Asignatura: Microbiología 6
1. Título práctica de laboratorio:
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE AGENTES MICÓTICOS
Integrantes: Código:
2. OBJETIVOS
General
Conocer las técnicas más empleadas para el aislamiento e identificación de levaduras y hongos
filamentosos y sus aplicaciones en la microbiología.
Específicos:
Diferenciar las estructuras morfológicas macroscópicas y microscópicas de hongos filamentosos y
levaduriformes.
Aislar e identificar agentes micóticos a partir de muestras medioambientales y biológicas.
Evaluar la capacidad antagónica y de control que se ejercen entre especies de hongos como
mecanismos de control de crecimiento micótico.
3. REFERENTES CONCEPTUALES
Los hongos constituyen un reino propio y heterogéneo, constituido por organismos unicelulares
microscópicos (levaduras) y organismos pluricelulares visibles a simple vista (setas) (1). Están
conformados por células eucariotas, caracterizadas por tener una pared rica en quitina, no poseen
flagelos, su metabolismo es heterótrofo y pueden tener reproducción sexual y asexual (2). De
aproximadamente 90.000 especies existentes, menos de 200 se han reportado como patógenas en
humanos (3). Los hongos son clasificados de manera general de acuerdo a su estructura y forma de
reproducción en tres grandes grupos: Glomeromycota (Mucormicetos anteriormente zygomicetos),
Ascomycota y Basidiomycota (Figura 1).
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Figura 1. Microfotografías de especie representativa de los tres grupos de hongos. De derecha a
izquierda: Glomeromycota, Ascomycota y Basidiomycota. Fuente:
https://i.pinimg.com/originals/9c/f4/f5/9cf4f5ea9d0587e5843608aa5674919d.gif, http://3.bp.blogspot.com/-
uNQkwV84kCw/UEItSV68yrI/AAAAAAAAHrQ/DkssIAGJzfg/s1600/15-+T_tonsurans+1000X.jpg,
https://www.bio.fsu.edu/~outlaw/Fungi1005L/lrg.Photos/BasidiumLrg.jpg
En la naturaleza los hongos desempeñan un papel esencial en el procesamiento de la materia
orgánica. A nivel industrial son empleados en la producción de quesos, pan, bebidas alcohólicas,
producción de antibióticos, medicamentos inmunosupresores, entre otras aplicaciones. Desde el punto
de vista patogénico pueden ser agentes causales de grandes pérdidas en el campo de la agricultura.
En el campo de la salud, pueden causar micosis en animales y humanos, generalmente oportunistas
que pueden llegar a ser severas (1, 2).
Los hongos crecen bien en medios artificiales y en general tienen requerimientos simples. El medio de
cultivo más empleado para su aislamiento e identificación es el agar Sabouraud, que contiene glucosa
y peptona, con un pH ligeramente bajo que interfiere con el crecimiento bacteriano (1, 2). La mayoría
de hongos de interés médico crecen en condiciones de aerobiosis, entre 25 y 30ºC, con un tiempo de
desarrollo que va desde los dos días hasta las tres semanas (1).
Para realizar un cultivo fúngico se debe tener en cuenta (2):
● Las muestras se ponen directamente sobre la superficie del medio de cultivo.
● Las vellosidades y escamas de piel se distribuyen por toda la superficie del agar.
● Los líquidos se deben dejar absorber en toda la superficie del agar antes de incubar.
● Las levaduras que se encuentren aisladas se siembran por agotamiento a modo bacteriano.
Un hongo se identifica como levaduriforme o filamentoso según el aspecto macroscópico de las
colonias y por la observación microscópica (1):
● Levaduras: colonias húmedas, cremosas, compactas, similares a las bacterianas (Figura 2).
Microscópicamente se observan como organismos unicelulares, donde con frecuencia se observan
gemas producto de su proceso de división (Figura 3)
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● Hongos filamentosos: colonias de aspecto algodonoso de formas colores y texturas variables
(Figura 4). Microscópicamente se observan como organismos pluricelulares formando estructuras
filamentosas (hifas), esporas asexuadas y estructuras que las producen (Figura 5).
