ESPECTROFOTOMETROS UV/VIS

2025
 Espectrofotómetros

Un espectrofotómetro UV-VIS es un instrumento

diseñado para medir la absorbancia en la región UV-
VIS mediante la ley de Beer-Lambert. Mide la
intensidad de la luz que atraviesa una solución de
muestra en una cubeta y la compara con la intensidad
de la luz antes de atravesar la muestra.
Los componentes principales de un espectrofotómetro
UV-VIS son una fuente de luz, un porta muestras, un
dispositivo de dispersión para separar las distintas
longitudes de onda de la luz y un detector adecuado.
 COMPONENTES BÁSICOS
•Fuente de luz

Genera una banda ancha de radiación electromagnética. Por lo general, se usa

una lámpara de deuterio para el rango ultravioleta y una de tungsteno para el
visible.
•Dispositivo de dispersión (Monocromador)

Separa la radiación en longitudes de onda. Puede ser un prisma o una rejilla de

difracción.
•Área de muestra

Lugar donde la luz pasa a través de la muestra. Puede ser intercambiable para
muestras líquidas y sólidas.
•Detector

Mide la intensidad de la radiación transmitida o reflejada. Puede ser un fotodiodo,

un fotomultiplicador o un detector de estado sólido.
•Electrónica y software

Controla el funcionamiento del espectrofotómetro, analiza los datos y presenta los

resultados.
  Un solo haz
 Doble haz
 Arreglo de Diodos
 Doble dispersión

CLASIFICACIÓN
 ESPECTROFOTÓMETRO DE UN
SOLO HAZ

 Un espectrofotómetro de un solo haz es

un dispositivo que mide la absorción de luz de
una sustancia utilizando un haz de luz para
determinar su concentración, pureza y
características químicas. Los
espectrofotómetros monohaz cubren la gama
de longitudes de onda de UV a visible y ofrecen
mediciones muy fiables.
Conventional Spectrophotometer

Schematic of a conventional single-beam spectrophotometer

F undamentals of modern UV-visible spectroscopy

F igure : 23
 CARACTERISTICAS
 Equipo sencillo y económico
 Trabajan en la región Vis y otros en la región UV/Vis
(190/320 – 800/1100)nm.
 Producen anchos de banda de 2 - 8 nm.

DESVENTAJAS
 Presencia de ruido de “parpadeo” de las fuentes y
detectores
 Cambios de intensidad de la fuente y sensibilidad del
detector con la longitud de onda de trabajo
  Un espectrofotómetro de doble haz es
un instrumento que mide la absorbancia o
transmitancia de la luz de una muestra. Compara la
intensidad de la luz entre dos trayectorias, una con
la muestra de referencia y la otra con la muestra de
prueba.

ESPECTROFOTÓMETROS DE
DOBLE HAZ
ESPECTROFOTÓMETRO DE DOBLE HAZ
 VENTAJAS

• Son rápidos y precisos

• Corrigen automáticamente la pérdida de intensidad de la
luz
• Son adecuados para muchas aplicaciones analíticas
• Son útiles para medir la absorción y la transmisión en
función de la longitud de onda
ESPECTROFOTÓMETROS UN SOLO HAZ VS. DOBLE
HAZ
 ESPECTROFOTÓMETRO CON
ARREGLO DE DIODOS
 Un espectrofotómetro de matriz de diodos es un tipo diferente de diseño
óptico de haz único en comparación con un diseño dispersivo. Los
instrumentos de matriz de diodos están optimizados para la adquisición
rápida y simultánea de un espectro UV/Vis completo.
 El diseño es algo así como un instrumento de haz único dispersivo, excepto
que la rejilla de difracción está después de la muestra para dispersar
directamente la luz transmitida desde la muestra sobre un detector de matriz
de diodos.
 La luz transmitida desde la muestra ilumina el detector de matriz de forma
continua, lo que permite una rápida recopilación de datos espectrales. Una
novedad adicional es el uso de ambas lámparas fuente simultáneamente
para iluminar la muestra con todas las longitudes de onda de luz desde 190
nm hasta 1100 nm. Un instrumento de matriz de diodos puede recolectar un
espectro UV/Vis de rango completo en milisegundos a segundos.
ESPECTROFOTÓMETRO CON ARREGLO DE
DIODOS
ESPECTROFOTÓMETRO CON ARREGLO
DE DIODOS
 INSTRUMENTOS DE DOBLE DISPERSIÓN

 El espectrofotómetro de doble monocromador

logra una alta linealidad al garantizar una luz
difusa extremadamente baja en comparación
con un sistema de un solo monocromador.
Este tipo de instrumento es adecuado para
mediciones de soluciones de muestra de alta
concentración y materiales de baja
transmitancia, como filtros óptico
INSTRUMENTOS DE DOBLE DISPERSIÓN
 ESPECTRO ELECTROMAGNÉTICO

El espectro electromagnético comprende desde la

radiación de energía baja y frecuencia baja que se
desplaza en ondas largas (como las ondas de radio y
las microondas) hasta la radiación de energía alta y
frecuencia alta que se desplaza en ondas cortas
(como los rayos X y los rayos gamma).
 PROPIEDADES DE UN PRISMA

Cuando la luz
incide en un
objeto, la luz
puede ser:

 Reflejada
 Absorbida,
 Transmitida
 Difractada.
ESPECTRO ELECTROMAGNÉTICO
 TRANSMITANCIA REGULAR ESPECTRAL

Transmitancia es la fracción de luz que pasa a través de

la muestra y se define como la intensidad de luz que pasa
a través de la muestra sobre la intensidad de luz
incidente.

