Instituto Int eruniv ersitario de Inv es tigación

de Reconocimiento Mol ecular y Desarroll o

Tecnológico

Departament o de Química

T ESIS D OCTORAL

Síntesis, estabilización y funcionalización de

nanocristales de perovskita de haluros metálicos
para su empleo como reveladores y marcadores en
histoquímica, cultivos celulares y biosensado

Cynthia Collantes Pablo

Directores

Dra. Victoria González Pedro Profesora Permanente Laboral de

Universidad

Dra. Mª José Bañuls Polo Catedrática de Universidad

Dr. Ángel Maquieira Catalá Catedrático de Universidad

València, Noviembre, 2023

1
2
3
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Estancia en el Instituto de Agroquímica y Tecnología de los
Alimentos (IATA – CSIC)

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Estancia en el Istituto Italiano di Tecnologia (IIT)

7
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Agradecimientos

Quiero expresar mi gratitud a todas las personas e instituciones que han

hecho posible la realización de esta tesis.

A Mª José Bañuls y Ángel Maquieira, por concederme la beca de formación

predoctoral FPI (BES-2017-080242), asociada al proyecto de Biosensores
holográficos. Prueba de concepto y demostración en aplicaciones clínicas
(CTQ2016-75749-R), financiado por el Ministerio de Economía y Competitividad.

A mis directores, Victoria González, Mª José Bañuls y Ángel Maquieira, por

el tiempo invertido y darme las herramientas necesarias para sacar adelante
esta investigación, sus sugerencias y correcciones a lo largo de este proceso, así
como su mediación para entablar posibles colaboraciones con otros grupos.

En esta tesis he tenido la oportunidad de realizar dos estancias:

o En el Instituto de Agroquímica y Tecnología de los Alimentos (IATA –

CSIC), València
o En el Istituto Italiano di Tecnologia (IIT), Génova

Sin duda, ambas han sido experiencias enriquecedoras, tanto en lo

personal como en lo profesional, que han contribuido al desarrollo de esta
investigación y a establecer un vínculo de colaboración con ambas instituciones.
Ante la oportunidad brindada, agradezco a la dirección de los centros, a los
grupos y supervisores correspondientes:

o Al grupo de Envases del IATA – CSIC, bajo la supervisión de Amparo López

y Mª José Fabra, por el acceso a sus instalaciones para utilizar su equipo
de electrospraying y formarme en esta técnica
o Al grupo de Elementos Traza del IATA – CSIC, bajo la supervisión de
Vicenta Devesa, por proporcionar los medios necesarios para que pudiera
realizar ensayos en cultivos celulares y analizar los resultados. Especial
mención a Pepe Coll, por las imágenes de microscopía de fluorescencia
o Al grupo de Nanoquímica del IIT, bajo la supervisión de Dmitry Baranov,
Milena Arciniegas y Liberato Manna, por su accesibilidad e interés en que
mi estancia fuera fructífera en todos los aspectos
o Al grupo de Nanomateriales para Aplicaciones Biomédicas, bajo la
supervisión de Teresa Pellegrino. Me llevo un gran aprendizaje de Niccolò
Silvestri y Sahitya Avuggada, por su metodológica forma de trabajar y
criterio en el diseño experimental

9
 En lo que respecta a esta tesis, debo reconocer la labor de Amadeo Sena y
Javier Carrascosa, quienes han dedicado parte de su tiempo en formarme,
diseñar y proporcionar el equipo de medida necesario para realizar los
inmunoensayos en formato de tira reactiva. También mencionar a William
Teixiera, con quien he tenido oportunidad de compartir en múltiples ocasiones
reflexiones, ideas y experimentos.

Por otro lado, destacar a los técnicos del Servicio de Microscopía de la

Universitat Politècnica de València, quienes me han acompañado a lo largo de
toda la etapa experimental, facilitándome el trabajo de caracterización. Valoro
su profesionalidad, buen trato y disposición.

A todos mis compañeros del IDM, por los buenos momentos dentro y fuera
del laboratorio, las aportaciones en lo científico y en lo personal, la colaboración
durante estos años y los ánimos durante la etapa final.

A los profesores del Dpto. de Química, por su accesibilidad para compartir

su experiencia y consejos.

A Pilar Aragón, por su implicación como tutora durante mi colaboración

como docente.

Y por supuesto a mi familia, que se merece mucho más de lo que pueda

decir en estas líneas.

10
Resumen

Los nanocristales de perovskita de haluros metálicos, cuya fórmula general

es ABX 3 (A = Cs + , CH 3 NH 3 + , CH(NH 2 ) 2 + ; B = Pb +2 , Sn +2 ; y X = Cl - , Br - , I - ) son una clase
de nanomateriales semiconductores que han tenido un gran impacto en
fotovoltaica y en la fabricación de dispositivos emisores de luz debido a sus
excelentes propiedades optoelectrónicas, entre ellas, la capacidad para
transportar cargas, generar electricidad y producir luz.

Aunque se trata de un área menos explorada, tienen potencial para

convertirse en marcadores luminiscentes en aplicaciones biológicas por sus
dimensiones nanométricas (4-15 nm) y por exhibir propiedades ópticas únicas,
entre ellas: alto rendimiento cuántico de fluorescencia, espectro de emisión
estrecho y posibilidad de modular su emisión en función de su tamaño y
composición para obtener una amplia gama de colores en la región visible (4 10-
700 nm), lo que los convierte en candidatos prometedores en multiplexado.

Además, presentan absorción multifotónica en el cercano infrarrojo y

emisión upconversion, siendo una ventaja en diagnóstico por imagen, ya que se
emplea una radiación que es inocua para los tejidos, tiene mayor penetración,
reduce la autofluorescencia celular y mejora la relación señal-ruido.

A pesar de las excelentes propiedades ópticas de estos materiales, tienden

a degradarse frente a la humedad, oxígeno, luz y alta temperatura, lo que
supone una clara limitación para el desarrollo de sus aplicaciones en biosensado
y diagnóstico por imagen.

Durante los últimos años, los avances en los métodos de encapsulación han
permitido mejorar su estabilidad frente a agentes externos, generando
estructuras core-shell o integrándose en matrices de una gran variedad de
materiales, entre los que se incluyen óxidos inorgánicos, polímeros u otros
semiconductores.

Esta tesis se ha centrado en el desarrollo de diferentes nanopartículas de

perovskita estables en medio acuoso para su utilización como marcadores
luminiscentes en biosensado o bioimagen in vitro. En todas las metodologías
propuestas se ha pretendido que las partículas resultantes cumplan con una
serie de requisitos, principalmente: tamaño nanométrico (< 200 nm), elevado
rendimiento cuántico de fluorescencia, estabilidad química y estructural en
tampón salino o medios de cultivo, y fácil conjugación a biorreceptores
específicos.

11
 La primera estrategia consiste en la preparación de nanopartículas core-
shell mediante la adaptación del método Stöber, una metodología sol-gel que
permite generar un recubrimiento de sílice que protege al material encapsulado
de disolventes polares y otros factores externos. La principal dificultad es
compatibilizar las condiciones de reacción sin comprometer la integridad y
propiedades ópticas de los nanocristales, ya que el proceso pasa por una etapa
hidrolítica que desencadena la degradación de los nanocristales. Esta estrategia
se ha llevado a cabo mediante dos aproximaciones diferentes.

En una primera aproximación, se ha obtenido una población monodispersa

de nanopartículas de CsPb 2 Br 5 @SiO 2 de 32 nm mediante una metodología de
adición lenta de la fuente precursora de sílice y el catalizador sobre los
nanocristales de CsPbBr 3 previamente sintetizados. Si bien, su principal
limitación es la baja emisión de fluorescencia, se ha demostrado en una prueba
de concepto su potencial como marcadores luminiscentes en un inmunoensayo
directo con un sistema modelo (anti-BSA y BSA).

En una segunda aproximación, se han obtenido nanopartículas

multicolores (azul, verde y rojo) core-shell de CsPbX 3 @SiO 2 (X = Cl/Br, Br y I) con
tamaños de 20-30 nm mediante un proceso de transformación estructural
combinado con la metodología sol-gel. Tras una etapa de estabilización térmica
que confiere estabilidad en medio acuoso, se ha demostrado su viabilidad como
marcadores luminiscentes en un ensayo directo entre el anticuerpo Omalizumab
y su receptor.

La segunda estrategia consiste en la incorporación de los nanocrista les en

partículas poliméricas mediante la técnica de coprecipitación. Se basa en la
capacidad que tienen los copolímeros anfifílicos para autoensamblarse en
medios selectivos y permite atrapar a los nanocristales de perovskita en el
interior de micelas poliméricas, las cuales ofrecen una barrera física eficaz por
su elevado grado de entrecruzamiento. Concretamente se han encapsulado
nanocristales de CsPbBr 3 en micelas compuestas por un copolímero de
poliestireno y ácido poliacrílico, alcanzando un tamaño me dio de 200 nm.
Finalmente, se han utilizado para la puesta a punto de ensayos en tira reactiva
para la detección de inmunoglobulinas G de suero humano.

La tercera estrategia recurre a la técnica denominada

electrospraying/electrospinning, una técnica de atomización que permite
generar partículas o fibras poliméricas en las cuales quedan embebidos los
nanocristales. En este caso, los nanocristales se han encapsulado en partículas
de poli(estireno-co-anhídrido maleico) y se han incubado en cultivo celular para
analizar su potencial en bioimagen por microscopía de fluorescencia.
12
 En resumen, esta tesis contribuye al avance en el desarrollo de
nanomateriales luminiscentes basados en perovskitas de haluros metálicos,
abordando el desafío que supone su estabilización en medio acuoso y
demostrando su viabilidad en medios biológicos.

Se prevé que, en un futuro, sea posible su implantación en el desarrollo de

plataformas analíticas de alto rendimiento que permitan la detección y/o
cuantificación óptica de analitos de interés clínico, medioambiental o
alimentario en el punto de atención, cumpliendo con los criterios de rapidez,
fiabilidad, facilidad de manejo y bajo coste, superando en sensibilidad y
capacidad de multiplexado a los sistemas actuales, la mayo ría de ellos basados
en nanopartículas de oro, colorantes orgánicos o sistemas quimioluminiscentes.

13
14
Abstract

Metal halide perovskite nanocrystals, with the general formula ABX 3 (A =

Cs + ,
CH 3 NH 3 + , CH(NH 2 ) 2 + ; B = Pb +2 , Sn +2 ; y X = Cl - , Br - , I - ), constitute a new class
of semiconductor nanomaterials with a significant impact on photovoltaic
industry and fabrication of light-emitting devices due to their excellent
optoelectronic properties, including the ability to transport charges, generate
electricity and produce light.

While it has not been deeply explored yet, they have the potential to
become luminescent labels in biological applications, given their nanometric
size (4-15 nm) and unique optical properties, such as high photoluminescence
quantum yield, narrow emission spectra, and the possibility to tune their
emission based on size and composition. This enables a wide color gamut in the
visible region (410-700 nm), making them promising candidates in multiplexing.

Moreover, perovskite nanocrystals exhibit strong multi-photon absorption

properties in the near-infrared region and upconversion emission, which are an
advantage for bioimaging applications since near-infrared radiation is less
hazardous to living organisms, has deeper tissue penetration, reduces cellular
autofluorescence and enhances signal-to-noise ratio.

Despite the exceptional optical properties of perovskite nanocrystals, their

potential in biosensing and bioimaging applications is hindered by their poor
stability against moisture, oxygen, light and heat.

To overcome these issues, in the last years, several strategies have been
developed to improve their stability through the encapsulation of perovskite
nanocrystals in a wide variety of protective materials, such as inorganic oxides,
polymers, or semiconductors, in the form of core-shell nanoparticles or
embedded in a matrix.

This thesis focuses on the synthesis and stabilization of perovskite

nanocrystals in aqueous environments with the aim of using them as
luminescent labels in biosensing or in vitro bioimaging. Different methodologies
have been employed to yield particles that meet specific requirements:
nanometric size (< 200 nm), high photoluminescence quantum yield, robust
chemical and structural stability in saline buffers or culture media, and facile
conjugation with bioreceptors.

15
 The first strategy produces core-shell nanoparticles by adapting the Stöber
method, a sol-gel reaction that generates a silica coating around the core, thus
protecting it from polar solvents and other external factors. The critical aspect
here is to establish the reaction conditions for silica growth without
compromising the integrity and optical properties of perovskite nanocrystals
during the hydrolytic step. This strategy has been carried out through two
different approaches.

In a first approach, a monodisperse population of CsPb 2 Br 5 @SiO 2

nanoparticles (32 nm) was obtained through a methodology where the silica
precursor source and catalyst are slowly added onto a solution containing
previously synthesized CsPbBr 3 nanocrystals. Although the main limitation is the
low fluorescence emission, their potential as luminescent markers was
demonstrated in a direct immunoassay with a model system (anti -BSA and BSA),
as a proof-of-concept.

In a second approach, multicolored CsPbX 3 @SiO 2 (X = Cl/Br, Br y I) core-

shell nanoparticles were produced by exploiting the structural transformative
features of perovskite nanocrystals in combination with a sol -gel process. The
resulting nanoparticles, with sizes ranging between 20-30 nm, emit blue, green,
and red light, respectively. After a thermal treatment were stabilized in aqueous
media and used as luminescent labels in a direct immunoassay, involving
Omalizumab antibody and its receptor.

The second strategy incorporates perovskite nanocrystals within polymeric

particles through a coprecipitation technique, which relies on the self-
assembling behavior of amphiphilic polymers in selective solvents . As a result,
perovskite nanocrystals are entrapped inside polymeric micelles which offer an
effective physical barrier due to the high crosslinking degree of the polymer
matrix. In this case, the resulting micelles, composed by a polystyrene-block-
polyacrylic acid copolymer, reached a size of 200 nm and were used as
fluorescent reporters in lateral flow immunoassay for human IgG detection.

The third strategy makes use of electrospraying/electrospinning method,

an atomization technique which enables embedding perovskite nanocrystals
inside polymeric particles or fibers. In this case, perovskite nanocrystals were
encapsulated inside poly(styrene-co-maleic anhydride) particles and were
incubated in a cell culture to explore their potential in bioimaging by using
fluorescence microscopy.

To sum up, this thesis contributes to the development of luminescent

nanomaterials based on metal halide perovskite nanocrystals, facing the

16
challenge of stabilizing them in aqueous media and testing their viability in
biologic media.

We envision that, in the near future, it will be possible to incorporate

perovskite nanoparticles in the development of high-throughput analytical
platforms for the optical detection and/or quantification of clinically,
environmentally or food-related analytes at the point of care, meeting the
criteria of speed, reliability, ease of use, and low cost, surpassing current
systems in sensitivity and multiplexing, most of them based on gold
nanoparticles, organic dyes or chemiluminescent systems.

17
18
Resum

Els nanocristals de perovskita d'halurs metàl·lics, amb fórmula general

ABX 3 (A = Cs + , CH 3 NH 3 + , CH(NH 2 ) 2 + ; B = Pb +2 , Sn +2 ; y X = Cl - , Br - , I - ), són una classe
de nanomaterials semiconductors que han tingut un gran impacte en
fotovoltaica i en la fabricació de dispositius emissors de llum a causa de les
seues excel·lents propietats optoelectròniques, entre elles, la capacitat per a
transportar càrregues, generar electricitat i produir llum.

Encara que es tracta d'una àrea menys explorada, tenen potencial per a
convertir-se en marcadors luminescents en aplicacions biològiques per les seues
dimensions nanomètriques (4-15 nm) i per exhibir propietats òptiques úniques,
entre elles: alt rendiment quàntic de fluorescència, espectre d'emissió estret i
possibilitat de modular la seua emissió en funció de les seues dimensions i
composición, de manera que es pot obtindre una àmplia gamma de colors a la
regió visible (410-700 nm), la qual cosa els converteix en candidats prometedors
en multiplexatge.

A més, presenten absorció multifotònica en el pròxim infraroig i emissió

upconversion, sent un avantatge en diagnòstic per imatge, ja que s'empra una
radiació que és innòcua per als teixits, té major penetració, redueix
l'autofluorescència cel·lular i millora la relació senyal-soroll.

Malgrat les excel·lents propietats òptiques d'aquests materials, tendeixen

a degradar-se enfront de la humitat, oxigen, llum i alta temperatura, la qual cosa
suposa una clara limitació per al desenvolupament de les seues aplicacions en
biosensat i diagnòstic per imatge.

Durant els últims anys, els avanços en els mètodes d'encapsulació han
permés millorar la seua estabilitat enfront d'agents externs, gener ant
estructures core-shell o integrant-se en matrius d'una gran varietat de
materials, entre els quals s'inclouen òxids inorgànics, polímers o altres
semiconductors.

Aquesta tesi s'ha centrat en el desenvolupament de diferents

nanopartícules de perovskita estables al mig aquós per a la seua utilització com
a marcadors luminescents en biosensat o bioimatge in vitro. En totes les
metodologies proposades s'ha pretés que les partícules resultants complisquen
amb una sèrie de requisits, principalment: grandària nanomètric (< 200 nm),
elevat rendiment quàntic de fluorescència, estabilitat química i estructural en
tampó salí o medis de cultiu, i fàcil conjugació a biorreceptors específics.

19
 La primera estratègia consisteix en la preparació de nanopartícules core-
shell mitjançant l'adaptació del mètode Stöber, una metodologia sol -gel que
permet generar un recobriment de sílice que protegeix el material encapsulat
de dissolvents polars i altres factors externs. La principal dificultat és
compatibilitzar les condicions de reacció sense comprometre la integritat i
propietats òptiques dels nanocristals, ja que el procés passa per una etapa
hidrolítica que desencadena la degradació dels nanocristals. Aquesta estratègia
s'ha dut a terme mitjançant dues aproximacions diferent s.

En una primera aproximació, s'ha obtingut una població monodispersa de

nanopartícules de CsPb 2 Br 5 @SiO 2 de 32 nm mitjançant una metodologia
d'addició lenta de la font precursora de sílice i el catalitzador sobre els
nanocristals de CsPbBr 3 prèviament sintetitzats. Si bé, la seua principal limitació
és la baixa emissió de fluorescència, s'ha demostrat en una prova de concepte
el seu potencial com a marcadors luminescents en un immunoassaig directe amb
un sistema model (anti-BSA i BSA).

En una segona aproximació, s'han obtingut nanopartícules multicolors

(blava, verda i roig) core-shell de CsPbX 3 @SiO 2 (X = Cl/Br, Br i I) amb dimensions
de 20-30 nm mitjançant un procés de transformació estructural combinat amb
la metodologia sol-gel. Després d'una etapa d'estabilització tèrmica que
confereix estabilitat al mig aquós, s'ha demostrat la seua viabilitat com a
marcadors luminescents en un assaig directe entre l'anticòs Omalizumab i el seu
receptor.

La segona estratègia consisteix en la incorporació dels nanocrista ls en

partícules polimèriques mitjançant la tècnica de coprecipitació. Es basa en la
capacitat que tenen els copolímers amfifílics per a autoassemblar -se en mitjans
selectius i permet atrapar als nanocristals de perovskita a l'interior de micel·les
polimèriques, les quals ofereixen una barrera física eficaç pel seu elevat grau
d'entrecreuament. Concretament s'han encapsulat nanocristals de CsPbBr 3 en
micel·les compostes per un copolímer de poliestiré i àcid poliacrílic, aconseguint
una grandària mitjana de 200 nm. Finalment, s'han utilitzat per a la posada a
punt d'assajos en tira reactiva per a la detecció d'immunoglobulines G de sèrum
humà.

La tercera estratègia recorre a la tècnica denominada

electrospraying/electrospinning, una tècnica d'atomització que permet generar
partícules o fibres polimèriques en les quals queden embeguts els nanocristals.
En aquest cas, els nanocristals s'han encapsulat en partícules de poli(estiré -co-
anhídrid maleic) i s'han incubat en cultiu cel·lular per a analitzar el seu pote ncial
en bioimatge per microscòpia de fluorescència.
20
 En resum, aquesta tesi contribueix a l'avanç en el desenvolupament de
nanomaterials luminescents basats en perovskitas d'halurs metàl·lics, abordant
el desafiament que suposa la seua estabilització al mig aquós i demostrant la
seua viabilitat en mitjans biològics.

Es preveu que, en un futur, siga possible la seua implantació en el

desenvolupament de plataformes analítiques d'alt rendiment que permeten la
detecció i/o quantificació òptica d'anàlits d'interés clínic, mediambiental o
alimentari en el punt d'atenció, complint amb els criteris de rapidesa, fiabilitat,
facilitat de maneig i baix cost, superant en sensibilitat i capacitat de
multiplexatge als sistemes actuals, la majoria d'ells basats en nanopar tícules
d'or, colorants orgànics o sistemes quimioluminescents.

21
22
Diseminación de resultados

Artículos publicados en revistas científicas indexadas

Título: Monodispersed CsPb 2 Br 5 @SiO 2 Core–Shell Nanoparticles as Luminescent

Labels for Biosensing
Autores: Cynthia Collantes, Victoria González Pedro*, Maria-José Bañuls and
Ángel Maquieira
Revista: ACS Applied Nano Materials
IF 2021 : 5,097
Referencia: ACS Appl. Nano Mater. 2021, 4, 2, 2011–2018.
https://doi.org/10.1021/acsanm.0c03340

Título: Highly Emitting Perovskite Nanocrystals with 2-Year Stability in Water

through an Automated Polymer Encapsulation for Bioimaging
Autores: Sahitya Kumar Avugadda, Andrea Castelli, Balaji Dhanabalan, Tamara
Fernandez, Niccolo Silvestri, Cynthia Collantes, Dmitry Baranov, Muhammad
Imran, Liberato Manna, Teresa Pellegrino*, Milena P Arciniegas*
Revista: ACS Nano
IF 2022 : 18,027
Referencia: ACS Nano. 2022, 16 (9), 13657-13666.
https://doi.org/10.1021/acsnano.2c01556

Título: Designing stable lead halide perovskite nanocrystals: From a single

particle to nanocomposites
Autores: Cynthia Collantes, William Teixeira, Victoria González Pedro*, Maria-
José Bañuls and Ángel Maquieira
Revista: Applied Materials Today
IF 2023 : 8,663
Referencia: Appl. Mat. Today. 2023, 31, 101775.
https://doi.org/10.1016/j.apmt.2023.101775

23
Título: Water-assisted synthesis of stable and multicolored CsPbX 3 @SiO 2 core-
shell nanoparticles as fluorescent probes for biosensing
Autores: Cynthia Collantes, William Teixeira, Victoria González Pedro*, Maria-
José Bañuls and Ángel Maquieira
Revista: Dalton Transactions
IF 2023 : 4,0
Referencia: Dalton Trans., 2023, Accepted Manuscript.
https://doi.org/10.1039/D3DT02593D

Comunicaciones en congresos nacionales e internacionales

Título: CsPbBr 3 Perovskite Nanoparticles Synthesis Approaches Towards

Biosensing Applications
Autores: Cynthia Collantes, Victoria González Pedro, María-José Bañuls and
Ángel Maquieira
Congreso: XIII International Workshop on Sensors and Molecular Recognition
Tipo: Internacional
Lugar: València (España)
Fecha: Del 04 al 05 de Julio de 2019
Contribución: Póster

Título: Monodispersed CsPb 2 Br 5 @SiO 2 Core−Shell Nanoparticles as Luminescent

Labels for Biosensing
Autores: Cynthia Collantes, Victoria González Pedro, María-José Bañuls and
Ángel Maquieira
Congreso: XIV International Workshop on Sensors and Molecular Recognition
Tipo: Internacional
Lugar: València (España)
Fecha: Del 08 al 09 de Julio de 2021
Contribución: Póster

24
Título: CsPbBr 3 NCs encapsulation into a polystyrene-based polymer by
electrospraying
Autores: Cynthia Collantes, Victoria González Pedro, Mª José Fabra, Amparo
López, Vicenta Devesa, María-José Bañuls and Ángel Maquieira
Congreso: XIV International Workshop on Sensors and Molecular Recognition
Tipo: Internacional
Lugar: València (España)
Fecha: Del 08 al 09 de Julio de 2021
Contribución: Póster

Título: Designing Water-Stable Metal Halide Perovskite Nanoparticles for

Biosensing and Bioimaging Applications
Autores: Cynthia Collantes, William Teixeira, Victoria González Pedro, María-
José Bañuls and Ángel Maquieira
Congreso: MATSUS23 & Sustainable Technology Forum València (STECH23)
Tipo: Internacional
Lugar: València (España)
Fecha: Del 06 al 10 de Marzo de 2023
Contribución: Póster

25
26
Listado de abreviaturas

APTES 3-Aminopropyl)triethoxysilane | 3-aminopropiltrietoxisilano

ATR-FTIR Attenuated total reflectance fourier-transform infrared | Infrarrojo
con transformada de Fourier y reflectancia total atenuada
BSA Bovine serum albumin | albúmina de suero bovino
Cs-OA Cesium oleate | oleato de cesio
CTL Control
CUP Concentración umbral de polímero
D.O. Densidad óptica
fwhm Full width at half maximum | anchura a media altura
HRFESEM High resolution field emission scanning electron microscopy |
microscopía electrónica de barrido de alta resolución
ICP-MS Inductively coupled plasma mass spectrometry |Espectrometría de
masas con plasma acoplado inductivamente
LARP Ligand-assisted re-precipitation | reprecipitación asistida por
ligando
LHP Lead halide perovskite | perovskita de haluros de plomo
MHP Metal halide perovskite | perovskita de haluros metálicos
NCs Nanocrystals | nanocristales
N.D. No descrito
NIR Near infrared | Infrarrojo cercano
NPLs Nanoplatelets | nanoplaquetas
NPs Nanoparticles | nanopartículas
OA Oleic acid | ácido oleico
OAm Oleylamine | oleilamina
ODE Octadecene | octadeceno
PAA Polyacrylic acid | ácido poliacrílico
PBS Phosphate buffered saline | tampón fosfato salino
PBS-T phosphate buffered saline with Tween 20 | tampón fosfato salino
con Tween 20
PL Photoluminescence | fotoluminiscencia

27
PLQY Photoluminescence quantum yield | Rendimiento cuántico de
fotoluminiscencia
PS Polystyrene | poliestireno
PSMA Poly(styrene-co-maleic anhydride) | poli(estireno-co-anhídrido
maleico)
QDs Quantum dots | punto cuánticos
TEM Transmission electron microscopy | microscopía de transmisión
electrónica
TEOS Tetraethyl orthosilicate | tetraetilortosilicato
TMOS Tetramethyl orthosilicate | tetrametilortosilicato
UV Ultraviolet | ultravioleta
UV-vis Ultraviolet – visible |Ultravioleta-visible

28
Índice

Capítulo 1. Introducción ........................................................ 31

1.1. Estado del arte de marcadores luminiscentes .......... 33

1.2. Perovskitas de haluros plomo (LHP) ......................... 41

1.2.1 Descubrimiento y breve historia ....................................... 41

1.2.2 Estructura ........................................................................ 42

1.2.3 Composición y propiedades ópticas .................................. 44

1.2.4 Métodos de síntesis de nanocristales de perovskita ......... 46

1.2.5 Estrategias de estabilización ............................................ 50

1.2.6 Aplicaciones ..................................................................... 81

1.3. Bibliografía ............................................................. 90

Capítulo 2. Objetivos ........................................................... 107

Capítulo 3. Estabilización de NCs de perovskita con

recubrimientos de sílice mediante la adaptación
del proceso gel .................................................. 111

3.1. Introducción ......................................................... 113

3.2. Resultados ............................................................ 118
3.3. Conclusiones ......................................................... 145
3.4. Materiales y Métodos ........................................... 148
3.5. Bibliografía ........................................................... 154

Capítulo 4. Estabilización de NCs de CsPbBr 3 en micelas

poliméricas para su utilización en tira reactiva ... 161

29
 4.1. Introducción ......................................................... 163
4.2. Resultados ............................................................ 169
4.3. Conclusiones ......................................................... 187
4.4. Materiales y métodos ............................................ 189
4.5. Bibliografía ........................................................... 195

Capítulo 5. Estabilización de NCs de perovskita en partículas

poliméricas mediante electrospraying ................ 201

5.1. Introducción ......................................................... 203

5.2. Resultados ............................................................ 206
5.3. Conclusiones ......................................................... 212
5.4. Materiales y métodos ............................................ 214
5.5. Bibliografía ........................................................... 217

Capítulo 6. Conclusiones ...................................................... 221

30
Capítulo 1. Introducción

Capítulo 1
Introducción

31
32
 Capítulo 1. Introducción

1.1. Estado del arte de marcadores luminiscentes

La utilización de técnicas fotoluminiscentes proporciona una herramienta

fundamental en investigación biomédica para el estudio de interacciones
biomoleculares y procesos biológicos. Estas técnicas se basan en la capacidad
que tienen ciertas moléculas o materiales de emitir luz tras ser excitadas por
una fuente de luz externa. Al marcar biomoléculas específicas con estos
fluoróforos, es posible rastrear su ubicación in vivo o in vitro dentro de la célula
(bioimagen) o utilizarlas para la detección y/o cuant ificación de analitos en
muestras biológicas (sistemas analíticos y biosensado).

Idealmente, un fluoróforo debe reunir las siguientes características para

su utilización en marcaje (1) tener un tamaño que no afecte a la función de la
biomolécula o impida su internalización celular (< 200 nm), 1,2 (2) presentar alto
rendimiento cuántico de fluorescencia para poder detectarlo mediante técnicas
de análisis de fluorescencia convencionales, (3) ser soluble y estable en
tampones salinos, medios de cultivo o fluidos biológicos, (4) ofrecer la
posibilidad de multiplexado (detección de múltiples señales simultáneamente),
(5) ser fácil de conjugar a biorreceptores de interés, (6) excitarse
preferiblemente con longitudes de excitación que reduzcan la autofluorescencia
celular y (7) presentar baja toxicidad, en el caso de utilizarse en marcaje celular
in vitro o in vivo. 3

Los agentes de marcaje de uso más extendido son los colorantes orgánicos,
por ejemplo: rodaminas, fluoresceínas, cianinas … Entre sus principales ventajas
destaca su pequeño tamaño (1 kDa), baja toxicidad y disponibilidad comercial. 4
Se caracterizan por tener un espectro de absorción estrecho, lo q ue limita el
rango de longitudes de onda de excitación, presentan un desplazamiento de
Stokes corto y un espectro de emisión asimétrico que se ensancha hacia
longitudes de onda más largas (Figura 1a). 5 Exhiben altos coeficientes de
absorción molar (ε), rendimientos cuánticos de fluorescencia (PLQY) moderados
y tiempos de vida de fluorescencia de unos pocos nanosegundos (< 5 ns en la
región visible y 1 ns en el infrarrojo cercano (NIR)).

Su aplicación en bioimagen y detección multicolor está limitada por el

solapamiento de los espectros de emisión y susceptibilidad a sufrir
fotoblanqueamiento, es decir, se descomponen cuando se exponen a una fuente
de excitación de forma prolongada.

Por otro lado, las proteínas fluorescentes se expresan de forma

recombinante dentro de la célula, lo que permite estudiar procesos biológicos
33
 Capítulo 1. Introducción

in situ. 6 Han demostrado ser un recurso esencial para el estudio de procesos

celulares, como por ejemplo la función de una proteína, la actividad de un
promotor o la eficiencia en la transfección de un gen. 7

La más conocida es la proteína verde fluorescente (GFP, green fluorescent

protein), cuya secuencia pertenece originalmente a la medusa Aequorea
victoria. Actualmente existen múltiples variantes obtenidas por mutagénesis
que abarcan todo el espectro visible, por ejemplo, con emisión en el azul (EBFP),
amarillo (YFP) o rojo (RFP). En general, todas ellas tienen un tamaño de ~ 25 kDa
y una estructura en barril beta que mide 4,2 nm de largo y 2,4 nm de diámetro.
Aunque es un tamaño relativamente grande en comparación con los colorantes
orgánicos, generalmente no interfiere en las funciones biológicas.

Su espectro de absorción es estrecho y el espectro de emisi ón es ancho y

asimétrico (Figura 1a), tienen coeficientes de extinción molar inferiores a los de
los colorantes orgánicos, su PLQY es variable y presentan tiempos de vida de
fluorescencia cortos (< 5 ns). En ocasiones, su señal solo es detectable cuando
la proteína se expresa en concentraciones altas, lo que a su vez puede causar
problemas de agregación e inducir toxicidad celular.

Figura 1. (a) Espectros de absorción y emisión de un ejemplo de colorante orgánico

(rodamina) y de proteína fluorescente (DsRed2). (b) Espectro de excitación
y de emisión de un complejo de Eu. Imágenes reproducidas de (a) Nature
Materials, 2005, 4, 435–446 y (b) Inorg. Chem. 2008, 47, 7, 2507-2513

De la misma forma que sucede con los colorantes orgánicos, sufren

fotodegradación y en experimentos de multiplexado, donde se requieren más
de dos fluoróforos para poder detectar múltiples señales simultáneamente, su
uso está limitado, debido a que tienen espectros de excitación estrechos,
espectros de emisión anchos que solapan entre sí y desplazamientos de Stokes
cortos.
34
 Capítulo 1. Introducción

Los quelatos de lantánidos son compuestos constituidos por un cromóforo

orgánico que actúa como antena o sensibilizador, absorbiendo luz y
transfiriendo la energía a los iones de lantánido, los cuales emiten luz. Los
complejos de lantánido más utilizados son los de Eu +3 y Tb +3 . Estos exhiben
bandas de emisión estrechas, con una anchura a media altura ( fwhm) de 1-
20 nm en la región espectral del rojo (590, 610 y 720 nm) (Figura 1b) y del verde
(490, 540 y 580 nm), respectivamente.

Ofrecen propiedades fotofísicas que los hacen interesantes para su

utilización como luminóforo en medios biológicos, por ejemplo, exhiben un gran
desplazamiento de Stokes (> 150 nm), lo que permite separar claramente la
señal de excitación de la de emisión. Además, son fotoestables y se caracterizan
por tiempos de vida de fluorescencia largos (del orden de nanosegundos hasta
milisegundos), lo que permite eliminar el scattering de la fuente de excitación y
la autofluorescencia de las muestras biológicas. 8,9

La principal desventaja de estos complejos es que la luminiscencia es

generalmente baja en medio acuoso. 4 En cuanto a toxicidad, únicamente se
produce si el ión lantánido se disocia del complejo, ya que al tener un radio
iónico similar al del Ca +2 , puede interferir en algunas funciones biológicas. Sin
embargo, la utilización de ligandos macrocíclicos no dentados con donantes
carboxilato es suficiente para prevenir que esto ocurra. 10

Los quantum dots (QDs) son nanocristales de semiconductores de entre 2-

10 nm que poseen propiedades ópticas y electrónicas distintas al mismo
material en la macroescala (bulk). Entre ellas, la capacidad de ajustar la
absorción y emisión en función del tamaño de la partícula. 11 Es decir, es posible
obtener una amplia gama de colores del espectro visible modificando
únicamente este parámetro. A medida que disminuye el tamaño de los QDs,
incrementa el bandgap, llevando a un desplazamiento de la absorción y emisión
hacia el azul. Mientras que se desplaza hacia el rojo cuando aumenta el tamaño
de la partícula.

La primera vez que se observaron estos efectos fue a principios de la

década de los 80, a partir de inclusiones de NCs de CuCl en una matriz de vidrio
o de nanocristales de CdS crecidos en suspensiones coloidales. 12 En 1993, el
grupo de Bawendi demostró cómo sintetizar de forma controlada QDs de CdE (E
= S, Se, Te) coloidales con un tamaño definido y alta calidad óptica mediante el
método hot-injection, que consiste en mezclar rápidamente los precursores
químicos en una mezcla de surfactantes a alta temperatura . 13 Esta metodología
supuso un antes y un después en la obtención de QDs monodispersos (con una
variación del tamaño < 5%) de forma reproducible para una gran variedad de
35
 Capítulo 1. Introducción

materiales semiconductores de los grupos II-VI (CdS, CdSe, CdTe…), III-V (InP,
InAs…) o IV-VI (PbS, PbSe…), aunque inicialmente presentaban una baja
eficiencia de emisión (PLQY < 10%).

Posteriormente, la metodología se modificó para sintetizar QDs como

heteroestructuras core-shell, donde el núcleo queda recubierto por una capa
adicional de otro material semiconductor de mayor bandgap, generalmente de
ZnS o CdS. 14 Esta capa protege al núcleo de la oxidación, previene su
degradación e incrementa significativamente el valor de PLQY. A lo largo de los
años, se ha logrado incrementar este valor desde el 50% hasta prácticamente el
100%. 15

La capacidad para producir QDs con estas características ha permitido

explorar sus aplicaciones con fines comerciales, fundamentalmente en la
fabricación de pantallas con una definición excepcional de los colores o diodos
emisores de luz (LEDs).

Por otro lado, su utilización como marcadores en sistemas biológicos fue

posible a partir de 1998, una vez se desarrollaron estrategias que permitieron
su transferencia al medio acuoso. Entre ellas, la generación de un recubrimiento
de sílice sobre la superficie de los QDs. 16 o el reemplazo de los ligandos
originales por ligandos bifuncionales, como el ácido mercaptoacético. 17 Estas
estrategias promovieron su dispersión en medios fisiológicos y permitieron su
conjugación a biomoléculas (proteínas, péptidos, ácidos nucleicos) para
utilizarlos por primera vez como alternativa a los colorantes orgánicos en
aplicaciones de bioimagen.

Entre sus ventajas, los QDs destacan por presentar amplios espectros de
excitación, lo que permite alcanzar desplazamientos de Stokes más largos (~
250 nm) (Figura 2a). Además, se caracterizan por tener elevados coeficientes de
absorción, un espectro de emisión simétrico y estrecho (fwhm de 25-40 nm), 18
y sintonizable en función de su tamaño (Figura 2b) y composición (Figura 2c),
pudiendo obtener una amplia gama de colores desde el ultravioleta al
infrarrojo. 4

A diferencia de los fluoróforos tradicionales, los QDs son 10-20 veces más
brillantes (por sus altos valores de PLQY y coeficiente de extinción molar), son
100-200 veces más fotoestables (Figura 2d), 19 y pueden excitarse
simultáneamente distintos colores utilizando una misma longitud de onda, lo
que los convierte en marcadores ideales para multiplexado. 4

36
 Capítulo 1. Introducción

Los QDs más utilizados en bioanálisis in vitro son los basados en CdSe,
capaces de emitir en todo el espectro visible, pero también existen otras
opciones menos tóxicas que emiten en el NIR, como por ejemplo los QDs de
InAs. Esta región espectral proporciona mayor resolución de imagen, tiene alta
penetración en los tejidos biológicos, es inocua y no produce autofluorescencia
celular, lo que hace que sea interesante en estudios de imagen in vivo. 19

Figura 2. Propiedades ópticas de los QDs. (a) Espectro de absorción ancho y un

espectro de emisión estrecho, (b) Emisión sintonizable en función del
tamaño, desplazándose hacia longitudes de onda más largas a medida
que aumenta su tamaño. (c) Emisión sintonizable en función de la
composición del nanocristal. Por ejemplo, los QDs de CdSe pueden
abarcar todo el espectro visible (400 – 700 nm), mientras que los de InAs
emiten en el infrarrojo cercano (NIR). (d) Comparación de la resistencia a
la fotodegradación en un cultivo celular. En rojo, el núcleo marcado con
QD630 y en verde los microtúbulos marcados con AlexaFluor 488. Imágenes
reproducidas de (a y b) Nature Materials, 2005, 4, 435–446, (c) Ind. Eng.
Chem. Res. 2018, 57, 6, 1790–1802, (d) Nature Biotechnology, 2003, 21, 41 -
46

Por otro lado, los nanocristales coloidales (NCs) de perovskita de haluros

metálicos (MHPs) son una clase de nanomateriales semiconductores más
reciente que surgió partir de 2014, 20,21 y tienen potencial para superar las
limitaciones de los QDs tradicionales.

