LABORATORIO

PRINCIPIOS DE
FOTOMETRIA

Proyecto 2021
 OBJETIVOS
 Mencionar los conceptos básicos de la fisiología
médica que guarda relación con el diagnóstico de
laboratorio.
 Describir los principios teóricos de la colorimetría.
 Ejemplificar el diagrama en bloques de un sistema
fotométrico.
 Describir y estudiar las partes que componen un
sistema fotométrico (espectrofotómetro o
colorímetro).
 SUMARIO
 Laboratorio. Introducción

 Espectro electromagnético. La luz.

 Ley de Lambert-Beer

 Diagrama en bloques de un Sistema Fotométrico.

 Partes que componen un Sistema Fotométrico

(espectrofotómetros o colorímetros).
 Naturaleza de la Luz
 La luz se puede explicar como un conjunto de
radiaciones que se mueven por todo el espacio.
Las detectables por nuestro ojo corresponden a
la luz visible, pero la mayoría son invisibles para
nosotros.
 La luz consiste en ondas electromagnéticas de
naturaleza ondulatoria que se propaga en el
vacío en línea recta.
 La luz es una pequeña parte de una clase muy
extensa de las radiaciones electromagnéticas.
Representación de una Espectro continuo de la
onda electromagnética, luz visible (desde el rojo
con los campos eléctrico al violeta disminuye la
(E) y magnético (H) longitud de onda)
asociados, avanzando a
la velocidad de la luz.
 Ondas Electromagnéticas
 Las ondas electromagnéticas se producen por la
oscilación de las cargas eléctricas y consisten
básicamente en un campo eléctrico y otro magnético
ortogonales que se propagan por el espacio. Las OEM,
como cualquier otro tipo de ondas, se caracterizan por
su longitud de onda (λ), su frecuencia (f) y su velocidad
de propagación c (“velocidad de la luz”).
 Longitud de Onda

Todas las OEM se propagan en el vacío con la

misma velocidad (c=300.000 Km/s), conocida como
velocidad de la luz. La distancia entre dos picos
(o dos valles) de una onda se llama longitud de
onda (λ=lambda).

λ
Longitud de onda = Velocidad de propagación / Frecuencia

 c f
= c / f
Donde c = velocidad de la luz en m/s

c =  f(m/s)
f = c / (s-1)
Relación entre frecuencia y longitud
de onda
Relación entre Hertz y metros
SENSIBILIDAD RELATIVA DE LA VISION HUMANA
 Absorción. Absortividad
Cuando un rayo de luz monocromática con una intensidad I0
pasa a través de una solución, parte de la luz es absorbida
resultando que la luz emergente I es menor que I0
Luz incidente (I0) Luz absorbida Luz emergente (I)

a a = absortividad

I0
I
c = concentración
(número de partículas por
b cm3)

Longitud del medio absorbente

o ancho de la celda
 Absortividad (a)

a es una constante de proporcionalidad

que comprende las características
químicas de cada compuesto o molécula y
su magnitud depende de las unidades
utilizadas para b y c.
Cuando se expresa la concentración en moles
por litro y la trayectoria a través de la celda
en centímetros, la absortividad se denomina
absortividad molar y se representa con el
símbolo e .
En consecuencia cuando b se expresa en
centímetros y c en moles por litro.

A = ebc
Donde A representa la absorbancia del
compuesto
 Las leyes de Lambert y Beer

o
Los fundamentos de la interrelación de la
luz que se absorbe y la que se transmite.
Ley de Lambert: Cuando un rayo de luz monocro-
mática (I0) pasa a través de un medio absorbente, su
intensidad disminuye exponencialmente (I) a medida
que la longitud del medio absorbente aumenta.

I = I0e-ab
I0 I I0 I I0 I

1 cm. 2 cm. 3 cm.

Ancho de la celda
Ley de Beer: Cuando un rayo de luz monocromática
pasa a través de un medio absorbente, su intensidad
disminuye exponencialmente a medida que la
concentración del medio absorbente aumenta.

I = I0e-ac
I I
I0 I I0 I0
Combinando ambas leyes se obtiene la Ley de Beer-Lambert
donde la fracción de luz incidente que es absorbida por una
solución es proporcional a la concentración de soluto y al
espesor de la sustancia atravesada por la luz.
La relación entre la luz incidente (I0) y la transmitida (I)
dará una idea de la cantidad de radiación que ha sido
absorbida por la muestra.
 Ley de Lambert - Beer:

I = I0e-abc

Si despejamos: I/I0 = e -abc

 Al cociente de las intensidades se denomina
Transmitancia

T = I/I0 = e-abc
Sacando logaritmos:
Loge I/I0 = abc

Convirtiendo a log10:
Log10 I/I0 = 2.303 abc
Log10 I/I0 = abc

Absorbancia = Log10 I/I0 = abc

La Transmitancia (T) es la relación entre la
intensidad de luz transmitida por una
muestra problema (I) con la intensidad de
luz incidente sobre la muestra (I0):

T = I / I0

Se expresa como % T
La absorbancia es directamente proporcional
a la longitud del recorrido b a través de la
solución, y a la concentración c del color
absorbente. Estas relaciones se dan como:

A = a.b.c
Generalmente b es dada en términos de cm y
c en gramos por litro,
entonces la Absortividad (a) tiene unidades de l.g–1.cm–1.
 ¿Qué relación guardan la transmitancia y la
absorbancia?

