Licence Professionnelle : Industrie Chimique et

Pharmaceutique - Bonnes Pratiques

de Laboratoire et de Fabrication
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NOM Prénom : DARCEL Christophe / PICQUET Michel Jeudi 18 Décembre 2003

Module LCP3 : Méthodes d'analyses Spectroscopiques et

Chromatographiques

Examen de Chromatographie

On rappelle qu'en chromatographie, pour une phase mobile de vitesse moyenne u , l'équation de
van Deemter s'exprime par le relation simplifiée suivante :

B
H A C.u où B est proportionnel au coefficient de diffusion DG
u
du soluté dans la phase mobile, et C lui est
inversement proportionnel.
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On considère le ( )-1-phényléthane-1,2-diol A dont la structure est représentée ci-dessous.

HO OH

A - Chromatographie en phase gazeuse (CPG)

1 - Comment appelle-t'on le paramètre H ? Rappeler brièvement sa signification vis-à-vis

d'une séparation chromatographique. (1 point)
- H = Hauteur Equivalente à un Plateau Théorique (HEPT)
- La colonne est divisée en petits tronçons de longueur H [tels que la concentration de
soluté dans la phase mobile qui sort du tronçon est en équilibre avec la concentration du soluté
dans la phase stationnaire du tronçon]. Plus le nombre de ces tronçons est élevé, i.e. plus ces
tronçons sont de petite taille, et plus la séparation sera efficace.

1
 2 - Dans le cas de l'utilisation d'une colonne CPG capillaire, quel est le principal type
d'injecteur utilisé ? (1 point)
Pour les colonnes capillaires, on utilise principalement des injecteurs de type
split/splitless.

3 - Un utilisateur inexpérimenté a injecté une quantité trop importante du composé A ci-

dessus dans un chromatographe en phase gazeuse. Quelle sera l'allure du pic obtenu par rapport à
un pic idéal qui serait parfaitement Gaussien ? Justifier en quelques lignes en expliquant de façon
qualitative ce qui se passe alors dans la colonne. (3 points)
Lors de l'injection d'une trop grande quantité de soluté dans une colonne CPG, la phase
stationnaire se retrouve saturée et, en 1ère approximation, on peut considérer qu'une grande partie
de l'échantillon reste dans la phase mobile. On peut alors concevoir que cette fraction de
l'échantillon sortira très vite, conduisant à une montée abrupte du pic, tandis que le reste, ralenti
par la phase stationnaire, génèrera une traînée ("Tailing").

Le ( )-1-phényléthane-1,2-diol est utilisé comme groupement protecteur de fonctions

carbonyle.

O - H2O
+
HO OH R1 R2 O O

B R1 R2
A
C

4 - Après réaction, on désire connaître par CPG la teneur en diol A résiduel du brut
réactionnel. Parmi les différentes méthodes d'analyse quantitative vues en cours, laquelle
utiliseriez-vous ? Justifier en quelques lignes. (2 points pour une des deux méthodes)
On pourra utiliser, au choix, la méthode de l'étalonnage externe ou de l'étalonnage
interne. Il ne serait pas judicieux d'utiliser la méthode par normalisation interne car elle ne
conduit qu'aux pourcentages relatifs des constituants de l'échantillon qui génèrent un pic
chromatographique or nous ne sommes pas sûrs ici que tous ces constituants sortent de la colonne
(ex. : formation d'un polymère, etc...).
- Etalonnage externe : cette méthode donnera des résultats très fiables à conditions d'avoir
une bonne reproductibilité des injections (volume, temps de séjour de l'aiguille,...). Elle sera
surtout utilisée si on dispose d'un chromatographe récent (stable) et équipe d'un passeur
d'échantillon (reproductibilité). Cette méthode présente l'avantage de na ne pas utiliser un étalon
autre que le diol de départ puisqu'il suffit d'injecter des solutions de diol de différentes
concentrations avant d'injecter l'échantillon à doser.
- Etalonnage interne : cette méthode est la plus générale car s'adapte à tout type de
chromatographe. Il faudra toutefois choisir convenablement l'étalon et avoir déterminé le
coefficient de réponse du diol par rapport à cet étalon. L'avantage de cette méthode est qu'elle est
indépendante du volume exactement injecté à partir du moment où l'on reste dans une même
gamme.
2
 B - Chromatographie liquide-solide

