GUIA DE LABORATORIO

MICROSCOPIA I
Biologia Celular y Molecular
Facultad de Ciencias Agrarias

Introducción
El microscopio es un instrumento óptico que produce una imagen
aumentada de los objetos. En los últimos tres siglos ha permitido ampliar el
campo de las investigaciones biológicas y se ha convertido en el instrumento
básico para establecer nuevas fronteras en la biología. La lupa es el
microscopio más simple y fue utilizada inicialmente por algunos
investigadores para adquirir los primeros conocimientos del mundo
microscópico; posteriormente se perfeccionó y en la actualidad hay varios
tipos de microscopios, algunos de ellos altamente específicos para una gran
variedad de usos, tales como: microscopio simple, compuesto (invertido, de
fluorescencia. de luz ultravioleta, de luz polarizada, de contraste de fase, de
campo oscuro) y electrónico (de transmisión y de barrido).

En las prácticas de este curso se utilizarán microscopios compuestos

binoculares, en los que se combinan dos sistemas de lentes (el ocular y el
objetivo) para obtener las imágenes.

Además de su capacidad para aumentar la visualización de objetos, el

microscopio desempeña diversas funciones cruciales. Aparte de evidenciar
que algunas estructuras aparentemente visibles a simple vista se presentan
de manera diferente bajo su lente, este instrumento nos brinda la
oportunidad de efectuar mediciones precisas y llevar a cabo estudios
morfológicos y fisiológicos de células y tejidos, enriqueciendo así nuestro
entendimiento del mundo biológico en todos sus matices
Objetivos
Conocer las diferentes
partes del microscopio
compuesto binocular y
sus respectivas
funciones.

Aprender a manejar
correctamente el
microscopio compuesto
binocular.

Adquiera competencia
en la preparación de
muestras en fresco

Diferencie algunas
estructuras como las
semillas de artefactos o
burbujas
 Materiales
Microscopios compuestos Toallas de papel
binoculares absorbente

Portaobjetos Polen de diferentes flores

Cubreobjetos Hebras de cabello

Beakers o frascos pequeños Papel delgado con letras

con agua impresas por un solo lado

Nota: Todos los materiales

Hilos de color
están en el laboratorio

Procedimiento
1. Las partes del microscopio compuesto binocular y sus funciones

En el laboratorio se encuentran dos modelos de microscopios

compuestos binoculares, el Microscopio Olympus CH30 (figura 1A) y
Microscopio Zeiss Primo Star (figura 1B).

La mayoría de los microscopios compuestos tienen los mismos

componentes básicos. Sin embargo, la disposición de muchos de esos
componentes varía según el modelo y la marca, mientras que otras piezas
son opcionales. En nuestro caso, nos referiremos a los dos modelos que
aparecen en las figuras.

Oculares

Son sistemas de lentes cuya función es aumentar la imagen procedente

del objetivo tantas veces como indique el número escrito en ellos, 10 en
este caso. Los dos oculares pueden moverse hacia los lados y hacia el
centro, de manera que se ajusten a la distancia inter-pupilar de quien esté
utilizando el microscopio. Algunos microscopios poseen una sola lente
ocular, y por eso se les llama monoculares.
En los microscopios de este laboratorio, por ejemplo, ambos oculares tienen
inscrito lo siguiente: 10X/18L. La cifra de la izquierda (10X) indica el número de
veces que cada ocular aumenta la imagen procedente del objetivo; y la de la
derecha (18L) es el llamado número de campo, que sirve para calcular el
tamaño del diámetro del campo visual, de acuerdo con el objetivo que se esté
utilizando.

Anillo de dioptrías

En este microscopio está en el ocular izquierdo y sirve para ajustar la visión

binocular, como se explicará más tarde.
Figura1: Microscopio Zeiss Primo Star

Figura 2: Microscopio Olympus CH30

 Revólver

Se trata de un sistema giratorio integrado por diversos objetivos, los cuales

siempre deben moverse desde esta estructura. Al girar el revólver
circularmente, es posible alinear cualquier objetivo de manera perpendicular
con respecto a la platina. Durante este ajuste, un tope sirve de indicador
para asegurar que la lente se encuentre en la posición correcta.

