MÉTODOS DE ECOLOGÍA MICROBIANA

Integrantes:
Cabello Escudero, Yutiana
Valladares Guerrero, Angela
Olivas Cueva, Noelia
Espinoza Rivera, Hilbert
Ruiz Santamaría, Camila
Mizhel
Aislamiento y
Enriquecimiento
CULTIVO DE ENRIQUECIMIENTO

 Establece un medio y una serie de condiciones de incubación que sean selectivas

para el organismo deseado y contraselectiva para los no deseados
 Los cultivos eficaces reproducen lo mejor posible los recursos y las condiciones
de un nicho ecológico determinado.
CULTIVO DE ENRIQUECIMIENTO
EXITOSO
SE CONSIDERA:
 Inóculo adecuado son las muestras que deben ser tomadas del hábitat
adecuado del organismo en interés. Luego deben ser incubados en
condiciones optimas.
 pH, temperatura, suministro de aire, luz, y otros.
Enriquecimiento del Azotobacter
Columna de Winogradsky
 Sesgo en el Enriquecimiento

Aunque la técnica del cultivo de enriquecimiento sea una herramienta

poderosa, en los enriquecimientos típicos se produce un sesgo, que a
veces llega a ser muy grave, en el resultado.

Este sesgo normalmente es más profundo en cultivos de enriquecimiento

líquidos donde dominan los organismos que crecen más rápidamente en las
condiciones elegidas.

Desgraciadamente, el organismo mejor adaptado de laboratorio a menudo

es solo un componente es solo un componente minotario del ecosistema
microbiano, en lugar de ser el mayoritario o el mas relevante desde el punto
de vista ecológico.
Métodos Generales Tinción
1) Tinción fluorescente con DAPI o naranja de acridina
- DAPI y la naranja acridina ambas se utilizan para teñir
microorganismos de cualquier hábitat microbiana.

A) DAPI B)Naranja acridina

2) Tinción de viables
- Permite diferenciar las células vivas de las muertas.

3) Anticuerpos fluorescentes
- Los anticuerpos son reactivos biológicos específicos.
4) Proteína fluorescente verde para etiquetar células
- Las células bacterianas se pueden alterar mediante ingeniería
genética para volverlas auto fluorescentes.

Proteína fluorescente verde

5) Limitaciones de la microscopía
- El microscopio es una herramienta que nos ayuda a
identificar los microrganismos que hay en una muestra
natural. Sin embargo con esto no se puede estudiar toda la
diversidad microbiana que existe debido a varias razones.
A)Microscopia de contraste B) FISH filogenética
de fase
FISH

es una técnica que emplea sondas de

oligonucleótidos marcadas con fluorocromos las
cuales van dirigidas hacia secuencias específicas
del ácido ribonucleico ribosomal (ARNr), lo que
permite la identificación rápida y específica de
células microbianas ya sea que estén como células
individuales o se encuentren agrupadas en su
ambiente natural
Tinción filogenética con fish

los colorantes FISH filogenéticos son oligonucleótidos fluorescentes con una

serie de bases complementaria a secuencias en el RNA ribosómico.
Penetran en la célula sin lisarla y se hibridan con el RNA y como los
ribosomas están dispersos por la célula en los procariotas, toda la célula se
vuelve fluorescente.
Con el fish se puede identificar o rastrear un organismo de interés o un
dominio de interés, en una muestra.
 La ISRT-FISH: se utiliza para explorar factores que
controlan la expresión genética en poblaciones naturales
de microorganismos y también para observar como las
perturbaciones ambientales en un ambiente afecta
transcripción de determinados genes.
 La card-fish:es util para los estudios filogeneticos de
procariotas que crecen muy lentamente estos
organismos habitan en temperaturas frias y bajas
concentraciones de nutrientes
PCR

 Conocida como, reacción en cadena de la polimerasa

 una técnica de biología molecular
 .Su objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento
de ADN particular
 Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN
 su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una
muy alta probabilidad, virus o bacterias.
Cultivo axénico:
Siembra de una sola clase de microorganismos.
Tipos de siembra:
 Siembra en placa petri por estrías
Tubos de dilución en agar y técnica del
número más probable (NMP)
 Un cultivo se purifica mediante diluciones sucesivas de
suspensiones de células en tubos con medio con agar fundido
 Al repetir este procedimiento utilizando una colonia del tubo de
mayor dilución como inóculo para una nueva serie de diluciones,
se obtienen finalmente cultivos axénicos.
 La utilización de varios tubos replicados para cada dilución mejora
la exactitud del NMP final obtenido.
 estimar el número de microorganismos en los alimentos, aguas
residuales y otras muestras en las que el número de células se
debe evaluar sistemáticamente
Criterios de pureza:

 una vez que se ha obtenido un cultivo supuestamente axénico, es esencial verificar su