On dépose le brut réactionnel précédent en haut d'une colonne de chromatographie sur

silice.
5 - En utilisant l'équation de van Deemter rappelée ci-avant, expliquer pourquoi il ne faut
pas tarder à éluer le mélange une fois qu'il a été déposé en tête de colonne (on considèrera que
dans le cas d'une chromatographie sur colonne de silice, la vitesse moyenne u de la phase mobile
est relativement faible). (3 points)
Dans le cas d'une vitesse d'élution u faible, voire nulle dans le cas d'un temps d'attente
après dépôt, on peut considérer que le terme B / u devient prépondérant par rapport au terme
C.u dans l'équation de van Deemter (i.e. B / u grand devant C.u ). La valeur de H sera donc
directement régie par celle de B, valeur qui est proportionnelle au coefficient de diffusion DG.
Ainsi, plus il y aura diffusion du mélange, plus la valeur de H sera élevée et donc moins la
séparation sera efficace.
C'est ce qui se passe si on dépose le mélange en tête de colonne puis que l'on attend sans
éluer. Les composés vont diffuser dans la phase mobile (éluant) et la valeur de H va ainsi
augmenter (on élargit le "front de migration"). La séparation des différents constituants du
mélange sera donc moins efficace ("on en sera encore à éluer la fin du premier composant quand
le second va arriver").

C - Chromatographie liquide haute performance (HPLC)

Le ( )-1-phényléthane-1,2-diol A peut être synthétisé sous sa forme optiquement active (NB : on

ne vous demande pas de donner le mode d'obtention de ce composé). Une analyse HPLC est effectuée
pour en déterminer la pureté optique.
On dispose d'une colonne HPLC chirale de type Chiralcel OB :

OR CH3

O O
RO O
OR R= N CH3
n H

Un rapide bilan des solvants de qualité HPLC disponibles au laboratoire donne : hexane, eau,
acétonitrile et isopropanol.

6 - Quel type d'éluant faut-il utiliser avec ce type de phase ? (1 point)

Il faut un éluant apolaire (ex. : hexane avec E alcool tel que EtOH, iPrOH)

7 - Donner les interactions qui seront mises en jeu dans la séparation des deux
énantiomères du 1-phényléthane-1,2-diol. (2 points, soit 0,5 point par interaction identifiée)

3
 - Formation de complexes diastéréoisomères par LIAISONS HYDROGÈNE ou
INTERACTIONS DIPOLAIRES entre le soluté et la cellulose
- INCLUSION de la partie aromatique du soluté dans les cavités chirales du réseau
polymère. La sélectivité est apportée principalement par des considérations d'ordre STÉRIQUE.

8 - Comment procéderiez-vous améliorer la séparation suivante (indiquer brièvement les

facteurs sur lesquels on peut influer) : (3 points)
- la polarité du solvant : diminuer la quantité du solvant le plus polaire (ex. : iPrOH)
- diminuer la température - Influence sur la viscosité de l'éluant
- diminuer le débit de l'éluant

9 - Calculer le facteur de résolution R entre les deux pics du chromatogramme précédent.

A partir de quelle valeur de R peut-on considérer que deux pics sont parfaitement séparés ? (2
points)
- R 1,18 ( tR12 tR21) 1,18 11,,56
21
0, 92
avec tR1 et tR2 : temps de rétention des deux pics ; 1 et d2 : largeur à mi-hauteur des
deux pics
- A partir de R=1,5, on peut considérer que deux pics sont résolus

10 - On considère un 1,3-dioxolane de type C. (2 points)

Peut-on séparer les différents isomères sur une colonne de type Chiralcel OB ? Combien
peut-on attendre de pics au maximum ?
On peut séparer les 4 différents isomères sur une colonne de type Chiralcel OB. Au
maximum, 4 pics.