Objetivos

Son cilindros que contienen uno o más lentes diseñados para ampliar la
imagen, determinan la calidad de la imagen. Normalmente, los objetivos
tienen información inscrita sobre diversas características propias de cada
uno de ellos. En los que usted está utilizando, se

tienen la siguiente información. (Figura 2)

Figura 2: Objetivos A40X y A100X

E: es la referencia de fábrica que identifica a estos objetivos en particular.

Aumento: cada objetivo tiene un número específico (4, 10, 40, 100) que
indica cuántas veces se aumenta la imagen del objeto observado. En
microscopía se utiliza la letra X para indicar "veces" y por eso se
acostumbra al referirse a un aumento particular, escribir o decir 4X, 10X,
etc. El objetivo menos potente se denomina lente de encuadre, y es
típicamente un objetivo 4×. La segunda lente se denomina el objetivo
pequeño, y es típicamente una lente 10×. La lente más potente de las tres
es el objetivo grande y es típicamente de entre 40× y 100× aumentos.
A: significa que estos objetivos son acromáticos, es decir, que vienen
corregidos para ciertas longitudes de onda (de los colores verde y rojo en
este caso), con el fin de que coincidan en el mismo plano y que, de este
modo, la imagen obtenida tenga mejor definición. Algunas lentes, de otros
microscopios, vienen corregidas para más de dos longitudes de onda.

Abertura numérica (AN): es la capacidad que tiene el objetivo para recibir

el cono de luz que pasa a través de la muestra, procedente de la fuente de
luz. La abertura numérica es directamente proporcional al índice de
refracción del medio en que se propaga la luz (aire, agua, vidrio, aceite de
inmersión), pues mientras mayor sea el índice de refracción, mayor será el
cono de luz, lo cual origina un mayor poder de resolución (concepto que se
explicará en la segunda práctica de laboratorio).

Grosor del cubreobjetos: Observe cómo aliado la longitud mecánica del

tubo, separados por una línea oblicua, aparecen un guion o la cifra 0.17. El
guion indica que esas lentes pueden usarse para observar muestras sin
que sea estrictamente necesario utilizar cubreobjeto; y la cifra 0.17, que
sólo está en la lente A40, indica que es necesario utilizar un cubreobjeto de
17 milímetros de espesor. Este grosor es importante tenerlo en cuenta
porque afecta también la calidad de la imagen

Longitud mecánica del tubo: es la distancia que hay entre la parte inferior
del objetivo y los oculares. Está indicada en los objetivos y generalmente
tiene un valor de 160 milímetros.

Platina

Lámina cuadrada, con un orificio central, en donde se coloca la muestra que

se va a observar.

Condensadores

hay dos: uno de ellos, el de abertura, está debajo de la platina y es un

sistema de lentes convergentes cuya función es concentrar los rayos de luz
en el centro de la platina. Por tanto, sirve para enfocarlos hacia la muestra
que se va a examinar. El otro es el de campo, que está en la base del
microscopio y se utiliza para concentrar la luz que viene de la fuente y para
dirigirla hacia el condensador de abertura.
 Carro

Sistema de pinzas ubicado encima de la platina, que sirve para desplazar la

muestra en el eje X (o sea, izquierda-derecha) y en el eje Y (o sea, adelante-
atrás), mediante las perillas del carro que para tal efecto posee éste.

Diafragma (iris)

Estructura con apariencia laminar que se emplea para regular el cono de luz
que pasa a través del condensador de abertura y llega a la muestra. El
número en la escala de abertura del diafragma, que regula el cono de luz,
debe coincidir con la abertura numérica del objetivo, aspecto que se
explicará posteriormente. Este ajuste se hace con la palanca que tiene el
diafragma para abrirlo y cerrarlo.

Base

Parte inferior del microscopio, que hace contacto con la mesa. Es su punto de
apoyo.

Columna

Estructura rígida ubicada en la parte posterior del microscopio, que sostiene

sus diferentes partes. En el Microscopio Olympus CH30 en su lado derecho
hay un Interruptor para prender y apagar el bombillo y, debajo de éste, una
perilla reguladora del voltaje. Y en el Microscopio Zeiss Primo Star en la
columna se encuentra la perilla reguladora que permite el encendido y la
regulación de la luz.