T = 100 (I / Io)
 ABSORBANCIA

Absorbancia es el logaritmo inverso de

la transmitancia y la cantidad de que su
espectrofotómetro medirá.

La relación entre %T y la concentración no es lineal,

pero asume una relación logarítmica inversa. La
absorbancia (A) es un concepto más relacionado con
la muestra puesto que nos indica la cantidad de luz
absorbida por la misma, y se define como el logaritmo
de 1/T, en consecuencia:

A = log 1/T = -log T = -log It/ Io

 LEYES DE LA ESPECTROFOTOMETRIA

 Figura 3. La segunda
película transmite el
70% de la luz que
recibe, o 49% (0.70 x
70%) de la luz original:
 I/Io = 0.49 T = 49%
A = - log10(0.49) = 0.310
 Figura 4. La tercera
película transmite el
70% de la luz que
recibe, o 34.3 % (0.70 x
49%) de la luz original:


 I/Io = 0.343 T =
Figura 1. Como no hay ninguna película en el paso de
haz de luz que absorba radiación, entonces el detector 34.3%
da una lectura de T=100% y A =0 A = - log10(0.343) = 0.465
 Figura 2. Una única película esta en el paso del haz
de luz, y su transmitancia es del 70%, entonces:
 I/Io = 0.70 T = 70% A = - log10(0.70) = 0.155
 LEY DE LAMBERT

 Se puede concluir que la absorbancia es

proporcional al número de películas de
material coloreado teniendo en cuenta que
cada una de las películas tiene un espesor
constante en cada una de ellas.
 LEY DE BEER

Figura 1 sin adición de un colorante. T=100% y A =0

Figura 2. la adición de una gota de colorante rojo a una de las cubetas

reduce la transmitancia a 70% A = - log10(0.70) = 0.155

Figura 3. La adición de una gota a la segunda cubeta reduce la transmitancia

a 49% (A = 0.310) duplicando la absorbancia como lo indica la ley de
Lambert, ya que la longitud que el haz atraviesa por el material colorido es
ahora el doble de la longitud inicial. A = - log10(0.49) = 0.310
 LEY DE BEER

Figura 1 sin adición de un colorante. T=100% y A =0

Figura 2. agregamos la primer gota en la primera cubeta

A = - log10(0.70) = 0.155

Sin embargo, si agregamos la segunda gota en la primera cubeta se

obtiene exactamente el mismo resultado que cuando fue agregada a la
segunda cubeta. A = - log10(0.49) = 0.310

En este caso, la longitud sigue siendo la misma inicial y final, pero la

concentración de material colorante ha sido duplicada, duplicando
también la absorbancia. A ese efecto se le conoce como la Ley de
Beer:
 LEY LAMBER-BEER

La ley de Beer–Lambert relaciona la absorción de la

luz de una solución con las propiedades de la
solución según la siguiente ecuación:
A = εbc, donde ε es la absortividad molar de las
especies absorbentes, b es la longitud del recorrido
y c es la concentración de las especies
absorbentes.
TRAZABILIDAD

Certificado Holmio
Informe Barrido Análisis
Hora Informe: Mié 05 Jun 12:06:32 PM 2019
Método:
Baño: C:\Documents and Settings\gvalenci\Escritorio\Laboratorio1 - EA2019\CM YCIA.DSW
Versión Software: 3.00(339)
Operador:

Nombre Muestra:muestra1
Hora Colección 05/06/2019 12:06:37 p.m.

Tabla Picos
Peak Style Picos
Umbral Picos 0.0100
Rango 650.00nm a220.00nm

Long. Onda (nm) Abs

________________________________
637.95 0.158
536.60 0.307
484.60 0.113
473.25 0.110
460.00 0.808
453.60 0.783
446.05 1.670
418.60 0.195
385.90 0.078
361.05 0.559
347.90 0.085
333.95 0.111
287.85 0.257
279.45 0.290
241.65 0.636
 EXACTITUD DE LA ESCALA DE ABSORBANCIA EN LA REGIÓN UV/ AbsorbanceScaleAccuracy intheUltraviolet Region
Longitud de Lectura Media Incertidum bre Ecuación de regresión
MRC (A) Error (A)
onda (nm ) (A) (A) lineal R2
Wavelenght (nm) CRM (A) AverageMeasure(A) Error (A) Uncertainty (A) Linear regressionequation
0,2381 0,2457 0,0076 0,0038
0,4890 0,4850 -0,0040 0,0045
235 nm 0,7373 0,7320 -0,0053 0,0049 1,01602 x + ( -0,0080 ) 0,9999
0,9767 0,9710 -0,0057 0,0058
1,2467 1,2353 -0,0114 0,0069

