UNIVERSITE DE LOME Année Académique : 2022-2023

Faculté Des Sciences Semestre : Mousson

Département De Biochimie

RAPPORT DE TRAVAUX PRATIQUES DE BIOCHIMIE

METABOLIQUE (BCH 221)

TP N°1 : SEPARATION DES ACIDES AMINÉS ET DES ACIDES

ORGANIQUES DE FEUILLES D’EPINARD PAR
CHROMATOGRAPHIE SUR ECHANGEUR D’IONS

Rédigé par
N° DE CARTE NOMS PRENOMS PARCOURS
473607 HOUNDJO TETE Tété Akoêté Paul BPA
513057 HOUSSOUNOUKPE Komi BPA
INTRODUCTION
La chromatographie se définie comme tout processus, physique ou chimique, permettant la séparation
des constituants d’un mélange au moyen d’une phase mobile liquide ou gaz, le long d’une phase
stationnaire qui peut être mobile ou liquide fixé.
On distingue deux grands types de chromatographie qui sont la chromatographie en phase gazeuse et
la chromatographie en phase liquide dans laquelle on distingue plusieurs catégories selon la nature de
la phase liquide. La chromatographie sur échangeur d’ions dont la phase stationnaire est un échangeur
d’ions constitué par une résine porteuse de groupements ionisés a fait l’objet de notre manipulation.
Cette dernière a consisté à séparer des acides aminés et acides organiques de fouilles d’épinards par
chromatographie sur échangeur d’ions ; la mise en évidence de ces acides aminés et au dosage des
acides organiques puis à la détermination de l’indice de saponification de ces acides organiques.

I. MATERIELS ET METHODES
A- Matériels
Durant notre manipulation nous avons eu à utiliser une colonne à chromatographie ; du coton ; de la
résine Amberlite IR 120 et IRA 410 ; l’eau distillée ; des feuilles d’épinards ; une solution tampon
phosphate à pH 7,0 ; un broyeur ; un chauffe-eau ; un réfrigérant à reflux(tube de verre) ; de l’alcool à
80% ; une centrifugeuse ; une solution d’ammoniac à 1,0 N ; une solution de ninhydrine à 1% ;
solution molaire de carbonate d’ammonium CO3(NH4)2 ; un erlenmeyer de 100 ml ; du potasse
alcoolique ; un bain-marie bouillant ; de l’ acide sulfurique 1,0 N et du phénolphtaléine.

B- Méthodes
Les colonnes de chromatographie ont été préparées au préalable par les techniciens.
On a broyé 12,5g de feuilles d’épinards dépourvues de leurs nervures principales. On l’a ensuite
mélangé avec 50ml de solution tampon phosphate à pH 7,0. Le tout a été porté à l’ébullition pendant
3mn sous réfrigérant à reflux, on l’a laissé reposer pendant 10 minutes. Le mélange a été ensuite filtré
à l’aide du coton puis on a ajouté 50 ml d’alcool à 80° pour précipiter les protéines contenues dans le
filtrat. Ensuite on l’a passé à la centrifugation à 2500 tours /mn pendant 5minutes. On a eu une
solution en deux phases : un culot au fond et un surnageant constitué des substances qu’on a eu à
séparer.
Le surnagent obtenu est versé sur dans la colonne chromatographique à résine Amberlite IR 120 et on
a recueilli le liquide d’écoulement A qu’on a versé au fur et à mesure sur dans la colonne IR 410. On
rince la colonne IR 120 avec de l’eau distillée et on fait passer lentement une solution d’ammoniaque
1 N pour déplacer les acides aminés captés par la résine. On a recueilli le liquide d’écoulement B que
contient des acides aminés mélangés à de l’ammoniaque en excès. On a chauffé cette solution B pour
éliminer l’ammoniaque. Ensuite on a mis en évidence les acides aminés de la solution B en ajoutant
quelques millilitres de Ninhydrine 1 N.
La solution A versé dans la colonne IR 410 a été laissé couler lentement. On a ensuite fait passer une
solution molaire de carbonate d’ammonium {CO3(NH4)2} et on a recueilli la solution C sous forme de
sels d’ammonium melangé à un exès de carbonate d’ammonium. Cette solution C est mélangée avec
la résine Amberlite IR 120 dans un grand bécher. On a ensuite séparé la solution C de l’amberlite par
décantation et on la porte à ébullition pour éliminer le CO2. On a préparé trois erlenmeyers notés T
(témoin), E1 (essai 1) et E2 (essai 2). On a versé dans le témoin 25 ml de KOH alcoolique et 10 ml de
solution tampon phosphate pH 7,0. Les deux essais ont contenu chacun 25 ml de KOH et 10 ml de la
solution C. On porte les trois erlenmeyers à ébullition pendant 5 min, on laisse refroidir dans de l’eau
froide puis on titrer avec de l’acide sulfurique 1,0 N en présence de la phénolphtaléine.
II. RESULTATS
Après l’ajout de l’alcool sur la feuille d’épinard broyée et filtrée on observe une précipitation qui se
sépare en culot (au fond du tube) et d’un surnageant après la centrifugation.
La solution B qui était jaunâtre donne une coloration violette en présence de la ninhydrine. En
présence de quelquesgouttes de phénolphtaléine, les solutions contenues dans les erlenmeyers de
couleur jaune pâle, virent au rose. Ces dernières passent du rose au blanc à l’équivalence, après
titrage avec l’acide sulfurique.
Le volume de la solution C mesuré est : VC total= 43ml.