37
 Capítulo 1. Introducción

Tienen fórmula general ABX 3 , donde A representa el catión monovalente y

puede ser Cs + , metilamonio (CH 3 NH 3 + , MA) o formamidinio (CH(NH 2 ) 2 + , FA), B
está constituido por un catión metálico divalente (Pb +2 , Sn +2 …), y X representa
al haluro (Cl - , Br - o I - ). 22 Se organizan en una estructura cúbica tridimensional,
que consiste en una red de octaedros BX 6 -4 que comparten sus esquinas,
mientras que el catión A se localiza en el centro de la cavidad formada por 8
octaedros (Figura 3a). 23 Los más populares son los NCs de perovskita de haluros
de plomo (LHP).

Coinciden con los QDs clásicos en que exhiben excelentes propiedades

optoelectrónicas: amplio espectro de absorción, emisión estrecha y sintonizable
en función de su tamaño y composición (Figura 3b-c), 21 alto coeficiente de
absorción y PLQY, capacidad de multiplexado, 24 y emisión upconversion
desencadenada por absorción multifotónica a partir de una fuente de luz
infrarroja (Figura 3d). 25,26

Respecto a los QDs, tienen la ventaja de que pueden ser sintetizados en

condiciones suaves de temperatura, de una forma rápida, sencilla y barata.
Además, los defectos que se forman son benignos (generalmente son vacantes
en los sitios A y X) y se localizan en las bandas de valencia (VB) y de conduc ción
(CB), por lo que alcanzan altos valores de PLQY sin necesidad de pasivar su
superficie (Figura 3e). Esto marca una diferencia importante con lo que ocurre
en los QDs, donde las trampas se localizan en el bandgap, lo que induce la
recombinación no radiativa y por tanto supone una pérdida de la eficiencia de
fotoluminiscencia, haciendo necesario recurrir a una etapa de pasivación de los
defectos para incrementar el valor de PLQY. 27

Los NCs de LHP han demostrado su gran potencial en aplicaciones en

fotovoltaica (celdas solares), 28 dispositivos emisores de luz (LEDs, pantallas), 29
fotodetectores… 30 Sin embargo, a pesar de las múltiples ventajas que ofrece, su
utilización como marcador fluorescente en aplicaciones biológicas está poco
explorada, principalmente por su baja estabilidad en disolventes polares y
toxicidad asociada a la liberación de Pb.

De la misma forma que ocurre con los QDs, es posible hacer frente a sus
limitaciones recurriendo a estrategias que permitan su estabi lización en
condiciones fisiológicas mediante la modificación química de su superficie y
faciliten su conjugación a biomoléculas para su utilización en bioimagen o
biosensado.

La Tabla 1 reúne las principales características de los marcadores

luminiscentes mencionados en esta sección.

38
 Capítulo 1. Introducción

Figura 3. (a) Estructura tridimensional de los NCs de perovskita de haluros metálicos

(MHPs). (b) Emisión estrecha (fwhm 12-42 nm) y sintonizable en función de
la composición del haluro (X = Cl, Br, I, o de las combinaciones mixtas Cl /Br
o Br/I) y (c) del tamaño del nanocristal. (d) Espectro de absorción ancho
(línea verde), espectro de emisión a una λ ex 400 nm (línea roja) y emisión
upconversion (línea azul) a una λ ex 800 nm). (e) Estructura electrónica de
QDs y NCs de CsPbX 3 . En los QDs las trampas originadas por los defectos
en la estructura se localizan en el bandgap, lo que conlleva a la pérdida
de su eficiencia de emisión, mientras que en los NCs de CsPbX 3 se localizan
en las bandas de valencia (VBM) y de conducción (CBM). Imágenes
reproducidas de (a) Crystals 2021, 11(3), 295, (b y c) Nano Letters, 2015,
15(6), 3692–3696, (d) Nano Lett. 2016, 16, 1, 448–453, (e) Nature Materials
2018, 17, 394–405

39
 Capítulo 1. Introducción

Tabla 1. Características de los marcadores luminiscentes

Fluoróforo Colorantes Proteínas Quelatos de QDs clásicos NCs de LHP

orgánicos fluorescentes lantánido
Tamaño 0,5 nm (1 kDa) 4 nm (27 kDa) < 1 nm 2-10 nm 4-15 nm
Espectro de Estrecho Estrecho Ancho Ancho Ancho
absorción
Coeficiente de 10 4 -10 5 10 3 10 4 10 4 -10 6 10 5
absorción molar
(M - 1 .cm -1 )
Espectro de Ancho (fwhm Ancho, fwhm Estrecho (fwhm Estrecho Estrecho
emisión de 35-100 nm) (40-150 nm) y < 10 nm) (fwhm de 25- (fwhm de
y asimétrico asimétrico 40 nm) y 12-42 nm) y
simétrico simétrico
PLQY (%) 50-90 20-80 20-50 10-80 50-90
Tiempo de vida < 5 ns < 5 ns 0,5 – 2,5 ms 10-20 ns 1-29 ns
de fluorescencia
Fotoestabilidad Baja Baja Alta Alta Alta
Toxicidad Baja Baja Baja Alta (Cd) Alta (Pb)
Refs. 3,4 7 , 3 1 , 32 4,8 1 8 , 33 2 1 , 34

40
 Capítulo 1. Introducción

1.2. Perovskitas de haluros plomo (LHP)

1. 2. 1 D e sc ubr imi e nto y br e ve h is tor i a

El término “perovskita” se refiere a cualquier material con fórmula ABX 3

que comparte la estructura cristalina del titanato de calcio (CaTiO 3 ), mineral que
fue descubierto en los Montes Urales de Rusia por Gustav Rose en 1893 y
bautizado en honor al mineralista y político ruso Lev Perovski. 35

Las perovskitas de haluros metálicos (MHPs) adoptan la fórmula general

ABX 3 , donde A es un catión monovalente y puede ser inorgánico, como el Cs + o
el Rb + , u orgánico como el metilamonio (MA, CH 3 NH 3 + ) o formamidinio
(CH(NH 2 ) 2 + , FA). B es un catión metálico divalente (Pb +2 , Sn +2 , Ge +2 …) y X es un
anión de haluro (Cl - , Br - o I - ).

Esta clase de materiales ha experimentado un importante crecimiento en

la última década, especialmente aquellos en los que el sitio B está ocupado por
Pb, es decir, perovskitas de haluros de plomo (LHPs). Son materiales versátiles,
sus precursores sintéticos son abundantes y de bajo coste, su preparación es
sencilla, presentan excelentes propiedades optoelectrónicas (absorber luz,
transportar cargas, generar electricidad y emitir luz ) y son tolerantes a los
defectos. 36

Inicialmente, el interés por las LHPs se centró en su implantación en

fotovoltaica, como sensibilizador en células solares, por su capacidad para
absorber luz y transportar cargas. En sus comienzos, la metodología consistía en
recurrir a síntesis de plantilla (template synthesis) para preparar material
nanoparticulado de perovskita en matrices porosas de óxidos metálicos (TiO 2 o
Al 2 O 3 ). 37

Sin embargo, el desarrollo de metodologías de síntesis de NCs coloidales

de LHPs permitió ampliar el abanico de posibilidades, tanto en la procesabilidad
de finas películas de perovskita para células solares, como en su integración en
dispositivos optoelectrónicos (diodos emisores de luz, fotodetectores…)
utilización en fotocatálisis, biosensado/sensado y bioimagen.

En este sentido, cabe destacar el año 2014, cuando Schmidt et al

demostraron la primera síntesis coloidal de nanopartículas de perovskita,
concretamente de MAPbBr 3 , por el método de microemulsión inversa,
alcanzando un PLQY del 20%. 20 El papel de los ligandos orgánicos de cadena
41
 Capítulo 1. Introducción

larga demostró ser crítico para limitar el crecimiento y evitar el colapso

generando cristales más grandes.

Posteriormente, en 2015 Protesescu et al adaptaron la metodología hot-

injection, tradicionalmente utilizada para sintetizar QDs tradicionales de CdSe, 21
y obtuvieron NCs coloidales monodispersos de perovskita inorgánica para todas
las composiciones, es decir, CsPbX 3 (X = Cl, Br, I y composiciones mixtas de Cl/Br
y Br/I). Se trata de uno de los trabajos más relevantes de la última década (con
más de 6.000 citas). Con esta metodología es posible controlar el tamaño de los
NCs en función de la temperatura de reacción y permite explorar sus excelentes
propiedades ópticas, entre ellas: alto PLQY (50-90%) y emisión estrecha (fwhm
de 12-42 nm) y ajustable en todo el espectro visible (400-700 nm) en función de
la composición del haluro y el tamaño del nanocristal.

Estos resultados despertaron un gran interés en la comunidad científica

por los NCs de LHPs, debido a que su síntesis podía producirse en condiciones
más suaves, empleaba precursores sintéticos más económicos y los NCs exhibían
altos PLQY sin la necesidad de pasivar los defectos de su superficie, haciéndolos
más competitivos frente a los QDs de CdSe. 38

El impacto de este trabajo, se tradujo en múltiples adaptaciones de la

metodología hot-injection que permitieron obtener nanoestructuras de LHPs de
diferentes tamaños y morfologías, como nanoplaquetas (NPLs), nanohojas (NSs),
nanocables (NWs) y quantum dots (QDs). 36

1. 2. 2 E s tr uc tur a

La estructura perovskita tridimensional

está formada por una combinación de 3 iones
que cumplen con la estequiometría ABX 3 . En
estos compuestos, los cationes B se coordinan
con 6 aniones para formar un octaedro (BX 6 ) y
los cationes A se coordinan con 12 aniones
para formar un cuboctaedro (Figura 4). 39

Figura 4. Estructura perovskita ABX 3 , donde los

cationes B se coordinan con 6 aniones formando
un octaedro (BX 6 ) y los cationes A ocupan el sitio
central del cuboctaedro. Imagen reproducida de
Materials Today, 2015, 18(2), 65–72

42
 Capítulo 1. Introducción

El trío de iones en las MHPs debe cumplir con la neutralidad de carga (A + ,

B +2 , X - ) para adoptar la fórmula ABX 3 . 40 Sin embargo, esto no implica
necesariamente que adquieran la estructura cristalina perovskita. Existe una
combinación de dos parámetros que permite predecir la estabilidad de la
estructura. Estos son el factor de tolerancia (t) de Goldschmidt y el factor
octaédrico (μ).

El factor de tolerancia (t) de Goldschmidt permite evaluar los desajustes

relativos al tamaño de los iones para formar la estructura perovskita y se define
como:

(𝑟𝐴 + 𝑟𝐵 )
𝑡=
√2(𝑟𝐵 + 𝑟𝑋 )

donde r A , r B y r X son los radios iónicos de A, B y X, respectivamente.

En una estructura perovskita cúbica ideal, el factor de tolerancia equivale

a 1, aunque experimentalmente, el valor de t oscila entre 0,8 y 1 en la mayor
parte de las perovskitas. 41 En el caso de las perovskitas de haluros de plomo
(LHPs), t ≥ 0,89, lo que implica que A solo pueda ser ocupado por Cs, MA o FA.
Las LHPs que se encuentran en los límites de este rango, p.ej: FAPbI 3 (t=1) y
CsPbI 3 (t=0,8), se transforman con facilidad en otras fases fotoinacti vas a
temperatura ambiente, conocidas como fases amarillas. 36

El factor octaédrico (μ) permite estimar la estabilidad de los octaedros BX 6

y se define como:

𝑟𝐵
μ=
𝑟𝑋

donde r B y r X son los radios iónicos de B y X, respectivamente. El rango de

estabilidad se encuentra entre 0,4 y 0,89.

El factor de tolerancia (t) junto con el factor octaédrico (μ) permiten

predecir si una determinada combinación de iones puede adoptar la estructura
perovskita 3D y, por tanto, constituye una herramienta clave para predecir y
diseñar nuevos materiales de perovskita (Figura 5).

43
 Capítulo 1. Introducción

Figura 5. Mapa que determina la región en que la estructura perovskita se forma

(puntos en azul), delimitada por el valor del factor octaédrico situado entre
0,4 – 0,89 y el factor de tolerancia, entre 0,8 y 1. Imagen reproducida de
Chem. Sci., 2016,7, 4548-4556

1. 2. 3 C om po si ci ó n y pr op i ed ade s ópti c as

Como ya se ha mencionado, las perovskitas de haluros plomo adoptan la

fórmula general APbX 3 , donde A es un catión monovalente y puede ser
inorgánico, como el Cs + , u orgánico como el metilamonio (MA, CH 3 NH 3 + ) o
formamidinio (CH(NH 2 ) 2 + , FA). B está ocupado por Pb +2 y X es un halógeno (Cl - ,
Br - o I - ).

En función de la naturaleza del catión, se puede distinguir entre

perovskitas puramente inorgánicas o híbridas orgánico-inorgánicas. Entre ellas,
las puramente inorgánicas se caracterizan por una mayor estabilidad frente a
temperaturas elevadas. 42

La preocupación por la toxicidad del Pb ha llevado a buscar sustitutos que

ocupen el sitio B, como otros elementos del grupo 14 (Sn, Ge), elementos del
grupo 15 (Bi, Sb) o tierras raras (Yb, Eu). 43

Los nanocristales de perovskita de LHPs reúnen propiedades fotofísicas de

especial interés, ya que combinan las propiedades optoelectrónicas de
perovskita en bulk junto con efectos de confinamiento cuántico en la
44
 Capítulo 1. Introducción

nanoescala. Entre ellas: amplio espectro de absorción, banda de emisión

estrecha, posibilidad de modular el bandgap en función de la composición y el
tamaño del nanocristal, 21 alto coeficiente de absorción, PLQY cercano a la
unidad y posibilidad de presentar fenómenos de emisión upconversion,
pudiendo convertir energía infrarroja en visible.

Una de las mayores ventajas de estos materiales es la facilidad de modular

sus propiedades ópticas en función de la composición, especialmente la del
haluro. Por ejemplo, Protesescu et al demostraron cómo en función de las sales
precursoras de PbX 2 es posible sintetizar CsPbX 3 cuya emisión cubre el espectro
visible (400-700), a partir de composiciones puras de CsPbCl 3 (λ em 410 nm),
CsPbBr 3 (λ em 512 nm) y CsPbI 3 (λ em 685 nm) y mixtas (X = Cl/Br y Br/I), cuya
emisión adquiere los valores intermedios del espectro en función de los ratios
de las sales precursoras (Figura 6a). 21 Los grupos de Manna y Kovalenko
demostraron al mismo tiempo que la composición del haluro también puede
modularse postsintéticamente de Br → Cl o Br → I (y viceversa) a partir de
reacciones de intercambio aniónico añadiendo una fuente de aniones ( PbX 2 ,
OAmX…) (Figura 6b). 44,45

Figura 6. (a) Comparación de los espectros de absorción y emisión de los NCs de

CsPbX 3 en función de su composición (X = Cl, Br, I y de las composiciones
mixtas de Cl/Br y Br/I). (b) Modulación del espectro de emisión a partir de
reacciones de intercambio aniónico de los NCs de CsPbBr 3 previamente
sintetizados. Imágenes reproducidas de (a) Nano Letters, 2015, 15(6), 3692–
3696 y (b) Nano Lett. 2015, 15, 8, 5635-5640

45
 Capítulo 1. Introducción

Otra de las ventajas de este material es la tolerancia a los defectos, lo que

implica que es relativamente sencillo obtener altos valores de PLQY. La
estructura perovskita tiene una baja densidad de defectos estructurales de alta
energía y aquellos de baja energía (vacantes) crean estados electrónicos
superficiales localizados en las bandas de valencia o de conducción. Esto implica
que son benignos y por tanto la eficiencia de emisión no se ve afectada de forma
significativa. Por el contrario, en los QDs tradicionales, las trampas se localizan
en el bandgap, lo que induce procesos de recombinación no radiativa que
producen una pérdida de la eficiencia de fotoluminiscencia, haciendo necesario
recurrir a una etapa adicional de pasivación para incrementar el valor de PLQY. 27

Además de las ventajas mencionadas, una de sus propiedades más

atractivas radica en la no linealidad de su óptica. Es decir, en la emisión
upconversion, donde la absorción simultánea de hasta cinco fotones de una
fuente de luz infrarroja produce la emisión de un fotón de mayor energía. 23,24
El elevado grado de absorción no lineal ofrece ventajas significativas, ya que
permite eliminar autofluorescencia de fondo de las muestras biológicas, mejora
de la resolución de la imagen y, reduce el daño biológico de la muestra, al
requerir irradiaciones menos energéticas que tienen alta penetración en los
tejidos.

1. 2. 4 M é tod os de s í nte si s de nano cr is tal es de

p er o vsk i ta

Existe una gran variedad de métodos de síntesis de nanocristales de

perovskita (PNCs). En función del material de partida pueden clasificarse en
métodos top-down o bottom-up. La Figura 7 ilustra algunos ejemplos de síntesis
top-down y bottom-up.

Los métodos top-down son aquellos en los que los NCs se obtienen a partir
de perovskita en bulk empleando métodos mecánicos como por ejemplo, la
utilización de un molino de bolas, 46,47 ultrasonidos, 48,49 o métodos
fotoinducidos, como la ablación láser. 50,51 Estas técnicas implican la
fragmentación y reducción de tamaño de los cristales hasta alcanzar
dimensiones nanométricas. Por lo general, son estrategias que permiten la
producción a gran escala, pueden llevarse a cabo en condiciones ambientales y
son más sostenibles, ya que reducen el consumo de disolventes orgánicos. Sin
embargo, generalmente dan lugar a una población polidispersa de NCs.

46
 Capítulo 1. Introducción

Figura 7. Clasificación de los métodos de síntesis de NCs coloidales de LHP. (a) Top-
down, cuando el material de partida son macro- o microcristales que
someten a disrupción mecánica (a1) molino de bolas, o fotoinducida (a2)
ablación láser. (b) Bottom-up, cuando se parte de los precursores sintéticos
(sales y ligandos). Los métodos bottom-up más representativos son (b1) hot-
injection, y (b2) LARP. Imágenes de TEM reproducidas de (a1) ACS Appl.
Nano Mater. 2018, 1, 3, 1300–1308, (a2) Chem Phys Chem, 2017, 8,9, 1047 –
1054, (b1) Nano Letters, 2015, 15(6), 3692–3696, (b2) Advanced Functional
Materials, 2016, 26, 15, 2435–2445

En los métodos bottom-up, los NCs se obtienen a partir de sus precursores

sintéticos, entre los que se incluyen la fuente de iones (A + , Pb +2 y X - ) junto con
otras moléculas estabilizantes o ligandos que permiten dirigir el crecimiento del
nanocristal para que se produzca de forma confinada. La principal ventaja de los
métodos bottom-up es que tienen un control más preciso sobre el tamaño y
morfología del nanocristal. Como desventaja, cabe destacar que son procesos
más difíciles de escalar y requieren un mayor consumo de disolventes orgánicos.
Algunos ejemplos son la microemulsión inversa, la síntesis de inyección en
caliente (hot-injection) y la reprecipitación asistida por ligando (LARP, ligand-
assisted reprecipitation).

47
 Capítulo 1. Introducción

⎯ M i c r o e m u l s i ó n i n v er s a

La microemulsión inversa fue la metodología con la cual Schmidt et al

demostraron en 2014, la primera síntesis coloidal de nanopartículas de LHPs,
concretamente de MAPbBr 3 . 20

En ella, las sales precursoras (MABr y PbBr 2 ) se disuelven previamente en

dimetilformamida (DMF) y posteriormente se añaden a una mezcla de los
ligandos bromuro de octilamonio (OABr) y ácido oleico (OA) en octadeceno
(ODE). La adición de acetona produce la precipitación de los NC s, los cuales
posteriormente pueden dispersarse en disolventes apolares como el tolueno,
manteniendo una estabilidad coloidal de 3 meses (Figura 8a).

Figura 8. (a) Síntesis coloidal de MAPbBr 3 mediante la metodología de

microemulsión inversa. Caracterización por T EM de las (b) NPs esféricas y
de las (c) NPLs. Imágenes reproducidas de (a y b) J. Am. Chem. Soc. 2014,
136, 3, 850–853 y (c) Nanoscale, 2022,14, 1160 -1164

En un principio, las NPs de MAPbBr 3 se caracterizaron por tener morfología

esférica, un tamaño de 6 nm y un PLQY del 20% (Figura 8b). Poco después,
González-Carrero et al, publicaron un segundo trabajo donde optimizaron la
proporción de los precursores sintéticos y obtuvieron una población mixta de
nanopartículas esféricas y nanoplaquetas (NPLs), con un PLQY del 83%. 52

Finalmente, en su trabajo más reciente, Rosa-Pardo et al resolvieron

algunas de las cuestiones sobre las que se ha debatido durante estos últimos
años. 53 En primer lugar, concluyeron que la metodología de microemulsión
reversa genera NPLs (Figura 8c), cuyo valor de PLQY asciende hasta el 93% tras
mejorar el proceso de purificación. En segundo lugar, aclararon que las NPs
esféricas observadas en los trabajos anteriores son resultado del proceso de
degradación de las NPLs de MAPbBr 3 causado por la exposición al haz de
electrones durante la caracterización del material por TEM. Según Sichert et al,
las NPs esféricas se componen de Pb o PbBr 2 . 54
48
 Capítulo 1. Introducción

⎯ Hot-injection

La metodología de inyección en caliente o hot-injection fue desarrollada

por Protesescu et al en 2015, 21 basándose en la metodología empleada
tradicionalmente para obtener QDs de CdSe.

El método consiste en la obtención de NCs de CsPbX 3 coloidales por medio

de la inyección rápida a alta temperatura (140-200 °C) y bajo atmósfera inerte
de oleato de cesio (Cs-OA) en una disolución que contiene la sal de plomo (PbX 2 )
en presencia de los ligandos ácido oleico (OA) y oleilamina (OAm) en octadeceno
(ODE). En el momento de la inyección, se produce rápidamente la nucleación y
crecimiento de los NCs.

Los NCs obtenidos por hot-injection se caracterizan por tener morfología

cúbica y un tamaño que puede ajustarse de 4 a 15 nm en función de la Tª de
inyección. Generalmente, el tamaño disminuye al aplicar temperaturas más
bajas, aunque cuando es inferior a 130 °C, se obtienen nanoestructuras 2D
conocidas como nanoplaquetas (NPLs), cuya emisión se d esplaza hacia el azul. 57

La emisión de los NCs es estrecha, con fwhm de 12-42 nm y altos valores

de PLQY (50-90%) para las composiciones de CsPbBr 3 y CsPbI 3 . 44,55,56 Sin
embargo, los NCs de CsPbCl 3 presentan un PLQY relativamente bajo (< 5%). 57–59
Esto se debe al pequeño tamaño del anión de Cl, que resulta en la reducción de
la distancia interplanar y distorsión de la estructura del cristal y a la presencia
de defectos que inducen recombinación no radiativa, lo que disminuye la
eficiencia de emisión de fluorescencia.

Esta metodología ha tenido un gran impacto. Actualmente cuenta con más

de 6.000 citas y permite sintetizar otras nanoestructuras con tamaño y
morfología uniforme, entre ellas: nanocables, nanoplaquetas, quantum dots y
nanorods.

⎯ R e p r e c i p i t a c i ón a s i s t i d a p o r l i g a n d o ( L A R P )

El método LARP también permite obtener NCs de CsPbX 3 de forma más

económica, sencilla y fácil de escalar, donde la cristalización se desencadena al
reducir la solubilidad de las sales en el medio de reacción. 60

Para ello, inicialmente las sales precursoras (CsBr y PbX 2 ) y los ligandos
(OA/OAm) se mezclan en un disolvente donde estos componentes presentan
una buena solubilidad (p.ej: DMF o DMSO). Cuando esta disolución se añade a

49
 Capítulo 1. Introducción

un disolvente donde son poco solubles, también conocido como antidisolvente

(p.ej: tolueno), precipitan y cristalizan. Los ligandos (ácido oleico y oleilamina)
controlan el tamaño de los cristales y facilitan su dispersión.

A diferencia del método de hot-injection, esta reacción ocurre a

temperatura y atmósfera ambiental. Los NCs se caracterizan por espectros de
emisión estrechos, con fwhm de 18-35 nm y valores de PLQY generalmente altos
para la emisión verde de CsPbBr 3 (95%) y las composiciones mixtas de Cl/Br
(70%) y Br/I (80%). De la misma forma que con el método hot-injection, se
registran valores bajos de PLQY para la composición de CsPbCl 3 (10%).

Aunque el método LARP está bien establecido para la obtención de

nanocubos, a menudo su población puede incluir otras nanoestructuras (NPLs y
nanocables). Mientras que el método hot-injection ofrece mejor control de la
forma y distribución de los NCs. 61

En esta tesis, cuyo objetivo principal es obtener partículas uniformes de

pequeño tamaño para su utilización como marcadores en sistemas analíticos,
biosensado o bioimagen, se recurre a la metodología hot-injection, ya que es la
más extendida para obtener NCs monodispersos de forma reproducible y con
una morfología controlada.

1. 2. 5 E s tr ate gi as d e e s tab iliz aci ó n

La principal limitación de estos materiales es la baja estabilidad que

presentan frente a factores ambientales (humedad, oxidación, luz y alta
temperatura), lo cual dificulta el desarrollo de sus aplicaciones. Por ello,
múltiples estrategias se han centrado en solventar este problema por medio de
la pasivación de su superficie con ligandos alternativos a los utilizados en la
etapa sintética o mediante recubrimientos basados en sílice o poliméricos para
dotarlos de una barrera física que los proteja frente a factores externos, de
modo que sea posible desarrollar sus aplicaciones.

50
 Capítulo 1. Introducción

 Modificación de los ligandos de superficie

Los ligandos juegan un papel esencial en la preparación de nanocristales

de perovskita, ya que proporcionan estabilidad estructural y col oidal. Son
necesarios para solubilizar las sales, controlar el tamaño del nanocristal, pasivar
su superficie y prevenir que los NCs se aglomeren entre sí.

Para la síntesis de los NCs de perovskita, generalmente se emplean

ligandos orgánicos de cadena larga, como la oleilamina (OAm) y el ácido oleico
(OA). Existen múltiples mecanismos que explican cómo se unen y estabilizan la
superficie de los NCs (Figura 9). La amina en su forma protonada (oleilamonio)
puede unirse a la superficie del NC ocupando las vacan tes de A o uniéndose a
los aniones X (por interacción electrostática o formando puentes de hidrógeno).
Mientras que el oleato puede ocupar las vacantes de X o unirse a los cationes A
por interacción electrostática. 27,62

Figura 9. Mecanismos de unión de los ligandos convencionales (ácido oleico y

oleilamina) a la superficie de los NCs de APbX 3 . (i) La oleilamina en su forma
protonada (oleilamonio) se une a los haluros (X - ) por interacción
electrostática o formando puentes de hidróge no. (ii) Los iones de oleato
no se unen a la superficie, sino que neutralizan la carga de los ligandos de
oleilamonio unidos a la superficie. (iii) El oleato ocupa las vacantes de las
posiciones de X de la superficie. (iv) El oleato y los iones de oleilamo nio
interaccionan electrostáticamente con los iones de A + y X - ,
respectivamente. (v) El oleilamonio ocupa las vacantes de A y los iones de
oleato interaccionan con A + . Imagen reproducida de ACS Energy Lett.
2023, 8, 2, 1152–1191

Sin embargo, la labilidad de su química de superficies, favorecida por la

reacción de neutralización entre ambos ligandos, resulta en la pérdida de los
mismos, favoreciendo la coalescencia de los NCs y/o la degradación causada por
agentes externos, lo que conlleva a la pérdida de su estabilidad estructural y
propiedades ópticas.
51
 Capítulo 1. Introducción

Una estrategia para mejorar la estabilidad de los NCs de perovskita

consiste en sustituir estos ligandos por otros que proporcionen mayor
estabilidad, bien por efectos estéricos o por mayor estabilidad del en lace. A
continuación, se muestran algunos ejemplos descritos en la bibliografía. La
Tabla 2 resume los resultados.

Tabla 2. NCs de LHP estabilizados mediante reemplazo de ligando

Ligando NCs Tamaño PLQY Estabilidad en Aplicación Ref.
(nm) (%) agua
a APTES MAPbBr 3 2,5 - 100 2 - 55 N.D. N.D. 63

b PFOTES CsPbBr 3 20-100 80 8 días Inmunotinción 64

c TDPA CsPbBr 3 5 68 5h LEDs 65

d OPA CsPbBr 3 11 90 N.D. LEDs 66

e DBSA CsPbBr 3 8 90 N.D. N.D. 67

f Sulfobetaína CsPbBr 3 15 80 N.D. N.D. 68

g TOP/TBP/DPP CsPbBr 3 9 75 - 83 2 días N.D. 69

h TOPO CsPbBr 3 11,2 N.D. N.D. N.D. 70

APTES: 3-aminopropiltrietoxisilano · DBSA: ácido dodecilbenceno sulfónico · DPP: difenilfosfina ·

PFOTES: perfluorooctiltrietoxisilano · TDPA: ácido tetradecilfosfónico · TBP: tributilfosfina · TOP:
trioctilfosfina · TOPO: óxido de trioctilfosfina

a) Sustitución de uno o ambos ligandos por:

o Ligandos ramificados, como el 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES) o

silsesquioxanos oligoméricos poliédricos con terminación de grupo amino
(NH 2 -POSS). 63 Estos permiten sintetizar NCs con tamaños más pequeños
(< 5 nm) (Figura 10a) y, por efecto estérico, restringen el acceso de
moléculas de disolventes polares a la superficie del NC, principalmente
de isopropanol y en menor medida de moléculas más pequeñas como
etanol o metanol.
o Agentes fluorocarbonados, como el perfluorooctiltrietoxisilano
(PFOTES), 64 se han utilizado en combinación con la OAm para sintetizar
NCs directamente resistentes en agua. El PFOTES posee una cadena
fluorocarbonada que interacciona hidrofóbicamente con las cadenas de
la OAm, contribuyendo a la estabilización del NC. Por otro lado, las
cabezas polares (Si-OH) facilitan su dispersión en agua. Aunque la
población de NCs es polidispersa (20-100 nm), mantienen su
fluorescencia en agua 8 días (Figura 10b).

52
 Capítulo 1. Introducción

o Ácidos fosfónicos (ácido tetradecilfosfónico, ácido octilfosfónico) 65,66,71 y

ácidos sulfónicos (ácido dodecilbenceno sulfónico) 67 ambos con cadenas
apolares largas (Figura 10c-e). Haciendo uso de esta estrategia, los NCs
resisten a varios ciclos de purificación con disolventes orgánicos polares
y pueden alcanzar una larga estabilidad coloidal (5 meses).
o Moléculas zwitteriónicas (sulfobetaínas, fosfocolinas, ɣ-aminoácidos),
permiten sustituir directamente a ambos ligandos, ya que pueden
coordinarse simultáneamente a los cationes y aniones de la superficie. 68
Son menos lábiles, ya que no se produce la reacción de neutr alización
como con la pareja convencional de ligandos. Los NCs resultantes son
capaces de retener el 70-90% de su PLQY hasta 50 días después de haber
sido lavados con disolventes orgánicos polares durante la etapa de
purificación (Figura 10f).

b) Incorporación de otros ligandos al sistema de reacción, como fosfinas

(trioctilfosfina, tributilfosfina o difenilfosfina) u óxido de trioctilfosfina
(TOPO), que confieren estabilidad en presencia de etanol (Figura 10g-
h). 69,70,72

Figura 10. Imágenes de TEM de los NCs de LHPs estabilizados mediante el reemplazo
de ligandos. (a) Angewandte. 2016, 70005, 9010–9014, (b) ACS Appl. Mater.
Interfaces 2018, 10, 50, 43915–43922, (c) Nanoscale, 2017,9, 15286 -15290,
(d) ACS Appl. Mater. Interfaces 2018, 10, 4, 3784 –3792, (e) Advanced
Materials. 2019, 3130, 1–8, (f) ACS Energy Lett. 2018, 3, 3, 641–646, (g) Nano
Research. 2019, 785–789, (h) Langmuir 2017, 33, 44, 12689–12696

53
 Capítulo 1. Introducción

En general, la modificación de los ligandos de superficie contribuye a

mejorar la estabilidad coloidal de los NCs durante su almacenaje y a resistir
frente a algunos disolventes polares. Sin embargo, las aplicaciones que se busca
desarrollar en esta tesis implican que las partículas puedan dispersarse
completamente en agua y en tampones salinos sin perder su estructura, por lo
que es necesario recurrir a estrategias que proporcionen una barrera física que
pueda asegurar una mayor estabilidad de las propiedades ópticas de los NCs de
perovskita.

 Recubrimientos basados en sílice

La sílice (SiO 2 ) es un material inorgánico, transparente, biocompatible, con

una química ampliamente estudiada y fácil de funcionalizar. Se utiliza co n
frecuencia como recubrimiento de otros nanomateriales para mejorar su
estabilidad estructural frente a agentes externos (humedad, oxidación…).

La estabilización de los NCs de perovskita en una matriz de sílice puede

llevarse a cabo mediante dos estrategias: crecimiento de una envoltura de sílice
mediante el proceso sol-gel o cristalización in situ en materiales silíceos
porosos.

I. Crecimiento de una envoltura de SiO 2

Las nanoesferas de sílice se sintetizan generalmente por el método de

Stöber, 73 un proceso sol-gel que implica la hidrólisis y condensación de un
alcoxisilano como fuente precursora de sílice (p.ej: tetraetilortosilicato, TEOS).
La hidrólisis del grupo alcoxisilano (-Si-OR) (ec. 1), genera grupos silanol (-Si-
OH), que condensan formando un enlace -Si-O-Si- liberando alcohol (ec. 2) o
agua (ec. 3).

(1) -SiOC 2 H 5 + H 2 O → -SiOH + C 2 H 5 OH

(2) -SiOH + -SiOC 2 H 5 → -SiOSi- + C 2 H 5 OH
(3) -SiOH + -SiOH → -SiOSi- + H 2 O

La principal limitación a la hora de crecer una capa de sílice alrededor de

los NCs de perovskita es la rápida degradación que estos sufren en las
condiciones de reacción del método de Stöber, lo que conlleva a la pérdida de
su integridad estructural y capacidad de emisión.

54
 Capítulo 1. Introducción

Las estrategias que han logrado adaptar el proceso sol-gel para estabilizar
a los NCs de LHP mediante un recubrimiento de sílice se dividen en tres
categorías, atendiendo al material de partida: (A) mezcla de las sales CsBr y
PbBr 2 , (B) NCs de CsPbBr 3 o (C) NCs de Cs 4 PbBr 6 (Figura 11).

Figura 11. Crecimiento de una envoltura de SiO 2 a partir de (a) las sales precursoras,
(b) los NCs de CsPbBr 3 o (c) Cs 4 PbBr 6

A. Adaptación de la metodología LARP

Esta aproximación consiste en sincronizar el método sintético LARP con el

proceso sol-gel de crecimiento de la envoltura de sílice. En primer lugar, las sales
precursoras (CsBr y PbBr 2 ) y los ligandos (OA/OAm), se disuelven en DMF o
DMSO. Posteriormente, esta disolución se inyecta rápidamente y b ajo agitación
vigorosa en otra disolución que contiene el alcoxisilano en tolueno y se deja
incubar hasta completar el proceso de hidrólisis y condensación de los grupos
silanoles.

El ejemplo más representativo de esta estrategia es el trabajo de Zhong et

al (Figura 12), donde obtienen NPs monodispersas core-shell de CsPbBr 3 @SiO 2
con un solo núcleo de 10,5 nm y una capa de sílice de un grosor de 7,7 nm. 74 En
su metodología utilizan TMOS como fuente precursora de sílice en presencia de
NH 4 OH como catalizador básico de la reacción. Las NPs resultantes alcanzan un
valor de PLQY alto (90%) en tolueno y muestran mayor estabilidad en agua
frente a los NCs sin encapsular (al menos durante los primeros 40 min).

55
 Capítulo 1. Introducción

Figura 12. (a) Mecanismo de síntesis de NPs core-shell de CsPbBr 3 @SiO 2 basado en la
adaptación del método LARP de Zhong et al. La disolución de DMF que
contiene las sales precursoras (CsBr, PbBr 2 ), los ligandos (OA/OAm) y el
amoniaco, se inyecta en una disolución que contiene tolueno y TMOS. La
reacción transcurre a 30 °C en condiciones de agitación durante un
tiempo de incubación de 2 h. (b) Caracterización por TEM de las NPs core-
shell de CsPbBr 3 @SiO 2 (18,2 nm) y de los NCs de CsPbBr 3 (17,2 nm).
Seguimiento de la fluorescencia durante los primeros 40 minutos en agua
aplicando condiciones de ultrasonidos. Imágenes reproducidas de ACS
Nano 2018, 12, 8, 8579-8587

También hay otros trabajos donde el recubrimiento de sílice se genera a

partir una fuente alternativa de sílice, por ejemplo silanos aminados como el (3-
aminopropil)trimetoxisilano (APTMS), 75 o el (3-aminopropil)trietoxisilano
(APTES). 76 A la vez que se unen a la superficie de los NCs, proporcionan grupos
silanoles libres tras hidrolizarse. Sin embargo, como resultado se obtienen
compuestos de gran tamaño.

56
 Capítulo 1. Introducción

Por ejemplo, Xu et al sustituyeron el TMOS por APTES y produjeron NPs de

sílice con un tamaño de 200 nm, en cuyo interior coexisten NCs de CsPbBr 3 y de
Cs 4 PbBr 3 y alcanzan un PLQY del 48%. 76 Estas NPs pueden dispersarse en PDMS
y utilizarse como tintas fluorescentes que resisten temperaturas hasta 120 °C.
Los resultados de este trabajo se incluyen en la Figura 13.

Figura 13. (a) Mecanismo de síntesis de compuestos de CsPbBr 3 /Cs 4 PbBr 3 @SiO 2
basado en la adaptación del método LARP de Xu et al. Las sales
precursoras (CsBr, PbBr 2 ) disueltas en DMSO se inyectan en una disolución
de tolueno que contiene los ligandos (OA/OAm) y APTES. La reacción
transcurre en condiciones de agitación y temperatura ambiente durante
12 h. (b) TEM de una partícula de CsPbBr 3 /Cs 4 PbBr 3 @SiO 2 (~200 nm). (c) XRD
que confirma la coexistencia de NCs de CsPbBr 3 y Cs 4 PbBr 3 en las NPs de
SiO 2 . (d) Resistencia térmica de 30-120 °C) de la tinta fluorescente.
Imágenes reproducidas de ACS Appl. Mater. Interfaces 2017, 9, 31, 26556 –
26564

57
 Capítulo 1. Introducción

B. Encapsulación de los NCs de CsPbBr 3

En este caso, el proceso sol-gel se aplica directamente sobre los NCs

CsPbBr 3 en condiciones de reacción más suaves para evitar su degradación. Estas
condiciones contemplan:

a) La sustitución del medio de reacción (mezcla agua/etanol) por un

disolvente compatible con los NCs (p.ej: tolueno) en presencia de un
volumen mínimo de agua, 77–79 o bajo un entorno húmedo (H.R. 40-
75%), 80–82 que permita inducir la hidrólisis y condensación del
alcoxisilano.

b) La selección de una fuente precursora de sílice alternativa al

tetraetilortosilicato (TEOS), por ejemplo, tetrametilortosilicato (TMOS)
que, al hidrolizar más rápido, permite reducir el tiempo de exposición de
los NCs frente al daño causado en contacto con el agua. 77,80

Figura 14. (a) Esquema de la metodología de síntesis de NPs MAPbBr3@SiO2 descrita

por Huang et al. (b) TEM de NPs MAPbBr3@SiO2 preparadas con distintos
tiempos de reacción: 1 h (10 nm), 4 h (45 nm), 12 h (150 nm) y 36 h (450 nm).
Imágenes reproducidas de J. Am. Chem. Soc. 2016, 138, 18, 5749–5752

Un ejemplo es el trabajo de Huang et al. 80 En su metodología, los NCs de

MAPbBr 3 se sintetizan previamente por la metodología LARP y, una vez
dispersos en tolueno, se tratan con tetrametilortosilicato (TMOS). El tolueno d e
grado analítico, al contener trazas de agua, permite que se lleve a cabo la

58
 Capítulo 1. Introducción

hidrólisis del TMOS. La reacción transcurre a una temperatura de 25 °C, bajo una
humedad relativa del 60% y distintos tiempos de incubación (1, 4, 12 y 36 h),
con los que consiguen modular el tamaño final de la partícula de sílice de 10 a
450 nm. Los resultados de este trabajo se incluyen en la Figura 14.

c) La funcionalización de la superficie de los NCs con silanos aminados

capaces de unirse a la superficie de los NCs a través del grupo amino y, al
mismo tiempo, proporcionar la fuente precursora de sílice. Como por
ejemplo el (3-mercaptopropil)trimetoxisilano (MPTMS), 78 o el 3-
aminopropiltrietoxisilano (APTES). 79,81–83

En la metodología de Li et al los NCs de CsPbBr 3 se producen por hot-

injection y posteriormente se silanizan añadiendo MPTMS, el cual se une como
ligando a la superficie de los NCs, mediante la formación del enlace de
coordinación S-Pb. 78 Tras un tiempo de incubación, se añade de nuevo MPTMS
y un volumen mínimo de agua, lo que produce que se inicie lenta mente el
proceso de hidrólisis y condensación. La reacción se produce a 45 °C, durante
un tiempo de incubación de 32 h. Las NPs resultantes alcanzan un tamaño de
170 nm, exhiben un PLQY alto (78%) y mantienen el 60% de la fluorescencia
inicial durante 20 días en agua. Los resultados de este trabajo se muestran en la
Figura 15.