De acuerdo a las características de la sustancia

analizada, la luz que no se absorbe atraviesa la
solución

LUZ ABSORBIDA
Luz transmitida

I0 I
T = I/I0
 La absorbancia es reciproca de la
transmitancia
Absorbancia contra concentración (comportamiento lineal)

Absorbancia

Concentración

% Transmitancia contra concentración (pendiente con signo

negativo y comportamiento exponencial)

% Transmitancia

Concentración
 Absorbancia
De lo anterior se desprende que la Absorbancia (A), o luz
que es absorbida por la muestra, es igual al logaritmo en
base diez del recíproco de la transmitancia (T) o bien al
log10 de la transmitancia, esto es:

A = log10 1/T = log101- log10 T = 0 – log10 T = – log10 T

La representación gráfica correspondiente a
absorbancia y transmitancia en un gradiente
de concentraciones es la siguiente:

Concent
ración
 TIPOS DE INSTRUMENTO
 Los fotómetros y espectrofotómetros se suelen
clasificar según la región espectral en la cual
funcionan, su banda espectral, y las caracterís-
ticas de sus sistemas electromecánicos.

• Fotómetros de Filtro de Simple Haz

• Fotómetros de Filtro de Doble Haz
• Espectrofotómetros de Simple Haz
• Espectrofotómetros de Doble Haz
 Diagrama de Bloques

Procesamiento
Lámparas incandescentes comúnes con filamentros de turgsteno: El rango
Señalde
uso es de 330 nm hasta cerca del infrarrojo cercano.
Filtro:
Filtros de vidrio y filtros wratten
Lentes: Son todos– los cuerpos transparentes limitados
Lámpara de Halógeno Tungsteno
Celdas esta lámpara
Fotovoltaicas o puede contenerpor
Fotoceldas unodos
o más
halógenos Filtros
superficies de interferencia:
en suesféricas. (cóncavas:
interior Foto-Tubos
y abarca un rangobicóncava)
mayor dentro( plano-concava)
del espectro
emitiendo Películas
y (convexo-cóncava).
radiaciones pocoMetálicas
unFotodiodos
por debajo de 330 nm.
Microcubetas Pre-Amplificadores
50, 75 y 100
Multiestratificados
Espejos:
Cubetas Superficies
Colimadores:
de Amplificadores
Seque son
usan
Detector
Polystileno para
de Logarítmicos
capaces dede
lograr
diodo unreflejar
haz delos
silicio luz
Lámpara de Deuterium (190-400) nm.
Conversores análogos digitales
elementos
Tubos
Monocromadores: del
estable,
de medio.
sin
Prueba (planos)
perturbaciones
Arreglo de (esféricos
de
diodos la cóncavos)
fuente de (esférico
cóncavos)
energía
Cubetas (esféricos Presentación
radiante,
de convexos).
se Datosenfocar
recomienda
Fotomultiplicadores
Flujo Continuo (Display, el Printer, Red)
Lámpara de Mercurio (Hg)
Prismas y Xenon emiten emisión de longitudes de onda
filamento
especificas de302,
(265, 280,
Redes laCélulas
lámpara
335,
de 405,en el o
436,
Difracción centro
Fotoconductoras
492, de578,
546,
Rejillas la rejilla o y 772) nm
673, 691
colimador.
 MONOCROMADOR:
La función del MONOCROMADOR es
convertir el HAZ DE LUZ POLICROMATICA
en una RADIACION MONOCROMATICA

Los monocromadores usados en los instrumentos

presentan características que lo diferencian del ideal.

- OPACIDAD: LA ENERGIA DE SALIDA ES MENOR QUE LA DE

ENTRADA EN LA LONGITUD DE ONDA DE TRABAJO.

- ANCHO DE BANDA ESPECTRAL: EL MONOCROMADOR

REAL SE COMPORTA COMO UN FILTRO PASA BANDA.
34
 - VIDRIO (20 – 50 nm)
FILTROS
- INTERFERENCIA (5 – 10 nm)

Los filtros de vidrio son generalmente cristales

coloreados. Pueden estar formados por mas de una
lámina coloreada. El ancho espectral no es bueno. Son
baratos y de fácil fabricación.

