced with ARCH_0271, QWA_00075, or SMD_2351, respectively.

[0104]Isto é, foi confirmado que a quantidade de diamina produzida na cultura celular foi notavelmente aumentada realçando-se a atividade da proteína ARCH_0271, QWA_00075 ou SMD_2351 tendo homologia de sequência de 56 %, 41 %, ou 52 % com a sequência de aminoácido de NCgl2522, sugerindo que a capacidade de exportar diamina tal como putrescina e cadaverina pode ser melhorada realçando-se a atividade de CE2495 ou a proteína tendo homologia de sequência de 42 % ou mais alta com esta.[0104] That is, it was confirmed that the amount of diamine produced in the cell culture was remarkably increased by enhancing the activity of the ARCH_0271, QWA_00075 or SMD_2351 protein having 56%, 41%, or 52% sequence homology to the amino acid sequence of NCgl2522, suggesting that the ability to export diamine such as putrescine and cadaverine can be improved by enhancing the activity of CE2495 or the protein having 42% or higher sequence homology to it.

[0105]Como tal, os presente inventores demonstraram que Corynebacterium glutamicum tendo atividade de ARCH_0271 realçada preparada introduzindo-se ARCH_0271 em transpóson de micro-organismo de Corynebacterium sp. KCCM11240P ΔNCgl2522 que tem uma via sintética de putrescina, mas uma atividade de exportação de putrescina reduzida tem atividade de exportação de putrescina realçada, desse modo produzindo a putrescina em um rendimento alto.[0105] As such, the present inventors have demonstrated that Corynebacterium glutamicum having enhanced ARCH_0271 activity prepared by introducing ARCH_0271 into the transposon of Corynebacterium sp. KCCM11240P ΔNCgl2522 microorganism which has a putrescine synthetic pathway but a reduced putrescine export activity has enhanced putrescine export activity, thereby producing putrescine in a high yield.

[0106]Consequentemente, esta cepa KCCM11240P ΔNCgl2522 Tn:P(cj7)- ARCH_0271 foi designada como CC01-0758, e depositada sob o Tratado de Budapeste ao Centro de Cultura Coreano de Micro-organismos (KCCM) em 15 de Novembro de 2013, sob o No de Acesso KCCM11476P.[0106]Accordingly, this strain KCCM11240P ΔNCgl2522 Tn:P(cj7)- ARCH_0271 was designated as CC01-0758, and deposited under the Budapest Treaty to the Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) on November 15, 2013, under Accession No. KCCM11476P.

Claims

1. Microorganism for producing putrescine or cadaverine, CHARACTERIZED by the fact that a gene having a polynucleotide sequence selected from SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 27, or a degenerate sequence thereof is introduced into the microorganism, and in which the microorganism for producing putrescine or cadaverine is a microorganism belonging to Escherichia coli; in which the microorganism for producing putrescine is a microorganism belonging to Corynebacterium glutamicum; or in which the microorganism for producing cadaverine is a microorganism belonging to Corynebacterium glutamicum, and a gene encoding lysine decarboxylase is introduced into the microorganism.

2. Microorganism, according to claim 1, CHARACTERIZED by the fact that a gene encoding diamine acetyltransferase is deleted, in which the microorganism is a microorganism belonging to Corynebacterium glutamicum, in which the diamine acetyltransferase has an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 12, 13 and 14.

3. Method for producing putrescine or cadaverine, CHARACTERIZED by the fact that it comprises: (i) culturing the microorganism, as defined in claim 1 or 2, to obtain a cell culture; and (ii) recovering putrescine or cadaverine from the cultured microorganism or cell culture.