Figura 15. (a) Esquema de la metodología de síntesis de partículas de CsPbBr 3 @SiO 2

descrita por Li et al. (b) TEM de las partículas de CsPbBr 3 @SiO 2 (170 nm). (c)
Estabilidad óptica de las NPs dispersas en agua durante 20 días. Imágenes
reproducidas de Nat Commun. 2020 11, 1192
59
 Capítulo 1. Introducción

Por otro lado, en la metodología de Song et al se sustituye OAm por APTES

durante la síntesis de NCs de CsPbBr 3 por hot-injection. 79 Posteriormente, a los
NCs silanizados se le añade un volumen mínimo de agua y tras un tiempo de
incubación de 30 min se generan NPs core-shell de CsPbBr 3 @SiO 2 de tamaño
nanométrico (~ 20 nm) que pueden utilizarse como marcador fluorescente en
bioimagen de cultivos celulares, con tiempos de incubación de 2 a 24 h. Los
resultados de este trabajo se incluyen en la Figura 16.

Figura 16. (a) Esquema de la metodología de síntesis de las NPs core-shell

CsPbBr 3 @SiO 2 producidas por Song et al. Los NCs de CsPbBr 3 silanizados se
producen mediante hot-injection, sustituyendo la OAm por APTES.
Posteriormente, se añade un volumen mínimo de agua y tras un tiempo de
incubación de 30 min se generan las NPs core-shell CsPbBr 3 @SiO 2 (20 nm).
(b) Imagen de microscopía confocal que muestra la localización de las
células tumorales CT26 (en azul se muestran los núcleos teñidos con DAPI)
y las NPs core-shell (en verde) tras un tiempo de incubación de 4 h.
Imágenes reproducidas de Nano Res. 2020, 13, 795 –801

60
 Capítulo 1. Introducción

C. Transformación de fase combinada con la metodología sol -gel

Esta alternativa consiste en aprovechar los cambios de fase de los NCs en

combinación con la metodología sol-gel. De modo que, simultáneamente a la
formación del cristal, tiene lugar el crecimiento de la sílice, evitando de este
modo que se degraden los NCs.

El ejemplo más extendido es la utilización de NCs de Cs 4 PbBr 6 como

material precursor. Estos se caracterizan por tener una estructura de dimensión
0 (0D), donde los octaedros de PbX 6 -4 están completamente separados los unos
de los otros. 84

Estos NCs carecen de propiedades luminiscentes. Sin embargo, son capaces

de adquirir la estructura tridimensional (3D) en determinadas condiciones y así
recuperar las propiedades ópticas propias de los NCs de CsPbBr 3 .

Las condiciones que promueven la transformación de NCs Cs 4 PbBr 6 a

CsPbBr 3 (Figura 17), consisten básicamente en producir un exceso PbBr 2 , un
déficit de cesio en la estructura del NC o un desequilibrio en la relación de los
ligandos de la superficie. Entre ellas:

Figura 17. Condiciones que desencadenan la transformación de los NCs de Cs 4 PbBr 6

a los NCs de CsPbBr 3

61
 Capítulo 1. Introducción

a) La inserción de PbBr 2 en la estructura se produce cuando el entorno se

enriquece con un exceso de la sal de plomo, lo que genera la
transformación de Cs 4 PbBr 6 en CsPbBr 3 . 84 Los NCs resultantes exhiben un
PLQY bajo (26%) en comparación con los NCs sintetizados directamente,
lo que sugiere que durante esta transformación se generan defectos
estructurales.

b) La presencia de agua en un disolvente no polar desencadena el

desprendimiento de CsBr de la estructura Cs 4 PbBr 6 , convirtiéndose a la
fase cúbica. Esta transformación se produce debido a la alta solubilidad
del CsBr en agua, la naturaleza iónica del NC y alta difusión de los iones. 85
Los NCs de CsPbBr 3 resultantes presentan un PLQY del 75% y mayor
estabilidad a la humedad que los producidos por los métodos
convencionales.

c) La extracción química de CsBr también ocurre al reaccionar con

hexacianoferrato férrico de potasio, también conocido como azul de
Prusia. 86 Se trata de un pigmento artificial y un excelente absorbente de
iones Cs + . Aunque el azul de Prusia es poco soluble en disolventes
orgánicos, la extracción de CsBr puede producirse lentamente (24 h) en
la interfase entre ambos disolventes. Los NCs transformados no sufren
más cambios en presencia del colorante, manteniéndose estables incluso
3 días después.

d) El proceso térmico (en inglés, thermal annealing) promueve la extracción

física de CsBr de la estructura. 87 A partir de los 150 °C comienza a
formarse la fase cúbica, debido a la extracción de iones Cs + y Br - que
quedan acumulados en pequeños clusters junto con otros residuos
orgánicos. Esta transformación no es completa, ya que ambas fases llegan
a coexistir hasta los 350 °C. Excepto a partir de los 400 °C, donde ya solo
permanece la fase Cs 4 PbBr 6 , lo que indicaría la reinserción de CsBr o
extracción de PbBr 2 de la estructura CsPbBr 3 .

e) El exceso de ácido oleico desestabiliza la relación de los ligandos de

superficie del NC (OA/OAm), induciendo su conversión en CsPbBr 3
mediante un proceso de exfoliación y recristalización. 88 Esta
transformación puede revertirse añadiendo OAm hasta alcanzar de nuevo
la relación inicial. El mecanismo está controlado por el equilibrio ácido-
base Brønsted, de forma que pequeños cambios en la concentración de

62
 Capítulo 1. Introducción

ambas especies, desencadena la desestabilización de la superficie con el

consiguiente cambio en la estequiometría del NC.

f) La reacción de las unidades de anhídrido succínico del copolímero

poli(anhídrido maleico-alt-1-octadeceno) (PMAO) con las especies de
oleilamina, da lugar a ácido polisuccinámico. Este desplaza a los ligandos
de amina y oleato y acidifica el medio de reacción, desencadenando la
transformación de Cs 4 PbBr 6 a CsPbBr 3 . 89 Los NCs resultantes pueden
llegar a alcanzar un PLQY del 69% (si la transformación ocurre bajo
atmósfera inerte) y presentan estabilidad coloidal durante al menos un
mes.

De las transformaciones descritas, la más recurrente a la hora de

combinarla con el proceso sol-gel es la desencadenada en la interfase hexano-
agua. Hu et al. obtuvieron heteroestructuras Janus de CsPbX 3 (X = Cl/Br, Br, Br/I
and I) y SiO 2 , con un tamaño de unos 24 nm y un PLQY del 80% (Figura 18a). 90 El
seguimiento de la fluorescencia sobre esta interfase demostró una estabilidad
mejorada con respecto al control, alcanzando un total de 7 días.

Li et al. incorporaron un paso previo de silanización con tetrametil

ortosilicato (TMOS) parcialmente hidrolizado (PH-TMOS) para generar semillas
de silanización distribuidas por toda la superficie del NC precursor, logrando una
deposición simétrica de la capa de sílice y dando lugar a NPs de tipo core-shell
CsPbBr 3 @SiO 2 con un tamaño de 60 nm y PLQY de 65% (Figura 18b). 91 En este
caso, la prueba de estabilidad se realizó en presencia de un 10% de etanol,
demostrando cierta estabilidad (al menos durante 30 min), frente al control, que
decayó prácticamente al minuto.

Rossi et al. optaron por la transformación mediada por PMAO, aunque

utilizando solo el fragmento reactivo del polímero: el anhí drido maleico
(MANH). 92 Además de desencadenar la conversión, acidifica el medio de
reacción y, por tanto, contribuye a catalizar el crecimiento de la sílice. El
resultado fueron NPs CsPbBr 3 @SiO 2 con un tamaño de 17 nm y un PLQY de 1-4%
(Figura 18c). Sin embargo, esta envoltura resultó poco compacta, ya que la
fluorescencia desapareció a los 15 min en presencia de etanol. En un
tratamiento posterior de pasivación con PbBr 2 , el PLQY se incrementó hasta un
8% y, en combinación con una segunda etapa de crecimiento de la sílice, se
generó una capa más densa contribuyendo al sellado de los poros.

La Figura 18 resume las metodologías que combinan la transformación de

fase Cs 4 PbBr 6 en CsPbBr 3 con el proceso sol-gel para el crecimiento de una
envoltura de sílice.
63
 Capítulo 1. Introducción

Figura 18. Metodologías de estabilización de NCs de CsPbBr 3 por un recubrimiento de

sílice mediante la adaptación del proceso sol -gel aprovechando el
cambio de fase de los NCs de Cs 4 PbBr 6 . Imágenes de TEM reproducidas de
(a) J. Am. Chem. Soc. 2018, 140, 1, 406 -412. (b) Nanoscale, 2021, 13, 3860,
(c) Chem. Mater. 2022, 34, 1, 405–413

II. Cristalización in situ en materiales silíceos porosos

La cristalización in situ de NCs de perovskita en materiales porosos

constituye una estrategia alternativa para su estabilización. Estas matrices
cuentan con una estructura interna idónea que permite el crecimiento de los
nanocristales a partir de sus sales precursoras confinando su tamaño a las
dimensiones del poro. Además, al aislarlos del medio, la matriz previene su
degradación frente a factores ambientales como el oxígeno, la humedad o la
temperatura.

Entre los materiales porosos silíceos más utilizados para el crecimiento in

situ de NCs de perovskita se encuentran las zeolitas, la sílice mesoporosa y rocas
sedimentarias como la diatomita (Figura 19).

64
 Capítulo 1. Introducción

Figura 19. Materiales porosos basados en sílice utilizados para la estabilización de NCs
de CsPbBr 3

La metodología consiste en poner en contacto el material poroso con los

precursores de perovskita, en estado sólido o en disolución, y lograr que sus
iones difundan al interior a través de los poros. Posteriormente, bajo
determinadas condiciones de temperatura, tiene lugar la nucleación y
crecimiento de los NCs.

La Figura 20 ilustra las aproximaciones más frecuentes para el crecimiento

de NCs de LHP en materiales porosos. A continuación, se detalla en qué consiste
cada una de ellas:

⎯ Impregnación:

Consiste en empapar las partículas con un volumen mínimo de la disolución

que contiene las sales precursoras. Posteriormente, se aplican condiciones de
secado térmico que desencadenan la cristalización. Se trata de una de las
aproximaciones más rápidas y utilizadas para el crecimiento de NCs en sílice
mesoporosa. Dirin et al y Malgras et al fueron los primeros en aplicar esta
metodología para un amplio abanico de partículas de sílice mesoporosa con
dimensiones de diámetro de poro desde 2,5 hasta 50 nm. 93,94

65
 Capítulo 1. Introducción

⎯ Remojo:

El material poroso se sumerge en un volumen mayor de la disolución que

contiene las sales precursoras y se aplican condiciones de agitación o
ultrasonidos para facilitar su difusión a través de los poros. En este caso, el
tiempo de incubación puede ser de hasta varias horas, lo que permite maximizar
la adsorción de precursores en el interior del material. Posteriormente, se
somete a un proceso de secado para que tenga lugar la cristalización. Esta
aproximación se ha aplicado en zeolitas, 95 y en partículas de sílice
mesoporosa. 96

Figura 20. Metodologías para el crecimiento in situ de NCs de LHP en materiales

porosos: a) impregnación, b) remojo, c) inyección en c aliente y d)
calcinación

⎯ Inyección en caliente:

Se trata de una variante de la metodología de hot-injection. En un matraz

se añade el material poroso junto con una de las sales precursoras en
octadeceno. Posteriormente, bajo atmósfera inerte y alta tempera tura (120-
170 °C) se inyecta el ion precursor necesario para desencadenar la cristalización.
En el caso de las zeolitas, es la sal de plomo (PbX 2 ) la que se inyecta en último
lugar. 97,98 Mientras que en la sílice mesoporosa, 99 y en la diatomita, 100 se inyecta
el oleato de cesio. Finalmente, se atempera en baño de hielo para detener
rápidamente el crecimiento del cristal.

66
 Capítulo 1. Introducción

⎯ Calcinación:

Esta estrategia consiste en someter a una alta temperatura el material

poroso junto con las sales precursoras en estado sólido para que difundan a
través de los poros. Al eliminar la necesidad de utilizar disolventes orgánicos,
resulta en una alternativa simple, escalable y ecológica. En zeolitas se aplica una
temperatura de 650 °C. 101–103

A. Zeolitas

Las zeolitas son aluminosilicatos cristalinos microporosos (diámetro de

poro < 2 nm), compuestos por óxido de aluminio (Al 2 O 3 ) y sílice (SiO 2 ). Se utilizan
principalmente en la preparación de catalizadores en procesos relacionados con
la petroquímica, pero también sirven para el crecimiento in situ de NCs de
perovskita mediante la metodología de remojo, 95 inyección en caliente, 97,98 o
calcinación. 101–103

Los NCs de LHP que crecen en el interior de zeolitas se caracterizan por ser
resistentes a estrés térmico. 95,101 Además, al disponer de poros tan pequeños,
dota a los NCs de una excelente estabilidad a largo plazo en agua. 101,103

Han demostrado ser útiles como indicadores de NH 3 en aire, 98 humedad, 104

o temperatura, 103 e incluso como tintas fluorescentes con aplicación en medidas
anti-falsificación. 101–103

La Figura 21 recopila la caracterización por TEM de los materiales más

representativos de la estabilización de NCs de LHPs en zeolitas.

Figura 21. NCs de LHP estabilizados en zeolitas: a) MAPbX 3 @AIPO-5, b) CsPbBr 3 -Y, c)
CsPbBr 3 @LTA, d) CsPbBr 3 @HSZ ZSM-5, e) CsPbBr 3 @ZSM-5. Imágenes
reproducidas de (a) Angewandte Chemie. 2020, 59, 51, 23100 –23106, (b)
RSC Adv., 2021,11, 2866-2871, (c) Materials Today Physics, 2021, 18, 100374,
(d) NPG Asia Materials. 2022, 14, 87, (e) Chemical Engineering Journal, 2022,
437, 135290.

67
 Capítulo 1. Introducción

B. Sílice mesoporosa

La sílice mesoporosa está constituida por dióxido de silicio (SiO 2 ) en una

estructura tridimensional, donde los poros se ordenan en una de sus
dimensiones. Existe un amplio abanico de posibilidades en cuanto a su
morfología, dimensiones de poro o tamaño de partícula, y tiene la ventaja de
que están comercialmente disponibles.

El diámetro de poro es un factor importante porque influye en tamaño de

los nanocristales que crecen en su interior y, en función de ello, es posible
sintonizar el color de la emisión. Por otro lado, el tamaño de partícula puede
reducirse hasta los 100 nm, siendo ya más adecuado para su utilización en
biosensado o bioimagen.

Las estrategias que permiten crecer NCs de LHP en el interior de partículas

de sílice mesoporosa son: impregnación, 93,94 remojo, 96 inyección en caliente, 99
y calcinación. 105 Desgraciadamente, los compuestos resultantes son poco
estables en agua. Aun así, es posible utilizarlos en la fabricación de LEDs, 96,99,105
o en fotocatálisis. 106

Para poder explorar aplicaciones en disolventes polares es necesario

combinar la estrategia sintética con algún mecanismo que contribuya al sellado
de los poros. Las opciones que permiten estabilizar estos compuestos son las
siguientes:

⎯ Calcinación:

La aplicación de calor por encima de los 600 °C induce el colapso parcial de

la estructura mesoporosa, produciéndose el cierre de los poros y atrapamiento
de los nanocristales de LHP en su interior. 105 Sin embargo, las partículas
mesoporosas pierden su identidad individual y pasan a formar parte de
agregados de tamaño micrométrico.

Para prevenir la fusión de las partículas de sílice, una opción es añadir una
combinación de sales inorgánicas (KNO 3 , NaNO 3 y KBr) que contribuyen al
sellado de los poros a una temperatura de calcinación inferior (320 -
350 °C). 107,108 Otra opción consiste en utilizar K 2 CO 3 , seguido de un tratamiento
de calcinación a 600 °C. 109 Como resultado se obtienen partículas de 200 nm de
diámetro que se dispersan homogéneamente en agua y mantienen su
fluorescencia estable durante 150 días. Estas partículas han demostrado su
utilidad tanto en LEDs, 109 como en radioterapia. 110

68
 Capítulo 1. Introducción

⎯ Recubrimiento polimérico:

Tapizar las partículas con un polímero hidrófobo, como el PMMA, 111,112

ofrece una solución alternativa al problema de estabilidad que sufren los NCs
de LHP crecidos en el interior de partículas de sílice mesoporosa.

La Figura 22 recopila la caracterización por TEM de los materiales más

representativos de crecimiento y estabilización de NCs de LHP e n partículas de
sílice mesoporosas.

Figura 22. Panel I. NCs de LHP crecidos en el interior de sílice mesoporosa por (a -c)
impregnación, (d) remojo, (e) inyección en caliente. Panel II. NCs de LHP
estabilizados en meso-SiO 2 mediante (f) calcinación, (g-i) tratamiento
combinado con sales inorgánicas y calcinación, (j) recubrimiento
polimérico. Imágenes reproducidas de (a) Nano Lett. 2016, 16, 9, 5866 –
5874, (b) J. Am. Chem. Soc. 2016, 138, 42, 13874 –13881, (c) ACS Energy Lett.
2022, 7, 12, 4389–4397, (d) New J. Chem., 2020,44, 2980-2985, (e) Inorg.
Chem. Front., 2020,7, 2060-2071, (f) Nat Com. 2020, 11, 31 (g) ACS Energy
Lett. 2021, 6, 3, 900–907, (h) Advanced Energy Materials. 2022, 12, 38, (i)
ACS Energy Lett. 2023, 8, 4, 1795–1802 (j) Composites Part B: Engineering.
2022, 239, 109956

69
 Capítulo 1. Introducción

C. Diatomita

La diatomita es una roca sedimentaria silícea, formada por microfósiles de

diatomeas, las cuales son microalgas acuáticas unicelulares que secretan un
esqueleto silíceo. Presenta una morfología circular de ~ 17 µm de diámetro y
500 nm de grosor, y una estructura jerárquica de poros de 200 nm de diámetro,
por lo que entra dentro de la categoría de materiales macroporosos.

Hao et al crecieron NCs de CsPbBr 3 en el interior de los poros del material

y en su superficie (Figura 23) mediante la funcionalización previa de la diatomita
con ácido poliacrílico (PAA) como sitios activos de nucleación. 100 La prueba de
estabilidad en agua la realizaron en formato de película, logrando un incremento
de 100 h respecto al control.

Figura 23. NCs de CsPbBr 3 estabilizados en diatomita. (a) Estructura de la diatomita y

(b) detalle de la estructura cristalina en el interior de uno de los poros.
Imágenes reproducidas de Chemical Engineering Journal. 2021, 417,
128056

La Tabla 3 resume los resultados más representativos de la estabilización

de NCs de perovskita en materiales porosos.

70
 Capítulo 1. Introducción

Tabla 3. NCs de LHP estabilizados mediante su cristalización en materiales porosos

Material Composición Tamaño PLQY Estabilidad Aplicación Ref.
poroso (nm) (%) en agua

Zeolita | a MAPbBr 3 @AIPO-5 N.D. 18,2 14 días N.D. 95

Figura 21
b CsPbBr 3 @zeolita-Y N.D. N.D. 10 días N.D. 97

(µm)

c CsPbBr 3 @LTA N.D. 66 554 días Tintas 101

(µm)

d CsPbBr 3 @HSZ ZSM-5 N.D. 92,5 30 días Tintas 102

(µm)

e CsPbBr 3 @ZSM-5 N.D. 62 100 días Tintas, sensor 103

(µm) de Tª

Meso-SiO 2 | a APbBr 3 @meso-SiO 2 200-1000 50 N.D. N.D. 93

Figura 22
b MAPbBr x I 3−x @meso- N.D. 5,5 N.D. N.D. 94

SiO 2

c CsPbBr 3 @ meso-SiO 2 200 62 N.D. Fotocatálisis 106

d CsPb 1-x Mn x Br 3 @MCM- 100 N.D. N.D. LEDs 96

41

e CsPbBr 3 @meso-SiO 2 110 89 N.D. LEDs 99

f CsPbBr 3 @MCM-41 500-1000 71 50 días LEDs 105

g CsPbBr 3 @MCM-41 600 89 30 días LEDs 107

h CsPbBr 3 @MCM-41 100 77 N.D. LEDs 108

i CsPbBr 3 @ meso-SiO 2 200 87 150 días LEDs, 109,110

radioterapia

j CsPbBr 3 @ meso- 200 20 5 meses LEDs 111

SiO 2 @PMMA

Diatomita | a CsPbBr 3 @diatomita-g- D= 76,4 N.D. LEDs 100

Figura 23 PAA 17 µm

 Recubrimientos poliméricos

I. Micelas poliméricas

Las micelas poliméricas son estructuras que se forman como resultado del
proceso de autoensamblaje de polímeros anfifílicos en un disolvente selectivo.

Un polímero anfifílico dibloque está constituido por un bloque hidrofóbico

y un bloque hidrofílico y, junto con otras moléculas estabilizantes, es capaz de
71
 Capítulo 1. Introducción

organizarse para formar micelas, donde el dominio compatible con el disolvente

se expone hacia el exterior. En un disolvente polar, el bloque hidrofílico q ueda
en contacto con el disolvente, mientras que el bloque hidrofóbico conforma el
núcleo de la micela. Por el contrario, en un disolvente apolar, el dominio
hidrofóbico se expone hacia el exterior, dando lugar a lo que se conoce como
micela inversa.

Estas estructuras micelares proporcionan un núcleo idóneo donde atrapar

a los NCs de perovskita o confinar su crecimiento a partir de sus sales
precursoras, confiriéndoles una barrera de protección más estable que la que
ofrecen los ligandos de superficie convencionales (OA/OAm).

Las estrategias pueden agruparse en tres aproximaciones (Figura 24).

Figura 24. Estrategias de estabilización de NCs de LHP en micelas poliméricas: (a)

cristalización en micelas inversas a partir de la difusión de las sales
precursoras, (b) cristalización en micelas inversas mediante la adaptación
de la metodología LARP, (c) coprecipitación de los NCs previamente
sintetizados

72
 Capítulo 1. Introducción

⎯ Cristalización en micelas inversas a partir de la difusión de las sales

precursoras

Esta metodología contempla tres etapas. Inicialmente, tiene lugar la

formación de micelas inversas del copolímero anfifílico en tolueno.
Posteriormente, se añade la primera sal precursora (PbBr 2 ) que, dada su baja
solubilidad en este medio, difunde lentamente hasta impregnar el núcleo de la
micela. Finalmente, se añade la segunda sal precursora (CsBr) y, cuando ésta
alcanza el núcleo de la micela inversa, desencadena el proceso de cristalización
(Figura 24a). En función del polímero utilizado, es posible modular el tamaño
del NC. Hou et al y Hintermayr et al obtuvieron NCs de 6-27 nm con poliestireno-
bloque-poli(2-vinilpiridina) (PS-b-P2VP), 113,114 mientras que Pan et al alcanzaron
dimensiones de 50-60 nm con N-fenilaminopropil silsesquioxanos oligoméricos
poliédricos, polimetilmetacrilato-bloque- poli(2-(dimetilamino)etil metacrilato
(ap-POSS-PMMA-b-PDMAEMA) (Figura 25a-c). 115

La principal desventaja de esta estrategia es que se trata de un proceso

lento, debido a la baja solubilidad de las sales precursoras en el medio de
reacción, pudiendo alcanzar tiempos de incubación de hasta 2 se manas.

⎯ Cristalización en micelas inversas mediante adaptación de la

metodología LARP

Se trata de un proceso más rápido, ya que la mezcla de las sales

precursoras se prepara previamente en un disolvente donde su solubilidad es
buena (p.ej: DMF). A esta disolución se añaden los ligandos OA/OAm, 116 u otros
estabilizantes. 117

A diferencia del método LARP, en esta variante se incluye un copolímero

anfifílico. Este puede añadirse en el primer disolvente, 116,117 o en el
antidisolvente (p.ej: tolueno). 1,75

Cuando la mezcla que contiene las sales precursoras se inyecta en el

antidisolvente, la solubilidad de las sales disminuye y desencadena el proceso
de cristalización (Figura 24b). Sin embargo, esta vez el crecimiento de los NCs
queda confinado en el núcleo de la micela inversa polimérica ( Figura 25d-f),
mientras que en el método LARP los NCs solo quedan estabilizados por los
ligandos convencionales.

Adicionalmente, otros trabajos refuerzan el recubrimiento polimérico con

una capa de sílice, generada a partir del proceso sol-gel (Figura 25g-h), o con un

73
 Capítulo 1. Introducción

recubrimiento basado en silanos que incrementa su estabilidad y mejora su

dispersión en agua. 1,118,119

⎯ Coprecipitación de NCs presintetizados

Esta estrategia consiste en inducir a través de un cambio de solubilidad el

proceso de autoensamblaje del polímero para que forme micelas, en cuyo
interior quedan atrapados los NCs previamente sintetizados que se encuentran
en la disolución (Figura 24c). 120

Figura 25. Cristalización de LHP en micelas poliméricas a partir de (a -c) la difusión de

las sales precursoras o (d-f) de la variante del método LARP, (g -h)
incluyendo un recubrimiento adicional de SiO 2 . (i) NCs de CsPbBr 3
presintetizados atrapados en micelas poliméricas. Imágenes reproducidas
de (a) ACS Appl. Mater. Interfaces 2017, 9, 22, 18417 –18422 (b) Nano Lett.
2019, 19, 8, 4928–4933, (c) Journal of Alloys and Compounds. 2020, 844,
156102, (d) ACS Appl. Mater. Interfaces 2020, 12, 2, 3080–3085, (e) ACS
Energy Lett. 2021, 6, 8, 2844–2853 (f) RSC Adv., 2023,13, 5946-5956 (g) Sci.
Adv. 2019, 5, eaax442 (h) ACS Appl. Nano Mater. 2021, 4, 11, 11791 –11800
(i) ACS Nano 2022, 16, 9, 13657–13666

74
 Capítulo 1. Introducción

La Tabla 4 resume los resultados de los trabajos más representativos de la

estabilización de NCs de perovskita en micelas poliméricas.

Tabla 4. Características del resultado de la cristalización asistida por

nanorreactores poliméricos
Técnica Composición Tamaño PLQY Estabilidad Aplicación Ref.
(nm) (%) en agua
Difusión de a CsPbBr 3 @PS-b-P2VP 20 51 10 h N.D. 113

sales
b MAPbBr 3 @PS-b-P2VP 6-27 63 N.D. N.D. 114
precursoras |
Figura 25
c CsPbBr 3 @ap-POSS- 50-60 60 12 h N.D. 115

PMMA-b-PDMAEMA
Variante de d CsPbBr 3 @PI DH = 88,1 1h LEDs 116

LARP | Figura 132,5

25
e CsPbBr 3 @PS-b-PAA D H = 69 30 23 días LEDs 117

f CsPbBr 3 @PVP/NIPAM 12 84 3 días Bioimagen 75

g MAPbBr 3 @PAA-b- 15 88 24 h N.D. 118

PS@SiO 2

h CsPbBr 3 @PVP@SiO 2 170 41,6 10 días Bioimagen 1

Coprecipitación i CsPbBr 3 @PS-b-PAA 200 60 2 años Bioimagen 120

| Figura 25

DFTHS: dodecafluoroheptil-propil.trihidroxisilano · NIPAM: N-isopropilacrilamida · P2VP: poli(2-

vinilpiridina) · PAA: ácido poliacrílico · PDMAEMA: poli(2-(dimetilamino)etil metacrilato · PEO:
polietilenglicol · PI: poliimida · PMMA: polimetilmetacrilato · POSS: silsesquioxanos oligoméricos
poliédricos · PS: poliestireno · PVP: polivinilpirrolidona

II. Fotopolimerización

Las propiedades fotocatalíticas de los NCs de LHP pueden aprovecharse

para desencadenar reacciones de fotopolimerización que permitan el
crecimiento de recubrimientos poliméricos para su propia estabilización.

En esta estrategia los NCs actúan a la vez como fotocatalizadores y

sustratos. Es decir, la excitación de los NCs de LHP desencadena la
polimerización de los monómeros que se encuentran anclados a su superficie,
logrando un recubrimiento polimérico que se limita a las inmediaciones de cada
nanocristal por separado.

Esta metodología graft-from permite crecer cadenas poliméricas

directamente en la superficie del NC. Wong et al consiguieron estabilizar NCs de

75
 Capítulo 1. Introducción

perovskita con un recubrimiento de poliestireno mediante la excitación de los

NCs con luz blanca. 121

Por otro lado, el grupo de Haifeng Gao desarrolló otra estrategia donde los
NCs excitados (λ ex 420 nm), activan a los fotoiniciadores que se encuentran
adheridos a su superficie, lo que desencadena la polimerización radicálica de los
monómeros acrilato. 122 El nivel de entrecruzamiento, y por tanto, la
permeabilidad del recubrimiento polimérico puede regularse en función del
disolvente. Por ejemplo, en un disolvente donde el polímero es soluble, las
cadenas de polímero se encuentran extendidas, permitiendo que se produzca
intercambio iónico y así sintonizar el color de la emisión en base a la
composición del haluro. Mientras que en un disolvente polar las cadenas
poliméricas colapsan, generando una barrera densa que confiere estabilidad a
largo plazo (Figura 26). Este mecanismo permite la coexistencia de las diferentes
composiciones para generar luz blanca en agua, manteniéndose estable durante
al menos 1 día. 123

Figura 26. Recubrimiento polimérico obtenido por fotopolimerización

La estabilización basada en la fotopolimerización inducida por los propios

NCs de LHP es una estrategia que también ha sido reproducida con éxito en
Upconverting nanoparticles (UCNPs). 124 Sin embargo, la realidad es que son muy
pocos los resultados que lo consiguen a nivel de partícula individual,
obteniéndose generalmente grandes compuestos poliméricos que integran
múltiples NCs. 125,126

76
 Capítulo 1. Introducción

Los resultados de los trabajos de estabilización de NCs de perovskita

mediante la estrategia de fotopolimerziación pueden consultarse en la Figura
27 y en la Tabla 5.

Figura 27. NCs de CsPbBr 3 estabilizados mediante la estrategia de fotopolimerización.

Imágenes reproducidas de (a) Advanced Materials. 2018, 30, 21, 1 –6, (b)
ACS Energy Lett. 2022, 7, 2, 610–616, (c) Applied Surface Science. 2020, 526,
146735

Tabla 5. Características de los NCs de LHP estabilizados mediante

fotopolimerización
Figura Composición Tamaño PLQY Estabilidad en Aplicación Ref.
27 (nm) (%) agua
a CsPbBr 3 @PS ~ 15 nm 42 N.D. LEDs 121

b CsPbBr 3 @PMA ~ 14 nm 48 1 día N.D. 1 2 2 ,1 23

c CsPbBr 3 @PPy N.D. N.D. 30 días N.D. 125

PMA: polimetilacrilato · PPy: polipirrol · PS: poliestireno

III. Técnicas de atomización

Las técnicas de atomización se basan en generar un aerosol a partir de una

disolución que, al secarse rápidamente, dan lugar a un producto sólido. 127,128 En
función del mecanismo por el que se produce la atomización, pueden
distinguirse varias técnicas: electrospraying/electrospinning, spray-drying y
spray-pyrolysis. 129

77
 Capítulo 1. Introducción

D. Electrospraying/electrospinning

La técnica de electrospraying/electrospinning genera gotas muy pequeñas

al someter una disolución a alto voltaje. Según el producto generado, se utiliza
un nombre u otro para referirse a esta técnica. Cuando se obtienen partículas
de aspecto esférico, recibe el nombre de electrospraying, mientras que cuando
son fibras, se denomina electrospinning. 130,131

El resultado depende de los parámetros fisicoquímicos implicados en el

proceso. Normalmente, a partir de disoluciones con baja viscosidad se generan
partículas esféricas, mientras que cuando la viscosidad es alta se generan
fibras. 132 Controlando otros factores como: voltaje, velocidad de inyección,
condiciones ambientales, conductividad eléctrica y las propiedades reológicas
de la disolución, es posible modificar el tamaño y morfología. 133

Figura 28. Metodología para la estabilización de NCs de LHP en (a) partículas

(electrospraying) o (b) fibras (electrospinning) poliméricas

El montaje típico del equipo de electrospraying/electrospinning se ilustra

en la Figura 28 y consiste generalmente en: (i) una jeringa cargada con la
disolución, (ii) una bomba de jeringa que controla la velocidad a la que se
inyecta, (iii) una aguja metálica que se coloca en la punta de la jeringa y se

78
 Capítulo 1. Introducción

conecta a (iv) la fuente de alto voltaje. (v) El colector es una superficie

conductora que se coloca a una determinada distancia de la aguja y es donde se
recoge el producto final. 134

Ambas técnicas se han empleado para encapsular NCs de LHP en partículas

o fibras de polímeros hidrófobos como poliestireno (PS), 135–139 fluoruro de
polivinilideno (PVDF), 140 polimetilmetacrilato (PMMA), 141,142 poli(estireno-
butadieno-estireno) (SBS), 143 o poliacrilonitrilo (PAN). 144 La Tabla 6 resume los
resultados de los trabajos más representativos de la estabilización de los NCs de
perovskita mediante técnicas de atomización.

Hasta la fecha, los trabajos que recurren a la estrategia d e electrospraying

para la encapsulación de NCs de LHP, someten a alto voltaje una disolución que
contiene un polímero de naturaleza hidrófoba en una mezcla con los NCs de LHP.
El resultado son partículas poliméricas de tamaño micrométrico (5 -17 µm)
(Figura 29a-c), 136,138,141 cargadas de NCs en su interior. Otra alternativa, consiste
en utilizar la mezcla de las sales precursoras junto con el polímero disueltos en
DMF. De esta manera, Wang et al obtuvieron partículas por debajo de 1 µm, con
las que demostraron su aplicación como marcadores fluorescentes en cultivos
celulares (Figura 29d). 140

Figura 29. NCs de LHP estabilizados en partículas poliméricas mediante la estrategia

de electrospraying. Imágenes reproducidas de (a) J. Mater. Chem. C,
2018,6, 7971-7975, (b) Chemistry - A European Journal. 2020, 26, 46, 10528 –
10533, (c) Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering
Aspects. 2022, 634, 127909, (d) Inorganic Chemistry Communications. 2019,
106, 99–103

De la misma manera, en la modalidad de electrospinning la metodología

habitual consiste en producir las fibras a partir de una disolución que contiene
los NCs de LHP presintetizados en una mezcla con el polímero disuelto ( Figura
30). Paralelamente, también hay trabajos donde en lugar de los NCs se parte de
las sales precursoras tanto de cesio, 137 como de metilamonio. 144

79
 Capítulo 1. Introducción

Figura 30. NCs estabilizados en fibras poliméricas mediante la estrategia de

electrospinning. Imágenes reproducidas de (a) J. Phys. Chem. Lett. 2016, 7,
21, 4253–4258 (b) Nanoscale Horiz., 2017,2, 225-232, (c) ACS Appl. Mater.
Interfaces 2018, 10, 3, 2210–2215, (d) Nature Communications. 2021, 14, 234

E. Spray-drying

La técnica de spray-drying es un método donde la disolución se atomiza al

pasar a través de un nebulizador que genera un aerosol de pequeñas gotas que
al entrar en contacto con un gas se secan de forma instantánea, dando lugar a
un polvo muy fino (Figura 31). 128,145

El tamaño y morfología de las partículas puede ajustarse a través de las

condiciones de atomización, temperatura de secado, flujo del gas de secado,
concentración de la disolución y presión. 146

El único trabajo que ha utilizado esta técnica para la encapsulación de NCs

de LHP es el de Boussoufi et al, logrando una población polidispersa de
partículas, con un tamaño medio de 400 nm. 147

Figura 31. NCs de LHP estabilizados en partículas poliméricas mediante la estrategia

de spray-drying. Imagen reproducida de ACS Appl. Nano Mater. 2021, 4, 7,
7502–7512

80
 Capítulo 1. Introducción

Tabla 6. Características de los NCs de LHP estab ilizados mediante técnicas de

atomización
Técnica Composición Tamaño PLQY Estabilidad Aplicación Ref.
(µm) (%) en agua
Electrospraying a CsPbBr 3 @PS 4-5 52 30 días LEDs 136

| Figura 29
b CsPbBr 3 @PS 10-15 43 N.D. N.D. 138

c CsPbBr 3 @PMMA 17 N.D. 20 días Sensor de 141

fosfatasa
alcalina
d *CsPbBr 3 @PVDF 0,6 N.D. 3 días Bioimagen 140

Electrospinning a CsPbBr 3 @PS 0,8 91 4h Sensor de 135

| Figura 30 rodamina
6G
b CsPbBr 3 @PMMA 3 88 30 días Sensores 142

de tripsina,
Cu + 2 y pH
c CsPbBr 3 @SBS 0,8 23 1h LEDs 143

d CsPbBr 3 @HPβCD@PS@PFOS 3 49,7 138 días Tinta, 139

WLEDs y
textil
- *CsPbBr 3 @PS 0,8 48 8 días LEDs 137

- *MAPbBr 3 @PAN 0,2 30,9 2 días N.D. 144

Spray-drying | CsPbBr 3 @PMMA/PBMMA 0,4 65 N.D. LEDs 147

Figura 31

*Casos en los cuales la disolución de partida contiene la mezcla de las sales precursoras
(ABr:PbBr 2 ), en lugar de los NCs presintetizados
HPβCD: hidroxipropil-beta-ciclodextrina · PAN: poliacrilonitrilo · PBMMA: poli(butil metacrilato -
co-metil metacrilato · PFOS: perfluorooctiltrietoxsisilano · PMMA: polimetilmetacrilato · PS:
poliestireno · PVDF: fluoruro de polivinilideno · SBS: poli(estireno-butadieno-estireno)

1. 2. 6 A pl ic aci o ne s

Los NCs de perovskita son una clase de materiales luminiscentes con

capacidad para superar a los fluoróforos tradicionales en bioaplicaciones,
principalmente por la sencillez de su síntesis, fotoestabilidad, alto PLQY,
emisión estrecha y posibilidad de obtener una amplia gama de colores en
función de su composición.