Los filtros de interferencia son láminas de vidrio que se

colocan entre dos placas reflectivas. Utilizando el
fenómeno de la interferencia se logra que algunas de las
longitudes de onda se atenúen. El ancho de banda se
considera bueno para un gran número de aplicaciones.
 ELEMENTOS - PRISMAS
DE DISPERCION - RED DE DIFRACCION ( > 0.1 nm )
VISTA DE UN m
MONOCROMADOR 680n
CON RED DE
DIFRACCION

SLIT DE
SALIDA

38
0
nm

SLIT DE ENTRADA

LA ALTURA DEL SLIT DE SALIDA GARANTIZA LA

ENERGIA LUMINOSA, SU ANCHO DETERMINA EL
ANCHO DE BANDA ESPECTRAL.
Diferencias Colorímetro-Espectrofotómetro

 La diferencia fundamental radica en el sistema

monocromador (sistema para obtener luz
monocromática) ya que el colorímetro esta limitado
a trabajar con longitudes de onda en la zona visible
del espectro (entre 400 y 800 nm), mientras que el
espectrofotómetro puede trabajar con longitud de
onda superiores e inferiores a estas.

 Un colorímetro utiliza filtros para seleccionar la luz

monocromática, mientras que un espectrofotómetro
usa una red de difracción o un prisma para igual
propósito.
La diferencia entre colorimetría y espectro-
fotometría consiste en el tipo de instrumental
empleado:
El colorímetro es un aparato en los que la longitud de
onda se selecciona por medio de filtros ópticos que son
insertados en este.

En el espectrofotómetro la longitud de onda es

seleccionada mediante dispositivos monocromadores los
cuales están integrados a la máquina.
 DETECTORES
 Celdas Fotovoltaicas o Fotoceldas

 Foto-Tubos

 Fotodiodos
 Detector de díodo de silicio
 Arreglo de díodos
 Fotomultiplicadores
 Células Fotoconductoras
 Fotoceldas
 120 microamperios/lumen (como máximo 10 miliamperios
cuando se expone a los rayos solares directos)

 Sensibilidad desde 250nm UV hasta la zona de los 800 nm.

 No se requiere ningún aporte externo de energía.

 La corriente fotoeléctrica producida es casi directamente

proporcional a la intensidad de energía radiante siempre
que los valores de resistencia de circuito externo sean
bajos (100 ohms o menos)

 La repuesta depende de la temperatura.

 Foto-Tubos
Cátodo
 Son fabricados con envoltura de Luz monocromática
cristal a cuarzo de acuerdo al
rango de longitudes de onda
donde se vaya a trabajar. Ánodo
 Tiene un cátodo cubierto con
una superficie foto-emisora.
 Una malla de alambre fino como
ánodo. Electrones
liberados
 La luz entra al fototubo a través
de la malla e incide sobre el
cátodo liberando electrones,
estos electrones son capturados
por el ánodo produciendo una
corriente del orden de los 20-100
microamperios/lumen)
 Fotodiodos
 Consisten en una unión P-N
polarizada inversamente. Cuando
la luz incide en su superficie, los
huecos de la zona N emigran a la P
zona P y son recombinados,
incrementando la conductividad
del dispositivo.
 Tienen un pico de sensibilidad
cerca de los 1000 nm.
 Baja sensibilidad por debajo de
los 400 nm.
 Su sensibilidad no compite con los
fotomultiplicadores y es esta la
razón por lo que no se usan en N
instrumentos donde los niveles de
energía son relativamente bajo.
 Fotomultiplicadores

Se utilizan en el rango de 190 nm

hasta 900 nm.

La corriente final puede llegar a

ser 108 superior a la
fotocorriente primaria.

Se emplean con niveles muy bajos

de iluminación

Pueden deteriorarse si la luz del

día incide sobre ellos.
 Características del Tubo Fotomultiplicador

Principio de 1- Tiempo de vuelo de la cascada 10-9 - 10-10 s.

2- Factor de multiplicación 108 (para 10 dinodos)
funcionamiento 3- Bajo nivel de ruido electrónico
4- Poca variación de la amplitud de los pulsos.
FOTOCATODO 5- Corto tiempo de recuperación.

1- Alta probabilidad
de emisión de
electrones por fotón
incidente
2- Espectro de
absorción similar al
espectro de emisión
del centelleante (400-
500 nm)
ANODO
3- Baja emisión
termoeléctrica DINODOS
1- Se construyen del mismo material que el fotocátodo.
2- Alto coeficiente de emisión secundaria.
 Células Fotoconductoras
 El elemento fotosensible en estas células consiste en
un material con muy poca conductividad eléctrica en
la oscuridad, que experimenta un notable cambio en
su resistencia al ser iluminado.
 Las células de sulfuro de plomo son utilizadas en la
región del infrarrojo próximo.
 En la zona del espectro visible y la del ultravioleta
próximo, el material sensible que generalmente se
emplea suele ser sulfuro de cadmio o selenuro de
cadmio.
 Requieren un aporte externo de voltaje
 Proporcionan una salida con baja impedancia.