220nm, 235 nm, 257 nm, 275 nm, 313 nm, y 350nm
 EXACTITUD DE LA ESCALA DE ABSORBANCIA EN LA REGIÓN VISIBLE/ AbsorbanceScaleAccuracy intheVisibleRegion

Longitud de Lectura Media Incertidum bre Ecuación de regresión

MRC (A) Error (A)
onda (nm ) (A) (A) lineal R2
Wavelenght (nm
) CRM (A) AverageMeasure(A) Error (A) Uncertainty (A) Linear regressionequation
0,5650 0,5633 -0,0017 0,0028
440 nm 0,7472 0,7420 -0,0052 0,0028 0,99931 x + ( 0,0035 ) 0,9999
1,0419 1,0400 -0,0019 0,0028

405 nm, 410 nm, 420 nm, 440 nm, 450 nm,465 nm, 492 nm, 520 nm,
530 nm, 546,1 nm,550 nm, 560 nm, 570 nm, 590 nm, 605 nm,610 nm,
620 nm, 630 nm, 635 nm, 650 nm,660 nm, 680 nm, 690 nm, 750 nm,
820 nm y 880 nm
 MRC CÓDIGO N° CERTIFICADO FECHA DE CALIBRACIÓN TRAZABILIDAD
CRM Code CertificateNuber CalibrationDate Traceability

ÓXIDO DE HOLMIO 027 62181 2017-03-02 STARNA SCIENTIFIC LTD

DICROMATO DE POTASIO 030 62178 2017-03-02 STARNA SCIENTIFIC LTD
FILTROS DE DENSIDAD NEUTRA 028 62183 2017-03-02 STARNA SCIENTIFIC LTD

TRAZABILIDAD
 CONCENTRACIONES (mg/L)
235 nm
20,0 40,0 60,0 80,0 100,0
P romedio 0,2457 0,4850 0,7320 0,9710 1,2353
R eferencia 0,2381 0,4890 0,7373 0,9767 1,2467
E rro r 0,0076 -0,0040 -0,0053 -0,0057 -0,0114
U repetib 0,0003 0,0000 0,0000 0,0000 0,0003
U P atrón 0,0019 0,0023 0,0025 0,0029 0,0034
U R eso lució n
0,0003
del equipo
U combinada 0,0019 0,0023 0,0025 0,0029 0,0034
Grados Vef 2,12E+03 2,23E+55 1,95E+54 9,99E+02 2,24E+04
F actor K 2,0000 2,0000 2,0000 2,0025 2,0000
U expandida 0,0038 0,0045 0,0049 0,0058 0,0069

FUENTES DE INCERTIDUMBRE
LECTORES DE
ELISA
 ELISA es el acrónimo en inglés para
enzimoinmunoanálisis de adsorción. Se trata
de un examen de laboratorio comúnmente
usado para detectar anticuerpos en la sangre.
Un anticuerpo es una proteína que el sistema
inmunitario del cuerpo produce cuando detecta
substancias dañinas, llamadas antígenos
 Un lector ELISA es
un instrumento diseñado para
medir la absorbancia de
muestras contenidas en
pocillos de microplacas,
normalmente en formato de 96
pocillos.
Las microplacas son equipos de laboratorio
que consisten en una placa con múltiples
cavidades (pocillos) que se utilizan como
pequeños tubos de muestra . También se las
conoce como placas de microtitulación o
multipocillos y, por lo general, vienen en
formatos de 6, 12, 24, 48, 96, 384 o 1536
pocillos, siendo el formato de 96 pocillos el
más utilizado.
Componentes lector de Elisa
 RESULTADOS DE CALIBRACION LECTOR DE ELISA

Longitud de Lectura Media Incertidum bre Ecuación de regresión

MRC (A) Error (A)
onda (nm ) (A) (A) lineal R2
Wavelenght (nm
) CRM (A) AverageMeasure(A) Error (A) Uncertainty (A) Linear regressionequation
0,5650 0,5633 -0,0017 0,0028
440 nm 0,7472 0,7420 -0,0052 0,0028 0,99931 x + ( 0,0035 ) 0,9999
1,0419 1,0400 -0,0019 0,0028

405 nm, 410 nm, 420 nm, 440 nm, 450 nm,465 nm, 492 nm, 520 nm,
530 nm, 546,1 nm,550 nm, 560 nm, 570 nm, 590 nm, 605 nm,610 nm,
620 nm, 630 nm, 635 nm, 650 nm,660 nm, 680 nm, 690 nm, 750 nm,
820 nm y 880 nm