Además, pueden excitarse simultáneamente sin que sus espectros solapen,

por lo que son ideales para multiplexado. Por ejemplo, Zhang et al, produjeron
partículas de hasta 7 colores distintos, las cuales pueden distinguirse
simultáneamente por microscopía confocal de fluorescencia bajo una excitación
de 325-375 nm sin que sus espectros solapen (Figura 32). 24
81
 Capítulo 1. Introducción

Figura 32. (a) Fluorescencia de las micropartículas CsPbX 3 @PS producidas por Zhang
et al multicolores bajo una misma fuente de excitación a 325 -375 nm. (b)
Espectro de la emisión multiplex. Imágenes reproducidas de Adv. Funct.
Mater. 2017, 1604382

Una de las aplicaciones más exitosas de los NCs de perovskita en e l área

biomédica es en biología celular (Figura 33). En ese caso, pueden utilizarse para
la visualización de las células, marcaje de células tumorales o seguimiento de la
dinámica celular. En la Tabla 7 se muestran algunos ejemplos de partículas de
perovskita estabilizadas que han sido utilizadas como agentes de contraste en
cultivos celulares.

Tabla 7. Ejemplos de NCs de LHP aplicados en bioimagen

Composición Tamaño PLQY Estabilidad Viabilidad Culltivo Ref
(%) en agua celular celular
CsPbBr 3 @SiO 2 170 nm 44,2 10 días 89% a MCF-7 1

100 µg/mL
CsPbBr 3 @PS-b-PAA 200 nm 60 2 años 90% a 200 U87-MG 120

μgPb/mL
CsPbBr 3 @PMMA 112 nm 73 80 días 92% a HeLa 2

60 µg/mL
CsPbBr 3 @SiO 2 55 nm 10 24 h 96,21% a HepG2 148

16 µg/mL

En función de las dimensiones y naturaleza de las partículas, estas pueden

adherirse a la membrana o ser endocitadas por las células. Esta información
puede completarse recurriendo a procesos de tinción convencionales que
permiten localizar el núcleo u otros orgánulos celulares y, por tanto, determinar
si la señal de las NPs colocaliza con alguna de estas señales.

82
 Capítulo 1. Introducción

Figura 33. Panel I, resultados de las NPs de CsPbBr 3 @SiO 2 producidas por Wu et al.
Panel II, resultados de las NPs de CsPbBr 3 @PS-b-PAA producidas por
Avugadda et al. Panel III, resultados de las NPs producidas por Wang et al.
(a) Imagen de TEM de las partículas (b) Imagen de microscopía confocal
que permite visualizar la localización de las NPs en cultivo celular (en azul
núcleos de las células teñidos con DAPI, en verde la fluorescencia emitida
por las NPs y en rojo, los lisosomas de la célula). (c) Seguimiento de la
intensidad de fluorescencia de las NPs dispersas en agua como medida de
estabilidad óptica de los NCs de CsPbBr 3 encapsulados. Imágenes
reproducidas de (I) ACS Appl. Nano Mater. 2021, 4, 11, 11791 –11800. (II)
ACS Nano 2022, 16, 9, 13657–13666. (III) Small. 2018, 14, 51, 1-8

Una de las propiedades que convierte a los NCs de perovskita en

marcadores luminiscentes prometedores en bioimagen celular es su capacidad
de absorción multifotónica y emisión upconversion, es decir, pueden absorber
varios fotones de la región del infrarrojo cercano (NIR) y emitir luz en la región
visible. Esto permite sustituir una fuente de excitación UV por NIR, la cual ofrece
buena resolución espacial, tiene alta penetración en los tejidos sin producir
daño celular y reduce la autofluorescencia celular.
83
 Capítulo 1. Introducción

El trabajo de Zhong et al es un ejemplo donde exploran el potencial en

bioimagen de NPs core-shell de CsPbBr 3 @SiO 2 de 100 nm utilizando una fuente
de excitación NIR (800 nm) (Figura 34). 148 La cuantificación de la señal emitida
a 526 nm muestra que las células incubadas en presencia de las NPs alcanzan
una intensidad que es 5 veces mayor a la del grupo control, de modo que la
fuente NIR permite reducir la autofluorescencia celular y adquirir una buena
calidad de imagen.

Figura 34. (a) Las NPs core-shell de CsPbBr 3 @SiO 2 producidas por Zhong et al pueden
absorber dos fotones de una fuente de excitación láser a 800 nm y emisión
de un fotón a 526 nm. (b) Imágenes de microscopía confocal de
fluorescencia y cuantificación de la intensidad emitida por las células
HepG2 en ausencia (control) y en presencia ( experimental) de las NPs
core-shell de CsPbBr 3 @SiO 2 bajo una fuente de excitación láser de 800 nm.
Imágenes reproducidas de Chemical Engineering Journal (2022) 431, 3,
134110

En algunos ensayos biológicos, donde la observación de las células puede

requerir tiempos largos, los fluoróforos orgánicos no resultan útiles, ya que son
susceptibles a fotoblanqueamiento y como consecuencia dejan de emitir
fluorescencia. En cambio, los NCs de perovskita tienen tiempos de vida de
fluorescencia más largos, por lo que se convierten en una alternativa eficiente
en estudios de bioimagen celular de larga duración, como por ejemplo estudios
in vivo realizados en modelos animales.

84
 Capítulo 1. Introducción

Por ejemplo, Luo et al, confirmaron la estabilidad y biocompatibilidad de

los NCs de CsPbBr 3 estabilizados en nanomicelas de polietilenglicon-
policaprolactona (PEG-PCL) en un estudio realizado en pez cebra, lo que
confirma la posibilidad de realizar estudios in vivo sin aparecer indicios de
toxicidad (Figura 35). 149

Figura 35. (a) TEM e imagen de fluorescencia de las NPs de CsPbBr 3 @PEG-PCL
producidas por Luo et al. (b) Medida de la estabilidad de las NPs en agua,
PBS a pH 5, 8 y 7,5 y medio de cultivo DMEM. (c) TEM de las NPs de
CsPbBr 3 @PEG-PCL tras reaccionar con H 2 S. En la fotografía adjunta se
puede ver le precipitado negro resultante de la formación de PbS. (d)
Comparación de la respuesta fluorescente de las NPs tras exponerse a
biomoléculas, aniones, cationes y H 2 S. (e) Seguimiento de la fluorescencia
in vivo en pez cebra y comparación de su intensidad en presencia de 15 y
30 µm de H 2 S. Imágenes reproducidas de Nanoscale, 2021, 13, 14297 –14303

85
 Capítulo 1. Introducción

Además, estos autores mostraron la respuesta de los NCs de perovskita

frente a la presencia de sulfuro de hidrógeno (H 2 S), una molécula de
señalización que juega un papel fisiológico importante en el sistema nervioso,
cardiovascular e inmune. En presencia de H 2 S, los iones de sulfuro eran capaces
de reaccionar con los iones de Pb, dando lugar a un precipitado negro (PbS) que
producía una drástica caída de la fluorescencia emitida por los NCs de
perovskita. Por otro lado, comprobaron que otras biomoléculas (serina, alanina,
glutatión, cisteína, ácido úrico, ácido ascórbico, dopamina), cationes (Na + , K + ,
Mg +2 , Cs +2 , NH 4 + ) o aniones (Cl - , Br - , I - , NO 3 - , SO 4 -2 , SO 3 -2 , HCO 3 - ) no interferían
en la fluorescencia emitida por los NCs de perovskita. Por tanto, estos resultados
convierten a los NCs de perovskita en una herramienta para la monitorización
de los niveles de H 2 S y detección del desequilibrio que se produce en
enfermedades como síndrome de Down, Alzheimer, diabetes y cirrosis.

Otros autores han desarrollado sistemas de detección biomolecular donde

la presencia del analito induce la transición de un estado apagado a encendido
de la fluorescencia (sistemas off-on). Por ejemplo, Wang et al encapsularon NCs
de CsPbBr 3 en fibras de PMMA mediante la estrategia de electrospinning y las
utilizaron para la detección de tripsina, que desde el punto de vista diagnóstico
es interesante porque se considera un biomarcador de múltiples enfermedades
cardiovasculares. 142 El sistema se basa en Transferencia de energía de
resonancia de Förster (FRET) entre los NCs de perovskita (donante) y la
rodamina 6G (aceptor), que está conjugada a una secuencia peptídica. En
presencia de tripsina, la enzima cataliza la ruptura de los enlaces peptídicos lo
que permite la separación de ambos fluoróforos, resultando en el increment o
de la fluorescencia del donante y en la disminución de la fluorescencia del
aceptor. De este modo es posible determinar la concentración de tripsina en
función de la relación entre la fluorescencia del donante y el aceptor.

Otro ejemplo es el sistema desarrollado por Wang et al, que tiene como
fin la detección de la enzima fosfatasa alcalina (ALP) en suero. 141 En este sistema
se emplean nanohojas de dióxido de manganeso que quenchean la fluorescencia
de los NCs de perovskita estabilizados en microesferas de PMMA. En presencia
del sustrato y de la enzima ALP, se produce una reacción química que reduce a
las nanohojas en iones de manganeso (Mn +2 ), las cuales pierden su capacidad
para seguir quencheando la fluorescencia de los NCs y, por tanto, el sistema pasa
del estado apagado a encendido (Figura 36).

86
 Capítulo 1. Introducción

Figura 36. Ilustración del principio de detección del sistema desarrollado por Wang
et al. (b) Demostración del efecto quenching que producen las nanohojas
de MnO 2 sobre la intensidad de fluorescencia emitida por los NCs de
perovskita. (c) Incremento de la intensidad de fluorescencia con
concentraciones crecientes de la enzima ALP. Imágenes reproducidas de
Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects 2022,
634, 127909

Además de biomoléculas, también se han diseñado sistemas para la

detección de bacterias basados en FRET. El sistema de Jiang et al permite la
detección de Mycobacterium tuberculosis. 150 En él, los NCs de perovskita actúan
como aceptor y están funcionalizados con una sonda de DNA que reconoce la
secuencia complementaria del DNA de la bacteria, mientras que como quencher
utilizan nanohojas de MoS 2 . Cuando la sonda de DNA marcada se une a las
nanohojas de MoS 2 , induce el estado de apagado. Mientras que, en presencia
de la secuencia complementaria de la bacteria, ambas hibridan, evitando así que
la sonda se adsorba en la superficie de las nanohojas, por lo que en estas
condiciones se pasa al estado encendido de la fluorescencia.

Por otro lado, la combinación de NCs de perovskita estables con

anticuerpos específicos también ha permitido obtener conjugados fluorescentes
para la detección cuantitativa de biomoléculas específicas de interés clínico,
alimentario o medioambiental. Por ejemplo, Dong et al desarrollaron un
inmunoensayo en formato sándwich, donde el anticuerpo de captura se conjuga
87
 Capítulo 1. Introducción

con NCs de perovskita para la detección de pequeñas moléculas, como la

aflatoxina, y macromoléculas, como el antígeno carcinoembriónico, alcanzando
límites de detección (LOD) de 0,02 ng/mL y 0,482 ng/mL, respectivamente . 151

También es interesante citar el trabajo de Li et al, donde los NCs de

perovskita están estabilizados por un recubrimiento fosfolipídico b iotinilado y
los emplean como marcadores fluorescentes para desarrollar un inmunoensayo
en formato sándwich para la detección del antígeno prostático específico (PSA)
un biomarcador de diagnóstico en cáncer de próstata. 152 Cabe destacar que
atribuyen a los NCs de perovskita capacidad catalítica que simula la ac tividad
peroxidasa y por tanto pueden convertir los sustratos (TMB y H 2 O 2 ) en un
producto coloreado, de modo que permite una detección dual. Alcanzan un LOD:
0,29 ng/mL mediante detección colorimétrica y un LOD: 0,081 ng/mL mediante
detección fluorimétrica (Figura 37).

Figura 37. (a) Esquema del inmunoensayo en formato sándwich para la detección de
PSA desarrollado por Li et al. (b) Intensidad de fluorescencia a 521 nm
alcanzada para diferentes concentraciones del analito (PSA) (c)
Absorbancia a 652 nm obtenida para diferentes concentraciones de PSA.
Imágenes reproducidas a partir de Biosensors and Bioelectronics 2022, 203,
113979

En conclusión, los avances de los últimos años en encapsulación de NCs de

perovskita hacen que cada vez esté más cerca su implantación como marcadores
luminiscentes. La mayor parte de los ejemplos descritos se centran en
aplicaciones de diagnóstico por imagen, aunque hasta ahora generalmente se
ciñen únicamente a demostrar la biocompatibilidad de las partículas en un
cultivo celular. El paso siguiente debe ser su conjugación a biorreceptores para
que reconozcan de forma específica determinados tipos celulares o estructuras
internas, ya que respaldaría su versatilidad en histoquímica o citoquímica,
respectivamente.

88
 Capítulo 1. Introducción

Por otro lado, aun hay pocos ejemplos que demuestren la utilización de
NCs de perovskita como marcadores en sistemas analíticos. Ante la creciente
necesidad de monitorizar biomarcadores de interés clínico, medioambiental o
alimentario, 153 consideramos relevante aportar estrategias de estabilización que
resulten en partículas monodispersas, de tamaño nanométrico, exhiban alto
PLQY, con capacidad para dispersarse homogéneamente en tampón salino o
medios biológicos y se mantengan ópticamente estables que contribuyan al
desarrollo de los nanocristales de perovskita en esta dirección .

89
 Capítulo 1. Introducción

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106
Capítulo 2. Objetivos

Capítulo 2
Objetivos

107
108
 Capítulo 2. Objetivos

Los nanocristales de perovskita tienen potencial para convertirse en

marcadores fluorescentes en aplicaciones biológicas por sus excelentes
propiedades ópticas, fotoestabilidad y simplicidad de su síntesis.

Entre sus características destaca su amplio espectro de absorción, emisión

estrecha y sintonizable en función de su tamaño y comp osición, alto
rendimiento cuántico de fluorescencia y emisión upconversion desencadenada
por absorción multifotónica a partir de una fuente de luz infrarroja.

En base a estas propiedades, consideramos que estos materiales pueden

llegar a competir con otros marcadores habitualmente utilizados en kits
comerciales basados en nanopartículas de oro, enzimas, colorantes orgánicos o
quantum dots, por su sensibilidad, capacidad de multiplexado y bajo coste,
siempre y cuando se resuelva su compatibilidad en medio acuoso, donde tienen
lugar las aplicaciones biológicas.

Por tanto, el objetivo principal en el que se basa esta tesis es la

estabilización de nanocristales de perovskita de haluros metálicos para que
mantengan sus propiedades ópticas en medio acuoso y puedan ser utilizados
como marcadores luminiscentes en sistemas analíticos, biosensado o
bioimagen.

Para alcanzar este fin, se plantean los siguientes objetivos específicos:

⎯ Obtención de nanocristales de perovskita de haluros metálicos

mediante metodologías de síntesis coloidal que proporcionen, de
forma reproducible, una población de partículas monodispersas de
tamaño nanométrico, que exhiban un espectro de emisión estrecho
y presenten un alto rendimiento cuántico de fluorescencia.
⎯ Encapsulación de los nanocristales de perovskita en materiales que
permitan su transferencia al medio acuoso mediante las siguientes
estrategias:
a) Adaptación del proceso sol-gel para generar partículas core-
shell con un recubrimiento de sílice
b) Coprecipitación de los nanocristales de perovskita en micelas
poliméricas basadas en un copolímero de poliestireno y ácido
poliacrílico
c) Atomización mediante electrospraying para producir
partículas poliméricas de poli(estireno-co-anhídrido maleico)
que contengan a los nanocristales de perovskita en su
interior

109
 Capítulo 2. Objetivos

⎯ Caracterización óptica y morfológica de las partículas resultantes y

estudio de su estabilidad química y estructural en medio acuoso.
⎯ Demostración del potencial de los nanocristales de perovskita
estabilizados en bioaplicaciones mediante su incubación en cultivos
celulares o mediante su conjugación a biorreceptores para la
detección de analitos de interés en inmunoensayos in vitro.

110
Capítulo 3. Estabilización de NCs de perovskita
con recubrimientos de sílice mediante la
adaptación del proceso gel

Capítulo 3
Estabilización de NCs de perovskita
con recubrimiento de sílice mediante
la adaptación del proceso sol-gel

111
112
 Capítulo 3. Estabilización de NCs de perovskita con recubrimiento de sílice mediante la adaptación del proceso sol-gel

3.1. Introducción

Los nanocristales (NCs) de perovskita de haluros de plomo (LHP) son

extremadamente sensibles en presencia de disolventes polares, medios ácidos
o alcalinos y de otros factores externos, como largos tiempos de exposición a la
luz o elevadas temperaturas. 1,2 Estos factores desencadenan rápidamente la
descomposición del nanocristal, lo que conlleva a la pérdida de su estructura y
excelentes propiedades ópticas intrínsecas.

En este contexto, la sílice (SiO 2 ) es un material transparente, robusto,

químicamente inerte y de fácil funcionalización. Se trata de uno de los más
utilizados para obtener nanomateriales biocompatibles, ya que permite
estabilizar a las nanopartículas inorgánicas en estructuras de tipo core-shell o
mesoporosas. 3

La encapsulación de los NCs de LHP en SiO 2 puede llevarse a cabo a través

de dos estrategias principales: el método sol-gel, que genera un recubrimiento
de SiO 2 sobre la superficie de los NCs, o la cristalización in situ en los poros de
nanopartículas (NPs) de sílice mesoporosa (meso-SiO 2 ). 4

El método sol-gel permite sintetizar NPs de tipo core-shell donde un solo

nanocristal queda envuelto por una capa de sílice. El control de las variables
durante la etapa de crecimiento permite modular el grosor de la envoltura y por
tanto respetar el tamaño nanométrico de la nanopartícula pudiendo oscilar
entre 20-30 nm. 1,5,6

Por otro lado, la cristalización in situ en los poros de nanopartículas (NPs)

de sílice mesoporosa (meso-SiO 2 ) es una estrategia que ha demostrado ser
igualmente válida para la estabilización de los NCs de LHP. Según los trabajos de
la bibliografía, las NPs de meso-SiO 2 que se han utilizado para estabilizar NCs de
LHP tienen un tamaño superior a 100 nm, donde múltiples NCs crecen en su
interior. 7–9

El objetivo principal que motiva esta investigación es estabilizar NCs de

LHP para su utilización como marcadores fluorescentes en difer entes sistemas
analíticos, biosensado, o bioimagen, ya que poseen propiedades ópticas muy
interesantes: amplia absorción, emisión estrecha, gran gama de color capaz de
cubrir el espectro visible en función de su composición y alto rendimiento
cuántico de fluorescencia (PLQY ~ 90%). 10

113
 Capítulo 3. Estabilización de NCs de perovskita con recubrimiento de sílice mediante la adaptación del proceso sol-gel

Teniendo en cuenta que uno de los principales requisitos que demandan

estas aplicaciones es que el tamaño de partícula sea pequeño para que no afecte
a la función de la biomolécula o impida su internalización celular, las estrategias
de estabilización que generan grandes aglomerados son inviables.

En este sentido, el crecimiento de una envoltura de sílice mediante el

método sol-gel se considera una estrategia adecuada para alcanzar este fin, con
potencial de proporcionar NPs versátiles y universales que puedan utilizarse
como biomarcadores luminiscentes en diferentes sistemas analíticos,
biosensado o bioimagen.

En general, se pueden distinguir entre tres aproximaciones en función del

material de partida: (A) NCs de CsPbX 3 , (B) NCs de Cs 4 PbX 6 y (C) sales
precursoras. Este capítulo se centra en las dos primeras aproximaciones, ya que
son las más extendidas para obtener NPs core-shell.

En todas ellas, la metodología implica el crecimiento de una envoltura de

sílice mediante un proceso sol-gel (método Stöber) que conlleva la hidrólisis de
un alcoxisilano y condensación en una red de sílice. La rápida degradación de
los NCs de LHP en las condiciones de reacción (presencia de agua, alcohol o
aminas), ha llevado a desarrollar variantes del proceso en condiciones de
reacción menos agresivas. 11

En definitiva, el objetivo de las estrategias de estabilización consiste en

alcanzar un equilibrio entre la tasa de degradación de los NCs y la formación de
la envoltura de sílice. 12

Las estrategias que se engloban dentro de la primera aproximación (A), en

las que se utilizan NCs presintetizados de perovskita como material de partida,
básicamente buscan suavizar las condiciones de reacción del método Stöber
para ajustar la velocidad del proceso hidrolítico y minimizar el tiempo de
exposición de los NCs con el agua o evitar que entren en contacto directo.

Por ejemplo, Huang et al desarrollaron una metodología sencilla, donde

los NCs de MAPbBr 3 dispersos en tolueno se tratan con tetrametilortosilicato
(TMOS). 13 La hidrólisis a partir de las trazas de agua que contiene el tolueno
cuando la reacción se lleva a cabo bajo una humedad controlada del 60%. En
función del tiempo de incubación, señalan que es posible modular el tamaño de
partícula de sílice desde unos pocos nanómetros hasta alcanzar tamaños de 150 -
500 nm.

114
 Capítulo 3. Estabilización de NCs de perovskita con recubrimiento de sílice mediante la adaptación del proceso sol-gel

De forma similar, Wang et al generaron un recubrimiento de sílice en NCs

de CsPbX 3 a partir de TMOS y un volumen mínimo de agua. 14 Al tratarse de un
alcoxisilano con una rápida tasa hidrolítica, en un corto período de tiempo es
capaz de consumir gran parte del agua, disminuyendo el riesgo de degradación
de los NCs. Una de las desventajas de utilizar TMOS es que no tiene ningún grupo
funcional con el que pueda unirse a la superficie del NC, por lo que la sílice se
deposita aleatoriamente sobre la superficie del nanocristal. 5 Como
consecuencia, los NCs se aglomeran debido a la desorción de los ligandos de la
superficie, y la sílice se entrecruza, dando lugar a partículas de sílice
relativamente grandes (1,2 µm), por lo que su aplicación se ve limitada.

Li et al utilizaron (3-mercaptopropil)trimetoxisilano (MPTMS). 15 Este silano

puede unirse como ligando a la superficie de los NCs, mediante la formación del
enlace de coordinación S-Pb, 16 y a la vez, actúa como fuente precursora de sílice.
En su metodología, los NCs de CsPbBr 3 se silanizan inicialmente mediante su
incubación con MPTMS. Posteriormente, en presencia de mayor cantidad de
MPTMS y un volumen mínimo de agua, se inicia lentamente el proceso de
hidrólisis y condensación. En comparación con los trabajos anteriores, las NPs
resultantes alcanzan un tamaño inferior (170 nm). Además, exhiben un PLQY
alto (78%) y mantienen el 60% de la fluorescencia inicial durante 20 días en
agua.

El 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES) es otro ejemplo de silano capaz de

unirse a la superficie del NC a través de su grupo amino y, al mismo tiempo,
proporcionar grupos silanoles libres tras hidrolizarse. Es altamente reactivo y
participa en reacciones de homo-condensación que pueden generar problemas
de agregación, 17 por lo que algunos trabajos proponen que la reacción de
hidrólisis transcurra a partir de la humedad ambiental. Sin embargo, un tiempo
de incubación excesivo puede generar agregación entre partículas, 18 mientras
que tiempos cortos proporcionan una fina capa de sílice insuficiente para
preservar los NCs íntegros en condiciones de humedad. 19 En este sentido, cabe
destacar el trabajo de Song et al por ser uno de los pocos ejemplos que,
utilizando APTES y un volumen mínimo de agua, ha conseguido NPs core-shell
de CsPbBr 3 @SiO 2 de tamaño nanométrico (~ 20 nm) compatibles con
aplicaciones de diagnóstico por imagen, aunque no indican qué valor de PLQY
alcanzan. 20

Por otro lado, Meng et al combinaron la funcionalización con APTES, con

la hidrólisis/condensación de los alcoxisilanos TMOS y tetraetilortosilicato
(TEOS), en una segunda y tercera etapa, respectivamente, obteniendo partículas
core-shell de 18 nm estables en un ambiente con una humedad del 70%. 5 En este
caso tampoco proporcionan el valor de PLQY de los NCs estabilizados.
115
 Capítulo 3. Estabilización de NCs de perovskita con recubrimiento de sílice mediante la adaptación del proceso sol-gel

Otra estrategia prometedora para estabilizar los NCs de perovskita (B)

aprovecha la transformación estructural de los NCs de Cs 4 PbX 6 para llevar a cabo
el proceso sol-gel en presencia de agua sin afectar significativamente a las
propiedades ópticas de los NCs.

Los NCs de Cs 4 PbX 6 se caracterizan por tener una estructura de dimensión

0 (0D), donde los octaedros de PbX 6 -4 están completamente separados los unos
de los otros. 21 Estos NCs carecen de propiedades luminiscentes. Sin embargo,
en presencia de un exceso de PbBr 2 , 21 agua, 22 azul de prusia, 23 ácido oleico, 24
anhídrido succínico, 25 o al someterse a un proceso térmico (150-350 °C), 26 son
capaces de reorganizar su estructura y transformarse en NCs de CsPbX 3
luminiscentes.

En presencia de una interfase hexano-agua, el CsX se desprende, dada su

alta solubilidad y naturaleza iónica del NC, desencadenando la transformación
estructural: Cs 4 PbX 6 (hexano) → CsPbX 3 (hexano) + 3 CsX (agua)

Los NCs de CsPbX 3 recién transformados son monodispersos, tienen

emisión estrecha (13-34 nm) y alto PLQY (75%). Además, son más estables frente
a la humedad que aquellos obtenidos por los métodos convencionales , 22 lo que
ofrece una oportunidad idónea para utilizarlos como material precursor durante
el proceso sol-gel para la obtención de nanopartículas core-shell CsPbBr 3 @SiO 2 .

Hasta ahora, la bibliografía cuenta con pocos trabajos. Hu et al fueron

pioneros en combinar la transformación desencadenada por agua con el
crecimiento de una envoltura de sílice a partir de TMOS. Como resultado,
obtuvieron heteroestructuras de 24 nm y un PLQY del 80%, 27 donde la SiO 2 se
deposita asimétricamente sobre la superficie de los NCs de CsPbX 3 (X = Cl/Br,
Br, Br/I and I).

Posteriormente, Li et al continuaron con la metodología, incorporando un

paso previo de silanización, que permitió sintetizar NPs de tipo core-shell
CsPbBr 3 @SiO 2 con un tamaño de 60 nm y un PLQY de 65%. 28

Park et al utilizaron TEOS como fuente precursora de la sílice en presencia

de una disolución acuosa de ácido nítrico 65% (v/v), sin embargo, con esta
metodología se genera un compuesto donde la sílice se aglomera y múltiples
NCs quedan embebidos en su interior. 29

Paralelamente, Rossi et al optaron por una vía alternativa de

transformación de NCs de Cs 4 PbX 6 a CsPbX 3 . mediada por PMAO, utilizando solo

116
 Capítulo 3. Estabilización de NCs de perovskita con recubrimiento de sílice mediante la adaptación del proceso sol-gel

el fragmento reactivo del polímero: el anhídrido maleico (MANH). 1 El resultado

fueron NPs CsPbBr 3 @SiO 2 con un tamaño de 17 nm y un PLQY de 1-4%.

El primer trabajo que se presenta en el Capítulo 1 “MÉTODO A.

Nanopartículas core-shell monodispersas de CsPb 2 Br 5 como marcadores
fluorescentes en inmunosensado” persigue desarrollar una nueva metodología
de síntesis de nanopartículas core-shell a partir de los NCs de CsPbBr 3 como
material precursor. En ella, el alcoxisilano (TEOS) y el catalizador (NH 4 OH) se
incorporan lentamente al medio de reacción, lo que permite retrasar la
degradación de los NCs a la vez que se deposita a su alrededor una capa de sílice.

El segundo trabajo del Capítulo 1 “MÉTODO B. Síntesis de nanopartículas

multicolores core-shell de CsPbX 3 @SiO 2 estables en agua para su utilización
como marcadores fluorescentes en inmunosensado”, utiliza NCs de Cs 4 PbBr 6
como material de partida ya que, atendiendo a los trabajos descritos en la
bibliografía, se considera una estrategia prometedora para la obtención de NPs
de perovskita con propiedades adecuadas para su uso como marcadores
fluorescentes en biosensado y sistemas analíticos.

117
 Capítulo 3. Estabilización de NCs de perovskita con recubrimiento de sílice mediante la adaptación del proceso sol-gel

3.2. Resultados

 MÉTODO A. Nanopartículas core-shell monodispersas de

CsPb 2 Br 5 como marcadores fluorescentes en
inmunosensado

Los NCs de CsPbBr 3 se sintetizaron según la metodología de hot-injection

descrita por Protesescu et al. 10 Como resultado se obtuvo una disolución
coloidal de NCs dispersos en tolueno a una concentración de ~ 52,5 nM. La
caracterización estructural y óptica de los NCs se resume en la Figura 38. Tienen
morfología cúbica, tamaño medio de 11 nm, emisión a 515 nm y fwhm de 35 nm.

Figura 38. Caracterización de los NCs coloidales de CsPbBr 3 producidos por la

metodología de hot-injection. (a y b) imagen de TEM e histograma con la
distribución del tamaño de partícula de los NCs. (c) Imágenes tomadas
bajo luz visible y ultravioleta (λ ex 254 nm). (d) Espectros de absorción (línea
negra) y emisión bajo una λ ex 480 nm (línea verde)

118
 Capítulo 3. Estabilización de NCs de perovskita con recubrimiento de sílice mediante la adaptación del proceso sol-gel

La concentración del alcoxisilano juega un papel importante en el

crecimiento de la sílice, por tanto, fue el primer parámetro a evaluar. Para ello,
inicialmente, se prepararon cinco muestras (A-E) en viales de vidrio, a los que
se añadieron 0,5 mL de NCs de CsPbBr 3 y un volumen variable de TEOS (60, 310,
480, 960 y 1440 µL, respectivamente). Como catalizador básico de la reacción
se añadió amoníaco al 25% en pequeña cantidad (2 µL), ya que grandes
volúmenes desencadenan rápidamente la degradación de los NCs. Las muestras
se incubaron durante toda la noche en condiciones de agitación magnética
(300 rpm) y tras su purificación, se analizaron por TEM. Los resultados se
muestran en la Figura 39.

Figura 39. Caracterización por TEM de las muestras tratadas con 2 µL de NH 4 OH 25%
como catalizador y concentraciones crecientes de TEOS (60, 310, 480, 960
y 1440 µL). Se incluye el control de la muestra B (sin catalizador)

119
 Capítulo 3. Estabilización de NCs de perovskita con recubrimiento de sílice mediante la adaptación del proceso sol-gel

Todas las muestras contienen NCs de 2-3 nm, embebidos en NPs de sílice
de diferentes tamaños y morfologías. La muestra A presenta NCs encapsulados
en nanopartículas de SiO 2 con forma de elipse y diámetros de 35,5 ± 8,4 nm y
20,7 ± 3,4 nm, respectivamente. Además, exhibe una población minoritaria de
NCs de gran tamaño (162 ± 38 nm) y nanocables (56 ± 14 nm de grosor). Esto
puede atribuirse a la descomposición y reorganización de los NCs de perovskita
en estructuras de mayor tamaño. 30–32

La muestra B evoluciona hacia la formación de NPs de SiO 2 esféricas de

101,4 ± 6,5 nm. Sin embargo, las muestras C y D, dan lugar a NPs de SiO 2
encadenadas, con tamaños de 19,7 ± 2,4 y 33,8 ± 4 nm, respectivamente.

La muestra E produce la agregación de NCs en un compuesto de gran

tamaño, como resultado de la polimerización aleatoria de los monómeros de
alcoxisilano cuando éste se encuentra en exceso. El control de la muestra B (sin
catalizador) produce un resultado similar, lo que indica el papel importante que
juega el NH 4 OH en el mecanismo de nucleación.

Otro parámetro importante en el crecimiento de la envoltura de sílice es

el contenido de agua, ya que marca la velocidad de hidrólisis del alcoxisilano.
Para evaluar su influencia, se prepararon 3 muestras (F-H) donde 0,5 mL de
CsPbBr 3 se trataron con 310 µL de TEOS y 2 µL de NH 4 OH 25% diluidos en los
siguientes volúmenes de agua: 0, 28 y 90 µL. Como los NCs de perovskita se
descomponen rápidamente, la adición se llevó a cabo de forma lenta para
retrasar el proceso de degradación (TEOS a 0,74 µL/min y NH 4 OH a 0,07 µL/min).
Los resultados se muestran en la Figura 40.

En ausencia de agua (muestra F), las nanopartículas aparecen encadenadas

unas a las otras, mientras que cuando aumenta el contenido en agua, se
obtienen nanopartículas core-shell monodispersas con un tamaño de unos
30 nm (muestra G). Por otro lado, el exceso de agua desencaden a la
descomposición de los NCs en los precursores iónicos, resultando en NPs de
sílice vacías (muestra H). Las diferencias encontradas en la caracterización de
las muestras B y F por TEM, se atribuyen al procedimiento de adición
fraccionada, ya que las condiciones utilizadas son las mismas (2 µL NH 4 OH 25%
+ 310 µL TEOS).

120
 Capítulo 3. Estabilización de NCs de perovskita con recubrimiento de sílice mediante la adaptación del proceso sol-gel

Figura 40. Caracterización por TEM de las muestras sometidas al proceso de adición
fraccionada. Muestras F-H tratadas con volúmenes crecientes de agua (0,
28 y 90 µL) y muestras I-J tratadas con 28 µL y concentraciones crecientes
de TEOS (480 y 960 µL, respectivamente)

Una vez ajustada la cantidad de agua, se procedió a determinar si era

posible controlar el grosor de la capa de sílice con concentraciones crecientes
de TEOS. De modo que en las muestras I y J se repitieron las condiciones de la
muestra G, para volúmenes de TEOS de 480 y 960 µL, respectivamente. Sin
embargo, los resultados no fueron satisfactorios, en ambos casos dieron lugar a
la aglomeración de la sílice.

Detrás del proceso químico implicado en la nucleación de la sílice se dan

las reacciones de hidrólisis y condensación del TEOS. Cuando la cantidad de agua
no es suficiente, hay una mayor proporción de monómeros de TEOS sin
hidrolizar, lo que lleva a un proceso de policondensación ale atorio, resultando
en nanopartículas de sílice que se encadenan unas a otras (muestras B -E).
Mientras que, cuando aumenta el contenido de agua, la proporción de
monómeros de TEOS hidrolizados aumenta. Debido al alto valor de pH (10,5),
los monómeros se desprotonan y se unen a la superficie de los NCs a través de
la interacción con los átomos de Pb, lo que da lugar a un crecimiento uniforme
y localizado de la envoltura de sílice (muestra G).
121
 Capítulo 3. Estabilización de NCs de perovskita con recubrimiento de sílice mediante la adaptación del proceso sol-gel

Figura 41. Caracterización de las NPs core-shell de la muestra G. (a-b) TEM e

histograma de la distribución del tamaño de partícula. (c) Espectro de
emisión (línea azul) obtenido a λ ex 355 nm y espectro de absorción UV-vis
(línea negra). (d) Análisis elemental por EDX -TEM. (e) Espectro ATR-FTIR de
los NCs de CsPbBr 3 (línea naranja) y las NPs core-shell (línea marrón)

Las propiedades estructurales y ópticas de las nanopartículas core-shell de

la muestra G se resumen en la Figura 41a-c. Se observa que exhiben
fluorescencia azul (λ em 432 nm) y un PLQY de ~ 5%. El diámetro de partícula es
32,07 ± 2,94 nm y por cada NP se localizan 2-3 nanocristales de unos 2 nm de
diámetro.

El análisis elemental EDX-TEM (Figura 41d) proporciona la distribución

atómica de los elementos, guardando una relación Si:O cercana al v alor teórico
(1:2). La red de sílice también se confirma al comparar el espectro ATR -FTIR de
los NCs de CsPbBr 3 con el de las NPs core-shell (Figura 41e). El pico a 1.050 cm -
1 se corresponde con la banda de tensión asimétrica del enlace Si -O-Si y el pico

a 790 cm -1 se corresponde con el la banda de tensión simétrica de Si -O-C de los

grupos de TEOS que no han reaccionado.

La densa envoltura de sílice y el pequeño tamaño de los nanocristales

dificultan la detección de los elementos Cs, Pb y Br por EDX -TEM. Tampoco fue
posible determinar la estructura cristalina utilizando HR-TEM o difracción de
122
 Capítulo 3. Estabilización de NCs de perovskita con recubrimiento de sílice mediante la adaptación del proceso sol-gel

rayos X (XDR), por lo que para determinar la estequiometría de los NCs se llevó
a cabo un análisis por espectrometría de masas con plasma acoplado
inductivamente (ICP-MS) para la cuantificación de estos elementos, que
resultaron ser de 0,557 mmol/g Br, 0,0227 mmol/g Cs y 0,0405 mmol/g Pb,
respectivamente. Los resultados muestran una relación Pb:Cs cercana a 2
(0,04 mmol/g y 0,023 mmol/g) lo que podría sugerir que la comp osición de los
NCs es CsPb 2 Br 5 . En cuanto a la relación Br:Pb, la gran proporción de Br con
respecto a Pb, puede atribuirse a la dificultad técnica para determinar las
especies de bromo por ICP-MS, ya que la señal interfiere con el dímero de Ar del
gas plasmógeno y por tanto lleva a una sobreestimación de la cantidad de Br. 33

Los NCs CsPb 2 Br 5 se caracterizan por tener una estructura tetragonal 2D,
donde las capas de Pb 2 Br 5 - están separadas por cationes Cs + . 34 Las propiedades
ópticas intrínsecas de estos NCs han sido objeto de debate durante los últimos
años. Algunos autores descartan emisión de fluorescencia en cristales de
tamaño milimétrico, 35 o nanohojas, 36 mientras que otros trabajos con
nanoplaquetas, 37 y microplacas, 38 atribuyen una fuerte emisión en el verde.
Incluso también se ha registrado emisión azul en microplacas, con un PLQY del
11%. 39 Por otro lado, Li et al sugieren que la fluorescencia verde de las
nanoplaquetas se debe a la coexistencia de NCs de CsPbBr 3 y, en su lugar,
atribuyen a las nanoplaquetas dos picos de emisión a 385 y 460 nm. 40

En base a los resultados obtenidos por ICP-MS puede asumirse que

probablemente se trata de esta estructura, lo que permite proponer el siguiente
mecanismo de formación.

El proceso de transformación está controlado por la intercalación de los

cationes NH 4 + en la estructura, el desplazamiento de los cationes Cs + y de las
especies de oleilamina y la variación del número de coordinación de Pb +2 en
presencia de agua. 41 La Figura 42 y las ecuaciones 1 y 2, ilustran el posible
mecanismo de la evolución de la estructura del nanocristal.