Volume du Volume d’acide

Volume de KOH Volume de la
tampon sulfurique versé
(ml) solution C (ml)
phosphate (ml) (ml)
Témoin (T) 25 - 10 8,3
Essai 1 (E1) 25 10 - 6,3
Essai 2 (E2) 25 10 - 6,1
Tableau de dosage
Pour les essais on prendra le volume moyen de H2SO4 VM = 6,2 ml

III. DISCUSSIONS
Le tampon phosphate a été utilisé pour broyer les feuilles d'épinards afin de déshydrater de façon
mécanique les cellules par éclatement en libérant leur contenus. Le chauffage du broyat permet la
dénaturation des protéines par altération dans la conformation de la chaîne peptidique. La filtration du
broyat a permis d'éliminer les fragments végétaux les plus volumineux et l'ajout d'alcool à 80% a
précipité les protéines contenues dans le filtrat. Le passage du surnageant dans la colonne de la résine
IR120 (résine cationique forte de type sulfonique) a permis la fixation des acides aminés. La fixation
s'effectue selon l'équation :
Res-SO3ˉ + R’- NH3+ + OH- Res-SO3ˉ NH3-R’ + H2O Avec R’ = R-C-COOH

Le passage lent de la solution d'Ammoniaque a pour but de décrocher les acides aminés fixés sur la
résine(c'est la phase d'élution) qui s'effectue selon l'équation :

Res-SO3ˉ NH3-R’ + (NH4+; OH-) Res-SO3ˉ NH4+ + R’- NH2 + H2O

La coloration violette obtenue est l’action de la ninhydrine sur les acides aminés libres. En présence de
la ninhydrine, un oxydant puissant, réagissant en excès et à chaud avec tous les acides aminés, protéines
ou dérivés protéiques possédant un groupement aminé et un groupement carboxylique libre, les acides
aminés sont désaminés, décarboxylés et transformés en aldéhydes avec formation d’un composé coloré
en bleu-violet (Pourpre de Ruheman). La solution B contient donc des acides aminés. Les feuilles
d’épinards contiennent des acides aminés. La réaction avec la ninhydrine est :

(Bleu-violacé)
Le passage de la solution A sur IR 410 (résine anionique forte à groupements aminés quaternaires) est
une phase de fixation des acides organiques sur cette dernière selon l’équation :

Le passage de CO3(NH4)2 sur IR 410 a pour but de décrocher les acides organiques fixés sur la résine
(c’est la phase d’élution) selon l’équation :

Le chauffage du mélange du KOH avec la solution C produit une réaction de saponification

(transformation des acides gras en savon) selon l’équation:

R-COOH + KOH R-COOK + H2O

 Calcul de l’indice de saponification

L’équation de la réaction de dosage de KOH

H2SO4 + 2KOH K2SO4 + 2H2O

 La quantité de H2SO4 nécessaire pour neutraliser la totalité de KOH dans le témoin (X) :

X = C H2SO4.VT or C=n/q avec n=1 et q=2 donc X = 8,3· 10ˉ3 / 2 d’où X= 4, 15 · 10ˉ3 mol
 La quantité de H2SO4 nécessaire pour neutraliser l’excès de KOH dans les essais (X')
X' = C H2SO4 × VM or C=n/q avec n=1 et q=2 donc X' = 6,2 ·10ˉ3/ 2 d’où X'= 3,1·10ˉ3mol
 La quantité de KOH impliqué dans la réaction de saponification (nKOH)
 Dans 10 ml de solution C
nKOH = 2nH2SO4 → nKOH = 2 (X - X’) → nKOH = 2 (4,15· 10ˉ3- 3,1· 10ˉ3) d’où nKOH = 2,1· 10ˉ3 mol
 Dans 43 ml de solution C
nKOHT =(VC × nKOH ) / 10 → nKOHT = (43× 2,1· 10ˉ3) / 10 d’où nKOHT = 9,03· 10ˉ3mol
 Détermination de la masse de KOH
mKOH = nKOHT × MKOH → mKOH = 9,03.10ˉ3 mol × 56 g/mol => mKOH= 505,68 mg
 Détermination de l’indice de saponification
L’indice de saponification (Is) est la quantité de (KOH) en mg nécessaire pour saponifier ou
neutraliser la totalité des acides gras contenus dans 1 g de matière grasse (feuilles d’épinard).
Is=mKOH / m m = la masse initiale de feuille d’épinards broyées (12,5g)
Is=505,68mg x1g /12,5g donc Is=40,45mg

Conclusion
Ce travail pratique nous a permis de se familiariser avec les techniques utilisées pendant la
chromatographie sur colonne échangeuse d’ions. Ainsi nous avons eu à séparer les acides aminés et les
acides organiques à partir d’un extrait végétal, puis à déterminer l’indice de saponification de ces acides
organiques. Cette technique requiert d’une très grande importance sur le plan alimentaire surtout
sanitaire et pharmaceutique. Les épinards sont bons pour le système digestif.