pureza.
 Hay que emplear una combinación de:
1) microscopía,
2) observación de las características de la colonia en placa o tubos de siembra en
profundidad y
3) comprobación del crecimiento del cultivo en otros medios, para lo que resulta
importante utilizar medios en los que se prevé que el organismo deseado crecerá poco o
nada, pero que favorecen el crecimiento de los organismos contaminantes.
 el análisis final, la observación microscópica de un único tipo morfológico de célula
con métodos de tinción uniformes (por ejemplo, en una tinción de Gram), junto a unas
características uniformes de la colonia y ausencia de contaminación en las pruebas de
crecimiento con varios medios de cultivo, es una buena prueba de que el cultivo es
axénico (puro).
Sondas para cultivos axénicos:
LAS PINZAS DE LÁSER
 nueva herramienta para obtener cultivos axénicos.
 consisten en un microscopio óptico invertido equipado con un láser infrarrojo enfocado con
precisión y un dispositivo de micromanipulación.
 Se puede atrapar una única célula porque el haz de láser crea una fuerza que empuja hacia abajo
sobre una célula microbiana (u otro objeto pequeño) y lo mantiene en su lugar
 Entonces, cuando se mueve el haz de láser, la célula atrapada se desplaza con él.
 Si una muestra mezclada se encuentra en un tubo capilar, se puede atrapar ópticamente una
única célula y separarla de los organismos contaminantes.
 Después se puede aislar la célula rompiendo el tubo en un punto entre la célula y los
contaminantes, y llevando la célula a un tubo pequeño de un medio estéril
 Las pinzas de láser son especialmente útiles para aislar bacterias que crecen lentamente, que
pueden ser superadas por otras especies de crecimiento rápido presentes en los cultivos de
enriquecimiento o para organismos presentes en tan poca cantidad que se podrían perder con los
métodos de enriquecimiento basados en diluciones .
Sondas para cultivos axénicos:
LAS PINZAS DE LÁSER
MEDICIÓN DE LAS ACTIVIDADES
MICROBIANAS EN LA NATURALEZA
 Análisis químicos, métodos
radioisotópicos y microelectrodos

(a) Ensayo químico para las transformaciones del lactato (c) Reducción de sulfato medida
y el H2S durante la con 5SO
reducción de sulfato, (b-d) Determinaciones (d) Producción de 14C02 a partir de
radioisotópicas ,4C-glucosa.

(b) Fotosíntesis medida con 14CC>2

 Radioisótopos en combinación con
FISH: FISH-MAR

b) Captación de la 14C-glucosa por un cultivo mixto de

(
(a) Una célula filamentosa no cultivada que Escherichia co li(células amarillas) y Herpetosiphon
pertenece a las gammaproteobacterias (según aurantiacus
indica la FISH) aparece como autótrofa (según (células verdes filamentosas),
la captación, medida con MAR, del 14C02). La (c) MAR del mismo campo de células mostrado en b). L
descomposición radioactiva del ,4C se expone radioactividad incorporada se expone en la película y
en la emulsión fotográfica, lo que genera los muestra que la glucosa era asimilada por E. coli pero n
puntos negros. por H. aurantiacus
 Microelectrodos

(a) Esquema de un microelectrodo de oxígeno. La varilla de platino hace de cátodo

y, cuando se aplica el voltaje, el 0 2 se reduce a HzO y se genera una corriente. La
corriente resultante de la reducción del O2 en la superficie del oro del cátodo es
proporcional a la concentración
de oxígeno en la muestra. Obsérvese la escala del electrodo.

(b) Utilización de los microelectrodos en un tapete microbiano de las fuentes hidrotermales

calientes.
Tapetes microbianos y el uso de los
microelectrodos para estudiarlos
(a) Fotografía de la porción central de una muestra de
tapete microbiano de una fuente hidrotermal caliente
similar a la utilizada en el experimento
resumido en la parte

La capa superior (verde oscuro) contiene

cianobacterias, por debajo de las cuales hay varias capas
de
bacterias fotótrofas anoxigénicas (naranja),
principalmente
Chloroflexus y Roseiflexus. El tapete tiene un grosor de
unos
2 cm.

(b) Perfiles de oxígeno, sulfuro y pH en un tapete

microbiano de una fuente hidrotermal caliente. Obsérvese
la
escala milimétrica de las ordenadas.
 Isótopos estables
Fraccionamiento isotópico

Mecanismo de fraccionamiento isotópico con

el carbono como ejemplo
 Sondeo con isótopos estables

SONDEO CON ISÓTOPOS ESTABLES.

La comunidad microbiana de una muestra natural se alimenta con un sustrato marcado

con 13C. Los organismos que lo metabolizan producirán un 13C-DNA a medida que crecen y se
dividen, que se puede separar de la forma

ligera del DNA (con 12C) mediante una centrifugación en gradiente de densidad (fotografía). Al
DNA aislado se le analiza un gen
determinado o todo el genoma.