Peut-on séparer ces mêmes isomères sur une colonne remplie de phase achirale ? Combien
peut-on attendre de pics ?
Sur colonne achirale, on sépare les 2 diastéréoisomères (2 couples de diastéréoisomères).
Au maximum, 2 pics.

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 Licence Professionnelle : Industrie Chimique et
Pharmaceutique - Bonnes Pratiques
de Laboratoire et de Fabrication
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NOM Prénom : DARCEL Christophe / PICQUET Michel Jeudi 02 Septembre 2004

Module LCP3 : Méthodes d'analyses Spectroscopiques et

Chromatographiques

Examen de Chromatographie

On rappelle qu'en chromatographie, pour une phase mobile de vitesse moyenne u , l'équation de
van Deemter s'exprime par la relation simplifiée suivante :

B
H A C.u où B est proportionnel au coefficient de diffusion DG
u
du soluté dans la phase mobile, et C lui est
inversement proportionnel.
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A - Chromatographie - Généralités

Soit le chromatogramme ci-dessous où le pic 1 correspond à un composé non retenu par la

phase stationnaire et le pic 2 correspond à un composé retenu cette phase.

1
 1 - Indiquer sur ce chromatogramme les grandeurs caractéristiques suivantes :
- le temps mort tM,
- le temps de rétention tR du composé 2,
- le temps de rétention réduit t'R du composé 2.
Le temps mort correspond au temps de rétention du composé 1 non retenu par la phase
stationnaire.
Le temps de rétention du composé 2 correspond à l'abscisse du sommet du pic 2.
Le temps de rétention réduit du composé 2 est la différence entre son temps de rétention et
le temps mort.
(voir chromatogramme ci-avant)

2 - En négligeant les volumes morts de l'injecteur et du détecteur, et en considérant qu'à

débit D constant, on peut passer de la grandeur "temps" (t) à la grandeur "volume" (V) par la
relation V = t x D :
- Comment peut-on déterminer, d'après le chromatogramme, le volume de phase mobile
dans la colonne ?
Le composé 1 n'étant pas retenu par la phase stationnaire, et donc étant seulement
transporté par la phase mobile, son temps de rétention correspond au temps que met la phase
mobile pour traverser la colonne (en négligeant les temps morts dûs aux volumes mort de
l'injecteur et du détecteur). Le volume de phase mobile dans la colonne est donc : VM = tM x D

- Le volume de phase stationnaire apparaît-il sur le chromatogramme ? Si non, comment

peut-on le calculer ?
Le volume de phase stationnaire n'apparaît pas sur le chromatogramme. Toutefois, on peut
le calculer en retranchant le volume de phase mobile calculé ci-avant au volume total de la
colonne (connu d'après ses dimensions).

- Comment peut-on, toujours d'après ce chromatogramme, calculer le facteur de rétention

k du composé 2 ?
Le facteur de rétention k est donné par la relation : k = t'R / tM

- En règle générale, préfère-t'on avoir une valeur de k élevée ou faible ? Pourquoi ?

On préfère avoir une valeur de k faible pour ne pas allonger les durées d'analyse.

B - Chromatographie en phase gazeuse (CPG)

3 - Quels sont les principaux gaz vecteurs utilisables en CPG ?

Dihydrogène (H2), hélium (He) et diazote (N2).

- Quelles sont les précautions à prendre vis-à-vis de ces gaz pour ne pas endommager la
colonne ?
Ces gaz doivent être de pureté suffisante et notamment être séchés et désoxygénés (au
moyen de cartouches).
4 - Si vous avez à choisir un de ces gaz pour alimenter un appareil de CPG, quels peuvent
être les critères qui influenceront votre choix ?
2
- la vitesse d'analyse (vitesse optimale du gaz vecteur),
 - les conditions de température utilisées (la viscosité de certains gaz augmente avec la
température, ce qui entraîne une perte d'efficacité [perte de charge]),
- la sécurité (utilisation de H2).