Figura 2. Hongo levaduriforme. Típicas Figura 3. Hongo levaduriforme. Examen
colonias de M. globosa en medio mDixon. directo de pitiriasis versicolor en KOH +
http://www.actasdermo.org/es/la-pitiriasis- tinta,
versicolor-las-levaduras/articulo/13129571/ http://www.actasdermo.org/es/la-pitiriasis-
versicolor-las-levaduras/articulo/13129571/
Figura 4. Hongo Filamentoso Penicillium Figura 5. Hongo Filamentoso. Penicillium
spp. sobre Agar sabouraud. spp. Azúl de lactofenol ×1.000
4http://www.cram.com/flashcards/clinical- http://es.scribd.com/doc/239663976/Bases-
pathologymicro-4692621 Celulares-de-La-Vida-i#scribd
Los hongos antagonistas resultan importantes para el control biológico de los fitopatógenos. En este
sentido, las especies del género Trichoderma y del género Aspergillus se destacan entre las más
utilizadas para el biocontrol de patógenos fúngicos del suelo como Fusarium. En el suelo existen
diversos microorganismos con capacidad antagónica hacia microorganismos fitopatógenos, pero el
más estudiado es Trichoderma, debido a su fácil y rápido crecimiento además de sus características
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de micoparasitar a otros hongos (4). Estas especies presentan diferentes modos o mecanismos de
acción que le permiten el control de los fitopatógenos. Entre estos mecanismos se encuentran:
competencia por el sustrato, micoparasitismo, antibiosis, desactivación de enzimas del patógeno,
resistencia inducida, entre otros (5).
4. CONSULTA PREVIA
1. Dibuje la morfología microscópica de un hongo filamentoso y un hongo levaduriforme, describa las
diferencias.
2. Escriba cuales son las diferencias entre los grupos: Glomeromycota Ascomycota y Basidiomycota.
Dé tres ejemplos de especies representativas de cada uno.
3. Dibuje la morfología microscópica de un hongo Glomeromycota, señale y describa sus estructuras
reproductivas.
4. ¿Para la toma de muestra de una posible micosis humana que preparación debe tener el paciente?
5. ¿Qué géneros de hongos ambientales pueden estar involucrados en procesos infecciosos
humanos?
6. Mencione cinco micosis humanas importantes, describa y dibuje la estructura del microorganismo
causal.
7. ¿Qué medios de cultivo se utilizan para hongos levaduriformes? Describa las condiciones
medioambientales de crecimiento.
8. Describa el fundamento y realización de la prueba de KOH en hongos.
9. De tres ejemplos de hongos utilizados en control Biológico. Explique.
10. Defina los términos: competencia, micoparasitismo, antibiosis y crecimiento quimiotrófico.
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5. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS
MATERIALES (Grupo 3 o 4 de REACTIVOS (Grupo 25 EQUIPOS (Grupo 25
estudiantes) estudiantes) estudiantes)
4 cajas de agar Sabouraud 1 frasco con 20ml de azul 1 Baño serológico
2 cajas de agar PDA de Lactofenol 2% 1 microscopio
2 tubos de tapa rosca estéril pequeños de 20mL de KOH 40% 1 mechero
5mL
1 tubo de tapa rosca con agua destilada
estéril pequeño de 5mL
1 bajalenguas
1 pipeta Pasteur
3 asas micológicas
1 Caja de Fusarium spp.
1 Caja de Aspergillus spp
1 Caja de Trichoderma spp.
Materiales que debe traer el estudiante
Elementos de bioseguridad
Láminas portaobjeto
Láminas cubreobjeto
Toallas desechables
Encendedor
Lápiz de cera o marcador para vidrio
Tijeras
Cinta transparente delgada
Muestra de agua
Muestra de suelo
6. PROCEDIMIENTO
Montaje
Detección directa de estructuras fúngicas en muestras humanas
Previo interrogatorio del paciente, donde cumpla las condiciones para la toma de muestra:
1. Hacer un raspado aséptico de la zona afectada, deben recolectarse escamas.
2. Depositar las escamas en un tubo estéril.
3. Adicionar al tubo 1mL de KOH al 20% ó 40%, o hasta que se cubran las escamas.
4. Deje en baño maría el tubo por aproximadamente 15 minutos.
5. Realizar un montaje en fresco.
6. Observar al microscopio en 10X, 20X y 40X.
7. Si desea puede hacer el montaje en lámina cubreobjetos y calentar al mechero. Dejar enfriar y
observar.