𝑛 𝐶𝑠𝑃𝑏𝐵𝑟3 + 𝑥𝑁𝐻4+ → (𝑛 − 𝑥)𝐶𝑠𝑃𝑏𝐵𝑟3 + 𝑥𝑁𝐻4+ [𝑃𝑏𝐵𝑟3 ]− + 𝑥𝐶𝑠 + (1)

2𝑥𝑁𝐻4+ [𝑃𝑏𝐵𝑟3 ]− + 𝑥𝐶𝑠 + → 𝑥𝐶𝑠𝑃𝑏2 𝐵𝑟5 + 𝑥𝑁𝐻4+ 𝐵𝑟 − + 𝑥𝑁𝐻4+ (2)

123
 Capítulo 3. Estabilización de NCs de perovskita con recubrimiento de sílice mediante la adaptación del proceso sol-gel

Figura 42. Esquema del mecanismo de formación de las NPs core-shell

(CsPb 2 Br 5 @SiO 2 ). El mecanismo implica la difusión e intercalación de los
cationes de NH 4 + en la estructura nativa de CsPbBr 3 (pasos 1-2), exfoliación
de [PbBr 3 ] - en pequeños nanoclusters a través de la interfase tolueno-agua
(paso 3), reorganización en NCs CsPb 2 Br 5 (paso 4) y crecimiento de la
envoltura de sílice (pasos 5 y 6)

En un primer paso, los cationes NH 4 + difunden y pasan a ocupar las

posiciones de los cationes Cs + de la estructura perovskita, dando lugar a
NH 4 PbBr 3 , lo que desencadena cambios en la estructura cristalina.
Paralelamente los cationes NH 4 + desplazan a las especies de oleilamina de la
superficie del NC y, en presencia de moléculas de agua, se desencadena un
proceso de exfoliación de xNH 4 + [PbBr 3 ] - dando lugar a nanoclusters más
pequeños que probablemente se reorganizan en la estructura CsPb 2 Br 5 .
Después, los monómeros de TEOS desprotonados se unen a la superficie del NC
por coordinación con el Pb +2 y condensan en una red uniforme de sílice
alrededor de los NCs de CsPb 2 Br 5. 42

124
 Capítulo 3. Estabilización de NCs de perovskita con recubrimiento de sílice mediante la adaptación del proceso sol-gel

En un experimento adicional se incrementó el tiempo de reacción de 24 a

48 h (Figura 43). Como resultado se formaron core-shell aglomeradas, en cuyo
interior pudieron detectarse, mediante HR-TEM, algunos NCs más grandes
(~7,5 nm) con una distancia entre planos de ~ 0,3 nm, que coincide con el plano
cristalino (220) asociado a la estructura CsPb 2 Br 5 , 39,43 lo que nos permitió
confirmar la formación de esta estructura. El mayor tamaño de los NCs
obtenidos en este último experimento puede ser debido a una etapa de
maduración, en la cual se produce la difusión de los clústeres de NH 4 + [PbBr 3 ] -
en el interior de la envolvente de sílice, y su integración en los NCs de CsPb 2 Br 5 ,
generando núcleos de mayor tamaño.

Figura 43. HR-TEM de NPs core-shell preparadas con 310 µL TEOS, 2 µL NH 4 OH y 28 µL

agua y un tiempo de reacción de 48 h.

Para analizar la estabilidad de las NPs core-shell se dispersaron 5 mg en

5 mL de agua destilada y se sonicaron durante 2 min. Las NPs se mantuvieron
coloidalmente estables tras dispersarse y posteriormente, se midió la PL
durante los primeros 20 minutos y al cabo de 3 días (Figura 44). Con estos
resultados se puede concluir que esta metodología de síntesis da lugar a NPs
core-shell que se mantienen estables en agua, llegando a retener el 90% de su
PL inicial.

125
 Capítulo 3. Estabilización de NCs de perovskita con recubrimiento de sílice mediante la adaptación del proceso sol-gel

Figura 44. (a) Evolución de la intensidad de PL de las NPs core-shell en agua. La

imagen de la esquina demuestra que las NPs se mantienen coloidalmente
estables durante la medida. (b) Variación de la PL relativa con el tiempo

La funcionalización de las NPs de sílice puede llevarse a cabo de forma

sencilla mediante la utilización de organosilanos que contengan los grupos
funcionales deseados. Estos son capaces de anclarse a la superficie mediante la
formación del enlace covalente siloxano (Si-O-Si), producto de la reacción de
hetero-condensación con los grupos silanoles (Si-OH) terminales de la superficie
de las NPs de sílice. 44

Con el fin de funcinoalizar las NPs core-shell previamente sintetizadas, se

trataron con (3-aminopropil)trietoxisilano (APTES), un silano caracterizado por
su alta reactividad promovida por la acción catalítica de su grupo amino ( -NH 2 )
terminal. Por otro lado, las NPs se funcionalizaron con viniltrietoxisilano(VTES),
un silano con grupo vinilo (−CH=CH₂). Los resultados de espectroscopía ATR-
FTIR confirman la correcta funcionalización de las NPs core-shell (Figura 45).

Las NPs core-shell funcionalizadas con (3-aminopropil)trietoxisilano

(APTES) presentan la banda de tensión característica de Si-O-Si (1.050 cm -1 ) y Si-
O-C (780 cm -1 ), así como las bandas de tensión simétrica y asimétrica de CH 2
(2.923 cm -1 y 2.854 cm -1 , respectivamente). La funcionalización de las NPs con
APTES también queda respaldada por la presencia de bandas es pecíficas de los
enlaces N-H (1.579 cm -1 ), C-N (1.590 cm -1 ) y C-N (1.315 cm -1 ). 45,46 La ausencia de
la banda de tensión de NH 2 (3.300-3.400 cm -1 ) puede atribuirse a la formación
de puentes de hidrógeno que resulta en un ensanchamiento del pico, como ya
se observa en el espectro de referencia del APTES. Por otro lado, las NPs core-
shell funcionalizadas con viniltrietoxisilano (VTES) exhiben los rasgos
característicos del grupo vinilo:(ν st (C=C): 1.629 cm -1 ; δ (CH 2 =CH):1.503 cm -1 ; δ
(=CH 2 ): 1.382 cm -1 ). 47
126
 Capítulo 3. Estabilización de NCs de perovskita con recubrimiento de sílice mediante la adaptación del proceso sol-gel

Figura 45. Espectro ATR-FTIR de los alcoxisilanos de referencia (línea marrón) y de las
NPs core-shell funcionalizadas (línea naranja) con (a) APTES y (b) VTES

Por último, como prueba de concepto de su aplicabilidad, se demostró el

potencial de las NPs core-shell como marcadores fluorescentes en un
inmunoensayo directo.

En primer lugar, se prepararon los conjugados de NP con anticuerpos anti-

BSA inmovilizados por adsorción pasiva. Para ello, se incubaron durante toda la
noche una determinada concentración de NPs con anti-BSA en concentraciones
crecientes de (0, 10, 20, 50 y 100 µg/mL). Después, la disolución del conjugado
se añadió a las cubetas de policarbonato previamente tapizadas con proteína
BSA. Tras un período de incubación de 2 h, se lavaron, se añadió 1 mL de agua
destilada y se registró la fluorescencia.

La Figura 46 muestra la señal de PL y la relación señal-ruido para cubetas

incubadas con los conjugados NP/anti-BSA. Los resultados confirman que se
produce el reconocimiento específico del anticuerpo anti-BSA con su diana
(BSA), logrando en el mejor de los resultados una relación señal -ruido de 25
127
 Capítulo 3. Estabilización de NCs de perovskita con recubrimiento de sílice mediante la adaptación del proceso sol-gel

frente a una señal prácticamente nula del blanco, que contiene las NPs sin
conjugar. La disminución de la señal para NPs conjugadas con concentraciones
de anticuerpo anti-BSA superiores a 50 µg/mL posiblemente se deba al
impedimento estérico causado por un exceso de anticuerpos inmovilizados en
la superficie de la nanopartícula. Esto dificulta la accesibilidad de la proteína,
dificultando el biorreconocimiento. 48,49

Figura 46. (a) Esquema del inmunoensayo directo. (b-c) Intensidad de PL y relación
señal-ruido de los conjugados preparados con diferentes relaciones NP
core-shell/anticuerpo. La imagen superior muestra imágenes de las
muestras tratadas con 0 y 20 µg/mL de anti-BSA

Actualmente, existen múltiples trabajos en la bibliografía que adaptan el

proceso sol-gel sobre los NCs de CsPbBr 3 presintetizados. Sin embargo, este
trabajo se diferencia de los anteriores en varios aspectos interesantes.

En primer lugar, cabe resaltar el pequeño tamaño de partícula obtenido

(32 nm), ya que otras aproximaciones generan partículas de mayor diámetro
(170 nm – 1,2 µm) como consecuencia de la agregación de la sílice (Figura 47a-
c1). 13–15 En este caso, al apostar por un procedimiento donde la fuente
precursora de sílice y el catalizador se añaden de forma fraccionada, se favorece
que la deposición de la sílice ocurra de forma más lenta y controlada, dando
lugar a partículas de 32 nm donde solo se encapsulan un par de núcleos de
perovskita (Figura 47d1).

Es cierto que Huang et al tienen control del tamaño de partícula, pudiendo

alcanzar dimensiones similares o incluso inferiores en función del tiempo de
reacción, por ejemplo 10 nm (1h) y 45 nm (4 h) (Figura 47a1). 13 Sin embargo, los
resultados de estabilidad demuestran que el recubrimiento no produce una
mejora sustancial de la estabilidad óptica de los NCs de MAPbBr 3 . En este caso,
128
 Capítulo 3. Estabilización de NCs de perovskita con recubrimiento de sílice mediante la adaptación del proceso sol-gel

la prueba se realiza en condiciones de humedad relativa del 80% (en lugar de

llevarse a cabo en un medio acuoso) y, aun así, la muestra MAPbBr 3 @SiO 2 tan
solo mejora en un 20% con respecto a su control (MAPbBr 3 ) durante las 3
primeras horas (Figura 47a2). En ambos casos, la fluorescencia decae por
completo a las 11 h, por lo que el recubrimiento que genera esta metodología
es poco eficiente de cara a obtener NPs estables en medios acuosos.

Por otro lado, la medida de estabilidad de las micropartículas

CsPbBr 3 @SiO 2 producidas por Wang et al, 14 (Figura 47b2) sugiere cierta mejora
en comparación con los resultados de Huang et al, ya que se mantienen
fluorescentes 12 h en una mezcla 4:1 de tolueno y agua. Sin embargo, el tamaño
micrométrico (1,2 µm) de estas partículas (Figura 47b1) se aleja de las
dimensiones que se consideran adecuadas en bioaplicaciones.

Li et al reducen el tamaño a 150 nm (Figura 47c1), sin embargo, las

imágenes de su dispersión en agua indican que, aunque se mantienen
ópticamente estables, tienden a sedimentar, posiblemente debido a la
agregación de las partículas (Figura 47c2). 15 En este sentido, otro de los
aspectos a destacar de este trabajo es que las NPs se dispersan de forma
homogénea y mantienen una buena estabilidad coloidal en agua ( Figura 47d2).

Figura 47. Comparativa con los resultados de la bibliografía que llevan a cabo
adaptaciones del proceso sol-gel para la estabilización de los NCs de
perovskita en SiO 2 . (1) Imágenes de TEM de las partículas. (2) Medida de
estabilidad. Imágenes reproducidas de (a) Huang et al. J. Am. Chem. Soc.
2016, 138, 18, 5749–5752. (b) Wang et al. ES Materials & Manufacturing,
2019, 4, 66-73, (c) Li et al Nat Commun. 2020, 11, 1192, (d) Este trabajo

129
 Capítulo 3. Estabilización de NCs de perovskita con recubrimiento de sílice mediante la adaptación del proceso sol-gel

También hay trabajos que logran un tamaño de partícula pequeño . Por

ejemplo, Meng et al obtienen una población de NPs de 18 nm, donde el grosor
de sílice es de tan solo 2,6 nm (Figura 48a1). 5 Mientras que las NPs obtenidas
en este trabajo se caracterizan por ser de 32 nm donde un par de núcleos se
encuentran envueltos por una capa de sílice de 12,5 nm (Figura 48c1). Sin
embargo, la medida de estabilidad de las NPs de Meng et al no se realiza en un
medio completamente acuoso, sino en condiciones de humedad del 70% y solo
durante 6 h (Figura 48a2). Tampoco llegan a probar su utilidad en alguna
aplicación, por lo que se queda sin definir el potencial de estas NPs.

Por otro lado, destaca el trabajo de Song et al, donde obtienen NPs
similares mediante la sustitución de oleilamina por APTES durante la síntesis de
hot-injection de NCs de CsPbBr 3 . 20 En comparación con otras metodologías, ésta
es la más rápida, ya que la reacción de hidrólisis y condensación transcurre en
tan solo 30 min, dando lugar a NPs con un grosor de sílice de 4,2 nm (Figura
48b1). Sin embargo, la homogeneidad de la población no queda demostrada, ya
que la imagen de TEM tan solo muestra una partícula y tampoco se presenta el
análisis de la distribución de tamaños. En este caso, la medid a de estabilidad de
las NPs se realiza en una mezcla de tolueno:agua y experimentan una
disminución de la fluorescencia del 50% en las primeras 12 h (Figura 48b2),
frente a una variación de apenas un 10% en 3 días en un medio completamente
acuoso de las NPs producidas en este trabajo (Figura 48c2). Aun así, ambas han
demostrado ser viables en medio de cultivo y en tampón salino,
respectivamente (Figura 48b3 y 48c3).

Según la bibliografía, los NCs de perovskita estabilizados se han utilizado

de forma recurrente en bioimagen. 20,50,51 Sin embargo, hasta ahora, muy pocos
trabajos aportan la estabilidad en tampón salino o demuestran su conjugación
a anticuerpos para su futura implantación como marcadores luminiscentes en
sistemas analíticos o técnicas de bioimagen basadas en inmunotinción. Por
tanto, este trabajo supone un primer avance en lo que se refiere a NCs
estabilizados en sílice, al demostrar su funcionalización y conjug ación a
anticuerpos anti-BSA en tampón fosfato salino pH 7 PBS 10 mM (PBS 1X).

130
 Capítulo 3. Estabilización de NCs de perovskita con recubrimiento de sílice mediante la adaptación del proceso sol-gel

Figura 48. Comparativa con los resultados de la bibliografía que llevan a cabo
adaptaciones del proceso sol-gel para la estabilización de los NCs de
perovskita en SiO 2 . (1) Imágenes de TEM de las partículas. (2) Medida de
estabilidad. (3) Compatibilidad con bioaplicaciones. Imágenes
reproducidas de (a) Meng et al. J. Mater. Chem. C, 2020,8, 17403-17409,
(b) Song et al. Nano Res. 2020, 13, 795–801, (c) Este trabajo

131
 Capítulo 3. Estabilización de NCs de perovskita con recubrimiento de sílice mediante la adaptación del proceso sol-gel

 MÉTODO B. “Síntesis de nanopartículas multicolores

core-shell de CsPbX 3@SiO 2 estables en agua para su
utilización como marcadores fluorescentes en
inmunosensado”

Para esta aproximación, se sintetizaron NCs de Cs 4 PbX 6 (X = Cl/Br, Br y I)

en un ambiente enriquecido en cesio mediante el método hot-injection descrito
por Akkerman et al, 21 con algunas modificaciones. Como resultado, se obtuvo
una disolución transparente de NCs de Cs 4 PbX 6 dispersos en hexano. El espectro
de absorción UV-Vis (Figura 49a) coincide con el descrito en la bibliografía para
cada composición, con picos característicos a 305, 314 y 367 nm para las
composiciones de Cl/Br, Br y I, respectivamente. La Figura 49b incluye la
caracterización morfológica obtenida por TEM, junto con la distribución del
tamaño de los NCs, que resultó ser de 18,97 ± 2,84 nm, 14,83 ± 1,62 nm y 17,59
± 2,99 nm, respectivamente.

Figura 49. (a) Espectro de absorción UV-Vis de los NCs Cs 4 PbX 6 (X= Cl/Br, Br y I). (b)
Imágenes de TEM de los NCs Cs 4 PbX 6 (X= Cl/Br, Br y I) e histogramas de la
distribución del tamaño de partícula.
132
 Capítulo 3. Estabilización de NCs de perovskita con recubrimiento de sílice mediante la adaptación del proceso sol-gel

Para la preparación de las NPs core-shell de CsPbX 3 @SiO 2 se procedió

según la metodología descrita por Li et al (Figura 50). 28 Los NCs de Cs 4 PbX 6 se
silanizaron utilizando TMOS parcialmente hidrolizado (PH TMOS). Los grupos
silanoles se adhieren a la superficie de los NCs, reemplazando a los ligandos
nativos de la superficie, de forma que en este punto ya introducen semillas de
crecimiento para la red de SiO 2 . En un segundo paso, se añadió TMOS y agua
para desencadenar simultáneamente la transformación de los NCs 0D de
Cs 4 PbX 6 a 3D de CsPbX 3 mediante el desprendimiento de CsX y el proceso de
condensación de la sílice sobre la superficie de los NCs transformados, dando
lugar a NPs de CsPbX 3 @SiO 2 .

Figura 50. Mecanismo de formación de las NPs core-shell CsPbX 3 @SiO 2 a partir de la
transformación de NCs de Cs 4 PbX 6 en presencia de una interfase hexano-
agua

Considerando que la concentración de partida de los NCs de Cs 4 PbX 6 es un

parámetro clave para poder reproducir la metodología, se procedió a
determinar su concentración óptima probando diluciones seriadas a partir de
las siguientes concentraciones: 14,4 mg/mL, 25,7 mg/mL y 17,6 mg/mL Cs 4 PbX 6
(X = Cl/Br, Br y I), respectivamente.

La Tabla 8 resume las características de las partículas core-shell producidas

a partir de distintas concentraciones del material precursor. En ella no se
incluyen las concentraciones más altas, ya que se trata de poblaciones muy
heterogéneas. Por ejemplo, la muestra más concentrada de Cs 4 Pb(Cl x Br 6-x ) (14,4
mg/mL) contiene cubos de 9 nm, cristales hexagonales de 60 nm y esferas de
8 nm con núcleo inapreciable. En el caso de Cs 4 PbBr 6 (25,7 mg/mL) ocurre lo
mismo, incluso a una concentración de 6,4 mg/mL, se generan nanoplaquetas
de 23 nm de largo y esferas de 23 nm sin un núcleo apreciable. Finalmente, en
el caso de Cs 4 PbI 6 es necesario reducir aún más la concentración para
aproximarse a muestras más homogéneas (2,2 mg/mL).
133
 Capítulo 3. Estabilización de NCs de perovskita con recubrimiento de sílice mediante la adaptación del proceso sol-gel

Tabla 8. Características de las NPs core-shell CsPbX 3 @SiO 2 obtenidas a partir de

distintas concentraciones de NCs de Cs 4 PbX 6
[NCs] λem Fwhm Tamaño Tamaño Núcleos/partícula
(mg/mL) (nm) (nm) de del
partícula núcleo
(nm) (nm)
Cs 4 Pb(Cl x Br 6 - x ) 7.2 483 26 30 11 1
3.6 486 20 32 3 1
1.8 486 19 32 3 1
0.9 490 19 32 - -
Cs 4 PbBr 6 3.2 506 22 22 4 1
1.6 509 22 25 2 2
Cs 4 PbI 6 2.2 689 33 33 2 5
1.1 692 38 15 - -

Las imágenes de la izquierda de la Figura 51 muestran los resultados de

TEM para tres concentraciones representativas de cada composición, mientras
que a la derecha se muestra la intensidad de fluorescencia (PL) para la longitud
de emisión máxima alcanzada para diferentes concentraciones de cada
composición.

De los resultados de TEM, se puede concluir que, independientemente de

la composición del haluro, cuando la concentración de los NCs de Cs 4 PbX 6 es alta
se obtiene una población heterogénea, entre la que se incluyen cristales de
diferentes tamaños y formas sin un recubrimiento apreciable. Esta población
desaparece a medida que la concentración de NCs precursores disminuye,
aproximándose a las condiciones que mejoran la eficiencia de recubrimiento,
dando lugar a NPs donde los NCs CsPbX 3 se localizan en el núcleo de las esferas
de sílice. Sin embargo, cuando la concentración es crítica, estas NPs son
minoritarias frente a la prevalencia de nanoesferas de sílice vacías.

Los resultados de PL muestran una tendencia similar, el pico de emisión de

fluorescencia de la concentración más alta está desplazado hacia la izquierda,
mientras que se mantiene estable en concentraciones inferiores, pudiendo ser
indicativo de una mayor homogeneidad en las muestras.

134
 Capítulo 3. Estabilización de NCs de perovskita con recubrimiento de sílice mediante la adaptación del proceso sol-gel

Figura 51. Caracterización por TEM de las NPs CsPbX 3 @SiO 2 a partir de las siguientes
concentraciones de NCs de Cs 4 Pb(Cl x Br 6-x ): a) 14,4, b) 7,2, c) 3,6 mg/mL;
Cs 4 PbBr 6 : d) 6,4, f) 3,2 y g) 1,6 mg/mL; Cs 4 PbI 6 : i) 8,8, j) 2,2 y k) 1,1 mg/mL.
Intensidad de fluorescencia para el máximo de emisión para diferentes
concentraciones de NCs precursores (d, h y l)

Como concentraciones óptimas se seleccionaron aquellas con las que se

obtuvieron NPs core-shell más uniformes y en mayor proporción, siendo
7,2 mg/mL, 3,2 mg/mL y 2,2 mg/mL Cs 4 PbX 6 (X = Cl/Br, Br y I), respectivamente.
La Figura 52 muestra los espectros de absorción/emisión y las imágenes de TEM
de las NPs resultantes. La Tabla 9 aporta información sobre el máximo de
emisión, fwhm, PLQY, tamaño medio de partícula, tamaño del núcleo y número
de núcleos/partícula.

135
 Capítulo 3. Estabilización de NCs de perovskita con recubrimiento de sílice mediante la adaptación del proceso sol-gel

Figura 52. Caracterización óptica y estructura de las NPs de CsPbX 3 @SiO 2 . (a)
Espectro de absorción UV-Vis y de emisión de PL (λ ex 355 nm). Imágenes de
TEM a (b) menor y (c) mayor resolución e (d) histograma de la distribución
del tamaño de partícula

De esta información, cabe destacar que las NPs core-shell tienen un

tamaño de partícula pequeño (20-30 nm), su emisión es estrecha (fwhm de 26-
33 nm) y el PLQY alcanza valores moderados: 18% para CsPb(Cl x Br 3-x )@SiO 2 y
57% para CsPbBr 3 @SiO 2 . Estos valores son ligeramente superiores frente a los
de sus análogos sin recubrir (10% y 43%, respectivamente), lo que indica que la
sílice puede estar contribuyendo a pasivar los defectos de superficie. Jiang et al
también describieron un aumento del PLQY (de 53% a 84%) en NCs de CsPbBr 3
tras su encapsulación en NPs de SiO 2 . 52
136
 Capítulo 3. Estabilización de NCs de perovskita con recubrimiento de sílice mediante la adaptación del proceso sol-gel

En la Tabla 9 pueden compararse estos resultados con otros trabajos de

síntesis de NPs core-shell basados en la transformación de Cs 4 PbX 6 . No se incluye
el trabajo de Hu et al, por tratarse de heteroestructuras Janus, 27 ni tampoco el
de Park et al, 29 porque se trata de un gran aglomerado de sílice. Por tanto, este
es el único trabajo que explora composiciones más allá de la habitual
composición de bromo, lo que permite obtener NPs de varios colores, que
emiten en el azul, verde y rojo. De la comparativa recogida en la Tabla 9, el
trabajo de Rossi et al, genera partículas core-shell de menor tamaño (17 nm),
sin embargo, su PLQY es inferior (8%). 1 Por otro lado, Li et al alcanzan un valor
de PLQY más alto (65%), pero el tamaño de la partícula es superior (60 nm). 28

Tabla 9. Propiedades de las NPs core-shell CsPbX 3 @SiO 2 (X = Cl/Br, Br y I) a partir

de las concentraciones seleccionadas: 7,2, 3,2 y 2,2 mg/mL de NCs de
Cs 4 PbX 6 , respectivamente. Comparación con otros trabajos de la
bibliografía basados en la transformación de Cs 4 PbX 6 .
NPs Emisión Fwhm PLQY Tamaño Tamaño Núcleos/partícula Ref.
máx (nm) (%) de del
(nm) partícula núcleo
(nm) (nm)

CsPb(Cl x Br 3 - x )@SiO 2 492 26 18 30,06 ± 11,62 ± 1 Este

2,98 2,1 trabajo

CsPbBr 3 @SiO 2 506 22 57 22,15 ± 4,26 ± 1 Este

1,94 0,9 trabajo

CsPbI 3 @SiO 2 689 33 N.D* 33,89 ± 2,05 ± 5 Este

4,82 0,46 trabajo

CsPbBr 3 @SiO 2 521 16 65 60 12,25 1 28

CsPbBr 3 @SiO 2 507 20 8 17 10 1 1

*No se describe. El PLQY no se determinó debido a la baja estabilidad de la composición de

yodo.

Una de las principales consecuencias del proceso de la transformación

desencadenada en presencia de agua es la reducción del tamaño del NC original
debido al desprendimiento de CsX. 22,27,28 En el trabajo de Li et al, los NCs pasan
de 14,5 nm (Cs 4 PbBr 6 ) a 12,25 nm (CsPbBr 3 ), mientras que, en nuestro caso
sufren una reducción de 10 nm, aun partiendo de un tamaño de cristal similar
(14,8 nm). 28 Esta diferencia significativa sugiere que, en nuestra metodología,
aun siendo una adaptación del método de Li et al, el proceso de degradación de
los NCs ocurre en mayor extensión.

Es también relevante la correlación entre la naturaleza del haluro y el

tamaño del núcleo. Por ejemplo, asumiendo que no hay grandes diferencias en

137
 Capítulo 3. Estabilización de NCs de perovskita con recubrimiento de sílice mediante la adaptación del proceso sol-gel

el tamaño de los NCs precursores (~ 17 nm) los núcleos en la composición de

yodo son más pequeños que los de la composición de bromo y la composición
mixta (2, 4 y 8 nm, respectivamente).

Este comportamiento señala que los NCs son susceptibles a la degradación,

y en consecuencia este proceso afecta en mayor medida a la composición de
yodo, que por defecto es la menos estable debido a su tendencia a
transformarse en la fase amarilla a temperatura ambiente. 18,53

Para evaluar la estabilidad estructural, se midió la PL de las NPs core-shell

y de su respectivo control (NCs transformados sin recubrir) durante 4 días. Para
que fueran comparables, se prepararon disoluciones en hexano a una misma
concentración tomando como referencia el mismo valor de absorbancia a
310 nm (Figura 53).

La intensidad de PL disminuye más rápido para los NCs control que para
los NCs encapsulados. Los NCs de CsPb(Cl x Br 3-x ) sufren una caída del 75% y su
emisión se desplaza desde 488 nm a 458 nm 4 días después, lo que sugiere que
durante este tiempo la estructura continúa sufriendo cambios hasta que se
enriquece la proporción de Cl frente a la de Br. Sin embargo, las NPs de
CsPb(Cl x Br 3-x )@SiO 2 , mantienen su emisión prácticamente constante (solo se
desplaza 7 nm), lo que indica que la envoltura ofrece mayor estabilidad
estructural al nanocristal.

De forma análoga, en los NCs de CsPbBr 3 , la PL desaparece prácticamente

al día siguiente, mientras que las NPs de CsPbBr 3 @SiO 2 mantienen intacta su
fluorescencia 4 días después. Estos resultados confirman de nuevo el papel
beneficioso del recubrimiento de SiO 2 , que dota a los NCs de cierta estabilidad
estructural frente a las condiciones ambientales, excepto en el caso de las
muestras compuestas por yodo, donde ambas muestras se degradan
rápidamente.

A pesar de que las NPs de CsPbX 3 @SiO 2 tienen cierta estabilidad

estructural en el medio de reacción (hexano y trazas de agua), al añadir etanol
la fluorescencia desaparece rápidamente. Esto implica que el recubrimiento aun
es permeable a la difusión de moléculas polares que desencadenan la
descomposición de los NCs.

138
 Capítulo 3. Estabilización de NCs de perovskita con recubrimiento de sílice mediante la adaptación del proceso sol-gel

Figura 53. Espectro de emisión (λ ex 355 nm) de (a,c,e) los NCs control y (b, d, f) las
NPs core-shell. Las muestras se prepararon a una misma concentración,
tomando como referencia el valor de absorbancia a 310 nm.

139
 Capítulo 3. Estabilización de NCs de perovskita con recubrimiento de sílice mediante la adaptación del proceso sol-gel

Esta es una cuestión donde los trabajos de referencia no profundizan. Por

ejemplo, Hu et al realizan un seguimiento de la PL en el medio de reacción
(hexano/agua), pero esto no determina cómo se comportan directamente en
agua. 27 Li et al llevan a cabo la medida en presencia de un 10% de etanol. 28 Sus
resultados indican que son estables, al contrario que en este caso, posiblemente
porque su envoltura de sílice es más gruesa. Aun así, el seguimiento de la PL
solo se registra durante los primeros 30 min, tiempo que es insuficiente para
determinar cómo de estables son las NPs de cara a utilizarlas en bioaplicaciones.

Por otro lado, Rossi et al, 1 claramente señalan que el recubrimiento de SiO 2
que generan no es lo suficientemente compacto para estabilizar a los NCs. En su
lugar, recurren a un tratamiento adicional de pasivación con PbBr 2 que
combinan con una segunda etapa de deposición de sílice para aumentar el grado
de entrecruzamiento de la sílice.

En nuestro caso, para aumentar la resistencia al agua, se optó por un

tratamiento térmico hasta alcanzar los 565 °C para cerrar los poros en partículas
de sílice mesoporosa. 54 En estas condiciones, los poros comienzan a colapsar y
dan lugar a una red compacta de sílice.

La Figura 54 muestra los resultados de la caracterización de las partículas

tras el tratamiento térmico y su estabilidad al dispersarlas completamente en
agua.

A pesar de que en ambos casos se obtienen partículas fluorescentes y

estables en agua durante 3-4 días, la caracterización de las muestras señala que
las NPs sufren importantes cambios durante este proceso.

En primer lugar, su morfología pasa de una población monodispersa de NPs

a grandes aglomerados de sílice con múltiples núcleos embebidos,
especialmente en la composición mixta de Cl/Br, donde no es posible distinguir
una partícula de otra.

En segundo lugar, cambian sus propiedades ópticas tras el tratamiento

térmico. En el caso de la composición mixta, su espectro de emisión es un pico
ancho centrado en 500 nm, que con el tiempo evoluciona hacia un pico más
intenso y asimétrico, localizado a 513 nm. Esto puede indicar que la estructura
se reorganiza hacia una composición enriquecida en Br como consecuencia de
la difusión de los iones Cl. Por otro lado, el espectro de emisión de la
composición de Br muestra un pico asimétrico centrado en 480 nm, que se aleja
de su emisión original a 506 nm.

140
 Capítulo 3. Estabilización de NCs de perovskita con recubrimiento de sílice mediante la adaptación del proceso sol-gel

Es necesario un estudio en mayor profundidad del proceso para poder dar

una explicación a todos los cambios producidos como consecuencia del
tratamiento térmico. Como alternativa, sería interesante probar una
combinación de sales inorgánicas (KNO 3 , NaNO 3 y KBr) que selle los poros a una
temperatura de calcinación inferior (320-350 °C), ya que posiblemente conserve
la individualidad de las partículas y propiedades ópticas originales. 55,56

Finalmente, con el fin de determinar la viabilidad de estas partículas como

marcadores fluorescentes, se desarrolló, como prueba de concepto, un
inmunoensayo directo (Figura 55), para el reconocimiento de Omalizumab
(αIgE), un anticuerpo utilizado para el tratamiento de asma severa.

Figura 54. (a y d) Imágenes de TEM de las muestras calcinadas de

CsPb(Clx/Br 3- )@SiO 2 y CsPbBr 3 @SiO 2 , respectivamente. (b y e) Seguimiento
de la intensidad máxima de PL con el tiempo de las muestras calcinadas
dispersas en agua. (c y f) Evolución de los espectros de emisión de
fluorescencia con el tiempo.

Para ello, las NPs se conjugaron al αIgE mediante adsorción pasiva. Por
otro lado, en una placa multipocillo negra se tapizó el receptor específico del
omalizumab (5 mg/L). Como control negativo, los pocillos se tapizaron con
ovoalbúmina (5 mg/L). Posteriormente, se añadió el conjugado (NPs -αIgE) y se
dejó incubar durante 1 h a 25 °C. Tras realizar varios lavados, se obtuvo el
espectro de PL con un lector de placas.

141
 Capítulo 3. Estabilización de NCs de perovskita con recubrimiento de sílice mediante la adaptación del proceso sol-gel

La Figura 55 muestra la relación señal-ruido y los espectros de PL. Estos

resultados confirman el reconocimiento específico del anticuerpo con su
receptor, con una relación señal-ruido de 10.000 y 30.000 para los anticuerpos
marcados con las NPs estabilizadas de CsPb(Cl x Br 3-x ) y CsPbBr 3 , respectivamente.
Los controles, muestran una señal de PL prácticamente nula, lo que revela la
excelente selectividad del ensayo.

Figura 55. (a) Esquema del evento de inmunoreconocimiento fluorogénico (b)

Relación señal-ruido y (c) espectro de PL. En negro, la señal del Control
negativo

Como se ha mencionado en la introducción de este capítulo, el número de

publicaciones que aprovecha la transformación de los NCs de Cs 4 PbBr 6 en
combinación con el proceso sol-gel es limitado, por lo que este trabajo
constituye una valiosa aportación a este campo.

Por ejemplo, las metodologías desarrolladas para la obtención de NPs core-

shell únicamente se centran en la composición de Br, por ser la más estable. Sin
embargo, teniendo en cuenta que hay un gran interés en el desarrollo de
marcadores de perovskita multicolores para su implantación en multiplexado,
es necesario comprobar si las metodologías de síntesis de NPs core-shell
actuales son compatibles con otras composiciones de haluro, permitiendo así
ampliar la gama de colores.

142
 Capítulo 3. Estabilización de NCs de perovskita con recubrimiento de sílice mediante la adaptación del proceso sol-gel

Precisamente, este trabajo extiende la metodología de Li et al, 28 para

obtener NPs basadas en Br, I y Cl/Br (Figura 56a). Además, profundiza en el
estudio de optimización para cada composición, a partir de su caracterización
óptica y morfológica, análisis de dispersión de tamaños y seguimiento de su
estabilidad estructural.

Es cierto que Hu et al, 27 incluyen hasta cuatro composiciones: Br, I, Cl/Br y

Br/I. Sin embargo, se trata de heteroestructuras de tipo Janus, donde la sílice se
deposita de forma asimétrica (Figura 56b) y solo ofrecen información acerca de
la estabilidad estructural de la composición de bromo en una mezcla de hexano
y agua. Por otro lado, Park et al, 29 también aplican su metodología con
composiciones mixtas de Cl/Br y de Br/I dopada con Mn, pero obtienen grandes
aglomerados de escasa utilidad para las aplicaciones que se persiguen en esta
tesis (Figura 56c).

Figura 56. NPs multicolores de CsPbX 3 @SiO 2 producidas a partir de la transformación

de Cs 4 PbX 6 en combinación con el proceso sol -gel según (a) este trabajo
(b) Huang et al. J. Am. Chem. Soc. 2018, 140, 406−412 (c) Par k et al.
Nanoscale, 2019,11, 18739-18745

143
 Capítulo 3. Estabilización de NCs de perovskita con recubrimiento de sílice mediante la adaptación del proceso sol-gel

Otro de los aspectos interesantes de este trabajo es que, en comparación

con los otros dos trabajos de obtención de NPs core-shell basados en la
transformación de Cs 4 PbBr 6 , 1,28 obtiene un balance adecuado entre tamaño de
partícula pequeño (22 nm) y alto valor de PLQY (57%). Además, proporciona una
medida de la estabilidad de las partículas completamente dispersas en agua de
la composición de Br y Cl/Br durante 3-4 días tras la aplicación de un tratamiento
térmico (Figura 57a1). Mientras que en los trabajos de Li et al, 28 (Figura 57b1)
y Rossi et al, 1 (Figura 57c1) la prueba de estabilidad se lleva a cabo en una
mezcla de tolueno o hexano con etanol y no se llega a demostrar su
compatibilidad con bioaplicaciones.

Finalmente, este trabajo busca evidenciar el potencial de las NPs de

perovskita como marcadores fluorescentes para el desarrollo de test basados
en inmunoensayos mediante una prueba de concepto. En concreto, se lleva a
cabo un ensayo directo que demuestra la posibilidad de marcar el anticuerpo
Omalizumab (αIgE) con las NPs de Cl/Br o de Br (Figura 57a2). El conjugado es
estable en tampón salino e informa de la interacción específica entre el
anticuerpo y su receptor. Esto supone un primer paso hacia el marcaje
multicolor para ensayos multiplex, los cuales demandan NPs con tamaño
reducido, alto PLQY, emisión estrecha y sintonizable en la región visible sin que
sus espectros solapen entre sí.

Figura 57. NPs core-shell de CsPbBr 3 @SiO 2 producidas por la transformación de

Cs 4 PbBr 6 . (1) Prueba de estabilidad de las NPs en agua o mezclas de
disolvente orgánico y disolvente polar (2) Compa tibilidad con
bioaplicaciones. (a) Este trabajo). (b) Li et al. Nanoscale, 2021, 13, 3860.
(c) Rossi et al. Chem. Mater. 2022, 34, 1, 405–413
144
 Capítulo 3. Estabilización de NCs de perovskita con recubrimiento de sílice mediante la adaptación del proceso sol-gel

3.3. Conclusiones

En este capítulo se han desarrollado dos metodologías de síntesis de NPs

core-shell para la estabilización de NCs de perovskita con un recubrimiento de
sílice.

La primera estrategia (MÉTODO A) proporciona una metodología que busca

suavizar las condiciones del proceso sol-gel mediante la adición fraccionada de
TEOS, amoníaco y agua a una disolución que contiene los NCs de CsPbBr 3 en
tolueno.

Este método permite retrasar la descomposición de los NCs de CsPbBr 3 , sin

embargo, induce un proceso de transformación estructural que altera las
propiedades ópticas del nanocristal. En su lugar, el material encapsula do en las
NPs de sílice consiste en núcleos de 2-3 nm de CsPb 2 Br 5 que emiten una tenue
fluorescencia azul (λ em 430 nm y PLQY 5%).

Una de las ventajas de esta metodología es la reproducibilidad con que se

genera una población monodispersa y luminiscente de NPs core-shell (32,07 ±
2,94 nm) que pueden dispersarse homogéneamente en agua y en tampón salino,
exhibiendo una buena estabilidad coloidal y óptica durante al menos 3 días,
reteniendo cerca de un 90% de la intensidad de fluorescencia inicial.

Además, las NPs core-shell pueden funcionalizarse de forma sencilla

mediante un tratamiento post-sintético con alcoxisilanos con grupos amino y
vinilo. Por otro lado, como prueba de concepto se ha explorado el potencial de
las NPs en inmunomarcaje, concretamente a partir de un ensayo directo con la
proteína diana inmovilizada (BSA) demostrando que el anticuerpo anti -BSA
puede marcarse fluorescentemente con las NPs por adsorción pasiva, lo que
constituye un primer paso hacia la utilización de los NCs de perovskita en
inmunosensado.

Siendo conscientes del bajo PLQY (5%), es necesario continuar optimizando

el proceso para preparar NPs que mantengan la estructura nativa del nanocristal
y con ello sus propiedades ópticas intactas, ya que la baja eficiencia de emisión
limitaría la sensibilidad en el caso de implantarse como marcadores
luminiscentes en un sistema analítico.

Asumiendo que el amoniaco es el detonante del proceso de

transformación, una posibilidad es sustituirlo por L-lisina o L-arginina, ya que

145
 Capítulo 3. Estabilización de NCs de perovskita con recubrimiento de sílice mediante la adaptación del proceso sol-gel

estos aminoácidos son capaces de catalizar la hidrólisis del TEOS, 57 y a la vez

actuar como ligandos que estabilizan los NCs de CsPbBr 3. 58,59

La segunda estrategia (MÉTODO B) emplea la transformación de NCs

Cs 4 PbX 6 en CsPbX 3 en presencia de agua en combinación con el proceso sol-gel
para la síntesis de NPs core-shell.

Este trabajo se suma a la metodología descrita por Li et al, 28 aportando

algunas novedades. Entre ellas, la expansión a otras composiciones, lo que
permite sintonizar el color de la emisión desde 480 a 690 nm, en función de la
composición del haluro.

