REPLICACIÓN DEL ADN

• Yeneiris Karina Villero Wolf

• Microbióloga
• M.sc en Microbiología Tropical
Micrografía electrónica de transmisión de DNA humano de una célula HeLa, que muestra una horquilla de replicación característica de la replicación activa del
DNA.
 La importancia de la replicación del ADN en la medicina

La replicación del material genético es

mitosis
esencial a la vida

Errores en la replicación son el origen de las

enfermedades hereditarias
meiosis

Errores en la replicación son causa primaria

de canceres

Existen patologías por incapacidad de

reparar errores cometidos en la replicación
mitosis

Los patógenos tambien replican. Entender

estos procesos permite establecer terapias
especifica s

Muchos antibioticos inhiben la replicación

de microorganismos
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 REPLICACIÓN DEL ADN- EXPERIMENTOS PREVIOS
Frederick Griffith, que investigaba varias cepas de neumococo (Streptococcus pneumoniae) (1928)
Experimento de Avery, Macleod y
Mccarty

1944
Solo extractos con ADN
transformaban
 EXPERIMENTO DE KORNBERG

Extrajo la enzima ADN polimerasa

-Muy eficaz
-Necesita de cebador y hebra patrón
-Necesita de una cadena previa
-Solo añade nucleótidos al extremo 3’.
-El crecimiento es 5´- 3
-Nueva hebra, antiparalela y complementaria a la hebra patrón
Tres posibles modelos de replicación
 El experimento de Meselson y Stahl 1957

•La replicación es semiconservativa

•Cada hebra se usa como molde para sintetizar otra
•Los nucleótidos se unen por complementariedad
•Se sintetiza una cadena nueva a partir de cada hebra vieja
•Se respeta la disposición antiparalela de las hebras
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EXPERIMENTO DE CAIRNS

Mantuvo un cultivo de E. coli creciendo

durante dos generaciones sucesivas en un
medio que contenía Timidina tritiada (TH3).

El DNA se estaba abriendo en una zona

(Origen de replicación)

Se estaba formando una hebra nueva

Dos puntos de crecimiento
Bidireccional
Burbuja de replicación
EXPERIMENTO DE OKAZAKI
 Replicación de ADN circular y lineal

1. Theta Cromosoma bacteriano 3. Lineal Cromosoma eucariota

1 origen de replicación

2. Círculo rodante Bacteriófagos

1 origen de replicación
Replicación del DNA
bacteriano
Cell Division in Bacteria Occurs
After Chromosome Replication

1. Replicación del
cromosoma
2. Partición de los
cromosomas hijos
3. Elongación celular
4. Separación de las dos
células hijas por formación
de una pared transversal
El superenrollamiento causa problemas para la
replicación

El ADN es una doble hélice y está

superenrollado.

• Desenrollar las superenrollamiento

• Desenroscar la doble hélice
• Desenredar los dos nuevos círculos
de ADN.
• En E. coli, las dos topoisomerasas de
tipo II, la ADN girasa y la
topoisomerasa IV, resuelven el
problema del superenrollamiento
 MECANISMOS DE
REPLICACIÓN DEL
Helicasas ADN

1. INICIACION
• Reconocimiento de origenes de replicación
• separación de hebra
• Posicionamiento de maquinaria transcripcional

2. ELONGACION
• Crecimiento bidireccional de las horquillas de replicación
• Replicación semiconservativa, semidiscontinua, coordinada

3. TERMINACION
Reconocimiento de señales de terminación Desensamble de
replisomas
 Replicación del DNA bacteriano: iniciación

La proteína DnaA se une primero a las tres cajas DnaA de alta

afinidad.
Iniciación de la replicación en procariotas

Proteínas de iniciación
(DNA A)

Repetidos 13 pb ricos en
AT Repetidos 9 pb

Formación de un bucle y
las cadenas ricas en AT se
se separan

Dna C ayudan a helicasas Las helicasas (dna B)

(dna B) a unirse al ADN. rompen puentes de
Hidrogeno con gasto de
ATP

Replisoma: Conjunto de proteínas (incluyendo

primasa, ADN polimerasa, helicasa, proteína
SSB) que replica el ADN
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 Superenrollamientos positivos

A medida que la horquilla de replicación

avanza a lo largo del ADN, enrolla
demasiado el ADN y genera
superenrollamientos positivos delante del
replisoma.

La ADN girasa se une al ADN antes de la

horquilla de replicación e introduce
superenrollamientos negativos que cancelan
el superenrollamiento positivo. El resultado
neto es que la ADN girasa (topoisomerasas
de tipo IIA) "elimina" el superenrollamiento

Tipo IIA : topo II eucariótica, a la

girasa de E. coli, y a la topo IV de
E. coli.
 Primasa y pri A

En términos químicos, la ADN polimerasa

necesita un 3´-OH preexistente en un azúcar
para unir el nuevo nucleótido.