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Aislamiento de hongos contaminantes del aire
Para el aislamiento de hongos contaminantes del aire se empleará el método de sedimentación en
placa. Este método consiste en dejar expuestas durante un tiempo determinado placas petri con un
medio de cultivo selectivo.
1. Seleccionar el área a muestrear y rotular la placa con el nombre del área de muestreo.
2. Destapar la placa de petri de agar Sabouraud y dejarla abierta durante15 minutos.
3. Cerrar la placa e incubar entre 25 y 30ºC hasta la próxima sesión práctica.
Aislamiento de hongos contaminantes del agua
1. Seleccionar el punto de muestreo y rotular la placa con el nombre del área de muestreo.
2. Con ayuda de una pipeta Pasteur, tomar entre 5 y 10ml del agua y colocarlos dentro del tubo
tapa rosca estéril.
3. Homogenizar la muestra recogida.
4. Sembrar una alícuota que cubra la superficie de la placa de agar Sabouraud.
5. Mover la caja circularmente para distribuir la muestra y permitir la absorción por 10 minutos a
temperatura ambiente.
6. Incubar entre 25 y 30ºC hasta la próxima sesión práctica.
Aislamiento de hongos contaminantes de la tierra
1. Seleccionar el punto de muestreo y rotular la placa con el nombre del área de muestreo.
2. Con ayuda de un bajalengua estéril, recolectar la tierra en un tubo tapa rosca que contiene
1mL de agua destilada estéril.
3. Mezclar vigorosamente.
4. Sembrar una alícuota que cubra la superficie de la placa de agar Sabouraud.
5. Mover la caja circularmente para distribuir la muestra y permitir la absorción por 10 minutos a
temperatura ambiente.
6. Incubar entre 25 y 30ºC hasta la próxima sesión práctica.
Aislamiento de hongos de muestras humanas
1. Tocar con su mano y uñas una placa de Agar sabouraud y rotular la placa con el nombre del
área de muestreo.
2. Incubar entre 25 y 30ºC hasta la próxima práctica.
3. Repita el mismo procedimiento si desea observar el crecimiento de hongos en otras partes.
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Siembra de pruebas de antagonismo
1. Para corroborar la actividad antogónica de pares de hongos realice la siembra de dos hongos
de su elección en cajas de PDA de la siguiente manera:
a. Caliente el asa recta y tome una muestra de la colonia del primer hongo seleccionado para
la prueba de antagonismo y realice una única punción en el medio de cultivo de PDA en uno de
los extremos de la caja.
b. De nuevo esterilice por calor el asa y tome una muestra del segundo hongo seleccionado
para la prueba y realice una punción paralela al otro extremo de la misma caja donde sembró
el primer hongo.
3. Lleve a incubación a 25ºC durante 5 días.
Disponga las láminas utilizadas en el recipiente rotulado como “Descarte de láminas”
Lectura
Morfología macroscópica
Luego de la incubación, realizar el estudio macroscópico de las colonias aisladas teniendo en cuenta
las siguientes características:
● Color en la superficie y en la base
● Textura
● Forma de los bordes
● Tamaño
Morfología microscópica
Tinción con azul de lactofenol: Tinción sencilla que permite visualizar las estructuras de los hongos
y así identificar muchos de los géneros, aunque en ocasiones se puede alterar el ordenamiento
característico de las esporas.
1. Colocar una gota de azul de lactofenol sobre una lámina portaobjetos.
2. Esterilizar el asa, permitir que se enfríe asépticamente.
3. Seleccionar un hongo que se encuentre aislado, extraer un fragmento.
4. Depositar el fragmento extraído sobre el portaobjetos con la gota de azul de lactofenol
5. Cubrir con un cubreobjetos, presionar suavemente para dispersar la gota.
6. Limpiar si hay azúl de lactofenol fuera del cubreobjetos.
7. Observar al microscopio en 20X y 40X.
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Preparación mediante impronta: Método rápido sencillo y que no altera la organización de las
estructuras de reproducción.
1. Colocar una gota de azul de lactofenol sobre una lámina portaobjetos.
2. Cortar un trozo de cinta adhesiva, de unos 3cm.
3. Colocar la cinta sobre la superficie filamentosa del hongo, haciendo presión, ponga del
centro hacia afuera del hongo para lograr recuperar mejores estructuras.