Perilla macrométrica

Está en la parte lateral inferior, tanto derecha como izquierda de la columna

y se utiliza para acercar la platina al objetivo y para alejarla. Por medio de
estos movimientos se obtiene una imagen poco nítida de la muestra, o sea el
"enfoque grueso".
Perilla micrométrica

Está unida a la macrométrica, en la parte externa de ésta. Sirve para

obtener el “enfoque fino” o nítido de la imagen mediante movimientos
suaves de acercamiento o alejamiento de la platina.

Perilla micrométrica

Se utiliza para permitir el paso de energía desde el tomacorriente hacia el

microscopio, esta tiene una regulación de 12 voltios. El Microscopio Zeiss
Primo Star además presenta un sitio de acople en la parte posterior de la
columna donde ésta se ubica para su guardado.

Perilla ajuste

Perilla de ajuste de altura del condensador de abertura, se utiliza para

acercar o alejar el condensador de abertura a la muestra, esto con el fin
de enfocar correctamente la muestra y proteger los objetivos, se ubica del
lado izquierdo debajo del carro

A continuación partes que se encuentran específicamente en el

Microscopio Zeiss Primo Star (Figura 1)

Tornillos de centrado del condensador: Se utilizan para fijar

correctamente el condensador de abertura de manera que éste quede
alineado con los objetivos y el condensador de campo, estos se aprietan
en sentido de las manecillas del reloj y se liberan en sentido contrario a
las manecillas del reloj. (No deben manipularse)

Tornillos de ajuste del condensador: Se utilizan para fijar correctamente

el condensador de abertura a la parte inferior de la platina de manera
que este no se mueva al realizar el montaje y observación de las
muestras, estos se aprietan en sentido de las manecillas del reloj y se
liberan en sentido contrario a las manecillas del reloj. (No deben
manipularse)
2. Cuidados del microscopio
Cuando transporte el microscopio cójalo siempre con las dos manos,
como se indica en la figura 4.

Figura 4: Manera correcta de transportar el microscopio

Al poner el microscopio sobre la mesa, sitúe lo a unos 10 centímetros

de la orilla.
Para girar el revólver, utilice la rosca estriada de su parte superior. No lo
haga tirando los objetivos hacia la izquierda o hacia la derecha, pues de
esta manera se van desajustando los sistemas de lentes y la propiedad
parafocal, que es la propiedad de mantener una muestra más o menos
enfocada y en el mismo campo focal al pasar de un objetivo a otro.
.
Al terminar la práctica de laboratorio, siga estas instrucciones:

Retire la placa, o preparación, de la platina.

Ponga en el punto cero la perilla reguladora del voltaje (modelo ZEISS
Primo Star) o proceda a apagar el interruptor (posición ‘0') (modelo
Olympus CH30). Desconecte del toma corrientes el cable de la luz y deje
enfriar el bombillo antes de mover el microscopio.
Baje hasta el máximo la platina y deje el objetivo de aumento menor en
posición de enfoque.
Deje centrado el carro.
Cubra el microscopio con la bolsa plástica o de tela dispuesta para ello.
Deje el microscopio encima de la mesa para que el monitor lo revise y lo
guarde en su sitio.
3. Preparación de una muestra en fresco (placa húmeda)

Lave el portaobjeto con jabón y abundante agua, secándolo preferiblemente

con un pedazo de tela que no deje residuos encima del vidrio. Con un
gotero eche una gota de agua en el centro del portaobjeto y después ponga
en ella un pedazo de hilo de color de un centímetro de largo
aproximadamente. Apoye luego el cubreobjeto en un ángulo de 45 grados
con relación al portaobjeto y sosténgalo con un lápiz, de modo que haga
contacto con el agua, como se muestra en la figura 5. Por último, déjelo caer
lentamente. De esta manera se evita la formación de burbujas que podrían
dificultar la observación. Si queda agua por fuera del cubreobjeto, séquela
con papel absorbente. Igualmente, seque el portaobjeto si éste queda
mojado por debajo, ya que la humedad lo pega a la platina y le impide
desplazarse cuando el carro se mueve.

(Nota: No siempre las muestras en fresco se preparan con agua. En algunos

casos es necesario utilizar otras sustancias, o soluciones adecuadas, según
el tipo de material que se quiera observar.)