Además, evalúa el efecto que tiene la concentración inicial de los NCs de

Cs 4 PbX 6 , concluyendo que juega un papel crucial a la hora de conseguir una
distribución monodispersa de NPs core-shell.

Se han determinado las concentraciones óptimas para cada una de las

composiciones Cs 4 PbX 6 (X = Cl/Br, Br y I), resultando en NPs core-shell que
exhiben un tamaño de partícula pequeño (20-30 nm), un PLQY moderado (18-
57%) y una emisión estrecha (fwhm 20-30 nm), siendo características adecuadas
para su conjugación a biomoléculas y utilización como marcadores para
detección fluorescente en ensayos de multiplexado.

El recubrimiento de sílice sobre los NCs de la composición mixta y la de

bromo confiere estabilidad estructural en el medio de reacción (hexano y tr azas
de agua) al menos durante 4 días.

Adicionalmente, se demuestra que, mediante un tratamiento térmico es

posible estabilizar completamente las NPs en agua y tampón salino, lo que
permite su conjugación a Omalizumab (IgE). En el inmunoensayo directo, la
señal fluorescente del anticuerpo marcado informa del reconocimiento
específico con su receptor, siendo un resultado preliminar que demuestra el
potencial que pueden tener los NCs de perovskita en el desarrollo de ensayos
multiplex basados en detección simultánea multicolor.

La continuidad de esta investigación debe pasar necesariamente por dos

cuestiones para perfeccionar la metodología. Primero, reducir el contenido de
nanoesferas vacías, ya que disminuyen la eficiencia de marcaje y por tanto la
sensibilidad del ensayo. Segundo, buscar alternativas al tratamiento térmico
como solución para asegurar la completa estabilidad de las NPs en agua, ya que
promueve su agregación y posiblemente cambios estructurales que afectan a
sus propiedades ópticas. Una posibilidad es generar un recubrimiento de sílice
adicional, pero esto aumentaría las dimensiones de la partícula. Otra posibilidad

146
 Capítulo 3. Estabilización de NCs de perovskita con recubrimiento de sílice mediante la adaptación del proceso sol-gel

es combinar un tratamiento térmico con sales, ya que esta estrategia ha

funcionado con anterioridad en trabajos previos encontrados en la bibliografía
para al sellado de los poros de partículas mesoporosas sin producir cambios en
su morfología o propiedades ópticas. 55,56

En resumen, en este capítulo se han desarrollado dos metodologías

distintas que contribuyen al estado del arte centrado en la generación de
recubrimientos de sílice a partir de NCs de CsPbBr 3 y de la transformación de los
NCs de Cs 4 PbX 6 durante el proceso sol-gel. El objetivo del proceso de
optimización en ambos casos ha sido el mismo, desarrollar nanopartículas
basadas en perovskita de pequeño tamaño (20-30 nm), coloidalmente estables
en agua y en tampón salino, siendo estos los requisitos previos para implantarlas
en un futuro como marcadores luminiscentes en sistemas analíticos.

La Tabla 10 muestra los resultados obtenidos en esta tesis frente a los

trabajos más representativos de estabilización de NCs de perovskita con un
recubrimiento de sílice mediante la adaptación del proceso sol -gel.

Tabla 10. Resultados de estabilización de NCs de LHP por un recubrimiento de sílice mediante la
adaptación del proceso sol-gel
Material Composición Tamaño PLQY Estabilidad Aplicación Alcoxisilano Tiempo de Ref.
precursor (nm) (%) en agua silanización
Sales CsPbBr 3 /Cs 4 PbBr 6 @SiO 2 200 84,5 N.D. Tintas APTES 12 h 60

precursoras
CsPbBr 3 @SiO 2 16,8 90 40 min N.D. TMOS 2h 6

CsPbBr 3 @SiO 2 100 10 N.D. Bioimagen TMOS 2h 50

CsPbBr 3 @SiO 2 20-40 72 N.D. Bioimagen APTMS 4h 51

NCs MAPbBr 3 @SiO 2 10-450 89 N.D. N.D. TMOS 1-36 h 13

CsPbBr 3
CsPbBr 3 @SiO 2 1,2 µm N.D. N.D. N.D. TMOS 48 h 14

CsPbBr 3 @SiO 2 170 78 20 días Láser MPTMS 32 h 15

CsPbBr 3 @SiO 2 18 82 N.D. N.D. TMOS/TEOS 5 h 5

CsPbBr 3 @SiO 2 20 N.D. N.D. Bioimagen APTES 30 min 20

CsPb 2 B r 5 @SiO 2 36,1 5 3 días Inmunomarcaje TEOS 32 h M É T O DO

A

CsPbBr 3 @SiO 2 20 84 4 días LEDs TEOS 30 min 52

NCs CsPbBr 3 @SiO 2 23,9 80 N.D. LEDs TMOS 12 h 27

Cs 4 PbBr 6
CsPbBr 3 @SiO 2 60 65 N.D. N.D. TMOS 15 h 28

CsPbBr 3 @SiO 2 @SiO 2 17 8 N.D. N.D. TMOS 40 h 1

CsPbBr 3 @SiO 2 22 57 3 días* tto. Inmunomarcaje TMOS 15 h M É T O DO

térmico B

APTES: 3-aminopropiltrietoxisilano · MPTMS: (3-mercaptopropil)trimetoxisilano · TEOS: tetraetilortosilicato · TMOS:

tetrametilortosilicato

147
 Capítulo 3. Estabilización de NCs de perovskita con recubrimiento de sílice mediante la adaptación del proceso sol-gel

3.4. Materiales y Métodos

 MÉTODO A. Nanopartículas core-shell monodispersas de

CsPb 2 Br 5 como marcadores fluorescentes en
inmunosensado

Reactivos

Carbonato de cesio (Cs 2 CO 3 , 99,9%, Sigma Aldrich), Bromuro de plomo

(PbBr 2 , ≥98%, Sigma Aldrich), 1-octadeceno (ODE, 90% grado técnico, Sigma
Aldrich), Ácido oleico (OA, grado técnico 90 %, Alfa Aesar), Oleilamina (OAm,
contenido C18 80-90%, Sigma Aldrich) Tolueno (Scharlab), Tetraetil ortosilicato
(TEOS, 98%, Scharlab), (3-aminopropil) trimetoxisilano (APTES, 95%, Fisher),
viniltrietoxisilano (VTES, 97%, Sigma-Aldrich). Anticuerpo IgG anti-albúmina de
suero bovino (αBSA) producido en conejo (SAB4301142, Sigma-Aldrich).

Síntesis de NCs CsPbBr 3

Preparación del oleato de cesio. En un matraz de 50 mL de dos bocas se

añadieron 205 mg de Cs 2 CO 3 y se aplicaron condiciones de vacío durante 10 min.
Posteriormente, se añadieron 10 mL de octadeceno (ODE) y 0,62 mL de ácido
oleico (OA) y se aplicaron condiciones de vacío, agitación magnética y
temperatura de 120 °C. Cuando el Cs 2 CO 3 se disolvió completamente, se subió
la temperatura a 150 °C y, tras alcanzar esta temperatura, se atemperó la
reacción hasta temperatura ambiente.

Síntesis de NCs de CsPbBr 3 . Los NCs se sintetizaron según Protesescu et

al. 10
En un matraz de 4 bocas de 100 mL se añadieron 138 mg de PbBr 2 , 10 mL
de ODE y 1 mL de OA. Se aplicó vacío y se subió la temperatura a 120 °C durante
45 min. Después, bajo atmósfera inerte (Ar), se inyectó 1 mL de o leilamina y se
incrementó la temperatura a 170 °C. Al alcanzar los 165 °C se inyectó
rápidamente el Cs-OA previamente calentado (> 100 °C). Tras 10 s, se detuvo la
reacción colocando el matraz en un baño de hielo.

Para la purificación de los NCs, se añadieron 25 mL de tolueno y la

disolución se centrifugó a 6.654 rcf durante 10 min. El sedimento se dispersó en
25 mL de tolueno y se centrifugó de nuevo a 10.397 rcf durante 10 min y
finalmente, se recolectó el sobrenadante conteniendo los NCs de CsPbBr 3 . La
concentración de NCs de CsPbBr 3 de la disolución stock se calculó de acuerdo al
trabajo de Maes et al. 61
148
 Capítulo 3. Estabilización de NCs de perovskita con recubrimiento de sílice mediante la adaptación del proceso sol-gel

Síntesis de NPs core-shell

Las muestras se prepararon en viales de vidrio. A cada una se le añadieron

0,5 mL de la disolución stock de NCs de CsPbBr 3 , 2 µL de NH 4 OH 25% (diluido en
un determinado volumen de agua) y TEOS, agitando la mezcla a 300 rpm. En el
caso de las muestras F-J la adición se realizó de forma fraccionada a una
velocidad de 0,74 µL/min y 0,07 µL/min para TEOS y NH 4 OH, respectivamente.
Las muestras se incubaron durante toda la noche en condiciones de agitación
magnética. Posteriormente se sonicaron con Sonorex Super, (Bandelin Co.
Germany) a una frecuencia de 50/60 Hz durante 15 min y se centrifugaron a
7.500 rcf durante 5 min. El sedimento se dispersó en 1 mL de tolueno y se
sonicaron una vez más durante 30 min. La Tabla 11 detalla las condiciones de
preparación de las distintas muestras (A-J).

Tabla 11. Preparación de las muestras A-J

Muestra TEOS NH 4 OH H2O Velocidad de adición Velocidad de adición
(µL) (25%) (µL) (µL) TEOS (µL/min) NH 4 OH (µL/min)
A 60 2 0 - -
B 310 2 0 - -
C 480 2 0 - -
D 960 2 0 - -
E 1440 2 0 - -
F 310 2 0 0,74 0,07
G 310 2 28 0,74 0,07
H 310 2 90 0,74 0,07
I 480 2 28 0,74 0,07
J 960 2 28 0,74 0,07

Funcionalización de NPs core-shell

Para obtener NPs funcionalizadas, se trataron con 20 µL de (3-

amonopropil) trietoxisilano (APTES) o viniltrietoxisilano(VTES). Después de lavar
y eliminar el exceso de reactivos por centrifugación a 7.500 rcf durante 5 min,
se realizó el análisis de las muestras y de los controles (APTES/VTES) por
espectroscopía ATR-FTIR.

149
 Capítulo 3. Estabilización de NCs de perovskita con recubrimiento de sílice mediante la adaptación del proceso sol-gel

Inmunoensayo

Preparación de los conjugados (NP core-shell/anticuerpo). El anticuerpo

IgG anti-albúmina de suero bovino (αBSA) se conjugó con las NPs core-shell por
adsorción pasiva. Para ello, 5 mg de las NPs se dispersaron en 1 mL de
concentraciones crecientes de αBSA (0-100 µg/mL) y se incubó durante toda la
noche en condiciones de agitación magnética a 4 °C.

Inmunoensayo directo. Este ensayo se llevó a cabo utilizando cubetas de

policarbonato. Para ello, se tapizaron previamente con 1 mL de proteína BSA
(500 µg/mL) en tampón fosfato salino (pH = 7) y se incubaron durante toda la
noche a 4 °C. Después, se lavaron las cubetas con tampón fosfato salino 10 mM,
150 mM NaCl, 0,05% Tween 20%, pH 7 (PBS-T) y agua y se incubaron durante 2 h
con el conjugado. Por último, las cubetas se lavaron con PBS -T y agua y se
registró la fluorescencia con el espectrofluorímetro.

Métodos de caracterización

El espectro de absorción UV-vis se registró con un espectrofotómetro

Agilent 8453 (Agilent Technologies) y un espectro de emisión de fluorescencia
con el espectrofluorímetro PTI QMA4 (Horiba) (λ ex = 480 nm). El PLQY de las NPs
core-shell se determinó utilizando como estándar sulfato de quinina en H 2 SO 4
0.5 M (Φ = 0,54) para una longitud de onda de excitación de 310 nm.

Las imágenes de TEM se tomaron con los microscopios electrónicos de

transmisión de 100 kV (JEM-1400, Flash) y 200 kV con detector de rayos-X (JEM
2100F, JEOL). La distribución del tamaño de partícula se representó con formato
de histograma a partir de las medidas del tamaño de partícula, obtenidas con el
programa ImageJ sobre las imágenes de TEM. Las fotografías de los viales se
tomaron bajo lámpara UV (VL-4.C λ ex 254nm, Vilber Lourmat).

Los espectros infrarrojos (4.000-600 cm -1 ) se obtuvieron con un

espectrómetro infrarrojo con transformada de Fourier y reflectancia total
atenuada ATR-FTIR Tensor-27 (Bruker). El análisis elemental se realizó con un
espectrómetro de masas con plasma acoplado inductivamente (ICP -MS) Agilent
7900. Para la preparación de la muestra, 1 mg de las NPs core-shell se llevó a un
volumen final de 5 mL con agua mili-Q. La digestión se llevó a cabo en un horno
de microondas de alta presión Milestone Ethos Easy a una temperatura máxima
de 220 °C. Para la determinación de Cs y Pb se realizó una digestión ácida con
una mezcla de HNO 3 :HF (5:1). Para la detección de Br se llevó a cabo una
digestión básica con hidróxido de tetraetilamonio.

150
 Capítulo 3. Estabilización de NCs de perovskita con recubrimiento de sílice mediante la adaptación del proceso sol-gel

 MÉTODO B. Síntesis de nanopartículas multicolores core-

shell de CsPbX 3 @SiO 2 estables en agua para su
utilización como marcadores fluorescentes en
inmunosensado

Reactivos

Carbonato de cesio (Cs 2 CO 3 , 99,9%, Sigma Aldrich), bromuro de plomo

(PbBr 2 , ≥98%, Sigma Aldrich), ioduro de plomo (PbI 2 , 98,5%, Alfa Aesar), cloruro
de plomo (PbCl 2 , 99%, Alfa Aesar), 1-octadeceno (ODE, 90% grado técnico, Sigma
Aldrich), ácido oleico (OA, grado técnico 90%, Alfa Aesar), oleilamina (OAm,
contenido C18 80-90%, Sigma Aldrich) tetrametil ortosilicato (TMOS, 99%,
ACROS Organics), tolueno y hexano, adquiridos de Scharlab.

Síntesis de NCs de Cs 4 PbX 6 (X = Br, I y composición mixta de Cl/Br)

Los NCs de Cs 4 PbX 6 se prepararon por el método hot-injection descrito por

Akkerman et al, 21 con algunas modificaciones.

Preparación del oleato de Cs (Cs-OA). Se disolvieron 400 mg de Cs 2 CO 3 en

8 mL de OA en condiciones de vacío a 100 °C.

Preparación de los NCs de Cs 4 PbX 6 . En un matraz de 3 bocas de 100 mL, se

añadieron 0,2 mmol PbX 2 (0,1 mmol de cada sal de plomo en el caso de la
composición mixta), 5 mL de ODE y 0,2 mL de OA. El matraz se s umergió en un
baño de aceite de silicona, se aplicaron condiciones de vacío y agitación, y la
temperatura se fijó en 120 °C. Una vez alcanzada la temperatura, se
mantuvieron estas condiciones durante 30 min más. Después, se inyectó 1,5 mL
de OAm bajo atmósfera inerte hasta que la disolución se volvió clara, indicando
la completa disolución del PbX 2 , y el matraz se sacó del baño de aceite para
dejarlo atemperar.

Posteriormente, el matraz se introdujo de nuevo en el baño de aceite y se

aplicaron condiciones de vacío y agitación. La temperatura se fijó en 60 °C en el
caso de PbI 2 , 80 °C para PbBr 2 y 100 °C para la mezcla PbCl 2 +PbBr 2 . Alcanzada
esta temperatura, se inyectaron 0,5 mL de Cs-OA y la disolución se volvió turbia
a los 15-30 s. Acto seguido, el matraz se dejó atemperar y su volumen se
distribuyó en 4 microtubos. Se centrifugaron a 4.000 rpm durante 5 min y el
sedimento se dispersó en aproximadamente 5 mL de hexano anhidro.

151
 Capítulo 3. Estabilización de NCs de perovskita con recubrimiento de sílice mediante la adaptación del proceso sol-gel

La dilución 1/200 de cada disolución stock dio los siguientes valores de

densidad óptica: D.O. 314 Cs 4 PbBr 6 = 0,50 ± 0,03, D.O. 367 Cs 4 PbI 6 = 0,53 ± 0,07 y
D.O. 343 Cs 4 Pb(Cl x Br 6-x ) = 0,29 ± 0,01. La concentración de NCs se determinó
midiendo la masa del sedimento, a partir de la diferencia en peso tras eliminar
el disolvente durante su purificación, obteniendo los siguientes valores: 25,74 ±
3,38 mg/mL para Cs 4 PbBr 6 , 35,19 ± 1.07 mg/mL para Cs 4 PbI 6 y 28,75 ±
1,54 mg/mL para Cs 4 Pb(Cl x Br 6-x ) .

Síntesis de NPs core-shell de CsPbX 3 @SiO 2 (X = Br, I y la composición mixta

Cl/Br)

Preparación de TMOS parcialmente hidrolizado (PH TMOS). En un vial de

vidrio, se mezclaron 2 mL de tolueno, 12 µL de H 2 O milli-Q y 198 µL de TMOS
manteniéndose en agitación magnética (500 rpm) durante 18 h.

Preparación de las NPs core-shell CsPbX 3 @SiO 2 . En un vial de vidrio, se

añadieron 2 mL de la disolución de NCs de Cs 4 PbX 6 y 2 µL de PH TMOS y se dejó
agitando a 500 rpm durante 5 h. Después, se añadieron 10 µL de TMOS agitando
a 900 rpm durante 1 min. Acto seguido, se añadieron 300 µL de H 2 O milli-Q bajo
agitación a 1.200 rpm durante 2 min. El vial se mantuvo en reposo durante toda
la noche y las NPs core-shell se recuperaron del sobrenadante tras centrifugar a
9.000 rpm durante 5 min.

Tratamiento térmico

En un recipiente de porcelana, se añadieron 5 mL de las NPs y se calcinaron

en un horno de mufla a 565 °C durante 10 min con una rampa de temperatura
de 1 °C/min. Después de atemperarse, la muestra se dispersó en agua y se
sonicó durante 30 min antes de preparar la muestra para TEM.

Inmunoensayo

Funcionalización de NPs core-shell con grupos amino (CsPbX 3 @SiO 2 -NH 2 ).

En un vial de vidrio, se añadieron 10,5 mg de las NPs CsPbX 3 @SiO 2 , 6 µL de (3-
aminopropil) trietoxisilano y 1 mL de tolueno anhidro y la mezcla se agitó
durante 5 h. Las NPs funcionalizadas se purificaron por centrifugación a 9.000
rpm y se dispersaron primero en etanol y, tras un segundo lavado, en 3,75 mL
de PBS.

152
 Capítulo 3. Estabilización de NCs de perovskita con recubrimiento de sílice mediante la adaptación del proceso sol-gel

Preparación del conjugado. Se añadieron 25 µL de Omalizumab (anticuerpo

IgE) a 1.5 mg/mL a las NPs CsPbX 3 @SiO 2 -NH 2 y se incubaron durante toda la
noche a 4 °C. Las NPs conjugadas, se centrifugaron a 9.000 rpm y el sedimento
se dispersó en 250 µL de tampón fosfato salino 10 mM, 150 mM NaCl, 0,05%
Tween 20%, pH 7 (PBS-T).

Inmunoensayo directo. Se tapizó una placa opaca de poliestireno de alta

afinidad con 5 mg/L de anticuerpo IgE específico para el alérgeno de Penicilina
G (100 µL/pocillo) en tampón bicarbonato/carbonato salino 50 mM pH 9,6 y se
incubó durante toda la noche a 4°C. Como control negativo, los pocillos se
incubaron con ovoalbúmina a 5 mg/mL. La placa se lavó 4 veces con PBS-T.
Después, se añadieron 100 μL/pocillo del conjugado y se incubó durante 1 h. a
temperatura ambiente. Después de un lavado exhaustivo con PBS-T (6 lavados)
y se midió la fluorescencia utilizando el lector de placas multimodo EnSpire
(PerkinElmer).

Métodos de caracterización

El espectro de absorción UV-vis se obtuvo con un espectrofotómetro

Agilent 8453 (Agilent Technologies) y el espectro de emisión de fluorescencia
con un espectrofluorímetro PTI QMA4 (Horiba) con una λ ex fija a 355 nm. El PLQY
de CsPb(Cl x Br 3-x ) y CsPbBr 3 NPs se determinó utilizando como estándar sulfato
de quinina en H 2 SO 4 0,5 M (Φ = 0,54) para una longitud de onda de excitación
de 310 nm.

Las imágenes de TEM se tomaron con los microscopios electrónicos de

transmisión de 120 kV (JEM-1400, Flash) y 200 kV (JEM 2100F, JEOL). La
distribución del tamaño de partícula se representó con formato de histograma
a partir de las medidas del tamaño de partícula, obtenidas con el programa
ImageJ sobre las imágenes de TEM. Las fotografías de los viales se tomar on bajo
lámpara UV (VL-4.C λ ex 254nm, Vilber Lourmat).

153
 Capítulo 3. Estabilización de NCs de perovskita con recubrimiento de sílice mediante la adaptación del proceso sol-gel

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Brüggemann, O.; Weiter, M.; Kaltenbrunner, M.; Sariciftci, N. S.;
Krajcovic, J.; Salinas, Y.; Kovalenko, A. Proteinogenic Amino Acid Assisted
Preparation of Highly Luminescent Hybrid Perovskite Nanoparticles. ACS
Appl. Nano Mater. 2019, 2 (7), 4267–4274.
https://doi.org/10.1021/acsanm.9b00725.

(59) Hu, Y.-L.; Wen, Q.-L.; Pu, Z.-F.; Liu, A.-Y.; Wang, J.; Ling, J.; Xie, X.-G.; Cao,
Q.-E. Rapid Synthesis of Cesium Lead Halide Perovskite Nanocrystals by
L-Lysine Assisted Solid-Phase Reaction at Room Temperature. RSC Adv.
2020, 10 (56), 34215–34224. https://doi.org/10.1039/D0RA07589B.

(60) Xu, L.; Chen, J.; Song, J.; Li, J.; Xue, J.; Dong, Y.; Cai, B.; Shan, Q.; Han, B.;
Zeng, H. Double-Protected All-Inorganic Perovskite Nanocrystals by
Crystalline Matrix and Silica for Triple-Modal Anti-Counterfeiting Codes.
ACS Appl. Mater. Interfaces 2017, 9 (31), 26556–26564.
https://doi.org/10.1021/acsami.7b06436.

(61) Maes, J.; Balcaen, L.; Drijvers, E.; Zhao, Q.; De Roo, J.; Vantomme, A.;
Vanhaecke, F.; Geiregat, P.; Hens, Z. Light Absorption Coefficient of
CsPbBr3 Perovskite Nanocrystals. J. Phys. Chem. Lett. 2018, 9 (11), 3093–
3097. https://doi.org/10.1021/acs.jpclett.8b01065.

160
 Capítulo 4. Estabilización de NCs de CsPbBr 3 en
micelas poliméricas para su utilización en tira
reactiva

Capítulo 4
Estabilización de NCs de CsPbBr 3 en
micelas poliméricas para su utilización
en tira reactiva

161
162
 Capítulo 4. Estabilización de NCs de CsPbBr3 en micelas poliméricas para su utilización en tira reactiva

4.1. Introducción

Existe una creciente demanda por métodos de detección rápidos que

permitan el diagnóstico clínico y la monitorización de la seguridad alimentaria y
medioambiental, sin la necesidad de recurrir a instrumentos sofisticados
manejados por personal altamente cualificado.

El ejemplo más claro ha sido el escenario en sanidad en los últimos años

que, marcado por la pandemia de la COVID-19, ha hecho necesario un cambio
hacia una medicina más descentralizada, acompañado del desarrollo de
dispositivos baratos, rápidos y de fácil manejo que permiten el diagnóstico en
el punto de atención sanitaria o en el punto de necesidad, como es caso de los
tests de antígenos frente al SARS-CoV-2.

Estas pruebas se han convertido en una herramienta clave para la

identificación y aislamiento de los casos positivos de la población mediante
rastreos masivos, en una situación desesperada por liberar la carga de pruebas
RT-PCR y ELISAs, las cuales, a pesar de su gran sensibilidad y reproducibilidad,
suponen un coste importante en tiempo, personal y equipamiento
especializado. 1 Además, los tests de antígenos han demostrado ser útiles en el
seguimiento de la infección por parte de la población general, por la sencillez y
rapidez del ensayo (15 min), la facilidad para interpretar los resultados sin
necesidad de instrumentación adicional y su bajo coste.

Estos ensayos inmunocromatográficos (lateral flow immunoassays, LFIA)

permiten detectar la presencia o ausencia del analito mediante la formación de
un inmunocomplejo en la línea de test (TL), visualizándose como una línea de
color rojo intenso que proviene de las nanopartículas (NPs) de oro coloidal con
las que se marca el anticuerpo de detección (Figura 58).

Los marcadores más extendidos en LFIA son las NPs de Au coloidal, ya que
pueden sintetizarse con diferentes tamaños y formas, conjugarse de forma
sencilla a anticuerpos, son relativamente estables y generan una señal que
puede distinguirse a simple vista. En algunas aplicaciones la detección
cualitativa es suficiente, por ejemplo, para determinar si una mujer está o no
embarazada (test de la hormona gonadotropina coriónica humana). Sin
embargo, en otras situaciones se requiere información cuantitativa que permita
controlar los niveles de determinados biomarcadores. En ese caso, se puede
recurrir a lectores basados en smartphones, los cuales permiten capturar
imágenes de la tira reactiva y procesarlas para calcular la concentración del
analito en base a una curva de calibrado previamente almacenada. 2
163
 Capítulo 4. Estabilización de NCs de CsPbBr3 en micelas poliméricas para su utilización en tira reactiva

Figura 58. (a) La tira reactiva se compone de almohadilla de muestra, almohadilla

del conjugado, membrana y almohadilla de adsorción. El anticuerpo de
detección marcado con Au (conjugado), se inmoviliza en la almohadilla
del conjugado. Los dos anticuerpos de captura se inmovilizan sobre las
líneas de test (TL) y control (CL). Cuando la muestra se deposita en la
almohadilla de muestra, fluye por capilaridad junto con el conjugado
hasta la almohadilla de adsorción, atravesando la TL y CL. (b) En presencia
de analito, éste es reconocido por el conjugado, formando un
inmunocomplejo que queda retenido en la línea TL al interaccionar con el
anticuerpo de captura inmovilizado, por tanto, la TL se marca de rojo. A su
vez, el exceso de conjugado que no ha interaccionado con el analito,
queda retenido en la CL, marcándose también de rojo. (c) En ausencia de
analito, el conjugado solo se acumula en la CL. Imagen reprodu cida de
Nature Protocols 2020, 15, 3788–3816

No obstante, los ensayos basados en la utilización de NPs de Au alcanzan

una baja sensibilidad, pudiendo dar lugar a falsos negativos cuando la
concentración del analito es baja. En este sentido, una de las estr ategias para
mejorar la sensibilidad de estos sistemas consiste en sustituir las NPs de Au por
marcadores fluorescentes, ya que permite alcanzar una mayor relación señal -
ruido al reducir la interferencia del fondo. 3

164
 Capítulo 4. Estabilización de NCs de CsPbBr3 en micelas poliméricas para su utilización en tira reactiva

Hasta ahora, se han utilizado diferentes tipos de marcadores fluorescentes

para el desarrollo de LFIA: colorantes orgánicos (rojo Nilo, 4 Alexa Fluor 647, 5
Cy5, 6 ), nanopartículas upconversion (UCNPs), 7,8 quantum dots (QDs)…

Los colorantes orgánicos son solubles en agua y fáciles de conjugar

directamente a anticuerpos, aunque generalmente se cargan en NPs de
poliestireno o de sílice para proporcionar una señal de fluorescencia más
intensa. Sin embargo, tienen desplazamientos de Stokes cortos, que hacen que
la señal interfiera con el ruido de fondo y tienen el inconveniente de que son
susceptibles a degradarse frente a la exposición prolongada de la fuente de
excitación.

Por otro lado, las UCNPs son nanomateriales dopados con iones de
lantánido que se excitan en la región NIR (800-1.000 nm) y emiten en el UV o
visible. Son fotoestables a largo plazo e incrementan la relac ión señal-ruido al
utilizar una fuente NIR. Sin embargo, los métodos sintéticos son complicados y
pueden implicar un alto coste de producción. 9

Los QDs superan a los colorantes orgánicos debido a una mayor

fotoestabilidad, alto PLQY, picos de emisión más estrechos y menor
interferencia con el ruido de fondo. Se puede obtener una amplia gama de
colores en función de su tamaño y excitarse simultáneamente utilizando una
misma fuente de excitación, por lo que son ideales para detectar múltiples
biomarcadores en una misma tira reactiva, en distintas líneas de detección, 10,11
o midiendo la intensidad de los picos correspondientes en una misma línea de
detección. 12

Los QDs más utilizados en LFIA son los del grupo II-VI, como por ejemplo
los QDs de CdSe/ZnS, 13,14 aunque también hay trabajos desarrollados con los
basados en InP, siendo una alternativa menos tóxica. 3

Considerando la necesidad de desarrollar kits robustos, sensibles y

económicos que puedan utilizarse en el punto de atención, es necesario tener
en cuenta el coste de producción del marcador. En este sentido, los NCs de
perovskita requieren condiciones más suaves de reacción, su síntesis es más
sencilla y es posible alcanzar altos valores de PLQY sin necesidad de pasivar su
superficie porque presentan mayor tolerancia frente a los defectos que los QDs.
Además, reúnen propiedades ópticas similares: emisión estrecha, posibilidad de
sintonizar su emisión para una amplia gama de colores en función de su
composición y pueden excitarse bajo una misma longitud de onda. De modo que,
en principio, la idea de implementarlos como marcadores en tira reactiva par ece
más apropiada.

165
 Capítulo 4. Estabilización de NCs de CsPbBr3 en micelas poliméricas para su utilización en tira reactiva

Para ello, primero es necesario dar con metodologías sencillas y escalables

que permitan sintetizar de forma reproducible partículas que contengan NCs de
perovskita y se mantengan estables en medio acuoso y tampón salino sin
deteriorar sus propiedades ópticas.

En el caso de los QDs, donde también es necesario recurrir a estrategias

que permitan su transferencia a la fase acuosa, una de las opciones más
extendidas consiste en funcionalizarlos con ácido 3-mercaptopropiónico (MPA),
ya que facilita su dispersión en medio acuoso y proporciona un grupo carboxílico
disponible para su conjugación a biomoléculas. 15,16 Para generar una señal lo
suficientemente intensa, generalmente se recurre a una estrategia que consiste
en adsorber múltiples QDs carboxilados en la superficie de nanopartículas de
sílice mediante la intercalación de una fina capa de un polímer o catiónico como
la polietilenimida (PEI). 10,14,17,18

También hay variaciones de este procedimiento donde, en lugar de

depositar los QDs sobre NPs de SiO 2 , se realiza sobre NPs magnéticas, las cuales
permiten incluir un previo tratamiento de la muestra para aislar y preconcentrar
el analito en muestras complejas mediante la exposición frente a un campo
magnético externo. 19–22 En algunos casos, otros diseños incorporan capas
intermedias con NPs de Au de 3 nm o 20 nm, con lo que se consigue una
detección dual (fluorimétrica y colorimétrica). 13,23,24

En general, esta estrategia se caracteriza por generar nanoestructuras de

180-200 nm que tienen una buena dispersión y están cargadas por múltiples
QDs, produciendo un aumento de la señal de fluorescencia y mejorando la
sensibilidad del ensayo. En el caso de los NCs de perovskita, las estrategias de
adsorción superficial no resultan viables, ya que los NCs quedan expuestos al
contacto directo con el medio acuoso, lo que induce rápidamente su
degradación.

Otra estrategia utilizada con QDs consiste en cargarlos en partículas de

poliestireno (PS) mediante swelling. 3 Se trata de una metodología sencilla que
consiste en incubar los QDs junto con las partículas de PS en un disolvente que
produce que el polímero se hinche y permita la difusión de las NPs al interior.
De esta forma, Wei et al incorporaron NCs de perovskita en micropartículas de
3 µm de PS (Figura 59a) y demostraron su estabilidad en agua, medios ácidos,
alcalinos, tampón salino y medio de cultivo. 25 Sin embargo, determinaron que
no resultaba efectivo al aplicarse con partículas de PS menor tamaño (400 y 800
nm) porque los NCs se distribuían de forma superficial y, por tanto, la
fluorescencia desaparecía rápidamente al dispersarse en agua.

166
 Capítulo 4. Estabilización de NCs de CsPbBr3 en micelas poliméricas para su utilización en tira reactiva

Por otro lado, las estrategias de atomización ofrecen la posibilidad de

incorporar a los NCs de perovskita en el interior de part ículas poímeros como
PS, 26,27 PMMA, 28,29 policarbonato (PC), 30 fluoruro de polivinilideno (PVDF). 31 Sin
embargo, salvo algunas excepciones, el tamaño de partícula resulta
relativamente grande (del orden de varias micras) (Figura 59b). Además, como
la superficie de la partícula tiene un fuerte carácter hidrófobo, al dispersarlas
en medio acuoso es posible que tiendan a interaccionar y formar agregados.

Figura 59. Estabilización de los NCs de perovskita en partículas poliméricas mediante

varias metodologías (a) swelling-shrinking, (b) electrospraying, (c)
combinación de polímeros hidrofóbicos e hidrofílicos, (d y e)
coprecipitación mediante copolímeros anfifílicos. Imágenes reproducidas
de (a) Adv Funct Mat. 2017, 1703535, 1 –8, (b) J. Mater. Chem. C, 2018, 6,
7971, (c) ACS Appl. Bio Mater. 2019, 2, 5872−5879, (d) Nanoscale, 2021, 13,
14297, (e) ACS Nano 2022, 16, 9, 13657 -13666

Una forma de mejorar la solubilidad de las partículas es recurrir a la

combinación de polímeros hidrofóbicos e hidrofílicos. Por ejemplo, Pramanik et
al, obtuvieron NCs de perovskita recubiertos por un polímero tribloque de
poliestireno-polietilen brasilato-poliestireno (PS-PEB-PS) y posteriormente
incorporaron otro polímero tribloque de polietilenglicol-polipropilenglicol-
167
 Capítulo 4. Estabilización de NCs de CsPbBr3 en micelas poliméricas para su utilización en tira reactiva

polietilenglicol (PEG-PPG-PEG) para mejorar su dispersión en agua (Figura

59c). 32 Los nanocompuestos resultantes son biocompatibles, tienen un tamaño
de 20 nm, exhiben alto PLQY (86%) y son estables en agua durante 8 días.
Además, pueden conjugarse por adsorción pasiva a anticuerpos anti-CD63 para
detectar específicamente exosomas derivados de cáncer de mama triple
negativo.

También hay opciones más sencillas donde, en lugar de combinar varios

polímeros, se utilizan directamente polímeros anfifílicos. Estos se caracterizan
por tener un dominio hidrofóbico, que interacciona con los ligandos de los NCs
y un dominio hidrofílico, que mejora su dispersión en agua y estabilidad coloidal.

Por ejemplo, Luo et al encapsularon NCs de perovskita en micelas

constituidas por un copolímero de polietilenglicol y poliε -caprolactona (PEG-
PCL) (Figura 59d). 33 En su metodología, inicialmente los NCs de perovskita y el
polímero se dispersan en tolueno, posteriormente se induce su coprecipitación
tras añadir hexano y finalmente, tras eliminar el hexano, se dispersan en agua.
Como resultado se obtienen nanomicelas que tienen un tamaño de 50 nm, son
biocompatibles, exhiben un PLQY del 54% y se mantienen óptica y coloidalmente
estables en agua durante 15 días, permitiendo explorar su potencial en
bioimagen intracelular e in vivo.

Por otro lado, Avugadda et al encapsularon NCs de perovskita en el interior

de micelas poliméricas de un copolímero de poliestireno y ácido poliacrílico (PS -
b-PAA) (Figura 59e). 34 De forma similar, los NCs se dispersan previamente en
una mezcla de tolueno y THF y posteriormente se añade metanol y hexano para
inducir la formación de las micelas y su precipitación, respectivamente. Las NPs
resultantes han demostrado gran potencial para utilizarse como marcadores
fluorescentes en bioimagen, puesto que tienen un PLQY relativamente alto
(60%), son extremadamente estables durante 2 años y biocompatibles.

En base a estos resultados, se planteó la posibilidad de recurrir a esta

estrategia para explorar su utilización como marcadores fluorescentes en
sistemas analíticos. Para ello se plantearon los siguientes objetivos:

1. Síntesis de nanocápsulas de CsPbBr 3 @PS-b-PAA mediante la

metodología de coprecipitación descrita por Avugadda et al. 34

2. Estudio de las variables de la metodología para optimizar las

condiciones de síntesis.

3. Utilización de las nanocápsulas como marcadores fluorescentes en

tira reactiva como plataforma de ensayo.
168
 Capítulo 4. Estabilización de NCs de CsPbBr3 en micelas poliméricas para su utilización en tira reactiva

4.2. Resultados

I. Síntesis de nanocápsulas de CsPbBr 3 @PS-b-PAA

Los NCs de CsPbBr 3 se sintetizaron según la metodología de Imran et al, 35

ya que permite obtener una población uniforme de NCs cúbicos sin
contaminación con otras nanoestructuras, como las nanoplaquetas (NPLs).

Se trata de una síntesis alternativa a la metodología convencional en la

cual se emplea ácido oleico (OA) como único surfactante para el crecimiento de
los NCs. La oleilamina es sustituida por una amina secundaria que, en su forma
de ion de amonio protonado, no es capaz de unirse a la superficie del NC de
forma tan efectiva a como lo hacen las aminas primarias. Por tanto, al no
competir con los iones Cs + por la pasivación de la superficie del NC, se inhibe el
crecimiento de NPLs. Estas nanoestructuras 2D, se caracterizan por tener un
grosor de unos pocos nanómetros y una emisión desplazada hacia el azul. 36 Se
generan cuando el OA se encuentra en exceso o cuando la inyección de oleato
de cesio (Cs-OA) se hace a una temperatura inferior a 150 °C. 37

La caracterización de los NCs de CsPbBr 3 sintetizados se incluye en la Figura

60a. Las imágenes de TEM demuestran que con esta metodología se obtiene una
población monodispersa de NCs cúbicos (9,3 ± 1,1 nm). La emisión es estrecha
(fwhm de 19 nm) y el máximo se localiza a 514 nm.

Uno de los inconvenientes de la síntesis de Imran et al es la baja estabilidad

coloidal de los NCs resultantes. 35 En menos de 2 días tienden a agregarse. Como
alternativa, se recurrió a un tratamiento postsintético sobre la superficie del NC
que consiste en la sustitución del ligando nativo (Cs-OA) por bromuro de
didodecildimetilamonio (DDAB), una sal de amonio cuaternario. Con este
tratamiento es posible intercambiar prácticamente el 90% de las especies de
oleato de la superficie del NC en un solo ciclo. 38 No solo mejora la estabilidad
coloidal (al menos 3 semanas), sino que además incrementa el PLQY hasta
~ 100% al pasivar casi por completo la superficie del NC original.

El intercambio de Cs-OA por DDAB no afectó a la morfología o al tamaño

del NC (10 ± 1,4 nm) (Figura 60b). Únicamente se produjo un ligero
desplazamiento del máximo de emisión de fluorescencia de 514 a 510 nm, pero
el fwhm se mantuvo constante.