Esto implica la síntesis de un cebador de ARN

corto cada vez que se inicia una nueva hebra de
ADN.

las ARN polimerasas pueden iniciar nuevas

hebras sin ningún 3´-OH preexistente.

la proteína PriA desplaza las proteínas SSB de

un tramo corto de ADN. Luego, la primasa
(DnaG) se une a PriA.

RNA polimerasa (DnaG, primasa): coloca

primer (ARN de 11- 12 bases) o cebador a
1500 nucleótidos de distancia del OriC.
Polimerización de Nucleótidos (polimerasa III )

Se muestran detalles del crecimiento de la

nueva cadena de ADN.

En cada paso, se agrega un nucleósido

trifosfato.

Durante el alargamiento de la cadena, los

dos grupos fosfato más externos del
precursor se separan, eliminando el
pirofosfato. Esto proporciona energía para
la reacción.

El grupo 3´ OH del precursor trifosfato

permanece disponible para la próxima
adición a la cadena en crecimiento.

Precursor trifosfato
DNA Polimerasa III
Varias subunidades que se combinan en una
holoenzima

2 Enzimas centrales: sintetiza ADN y consta de tres

subunidades,
• DnaE (subunidad α; polimerización),
• DnaQ (subnidad ε; corrección de pruebas)
• HolE (subunidad θ; estabiliza la subunidad ε)
Subunidad β (abrazadera deslizante): dos
subunidades semicirculares de proteína DnaN. Se
desliza hacia arriba y hacia abajo como un anillo
corredizo en cada cadena de ADN molde

Complejo de cargador de Anillo corredizo

• 2 τ (tau), 1 γ (gama), 1 δ (delta), 1 δ´ (delta
prima) : usan ATP para cargar la enzima central
en la abrazadera deslizante

• 1ψ, (psi) 1χ (ji): se unen a la abrazadera

deslizante
Muchas ADN polimerasas poseen capacidad de
corrección cinética

Capacidad de hacer correcciones sobre la

marcha.

Los desajustes se detectan porque provocan

distorsiones menores en la forma de la doble
hélice. La polimerasa se detiene al detectar un
desajuste y elimina el último nucleótido
agregado.

la actividad enzimática que elimina el

nucleótido infractor es una exonucleasa 3´.

En el caso de la ADN polimerasa III, la

revisión se debe a una subunidad separada, la
proteína DnaQ (subunidad ε)
 Dirección de la replicación y fragmentos de Okazaki

• Solo pueden agregar nucleótidos al extremo 3’

de la cadena proliferativa

• Las cadenas de DNA nuevas siempre se

alargan en la misma dirección 5’ a 3 ’ (5’—
>3’).

• En la cadena retrasada, la síntesis del DNA se

inicia en la horquilla y avanza en la dirección
opuesta al desenrollamiento; por ende, el
molde se agota con rapidez.

• La hebra rezagada se forma en segmentos

cortos de 1000 a 2000 bases de longitud,
conocidos como fragmentos de Okazaki
 Cada vez que se inicia un nuevo fragmento de Okazaki, el
ensamblaje Pol III que está creando la hebra rezagada suelta el
ADN y se reubica para comenzar a producir una nueva hebra de
ADN a partir del extremo 3´del cebador de ARN.

Esto implica el desmontaje y la reubicación de la abrazadera

deslizante, que se realiza mediante el complejo de carga de la
abrazadera.

En E. coli, los nucleótidos se agregan aproximadamente 1000

veces por segundo a pesar de estos constantes reordenamientos de
proteínas.
ADN Polimerasa I y ligasa

DNA Pol I degrada los

cebadores de ARN y llena
los huecos resultantes.

Finalmente, la ADN ligasa

se une al esqueleto de
fosfato de azúcar
 Terminación

Secuencias terminadoras
Retienen las horquillas de
replicación
Contienen secuencias que
facilitan la decatenación y
separación de los cromosomas
resultantes
Requieren elementos de
terminación particulares

Los sitios Ter tienen una secuencia consenso de 23

pb que se une a la proteína Tus. Esto bloquea el
movimiento de la helicasa DnaB y detiene el
movimiento de la horquilla de replicación.
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Desenredando los cromosomas hijos

Cuando un cromosoma
circular termina de
replicarse, los dos
nuevos círculos pueden
entrelazarse físicamente
o conectarse en cadena