5 - En utilisant l'équation de van Deemter, expliquer quelle sera la différence entre un gaz
vecteur de densité élevée et un gaz vecteur de plus faible densité.
Lors de l'utilisation d'une gaz vecteur dense (ex. : N2), il y aura de nombreux chocs entre
les molécules de gaz vecteur et la substance à analyser. On peut donc considérer que cette
substance sera "poussée" dans la colonne par le gaz sans qu'elle n'aie le temps de diffuser. Le
coefficient de diffusion DG sera donc petit, ce qui entraîne que dans l'équation de van Deemter, la
valeur de B sera également faible tandis que celle de C sera grande. Par suite, le terme C.u
l'emporte sur le teme B/u et l'équation de van Deemter devient en première approximation :
H A C.u
Pour avoir une efficacité maximum de la colonne (donc H le plus petit possible), il faudra
utiliser une vitesse de gaz vecteur (u) faible et les durées d'analyse seront donc allongées.

A l'inverse, avec un gaz vecteur de faible densité (ex. : H2), la substance subit moins de
chocs avec le gaz vecteur et a le temps de diffuser. Dans l'équation de van Deemter, c'est alors le
terme B/u qui l'emporte et l'équation devient :
B
H A
u
On pourra alors utiliser une vitesse élevée du gaz vecteur, ce qui permettra de raccourcir
les temps d'analyse.

6 - Citer les trois grandes familles de colonnes CPG et leurs principales caractéristiques.
- Colonnes remplies :
- tube de diamètre 1/8" ou 1/4" (3,18 ou 6,35 mm),
- débit : 10 à >40 ml / min,
- remplie de petites sphères, d'environ 0,2 mm de diamètre, d'un support poreux sur
lequel est greffée ou imprégnée la phase stationnaire (Chromosorb),
- de moins en moins utilisées car ont été supplantées par les colonnes capillaires ou
wide bore.
- Colonnes capillaires :
- colonnes les plus utilisées,
- préparées à partir de "silice fondue" très pure, obtenue par combustion de SiH4 ou
SiCl4 dans une atmosphère d'O2. Elles sont revêtues extérieurement de polyimide, polymère
mécaniquement et chimiquement protecteur (jusqu'à 370 °C).
- diamètre interne varie de 0,1 à 0,35 mm et la longueur de 5 à 100 m,
- phase stationnaire greffée sur la paroi interne de silice.
- Ces colonnes permettent l'analyse de traces et offrent de très bonnes résolutions
pour des débits de quelques ml/min.
- Colonnes "wide bore" ou 530 m :
- autres noms : megabore, macrobore ou ultrabore, selon les fabricants,
- conception proche des colonnes capillaires (phase stationnaire greffée sur la paroi
interne) mais ont un diamètre de 0,53 mm et une longueur de 5 à 50 m,
- moins efficaces que les colonnes capillaires, elles ont l'avantage de s'adapter sur
3
des appareils anciennement équipés de colonnes remplies
 C - Chromatographie liquide haute performance (HPLC)

7 - Donner deux types d'injecteurs utilisés en HPLC.

Dans un mode moyenne ou haute pression, lequel utilisera-t'on le plus couramment ?
Donner le principe et un schéma de ce type d'injecteur.
- Injection par seringue via un septum. Peu adapté à la moyenne et haute pression : injection à pression
atmosphérique par système « stop-flow ». on arrête le débit de la ^hase mobile, on met à pression
atmosphérique en aval de la tête d’injection , on injecte et on remet la pression.
- Injecteur type vanne d’échantillonnage (vanne Rheodyne) : le plus utilisé actuellement
Schéma (voir cours). L’opération se fait en deux temps ; 1) remplissage de la boucle 2) la vanne fait
communiquer la boucle (à pression atmosphérique) avec le flux de la phase mobile (à haute ou moyenne
pression)

8 - Au laboratoire, nous avons en réserve ces quatre solvants de qualité HPLC : hexane,
eau, éther diéthylique, méthanol. Classer ces quatre solvants selon leur pouvoir éluant lorsque l'on
utilise :
une colonne avec une phase polaire normale,
hexane < éther diéthylique < méthanol < eau

une colonne avec une phase à polarité inversée.