Figura 5: Preparación de una muestra en fresco

 4. Observación de una muestra

De la forma como usted utilice el microscopio depende el éxito de sus

observaciones. Por tal motivo se recomienda seguir siempre el
procedimiento que a continuación se explica:

a. Colocación de la muestra
Ponga sobre la platina la placa de hilo que acaba de hacer y fíjela a ella
utilizando las pinzas que para el efecto tiene el microscopio. Centre la
muestra en el orificio de la platina con las perillas del carro.

b. Iluminación del campo visual

Ponga en posición de observación el objetivo de 4X y abra lentamente el
diafragma haciendo coincidir la abertura numérica del objetivo, que para el
caso de 4X es 0.10, con el mismo valor (0.10) en la escala de abertura del
diafragma. Suba hasta el tope la platina, sin forzar el sistema, con la perilla
macrométrica, y luego, mirando por los oculares, obtenga una iluminación
homogénea del campo visual con la perilla reguladora del voltaje.

c. Obtención de la imagen

Mirando por los oculares, aleje lentamente la platina con la perilla

macrométrica hasta que aparezca la imagen. Si en este momento lo
considera necesario, mejore la iluminación con la perilla reguladora del
voltaje y con la del condensador de abertura. Moviendo los oculares, ajuste la
visión a su distancia interpupilar; igualmente, ajuste la visión binocular con el
anillo de dioptrías, de la siguiente manera: mire con el ojo derecho por el
ocular respectivo (derecho), manteniendo cubierto el ocular izquierdo con
una hoja de papel o con algo similar, y enfoque con la perilla micrométrica lo
mejor posible. Ahora proceda a ajustar el izquierdo así: cubra el ocular
derecho, mire con el ojo izquierdo por el respectivo ocular y enfoque con el
anillo de dioptrías.
Haga un esquema de lo observado, enmarcándolo con un círculo e indicando
a un lado el aumento con el que trabajó. Siempre que dibuje un objeto que
esté viendo con un microscopio, cumpla esta instrucción. Además, indique
con flechas y nombres las estructuras que pueda distinguir en él.
d. Uso de objetivos de aumento mayor

Una preparación siempre se observa primero con el objetivo de aumento

menor, 4X en este caso, para obtener un buen enfoque. La parte que se
desea observar con objetivos de aumento mayor debe centrarse en el campo
visual.

Para la observación con los objetivos de 10X y de 4OX, siempre que vaya a
cambiar de objetivo, ajuste la iluminación con la escala de abertura del
diafragma, tal como se explicó antes. Si es necesario, utilice también la perilla
reguladora del voltaje.

Gire lentamente el revólver por medio de la rosca estriada de su parte

superior, con el fin de poner el objetivo de 10X en la posición adecuada, sin
mirar por los oculares. A continuación, mire por ellos y, si lo requiere, dele
nitidez a la imagen con la perilla micrométrica. Haga un esquema de lo
observado y repita el procedimiento, pero utilizando el objetivo de 40X.
Compare estas imágenes entre si. ¿Qué relación encuentra entre sus
tamaños? ¿A qué se deben esas diferencias?

Haga lo mismo, es decir, enfocar con 4X, 10X Y 40X, y dibujarlo observado,
con otros materiales que le suministre su profesor: cabellos, granos de
polen, epidermis superior o inferior de hojas de guarda parques, etc.

5. Características de la imagen

a. Cómo se ve la imagen

Haga una preparación en fresco de una letra asimétrica (no utilice las letras
o, x, s, ni las mayúsculas 1, H, N Y Z). Póngala en la platina en posición normal
de lectura y enfoque con el objetivo de 4X. Haga el esquema
correspondiente. ¿Cómo se ve la imagen con relación a la posición de la letra
en el portaobjeto?

Enfoque esa misma letra con el objetivo de 10X y dibújela. ¿Qué proporción
aproximada de ella puede ver con relación a la obtenida con el objetivo de
4X?
b. Cómo es el desplazamiento de la imagen

Empleando la misma preparación anterior en 10X, desplace el carro hacia la

derecha, sin dejar de mirar por los oculares. ¿En qué dirección se mueve la
imagen? Desplácelo luego hacia la izquierda y fíjese de nuevo en la
dirección en que se mueve la imagen.
Tome ahora la otra perilla del carro y muévalo hacia adelante y hacia atrás.
Al hacer cada uno de estos movimientos, ¿en qué dirección se desplaza la
imagen?