169
 Capítulo 4. Estabilización de NCs de CsPbBr3 en micelas poliméricas para su utilización en tira reactiva

Figura 60. Esquema del procedimiento de síntesis de los NCs de CsPbBr 3 e intercambio
del ligando nativo (Cs-OA) por DDAB. (a y b) Caracterización de los NCs
de CsPbBr 3 cubiertos por Cs-OA y DDAB, respectivamente. Se muestran
imágenes a bajos y altos aumentos junto con el histograma de la
distribución de tamaños de partícula. Caracterización de las propiedades
ópticas mediante los espectros de (c) absorción y (d) emisión de
fluorescencia (λ ex 355 nm). En el recuadro superior de ambos espectros se
incluye la imagen de los NCs bajo luz Vis y UV ( λ ex 254 nm).

170
 Capítulo 4. Estabilización de NCs de CsPbBr3 en micelas poliméricas para su utilización en tira reactiva

Posteriormente, se procedió a reproducir la metodología de síntesis de

nanocápsulas de CsPbBr 3 @PS-b-PAA, 34 con los dos tipos de NCs, cubiertos por
Cs-OA o por DDAB, respectivamente.

El procedimiento (Figura 61) se resume en los siguientes pasos: (1)

Inicialmente el copolímero anfifílico PS-b-PAA se disuelve en una mezcla de
tolueno y tetrahidrofurano (THF) y se le añaden los NCs de CsPbBr 3 en tolueno.
(2) Posteriormente, se inyecta gradualmente metanol, que actúa como
antidisolvente para el bloque hidrofóbico, induciendo la formación de micelas.
Los NCs que no han sido atrapados en su interior se degradan, al ser
incompatibles con el antidisolvente. (3) Finalmente, las nanocápsulas se
purifican y se dispersan en agua.

Figura 61. Esquema de la metodología de síntesis de nanocápsulas de CsPbBr 3 @PS-b-

PAA estables en agua. (1) La disolución precursora contiene los NCs de
CsPbBr 3 y el copolímero PS-b-PAA en una mezcla tolueno:THF. (2) Al
inyectar el antidisolvente (metanol), se desencadena la formación de las
nanocápsulas de CsPbBr 3 @PS-b-PAA. (3) Dispersión de las cápsulas en
agua. Imagen reproducida de ACS Nano 2022, 16, 9, 13657 -13666.

Los resultados de la síntesis de nanocápsulas de CsPbBr 3 @Ps-b-PAA se

muestran en la Figura 62. En ningún caso se obtuvieron partículas, sino un gran
aglomerado de polímero. La única diferencia es que la muestra preparada con
los NCs cubiertos por Cs-OA (M1*) es más fluorescente, lo que indica que un
mayor porcentaje de NCs queda atrapado en la matriz polimérica. Esto se
atribuye a que el bloque de poliestireno se intercala mejor en la superficie de
los NCs sin tratar, al presentar un mayor número de vacantes.

Este resultado resalta la importancia de considerar la naturaleza de los

ligandos que cubren la superficie de los NCs, ya que la internalización y
ubicación de los NCs en el interior de las micelas poliméricas depende en gran
medida de la química de su superficie. 39,40

171
 Capítulo 4. Estabilización de NCs de CsPbBr3 en micelas poliméricas para su utilización en tira reactiva

Figura 62. Ligando de superficie del NC: Cs-OA y DDAB. Se corresponden con las
muestras 1 y 2 de la Tabla 12 (apartado “Materiale s y métodos”). La
condición seleccionada se resalta con (*)

En base a los resultados obtenidos se procedió a estudiar las variables de

la metodología para tener un mejor control del proceso. Pese a la baja
estabilidad coloidal de los NCs cubiertos por Cs-OA (M1*), se seleccionaron
como material de partida por su mayor compatibilidad con el proceso de
coprecipitación. Para evitar que la coalescencia de los NCs se convirtiera en una
variable más, se optó por trabajar siempre con material recién sintetizado.

II. Estudio de las variables de la metodología

A. Efecto del antidisolvente (metanol)

Velocidad de adición

Con intención de resolver el problema de agregación del polímero, se

incrementó la velocidad de inyección de metanol, ya que velocidades más
rápidas permiten generar partículas más pequeñas. 34 Las condiciones fueron las
siguientes: 250 µL/min (control), 1.500 µL/min y una inyección rápida.

172
 Capítulo 4. Estabilización de NCs de CsPbBr3 en micelas poliméricas para su utilización en tira reactiva

En la Figura 63, se muestran las imágenes de TEM acompañadas con una

fotografía bajo luz visible (izquierda) y luz UV λ ex 254 nm (derecha).

A simple vista, pudo comprobarse que la inyección de metanol a 250 y

1.500 µL/min generaba agregados que se depositaban por las paredes del vial,
mientras que cuando la inyección se realizaba de forma rápida la disoluc ión
adquiría un aspecto más uniforme.

La intensidad de fluorescencia también fue más alta al compararla bajo la

lámpara UV con las dos primeras muestras, lo que confirma que la inyección
rápida mejora la eficiencia de la encapsulación.

La caracterización de las muestras por TEM corrobora la aglomeración del

polímero en condiciones de inyección lentas. Sus dimensiones disminuyen
cuando la inyección se hace de forma rápida, e incluso ocasionalmente se
distingue alguna partícula aislada de aspecto similar al deseado, esférica y con
múltiples NCs en su interior.

Por tanto, los mejores resultados se obtuvieron para la inyección rápida de

metanol (M5*).

Figura 63. Velocidad de inyección de metanol: 250 µL/min, 1.500 µL/min e inyección
rápida. Muestras 3-5 de la Tabla 12 (apartado “Materiales y métodos”). La
condición seleccionada se resalta con (*)

173
 Capítulo 4. Estabilización de NCs de CsPbBr3 en micelas poliméricas para su utilización en tira reactiva

Volumen de antidisolvente

Además de la velocidad de inyección, también es importante determinar el

volumen y el número de inyecciones a realizar para añadir la totalidad del
antidisolvente.

De acuerdo con la metodología de referencia, el volumen total de metanol

(850 µL) se añade en tres pasos, primero 150 µL (a 250 µL/min), después 400 µL
y por último 300 µL. A partir de estos datos se probaron distintas combinaciones
para analizar el efecto del volumen total (550 ó 850 µL) y el número de adiciones
(una, dos o tres) en la formación de partículas poliméricas.

Los resultados de estas condiciones se muestran en la Figura 64.

En primer lugar, se observa que independientemente del volumen total de

antidisolvente (550 ó 850 µL), la intensidad de fluorescencia es mayor cuando
la inyección se realiza de forma gradual (en dos o tres adiciones) (M7, M9* y
M10). Mientras que cuando se añade directamente (M6 y M8), la fluorescencia
es muy tenue. Esto indica que cuando se añade un volumen relativamente
grande de metanol en un solo paso, los NCs se degradan antes de ser atrapados
en el interior de las micelas, por tanto, el cambio de solubilidad debe hacerse
de forma progresiva.

También se observan diferencias al comparar la inyección gradual de un

volumen total de 550 µL frente a un volumen de 850 µL, obteniendo una
intensidad de fluorescencia ligeramente superior cuando el volumen de
inyección es mayor, a la vez que el tamaño de partícula dism inuye de 800 nm
cuando se inyectan 550 µL (M7) a 500 nm cuando se inyectan 850 µL (M9* y
M10).

Por último, se procedió a replicar las condiciones de inyección, en este caso

sumergiendo los viales en un baño de ultrasonidos, con intención de reducir el
tamaño de las partículas. Los resultados obtenidos fueron muy similares a las
condiciones iniciales (M11-M15).

Como no había grandes diferencias entre la inyección de 850 µL en dos

(M9*) o tres adiciones (M10), se optó por seleccionar las condiciones más
simples de trabajo, resultando en la condición óptima de un volumen de
inyección de 850 µL en dos adiciones sin agitación (M9*).

174
 Capítulo 4. Estabilización de NCs de CsPbBr3 en micelas poliméricas para su utilización en tira reactiva

Figura 64. Volumen de metanol como antidisolvente. Volumen total de 550 µL en una
y dos adiciones (150 + 400 µL) y de 850 µL en una, dos (150 + 700 µL) y tres
adiciones (150 + 400 + 700 µL). En condiciones sin agitación y en baño de
ultrasonidos. Muestras 6-15 de la Tabla 12 (apartado “Materiales y
métodos”). La condición seleccionada se resalta con (*)

B. Efecto del polímero

Concentración de polímero

Hasta el momento, las partículas resultantes difieren de las partículas de

referencia, tanto en tamaño como en morfología. Se trata de partículas de gran
tamaño que presentan cavidades internas, dispuestas aleatoriamen te (M9*) o
de forma concéntrica con interespaciado entre las paredes (M14).

La aparición de estas estructuras se asocia con una concentración alta de

polímero, 41,42 por lo que el siguiente parámetro a optimizar fue su
concentración. Para ello, se establecieron tres concentraciones de crecientes de
PS 29 -b-PAA 5 en la mezcla de reacción: 25,6, 12,8 y 6,4 mg/mL.

En los resultados de TEM (Figura 65), se puede apreciar cómo se reduce el

tamaño de las partículas a medida que disminuye la concentración de polímero
y evolucionan de una organización multilaminar (M16) a una morfología esférica
(M18*). Por tanto, se optó por la concentración más baja de las tres (6,4
mg/mL).
175
 Capítulo 4. Estabilización de NCs de CsPbBr3 en micelas poliméricas para su utilización en tira reactiva

Figura 65. Concentración final de polímero PS 29 -b-PAA 5 en tolueno: 25,6 mg/mL 12,8
mg/mL y 6,4 mg/mL. Muestras 16-18 de la Tabla 12 (apartado “Materiales y
métodos”). La condición seleccionada se resalta con (*)

Relación entre la concentración de NCs y de polímero

En este apartado se estudia el efecto de la combinación de dos variables:

concentración de NCs de CsPbBr 3 y concentración del copolímero PS 29 -b-PAA 5 .
Para ello, se diseñó un ensayo 3x4, donde se establecieron 3 concentraciones
de NCs y 4 concentraciones de polímero. En ambos casos, la concentración
máxima se diluyó seriadamente a la mitad.

La Tabla 12 (apartado “Materiales y métodos”) indica cómo se prepararon

cada una de las muestras. La concentración de los NCs en el volumen total de
reacción (Vt =125 µL) varía de 0,42 a 1,68 µM. Mientras que la concentración de
polímero varía desde 1,6 hasta 12,8 mg/mL (equivalente a 47,06 y 376,47 µM).
Los resultados de la caracterización de todas las combinaciones de la matriz se
muestran en la Figura 66.

En todos los casos se observa que, para una concentración fija de NCs, la
intensidad de fluorescencia decae drásticamente al traspasar una determinada
concentración de polímero, a la que denominaremos concentración umbral de
polímero (CUP). Este valor varía proporcionalmente respecto a la concentración
176
 Capítulo 4. Estabilización de NCs de CsPbBr3 en micelas poliméricas para su utilización en tira reactiva

de NCs, lo que refleja la importancia de mantener una relación determinada

entre ambos componentes. Cuanto mayor es la concentración de NCs, mayor es
su valor de CUP. (Figura 66-I-II).

Cuando la relación µM de NCs CsPbBr 3 /PS 29 -b-PAA 5 en la mezcla de

reacción es óptima (= 0,002), las micelas están cargadas con nanopartículas de
9,5 nm, correspondientes con NCs de CsPbBr 3 (Figura 67a). Por debajo de esta
relación aparecen micelas mixtas, donde una segunda población de partículas
de tamaño inferior (~ 2,5 nm) compite con la de NCs nativos (Figura 67b). A
medida que disminuye la concentración de polímero, aumenta su prevalencia
hasta ser la mayoritaria (Figura 67c), hecho que coincide con la pérdida de la
fluorescencia emitida. Por tanto, lo lógico es que esta segunda población derive
de la degradación de los NCs de CsPbBr 3 que han entrado en contacto con el
antidisolvente durante el proceso de encapsulación.

177
Capítulo 4. Estabilización de NCs de CsPbBr3 en micelas poliméricas para su utilización en tira reactiva

178
 Capítulo 4. Estabilización de NCs de CsPbBr3 en micelas poliméricas para su utilización en tira reactiva

Figura 66. Concentración de NCs y de polímero PS 29 -b-PAA 5 . Para esta matriz, los
números 1-3 representan la concentración de NCs en la mezcla de
reacción en orden decreciente, 1,68, 0,84 y 0,42 µM. Por otro lado, las letras
A-D representan la concentración de polímero en la mezcla de reacción
en orden decreciente, siendo A = 12,8 mg/mL (376,5 µM), B = 6,4 mg/mL
(188,2 µM), C = 3,2 mg/mL (94,1 µM) y D = 1,6 mg/mL (47 µM). Las
condiciones de cada muestra se pueden consultar en la Tabla 12
(apartado “Materiales y métodos”), 1A-D (muestras 19-22), 2A-D (muestras
23-26) y 3A-D (muestras 27-30). La condición seleccionada se resalta con
(*)

Figura 67. Imágenes de TEM de los tipos de micelas poliméricas en f unción de su

contenido: a) NCs de CsPbBr 3 (~ 9,5 nm), b) mixtas (NCs de CsPbBr 3 y NPs
no fluorescentes de ~ 2,5 nm), c) NPs de ~ 2,5 nm y d) vacías

La relación óptima de NCs CsPbBr 3 /PS 29 -b-PAA 5 se cumple en las muestras

M23 (posición 2A de la matriz: 0,84 µM NCs y 376,47 µM polímero) y M28*
(posición 3B de la matriz: 0,42 µM NCs y 188,2 µM polímero). A pesar de que la
relación es la misma, en M23 se obtienen partículas más polidispersas (314 ±
145 nm) que en M28* disminuye la variación (191 ± 91 nm), posiblemente
debido a que la concentración de polímero en la disolución es mayor.

Llegados a este punto, las condiciones de la muestra M28* (posición 3B en

la matriz) reprodujeron resultados similares a los descritos por la metodología
de referencia, por lo que se dio por finalizada la optimización de la síntesis.

No obstante, sería interesante comprobar si la tendencia que reflejan los

resultados sigue cumpliéndose al desplazarse diagonalmente en la matriz hacia
concentraciones más bajas de NCs y de polímero, con lo que se conseguiría
seguir disminuyendo el tamaño de la micela. Por ejemplo, las siguientes
proporciones a analizar serían las siguientes: 4C (0,21 µM de NCs y 3,2 mg/mL
PS-b-PAA), 5D (0,1 µM de NCs y 1,6 mg/mL de PS-b-PAA) y 6E (0,05 µM de NCs
y 0,8 mg/mL de PS-b-PAA).

Según la bibliografía, la concentración de polímero PS 250 -b-PAA 13 en la

mezcla de reacción para encapsular otro tipo de nanopartículas de tamaño
similar, como QDs de CdSe@ZnS (6 nm), 43 ɣ-Fe 2 O 3 (11 nm), 44 y Au (12 nm), 45
179
 Capítulo 4. Estabilización de NCs de CsPbBr3 en micelas poliméricas para su utilización en tira reactiva

oscila entre 0,1 y 1 mg/mL. Trabajando en este rango es posible obtener micelas
con un tamaño inferior a 50 nm y modular la carga en función de la
concentración de NPs y de la velocidad de inyección de antidisolvente. La
adición lenta desencadena encapsulación a nivel de una sola partícula, mientras
que la adición rápida genera micelas cargadas con múltiples partícula s.

C. Aumento de la producción y purificación

Por último, con el fin de incrementar la producción de partículas con las

mismas prestaciones, se planteó la posibilidad de aumentar proporcionalmente
el volumen de reacción (x20 y x40).

Los resultados (Figura 68) muestran que en los tres casos (M31-M33) se
obtienen NPs esféricas similares, de tamaño medio de 240 nm, cargadas con
múltiples NCs en su interior, lo que demuestra la sencillez, robustez y
reproducibilidad de la estrategia.

Figura 68. Aumento de la producción de partículas: x1, x20 y x40. Muestras 31 -33 de
la Tabla 12 (apartado “Materiales y métodos”). La condición seleccionada
se resalta con (*)
180
 Capítulo 4. Estabilización de NCs de CsPbBr3 en micelas poliméricas para su utilización en tira reactiva

Ocasionalmente, aparecen partículas que se agregan dando lugar a

estructuras de gran tamaño (> 600 nm) (Figura 69, aparecen recuadrados en
blanco)

Para separarlas de la muestra se probaron varias condiciones de

centrifugado: revoluciones bajas o intermedias durante 15 min y revoluciones
altas durante menos tiempo (1 min). La única condición que consiguió separar
estos agregados fue la de 661 rcf durante 15 min.

Figura 69. Condiciones para la separación de los agregados de mayor tamaño: 165
rcf 15 min, 661 rcf 15 min, 2647 rcf 1 min. En la fila superior se muestra una
imagen representativa de TEM a bajos aumentos, mientras que en la fila
inferior se muestra una región con más detalle. El recuadro con contorno
en blanco resalta la presencia de los agregados

La Figura 70 resume las características de las nanopartículas obtenidas a

partir de la optimización de la estrategia de coprecipitación de los NCs de
CsPbBr 3 en micelas de PS 29 -b-PAA 5 . Se consiguen NPs con un tamaño de 209 ±
77 nm que contienen múltiples NCs en su interior y cuya emisión máxima a 517
nm se mantiene estable en metanol.

181
 Capítulo 4. Estabilización de NCs de CsPbBr3 en micelas poliméricas para su utilización en tira reactiva

Figura 70. Caracterización de las nanocápsulas optimiza das de CsPbBr 3 @PS-b-PAA

(a) espectro de emisión de fluorescencia en metanol ( λ ex 355 nm), (b)
histograma de la distribución de tamaños de partícula, (c) y (d) TEM a bajos
y altos aumentos, respectivamente

III. Utilización de las nanocápsulas de CsPbBr 3 @PS-b-PAA

como marcadores en plataformas de ensayo basadas
en tira reactiva

La metodología de coprecipitación optimizada permite generar de forma

reproducible nanocápsulas de CsPbBr 3 @PS-b-PAA que reúnen las características
deseadas para demostrar su utilización como etiquetas de marcaje.

Como plataforma de ensayo se seleccionó la tira reactiva, por tratarse de

una de las plataformas analíticas más utilizadas como dispositivo point-of-care
(POC). Estas pruebas se caracterizan por ser económicas, sencillas y rápidas, 46 y
son ampliamente conocidas por su aplicación en diagnóstico (embarazo, COVID -
19), salud alimentaria (alérgenos, patógenos) y medioambiental (pesticidas,
metales pesados, bacterias). 2
182
 Capítulo 4. Estabilización de NCs de CsPbBr3 en micelas poliméricas para su utilización en tira reactiva

En formato de tira reactiva, se lleva a cabo un ensayo

inmunocromatográfico, donde la muestra fluye por capilaridad a través de una
serie de almohadillas donde se han inmovilizado previamente determinados
biorreceptores. Como resultado de la interacción se genera una señal que indica
la presencia o ausencia de analito.

El primer objetivo fue demostrar que las nanocápsulas de CsPbBr 3 @PS-b-

PAA pueden conjugarse por adsorción pasiva a un anticuerpo de detección y
fluir a través de la tira reactiva. Para ello se planteó un ensayo directo, donde
se inmovilizó la proteína diana (albúmina de suero bovino, BSA) en la línea de
prueba (TL, test line) y ovoalbúmina (OVA, 1 mg/mL), como control negativo en
la línea control. La Figura 71a muestra el esquema del ensayo.

Las nanocápsulas se conjugaron por adsorción pasiva con anticuerpos IgG

policlonales anti-BSA (45,2 g/mL en PBS 10 mM pH 7,4). El mantenimiento de
la fluorescencia durante la etapa de incubación demostró que las propiedades
ópticas de los NCs atrapados en el interior de las micelas poliméricas de PS -b-
PAA se mantienen estables en tampón salino.

Posteriormente la tira reactiva se incubó durante 10 min en un pocillo de

placa ELISA conteniendo la disolución del conjugado, sumergiendo solo un
extremo, como se indica en la Figura 71a. Los resultados se muestran en la
Figura 71b. La señal fluorescente de la TL, bajo luz UV (λ ex 254 nm), confirma la
interacción del conjugado con la proteína BSA inmovilizada. Mientras que la
ausencia de señal en el control negativo indica que el conjugado es específico y
solo se une en el lugar donde el analito (BSA) se encu entra inmovilizado.

Por tanto, el ensayo directo permitió confirmar que las nanocápsulas son
estables, pueden conjugarse por adsorción al anticuerpo de detección sin perder
sus propiedades de emisión, fluir a lo largo de la tira reactiva y proporcionar una
señal específica.

El siguiente objetivo fue diseñar y desarrollar una prueba de concepto con

un inmunoensayo en formato sándwich. El formato sándwich es el formato
convencional en investigación y aplicaciones comerciales, ya que es fácil de
optimizar en comparación con el ensayo en formato competitivo y proporciona
una lectura intuitiva para el usuario, donde la señal es directamente
dependiente de la concentración de analito presente en la muestra.

183
 Capítulo 4. Estabilización de NCs de CsPbBr3 en micelas poliméricas para su utilización en tira reactiva

Figura 71. Ensayo directo para confirmar la conjugación de αBSA c on las

nanocápsulas de CsPbBr 3 @PS-b-PAA y su especificidad. (a) Esquema del
ensayo directo. TL es la línea de prueba, donde la proteína diana (BSA) se
encuentra inmovilizada (1 mg/mL) y C- es la línea de control negativo
inmovilizada con la proteína OVA (1 mg/mL). La tira se sumerge en un
pocillo que contiene la disolución del conjugado. (b) Fluorescencia
emitida por el conjugado tras realizar el ensayo.

Como prueba de concepto se diseñó un inmunoensayo para la detección

de inmunoglobulina G humana (H-IgG). Utilizando como anticuerpo de captura
y detección un anticuerpo αH-IgG policlonal de conejo, capaz de reconocer
diferentes epítopos del analito diana.

Con el fin de proporcionar fiabilidad al inmunoensayo en tira reactiva, se

incluyó un control positivo y un control negativo. La señal de estos controles
debe permanecer constante e independiente de la concentración de analito
diana en la muestra.

En el control positivo (C+) se inmovilizó IgG anti-cabra producida en

conejo. Se trata de un anticuerpo secundario que reconoce la fracción constante
de la αH-IgG. Esta línea siempre debe aparecer, en este caso como una señal
verde fluorescente, independientemente de si el analito está o no en la muestra,
ya que indica que el conjugado ha fluido por capilaridad ha sta el final de la tira.

En el control negativo (C-) se inmovilizó proteína BSA. Como el conjugado

no tiene afinidad por esta proteína, esta línea no debe emitir señal fluorescente.

Por último, en la línea de prueba (TL) se inmovilizó αH-IgG, que se une a

un epítopo del analito, formando un sándwich con el conjugado.
184
 Capítulo 4. Estabilización de NCs de CsPbBr3 en micelas poliméricas para su utilización en tira reactiva

La Figura 72 muestra el diseño del inmunoensayo en formato de tira

reactiva.

Figura 72. (a) Esquema del inmunoensayo en formato sándwich. En el control positivo
(C+) está inmovilizado con IgG anti-cabra producida en conejo, el control
negativo (C-) con proteína BSA y la línea de test (TL) con αH-IgG. (b y c)
representan los resultados de una muestra positiva y negativa al sumergir
la tira reactiva por un extremo en un pocillo que contiene el anticuerpo d e
detección junto con la muestra, en presencia y ausencia de analito,
respectivamente.

185
 Capítulo 4. Estabilización de NCs de CsPbBr3 en micelas poliméricas para su utilización en tira reactiva

El paso siguiente consistió en llevar a cabo una curva de calibrado a partir

de diluciones seriadas de la disolución de analito (H-IgG) de concentración
conocida (0, 1.000, 3.000 y 15.000 ng/mL).

Los resultados (Figura 73a) muestran una señal alta en el control positivo
y una señal indistinguible respecto al fondo en el control negativo. En cuanto a
la TL, las señales son difíciles de distinguir visualmente. Para obtener
información cuantitativa de las señales, se utilizó el programa de análisis de
imagen ImageJ, observándose que la señal del control positivo y negativo
permanecen constantes independientemente de la concentración de analito
(Figura 73b), siendo la intensidad media de la señal del control positivo de 76,7
± 10,9 mientras que la del negativo es de 8,1 ± 1,6.

La intensidad de la TL normalizada es 9,5 veces más alta al comparar la de

1.000 ng/mL respecto a 0 ng/mL (Figura 73c). Este incremento decrece para
3.000 y 15.000 ng/mL de H-IgG, debido al efecto hook, que es un fenómeno que
ocurre cuando el analito se encuentra en exceso, lo cual dificulta la generación
del immunosandwich. Este efecto hook también se observó cuando se realizó el
mismo ensayo con revelado colorimétrico con NPs de Au.

Figura 73. (a) Curva de calibrado a partir de disoluciones con concentración

conocida de analito. (b) Señal de los controles (c) Señal normalizada de
la TL

De acuerdo a los resultados obtenidos, se puede concluir que es posible

que haya una relación dosis-respuesta entre 0 y 1.000 ng/mL, demostrativo del
potencial de los marcadores de perovskita en inmunoensayo preparados en esta
tesis. Al tratarse de una prueba preliminar, la continuación de esta investigación
debe pasar por la optimización del ensayo para aumentar la señal de la TL,
realizar el calibrado con al menos 5 réplicas por punto, determinar las
propiedades analíticas del ensayo (límite de detección, límite de cuantificación,
sensibilidad, rango dinámico y desviación estándar relativa) y compararlas con
el ensayo colorimétrico estándar (utilizando NPs de Au de 20 nm).
186
 Capítulo 4. Estabilización de NCs de CsPbBr3 en micelas poliméricas para su utilización en tira reactiva

4.3. Conclusiones

La encapsulación de nanocristales de LHP en micelas poliméricas de PS -b-

PAA permite su estabilización y funcionalización para su posterior conjugación
a biomoléculas. El bloque hidrofóbico de PS previene la disociación de los
ligandos de superficie y crea una barrera hidrofóbica que dificulta la interacción
de las nanopartículas con el disolvente, mientras que el bloque hidrofílico de
PAA facilita su dispersión en disolventes polares.

El estudio de las variables más relevantes del proceso (tipo de ligando en

la superficie del nanocristal, velocidad y volumen de metanol, concentración de
polímero y de NCs…) ha permitido controlar el proceso de coprecipitación y
lograr resultados similares a los de la metodología de referencia, realizando
algunos cambios significativos (tal y como se muestra en la Figura 74, apartado
“Materiales y métodos”).

La adaptación de la metodología es el resultado de un proceso iterativo,

en el cual se ha seleccionado la mejor condición en base a la variable estudiada
siguiendo un orden determinado. Es posible que, de haber escogido otro orden,
las condiciones finales fueran distintas, por lo que no conviene descartar la
posibilidad de revisar los parámetros fijados al principio del proceso e incluso
seguir perfeccionando el método para disminuir aún más el tamaño de partícula.

Finalmente, otra de las alternativas que se ofrece en este cap ítulo es la de

aumentar la producción de partículas de forma sencilla. El trabajo de referencia
consta de numerosos pasos y, aunque algunos de ellos están automatizados por
un robot de dispensación de líquidos, la estrategia consiste básicamente en
reproducir réplicas de las condiciones de reacción.

En la adaptación de la metodología se ha reducido el número de pasos y

comprobado que es posible escalar la producción aumentando los volúmenes
de reacción de forma proporcional (Tabla 12, apartado “Materiales y métodos”).
Según la metodología de referencia, para el volumen total de síntesis (4 mL) se
necesita producir un total 160 réplicas. Considerando que el sistema de
automatización puede contener hasta 24 viales de reacción, entonces se
requieren 7 ciclos. En cambio, según la metodología adaptada, para 4 mL basta
con 4 réplicas de las condiciones de escalado x40. El paso siguiente sería
comprobar si es posible llevar a cabo el escalado x80 en un solo recipiente, para
lo que habría que tener en cuenta que debe abarcar un volumen total de 156
mL.

187
 Capítulo 4. Estabilización de NCs de CsPbBr3 en micelas poliméricas para su utilización en tira reactiva

Por último, se ha confirmado que las nanocápsulas de CsPbBr 3 @PS-b-PAA

son estables en tampón salino y pueden conjugarse por adsorción pasiva con
anticuerpos y, por extensión también con otras proteínas. Los ensayos
preliminares realizados en tira reactiva, han demostrado que el conjugado es
capaz de fluir a través de ella e interaccionar específicamente con el analito
diana.

De cara a implantar estos nanomateriales como marcadores en sistemas

analíticos basados en tira reactiva, primero es necesario determinar las
condiciones óptimas de preparación del conjugado, concentración de los
biorreceptores inmovilizados, evaluación del blanco (ausencia de analito)… y
posteriormente realizar un calibrado que permita evaluar las propiedades
analíticas del ensayo (límite de detección, límite de cuantificación, sensibilidad,
rango dinámico y desviación estándar relativa) y compararlas con un sistema
estándar.

188
 Capítulo 4. Estabilización de NCs de CsPbBr3 en micelas poliméricas para su utilización en tira reactiva

4.4. Materiales y métodos

Reactivos

Acetato de plomo (II) trihidratado ≥99.99%, Carbonato de cesio 99%, 1-

Octadeceno grado técnico 90%, Didodecilamina (DDDAm), Bromuro de
didodecildimetilamonio (DDAB) y Poliestireno-b-ácido(poliacrílico) (PS 29 -b-
PAA 5 ) con MM de 34.000 g/mol de Sigma-Aldrich. Ácido oleico grado técnico
90%, y Bromuro de benzoilo 97% de Thermo Scientific™. Tolueno anhidro 99,8%,
Acetato de etilo 99,8%, Tetrahidrofurano (THF) y Metanol adquiridos en
Scharlab.

Anticuerpo IgG anti-cabra producido en conejo (ab6697, Abcam),

anticuerpo policlonal IgG anti H-IgG (1011-2ML, Sigma) purificado utilizando una
columna de purificación HiTrapTM Protein G HP (H4522, Sigma), Fracción V de
albúmina bovina (Acros Organics). Membrana de nitrocelulosa Hi -Flow Plus 90
(Sigma).

Síntesis de NCs de CsPbBr 3 Cs-OA

Los nanocristales de CsPbBr 3 se prepararon siguiendo la metodología

descrita por Imran et al 17 con algunas modificaciones. En un matraz de 25 mL de
2 bocas y un termopozo se añadieron 76 mg de acetato de plomo (II)
trihidratado, 16 mg de carbonato de cesio, 10 mL de 1-octadeceno y 1,5 mL de
ácido oleico. El termopozo se rellenó con 0,2 mL de octadeceno y se introdujo
una sonda para el seguimiento de la temperatura. El matraz se colocó encima
de una manta calefactora y se aplicó vacío y agitación magnética (400 rpm) hasta
que la temperatura alcanzó 115 °C.

Después, se inyectó bajo flujo de Ar la disolución de DDDAm (443 mg

previamente disueltos en 1 mL de tolueno anhidro a una temperatura de
150 °C). Seguidamente, se disminuyó la temperatura hasta 80 °C y se inyectó
rápidamente una disolución de bromuro de benzoilo (50 μL en 500 μL de tolueno
anhidro). Tras 15 s, se introdujo el matraz en un baño de agua para detener la
reacción. Cuando la temperatura disminuyó a 40 °C, la mezcla se distribuyó en
dos tubos de 50 mL y se añadieron 15 mL de acetato de etilo a cada tubo para
desestabilizar los coloides. Finalmente, los nanocristales se centrifugaron a
13.580 rcf durante 20 min y el sedimento se dispersó en un volumen final de 4
mL de tolueno.

189
 Capítulo 4. Estabilización de NCs de CsPbBr3 en micelas poliméricas para su utilización en tira reactiva

La concentración de NCs de CsPbBr 3 de la disolución stock (2,1 µM) se

determinó según Maes et al, 47 tomando el valor medio calculado a partir de los
ε 355 y ε 400 en tolueno, considerando un tamaño medio de NC de 9,3 nm.

Intercambio de ligando de superficie (oleato de Cs por DDAB)

El intercambio de ligando se llevó a cabo según Imran et al, 38 con la

diferencia de que se realizó para un solo ciclo (en lugar de tres) durante la etapa
de purificación de la síntesis previamente descrita (y no al final del proceso).
Para ello, por cada tubo del crudo de reacción se añadieron 4 mL DDAB 0,025 M
en tolueno, junto con los 15 mL de acetato de etilo. La mezcla se centrifugó a
13.580 rcf durante 10 min y el sedimento se dispersó en un volumen total de 4
mL de tolueno.

Síntesis de nanocápsulas CsPbBr 3 @PS-b-PAA

La siguiente metodología ha sido adaptada a partir de Avugadda et al. 34

La Tabla 12 indica las condiciones de preparación de cada muestra duran te

el proceso de optimización. Cada muestra se preparó añadiendo 25 µL de la
disolución stock de NCs (pudiendo ser 2,1, 4,2 u 8,4 µM, que se corresponde con
los siguientes valores de D.O. 480 de una dilución 1/200 = 0,1, 0,2 y 0,4,
respectivamente), determinado volumen de PS-b-PAA (32 mg/mL en
THF/tolueno 1:9 v/v, lo que equivale a 941,17 µM) y el resto de tolueno hasta
completar un volumen total de 125 µL. Posteriormente, se añadió un
determinado volumen de antidisolvente (metanol), según las indicaciones de la
tabla. Las muestras se centrifugaron a 3.743 rcf durante 10 min y el sedimento
se dispersó en metanol. Posteriormente, se sonicaron y se prepararon para
analizar por TEM.

A continuación, se describe la metodología óptima para la síntesis de las

nanocápsulas. En un tubo de 50 mL se añadieron 3 mL de tolueno, 1 mL de PS -
b-PAA (32 mg/mL en THF/tolueno 1:9 v/v), 1 mL de CsPbBr 3 NCs (2,1 µM). La
mezcla se introdujo en baño de ultrasonidos durante 5 min. La adició n del
antidisolvente (metanol) se hizo de forma rápida por las paredes del tubo en
dos pasos, primero 6 mL y después 28 mL.

El volumen total (39 mL) se alicuotó en viales de vidrio (6,5 mL/vial) y se

centrifugó a 3.743 rcf durante 10 min. El sedimento se d ispersó en metanol (2
mL/vial) y se introdujo en baño de ultrasonidos durante ~ 10 min. Las
nanocápsulas se recolectaron a partir del sobrenadante tras centrifugar a 661
rcf durante 15 min.
190
 Capítulo 4. Estabilización de NCs de CsPbBr3 en micelas poliméricas para su utilización en tira reactiva

Fabricación de la tira reactiva

Los siguientes reactivos se inmovilizaron formando una línea en la

membrana de nitrocelulosa utilizando el dispensador AD1500 BioDot
(dispensando un volumen de 25 nL por punto en PBS 10 mM, pH 7,4. IgG anti -
cabra (2 mg/mL) producido en conejo como control positivo, BSA (1 mg/mL)
como control negativo y anticuerpo IgG anti-HIgG (αH-IgG) (1 mg/mL) en la línea
de prueba.

Los biorreceptores se fijaron a la membrana mediante incubación en estufa

37 °C durante 2 h. Después, la membrana se bloqueó utilizando un spray cargado
con la disolución de BSA 1% en PBS 10 mM, pH 7,4. Después de 5 min, se lavó
con PBS 10 mM, pH 7,4 y SDS 0,05% durante 20 min y se incubó durante toda la
noche en estufa a 37 °C. Posteriormente, se montó la almohadilla absorbente y
la membrana se cortó en tiras de 3 mm de ancho.

Preparación del conjugado

En un microtubo se añadieron 4,52 µL de αH-IgG (1 mg/mL) y 10 µL de las

nanocápsulas en PBS 10 mM pH 7,4 (volumen total 100 µL). La mezcla se incubó
en un agitador orbital a 500 rpm durante 2 h. El conjugado se centrifugó a 661
rcf durante 15 min y el sedimento se dispersó en 100 µL de tampón borato 20
mM, pH 7,4, 5% azúcar y 0,5% Tween 20.

Inmunoensayo en tira reactiva

Cada tira se incubó durante 10 min en un pocillo de placa ELISA,

conteniendo la disolución de conjugado (dilución 1/4) y la muestra en PBST en
un volumen total de 50 µL. Después se procedió a lavar cada tira. Para ello se
introdujeron por el extremo en pocillos conteniendo 50 µL de PBST durante 10
min.

Posteriormente se procedió a capturar la imagen de la tir a con un móvil

(modo manual, ISO 800). Para asegurar que todas las imágenes cumplían con la
misma iluminación, se utilizó un dispositivo propio, que consiste en una caja
opaca con una ranura para ubicar la tira en una misma posición, iluminada a una
distancia de 9 cm por un LED λ ex 365 nm.

191
 Capítulo 4. Estabilización de NCs de CsPbBr3 en micelas poliméricas para su utilización en tira reactiva

El análisis de la imagen se realizó con el programa ImageJ, obteniendo el

valor medio de intensidad de las líneas de prueba (TL), control positivo (CP),
control negativo y fondo (BK). La señal de la TL se normalizó (TL – BK / CP – BK).

Métodos de caracterización

La caracterización óptica de las partículas se llevó a cabo a partir de

diluciones 1/200 de las muestras. El espectro de absorción de la región UV -Vis
se obtuvo con el espectrofotómetro Agilent 8453 (Agilent Techno logies) y el
espectro de emisión de fluorescencia con el espectrofluorímetro PTI QMA4
(Horiba) con una λ ex fija a 355 nm.

Las imágenes de TEM se tomaron con un microscopio electrónico de

transmisión de 120 kV (JEM-1400, Flash). La distribución del tamaño de partícula
se representó con formato de histograma a partir de las medidas del tamaño de
partícula, obtenidas con el programa ImageJ sobre las imágenes de TEM. Las
fotografías de los viales se tomaron bajo lámpara UV (VL-4.C λ ex 254nm, Vilber
Lourmat).

192
 Capítulo 4. Estabilización de NCs de CsPbBr3 en micelas poliméricas para su utilización en tira reactiva

Tabla 12. Matriz con todas las variables de trabajo para la síntesis de NPs de
CsPbBr 3 @PS-b-PAA
Disolvente: tolueno Antidisolvente: metanol
Muestra D.O. 4 80 de NCs NCs (µL) PS-b-PAA Tolueno (µL) VI 1 (µL/min) V 1 (µL) V 2 (µL) V 3 (mL)
de dil 1/200 32 mg/mL (µL)
M1 C s - O A y 0,2 25 100 0 250 150 400 -
M2 D D AB
M3 0,4 25 100 0 250 150 400 -
M4 0,4 25 100 0 1500 150 400 -
M5 0,4 25 100 0 rápida 150 400 -
M6 y M11 US 0,04 25 100 0 rápida 550 - -
M7 y M12 US 0,04 25 100 0 rápida 150 400 -
M8 y M13 US 0,04 25 100 0 rápida 850 - -
M9 y M14 US 0,04 25 100 0 rápida 150 700 -
M10 y M15 U S 0,04 25 100 0 rápida 150 400 300
M16 0,04 25 100 0 rápida 150 700 -
M17 0,04 25 50 50 rápida 150 700 -
M18 0,04 25 25 75 rápida 150 700 -
M19 0,4 25 50 50 rápida 150 700 -
M20 0,4 25 25 75 rápida 150 700 -
M21 0,4 25 12,5 87,5 rápida 150 700 -
M22 0,4 25 6,25 93,75 rápida 150 700 -
M23 0,2 25 50 50 rápida 150 700 -
M24 0,2 25 25 75 rápida 150 700 -
M25 0,2 25 12,5 87,5 rápida 150 700 -
M26 0,2 25 6,25 93,75 rápida 150 700 -
M27 0,1 25 50 50 rápida 150 700 -
M28 0,1 25 25 75 rápida 150 700 -
M29 0,1 25 12,5 87,5 rápida 150 700 -
M30 0,1 25 6,25 93,75 rápida 150 700 -
M31 0,1 25 25 75 rápida 150 700 -
M32 0,1 500 500 1.500 rápida 3.000 14.000 -
M33 0,1 1.000 1.000 3.000 rápida 6.000 28.000 -

Los subíndices en M1 y M2 indican el tipo de ligando de superficie del NC: Cs-

OA y DDAB, respectivamente. Para el resto de las muestras (M3 -M31) se trabaja con
los cubiertos por Cs-OA. VI = velocidad de inyección. V = volumen. El subíndice en V
indica el número de la adición. Para V 2 y V 3 , la inyección se hace de forma rápida. M1 0-
M13 US se diferencian de sus homólogas (M6-M9) en que la inyección se ha realizado
en baño de ultrasonidos (US). Como indicador de la concentración de NCs, se incluye
el valor de D.O. 480 nm de una dilución 1/200 de la disolución stock. En naranja se
resaltan las condiciones selecionadas durante la optimización.
193
 Capítulo 4. Estabilización de NCs de CsPbBr3 en micelas poliméricas para su utilización en tira reactiva

Figura 74. Comparación del flujo de trabajo en (a) la metodología de referencia y

(b) en la metodología adaptada.