La topoisomerasa IV
desenreda las moléculas
hijas una vez finalizada
la replicación
 Proteins Involved in DNA Replication in E. coli
DnaA dnaA Inicia la división cromosómica; se une al origen de replicación
Helicasa dnaB Desenrolla la doble hélice
DnaC dnaC Carga DNA helicasa
SSB ssb Proteína de unión de cadena sencilla
Primase dnaG Síntesis de cebadores de ARN
RNase H rnhA Eliminación parcial de cebadores de ARN
(Alternativo)
Polimerasa I polA Degrada los cebadores de RNA y llena los vacíos resultantes
Polymerase III Holoenzima de ADN Pol III
α dnaE Elongación de la cadena
ε dnaQ Corrección cinética
θ holE Estabiliza la subunidad ε
β dnaN Pinza deslizante
τ dnaX Cargador de abrazadera deslizante; dimerización de la enzima central Pol III
γ dnaX Cargador de abrazadera deslizante
δ holA Cargador de abrazadera deslizante
δ’ holB Cargador de abrazadera deslizante
χ holC Cargador de abrazadera deslizante; se conecta a las proteínas SSB
ψ holD Cargador de abrazadera deslizante
DNA Ligase lig La unión de los fragmentos de Okazaki
DNA Gyrase Reducir la tensión molecular causada por el superenrollamiento
α gyrA Hace y sella roturas bicatenarias en el ADN
β gyrB ATP-using subunit
Topoisomerase II Desenrrolla el ADN
A parC Hace y sella roturas bicatenarias en el ADN
B parE Desenrrolla el ADN
Replicación del DNA
Eucariota
EUCARIOTAS:
MULTIPLES ORIGENES DE REPLICACIÓN

Una gran cantidad de orígenes de

replicación funcionan
simultáneamente.

Cada origen debe iniciarse una sola

vez durante cada ciclo de replicación

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Iniciación de la Replicación en Eucariotas fase G1 de la célula

Fase G1
1. El complejo de reconocimiento de origen (ORC
1-6) se une a cada origen de replicación y
desencadena una cadena de interacciones entre
proteínas.

2. ORC recluta Cdc6 y Cdt1 (también conocido

como factor de licencia de replicación).

3. Cdc6 y Cdt1 reclutan el complejo de

mantenimiento de minicromosomas (MCM 2 a 7;
también actúa como helicasa) para formar el
complejo prereplicativo (pre-RC), que solo se
forma al comienzo de la fase G1 Esto asegura que
la replicación solo ocurra una vez en cada ciclo
celular.
 Iniciación de la Replicación en Eucariotas

Fase S
• Aumentan los niveles de proteínas CDK
• CDK fosforilan el complejo ORC, las desactivan y
no atraerán mas helicasas (MCM)
• CD6 y Cdt1 son fosforlidas por CDK, desactivadas
y degradadas.
• los ensamblajes MCM en el Pre-RC son
fosforilados por CDK y promueve la unión de la
proteína Cdc45 y las proteínas Sld2 y Sld3
• Esto permite la unión del complejo GINS. El
complejo GINS es necesario para que funcione la
helicasa MCM.
• la proteína Mcm10 se une y el ensamblaje se
separa en dos complejos de replicación o
replisomas que proceden en direcciones opuestas
desde el origen.

• La ADN polimerasa también se une en esta etapa.

 Replicación en Eucariotas

La horquilla de replicación eucariota está creada por

helicasa MCM que desenrolla las dos cadenas de ADN y
las reviste con RPA para evitar que se vuelvan a unir.

El complejo de ADN polimerasa α forma un cebador de

ARN seguido de iDNA.

El complejo RFC clamp-loader ensambla la abrazadera

deslizante (PCNA) alrededor del ADN de cadena simple y
recluta otra ADN polimerasa.

La ADN polimerasa ε se carga en la cadena principal, y la

ADN polimerasa δ se carga en la cadena rezagada para
sintetizar ADN nuevo desde el extremo 3´ del ADNc.

En la cadena rezagada, las secciones de cebador de ARN

seguido de ADNc se eliminan mediante una exonucleasa y
luego se reemplazan con ADN nuevo por ADN polimerasa
δ.
El ADN eucariótico es lineal y necesita estructuras especiales, los telómeros, para
proteger sus extremos.

En el extremo del cromosoma

carece de extremos 3’-OH.

Durante cada ciclo de replicación,

los cromosomas se acortan y se
pierden varias de las repeticiones
de los telómeros.

Sin embargo, no se pierde ninguna

información de codificación única.
 Síntesis de DNA en los extremos de los
cromosomas.

Los eucariotas han resuelto el problema de

replicar el ADN lineal mediante telómeros.

Telómeros: se encuentran en los extremos de sus

cromosomas, como múltiples repeticiones en
tándem (de 20 a varios cientos)

La telomerasa transporta un pequeño segmento

de ARN, complementario a la repetición del
telómero de 6 pb.

La hebra complementaria se forma mediante

cebado de ARN, seguido de elongación por
ADN polimerasa y unión por ligasa.
 ADN Polimerasas Eucariotas

alfa delta Beta epsilon gama

Localización nuclear nuclear nuclear nuclear mitocondrial

replicación
Función replicación reparación reparación replicación
retardada
continua
Cebado

Funcíón similar en E.coli DNA Pol I DNA Pol III DNA Pol II

Polimerización 5´€3´ + + + + +

Exonucleasa 3´€5´ - + - + +

Asociada a DNA primasa + - - - -

Acepta primer de ARN + + - ? -

Acepta primer de ADN + + + + +

Sensible a afidicolina + + - + -