Eau < méthanol < éther diéthylique < hexane

9 - Chromatographie d'absorption en phase inverse.

Donner brièvement le principe, les avantages et les désavantages de ce type de
chromatographie.
Principe : c’est une chrommatographie d’adsorption liquide-solide dans laquelle la phase stationnaire se
distingue par son apolarité. Elle est constituée par des silices apolaires greffées. Il existe des greffons
apolaires de taille différente de 2 à 18 atomes de carbone , donc de polarité différentes. La phase mobile
est polaire et hydrophile. La séparation sont fondées sur des interactions hydrophobes entre les molécules
à séparer et la phase stationnaire.
Avantages : -possibilité de séparation de solutés de nature non ionique, ionisable et ionique
- séparation de solutés ioniques de ceux qui sont ionisables
- séparations rapides et ré-équilibration courtes
Désavantages : - la plage des pH utilisables se situe entre 2 et 7,5 pour des phases à base dee silice
- mécanisme de rétention complexe
- pics à effet de queue pour les composés polaires et les bases
- Quel type d'éluant doit-on utiliser pour avoir une séparation optimale ?
Solvants de type polaire avec eau, alcool majoritaire

4
 10 - On considère l'acide 2-phénylbutanoïque pur et son chromatogramme ci-dessous.

- Commenter les conditions utilisées pour réaliser cette séparation (élution, débit,
détection). Elution : de type polaire (aqueuse) ; Débit normal (entre 0 et 1 mL/min, classique pour
une HPLC de type analytique) ; Détection UV 254 nm (présence de chromophores UV sensible
phényle et carbonyle)
- Quel type de colonne est la colonne Chiralcel OD-R (normale, inverse, ...) ? inverse
(utilisation de phase mobile de type polaire)
- Nous observons deux signaux de même intensité (en aire sous le pic). Qu'en déduit-on à
propos de la colonne utilisée ? la molécule est chirale et racémique ; s’il y a deux pics d’égale
intensité c’est que la phase stationnaire est chirale ce qui permet de faire des complexes
diastéréoisomères sur la colonne et ainsi séparer les deux isomères.
Calculer le facteur de résolution R entre les deux pics de ce chromatogramme.
R = 1,18*(tR2-tR1)/( 1+ 2) = 1,18*(1,1)/(0,82) = 1,58
Avec tR1 et tR2 : temps de rétention des deux pics et 1 et 2largeur à mi-hauteur des deux pics
- A partir de quelle valeur de R peut-on considérer que les deux pics sont parfaitement
séparés ? A partir de R=1,5, on peut considérer que les deux pics sont résolus

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 Licence Professionnelle : Industrie Chimique et
Pharmaceutique - Bonnes Pratiques
de Laboratoire et de Fabrication
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NOM Prénom : Mardi 12 Décembre 2005

Module LCP3 : Méthodes d'analyses Spectroscopiques et

Chromatographiques

Examen de Chromatographie

On rappelle qu'en chromatographie, pour une phase mobile de vitesse moyenne u , l'équation de van
Deemter s'exprime par le relation simplifiée suivante :
B où B est proportionnel au coefficient de
H A C.u diffusion DG du soluté dans la phase mobile, et
u C lui est inversement proportionnel.
-------------------

1
 A – Chromatographie – Généralités

1 – Dans la théorie des plateaux, comment appelle-t'on le paramètre N ? Dans cette même
théorie, ainsi que dans l'équation de van Deemter, comment appelle-t'on le paramètre H ? Quelle
relation relie ces deux paramètres ?
2 – Quelle va être l'efficacité d'une séparation chromatographique en fonction de la valeur de H
?

B - Chromatographie en phase gazeuse (CPG)

3 – Le technique "Headspace", développée en CPG depuis quelques années, permet d'effectuer

l'analyse de composés volatils s'échappant d'une substance liquide ou solide. Lors de l'application de
cette technique à l'analyse d'un morceau de gâteau, le chromatogramme obtenu révèle la présence de
limonène (arôme du citron, pic 1) et de vanilline (arôme de vanille, pic 2).