194
 Capítulo 4. Estabilización de NCs de CsPbBr3 en micelas poliméricas para su utilización en tira reactiva

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200
Capítulo 5. Estabilización de NCs de perovskita
en partículas poliméricas mediante
electrospraying

Capítulo 5
Estabilización de NCs de perovskita
en partículas poliméricas mediante
electrospraying

201
202
 Capítulo 5. Estabilización de NCs de perovskita en partículas poliméricas por electrospraying

5.1. Introducción

La técnica de electrospraying de atomización de líquidos, genera gotas muy

pequeñas al someter una disolución a alto voltaje. Estas se evaporan
rápidamente dando lugar a nano- o micro- partículas ya secas. 1,2

El electrospraying es una variante de otra técnica conocida con el nombre

de electrospinning. Si bien el principio es el mismo, en electrospraying se
producen partículas, mientras que en electrospinning se generan fibras. 3,4 Esto
depende de los parámetros fisicoquímicos implicados en el proceso.
Generalmente a partir de disoluciones con baja viscosidad se generan partículas,
mientras que cuando la viscosidad es alta se generan fibras. 5 Controlando otros
factores como: voltaje, velocidad de inyección, conductividad eléctrica y
propiedades del disolvente, es posible modificar el tamaño y morfología. 6

Tanto el electrospraying como el electrospinning se han empleado para

encapsular nanocristales (NCs) de perovskita de haluros metálicos en partículas
o fibras de polímeros especialmente hidrófobos como poliestireno (PS), 7–11
fluoruro de polivinilideno (PVDF), 12 polimetilmetacrilato (PMMA), 13,14
poli(estireno-butadieno-estireno) (PSBS), 15 poliacrilonitrilo (PAN), 16 y
policarbonato (PC). 17

Las aplicaciones de los materiales obtenidos por esta técnica se enmarcan

en múltiples áreas (Figura 75):

a) En bioimagen, como agentes de contraste en cultivos celulares. Por

ejemplo, Wang et al produjeron nanopartículas de CsPbBr 3 @PVDF
de 600 nm que marcan la membrana de células MCF-7 debido a la
interacción hidrofóbica del PVDF con los fosfolípidos de la
membrana. 12 De forma similar, Long et al obtuvieron MAPbBr 3 @PC
de entre 80-160 nm que son internalizadas por la célula al cabo de
4 h de incubación. 17

b) En detección biomolecular. Wang et al produjeron microesferas de

CsPbBr 3 @PMMA de 17 µm que utilizaron para detectar la enzima
fosfatasa alcalina (ALP) en muestras biológicas. 13 El modo de
detección se basa en un sistema off-on de la fluorescencia, donde
las nanohojas de MnO 2 actúan como quencher de la fluorescencia.
Cuando la enzima ALP está presente, cataliza una reacción cuyo
producto desencadena la reducción de MnO 2 a Mn +2 , y por tanto
deja de interferir con la fluorescencia emitida por las microesferas.

203
 Capítulo 5. Estabilización de NCs de perovskita en partículas poliméricas por electrospraying

c) En la fabricación de LEDs. Yang et al integraron microesferas de

CsPbBr 3 @PS de 4-5 µm como capa de conversión de color en un UV-
LED (405 nm). 8 Otros autores han producido simultáneamente fibras
con emisión azul, verde y roja y posteriormente las ha integrado
para fabricar emisores de luz blanca (WLEDs). 9,11

d) Diseño de patrones e integración en tejidos. Tian et al recurrieron a

la estrategia de electrospinning para generar tejidos luminiscentes
funcionales, concretamente destinados a uniformes de rescat e
marino. 11

Figura 75. Aplicaciones en (a) bioimagen, (b) sensado, (c) WLEDs, (d) tintas y tejidos.
Imágenes reproducidas de (a) Inorg Chem Comm. 2019, 106, 99–103, (b)
Coll and Surf A: Phys and Eng Aspects 2022, 634, 127909. (c-d) Nat Comm.
2023, 14, 234.

En este capítulo se plantea la encapsulación de NCs de perovskita mediante

electrospraying, con el fin de explorar sus aplicaciones en bioimagen celular.

Concretamente, se centra en la utilización del copolímero poli(estireno-co-

anhídrido maleico) (PSMA). Se trata de un polímero que no ha sido utilizado
hasta ahora para la estabilización de los NCs de perovskita, pero puede ser una
opción viable, ya que el bloque de PS proporciona una excelente resistencia en
agua, mientras que el anillo del anhídrido maleico se abre en agua, poniendo a
disposición grupos carboxilo, los cuales permiten su conjug ación a biomoléculas
a través de sus grupos amina, mediante la formación de enlace amida ( Figura
76).

204
 Capítulo 5. Estabilización de NCs de perovskita en partículas poliméricas por electrospraying

De modo que ofrece la posibilidad de conjugarse con anticuerpos de forma

covalente, siendo un recurso útil en el caso de plantearse la opción de llevar a
cabo un marcaje específico.

Figura 76. Estructura química del poli(estireno-co-anhídrido maleico) (PSMA) y unión

de la biomolécula (NH 2 -R) mediante la conjugación con EDC-NHS.

El PSMA tiene buena estabilidad térmica, es biocompatible y además es

soluble en disolventes orgánicos, como el tolueno, donde los NCs de CsPbBr 3
son estables, por lo que cumple con el requisito de poder preparar una
disolución que contenga ambos componentes.

El objetivo principal de esta investigación es determinar si electrospraying

es posible obtener nanopartículas de CsPbBr 3 @PSMA estables que puedan
utilizarse como agentes de contraste en bioimagen de cultivos celulares.

Para ello se plantean los siguientes objetivos específicos:

1. Producir partículas de CsPbBr 3 @PSMA mediante electrospraying.

2. Caracterizar las partículas resultantes y determinar si el

recubrimiento de PSMA contribuye a su estabilización en agua.

3. Evaluar el potencial de las partículas de CsPbBr 3 @PSMA como

agentes de contraste en cultivos celulares.

Esta investigación se ha realizado en el marco de una colaboración, llevada

a cabo en el Instituto de Agroquímica y Tecnología de los Alimentos (IATA),
concretamente en el grupo de Envases, dirigido por la Dra. Amparo López Rubio
y el Grupo de Elementos Traza, bajo la supervisión de Vicenta Devesa, donde
disponían de la experiencia y equipamiento necesario para poner a punto la
técnica de electrospraying y evaluar el potencial de las partículas en cultivos
celulares.

205
 Capítulo 5. Estabilización de NCs de perovskita en partículas poliméricas por electrospraying

5.2. Resultados

En primer lugar, se sintetizaron los NCs de CsPbBr 3 por el método de hot-

injection, 18 y se añadieron a una disolución de PSMA al 5% (p/v) en tolueno. La
disolución se sometió a electrospraying en un equipo de diseño propio, a un
caudal de 0,3 mL/h, un voltaje de 25 kV y una distancia de 15 cm entre la aguja
y el colector. Este mismo proceso se repitió con una disolución de NCs y otra de
PSMA al 5% (p/v).

Posteriormente, las partículas depositadas sobre el colector se r ecogieron

mediante raspado y se midió su emisión de fluorescencia tras dispersarlas en
agua (Figura 77a). La muestra de NCs no se pudo desprender de la superficie del
colector, por su bajo contenido en sólidos, por lo que la medida de fluorescencia
se realizó a partir de la disolución de NCs en tolueno. La anchura a media altura
(fwhm) de las partículas de CsPbBr 3 @PSMA es de 28 nm y su máximo de emisión
se sitúa en 515 nm, coincidiendo con el control de NCs. La señal en la región de
420-480 nm se atribuye a la emisión del PSMA.

Figura 77. (a) Espectro de emisión de fluorescencia de las partículas de

CsPbBr 3 @PSMA y de PSMA dispersas en agua y de los NCs de CsPbBr 3 en
tolueno. (b) Seguimiento de la emisión máxima de fluorescencia en agua
durante 4 h. En la esquina superior se muestran las partículas de
CsPbBr 3 @PSMA en agua. Los espectros están registrados a una λ ex 355 nm.

La Figura 77b muestra el seguimiento de la fluorescencia de los NCs de

CsPbBr 3 y las partículas de CsPbBr 3 @PSMA durante 4 h tras dispersarlas en agua.
Transcurrido este tiempo, los NCs encapsulados en PSMA, retienen
prácticamente el 90% de su fluorescencia inicial, mientras que en los NCs control
decae rápidamente al cabo de 1 h. Por tanto, este primer resultado confirma
206
 Capítulo 5. Estabilización de NCs de perovskita en partículas poliméricas por electrospraying

que el PSMA puede utilizarse como recubrimiento para mejorar la estabilidad

de los NCs de CsPbBr 3 en agua.

A continuación, se llevó a cabo la caracterización morfológica de las

muestras mediante microscopía electrónica de barrido de emisión de campo de
alta resolución (HRFESEM) a partir del análisis de los portamuestras adheridos
sobre la superficie del colector durante el proceso de atomización.

Los resultados de la Figura 78 indican que las muestras preparadas a partir

de las disoluciones que contienen PSMA al 5% (p/v) producen partículas de
tamaño micrométrico (10 µm), con una morfología semiesférica que se atribuye
a la rápida volatilización del disolvente. 13 Mientras que, en ausencia de
polímero, los NCs de CsPbBr 3 se disponen formando una monocapa, de modo
similar a cuando se deposita una gota de la disolución sobre una rejilla de TEM.

La captura de imágenes con el detector de electrones retrodispersados

permite distinguir la presencia de metales pesados, como el Pb, por lo que es
posible localizar a los NCs en la muestra en aquellas regiones que se muestran
más brillantes (Figura 78 a4 y b4).

Figura 78. (a1, b1 y c1) Caracterización de las partículas de CsPbBr 3 , CsPbBr 3 @PSMA
y PSMA por HRFESEM. En el panel inferior se incluye una región de la imagen
tomada con (b3, c3 y d3) el detector de electrones secundarios SE2 y con
(b4, c4 y d4) el detector de electrones retrodispersados. (a2, b2 y c2)
Imagen bajo luz UV (λ ex 254 nm)

207
 Capítulo 5. Estabilización de NCs de perovskita en partículas poliméricas por electrospraying

El paso siguiente fue optimizar la metodología para obtener partículas con

un tamaño inferior, ya que 10 µm es un tamaño relativamente grande para su
utilización en bioimagen.

La concentración de polímero es uno de los parámetros que más influye en

el tamaño de la partícula. Cuanto mayor es la concentración de polímero, más
viscosa es la disolución y mayor es el tamaño de la partícula final. De modo que
se probaron disoluciones con un menor contenido en PSMA: 0,1, 1 y 2,5% (p/v).

Todas las disoluciones se usaron recién preparadas para minimizar el

tiempo de evaporación del disolvente y se sometieron a electrospraying durante
3h. Pasado este tiempo, se analizaron las partículas por HRFESEM ( Figura 79).

Según estos resultados, se observa que al reducir la concentración de

PSMA, disminuye el tamaño y la dispersión de las partículas. En l a muestra de
PSMA 2,5% (p/v) las partículas aun presentan un tamaño relativamente grande
(7,4 ± 4,9 µm). Sin embargo, cuando se reduce la concentración de PSMA al 1%
(p/v) el tamaño y la dispersión disminuyen (1,74 ± 0,31 µm), incluso en la
muestra de PSMA 0,1% (p/v) se distinguen algunas partículas de tamaño
nanométrico (72,75 ± 30,35 nm) que coexisten con nanocristales sin encapsular.

Las partículas obtenidas con la concentración más baja de polímero (PSMA

0,1%) son las más adecuadas para su utilización en bioimagen intracelular, ya
que el límite establecido para que sean endocitadas por las células es un tamaño
< 200 nm. Sin embargo, no fue posible recogerlas del colector, posiblemente
porque su proporción en la muestra es muy baja. Como se observa en la Figura
79a, coexisten con una población mayoritaria de NCs sin encapsular, y de la
misma forma que ocurría inicialmente con la muestra control, no pueden
recuperarse del colector mediante raspado, debido al bajo contenido en sólidos.

De este modo, aunque la condición siguiente (PSMA 1%) genera partículas

de entre 1-2 µm y por tanto se alejan del límite establecido para ser endocitadas,
es posible recurrir a células con capacidad fagocítica, como por ejemplo los
macrófagos, que pueden internalizar partículas del tamaño de unas pocas
micras. 19

208
 Capítulo 5. Estabilización de NCs de perovskita en partículas poliméricas por electrospraying

Figura 79. (a-c) Imágenes de HRFESEM y (d) tamaño medio de partícula en función
de la concentración de PSMA (0,1%, 1% y 2 ,5% (p/v)). Las imágenes a2, b3
y c3 están tomadas con el detector de electrones retrodispersados in lens
EsB.

Por ejemplo, Nicolete et al demostraron con macrófagos de ratón J774 la

internalización celular de micropartículas de 6,5 µm. 20 Zhang et al seleccionaron
macrófagos de ratón de la línea RAW 264.7 en una prueba de concepto de
bioimagen con micropartículas multicolores de PS con un tamaño de 3 -5 µm. 21
En este caso, se seleccionó un cultivo de macrófagos de esta misma línea celular
para comprobar la compatibilidad de las partículas con este recubrimiento en
bioimagen celular.

En una placa de 12 pocillos se establecieron cuatro condiciones (A -D) tal y

como se muestra en la Figura 80. En todas ellas se crecieron macrófagos RAW
264.7 durante 2 días a 37 °C. Las muestras A y B se crecieron sobre un
cubreobjetos de vidrio previamente depositado en el pocillo, para su posterior
análisis por microscopía de fluorescencia.

Transcurrido el período de crecimiento, se añadieron las partículas

fluorescentes a todas las muestras (excepto C) y se incubaron durante 2 h a
37 °C. La muestra A, como control positivo de fagocitosis (CTL +), se incubó con
FluoSpheres Rojo Nilo, que son partículas fluorescentes comerciales de
poliestireno (PS) funcionalizadas con grupos carboxilo y un tamaño de 1 µm. 22
Las muestras B y D se incubaron con las partículas de CsPbBr 3 @PSMA. La
muestra C, como control negativo (CTL-), no se incubó con partículas.

Finalizado el tiempo de incubación, las muestras A y B se tiñeron con

diamidino-2-fenilindol (DAPI) y se prepararon para ser analizadas por
209
 Capítulo 5. Estabilización de NCs de perovskita en partículas poliméricas por electrospraying

microscopía de fluorescencia, mientras que las muestras C y D se sometieron a

un proceso de lisis celular y su contenido se midió con un lector de placas,
registrando la fluorescencia a una longitud de onda de emisión de 520 nm.

De esta forma, se comprueba de dos formas distintas la interacción de las

CsPbBr 3 @PSMA con las células, en primer lugar, visualizando directamente la
localización de las partículas por microscopía de fluorescencia en el cultivo
celular y, en segundo lugar, analizando el contenido celular tras un proceso de
disgregación.

Figura 80. Esquema del diseño experimental. Las muestras A y B se incuban en

presencia de las partículas (FluoSpheres Rojo Nilo y CsPbBr 3 @PSMA,
respectivamente), los núcleos de las células se tiñen con DAPI y los
resultados se analizan por CSLM. La muestra C es un control negativo y la
muestra D se incuba con las partículas CsPbBr 3 @PSMA. Ambas muestras se
someten a un proceso de lisado celular y el contenido se analiza con un
lector de placas, mediante el registro de su fluor escencia a 520 nm.

Los resultados de las muestras A-D se resumen en la Figura 81. La

colocalización de la emisión de fluorescencia roja de las FluoSpheres con la
emisión azul de los núcleos de las células del grupo CTL+ confirma la capacidad
de los macrófagos RAW 264.7 para fagocitar partículas con un tamaño mínimo
de 1 µm (muestra A).

Por otro lado, la fluorescencia verde en la muestra B se corresponde con

la presencia de micropartículas de CsPbBr 3 @PSMA que han interaccionado con
las células. Sería necesario delimitar la membrana de la célula con otro
marcador para poder determinar si han sido internalizadas o simplemente se
encuentran adheridas a la membrana.

210
 Capítulo 5. Estabilización de NCs de perovskita en partículas poliméricas por electrospraying

Los resultados de cuantificación de fluorescencia del contenido del lisado

celular demuestran que la señal de la muestra D se atribuye a la presencia de
partículas CsPbBr 3 @PSMA que han interaccionado con los macrófagos durante
el período de incubación. Además, la detección de esta señal implica que las
partículas resisten a las condiciones de cultivo y al proceso de permeabilización
y disgregación celular, confirmando la estabilidad de los NCs de CsPbBr 3 al estar
recubiertos por PSMA.

Figura 81. Resultados de la emisión de fluorescencia de las muestras A -D. La

secuencia de imágenes de microscopía de fluorescen cia de las muestras
A y B, comienza con (a1 y b1) fluorescencia azul del núcleo de las células
teñido con DAPI, seguido de (a2 y b2) la emisión roja/verde de las
FluoSpheres/CsPbBr 3 @PSMA, respectivamente y de (a3 y b3) la fusión de las
imágenes anteriores. En el histograma se muestra la emisión de
fluorescencia a 520 nm del contenido del lisado celular de las muestras C
y D, cuantificada con un lector de placas. Cada una de las condiciones
incluye dos réplicas.

211
 Capítulo 5. Estabilización de NCs de perovskita en partículas poliméricas por electrospraying

5.3. Conclusiones

En este trabajo se ha recurrido por primera vez al copolímero de

poli(estireno-co-anhídrido maleico (PSMA) para encapsular NCs de CsPbBr 3
mediante electrospraying.

Se ha demostrado que este polímero no interfiere con las propiedades

ópticas de los NCs y proporciona un recubrimiento resistente, reteniendo el 90%
de su fluorescencia inicial 4 días después de dispersarse en agua.

Con el equipo disponible, se ha determinado que, reduciendo la

concentración de PSMA en la disolución que se somete a electrospraying, es
posible producir nanopartículas de unos 70 nm. Sin embargo, la dificultad para
recogerlas del colector por su bajo contenido en sólidos ha llevado a establec er
una concentración mínima de PSMA 1% (p/v), con la cual el tamaño de partícula
asciende a 1-2 µm.

Aunque este tamaño se aleja de los criterios fijados para esta tesis, es
relativamente pequeño si se compara con trabajos similares (Tabla 13). Por
ejemplo, Yang et al produjeron microesferas de PS de 4-5 µm, 8 Zhou et al
obtuvieron microesferas de PS de 10-15 µm, 10 y Wang et al generaron
micropartículas de PMMA que alcanzan un tamaño de 17 µm. 13

Tabla 13. Características de los NCs de perovskita estabilizados en partículas

poliméricas mediante electrospraying
MHP@Recubrimiento Diámetro PLQY Estabilidad en Aplicación Ref.
(µm) (%) agua

CsPbBr 3 @PSMA 1,7 N.D 4 días Bioimagen Este

trabajo
CsPbBr 3 @PS 4-5 52 30 días LEDs 8

CsPbBr 3 @PS 10-15 43 N.D N.D 10

CsPbBr 3 @PVDF 0,6 N.D 3 días Bioimagen 12

CsPbBr 3 @PMMA 17 N.D 20 días Sensor de 13

fosfatasa alcalina
MAPbBr 3 @PC 0,16 70 60 días Bioimagen 17

Es posible seguir optimizando otros parámetros que influyen en el proceso,

además de la concentración de polímero, como por ejemplo el voltaje, la
distancia de la aguja al colector o el caudal. Incluso, cabe la posibilidad de
incorporar una lámpara infrarroja para acelerar la volatilización del disolvente.
De esta manera Yong et al consiguieron producir partículas de 80-160 nm. 17
212
 Capítulo 5. Estabilización de NCs de perovskita en partículas poliméricas por electrospraying

Independientemente de estos factores, hay que considerar que el modo de

recolección de las partículas mediante el raspado del colector puede hacer que
se aglomeren y por tanto, el tamaño final de partícula sea superior al estimado
inicialmente. En este sentido deben plantearse otras opciones para evitarlo. Por
ejemplo, Wang et al atomizaron directamente la disolución sobre éter de
petróleo y obtuvieron partículas de CsPbBr 3 @PMMA de 100 nm, 23 y Dellacasa
et al obtuvieron partículas de PSMA de 170 nm al atomizar la disolución sobre
etanol. 24

Finalmente, las partículas de CsPbBr 3 @PSMA obtenidas por

electrospraying se han incubado en un cultivo de macrófagos con el fin de
evaluar su potencial como agentes de contraste en bioimagen celular. Los
resultados de esta prueba de concepto demuestran que, si bien algunas células
llegan a estar marcadas con la fluorescencia de estas partículas, el porcentaje
es bajo, probablemente porque las partículas se agregan durante el proceso de
recolección o porque el tiempo de incubación de 2 h no sea suficiente para que
las células las fagociten.

En base a los resultados, es posible que las técnicas de atomización no sean

las más apropiadas para fabricar nanopartículas que puedan aplicarse en
bioimagen. Sin embargo, puede ser una alternativa para depositar películas de
NCs sobre grandes superficies para la fabricación de células solares, en lugar de
por spin-coating, que está limitada para áreas de menor tamaño. 25,26

Con todo ello, se ha demostrado por primera vez que el recubrimiento de

PSMA estabiliza a los NCs de perovskita en agua, medio de cultivo y frente
condiciones agresivas durante la permeabilización y disgregación celular. En el
caso de recurrir a otras estrategias que permitan reducir en mayor medida el
tamaño de partícula puede convertirse en una opción interesante por su alta
estabilidad térmica y biocompatibilidad.

213
 Capítulo 5. Estabilización de NCs de perovskita en partículas poliméricas por electrospraying

5.4. Materiales y métodos

Reactivos

Carbonato de cesio 99,9%, Bromuro de plomo (II) ≥98%, 1-Octadeceno

(ODE) grado técnico 90% y poli(estireno-co-anhídrido maleico) (PSMA) con un
índice de fluidez 1,9 g/10 min (230 °C/2,16 kg), anhídrido maleico 14 wt% de
Sigma-Aldrich. Ácido oleico (OA) grado técnico 90% y Oleilamin a (OAm)
(contenido aproximado C-18 80-90%) comprados en Fisher Scientific. Tolueno
anhidro 99,8% obtenido de Scharlab.

Síntesis de NCs de CsPbBr 3

Los NCs de CsPbBr 3 se sintetizaron de acuerdo con la metodología de hot-

injection descrita por Protesescu et al. 18 Brevemente, en un matraz de 100 mL
de 3 bocas sumergido en un baño de silicona sobre una placa calefactora, se
añadieron 138 mg PbBr 2 , 10 mL de ODE y 1 mL de OA y se aplicó vacío hasta
alcanzar una temperatura de 120 °C (~ 45 min). Posteriormente, se inyectó 1 mL
de OAm bajo flujo de Ar y la temperatura se incrementó a 170 °C. Al alcanzar
165 °C, se inyectaron rápidamente 0,8 mL de oleato de cesio previamente
calentado en la misma placa. Después de 10 s, la reacción se atemperó
sumergiéndola en un baño de hielo.

Para purificar los NCs sintetizados, se dispersaron en 25 mL de tolueno,

seguido de centrifugación a 6.654 rcf durante 10 min. Se eliminó el
sobrenadante y el sedimento se dispersó en 25 mL de tolueno. La disolución se
centrifugó a 10.397 rcf durante 10 min y se almacenó el sobrenadante.

El oleato de cesio se preparó de la siguiente manera: en un matraz de 50

mL de 2 bocas, sumergido en un baño de silicona sobre una placa calefactora,
se añadieron 205 mg de Cs 2 CO 3 y se aplicó vacío durante 10 min.
Posteriormente, 10 mL de ODE y 0,620 mL de OA se inyectaron bajo atmósfera
inerte de Ar y la temperatura se incrementó a 120 °C en condiciones de vacío y
agitación magnética suave durante 40 min. Una vez disuelto el Cs 2 CO 3 , la
temperatura se subió a 150 °C bajo Ar y una vez alcanzada se atemperó la
reacción.

214
 Capítulo 5. Estabilización de NCs de perovskita en partículas poliméricas por electrospraying

Preparación de partículas de CsPbBr 3 @PSMA

Inicialmente el polímero PSMA (en perlas) se disolvió en 2,5 mL de tolueno,

obteniendo disoluciones concentradas al 0,2, 2, 5 y 10% (p/v). Posteriormente,
se añadieron 2,5 mL de NCs de CsPbBr 3 y la mezcla se homogeneizó mediante
agitación magnética durante 5 min. Todas las disoluciones se prepararon
previamente a su utilización para minimizar la evaporación del disolvente .

La jeringa de vidrio de 5 mL (Ruthe) se cargó con 3 mL de la disolución. Uno

de los electrodos del generador se conectó a la aguja de la jeringa y el otro al
colector de aluminio. La distancia entre la aguja y el colector fue de 15 cm. La
velocidad de inyección de la bomba de jeringa (KD Scientific 100) se fijó a 0,3
mL/h y se estableció un voltaje de 25 kV en el generador (Acopian Power Supply
Model P02HP15).

Sobre el colector se adhirieron portamuestras de aluminio con cinta

conductora de doble cara y, tras un tiempo de electrospraying de 3h, se
despegaron para caracterizar las muestras por microscopía electrónica de
barrido de alta resolución (HRFESEM).

Finalmente, el colector se raspó con una rasqueta para recuperar el resto

de las partículas adheridas a su superficie y se almacenaron en un vial. Para
evitar contaminación cruzada entre muestras, la jeringa, la aguja y el colector
se lavaron con tolueno y etanol tras su uso.

Incubación de las partículas con células de macrófagos

En una placa de 12 pocillos, se depositó un cubreobjetos de vidrio de

borosilicato de 10 mm de diámetro (Menzel Gläser) en los pocillos destinados a
las muestras A y B, mientras que los de C y D se dejaron vacíos. La placa se
irradió con luz UV durante 90 min en una cabina de seguridad biológica con flujo
laminar.

Posteriormente, se incubaron las células de macrófago de ratón de la línea

RAW 264.7 a una densidad de 500.000 células/pocillo durante 2 días en
Dulbeccos modified Eagles Medium (DMEM, Gibco™), suplementado con 10%
(v/v) de Suero Bovino Fetal (FBS), 1% de HEPES, 1% de penicilina y 1% de
anfotericina B, en una estufa a 37 °C con atmósfera de CO 2 al 5% y humedad del
95%.

215
 Capítulo 5. Estabilización de NCs de perovskita en partículas poliméricas por electrospraying

El medio se eliminó por aspiración. Se añadieron 300 µL/pocillo de las

partículas dispersas en DMEM suplementado y se mantuvo en estufa dur ante 2h
a 37 °C. La muestra A se incubó con las FluoSpheres Rojo Nilo (Invitrogen),
mientras que las muestras B y D con las micropartículas CsPbBr 3 @PSMA.
Transcurrido este tiempo, los pocillos se lavaron 3 veces con 400 µL de tampón
fosfato salino (PBS) 1x, pH 7,4.

Tinción de las muestras

Las muestras A y B se fijaron con 250 µL/pocillo paraformaldehído (PFA)

4% durante 15 min. Después, se eliminó el PFA con 3 lavados de PBS 1x y los
núcleos de las células se tiñeron añadiendo 250 µL/pocillo de diamidino -2-
fenilindol (DAPI). Tras 5 min en oscuridad, los pocillos se lavaron 3 veces con
PBS 1x y el cubreobjetos se montó con Prolong Antifade sobre un portaobjetos
de vidrio para analizar la muestra por microscopía de fluorescencia.

Lisis celular

Las células de las muestras C y D se despegaron del pocillo añadiendo 150

µL/pocillo del reactivo de disociación celular (GCDR, Stemcell). Su contenido se
centrifugó a 7.500 rcf durante 5 min y se eliminó el sobrenadante. El sedimiento
se resuspendió en 150 µL de Tritón X-100 (0,1% v/v en PBS) y se sometió a
ultrasonidos durante 10 min en baño de hielo para favorecer la disrupción
celular. El contenido del lisado se transfirió a una placa multipocillos opaca para
medir su fluorescencia (λ ex 295 nm, λ em 520 nm).

Métodos de caracterización

El espectro de emisión de fluorescencia se obtuvo con un

espectrofluorímetro PTI QMA4 (Horiba) con λ ex fija a 355 nm. La caracterización
de las partículas se realizó por HRFESEM (GeminiSEM 500, ZEISS). Las fotografías
de los portamuestras se tomaron bajo lámpara UV (VL-4.C λ ex 254nm, Vilber
Lourmat). Las muestras de los cultivos celulares se visualizaron con un
microscopio de fluorescencia (Eclipse 90i, Nikon) y el contenido del lisado
celular se midió a una longitud de onda de 520 nm con un lector de placas
(CLARIOstar, BMG Labtech).

216
 Capítulo 5. Estabilización de NCs de perovskita en partículas poliméricas por electrospraying

5.5. Bibliografía

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219
220
Capítulo 6. Conclusiones

Capítulo 6
Conclusiones

221
222
 Capítulo 6. Conclusiones

En esta tesis se han explorado varias estrategias de encapsulación para la

estabilización de nanocristales de perovskita de haluros metálicos en medio
acuoso, con el fin de desarrollar su potencial como marcadores luminiscentes
versátiles en sistemas analíticos o bioimagen in vitro.

Los resultados de esta investigación muestran que es posible producir

cuatro tipos de partículas, basadas en recubrimientos de sílice o poliméricos,
que permiten la transferencia de nanocristales de perovskita luminiscentes en
medio acuoso y los protegen frente a su degradación.

1. Nanopartículas core-shell de CsPb 2 Br 5 @SiO 2

En primer lugar, se ha desarrollado una metodología que consiste en la

adición lenta del alcoxisilano y el catalizador sobre los NCs presintetizados de
CsPbBr 3 . Como resultado se ha obtenido una población monodispersa de NPs
con estructura core-shell, donde unos pocos núcleos de perovskita CsPb 2 Br 5
quedan envueltos por una capa de sílice.

Estas NPs se caracterizan por tener un tamaño de 32 nm, emiten

fluorescencia en el azul y pueden dispersarse homogéneamente en agua y
tampón salino, condiciones en las que mantienen sus propiedades ópticas
durante al menos 3 días. Por último, como prueba de concepto, se ha
demostrado el potencial de las NPs core-shell como marcadores fluorescentes
en un inmunoensayo directo entre el anticuerpo anti-BSA y su diana (BSA). Si
bien, este estudio constituye una primera evidencia de su utilización como
marcador, el bajo rendimiento cuántico de photoluminiscencia (PLQY 5%)
conduciría a una baja sensibilidad en el caso de implantarse en un sistema
analítico.

2. Nanopartículas core-shell de CsPbX 3 @SiO 2 (X= Cl/Br, Br y I)

En segundo lugar, se ha aprovechado que la transformación de NCs de

Cs 4 PbX 6 en CsPbX 3 ocurre en condiciones compatibles con la metodología sol-
gel para obtener NPs core-shell de CsPbX 3 @SiO 2 con tamaños de 20-30 nm.

Una de las novedades que aporta este trabajo es que no se centra

únicamente en la habitual composición de bromo, sino que extiende la
metodología hacia otras composiciones de haluro. Concretamente, se han
obtenido NPs que emiten en el azul, en el verde y en el rojo (X = Cl/Br, Br y I,
respectivamente), siendo un paso clave hacia el multiplexado basado en la
emisión multicolor.

223
 Capítulo 6. Conclusiones

Esta metodología genera un recubrimiento de sílice que mejora la

estabilidad estructural y eficiencia de emisión con respecto a los NCs libres,
alcanzando valores de PLQY de 18 % y 57% para la composición mixta de Cl/Br y
Br, respectivamente.

Posteriormente, la aplicación de un tratamiento térmico adicional ha

permitido comprobar el potencial de las partículas como marc adores
fluorescentes en un inmunoensayo directo entre Omalizumab (anti -IgE) y su
receptor. Sin embargo, es necesario reconsiderar las condiciones de síntesis o
buscar una alternativa al tratamiento térmico como solución a la estabilización
de las partículas en medio acuoso, ya que esta etapa altera las propiedades
ópticas de las partícula resultantes y causa problemas de agregación.

3. Nanopartículas CsPbBr 3 @PS-b-PAA

En tercer lugar, se han obtenido nanopartículas poliméricas mediante la

estrategia de coprecipitación, donde el cambio de solubilidad ha inducido el
autoensamblaje del polímero en micelas, atrapando múltiples nanocristales de
perovskita en su interior.

Las NPs de CsPbBr 3 @PS-b-PAA exhiben un PLQY relativamente alto (60%),

se dispersan homogéneamente en medio acuoso y mantienen una excelente
estabilidad, características que cumplen con las expectativas definidas al
comienzo de esta tesis. Además, la optimización de la síntesis, ha derivado en
una metodología rápida, sencilla y reproducible, cuya producción es fácilmente
escalable sin la necesidad de equipamiento sofisticado.

Considerando todas estas características, prevemos que tienen verdadero

potencial como marcadores luminiscentes en tira reactiva como plataforma
analítica, pudiendo competir en sensibilidad frente a las NPs de oro coloidal
(marcador convencional) y en simplicidad de producción frente a los desarrollos
basados en la utilización de QDs clásicos. Si bien, queda un largo recorrido para
que se convierta en una realidad, esta tesis ha contribuido con resultados
iniciales de la utilización de estas nanopartículas para la detección de H-IgGs,
siendo la base para demostrar por primera vez la viabilidad de los NCs de
perovskita en tira reactiva.

4. Micropartículas CsPbBr 3 @PSMA

En cuarto lugar, la estrategia de electrospraying ha permitido encapsular

NCs en partículas poliméricas a partir de la atomización de la disolución que
contiene ambos componentes. Sin embargo, el gran tamaño y polidispersión de
las partículas resultantes, del orden de varios micrómetros, hace que no sea la
224
 Capítulo 6. Conclusiones

estrategia más adecuada para el fin que se pretende en esta tesis . No obstante,
puede interesante para la deposición de nanocristales en finas películas que
puedan integrarse en LEDs, pantallas o células solares.

En resumen, esta tesis se ha enfrentado al desafío que supone la

inestabilidad intrínseca de los nanocristales de perovskita, desarrollando
estrategias para su estabilización en medio acuoso con el fin de explorar su
potencial en biosensado o bioimagen. De todas ellas, se puede considerar que,
hasta ahora, la metodología de encapsulación por coprecipitación en micelas
poliméricas promete ser la estrategia más viable, por su sencillez y
reproducibilidad en la estabilización de NCs de perovskita sin deteriorar
siginificativamente sus propiedades ópticas. Se espera que la información
proporcionada resulte valiosa para reproducir esta metodología con otras
composiciones de haluro, o alternativas menos tóxicas comprometidas con el
desarrollo sostenible de nanomateriales basados en nanocristales de perovskita .

225
226
 Chapter 6
Conclusions

227
228
 In this thesis, metal halide perovskite nanocrystals were stabilized in
aqueous media through several encapsulation strategies to produce versatile
luminescent labels with application in analytical systems and in vitro bioimaging.

This research led to the synthesis of four types of water-stable particles,

based on silica or polymeric coatings which prevented perovskite nanocrystals
from degradation in aqueous environments.

1. CsPb 2 Br 5 @SiO 2 core-shell nanoparticles

A new methodology consisting of the slow addition of the alkoxysilane
precursor and catalyst into previously synthesized CsPbBr 3 NCs solution was
developed. As a result, a monodisperse population of core-shell NPs was
obtained, where some CsPb 2 Br 5 cores are coated within a silica shell.

The resulting NPs have a size of 32 nm and can be homogeneously

dispersed in water and saline buffer, maintaining their blue emission at least for
3 days. Finally, as a proof of concept, their potential as f luorescent labels was
assessed in a direct immunoassay involving anti-BSA antibody and its target (BSA
protein). While this study constitutes initial evidence, the low
photoluminescence quantum yield (PLQY 5%) would lead to low sensitivity if
implemented in an analytical system.

2. CsPbX 3 @SiO 2 core-shell nanoparticles, (X= Cl/Br, Br y I)

A methodology that combines Cs 4 PbX 6 NCs transformation into CsPbX 3 NCs
with the sol-gel process was optimized to produce core-shell CsPbX 3 @SiO 2 NPs
with sizes ranging between 20 and 30 nm.

One of the novelties of this work is applying the methodology to other

halide compositions apart from bromine. As a result, multicolor emitting
nanoparticles (X = Cl/Br (blue), Br (green), and I (red), respectively) were
produced, which is key for multiplexing assays. This methodology produces a
silica coating, enhancing the structural stability and emission efficiency
compared to free NCs, with PLQY values of 18% and 57% regarding the Cl/Br and
Br compositions, respectively.

After applying an additional thermal treatment, which ensured the water

resistance, the potential of the resulting particles as fluorescent markers was
assessed in a direct immunoassay between Omalizumab (anti-IgE) and its
receptor. Regarding this methodology, the synthesis conditions must be
adjusted to produce a more compact silica network. Another option is seeking
an alternative to applying a thermal treatment, since this step alters the optical
properties of the resulting particles and causes some aggregation problems.
229
3. CsPbBr 3 @PS-b-PAA nanoparticles
Polymeric nanoparticles were synthesized by a coprecipitation
methodology, where a change in solubility triggers the pol ymer self-assembly
behavior into micelles, entrapping multiple perovskite nanocrystals during this
process.

CsPbBr 3 @PS-b-PAA NPs exhibit a relatively high PLQY, disperse well in

aqueous media, and maintain excellent stability, accomplishing the expected
requirements established at the beginning of this thesis. Moreover, the
optimization process resulted in a faster, simpler, more reproducible, and easy-
to-scale-up methodology without sophisticated equipment.

Considering all these characteristics, we envision that they have real

potential as luminescent labels in lateral flow as the analytic platform,
competing in sensibility with the conventional colloidal Au NPs, and also in
terms of cost-effective production in comparison to traditional QDs-based
developments. While there is still a long way to become a real possibility, this
thesis contributes with initial results using these nanoparticles for H -IgGs
detection, paving the way towards the use of perovskite NCs in lateral flow for
the first time.

4. CsPbBr 3 @PSMA microparticles

Perovskite NCs can be embedded into polymeric particles by
electrospraying a solution containing both components. Given the high size and
polidispersion of the resulting particles, in the range of several micrometers, it
is not the best strategy according to the main objective of this thesis. However,
this technique may be interesting for the deposition of NCs on thin films with
applications in LEDs, displays, or solar cells.

To sum up, this thesis faces the intrinsic instability of perovskite

nanocrystals by developing strategies for their stabilization in aqueous media to
explore their potential in biosensing or bioimaging. Among all of them,
encapsulation by coprecipitation should be considered the most viable strategy
so far, due to the simplicity and reproducibility to stabilize perovskite
nanocrystals without producing significant changes in their optical properties.
The information offered is expected to be useful to reproduce this methodology
with other halide compositions or less toxic alternatives in order to develop
sustainable perovskite-based nanomaterials.

230