4. Colocar la cinta sobre la lámina, cubrir o no con un cubreobjetos.
5. Limpiar si hay azúl de lactofenol fuera del cubreobjetos.
6. Observar al microscopio
7. Para las pruebas de antagonismo y usando una regla establezca el radio de crecimiento del
hongo en cada caso usando como punto medio el sitio de la punción y extendiendo la regla
hacia el centro el medio.
Disponga las láminas utilizadas en el recipiente rotulado como “Descarte de láminas”
7. BIBLIOGRAFÍA
1. Prats, G. Microbiología y Parasitología Médicas. 1 ED. Madrid. Editorial Médica Panamericana. 2013
2. Brooks G, Carroll K, Butel J, Morse S, Mietzner T. Jawetz, Melnick & Adelberg’s Medical Microbiology. 26
ED. New York. McGraw-Hill. 2013
3. Kanneth Ryan, George Ray, Sherris Medical Microbiology. 6 ED. New York. McGraw-Hill. 2014
4. Infante, D., Martínez, B., González, N., & Reyes, Y. (2009). Mecanismos de acción de Trichoderma
frente a hongos fitopatógenos. Revista de protección vegetal, 24(1), 14-21.
5. -Quiroz-Sarmiento, V. F., Ferrera-Cerrato, R., Alarcón, A., Hernández, L., & Encarnación, M. (2008).
Antagonismo in vitro de cepas de Aspergillus y Trichoderma hacia hongos filamentosos que afectan al cultivo
del ajo. Revista mexicana de micología, 26, 27-34.
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INFORME DE LABORATORIO
Integrantes: Código:
TABLA DE RESULTADOS (1.5/5.0):
Con los resultados obtenidos y observaciones durante el desarrollo de la práctica, complete la
siguiente tabla de resultados:
Tabla 1. Resultados observados.
Identificación de la muestra:
Tinción Tipo de micelio Color de micelio Producción de Producción de
Morfología con azúl Septado Aseptado Hialino Dematéaceo conidias Blastoconidias
Microscópica de
lactofenol
Color Forma Consistencia Presencia de
Morfología Agar Aspecto
Anverso Reverso micelio
Macroscópica Sabouraud
Posible microorganismo identificado:
Observaciones:
Identificación de la muestra:
Tinción Tipo de micelio Color de micelio Producción de Producción de
Morfología con azúl Septado Aseptado Hialino Dematéaceo conidias Blastoconidias
Microscópica de
lactofenol
Color Forma Consistencia Presencia de
Morfología Agar Aspecto
Anverso Reverso micelio
Macroscópica Sabouraud
Posible microorganismo identificado:
Observaciones:
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Tabla 2. Descripción microscópica. Dibuje tres estructuras características que observó en los
montajes realizados y complete la tabla con la información relacionada a cada estructura.
Estructura
Colorante
Aumento
Objetivo
Magnificación
Origen
Estructura
Colorante
Aumento
Objetivo
Magnificación
Origen
Estructura
Colorante
Aumento
Objetivo
Magnificación
Origen
DISCUSIÓN DE RESULTADOS (2.0/5.0)
Realice un análisis, correlacionando los resultados obtenidos y los conceptos teóricos que soportan la
práctica. La discusión de resultados tiene un componente altamente teórico y es necesario que la
información que soporte esta sección sea citada y verificada en función de utilizar las referencias
pertinentes para el caso.
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En su análisis resuelva las siguientes preguntas:
1. ¿Cuáles son las principales diferencias observadas entre un hongo filamentoso y un hongo
levaduriforme? describa las diferencias, tanto macroscópicas como microscópicas.
2. ¿Cuáles son las características que permiten clasificar los hongos? ¿Cuáles observó usted en el
laboratorio?
3. ¿Por qué se emplea el azul de lactofenol como coloración simple para visualizar las muestras
fúngicas?
4. Indague sobre el proceso de inhibición de crecimiento micótico respecto de la prueba de
antagonismo, revise bibliográficamente que sustancias y mecanismos están implicados en dicho
proceso.
CONCLUSIONES (1.0/5.0)
Presente la conclusión en forma de un único párrafo en el que se incluya los hallazgos de la práctica
con su respectiva justificación teórica, y las habilidades personales adquiridas durante el desarrollo del
laboratorio como aporte al ejercicio profesional.
BIBLIOGRAFÍA (0.5/5.0)
Ingrese la lista de referencias utilizadas para la resolución del informe. Organícelas de acuerdo a las
normas VANCUOVER.
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