OH
OMe

CHO

3.1 – En admettant que le limonène n'est pas retenu par la phase stationnaire, à l'inverse de la
vanilline, indiquer sur ce chromatogramme les grandeurs caractéristiques suivantes :
- le temps mort tM de la colonne,
- le temps de rétention tR de la vanilline,
- le temps de rétention réduit t'R de la vanilline.

3.2 - En négligeant les volumes morts de l'injecteur et du détecteur, et en considérant qu'à débit
D constant, on peut passer de la grandeur "temps" (t) à la grandeur "volume" (V) par la relation V = t x
D:
- Comment peut-on déterminer, en s'aidant du chromatogramme, le volume de phase
stationnaire dans la colonne ?
- Comment peut-on, d'après ce chromatogramme, calculer le facteur de rétention k de la
vanilline sur cette colonne ?
- De quoi k est-il révélateur ? En règle générale, préfère-t'on avoir une valeur de k élevée ou
faible ? Pourquoi ?

2
 3.3 – Le gâteau, apporté par un étudiant qui ne souhaite pas révéler sa recette, étant excellent, les
enseignants décident de doser par CPG les différents arômes présents. Pour cela, ils réalisent une
solution par extraction d'un morceau du gâteau et disposent d'un chromatographe en phase gazeuse
équipé notamment d'un injecteur split, d'une colonne HP-5 et d'un détecteur à ionisation de flamme
(FID).
- A leur place, et en tenant compte notamment de l'allure des courbes de van Deemter ci-avant,
quel gaz vecteur utiliseriez-vous ? Justifier.
- Donner un protocole et les conditions à respecter pour déterminer les teneurs massiques
exactes en chacun des arômes dans l'échantillon.
- Sans étalonnage, est-il possible de déterminer les proportions approchées de ces deux arômes ?
Justifier.

3.4 - Un des étudiants , inexpérimenté en CPG, a injecté une quantité trop importante du
mélange ci-dessus. Quelle sera l'allure des pics obtenus par rapport à un pic idéal qui serait parfaitement
Gaussien ? Justifier en quelques lignes en expliquant de façon qualitative ce qui se passe alors dans la
colonne.
C – Chromatographie Liquide Haute Performance
On effectue l’analyse HPLC d’un mélange réactionnel constitué du composé A en solution dans le
toluène. La séparation chromatographique a été obtenue sur une colonne de silice greffée NH2 de 15 cm
de longueur à une température de 23°C. La phase mobile est utilisée avec un débit de 1,0 mL/min et la
pression en tête de colonne est de 33.105 Pa. Le temps mort de la colonne est 0,6 minute.

Les résultats sont rassemblés dans le tableau suivant :

Nom du composé tR (min.) Largeur du pic à mi-hauteur (min.)

Toluène 1,83 0,08

A 2,62 0,20
3,03 0,25

1) Quelle type de colonne est utilisé ? Donner les principales caractéristiques de ce type de colonne.
2) Quel système éluant doit-on utiliser avec ce type de colonne ? Proposer deux solvants susceptibles de
composer un système éluant acceptable pour ce type de colonne en indiquant lequel vous utiliseriez
majoritairement.
3) Quel type de détecteur classique utiliseriez vous en indiquant pourquoi vous le (les) choisissez et
dans quelles conditions vous le (les) utiliseriez.
4) Justifier que le composé A soit à l’origine de deux pics sur le chromatogramme.
5) Calculer le facteur de résolution R entre les deux pics du composé A puis indiquer s’ils sont
correctement séparés. Justifier votre réponse.
Calculer également le facteur de séparation des deux pics du composé A.
6) Si la séparation n’est pas correcte, sur quels paramètres pouvez vous influer pour l’améliorer.
7) le composé A est hydrolysé et l’alcool obtenu est analysé en HPLC. Quelle type de colonne doit-on
utiliser pour séparer les deux isomères de cet alcool ? Donner les principales interactions qui seront
mises en jeu dans cette séparation.
3
e
allongés
s s
n